TW202002997A - 來自十二指腸布隆納氏腺之幹細胞／前驅細胞及其分離和使用方法 - Google Patents

Abstract

本文揭示具有內胚層幹細胞的表型性狀和多能性標記物陽性特性之布隆納氏腺(Brunner’s Gland)的幹細胞/前驅細胞(BGSC)，以及從人類十二指腸中分離出它們的方法。此外，本揭示提供易於從人類提供者的十二指腸中分離出的BGSC，其可在培養液中倍增或誘導分化成肝和胰譜系，並可代表再生醫學臨床程序的細胞來源。

Description

來自十二指腸布隆納氏腺之幹細胞/前驅細胞及其分離和使用方法

相關專利申請案的交叉引用

本申請案係主張於2018年3月29日提申之美國臨時專利申請案第62/650,208號之優先權，其全文係併入本文中。

本發明係有關於來自十二指腸布隆納氏腺之幹細胞/前驅細胞及其分離和使用方法。

多種幹細胞/前驅細胞區位(niche)係持續存在於胎兒和出生後的人類膽管樹中的特定解剖學位置。儘管幹細胞/前驅細胞群早已在胎兒組織中被識別出，但它們在成人組織中的持續性是最近才發現。與肝臟隱窩平行的腺體元件，膽管周圍腺體（PBG），係位於肝外膽管、大肝內膽管和肝-胰總管中；而後期幹細胞/前驅細胞及衍生自PBG之幹細胞/前驅細胞，則在膽囊中發現。該網絡自肝-胰總管的PBG中的幹細胞/前驅細胞連續至胰臟內的胰管腺（PDG）內之定向前驅細胞。所有這些區位中的幹細胞/前驅細胞統稱為膽管樹幹細胞/前驅細胞（BTSC）。PBG中的BTSCs具有內胚層幹細胞/前驅細胞的特徵，包括增殖能力、自我更新和多潛能性(multipotency)；它們具有PDG中前驅細胞的特徵，包括增殖能力和多潛能性(multipotency)，但比PBG中的幹細胞/前驅細胞具有較低的自我複製能力。

位於肝-胰壺腹部水平位置上的BTSCs為原始性、共表現幾種多，能性(pluripotency)標記物（例如OCT4、SOX2、NANOG），可自我更新或分化成功能性肝細胞、膽管細胞和胰島（當前研究正在考量它們是否可產生腺泡細胞）。含有BTSCs的區位係延伸到肝臟和胰臟中。詳細的人類解剖學研究揭示了BTSC區位組織的近端到遠端軸線，從近端部位(最原始的幹細胞所在之肝胰壺腹)延伸至到遠端部位(成熟細胞所載之肝臟或胰臟)。此軸概括了這些器官的器官發生過程，並反映了它們共同的胚胎起源。實際上，從胚胎學的角度來看，肝臟、膽管系統和胰臟的共同前驅細胞存在於形成前腸的最終腹側內胚層發育的早期階段。在此發育階段，原始十二指腸包含腹側內胚層幹細胞/前驅細胞。

辨識出的最原始幹細胞/前驅細胞是位於十二指腸黏膜下層的布隆納氏腺(Brunner’s Gland)內的那些細胞。這些細胞可能是整個幹細胞/前驅細胞區位網絡的起點，由此產生肝臟和胰臟。從成人十二指腸中分離出這些細胞是相當困難的，迄今為止尚未由本領域已知的方法達成。這些細胞的實際顯著性是多重的。例如，這些細胞可用於藥物效應的體外 評估，並用於生成模型系統（如 類器官），用於分析肝臟和胰臟的發育、功能'維持及/或修復（鑑於它們含有兩種器官的前驅細胞），用於與肝臟、胰臟和其他內胚層組織相關的其他臨床或分析測試，以及用於診斷或治療涉及或影響肝臟、胰臟及/或其他內胚層組織之疾病或症狀。來自布隆納氏腺(Brunner’s Gland)的細胞在內胚層幹細胞/前驅細胞的來源位置(十二指腸)中是獨特的，可由內視鏡取得，因此可用於作為自體或同種異體細胞療法或基因療法的幹細胞/前驅細胞來源。此外，衍生自這些布隆納氏腺(Brunner’s Gland)的腫瘤，是各種形式的癌症治療的合理目標。因此，本領域仍需要開發一種分離有興趣細胞，稱為“布隆納氏腺(Brunner’s Gland)幹細胞/前驅細胞”的方法。

在一態樣中，本發明相關於一種從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞（稱為布隆納氏腺(Brunner’s Gland)之幹細胞/前驅細胞或BGSC），其表現一或多種標記物，該標記物選自於由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9及細胞角蛋白7（CK7）組成之群組，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖。

在另一態樣中，本揭示相關於一種從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞（稱為布隆納氏腺(Brunner’s Gland)幹細胞/前驅細胞或BGSC），其表現一或多種標記物，該標記物選自於由Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖。

在另一態樣中，本揭示相關於一種從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞（稱為布隆納氏腺(Brunner’s Gland)幹細胞/前驅細胞或BGSC），其表現SOX17及PDX1二者，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖。

在另一態樣中，本揭示相關於一種從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞（稱為布隆納氏腺(Brunner’s Gland)幹細胞/前驅細胞或BGSC），其表現一或多種標記物，該標記物選自於由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組，或其表現SOX17及PDX1二者，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖。

在一些實施例中，BGSC實質上不含病原體及/或致病性及/或有益微生物。在一些實施例中，BGSC可在有限或最小的分化情況下增殖至少一個月。在一些實施例中，BGSC可在有限或最小的分化情況下增殖至少二個月。在一些實施例中，BGSC可在有限或最小的分化情況下增殖至少六個月。在一些實施例中，BGSC可在有限或最小的分化情況下增殖至少十二個月。

在一些實施例中，支持BGSC自我更新的培養條件包含無血清培養液，任擇地為Kubota培養液。在一些實施例中，支持自我更新的培養條件包含含有血清之培養液。

在一態樣中，本揭示相關於從十二指腸分離出的一群幹細胞/前驅細胞，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現一或多種標記物，該標記物選自於由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9及CK7組成之群組。

在一態樣中，本揭示相關於一群從十二指腸分離的幹細胞/前驅細胞，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現一或多種標記物，該標記物選自於由Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組。

在一態樣中，本揭示相關於一群從十二指腸分離的幹細胞/前驅細胞其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現一或多種標記物，表現SOX17及PDX1二者。

在一態樣中，本揭示相關於一群從十二指腸分離的幹細胞/前驅細胞，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現一或多種標記物，選自於由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、 CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組，或其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現一或多種標記物，SOX17及PDX1二者。

在一些實施例中，該群幹細胞/前驅細胞實質上不含病原體及/或致病性及/或有益微生物。

在一些實施例中，該群幹細胞/前驅細胞可在有限或最小的分化情況下增殖至少一個月。在一些實施例中，該群幹細胞/前驅細胞可在有限或最小的分化情況下增殖至少二個月。在一些實施例中，該群幹細胞/前驅細胞可在有限或最小的分化情況下增殖至少六個月。在一些實施例中，該群幹細胞/前驅細胞可在有限或最小的分化情況下增殖至少十二個月。

在一些實施例中，支持該群幹細胞/前驅細胞自我更新的培養條件包含無血清培養液，任擇地為Kubota培養液。在一些實施例中，支持該群幹細胞/前驅細胞自我更新的培養條件包含含有血清之培養液。

在一態樣中，本揭示相關於一種從個體的十二指腸、其一部分或從其中取出的樣本中，分離出一或多種BGSC，或幹細胞/前驅細胞群的方法，包含： (a) 將實質上不含腸黏液的十二指腸黏膜層，與具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液，在可誘導黏膜層細胞產生滲透性休克的條件下接觸； (b) 藉由機械、手術及/或化學方法移除或溶解至少一部分黏膜層或其細胞，留下及/或暴露可包括黏膜下層的剩餘部分； (d) 消化或分離該剩餘部分；以及 (e) 從該經消化的剩餘物中分離出一或多種BGSC或幹細胞/前驅細胞群。

在一些實施例中，該分離步驟包含分離出BGSC，或一群BGSC，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現一或多種標記物，該標記物選自於由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19之組成之群組。

在一些實施例中，該分離步驟包含分離出BGSC，或一群BGSC，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現SOX17和PDX1二者。

在一態樣中，本揭示相關於從個體的十二指腸、其一部分或從其中取出的樣本中，分離出一或多種BGSC或BGSC群的方法，包含以下步驟，其中所述步驟實質上會殺死、失活或去除病原體及/或致病性及/或有益微生物，可於任何時間進行或不止一次進行： (a) 移除腸黏液； (b) 在可誘導黏膜層細胞產生滲透性休克的條件下，施加具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液； (c) 藉由機械、手術及/或化學方法移除或溶解至少一部分黏膜層或其細胞，留下及/或暴露可包括黏膜下層的剩餘部分； (d) 向黏膜層及/或剩餘部分施加培養液或溶液，以實質上殺死、失活或移除病原體及/或致病性及/或有益微生物； (e) 黏膜下層進行消化或分解，以產生經消化、經分解之細胞材料或細胞懸浮液； (f) 任擇地從細胞懸浮液中培養至少一些經消化、分解的細胞材料或細胞；以及 (g) 分離出其中的至少一些的、相當一部分的或大部分的細胞會表現Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組中之一或多者的細胞或細胞群；及/或會表現SOX17及PDX1二者之細胞。

在一些實施例中，該腸黏液的移除包含擠壓十二指腸組織。

在一些實施例中，該具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液包含低張、低滲透壓、高張或高滲透壓溶液。

在一些實施例中，該具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液包含葡萄糖溶液、高鹽溶液或蒸餾水。

在一些實施例中，該移除係藉由化學破壞法，該化學破壞法包括使用乳化劑及/或界面活性劑。

在一些實施例中，該界面活性劑及/或乳化劑置於水、生理食鹽水及/或緩衝液中。

在一些實施例中，該界面活性劑及/或乳化劑係施加一段短時間(小於15分鐘)。

在一些實施例中，該乳化劑選自於包含b卵磷脂、單月桂酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯20）、單油酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯80）、單棕櫚酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯40）、單硬脂酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯60）、三硬脂酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯65）、磷脂酸銨、脂肪酸之鈉、鉀和鈣鹽、脂肪酸之鎂鹽、脂肪酸之單-和二甘油酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的乙酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的乳酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的檸檬酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的單-和二乙醯基酒石酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的乙酸酯與酒石酸酯之混合物、脂肪酸之蔗糖酯、蔗糖甘油酯、脂肪酸之聚甘油酯、聚蓖麻油酸聚甘油酯、脂肪酸之丙烷-1,2-二醇酯、熱氧化大豆油與脂肪酸之單-及二甘油酯之反應物、硬脂醯-2-乳酸鈉、硬脂醯-2-乳酸鈣、單硬脂酸去水山梨糖酯、三硬脂酸去水山梨糖酯、單月桂酸去水山梨糖酯、單油酸去水山梨糖酯、單棕櫚酸去水山梨糖酯及其組合之群組。

在一些實施例中，該界面活性劑選自於由1-庚烷磺酸；N-月桂基肌胺酸、十二烷基硫酸鹽、1-辛烷磺酸和牛磺酸、苯扎氯銨、十六烷基吡啶、氯化甲基芐基銨、溴化十甲烯銨、烷基甜菜鹼、烷基醯胺基烷基甜菜鹼、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸鹽、磷脂醯膽鹼、N-癸基A-D-吡喃葡萄糖苷、N-癸基A-D-吡喃麥芽糖苷、N-十二基-B-D-麥芽糖苷、N-辛基B-D-吡喃葡萄糖苷、N-十四烷基B-D-麥芽糖苷、Tritons(Triton X-100）、Nonidet-P-40、泊洛沙姆188(Poloxamer 188)、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉及其組合組成之群組。

在一些實施例中，該剩餘部分包含黏膜下層。

在一些實施例中，消化或分解係以酵素方式進行。

在一些實施例中，實質上可殺死、失活或移除病原體及/或致病性及/或有益微生物的培養液或溶液，包含次氯酸鈉（NaClO）水溶液，或用於皮膚或表面消毒的任一溶液或試劑。

在一些實施例中，施加該實質上可殺死、失活或移除病原體及/或致病性及/或有益微生物的培養液或溶液，係於施加界面活性劑及/或乳化劑之前進行，或在消化或分解之後進行，或在移除黏液之後進行。

在一些實施例中，組織樣本在消化或分解步驟之前切碎。

在一些實施例中，該消化或分解步驟，及/或分離步驟係於低附著盤上進行。

在一些實施例中，該分離步驟係使用培養篩選法進行，培養條件包含無血清培養液，任擇地，Kubota培養液。

在一些實施例中，該分離步驟係使用培養篩選法進行，培養條件包含含有血清之培養液。

在一些實施例中，經分離的細胞係於支持或產生球狀體、一或多種類器官、細胞簇或細胞聚集體的條件下培養。

在一態樣中，本公開涉及通過在低附著盤中培養BGSC或BGSC群體而產生的球狀體，類器官，細胞聚集體或細胞簇。

在一態樣中，本揭示相關於藉由在懸浮液或3D培養條件下，培養BGSC或BGSC群而產生之球狀體、類器官、細胞聚集體或細胞簇。

在一態樣中，本揭示相關於一種治療被診斷患有涉及或影響肝臟、胰臟、胃，腸或其他內胚層組織的疾病或症狀的個體之方法，其包括投與有需要的個體有效量之BGSC或BGSC群。

在一態樣中，本揭示相關於一種治療被診斷患有涉及或影響肝臟、胰臟、胃，腸或其他內胚層組織的疾病或症狀的個體之方法，其包括投與有效量的BGSC。

在一態樣中，本揭示相關於一種治療被診斷患有涉及或影響肝臟、胰臟、胃，腸或其他內胚層組織的疾病或症狀的個體之方法，其包括投與有效量的BGSC群。

在一態樣中，本揭示相關於一種自體細胞或基因治療方法，其包括投與有效數量的BGSC或BGSC群。

在一態樣中，本揭示相關於一種同種異體細胞或基因治療方法，其包括投與有效數量的BGSC或BGSC群。

在一態樣中，本揭示相關於一種治療被診斷患有涉及或影響肝臟、胰臟、胃，腸或其他內胚層組織的疾病或症狀的個體之方法，其包括向有需要的個體投與有效量的BGSC或BGSC群，其中該細胞為基因改造或修飾細胞。

在一態樣中，本揭示相關於一種治療被診斷患有涉及或影響肝臟、胰臟、胃，腸或其他內胚層組織的疾病或症狀的個體之方法，其包括投與有效量的BGSC，其中該細胞為基因改造或修飾細胞。

在一態樣中，本揭示相關於一種治療被診斷患有涉及或影響肝臟、胰臟、胃，腸或其他內胚層組織的疾病或症狀的個體之方法，其包括投與有效量的BGSC群，其中該細胞為基因改造或修飾細胞。

在一態樣中，本揭示相關於一種自體細胞或基因治療方法，其包括投與有效數量的BGSC或BGSC群，其中該細胞為基因改造或修飾細胞。

在一態樣中，本揭示相關於一種同種異體細胞或基因治療方法，其包括投與有效數量的BGSC或BGSC群，其中該細胞為基因改造或修飾細胞。

在一態樣中，本揭示相關於一種使用BGSC細胞以治療涉及或影響肝臟、胰臟、胃，腸或其他內胚層組織的疾病或症狀之用途，用於人類及/或動物之自體或同種異體細胞或基因治療。

在一態樣中，本揭示相關於一種使用BGSC細胞以治療涉及或影響肝臟、胰臟、胃，腸或其他內胚層組織的疾病或症狀之用途，用於人類及/或動物之自體或同種異體細胞或基因治療，其中該細胞經基因改造或修飾。

在一態樣中，本揭示相關於一種使用BGSC群以治療涉及或影響肝臟、胰臟、胃，腸或其他內胚層組織的疾病或症狀之用途，用於人類及/或動物之自體或同種異體細胞或基因治療。

在一態樣中，本揭示相關於一種使用BGSC群以治療涉及或影響肝臟、胰臟、胃，腸或其他內胚層組織的疾病或症狀之用途，用於人類及/或動物之自體或同種異體細胞或基因治療，其中該細胞經基因改造或修飾。

在一些實施例中，該球狀體、類器官、細胞聚集體或細胞簇，更包含能夠將BGSC或BGSC群體分化成後期譜系階段（包括成熟細胞）的細胞之培養條件。

在一態樣中，本揭示相關於一種從個體的十二指腸、其一部分或從其中取出的樣本中，分離出一或多種布隆納氏腺(Brunner’s Gland)之幹細胞/前驅細胞，或BGSC群的方法，包含： (a) 消化或分解十二指腸、其一部分或從其中取出的樣本，以提供經消化或分解的細胞材料； (b) 從經消化或分解的細胞材料獲得：(i)某種細胞或某一群細胞，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19之一或多者；及/或（ii）某種細胞或某一群細胞，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現SOX17和PDX1二者。

在一些實施例中，十二指腸、其一部分或從其中取出的樣本、經消化、分解的細胞材料或其組合，係與培養液或溶液接觸，以實質上殺死、失活或移除病原體及/或致病性及/或有益的微生物。

在一態樣中，本揭示相關於一種分離方法，可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群，包括以下步驟，其可以下列順序發生，或者在其他實施例中，可以不同的順序發生： (a) 使具有黏膜層和黏膜下層的組織黏膜層，與具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液，在可誘導黏膜層細胞產生滲透性休克的條件下接觸； (b) 藉由機械、手術及/或化學方法移除或溶解至少一部分黏膜層或其細胞，留下及/或暴露可包括黏膜下層的剩餘部分； (c) 使剩餘部分與培養液或溶液接觸，以實質上殺死、失活或移除病原體及/或致病性及/或有益微生物； (d) 消化或解離該餘部分； (e) 分離出一或多種多能細胞或細胞群，其中至少一些或多數或大部分細胞表現一或多種所希望之生物標記物。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，更包含移除表面黏液。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，其中該具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液，包含低張、低滲透壓、高張或高滲透壓溶液。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，其中該具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液，包含葡萄糖溶液、高鹽溶液或蒸餾水。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，通過化學破壞進行去除，其包括使用乳化劑和/或去污劑。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，該界面活性劑及/或乳化劑係位於水、鹽水及/或緩衝液中。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，係施加界面活性劑及/或乳化劑一段短時間（少於15分鐘）。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法中，其中該乳化劑選自於包含卵磷脂、單月桂酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯20）、單油酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯80）、單棕櫚酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯40）、單硬脂酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯60）、三硬脂酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯65）、磷脂酸銨、脂肪酸之鈉、鉀和鈣鹽、脂肪酸之鎂鹽、脂肪酸之單-和二甘油酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的乙酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的乳酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的檸檬酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的單-和二乙醯基酒石酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的乙酸酯與酒石酸酯之混合物、脂肪酸之蔗糖酯、蔗糖甘油酯、脂肪酸之聚甘油酯、聚蓖麻油酸聚甘油酯、脂肪酸之丙烷-1,2-二醇酯、熱氧化大豆油與脂肪酸之單-及二甘油酯之反應物、硬脂醯-2-乳酸鈉、硬脂醯-2-乳酸鈣、單硬脂酸去水山梨糖酯、三硬脂酸去水山梨糖酯、單月桂酸去水山梨糖酯、單油酸去水山梨糖酯、單棕櫚酸去水山梨糖酯及其組合之群組。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法中，該界面活性劑選自於包含1-庚烷磺酸；N-月桂基肌胺酸、十二烷基硫酸鹽、1-辛烷磺酸和牛磺酸、苯扎氯銨、十六烷基吡啶、氯化甲基芐基銨、溴化十甲烯銨、烷基甜菜鹼、烷基醯胺基烷基甜菜鹼、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸鹽、磷脂醯膽鹼、N-癸基A-D-吡喃葡萄糖苷、N-癸基A-D-吡喃麥芽糖苷、N-十二基-B-D-麥芽糖苷、N-辛基B-D-吡喃葡萄糖苷、N-十四烷基B-D-麥芽糖苷、Tritons(Triton X-100）、Nonidet-P-40、泊洛沙姆188(Poloxamer 188)、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉及其組合之群組。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，實質上可殺死、失活或移除病原體及/或致病性及/或有益微生物的培養液或溶液，包含次氯酸鈉（NaClO）水溶液，或用於消毒皮膚或表面的任一溶液或試劑。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，係施加培養液或溶液，以實質上殺死、失活或移除病原體及/或致病性及/或有益微生物，係於施加界面活性劑及/或乳化劑之前，或在消化或分解後，或在除去黏液後進行。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，該剩餘部分包括黏膜下層。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，該消化或分解係以酵素方式進行。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，組織樣本係於消化或分解步驟之前切碎。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，該消化或分解係將黏膜下層組織分解成細胞懸浮液、細胞、細胞簇、團塊或聚集體，及/或組織碎片的混合物。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，該分離步驟係使用培養篩選法進行，其中培養條件包含無血清培養液，任擇地為Kubota培養液。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，該分離步驟係使用培養篩選法進行，其中培養條件包含含有血清之培養液。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，該分離步驟係於低附著盤中進行。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，分離出的細胞或細胞群係培養於可支持或產生球狀體、一或多種類器官、細胞簇或細胞聚集體的條件下。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，亦包含使用生理學上可接受的培養液進行一或多個洗滌步驟。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，其中該組織為內胚層組織。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，其中該組織選自於氣管、主支氣管、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸和直腸。

在一些實施例中，該可從具有黏膜層和黏膜下層的組織（或其部分或樣本），分離出表現有一或多種所希望之生物標記物的一或多種多能細胞，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種所希望之標記物的細胞群之方法，其中該組織選自於包含肝臟、胰臟、膽囊和膽管樹管之群組，其中膽管樹管包括總管和囊狀管道。

定義

如在本發明的描述和申請專利範圍中所使用的，單數形式“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”旨在也包括複數形式，除非上下文另有明確說明。

當提及諸如量或濃度等可測量值時，術語“約”意指包括指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的變化。

當用於描述本文揭示的任何成分、範圍、劑型等的選擇時，術語“可接受的”、“有效的”或“足夠的”意指該成分、範圍、劑型等適用於揭示之目的。

同樣如本文所用，“及/或”是指並且涵蓋一或多個相關所列項目的任何和所有可能組合，以及當在替代方案（“或”）中解釋時，缺乏組合。

如本文所用，術語“包含”旨在表示組成物和方法包括所列舉的要素，但不排除其他要素。如本文所用，過渡短語“基本上由......組成”（和語法變體）應被解釋為包含所述材料或步驟“以及不實質影響所述實施例的基本和新穎特徵者”。請參考 In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976) (強調原文)；亦請參考 MPEP § 2111.03。因此，如本文所用的術語“基本上由......組成”不應解釋為等同於“包含”。“由......組成”意指排除多於其他成分的痕量或微量元素，以及用於投與本文揭示的組成物的之實質方法步驟。由這些過渡術語中的每一者所定義的態樣落於本發明的範圍內。

當提及特定分子、生物或細胞材料時，術語“等同物”或“生物等同物”可互換使用，並且意指那些具有最小同源性同時仍保持所需結構或功能的物質。

如本文所用，當提及實質上為或主要為相同類型的細胞的聚集體，其中該細胞已組織成三維（3D）結構，使得細胞能夠在懸浮培養環境中相互作用時，係使用術語球狀體。

如本文所用，當提及一或多種類型的細胞的聚集體，其中該細胞已組織成三維（3D）結構，使得細胞能夠在懸浮培養環境中相互作用時，係使用術語類器官。在一些情況下，類器官可以模仿[人或動物]器官或組織的結構和功能的各種態樣。

如本文所用，術語微生物是指可為或可不為致病性或引起疾病的微生物，或者可為或可不為有益的微生物，其可存在於被加工的組織內部或外部，以獲得所需的細胞或細胞群。

如本文所用，術語“表現”是指DNA或聚核苷酸轉錄為mRNA的過程，及/或該經轉錄的mRNA隨後轉譯為胜肽、多胜肽或蛋白質的過程。若該聚核苷酸衍生自基因組DNA，則表現可包括在真核細胞中的mRNA剪接。基因的表現位準可藉由如測量細胞或組織樣本中mRNA或蛋白質的量而測定；此外，多個基因的表現為準可經測定，以建立特定樣本的表現譜。

如本文所用，術語“功能性”可用於修飾任何分子、生物性或細胞性材料，以使其實現某些效果。

如本文所用，術語“基因”或“基因性”意指廣泛地包括任何核酸序列，其可以或可以不轉錄成RNA分子，無論該DNA或RNA是否為編碼性(如 ,mRNA)或非編碼性(如 , ncRNA)。術語“核酸”、“聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互換使用，是指任何長度的核苷酸的聚合形式，不論是去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。聚核苷酸可具有任何三維結構，並可執行已知或未知的任何功能。以下是聚核苷酸的非限制性實例：基因或基因片段（例如，探針、引子、EST或SAGE標籤）、外顯子、內含子、信使RNA（mRNA）、微小RNA、轉移RNA、核醣體RNA、RNAi、核酶、cDNA、重組性聚核苷酸、支鏈聚核苷酸、質體、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引子。

本文所用的術語“基因改造的”意指廣泛地包括細胞或其基因材料的任何形式的修飾，包括但不限於基因或基因材料的刪去、加入或調節、重組DNA技術、經由病毒載體或電穿孔進行的基因修飾、經由CRISPER（( Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）或其他方法之基因靶向或編輯，以刪除或加入一DNA片段、修正基因突變等。

聚核苷酸可包含經修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，則可在聚核苷酸組裝之前或之後賦予該核苷酸結構修飾。核苷酸序列可被非核苷酸成分中斷。聚合後，聚核苷酸可被進一步修飾，例如，藉由與標記成分結合。該術語亦指雙股和單股分子。除非另有說明或要求，否則若此技術之一態樣為聚核苷酸，則涵蓋雙股形式，以及已知或預期可構成雙股形式的二互補性單股形式中之每一者。

術語“蛋白質”、“胜肽”及“多胜肽”可互換使用，且在其最廣泛的意義上是指胺基酸、胺基酸類似物或胜肽模擬物中的二或多個次單元的化合物。該次單元可經由胜肽鍵連接。在另一態樣中，該次單元可經由其它鍵，如 酯、醚等連接。蛋白質或胜肽必須包含至少兩個胺基酸，且不限於可包含蛋白質或胜肽序列的胺基酸的最大數目。如本文所用，術語"胺基酸"是指天然和/或非天然或合成胺基酸，包括甘胺酸以及D和L光學異構體二者、胺基酸類似物和胜肽模擬物。

如本文所用，術語“個體”和“患者”可互換使用，旨在表示任何人類或動物。在一些實施例中，該個體可為哺乳動物。在其他實施例中，該個體可為人類或非人類動物（例如小鼠或大鼠）。

術語“組織”在本文中用於指活體或死亡生物體的組織，或衍生自或旨在模擬活體或死亡生物體的某些態樣的任何組織。組織可以是健康的、患病的，及/或具有基因突變或修飾。本文所用的術語“天然組織”或“生物組織”及其變體，是指生物組織，當它以其天然狀態存在，或處於從其衍生自生物體時未修飾的狀態。“微器官”是指“經生物工程改造的組織”的一片段，其建立於或模擬“天然組織”。

生物組織可包括任何單一組織（如 可互連的細胞集合），或構成生物體的器官或其部分或區域的一群組織。該組織可包括均質或異質細胞材料，或者其可為複合結構，例如在包括胸部的身體區域中發現的複合結構，例如可包括肺組織、骨骼組織，及/或肌肉組織。例示性組織包括但不限於衍生自肝、肺、甲狀腺、皮膚、胰臟、血管、膀胱、腎、腦、膽道、十二指腸、腹主動脈、胯靜脈、心臟和腸者，且包括其任何組合。

如本文所用的術語“經分離的”是指實質上不含其他材料的分子，或生物性或細胞性材料。術語“經分離的”也用於描述已從其自然環境中移出的材料（例如，從體內 移至離體 或體外 ）。本文所用的術語“無菌”是指不含細菌或其他活微生物的物質（即無菌、滅菌、不含菌、防腐、消毒等）。 經分離的布隆納氏腺 (Brunner’s Gland) 幹細胞 / 前驅細胞和細胞培養液

如本文所用，術語“細胞”是指真核細胞。在各種實施例中，該細胞是人類或動物來源，並且可為幹細胞或前驅細胞或體細胞。術語“細胞群”是指一或多個相同或不同細胞類型的細胞群，其中至少一些或多數或大部分細胞具有相同或不同的來源及/或譜系階段。在一些實施例中，該細胞群可源自於一細胞株；在一些實施例中，該細胞群可源自於器官或組織，其部分或其樣本。

術語“幹細胞”是指可以自我複製的細胞群（產生與親代細胞相同的子細胞）並且是多潛能性，即可產生多於一種類型的成體細胞。如本文所用的術語“前驅細胞”或“前驅體”也是多潛能性，儘管前驅細胞或前驅體的多潛能性範圍或程度可能比幹細胞的多潛能性更有限。術語“前驅細胞”或“前驅體”也廣義地定義為包括幹細胞的後代及其後代。前驅細胞可為多潛能性、雙能性或單能性細胞群，但可能比幹細胞具更有限的自我複製能力。定向前驅細胞為可以分化成特定譜系者。幹細胞的非限制性實例包括但不限於胚胎幹（ES）細胞、誘導多能幹（iPS）細胞、胚層幹細胞、確定幹細胞(determined stem cells)、成體幹細胞、圍產期幹細胞、羊水來源幹細胞、間充質幹細胞（MSCs）和血管母細胞。幹細胞和定向前驅細胞之間的中間體包括細胞群，例如肝母細胞和胰導管前驅細胞和其他形式的短暫倍增細胞，其可以是多潛能性但可具有限的自我複製能力。

本揭示中感興趣的細胞在本文中稱為布隆納氏腺(Brunner’s Gland)幹細胞/前驅細胞（BGSC），並且可衍生自人類或動物的十二指腸（但非為腸中其他處） 基於至少以下特徵，這些BGSC與腸幹細胞是可區分的：

本申請人是第一位發現十二指腸及其布隆納氏腺(Brunner’s Gland)是重要的幹前驅細胞區位，其位於十二指腸黏膜下層腺體之幹細胞/前驅胞網絡的一部分，可產生肝臟、胰臟和其他內胚層細胞與組織，並持續到成年期。BGSC是布隆納氏腺(Brunner’s Gland)（也稱為十二指腸黏膜下層腺體）內細胞的一個小亞群（例如~5%），可識別為表現多能性基因如TRA-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2和NANOG者。BGSC與肝、膽管樹、胰臟、腸和其他具有生物標記物的內胚層組織相關，該生物標記物可包括Lgr5、NIS、CD44、CK19、SOX9和EpCAM，及/或可包括SOX17和PDX1二者。

如上所述，BGSC與腸幹細胞不同：BGSC表現Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4和CK7，而腸幹細胞不表現。BGSCs也不同於肝幹細胞和胰幹細胞，因為BGSCs表現SOX17和PDX1二者，而肝幹細胞表現SOX17但不表現PDX1，且胰腺幹細胞表現PDX1但不表現SOX17。

因此，在一態樣中，本公開相關於從十二指腸分離的BGSC，其表現一或多種標記物，該標記物選自於由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9與CK7組成之群組，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖。在另一態樣中，從十二指腸分離的BGSC表現一或多種標記物，該標記物選自於由Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組，且BGSC之進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖。在另一態樣中，從十二指腸分離的BGSC表現SOX17和PDX1二者，且BGSC之進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖。在一些實施例中，經分離的BGSC可表現一或多種標記物，該標記物選自於由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、 CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組，或其表現SOX17及PDX1二者 在一些實施例中，經分離的BGSC實質上不含病原體及/或不含致病性及/或有益的微生物。

在一些實施例中，經分離的BGSC可在有限或最小的分化情況下增殖至少一個月。在一些實施例中，經分離的BGSC可在有限或最小的分化情況下增殖至少二個月。在一些實施例中，在一些實施例中，經分離的BGSC可在有限或最小的分化情況下增殖至少十二個月。

在一些實施例中，支持BGSC自我更新的培養條件包括無血清培養液。在一些實施例中，無血清培養液包含Kubota培養液。

術語“培養物”或“細胞培養物”是指在體外 環境中維持細胞。“細胞培養系統”在本文中用於指培養條件，其中細胞群可以離體 （體外）生長。培養物可以由單一類型的細胞或不同細胞類型的混合物組成。

細胞培養物包括單層細胞培養物，其中細胞被種於具有或不具有塗覆物，例如細胞外基質成分塗覆物的表面上，以及位於補充有生物流體（例如血清或淋巴）及/或激素、生長因子與細胞激素之限定混合物（激素限定的培養基或HDM）之營養培養液（礦物質、維生素、胺基酸、脂質）中。HDM在經驗上被定義為在特定的成熟譜系階段，對特定類型的細胞或細胞群具可用性。

細胞培養物亦可為漂浮簇或種於低附著盤上的細胞聚集體，及/或可為懸浮培養物。支持漂浮簇或聚集體及/或懸浮培養物的培養液可為用於單層培養的相同培養液。培養液可不含血清或含有血清。無血清培養液缺乏可導致漂浮聚集體產生單層的附著蛋白（例如，纖連蛋白）。如果漂浮聚集體實質上或主要由一種細胞類型組成，則它們被稱為球狀體。 如果它們由多種細胞類型組成[例如，上皮細胞和間充質細胞夥伴]，則被稱為類器官 。 懸浮在懸浮液中的細胞簇或聚集體、球狀體和類器官培養物，被認為是位於3D微環境中，並且細胞能夠在三維空間中相互作用。

“培養液”在本文中用於指用於細胞培養、生長或增殖的營養液。培養液可透過功能特性來分別，例如但不限於將細胞維持在特定狀態（如多能(pluripoten)狀態、靜默狀態等）的能力，以促進細胞成熟，在某些情況下，促進多潛能(multipotent)細胞分化成特定譜系的細胞。

培養基的非限制性實例是血清補充培養液（SSM），其為補充有血清的任何基礎培養液（衍生自常規屠宰用於商業和農業產品的動物），其量通常為~10％。

如本文所用的術語“經分離的”是指基本上不含其他物質的分子或生物性或細胞性材料（除了培養液及/或細胞外基質，以及其各自成分）。術語“經分離的”也用於描述已從其自然環境中移除的材料（例如，從體內 移至離體 或體外 ）。

本文所用的術語“無菌”是指不含細菌或其他活微生物的材料（即無菌、滅菌、不含菌、防腐、消毒等）。 經分離之 BGSC 群

在另一態樣中，本揭示相關於一群從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現一或多種標記物，該標記物選自於由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9與CK7組成之群組，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖。在另一態樣中，本揭示相關於一群從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現一或多種標記物，該標記物選自於由Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組 在另一態樣中，本揭示相關於一群從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現SOX17和PDX1二者。在一些實施例中，本揭示相關於一群從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現一或多種標記物，該標記物選自於由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組，或其表現SOX17及PDX1二者。

在一些實施例中，前一段中描述的經分離的幹細胞/前驅細胞群實質上不含病原體及/或不含致病性及/或有益微生物。

在一些實施例中，本揭示相關於一種包含經分離的BGSC群之組成物，該細胞群表現一或多種標記物，其選自於由由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組，或其表現SOX17及PDX1二者，並且在一些實施例中，此BGSC群已經過滅菌、防腐或消毒。

在另一態樣中，本揭示相關於一種類器官，其經由培養該經分離的BGSC群而產生，其中至少一些或多數或大部分細胞表現一或多種標記物，其由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組，或其表現SOX17及PDX1二者，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖，任擇地位於低附著盤中或懸浮液中。在一些實施例中，該類器官更包含培養液，其中該培養液能夠將BGSC分化成後期譜系細胞，包括成熟細胞。

在一些實施例中，支持自我更新的培養條件包含無血清培養液。在一些實施例中，無血清培養基包含Kubota培養液。

在一些實施例中，無血清培養條件是激素限定培養液（HDM），其設計用於細胞的特定成熟譜系階段，無論是上皮細胞還是間充質細胞。除SSM外，尚有無血清HDM培養基，可用於細胞的特定成熟譜系階段，無論是上皮細胞還是間充質細胞。這方面的一實例為Kubota培養液，一種專為內胚層幹細胞/前驅細胞設計的無血清培養液，由基礎培養液（含有礦物質、胺基酸、糖、鹽、維生素、脂質的營養培養液）組成，不含銅和低鈣，並補充有胰島素、轉鐵蛋白/鐵和各種脂質，但沒有細胞因子或生長因子。該培養液可以支持來自肝臟、胰臟、肺和腸的內胚層幹細胞/前驅細胞。

如本文所用，“Kubota培養液”是指任何不含銅但含有鈣(>0.5mM)、硒、鋅、胰島素、轉鐵蛋白/Fe、與純化白蛋白結合的游離脂肪酸混合物，任擇地亦含有高密度脂蛋白（HDL）。在一些實施例中，Kubota培養液包含任何不含銅、低鈣（例如0.3 mM）、~10-9 M硒、~0.1％牛血清白蛋白或人類血清白蛋白（高純度和無脂肪酸）、~4.5 mM煙醯胺、~0.1 nM七水合硫酸鋅、~10-8 M氫化可的松（用於肝而非胰前驅細胞的任選成分）、~5 μg/ml轉鐵蛋白/鐵，~5 μg/ml胰島素，~10 μg/ml高密度脂蛋白，以及純化的游離脂肪酸混合物，將它們與純化的血清白蛋白結合後加入，之培養液（例如RPMI 1640或DMEM-F12）。該游離脂肪酸混合物由約100 mM的棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和硬脂酸組成。用於製備該培養液的非限制性例示性方法已在別處公開，如 , Kubota H, Reid LM,Proc. Nat. Acad. Scien. (USA) 2000; 97:12132-12137，其公開內容經由引用併入本文。

還有其他無血清HDM可以設計用於驅動幹細胞/前驅細胞至特定成熟細胞命運，如肝細胞（HDM-H）或膽管細胞（HDM-C）。這些HDM中的某些將在下文中進一步定義。在一些實施例中，該培養液可以是用於將細胞呈現或引入至指定環境的"接種培養液"。在其他實施例中，該培養液可以是用於促進細胞分化的"分化培養液"。

這種培養液由“基礎培養液”、營養素、礦物質、胺基酸、糖、脂質和微量元素的混合物組成（例子包括Dulbecco's Modified Eagle's Medium或DME和Ham's F10或F12和RPMI 1640，一種限定基礎培養液，由羅斯威爾公園紀念研究所建立。這些基礎培養液可補充血清（血清補充培養液或SSM）或經純化的激素、生長因子和營養素、激素混合的限定混合物、激素限定的培養液（HDM），並用於體外 維持細胞。如本文所用，“HDM-H”是用於類器官或用於單層培養物的HDM，其種於第IV型膠原和層黏連蛋白的基質上，以驅動內胚層幹細胞/前驅細胞朝分化為成熟肝細胞。HDM-C是是用於類器官或用於單層培養物的HDM，其種於第I型膠原和纖連蛋白基質上，以驅動細胞朝分化為成熟膽管細胞。

以下更詳細地描述特定的激素限定培養液（HDM）組成物： ●經修飾之 KM(MKM) : 以下所有三種HDM均使用KM進一步補充鈣，以達到0.6 mM的濃度，並補充10^-12 M銅和20 ng /ml FGF。 ●肝細胞分化（ HDM-L ）： ，用7 μg/L胰高血糖素、2g/L半乳糖、1 nM三碘甲狀腺素3（T3）、10 ng/ml制瘤素M（OSM）補充MKM；10 ng/ml表皮生長因子（EGF）、20 ng/ml肝細胞生長因子（HGF）和1 μm地塞米松(dexamethasone)。 ●膽管細胞分化（ HDM-C ）： 係補充具有20 ng/ml血管內皮細胞生長因子（VEGF）165和10 ng/ml HGF之MKM而製備。 ●用於胰臟分化的限定培養基（ PM 或 HDM-P ）： 使用不含氫化可的松(hydrocortisone )之MKM製備，並進一步補充2％之B27、0.1 mM抗壞血酸、0.25 μM環巴胺、1 μM視黃酸，前4天使用bFGF，並在剩餘時間內使用50 ng/ ml之exendin-4和20 ng/ml HGF代替。

基礎培養液是用於細胞培養的緩衝液，由胺基酸、糖、脂質、維生素、礦物質、鹽類、微量元素和各種營養素組成為組成物，模擬細胞周圍間質液之化學組成。另外，細胞培養液通常由補充有少量（通常2-10％）血清的基礎培養液組成，以提供驅動生物過程（例如，增殖、分化）所需的必需信號分子（激素、生長因子）。儘管血清可以與培養中使用的細胞類型自體同源，但最常見的是來自動物的血清，這些動物通常被屠宰用於農業或食品目的，例如來自牛、綿羊、山羊、馬等的血清。血清亦用於使酵素失活，該酵素作為組織解離過程的一部分。 從具有黏膜層和黏膜下層的組織中分離出多潛能 (multipotent) 細胞的方法

在另一態樣中，本揭示相關於一種從具有黏膜層或黏膜下層之組織分離出一或多種多潛能(multupotent)幹細胞/前驅細胞，該細胞表現一或多種希望之生物標記物，或其中至少一些或多數或大部分細胞表現該希望之生物標記物的細胞群的方法，包含： (a) 將實質上不含腸黏液的十二指腸黏膜層，與具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液，在可誘導黏膜層細胞產生滲透性休克的條件下接觸； (b) 藉由機械、手術及/或化學方法移除或溶解至少一部分黏膜層或其細胞，留下及/或暴露可包括黏膜下層的剩餘部分； (c) 消化或分解剩餘部分；以及 (d) 從消化的剩餘物中分離出一或多種BGSC或細胞群。

如本文所用，術語“滲透壓休克”是指相對於細胞內生理滲透壓，會導致細胞損傷的滲透壓變化。在一些實施例中，細胞會被滲透壓休克破壞，藉由在可誘導黏膜層細胞產生滲透性休克的條件下，施加具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液。具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液可為低張或低滲透壓或低滲透溶液，具有低於生理性滲透壓之滲透壓。具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液可為高張或高滲透壓或高滲透溶液，具有高於生理性滲透壓之滲透壓。具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液可以是任何類型的溶液。在一些實施例中，具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液可以是水、超純水、蒸餾水、5%葡萄糖溶液、高鹽溶液，以及類似物。

滲透壓休克可藉由將具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液，以可導致十二指腸擴張的量施加至空腔中，或藉由將這種培養液或溶液施加到組織的黏膜層來誘發。在一些實施例中，具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液可與空腔或黏膜層接觸約0.5分鐘、1分鐘、約2分鐘、約5分鐘、約10分鐘或約15分鐘。

在一些實施例中，從具有黏膜層或黏膜下層之組織分離出一或多種多潛能(multupotent)細胞或包含此類細胞之細胞群，其表現一或多種希望之生物標記物，的方法，包含進一步將混合物加工成細胞懸浮液。在一些實施例中，從具有黏膜層或黏膜下層之組織分離出一或多種多潛能(multupotent)細胞或包含此類細胞之細胞群，其表現一或多種希望之生物標記物，的方法，包含使用生理學上可接受的培養液進行一或多個洗滌步驟。

從具有黏膜層或黏膜下層之組織分離出一或多種多潛能(multupotent)細胞或包含此類細胞之細胞群，其表現一或多種希望之生物標記物，的方法，可用於從具有黏膜層或黏膜下層之任何合適組織中分離出多能幹細胞。在一些實施例中，該組織是內胚層組織。在一些實施例中，該組織選自於小腸、大腸、直腸。在一些實施例中，該組織選自於氣管、主支氣管、食道、胃和十二指腸。

在一具體態樣中，本揭示相關於一種從個體的十二指腸、其一部分或從其中取出的樣本中，分離出一或多種BGSC或包括BGSC的細胞群之方法，包含： (a) 移除腸黏液； (b) 在可誘導黏膜層細胞產生滲透性休克的條件下，施加具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液； (c) 藉由機械、手術及/或化學方法移除或溶解至少一部分黏膜層或其細胞，留下及/或暴露可包括黏膜下層的剩餘部分； (d) 向黏膜層及/或剩餘部分施加培養液或溶液，以實質上殺死、失活或移除病原體及/或致病性及/或有益微生物； (e) 對包括黏膜下層在內的剩餘部分進行消化或分解，以產生經消化、分解的細胞材料或細胞懸浮液； (f) 任擇地從細胞懸浮液中培養至少一些經消化、分解的細胞材料或細胞；以及 (g) 分離出其中的至少一些的、相當一部分的或大部分的細胞會表現Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組中之一或多者的細胞或細胞群；及/或會表現SOX17及PDX1二者之細胞。

如本文所用，術語“剩餘物”是指組織、其一部分或其樣本，其中黏膜層被部分或完全破壞及/或去除，因而暴露出黏膜下層。所需的多潛能(multipotent)細胞如BGSC，包含在剩餘的黏膜下層中。

在從個體的個體的十二指腸、其一部分或從其中取出的樣本中，分離出一或多種BGSC或包含BGSC的細胞群的方法的一些實施例中，該移除步驟係藉由化學破壞法進行，其包括使用乳化劑及/或界面活性劑。在一些實施例中，步驟（d）進行係以次氯酸鈉溶液消毒或滅菌。在一些實施例中，係以酵素進行消化。在分離出一或多種BGSC或包含BGSC的細胞群的方法的一些實施例中，該移除或溶解步驟後的剩餘部分包含黏膜下層，並且經消化的剩餘物包含組織片段。在分離出一或多種BGSC或包含BGSC的細胞群的方法的一些實施例中，組織或組織部分或樣本係於消化步驟（e）之前切碎。在分離出一或多種BGSC或包含BGSC的細胞群的方法的一些實施例中，分離步驟（f）係使用培養篩選法進行，所述培養條件包含無血清培養液，任擇地為Kubota培養液。在分離出一或多種BGSC或包含BGSC的細胞群的方法的一些實施例中，分離步驟（f）係使用培養篩選法進行，所述培養條件包含含血清之培養液。在分離出一或多種BGSC或包含BGSC的細胞群的方法的一些實施例中，該消化步驟（e）及/或分離步驟（f）係於低附著盤中進行。在分離出一或多種BGSC的方法的一些實施例中，經分離的細胞在支持或產生球狀體、一或多種類器官、細胞簇或細胞聚集體的懸浮液或3D條件下培養。

機械破碎/黏膜移除術可藉由移除黏膜層的各種可能程序和工具來完成。在一些實施例中，細胞表面層被剝除。已知許多不同的細胞層機械破碎方法，例如使用小珠子來剪切細胞壁、使用超音波破壞細胞壁、使用研缽和研杵研磨、使用攪拌器、使用冷凍和解凍循環、使用微波來破壞細胞壁內的鍵結並使蛋白質變性，或使用高壓，以及類似方法。

在分離出一或多種BGSC或包含BGSC的細胞群的方法的一些實施例中，該移除或分解步驟係以化學破壞法進行，其包含使用乳化劑，選自於由包含卵磷脂、單月桂酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯20）、單油酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯80）、單棕櫚酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯40）、單硬脂酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯60）、三硬脂酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯65）、磷脂酸銨、脂肪酸之鈉、鉀和鈣鹽、脂肪酸之鎂鹽、脂肪酸之單-和二甘油酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的乙酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的乳酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的檸檬酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的單-和二乙醯基酒石酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的乙酸酯與酒石酸酯之混合物、脂肪酸之蔗糖酯、蔗糖甘油酯、脂肪酸之聚甘油酯、聚蓖麻油酸聚甘油酯、脂肪酸之丙烷-1,2-二醇酯、熱氧化大豆油與脂肪酸之單-及二甘油酯之反應物、硬脂醯-2-乳酸鈉、硬脂醯-2-乳酸鈣、單硬脂酸去水山梨糖酯、三硬脂酸去水山梨糖酯、單月桂酸去水山梨糖酯、單油酸去水山梨糖酯、單棕櫚酸去水山梨糖酯及其組合之群組。

在分離出一或多種BGSC或包含BGSC的細胞群的方法的一些實施例中，該移除或分解步驟係以化學破壞法進行，其包含使用界面活性劑，選自於包含1-庚烷磺酸；N-月桂基肌胺酸、十二烷基硫酸鹽、1-辛烷磺酸和牛磺酸、苯扎氯銨、十六烷基吡啶、氯化甲基芐基銨、溴化十甲烯銨、烷基甜菜鹼、烷基醯胺基烷基甜菜鹼、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸鹽、磷脂醯膽鹼、N-癸基A-D-吡喃葡萄糖苷、N-癸基A-D-吡喃麥芽糖苷、N-十二基-B-D-麥芽糖苷、N-辛基B-D-吡喃葡萄糖苷、N-十四烷基B-D-麥芽糖苷、Tritons(Triton X-100）、Nonidet-P-40、泊洛沙姆188(Poloxamer 188)、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉及其組合之群組。

在一態樣中，本揭示相關於一種從個體的十二指腸取出的樣本中，分離出一或多種BGSC或包括BGSC的細胞群之方法，包含： (a) 在可誘導黏膜層細胞產生滲透性休克的條件下，將該黏膜層與具有超出生理範圍滲透壓性質的溶液接觸； (b) 藉由機械、手術及/或化學方法移除或溶解至少一部分黏膜層或其細胞，留下及/或暴露可包括黏膜下層的剩餘部分； (c) 將剩餘物與培養液或溶液接觸，以實質上殺死、失活或移除病原體及/或致病性及/或有益微生物； (d) 剩餘部分進行消化或分解，以提供細胞懸浮液； (e) 任擇地從細胞懸浮液中培養至少一些經消化、分解的細胞材料或細胞； (f) 分離出多潛能(multipoten)細胞或細胞群，其中至少一些或多數或大部分細胞表現有一或多種希望之生物標記物。

在一些實施例中，在可誘導黏膜層細胞產生滲透性休克的條件下，使黏膜層與具有超出生理範圍滲透壓性質的溶液接觸之前，係從組織或組織部分或樣本中移除黏液。

在另一態樣中，本揭示相關於一種從個體的十二指腸、其一部分或從其中取出的樣本中，分離出BGSC之方法，包含： (a) 消化或分解該十二指腸、其一部分或從其中取出的樣本，以提供經消化或分解的細胞材料； (b) 由該經消化或分解的細胞材料中獲得：(i)某種細胞或某一群細胞，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19之一或多者；及/或（ii）某種細胞或某一群細胞，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現SOX17和PDX1二者。

在分離出一或多種BGSC或包含BGSC的細胞群的方法的一些實施例中，該十二指腸、其一部分或從其中取出的樣本、剩餘物及/或經消化或分解的細胞或組織材料，或其組合物，係與消毒劑或滅菌用培養液、溶液或試劑接觸。

如本文所用，術語“消毒劑”包括破壞病原體及/或致病性及/或有益微生物（例如細菌、病毒和真菌）的所有培養液、溶液或試劑，並且還包括會殺死細菌或真菌孢子的培養液、溶液或試劑。在一些實施例中，該消毒劑是次氯酸鹽溶液。在一些實施例中，該消毒劑是具有約0.01%至約0.1%次氯酸鈉，或約0.1%至約0.2%次氯酸鈉的溶液。在一些實施例中，該消毒劑是0.01%次氯酸鈉溶液、0.02%次氯酸鈉溶液、0.05%次氯酸鈉溶液、0.1%次氯酸鈉溶液、0.15%次氯酸鈉溶液或0.2%次氯酸鈉溶液。在一較佳實施例中，該消毒劑是0.05%次氯酸鈉溶液。

或者，在一些實施例中，該消毒劑可以是培養液、溶液或試劑，選自於醇類、氫氧化鈉、醛、氧化劑、過氧化物和過氧酸、酚類、四級銨化合物、無機化合物（如氯、碘酸和檢、金屬）或萜烯等。如本文所用，消毒劑還包括抗生素，例如青黴素、多黏菌素、利福黴素(rifamycins)、利帕黴素(lipiarmycins)、喹諾酮或磺醯胺等。

本揭示發現將十二指腸、其一部分或從其中取出的樣本，與消毒劑或消毒培養液、溶液或試劑接觸，會導致獲得的包含BGSC的細胞群之BGSC，實質上不含病原體及/或不含致病性及/或有益微生物。生物學領域的普通技術人員將理解，生物和化學現象很少（如果有的話）完全及/或進展到完全，或達成或避免絕對結果。因此，術語“實質上”用於涵蓋許多生物和化學現象中固有的完整潛在缺乏性。例如，在一些實施例中，術語“實質上不含病原體及/或不含致病性及/或有益微生物”可指其中病原體及/或致病性和/或有益微生物的存在，處於某一含量的情況， 該含量可以是對於期望的用途而言是可接受的，或者可不阻止BGSC或包括BGSC的細胞群的預期用途，或者經由通常已知的方法在有興趣樣本中偵測不到。這些方法包括例如革蘭氏+、革蘭氏-、好氧和厭氧細菌的標準無菌度試驗、支原體和內毒素試驗。根據本揭示方法，術語“實質上不含病原體及/或不含致病性及/或有益微生物”，同樣適用從組織或組織部分或樣本獲得的BGSC以外的細胞或細胞群。

因此，本揭示的組成物可包含BGSC或包括BGSC的細胞群，該BGSC實質上不含病原體及/或不含致病性及/或有益微生物，並表現Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19之一或多者，以及表現SOX17和PDX1二者。

本發明組成物還可包含經分離的BGSC或其他多潛能細胞，或包含此類細胞的細胞群，以及生理學上可接受的培養液。如本文所用，術語“生理學上可接受的培養液”是指常規藥學實施用於配製藥物組成物，以投與個體例如人類患者的任何培養液。生理學上可接受的培養液可包含生理鹽水或含有葡萄糖和其他補充物，例如碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚醣、甘露醇；蛋白質；多胜肽或胺基酸如甘胺酸；抗氧化劑；維生素、螯合劑如EDTA或穀胱甘肽；佐劑（例如氫氧化鋁）； 和防腐劑的等張溶液。本發明組合物可配製為用於將BGSC或包括BGSC的細胞群注射到個體的循環系統中，或直接注射到標靶器官或組織中。

因此，本揭示相關於一種BGSC或包含BGSC的群的組成物，該BGSC實質上不含病原體及/或不含致病性及/或有益微生物，並表現Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19之一或多者，以及表現SOX17和PDX1二者，以及生理學上可接受的培養液。 使用經分離的布隆納氏腺 (Brunner’s Gland) 幹細胞 / 前驅細胞（ BGSC ）的方法

本文揭示的BGSC和/或包括BGSC細胞群係用於醫學治療。

例如，本揭示相關於一種治療被診斷患有涉及或影響肝、胰、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸和/或其他內胚層組織的疾病或症狀的個體的方法，包括投與有需要個體有效量的BGSC群。

在一些實施例中，本揭示相關於一種治療被診斷患有涉及或影響肝、胰、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸和/或其他內胚層組織的疾病或症狀的個體的方法，包含投與有效量之BGSC細胞群，其包括至少一些或多數或大部分BGSC，其表現一或多種標記物，該標記物選自於由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19，以及SOX17和PDX1二者組成之群組。

在另一態樣中，本揭示相關於一種自體細胞或基因治療的方法，包含投與有效數量的BGSC，或包含至少一些或多數或大部分BGSC的細胞群，其表現一或多種標記物，該標記物選自於Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19，以及SOX17和PDX1二者組成之群組，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖。在自體細胞或基因治療方法的一些實施例中，該細胞為經基因改造或修飾的細胞。

在另一態樣中，本揭示相關於一種同種異體細胞或基因治療的方法，包含投與有效數量的BGSC，或包含至少一些或多數或大部分BGSC的細胞群，其表現一或多種標記物，該標記物選自於Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19之一或多者，以及表現SOX17和PDX1二者，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖。在同種異體細胞或基因治療方法的一些實施例中，該細胞為經基因改造或修飾的細胞。

在另一態樣中，本揭示相關於一種表現一或多種標記物之BGSC的用途，該標記物選自於由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19，以及SOX17和PDX1二者組成之群組，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖，用於治療涉及或影響肝、胰、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸和/或其他內胚層組織的疾病或症狀，及/或用於自體或同種異體細胞或基因治療，任擇地使用經基因改造或修飾的細胞。

在另一態樣中，本揭示相關包含至少一些或多數或大部分BGSC的細胞群的用途，該細胞群表現一或多種標記物，該標記物選自於由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19，以及SOX17和PDX1二者組成之群組，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖，用於治療涉及或影響肝、胰、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸和/或其他內胚層組織的疾病或症狀，及/或用於自體或同種異體細胞或基因治療，任擇地使用經基因改造或修飾的細胞。

如本文所用，個體疾病之“治療(treating)”或“治療(treatment)”是指（1）預防在尚未表現出疾病症狀或顯示有限症狀的個體中發生症狀或疾病；（2）抑制疾病或阻止其發展；或（3）改善或引起疾病或疾病症狀的消退。如本技術領域中所理解的，"治療"是獲得有益或期望結果的方法，包括臨床結果。就本發明之技術目的而言，有益或期望的結果可以包括一或多種，但不限於，減輕或改善一或多種症狀、減少病症（包括疾病）的程度、使病症狀態（包括疾病）穩定（即 ，非惡化）、延遲或減緩症狀（包括疾病）進展、改善或緩解症狀狀態（包括疾病）和緩解（無論是部分還是全部），無論是可偵測還是不可偵測。

如本文所用，術語“有效的量”或“有效量”是指足以治療所述疾病或症狀的量。有效量可以一次或多次投藥、施加或劑量投與。此種傳送取決於許多變量，包括單獨劑量單位的使用時間、組成物的生物利用度、投藥途徑等。然而，應理解，任何特定患者的的組成物特定量可取決於多種因素，包括所用特定藥劑的活性、患者年齡、體重、一般健康狀況、合併症、性別和飲食、投藥時間、代謝和/或排泄速率、組成物組合、待治療的特定疾病或症狀（如 肝病）的嚴重程度和投藥形式。 實施本發明之模式

本文的揭示內容顯示：i）人類及/或動物之十二指腸包含細胞，包括布隆納氏腺(Brunner’s Gland)內的細胞，其在本文中稱布隆納氏腺(Brunner’s Gland)幹細胞/前驅細胞（BGSC），具有內胚層幹細胞/前驅細胞的表型性狀陽性，用於多能性或多潛能性標記物和幹細胞的其他生物標記物或“幹性(stemness)”；ii）這些細胞具有與黏膜隱窩內的腸幹細胞不同的表型，包括但不限於Tra-1-60、Tra1-81、OCT4和CK7之表現; iii）這些細胞也具有與肝幹細胞（其表現SOX17但不表現PDX1）和胰幹細胞（其表現DX1但不表現SOX17）的表型不同的表型，因為BGSC可表現SOX17和PDX1二者；iv）BGSC可經由化學、機械及/或外科手術或方法分離出，其至少部分地破壞黏膜上皮細胞（絨毛和隱窩），但至少部分地保持黏膜下層；v）BGSCs可於體外 選擇，它們顯示自我更新特性、形成和生長為球狀體、類器官、細胞聚集體或細胞簇的能力，並展現出多潛能性；vi）於體內 ，BGSC能夠植入組織並分化成與這些組織相關的譜系，例如移植到SCID小鼠的肝臟中，並分化為成熟肝細胞。

布隆納氏腺(Brunner’s Gland)是位於十二指腸黏膜下層的獨特黏液腺。這些腺體未在胃中發現，也未在小腸的其他部分（即空腸和迴腸）中發現，也未在大腸中發現。它們的主要已知功能在於產生黏液，其保護十二指腸黏膜免受來自胃的物質的酸性。布隆納氏腺(Brunner’s Gland)的數量從幽門口向十二指腸-空腸彎曲逐漸減少，在下行和上行十二指腸部分幾乎消失。在十二指腸壁中，布隆納氏腺(Brunner’s Gland)經由肌層黏膜 與腸道隱窩（和腺體）分開，但此二者具有直接的解剖學連續性。腸隱窩含有特定的幹細胞群，暗示腸上皮細胞沿著隱窩-絨毛軸的持續更新。

本文提供的數據證實，除黏液細胞外，布隆納氏腺(Brunner’s Gland)亦含有表現特定幹細胞標記物分佈的細胞群，例如SOX9、Lgr5、EpCAM、CD44，及/或SOX17和PDX1二者。這些細胞體積小、細胞質稀少、細胞核-對-細胞質比例高，以及其表型與胚胎腹側內胚層的形態相容。此外，這些細胞的受限亞群（接近5%）表現多能性的標記物，例如Oct4A、SOX2、Tra-1-60和Tra-1-81。此外，BGSC顯示增殖標記物PCNA的表現，因此說明它們的複製活性，可能涉及黏蛋白-產生細胞的更新。有趣的是，幹細胞標記物的表現是精確分佈的：多能性標記物在位於更深的腺泡中的細胞中表現，而Lgr5和PCNA則在靠近肌層黏膜 的細胞中表現並且與腸隱窩連續。這種分佈表明存在兩種不同但重疊的BGSC群體：一種群體具有原始表型，靜默並位於黏膜下層深處；另一種顯示短暫-倍增特徵，越過肌層黏膜 ，並且在空間上與腸隱窩相關。然而，“靜默”和短暫-倍增的BGSC群二者都顯示出表型(Lgr5^+/- /CK7⁺ /CK19⁺ /Tra-1-60⁺ )，清楚地將它們與腸道隱窩的(Lgr5⁺ /CK7^- /CK19⁺ /Tra-1-60- )細胞區分開來。

本文揭示的各態樣係相關於已發展為用於從人類十二指腸中分離BGSC或具有至少一些，或多數或大部分BGSC的群體的方法，包括：以化學、機械或手術破壞黏膜層至少部分移除表面上皮，留下可能暴露出黏膜下層的剩餘物；黏膜下層經消化或分解；分離出細胞或包括該細胞的細胞群，其表現本揭示中描述的標記物；該方法包括培養篩選條件，例如在無血清Kubota培養液中維持的球狀體、類器官、細胞聚集體或細胞簇的培養物。一旦分離，體外 細胞與描述該器官之表型(e.g., Lgr5^+/- /CK7⁺ /CK19⁺ /Tra-1-60⁺ /多能性基因⁺ )相匹配，證實細胞製備物中腸幹細胞的消耗。在體外 , BGSC能夠以球狀體、類器官、細胞聚集體或細胞簇的形式生長，並保持其未分化的表型，具有成熟細胞標記物的無效表現，並且沒有黏蛋白產生的證據。值得注意的是，當轉移到特定的分化條件時，BGSC能夠迅速成熟至各種命運，包括至少朝向肝細胞、膽管細胞和內分泌胰腺譜系。

有趣的是，先前的報導表明人類胃上皮細胞和十二指腸細胞並未顯示出幹細胞行為和多潛能性（請見表格），不具重新編程。相反地，本文揭示的結果證明，在人類和動物十二指腸內發現了幹細胞/前驅細胞（BGSC），包括布隆納氏腺(Brunner’s Gland)。鑑於它們在器官內的位置，這些BGSC或包括這些BGSC的細胞群可以使用本揭示中描述的方法容易地分離，並且不需要重新編程，但本質上顯示內胚層幹細胞/前驅細胞特徵、性質和能力，並且具有多潛能(multipotent)性質。

在此研究中，已測試了往成熟內胚層命運分化的能力。例如，BGSC已經由血管途徑注射到小鼠肝臟中。

在肝臟疾病領域，原位肝移植目前是治療急性肝衰竭和終末期慢性肝病的唯一療法。由於肝移植受到器官供體嚴重短缺的限制，因此細胞治療策略可代表在等待器官分配時支持肝功能的可行替代選擇。然而，用於肝臟疾病的再生醫學方法需要辨識出可持續且易於獲得的細胞來源。

本揭示提供了具有多潛能性(multipotent)的新型幹細胞區位，以及從出生後十二指腸中分離出適用細胞的流程。人類BGSC代表可從人類供體獲得的潛在可用來源。與重新編程細胞相較，細胞不需要基因重編程或主要操作，並且在臨床程序中應該更容易使用（且可能是更安全的方法）。此外，它們具有作為細胞來源的獨特潛力，可以使用內視鏡採樣，然後用於自體或同種異體細胞和基因療法。縮寫

AFP ，α-胎蛋白；ALB ，白蛋白；BTSCs ，膽管樹幹細胞；CD ，共同決定因素；CD44 ，透明質酸受器；CD133 ，prominin；CFTR ，囊性纖維化跨膜傳導調節因子；cGMP ，最新優良生產規範；CK ，細胞角蛋白；CXCR4 ，CXC-趨化因子受器4（也稱為fusin或CD184；也稱為血小板因子4；DAPI ， 6-二脒基-2-苯基吲哚；DPBS ， Dulbecco磷酸鹽緩衝生理食鹽水；EGF ，表皮生長因子；EpCAM ，上皮細胞黏附分子；FBS ， 胎牛血清（或FCS ， 胎牛血​​清）；FGF ，纖維母細胞生長因子（FGF 10是多種形式的FGF之一）；HBs ，肝母細胞；HDM ，激素限定的培養液；HDM-C ，一種用於將細胞譜系限制至膽管細胞的HDM;HDM-H ，一種用於將細胞譜系限制至肝細胞的HDM;HDM-P ， 一種用於細胞譜系限制至胰臟命運的HDM；HGF ，肝細胞生長因子;HpSCs ，肝幹細胞；IF ， 免疫螢光；IHC ， 免疫組織化學；KM ， Kubota培養液，專為內胚層幹細胞設計的無血清培養液； KRT ，細胞角蛋白基因；Lgr5 ，富含離胺酸的重複序列之G蛋白偶聯受器5，其與R-spondin結合； MKM ， 經修飾的Kubota培養液，由補充鈣、銅和bFGF的Kubota培養液組成；NANOG ，一種與自我更新密切相關的轉錄因子；NCAM ，神經細胞黏附分子；NIS ，鈉/碘同向轉運體；OCT4 ，（八聚體-結合轉錄因子4）也稱為POU5F1 （POU結構域，第5類，轉錄因子1），一種由幹細胞表現的基因；PBS ， 磷酸鹽緩衝生理食鹽水；PDX1 ，胰和十二指腸同源框1，一種對胰臟發育至關重要的轉錄因子；PBGs ，膽管周圍腺體、膽管樹幹細胞的幹細胞區位；RMPI ， 羅斯威爾紀念公園研究所-這個縮寫詞用於研究所研究人員建立的各種基礎培養液；RT-PCR ， 反轉錄聚合酶鏈反應；SALL4 ，Sal-樣蛋白4，被發現對幹細胞的自我複製很重要；SOX ，與Sry相關的HMG區塊；SOX2 ， 一種轉錄因子，對於維持胚胎和確定幹細胞的自我更新或多能性((pluripotency)是必須的。SOX9 ,與內胚層組織（肝臟、腸道、膽管樹和胰臟）相關的轉錄因子；SOX17 ， 肝臟分化必需的轉錄因子;VEGF ，血管內皮細胞生長因子。材料與方法 人類組織來源

人類十二指腸來自意大利羅馬Sapienza大學普通外科和器官移植科'Paride Stefanini'的器官捐獻者。從我們的移植計劃中獲得了將組織用於研究目的的知情同意。協議獲得了機構審查委員會的批准，並且處理符合最新優良生產規範（cGMP）。該研究方案由羅馬的Umberto I Policlinico倫理委員會審查和批准。培養液與溶液

將所有培養液無菌過濾（0.22-μm過濾器）並在使用前於4℃保持在黑暗中。RPMI-1640（所有細胞培養物的基礎培養液）和胎牛血清（FBS），獲自GIBCO/Invitrogen（Carlsbad，CA）。除非另有說明，否則所有試劑均購自Sigma（St.Louis，MO）。除了特別標註者之外，生長因子購自R＆D Systems（Minneapolis，MN）。

Kubota 培養液（ KM ） 由任何基礎培養液（此處為RPMI 1640）組成，不含銅、低鈣（0.3 mM）、10^-9 M硒、0.1％牛血清白蛋白（BSA）、4.5 mM煙醯胺、0.1 nM硫酸鋅七水合物、10^-8 M氫化可的松（或地塞米松）、5 μg/ml轉鐵蛋白/鐵、5 μg/ml胰島素、10 μg/ml高密度脂蛋白，並加入游離脂肪酸混合物，其與純化的人類血清白蛋白結合。其製備的詳細流程首先由Kubota和Reid報導為肝母細胞的限定培養基² 。此後，Kubota培養液對小鼠、囓齒動物和人類肝幹細胞、膽管樹幹細胞、肝母細胞、膽囊來源的幹細胞和胰臟前驅細胞皆有效^3-9 。

對於分化研究，無血清KM補充有鈣（終濃度：0.6mM）、銅（10^{-12 M} 和20 ng/ml bFGF，並稱為經修飾的Kubota培養液（MKM）。使用MKM作為基礎並使用特定的補充物來製備不同的激素限定培養液（ HDM ） ，用於誘導BG細胞向肝臟（HDM-H）與胰島（HDM-P）命運的選擇性分化： • 用於肝分化的HDM-H：係以補充有7 μg/L升糖素、2 g/L半乳糖，1 nM三碘甲狀腺素3（T3）、10 ng/ml制瘤素M（OSM）；10 ng/ml表皮生長因子（EGF）、20 ng/ml肝細胞生長因子（HGF）和1 μm地塞米松之MKM製備。 • 用於胰島細胞分化的HDM-P：不含氫化可的松之MKM，補充2％之B27、0.1 mM抗壞血酸、0.25 μM環巴胺、1μM視黃酸；在前4天加入bFGF，然後以50 ng / ml之exendin-4 和20 ng/ml之HGF取代。磁性分選流程

藉由使用磁珠免疫篩選法，以製造商（Miltenyi Biotec Inc.，Germany）說明的流程，對細胞進行EpCAM或TRA-1-60的分選。簡而言之，用EpCAM MicroBeads（Miltenyi Biotec Inc.，目錄號130-061-101）或TRA-1-60 MicroBeads（Miltenyi Biotec Inc.，目錄號130-100-832）磁性標記陽性細胞。然後，將細胞懸浮液上載到MACS LS管柱（Miltenyi Biotec Inc.，目錄號130-042-401）上，該管柱置於MACS分離器的磁場中。經磁性標記的細胞保留在管柱內，而未標記的細胞通過。從磁場中除去管柱後，磁性保留的細胞沖提出，為陽性篩選細胞分液。如前所述，經由細胞計數和細胞存活評估陽性細胞。將陽性細胞以300,000個細胞/ml的濃度懸浮於基礎培養液中，使用作為最終的細胞懸浮液。收集含有約200,000個細胞的4個等分試樣用於流式細胞術。在 GMP 條件下的細胞分離和無菌測試

為了在cGMP條件下生產BG幹細胞/前驅細胞，以供將來臨床應用，將十二指腸按照“歐盟醫藥產品規則”和歐洲人類用醫藥產品優良生產規範指南進行加工 (EudraLex - Volume 4 Good manufacturing practice Guidelines)。無菌測試在cGMP條件下，藉由“直接接種法”並根據用於人類和獸醫用途的醫藥產品優良生產規範指南進行。細胞培養和選殖倍增

將從十二指腸標本獲得的未分選和分選的細胞（大約3×10⁵ ）接種到3 cm直徑的塑膠培養盤上，並在含有10%FBS的KM中保持過夜（~12小時）。然後將細胞培養物保持在無血清KM中並觀察至少2個月。為了測試選殖倍增，獲得單細胞懸浮液，並且在無血清KM（自我複製培養基）中，以500個細胞/cm² 的選殖接種密度接種細胞。類器官的製備與培養

離心後，將細胞沉澱懸浮於KM中，將3×10⁵ 細胞置於12-孔之2.2 cm直徑的塑料培養盤中，並在含有10％FBS的KM中保持過夜（~12小時）；此後，向培養物提供無血清KM。將細胞置於KM中，於37℃的培養箱中培養，用大氣中的氧氣和5％ CO₂ 培養1週，因而獲得更多的細胞群。7天後后，從12-孔盤中取出細胞，將細胞沉澱物包埋在400μl冷Matrigel中(Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced，不含酚紅)。本申請人種入400 μl體積的凝膠，每個12孔盤含有2×10⁵ 個細胞。聚合（15分鐘，37℃）後，以500 μl類器官培養液覆蓋該凝膠。類器官培養液以Ad-DMEM/F12（Life Technologies為基礎），補充有B27、N2（Life Technologies）和1.25 mM之N-乙醯半胱胺酸（Sigma-Aldrich）、10 nM胃泌素（Sigma-Aldrich）和生長因子：50 ng/ml EGF（Peprotech）、1 μg/ ml重組人R-Spondin-1（Perotech）、100 ng/ml FGF10（Peprotech）、25 ng/ml HGF（Peprotech）、10 mM煙醯胺（Sigma-Aldrich）、5 μM之MA83-01（Tocris）和10 μM之Forskolin（FSK）。本申請人每2-3天更換一次培養液，以顯微鏡技術控制器官的大小和數量。

10-14天後，使用細胞回收溶液（Corning）和冰冷的PBS，從Matrigel中移出類器官。以細胞回收溶液（Corning）輕輕破壞培養凝膠中的類器官，以將Matrigel破碎成小片段，同時保留整個球體的類器官。然後輕輕地離心類器官，以獲得在管底部收集的完整類器官。以移液管除去大部分上清液，以4%甲醛固定類器官沉澱物，用於進一步分析。陽性控制組

NTERA-2株D1多能人類胚胎細胞株（Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA;代碼：01071221），係使用作為多能性標記物（SOX2、OCT4A和NANOG）的陽性對照組，用於流式細胞術、細胞培養和RT-PCR實驗¹⁰ 。此外，人類精原細胞瘤睾丸的片段已被使用作為多能性標記物的陽性對照組，用於免疫組織化學實驗。

HT-29，一種人類結腸腺癌細胞株（LGC Standards S.r.L，Milan，Italy;代碼：ATCC-HTB-38）使用作為Lgr5抗體的陽性對照組，用於流式細胞術和RT-PCR實驗。正常的胰島細胞已被使用作為胰島分化實驗的對照組，購自ProdoLab，Irvine CA US（HIR-001）。

初代人類肝細胞(Clonetics™ Human Hepatocyte Cell Systems NHEPS™ Cells, 代碼: CC-2591S)已購自Lonza（Basel，Switzerland），並使用作為肝細胞分化實驗的陽性對照組。

正常的胰島細胞已被使用作為胰島分化實驗的對照組，購自ProdoLab，Irvine CA US（HIR-001）。光學顯微鏡（ LM ）、免疫組織化學（ IHC ）和免疫螢光（ IF ）

將樣本在10％緩衝甲醛中固定2-4小時，包埋在低溫融合石蠟（55-57℃）中，並且用蘇木精-伊紅和天狼星紅/快速綠色(Sirius red/Fast green)染色3-4μm切片，依據標準流程。就IHC而言，藉由在甲醇之過氧化氫溶液（2.5%）中靜置30分鐘，來阻斷內源性過氧化酶活性。如供應商所示，藉由在室溫下施加蛋白酶K（Dako，代碼S3020）10分鐘來回收抗原。然後將切片在4℃下與一級抗體靜置過夜(補充表格 1 )。將樣本以PBS潤洗兩次，每次5分鐘，在室溫下與二級生物素化抗體（LSAB+System-HRP，Dako，代碼K0690; Glostrup，Denmark）靜置20分鐘，然後與鏈黴抗生物素蛋白-HRP（LSAB + System-HRP，Dako， 代碼K0690）靜置。二氨基聯苯胺（Dako）作為受質，且該切片以蘇木精複染。就細胞培養物之免疫螢光而言，將載玻片室於室溫下之丙酮中固定10分鐘，然後以PBS-Tween 20潤洗。非特異性蛋白質結合以5％正常山羊血清阻斷。將經固定的細胞與一級抗體一同靜置。然後，洗滌細胞，並與經標記的同種型特異性二級抗體（抗小鼠AlexaFluor-546、抗小鼠Alexafluor-488、抗兔Alexafluor-488、抗山羊AlexaFluor-546，Invitrogen, Life Technologies Ltd, Paisley, UK）靜置1小時，並使用4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）複染，以可視化細胞核。對於所有免疫反應，亦包括陰性對照組，係由免疫前血清取代一級抗體。藉由配備有Jenoptik Prog Res C10 Plus Videocam (Jena, 德國)的Leica Microsystems DM 4500 B Light and Fluorescence Microscopy (Weltzlar, 德國)，以編碼方式檢查切片/培養物。亦藉由共聚焦顯微鏡（Leica TCS-SP2）分析IF染色。LM、IHC和IF觀察，係使用圖像分析系統（IAS-Delta Sistemi，Roma-Italy）處理，並由兩位研究人員以盲目方式獨立完成。

由BGs佔據的面積由圖像分析系統（IAS-Delta Sistemi，Rome-Italy）評估。使用它，本申請人確定BG佔據的體積計算為腺體腺泡佔據的總面積，並以相對於十二指腸黏膜下層的百分比表示。所有計數均在每個載玻片的六個非重疊區域（放大倍數x20）中進行；從每個樣本中取出至少3個不同的載玻片。

就IHC/IF染色而言，就每一載玻片/培養物而言，係於六個非重疊區域（放大倍數×20）中以隨機、盲法的方式計數陽性細胞，數據以％陽性細胞表示。IF染色也以數字掃描儀（AperioScanscope FL System，Aperio Technologies，Inc，Oxford，UK）掃描，並由ImageScope處理。使用圖像分析算法來量化單一螢光團的陽性像素面積的比例，或具有兩個螢光團的共定位的面積。為了測試糖原-儲存能力，根據製造商的程序使用Periodic Acid-Schiff（PAS）染色系統（Sigma Aldrich，INC，目錄號395）和α-澱粉酶（Sigma Aldrich，INC，目錄號A 3176）消化流程（隨後使用PAS染色劑)。流式細胞儀（ FC ）分析

細胞培養物以胰蛋白酶消化、經溫和移液解離出，並以約2×10⁵ 個細胞/ ml懸浮於PBS中。分離出的細胞以螢光一級抗體或同種型對照物標記。就細胞內抗原而言，在與一級抗體靜置之前，將細胞固定在4％多聚甲醛中，並以PBS-Saponin 0.5%-FCS 10%穿透化。一級抗體包括EpCAM（EpCAM-FITC，MiltenyiBiotec Inc.，目錄號130-080-301）、Lgr5（Lgr5-PE，Origene Technologies Inc.，Rockville，MD，USA目錄＃TA400001）、TRA-1-60（TRA） -1-60-PE，MiltenyiBiotec Inc.，目錄號130-100-347）。經由BD FACScanto^TM 流式細胞儀（Becton，Dickinson and Company，NJ，USA）分析細胞。經由BD FACSDiva^TM 軟體（Becton，Dickinson and Company，NJ，USA）獲得並分析了一萬個案件。反轉錄聚合酶鏈反應（ RT-PCR ）分析

針對在無血清KM中維持6天然後在KM或HDM之一者中再培養7天（總共13天）的組織或培養物，進行RNA萃取。藉由Chomczynski和Sacchi¹¹ 的程序萃取總RNA。如前所述，以配備有RNA StSens分析晶片（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）的Experion Automated Electrophoresis System RNA，評估RNA的品質和含量。針對在無血清KM中維持6天然後在KM或HDM之一者中再培養7天（總共13天）的組織或培養物，進行RNA萃取 白蛋白（ALB）、細胞色素P450（CYP3A4）、胰島素（INS）、升糖素（GLUC）、PDX-1、SOX17、OCT4A、SOX2和NANOG基因的表現，係藉由在密閉管進行的反轉錄和PCR倍增反應 (OneStep RT-PCR by Qiagen, Hamburg, Germany) ，係以從細胞和組織中萃取的總RNA樣本進行。這些基因與使用作為參考物之GAPDH管家基因一同倍增。藉由以Experion System（Bio-Rad，UK）進行晶片上毛細管微電泳，定量出倍增子，來測量基因表現。目標基因的表現，係藉由計算目的基因和參考基因GAPDH的濃度比率而得（經由儀器以nmol/L報告）(補充表格 2 )。 將 BGSCs 體內 移植到正常小鼠的肝臟中。

將5隻SCID（嚴重聯合免疫缺陷）雄性小鼠飼養在平均恆溫22℃，12小時光暗循環的室內，並自由獲取標準的顆粒飼料和水。研究方案以符合我們的機構指南方式進行。實驗程序經羅馬Sapienza大學歐盟指令2010/63/EU和羅馬Umberto I大學醫院（Prot。＃：541）的動物實驗倫理委員會批准。將2×10⁶ 人類BGSC於100 μl生理食鹽水中的懸浮液，經由脾動脈注入肝臟。偽對照小鼠僅注入100 μl生理食鹽水。密切監測所有動物直至恢復，並允許自由獲取食物和水。沒有觀察到死亡率。

移植一個月後，犧牲動物，取得它們的肝臟。將肝片段置於10％緩衝甲醛中，用於組織學和免疫組織化學，並置於Trizol試劑中用於基因表現分析。分別在蘇木精和伊紅（H＆E）和天狼星紅染色中評估壞死和纖維化情況。經由免疫組織化學法，以及抗人類抗體（抗人類線粒體、抗人類HepPar-1、抗人類白蛋白），其不與其他地方描述的小鼠抗原反應，評估鼠類肝中的人類BGSC植入情況。以ImageScope處理的數字掃描儀（Aperio Scanscope CS System，Aperio Technologies，Inc，Oxford，UK）掃描免疫組織化學染色的（抗人類線粒體）載玻片。以圖像分析演算法量化抗人類線粒體陽性細胞佔據的面積比例。

如前所述進行小鼠中人類白蛋白的RT-PCR。簡言之，藉由使用Universal Probe Library Assay Design Center（Roche），將人白蛋白的特異性引子(補充表格 2 )設計為可編程的特異性序列，以特異性地區分人類白蛋白基因與鼠類基因。統計分析

數據以平均值±標準偏差（SD）表示。經由SPSS統計軟體（SPSS Inc. Chicago IL，USA）進行統計學分析。藉由通過Mann-Whitney U檢驗測試了非常態分佈參數的組別間差異。統計顯著性設定為p值>0.05。實例 1- 從黏膜中分離出細胞

包含肝胰壺腹和胰臟的人類十二指腸，從來自意大利羅馬羅馬大學的普通外科和器官移植科'Paride Stefanini'的器官供體獲得。經由我們的移植計劃獲得了將組織用於研究目的的知情同意。所有樣本均來自19至73歲的成年人。協議獲得了我們的機構審查委員會的批准，並且處理符合最新優良生產規範（cGMP）。該研究方案由羅馬Umberto I大學醫院倫理委員會審查和批准。小心地將人類十二指腸與胰臟分離，並且經由外科手術除去含有肝胰壺腹的腸。用手術刀將十二指腸切成薄片。然後如前所述處理組織樣本。簡而言之，組織在補充有0.1%牛血清白蛋白、1 nM硒、抗生素、第I型膠原酶（300 膠原消化單位/ ml）（Sigma-Aldrich意大利）、0.3mg/ ml去氧核糖核酸酶（Sigma-Aldrich，義大利）的RPMI 1640中進行消化，在37ºC，頻繁攪拌30-45分鐘。 將懸浮液通過800微米金屬篩過濾器（IDEALE ACLRI9 inox不銹鋼）過濾，並在重新懸浮之前以270 g旋轉10分鐘。然後，將細胞懸浮液連續通過100和30微米篩網過濾器; 然後，經由Fast-Read 102（Biosigma Srl，Venice，Italy）進行細胞計數，並經由Trypan Blue 試驗進行細胞存活計數（以活細胞相對於總細胞的%表示）。先前開發並成功用於肝臟和膽管樹的相同方法，當用於人類十二指腸時，反而導致產生巨大聚集體。這些巨大聚集體含有包覆和破碎的細胞，其不斷地（N=10）產生無法存活的分離細胞，且使其無法獲得細胞培養物。據推測，這是由於該經消化組織的物理和化學性質，其中黏液和黏膜上皮細胞釋出的降解產物高度飽和，這導致一種分子網結合細胞，這些細胞在手術過程中會被壓碎。實際上，在動物或人類中建立的從腸中分離出細胞的方法，可避免黏膜上皮的破壞。

藉由該方法獲得的培養物的另一個特徵是經常被污染（6/10）。由於這些結果，採用的策略是將黏膜上皮細胞與黏膜下層分離，以保持布隆納氏腺體(Brunner’s Gland)，並避免上述微生物污染問題。嘗試了四種不同的策略：1）手術切除（N=3），2）藉由先在黏膜下方注射生理鹽水（N = 3）進行黏膜切除術，3）刮擦黏膜（N=3），4）選擇性溶解黏膜（N=10））。除了經由注入腸腔的特定界面活性劑溶液選擇性溶解十二指腸黏膜之外，所有方法都證明是不合邏輯的且會產生與初始方法相同的結果。不成功和次佳的分離程序

小心地將人十二指腸與胰臟分離，並經由外科手術除去含有肝胰壺腹的腸的整個部分。用手術刀將十二指腸切成薄片。此後，在補充有0.1％牛血清白蛋白、1 nM硒、抗生素、第I型膠原酶（300膠原消化單位／ml）（Sigma-Aldrich Italy）、0.3 mg/ml去氧核糖核酸酶（Sigma-Aldrich，意大利））的RPMI 1640中消化組織樣本、在37ºC ，頻繁攪拌30-45分鐘。將懸浮液通過800微米金屬網過濾器（IDEALE ACLRI9 inox不銹鋼）過濾，並在重新懸浮之前以270 g旋轉10分鐘。然後，將細胞懸浮液連續通過100和30微米篩網過濾器；之後，經由Fast-Read 102（Biosigma Srl，Venice，Italy）進行細胞計數，並通過Trypan Blue檢驗進行細胞存活計數（以活細胞相對於總細胞的%表示）。

當在人類十二指腸（N=5）中使用時，先前開發並成功用於肝臟和膽管樹的相同方法，會導致40,816,000個（標準偏差）細胞的分離，且在Trypan Blue試驗僅有一半是活的（生存能力43+/-12.8%）。不管活細胞的數量如何，分離的細胞不能在培養物中黏附和存活，其中含有包覆和破碎細胞的巨大聚集體出現，並導致細胞死亡，使其無法獲得細胞培養物。此外，藉由該方法獲得的培養物總是被污染（5/5）。

這種不成功的結果可能是由於該經消化組織的物理和化學性質，其中黏液和黏膜上皮細胞釋出的降解產物高度飽和，這導致一種分子網結合細胞，這些細胞在手術過程中會被壓碎。

另一個關鍵點是黏膜層內存在腸幹細胞區位（腸隱窩）。鑑於這些發現，我們選擇將黏膜上皮與黏膜下層分開。這些是經由4種不同的策略完成的：1）手術切除（N=3），2）在黏膜下方注射生理鹽水（N=3）後進行黏膜切除術，3）刮擦黏膜（N=3），和4）選擇性溶解黏膜層（N=10）。在移除黏膜方面的最佳策略是策略＃4，因為策略＃1-3導致在腸隱窩存在的情況下，僅部分去除黏膜層(圖 11 )。此外，策略＃4在細胞分離和存活方面產生最佳方法。藉由注入腸腔的特定界面活性劑溶液選擇性溶解十二指腸黏膜。

在分離胰頭附近的十二指腸後，完全除去Vater的壺腹，並通過用手術鉗夾緊來封閉腸。十二指腸的末端被打開；經由從上到下按壓組織，從下切口擠出腸黏液，除去腸黏液。這部分操作非常重要，因為組織應盡可能不含黏液。使用25ml血清移液管，從上肢切口將約200 ml蒸餾水（意大利Gibco）沖入十二指腸；下端切口保持夾緊以收集水(圖 8A )。此後，藉由夾住兩個末端約20分鐘，使腸完全充滿蒸餾水，以誘發對於黏膜上皮細胞具有選擇性的滲透損傷。以這種方式，十二指腸看起來會變得粗糙(圖 8B )。打開下端並除去水後，以25 ml血清移液管將內十二指腸以100 ml之DPBS（Gibco）洗滌兩次。使用25ml血清移液管，從上肢切口將約200 ml DPBS（Gibco，Italy）沖入十二指腸。採用類似的程序填充內十二指腸，並以0.5 ml磷脂醯膽鹼（Sigma-Aldrich，義大利）、20 mg去氧膽酸（Sigma-Aldrich，義大利）組成的界面活性劑溶液（100ml）、99.5ml DPBS（Gibco，義大利）保持填充1分鐘。藉由打開下端再次除去溶液，以100 ml DPBS洗滌內十二指腸。最後，將十二指腸轉移到10 cm無菌培養盤中，並經由縱向切口打開(圖 8C )。

在上/下和橫向方向使用無菌手術刀，使黏膜進一步剝離，密切注意從組織的小褶皺（折疊）移除黏液。將組織在含有100 ml DPBS（Gibco，義大利）的無菌容器中洗滌。將組織浸沒在200 ml之0.05%次氯酸鈉中幾秒鐘，之後以DPBS溶液潤洗，獲得無菌分代。之後，以無菌剪刀和手術刀將組織切成小塊。在移除黏膜的機械和化學程序之後，收集樣本並進行組織形態學分析。然後如前所述處理組織樣本(圖 8D )。簡言之，將組織碎片收集在裝有消化緩衝液的兩個M管（Milteny Biotec，Germany）中並搖動。為了達到組織的分解狀態，進行MACS Dissociator（Milteniy Biotec，Germany）的程序的一或兩個循環（應注意溶液的不透明性以及產生非常小的組織塊）。將消化緩衝液預熱至34℃（酵素具有最佳效率的溫度），10分鐘。在機械解剖後，將含有組織片段的溶液稀釋於含有DTT（Sigma-Aldrich，義大利）的溶液中（參見下面組成物的細節），並置於兩個50 ml Falcon管中。將Falcon管以1,300 rpm（300g）離心5分鐘。收集沉澱，並在150 ml消化緩衝液存在下置入75平方厘米的培養瓶中。以封口膜（Parafilm，US）密封燒瓶，並水平放置在37⁰ C和 5% CO₂ 的水浴加熱器中約30分鐘，不時搖動，以控制消化情況。然後將燒瓶垂直放置約10分鐘，讓細胞藉由重力沉澱。溶液表面的漂浮上清液含有雜質，可以10 ml血清移液管丟棄。

酵素消化後，將含有組織片段的緩衝液置於四個50 ml Falcon管中。將Falcon管以1,300 rpm（300g）離心5分鐘。將沉澱收集到兩個50 ml Falcon管中，並以含有DTT的溶液稀釋（參見下面組成物的細節），然後將管在1,300 rpm（300g）下離心5分鐘。收集上清液並置於800微米金屬網過濾器（IDEALE ACLRI9 inox不銹鋼）上，以新鮮細胞洗滌液過濾。將濾液材料收集在無菌容器中。使用刮刀和注射器的柱塞（Terumo＃SS-20ES2）加速通過，並在過濾期間進一步解剖組織。使用兩瓶DNase Pulmozyme 2500 U/2.5ml（Roche，義大利）(圖 8D )處理所得懸浮液，平均為200 ml。從胎兒十二指腸中和對成人個體進行的內視鏡十二指腸切片，分離出 BGSC 。

從十二指腸切片和胎兒器官中分離出BGSC之方法，與從成人完整十二指腸獲得細胞之最佳化流程相較，較不複雜。

在轉譯和精準醫學部的胃鏡檢查期間，使用鑷子在球莖水平和遠端進行十二指腸切片。受過訓練的胃腸病學家使用該方法來獲得材料，用於廣範圍疾病。該過程在內視鏡下以可撓性內視鏡完成。內視鏡經口導入。目視取得切片，因而可避開任何動脈或靜脈。所收集的切片的組織學檢查，顯示BG存在於取自球莖的切片中，但不存在於遠端十二指腸中(圖 15A ); BG位於肌層黏膜下方的黏膜下層。然後，在該過程中收集每位患者的十二指腸球莖的2-4個切片，並用於分離出細胞。

胎兒十二指腸自胎兒取得(18週-22週：在胎兒和婦產科進行治療性流產)，藉由在幽門水平向近端並在特雷茨韌帶遠端水平切割。藉由在肝胰壺腹水平位置消除它們，來除去胰臟和胰臟內膽管。

隨後，以手術刀和MACS解離器（Miltenyi Biotec）進一步輕柔切下整個胎兒十二指腸或整個十二指腸切片，並在含有300 U/ml第I型膠原酶（Sigma Aldrich）和0.3 mg/ml去氧核糖核酸酶（Sigma Aldrich）的緩衝液中進行消化。在37℃下保持20-30分鐘。使用磁珠（Miltenyi biotec）對新鮮分離的細胞進行TRA1-60-陽性細胞的免疫篩選。

分選使從胎兒十二指腸（N=3）中分離出平均1200萬個活細胞，和來自十二指腸球莖切片的100,000個活細胞（N=2）。分離程序期間平均為5小時。將細胞以1百萬個細胞/ml懸浮於無菌10%葡萄糖溶液中，並在4℃的控制溫度下保持45分鐘，然後進行培養。根據此流程的自我複製布隆納氏腺(Brunner’s Gland)細胞顯示在圖 15B 。所有程序均按照“歐盟醫藥產品管理規則”和歐洲人類用醫藥產品GMP指南（EudraLex-第4卷優良生產規範指南）進行。經由標準無菌試驗評估細胞產物對革蘭氏+、革蘭氏-、好氧和厭氧細菌、真菌和內毒素試驗，並立即經由流式細胞術（FC）對TRA1-60（Miltenyi Biotec，人類；稀釋度1:50）進行鑑定。實例 2- 組織和細胞的鑑定 人類十二指腸組織的研究

成人十二指腸（N=10）的黏膜上升為腸絨毛並折疊在腸腺（隱窩）中，所述腸腺可以橫向切割並在固有層深處觀察到(圖 1A )。在十二指腸的近端部分（上行和下行），黏膜下層包含腺體單元（十二指腸腺體或布隆納氏腺(Brunner’s Gland)：BGs），其總共佔黏膜下層面積的9.95±2.68%和總壁面積的4.62±1.93%。BG主要由PAS陽性黏液細胞組成(圖 1A )。經由肌層黏膜 ，BG與腸隱窩具有解剖學連續性。少數BG腺泡位於黏膜的固有層 內，並且與腸隱窩連續(圖 1A )。在十二指腸的遠端部分（下行和上行）中，BG逐漸消失，下部僅有少數腺體單元（約1個每20倍區域），而在上升部分幾乎沒有腺體。

在人類十二指腸中，免疫組織化學分析顯示BG細胞和腸隱窩部分地共享表型性狀。至於細胞角蛋白的表腺，腸隱窩和BG均為CK19陽性；相反地，CK7由一些BG細胞特異性表現，但不由腸腺表現(圖 1B 和圖 9 )。腸腺和BG均含有表現SOX9（內胚層幹細胞的標記，圖 1C )的細胞；在BG中，SOX9在相同細胞中與CK7共表現。

此外，腸腺和BG包含表現PCNA，一種增殖標記物，和幾種其他幹細胞/前驅細胞標記物，例如CD44、EpCAM和Lgr5(圖 2A )的細胞。在BG中，Lgr5與SOX9共定位，並且其在位於肌層黏膜 內的腺泡中的表現更強，且其與腸隱窩的連續性比在黏膜下層內更深處的腺泡中更高(圖 10A )。

BG細胞的亞群表現多能性標記物(圖 2 )。有趣的是，Tra-1-60和Tra-1-81由BG細胞表現，但不由腸隱窩中的細胞表現(圖 2A )。Tra-1-60與SOX2和Oct4A共定位於相同的BG細胞中(圖 2B )。最後，BG含有表現NIS的細胞，NIS也由腸隱窩表現(圖 10B )。

總之，幹細胞/前驅細胞標記物表現的半定量分析顯示，BGs包含一區位，由 SOX9⁺ (9.12% ± 3.30) 細胞和增殖細胞(PCNA⁺ : 4.82% ± 1.33)組成。此外，BGs的區位包含表現內胚層幹細胞性狀的細胞，如Lgr5（4.76％±1.04）、EpCAM（8.80％±0.65）；約5%的細胞表現多能性標記物，如Tra-1-60、Tra-1-81、Oct4A和SOX2。有趣的是，在與腸腺細胞(SOX9⁺ /Lgr5⁺ : 11.80% ± 4.40; PCNA⁺ : 5.95% ± 2.25; p> 0.05)直接連續的腺體腺泡中的PCNA⁺ /SOX9⁺ /Lgr5⁺ 細胞數量，比位於黏膜下層深處的那些(SOX9⁺ /Lgr5⁺ : 4.80% ± 1.50; PCNA⁺ : 0.98% ± 0.62; p> 0.05)更多。相較之下，位於黏膜下層深處的腺泡中的多能細胞更多。 囓齒動物十二指腸組織的研究

與人類一樣，囓齒動物十二指腸含有黏液腺，位於黏膜下層。囓齒動物SGs與腸道隱窩直接相連，沒有完整的肌肉黏膜。由於黏液含量導致它們具有清晰的細胞質，因此它們與隱窩不同(圖 13A )。SG僅侷限於囓齒動物十二指腸的近端部分。當研究SOX9和PCNA的表現時，SOX9+細胞存在於SGs中，而PCNA+細胞主要位於隱窩（26.1±5.7％），只有少數SG細胞為PCNA陽性（6.7±2.2％;與隱窩相較，p >0.01））。十二指腸SGs和隱窩的Ck19表現亦不同，前者幾乎為陰性而後者為陽性(圖 13A )。在小鼠空腸中，隱窩含有SOX9+、PCNA+和Ck19+的細胞(圖 13B )。基於這種表型分布和SGs內PCNA+細胞的低百分比，我們引入了Krt19CreTdTomatoLSL小鼠譜系追踪模型，以評估SG的更新是否由在十二指腸隱窩內的Ck19+/PCNA+細胞開始進行。首先，分析空腸以估計腸隱窩中的重組效率 (圖 13C )。td-Tomato（Td-Tom）-陽性隱窩的百分比為72±6％，陰性隱窩位於陽性隱窩旁邊。td-Tom+隱窩上面的絨毛總是導致td-Tom陽性，因此，位於td-Tom-隱窩上方的絨毛是td-Tom陰性。當測試小鼠十二指腸時，Ck19-SG幾乎都是td6Tom-，包括位於130td-Tom+隱窩下方的細胞 (圖 13C )；並且一致地，SG內的PCNA+和SOX9+細胞是td-Tom-(圖 13D )。總之，這些數據表明囓齒動物SGs中的細胞增殖率低於十二指腸隱窩。此外，在生理條件下，十二指腸隱窩細胞不支持SG更新，並且SG中的SOX9+和PCNA+細胞並非來自Ck19+隱窩細胞。 成功的BGSC分離和培養程序

在如實例1中對十二指腸組織進行化學和機械處理之後，移出表面上皮和黏膜層的幾乎所有隱窩，同時保留固有層和黏液纖維的結締組織與肌層黏膜 (圖 3A )。由於它們在肌層黏膜 下方和黏膜下層內的解剖位置，如此可以保存BGs；因此，BG看起來完整並保留其CK7⁺ (圖 3B )、Tra-1-60⁺ (圖 3C )與SOX9⁺ (未顯示)細胞。

如方法中所述進一步處理十二指腸黏膜下層，分離出近350 ± 1億個細胞，存活率> 80％（85±5％）。FC顯示40.0±18.5%的新鮮分離細胞是EpCAM⁺ 。當細胞被免疫分選出用於EpCAM時，細胞群富集至70.3±19.3％EpCAM⁺ 細胞（p >0.05與預分選），其中46.3％±7.3的這些細胞也是Lgr5⁺ (FIG. 4A )。亦藉由流式細胞術（FC）研究從十二指腸分離的細胞的Tra-1-60表現情況。FC顯示5.8±1.6％的新鮮分離的細胞是Tra-1-60⁺ 。當細胞對Tra-1-60進行免疫分選時，細胞群富集至30.4±19.8％Tra-1-60⁺ 胞（p >0.05與預分選），和7.3％±4.2的Tra-1-60⁺ 細胞也是EpCAM⁺ （代表性散點圖顯示於圖 4B )。在磁性免疫分選後，被污染的細胞群藉由塑膠盤上的兩種不同培養物篩選法進一步移除，並作為類器官。首先，獲得單細胞懸浮液，並在無血清Kubota培養液中以500細胞/cm² 的選殖接種密度接種，該培養液允許內胚層幹細胞/前驅細胞的存活和自我複製，但非成熟細胞，也不是間充質細胞。在這些條件下，只有Tra-1-60⁺ 細胞能夠增殖(圖 4C )；它們在1-2天滯後期後開始增殖，並在培養6-8天後形成10-15個細胞的小簇(圖 4C )。14天後，觀察到大的菌落(圖 4C )。每個菌落主要由小（直徑=12.06±5.76 μm）、密集堆積和具有高細胞核-細胞質比的均勻細胞形成。自我複製培養條件導致幾乎所有間充質細胞的消失（未顯示），如先前在BTSC的培養篩選中所述。其次，在為器官形成而定製的培養條件下，單一BGSC開始自我組織成球形結構，其尺寸和數量進一步擴大。通常，在培養3-5天後可見類器官，並且它們的平均直徑在約13-14天內達到2.3±5 mm。類器官形成決定了Tra-1-60⁺ 細胞的富集，其代表形成類器官的主要細胞表型(圖 4D )。 BGSCs 2D集落和BGSC衍生的類器官的表型特徵

在塑膠盤和KM中（自我複製條件，圖 5A )），表型分析呈現培養物是如何由表現CK7、SOX9、EpCAM、Lgr5和多能性標記物（SOX2、Tra-1-60、Tra-1-81）的細胞組成的。

同時，類器官(圖 5B )由CK7⁺ 和CK19⁺ 細胞組成；類器官細胞表現內胚層幹細胞（EpCAM、Pdx1）和多能性標記物（Oct4A和Tra-1-60）。類器官為PAS陰性（杯狀細胞特徵），對幾種成熟細胞標記物呈陰性，如CFTR、白蛋白、Hep-Par1和胰島素（數據未顯示）。

藉由RT-PCR進一步研究BGSC表型；與適當陽性對照組的比較顯示，塑膠盤上和類器官中的單層BGSC會表現內胚層的生物標記物（例如EpCAM，SOX17和PDX1，圖 5C ）和多能性（例如SOX2、OCT4A和NANOG，圖 5D ）基因。在這些條件下，細胞對肝細胞（即白蛋白）、膽管細胞（即CFTR）和β-胰細胞（即胰島素）譜系的標記物大多是陰性的（數據未顯示）。體外 BGSCs的分化潛能

從BGs分離出的細胞之分化潛能之評估，係藉由將它們轉移到特異性定製的不同培養液中，以誘導向肝（HDM-H）或內分泌胰腺（HDM-P）譜系的分化來評估。

在HDM-H中7至14天後(圖 6A )，大多數細胞的形態發生顯著變化，從小的紡錘形細胞變為多邊形（立方形）細胞。與在KM中培養的細胞相較，這些細胞聚集形成多細胞索並且具有更大的直徑（p >0.01）；細胞大小對應於正常、二倍體、成人肝細胞的大小。IF顯示這些大的多邊形細胞表現有白蛋白(圖 6A )。此外，PAS染色顯示HDM-H中存在PAS陽性細胞(圖 6A )，但KM中沒有細胞（未顯示），並且在以α-澱粉酶消化後，未偵測到可見的PAS染色（未顯示）。這支持了在HDM-H中培養的細胞的糖原儲存能力。RT-PCR分析(圖 6A )證明HDM-H中的細胞之肝細胞特異性基因的表現增加，包括白蛋白（≈2倍）、轉鐵蛋白（中間體或區域2;> 100倍）、CYP3A4（藥物代謝，晚期或第3區基因;> 100倍）基因，和KM中的細胞相較。

在HDM-P中14天後，觀察到胰島樣結構；這些結構由表現Ngn3和胰島素的密集細胞組成(圖 6B )。在HDM-P中7天後，RT-PCR分析證明，與KM中的細胞中的發現相較，是PDX1而非胰島素和升糖素基因的表現增加(圖 12 )。在HDM-P中14天後，與KM中的細胞相較，檢測到PDX1、胰島素和升糖素基因表現顯著增加(圖 6B )。

Tra-1-60+十二指腸SG細胞可在體外快速定向為β-胰腺命運，並且SGs可以自發地體內產生胰島素表現細胞。將它們轉移到定製培養基（PM）中，以誘導向內分泌胰島譜系分化，來評估從十二指腸SG分離的細胞之體外分化潛能。在PM中7天後，觀察到少量胰島樣結構的存在（每個培養物1.4±0.5）(圖 14A )，RT-PCR分析表明PDX1而非胰島素基因上調，在PM中與KM相較。類似地，通過免疫螢光分析測定，胰島樣結構顯示PDX1的表現，但未顯示胰島素的表現(圖 14B )。在PM中14天後，與7天相較，胰島樣結構的數量顯著增加（每個培養物4.8±0.8; p >0.01）。與KM相較，在PM中14天後，PDX1基因表現更高，但與基於RT-PCR分析的7天PM相較則更低(圖 14B )。胰島素和升糖素基因表現在第14天大幅增加(圖 14C )，達到對照組的胰島位準。14天後，胰島素+和升糖素+細胞出現在胰島樣結構中(圖 14C )。

為了研究十二指腸SG細胞在體內對內分泌胰腺命運的作用，我們研究實驗誘導的小鼠糖尿病是否可以觸發特定胰臟性狀。因此，研究了兩種不同的鏈脲佐菌素（STZ）模型。高劑量STZ模型的特徵在於血糖含量的快速增加和高死亡率。低劑量STZ模型顯示血糖增加較慢且不太明顯，存活期延長，觀察時間延長。當以高STZ劑量處理小鼠並在14天後犧牲時，與對照組相較，十二指腸SG含量增加(圖 14D )。此外，與對照組相較，更高百分比的SG細胞表現PCNA、PDX1和NGN3(圖 14E-F )。最後，在2/5 STZ處理的小鼠中，而不是在對照組中，在十二指腸SGs內觀察到胰島素+和升糖素+細胞(圖 14E-F )。然而，沒有發現血糖分布的相關性。這些數據與來自囓齒動物十二指腸的標本的RT-PCR分析一致，其特徵在於與胰內分泌命運相關的基因表現增加(圖 14G )。當投與低STZ劑量時，未出現這些特徵（數據未顯示）。最後，在從患有第2型糖尿病（T2D）的患者獲得的人類十二指腸中，研究胰島素的表現。在來自T2D患者的十二指腸SG中可以發現少量（>5％）胰島素+細胞，但是在正常個體中沒有發現(圖 14H )。將未分化的人 BGSCs 體外 移植到小鼠肝臟中

經由血管途徑注射（脾臟注射），藉由移植到SCID小鼠的肝臟中來研究BGSC體內 產生成熟肝細胞的潛力。如先前報導的，藉由對僅與人類抗原（即抗人類粒線體、抗人類核、抗人類白蛋白和抗人類HepPar-1）反應的特異性抗體，進行免疫染色來評估BGSC的植入情況。細胞注射後一個月，在鼠類肝內觀察到人類（h）粒線體⁺ 細胞(圖 7A ); 陽性細胞主要位於門靜脈周圍，一些細胞也向小葉中心位置延伸。在注射的小鼠中，幾乎5.1±1.3％的宿主肝細胞團由人類抗原⁺ 細胞代表(圖 7B )。此外，h-粒線體⁺ 移植細胞對成熟肝細胞標記物如白蛋白(圖 7D )和HepPar-1 (圖 7E )呈陽性。在小葉間膽管內很少觀察到抗人類細胞核陽性的細胞。這些細胞對CK19呈陽性（數據未顯示）。

為了證實移植的hBGSC的有效植入和分化，申請人進一步研究了鼠類肝中的人類白蛋白mRNA表現。人類白蛋白mRNA在從注射的小鼠收穫的肝臟中可檢測到（圖 7C ），但在偽對照小鼠（注入鹽水）中未檢測到。

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圖 1 描繪了A）用Periodic Acid-Schiff（PAS）染色的人類十二指腸。十二指腸黏膜突起為腸絨毛並折疊在腸隱窩（箭頭）中。黏膜下層（SM）充滿了PAS⁺ 腺體元素（布隆納氏腺(Brunner’s Gland)：BGs，虛線）。經由肌層黏膜 (MM) ，BG與腸隱窩具有解剖學連續性。少許BG腺泡位於黏膜的固有層 內，與腸道隱窩連續（右圖中的箭頭）。B）人類十二指腸中細胞角蛋白7（CK7）的免疫組織化學。CK7特異性地由BG表現，但不由腸隱窩表現。C）人類十二指腸中SOX9的免疫組織化學。腸隱窩和BG二者都含有表現SOX9的細胞（箭頭）。D）SOX9（紅色）和CK7（綠色）的免疫螢光；原子核顯示為藍色。在BG中，SOX9與CK7在相同細胞中共表現（箭頭）。

圖 2 描述A）增殖細胞核抗原（PCNA）、CD44、上皮細胞黏附分子（EpCAM）、富含離胺酸的重複序列之G蛋白偶聯受體5（Lgr5）、Tra-1-60和Tra-1-81，在人類十二指腸中的免疫組織化學。PCNA⁺ 、CD44⁺ 、EpCAM⁺ 及Lgr5⁺ 細胞位於腸隱窩（箭頭）和布隆納氏腺(Brunner’s Gland)（箭頭）中。Tra-1-60⁺ 及Tra-1-81⁺ 細胞位於布隆納氏腺(Brunner’s Gland)（箭頭），但不在腸道隱窩。MM=肌層黏膜。B）與多能性相關的轉錄因子之免疫組織化學和免疫螢光。Oct4A和SOX2在布隆納氏腺(Brunner’s Gland)內的細胞中呈陽性，並在Tra-1-60⁺ 細胞中共表現（箭頭）。

圖 3 描述A）蘇木精和伊紅（H＆E）染色的人類十二指腸切片，在化學和機械移除黏膜之前和之後。幾乎所有表面上皮（絨毛）和腸隱窩（箭頭）內的上皮細胞都被移除，除了罕見的腸道隱窩（右圖中的虛線圓圈）。黏膜下層的布隆納氏腺(Brunner’s Gland)被保留（星號）。B）機械和化學移除黏膜後，人類十二指腸中細胞角蛋白7（CK7）的免疫組織化學。布隆納氏腺(Brunner’s Gland)中的CK7⁺ 細胞被保留下來。C）機械和化學移除黏膜後，人類十二指腸中Tra-1-60的免疫組織化學。布隆納氏腺(Brunner’s Gland)中的Tra-1-60⁺ 細胞被保留下來。MM=肌層黏膜。

圖 4 描述A-B）從十二指腸黏膜下層分離出的細胞中之上皮細胞黏附分子（EpCAM）、富含離胺酸的重複序列之G蛋白偶聯受體5（Lgr5）和Tra-1-60之流式細胞術。EpCAM和Tra-1-60之免疫分選程序，分別導致EpCAM⁺ (A)與Tra-1-60⁺ (B)群體的部分富集。C-D）培養物選擇策略進一步選出Tra-1-60⁺ 細胞。在C中，將細胞以選殖密度接種在Kubota培養液中的塑膠盤上。細胞在1-2天滯後期(lag period)後開始增殖，並在6-8天後形成10-15個細胞的小簇。14天後，觀察到大的菌落。每個菌落由Tra-1-60⁺ 之小、密集和均勻的細胞形成。在D中，細胞在適於形成類器官的條件下培養；單一布隆納氏腺(Brunner’s Gland)幹細胞（BGSCs）開始自我組織成球形結構，其尺寸和數量進一步擴大。類器官形成決定Tra-1-60⁺ 細胞的富集，這些細胞代表了形成類器官的主要表型。Ph-C：相位差。比例尺=200 μm。

圖 5 描述A-B）內胚層和多能性標記物的相位差（Ph-C）、蘇木精和伊紅（H＆E）及 Periodic Acid-Schiff（PAS）染色、免疫組織化學和免疫螢光圖。在圖A中，布隆納氏腺(Brunner’s Gland)幹細胞（BGSC）在自我複製條件下（即無血清的Kubota培養液）培養。在圖B中，BGSC在適於形成類器官的條件下培養。在這兩種情況下，培養出的細胞顯示出典型的表型，與形成布隆納氏腺(Brunner’s Gland)的細胞原位 觀察結果相似。細胞核以藍色顯示。C-D）RT-PCR分析證實了內胚層（C）和多能性（D）基因的表現。膽管樹幹細胞/前驅細胞（BTSC）和Ntera細胞株，分別使用作為內胚層和多能性基因的陽性對照。* =與另一組相較，p >0.05。GOI=感興趣的基因。

圖 6 描述A）體外 肝細胞分化。在激素限定的肝細胞分化培養液（HDM-H）中培養的人類布隆納氏腺(Brunner’s Gland)幹細胞/前驅細胞（hBGSCs）中的白蛋白之相位差（Ph-C）、Periodic Acid-Schiff（PAS）染色和免疫螢光圖。在HDM-H中14天後，大多數細胞的形態明顯改變為多邊形細胞。這些細胞聚集形成多細胞索，呈現PAS陽性（糖原貯積）並表現白蛋白。細胞核以藍色顯示。對在HDM-肝臟中培養14天的細胞中的肝細胞標記物進行即時PCR結果。與自我複製條件下的細胞（即無血清的Kubota培養液：KM）相較，肝細胞特異性基因，包括白蛋白（ALB）、轉鐵蛋白（TF）和細胞色素P450 3A4（CYP3A4）增加。初代人類肝細胞（hHeps）使用作為陽性對照。與其他組相較，* = p >0.05。GOI=感興趣的基因。B)體外 內分泌胰腺分化。在激素限定的肝細胞分化培養液（HDM-H）中培養的人類布隆納氏腺(Brunner’s Gland)幹細胞/前驅細胞（hBGSCs）之神經元素3(NGN3)及胰島素的Ph-C、蘇木精和伊紅（H＆E）染色和免疫螢光圖。在HDM-P中14天後，在培養物中出現胰島樣結構；這些聚集體呈現NGN3和胰島素陽性。細胞核以藍色顯示。在HDM-P中培養14天的細胞中胰臟內分泌標記物的即時PCR結果。與自我複製條件下的細胞（即Kubota's培養液：KM）相較，PDX1、胰島素和胰高血糖素大幅增加。正常胰島細胞使用作為陽性對照。與KM中的hBGSC相較，* = p>0.05。GOI=感興趣的基因。

圖 7 描述藉由脾內注射將人類布隆納氏腺(Brunner’s Gland)幹細胞（hBGSCs）體內 移植到SCID小鼠的肝臟中。A）30天後，表現人類粒線體抗原（hMito）的細胞出現於小鼠肝臟中，且大部分位於門靜脈三聯體空間周圍（箭頭）。注射生理鹽水（Veh）的小鼠中不存在陽性細胞。B）hMito陽性細胞佔小鼠肝臟中肝細胞的近5％。C）藉由RT-qPCR，在注射hBGSC的小鼠肝臟中偵測到人類白蛋白（hALB）基因的表線，但在注射Veh的小鼠中未偵測到（ND：未偵測到）。數據表示為三次實驗的平均值±SD。D-E）雙重免疫螢光證實了成熟人類肝細胞標記物，如人類白蛋白（hAlb）、Hep-Par1和hMito，在相同細胞中的表現。細胞核(Nu)以藍色顯示。

圖 8 描述十二指腸黏膜的選擇性溶解。A）灌洗法；B）夾住十二指腸末端；C）組織切開和黏液去除；D）使用漏勺進行機械過濾。

圖 9 描繪人類十二指腸中細胞角蛋白7（CK7）的免疫組織化學。十二指腸壁由黏膜、黏膜下層和肌肉層組成。布隆納氏腺(Brunner’s Gland)（BG）位於黏膜下層。CK7特異性地由BG表現，而非由腸隱窩中的細胞表現。框中的區域在右側的圖像中放大。

圖 10 描繪A）人類十二指腸中SOX9（紅色）和Lgr5（綠色）的免疫螢光。細胞核以藍色顯示。在布隆納氏腺(Brunner’s Gland)（包含在虛線中）中，Lgr5與SOX9（箭頭）共定位，並且其在肌層黏膜內部腺泡之表現較多，並與腸隱窩（箭頭）連續，而非與位於黏膜下層內部更深處的腺泡連續。MM=肌層黏膜。B-D）鈉/碘化物同向運輸蛋白（NIS）的免疫組織化學。NIS表現於腸隱窩底部（圖A和C中的箭頭）和布隆納氏腺(Brunner’s Gland)中(圖A和B中的箭頭）。

圖 11 描述用於移除黏膜上皮細胞同時保留黏膜下層存活的不成功的流程和程序。程序＃1：手術切除，＃2黏膜切除術，經由先前在黏膜下方注射生理鹽水進行，＃3刮擦黏膜。如蘇木精和伊紅（H＆E）和Periodic Acid-Schiff PAS）染色所示，這些策略導致部分移除黏膜層並保留腸絨毛（箭頭）和隱窩（箭號）。

圖 12 描述在激素限定的胰島細胞分化培養液(HDM-P)中培養7天的人類布隆納氏腺(Brunner’s Gland)幹細胞/前驅細胞（hBGSCs）之即時PCR。與自身複製條件下的細胞（即Kubota培養液：KM）相較，7天後PDX1和升糖素基因而非胰島素基因大幅增加。正常胰島細胞使用作為陽性對照。與KM中的hBGSC相較，*= p> 0.05。GOI=感興趣的基因。

圖 13 描繪小鼠中的十二指腸黏膜下腺體代表關於腸隱窩的獨特區室，並且顯示出增殖特徵。A）描繪鼠類（m）十二指腸中的細胞角蛋白19（Ck19）、SOX9和增殖細胞核抗原（PCNA）的蘇木精和伊紅（H＆E）染色與免疫螢光染色。虛線表示腸隱窩和黏膜下腺體（SGs：星號）之間的界面。十二指腸中的SG是可區分的，因為它們與隱窩相較具有更清晰的細胞質，以及由於它們的黏液含量。在囓齒動物的十二指腸中，腸隱窩和絨毛是Ck19陽性，而SGs（白色星號）幾乎都是陰性的。SOX9+ 細胞主要位於SGs（綠色細胞）內，PCNA+ 細胞主要位於腸隱窩（紅色細胞）中。細胞核以藍色顯示。比例尺=200 μm（H＆E和Ck19）或100 μm（SOX9/PCNA）。B）描繪鼠類（m）空腸中Ck19、SOX9和PCNA的蘇木精和伊紅（H＆E）染色與免疫螢光染色。在囓齒動物的空腸中，腸隱窩和絨毛為Ck19陽性。與十二指腸的區別在於SOX9+ 細胞位於隱窩中，並共表現PCNA（黃色箭頭）。細胞核以藍色顯示。比例尺=200 μm（H＆E和Ck19）或100 μm（SOX9/PCNA）。C）描繪他莫昔芬(tamoxifen)注射後14天，在Krt19CreTdTomatoLSL小鼠中，Ck19和TdTomato（Td-Tom）的免疫螢光圖。在鼠類（m）的空腸中，大多數腸隱窩為Td-Tom+（紅色箭頭），其中陰性隱窩（綠色箭頭）緊鄰於陽性隱窩。位於Td-Tom+隱窩上方的絨毛完全是td-Tom陽性。在鼠類的十二指腸中，SG主要是td-Tom-和Ck19-，因此不包括它們來自td-Tom+隱窩（紅色箭頭）的來源。白色星號表示SG。虛線表示腸隱窩和SG之間的界面。細胞核以藍色顯示。比例尺=200 μm。D）在鼠類的十二指腸中，PCNA+ 505和SOX9+細胞總是Td-Tom陰性（紅色箭頭）。黃色和綠色箭頭指向Td-Tom+腸隱窩，而十二指腸中為PCNA陽性和SOX9陰性。細胞核以藍色顯示。虛線表示腸隱窩和SG之間的界面。圖 13 之影像代表n=5隻動物。

圖 14 描述從十二指腸黏膜下層分離出的Tra-1-60+細胞，可在體外發育為內分泌胰腺，並顯示在體內可分化成胰島素+細胞的效力。A-C）體外的內分泌胰腺分化。圖A）顯示從人類十二指腸黏膜下腺體分離出的細胞之相位差（Ph-C）和蘇木精和伊紅（H＆E）染色，並在胰腺分化（PM）或自我複製條件（Kubota's培養液：KM））之限定培養液中培養。在PM中，胰島樣結構在7天後出現（PM7），14天後出現數量增加（PM14）；*p >0.001，與其他組相較。比例尺=100 μm。 n=5個生物性重複樣本。B）即時（RT）-PCR顯示，PM7-14中PDX1基因的表現增加；經由免疫螢光確認583核Pdx1的表現。n=4個生物性重複樣本。C）描述在PM14後（n=4個生物性重複樣本），胰島素（INS）和升糖素（GLU）基因的表現增加。人類胰島細胞（ISL）使用作為參考組（n=3個生物性重複樣本）。在14天PM中，胰島樣結構係經由免疫螢光顯示胰島素和升糖素的表現。比例尺=100 μm。D-G）描述小鼠中實驗誘導的糖尿病，可在體內引發dSG中的增殖和胰臟性狀（每組n=5隻動物）。D）描述與對照組（CTR）相較，經鏈脲佐菌素（STZ）處理的小鼠具有增加的dSG面積分率（星號）。虛線表示dSG的腸道隱窩。比例尺=200 μm。E）描述經由免疫螢光（IF）測定，與對照組相較，STZ小鼠中的dSG之增殖細胞核抗原（PCNA）、Pdx-1、神經生成素3（Ngn3）和胰島素的表現皆增加。比例尺=100 μm。F）描繪了IF-得分的熱圖。G）描述經由RT-PCR分析測定，與對照組相較，來自囓齒動物十二指腸的樣本，在STZ小鼠中的NGN3和INS基因表現略微增加，與對照組相較。同一小鼠的胰臟組織使用作為參考組。H）描述由患有第2型糖尿病（T2D）的患者獲得的人類十二指腸中胰島素表現的研究。在這些器官中（n=5個十二指腸樣本），少量胰島素+細胞存在於SG內（箭頭）。胰臟組織顯示在右側。比例尺=50 μm。在免疫螢光中，細胞核以藍色顯示。對於A-D和G，誤差線表示平均值±s.d。對於A-D和G，藉由雙尾t-檢驗決定p值。

圖 15 描述由人類十二指腸球莖的內視鏡切片獲得的自我複製的布隆納氏腺(Brunner’s Gland)細胞。A）顯示經由切片收集具有布隆納氏腺(Brunner’s Gland)（星號）的黏膜下層（左圖）。布隆納氏腺(Brunner’s Gland)中表現SOX9的細胞係以箭頭表示（右圖）。B）顯示於自我複製條件下，由培養從胎兒十二指腸分離出的布隆納氏腺(Brunner’s Gland)而獲得的體外細胞集落（虛線）。

Claims (15)

1. 一種從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞（稱為布隆納氏腺(Brunner’s Gland)之幹細胞/前驅細胞或BGSC），其表現一或多種選自由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9及細胞角蛋白7（CK7）組成之群組的標記物，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖。
2. 一種從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞（稱為布隆納氏腺(Brunner’s Gland)幹細胞/前驅細胞或BGSC），其表現一或多種選自由Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組的標記物，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖。
3. 一種從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞（稱為布隆納氏腺(Brunner’s Gland)幹細胞/前驅細胞或BGSC），其表現SOX17及PDX1二者，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖。
4. 一種從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞（稱為布隆納氏腺幹細胞/前驅細胞或BGSC），其表現一或多種選自由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、 CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組的標記物，或其表現SOX17及PDX1二者，且其進一步特徵為在支持自我更新的培養條件下，能夠以有限或最小的分化情況增殖。
5. 一種從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞群，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現一或多種選自由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9及CK7組成之群組的標記物。
6. 一種從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞群，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現一或多種選自由Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組的標記物。
7. 一種從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞群，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現SOX17及PDX1二者。
8. 一種從十二指腸分離出的幹細胞/前驅細胞群，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現一或多種選自由Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、 CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19組成之群組的標記物，或其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現SOX17及PDX1二者。
9. 一種從個體的十二指腸、其一部分或從其中取出的樣本中，分離出一或多種BGSC，或幹細胞/前驅細胞群的方法，包含： (a) 將實質上不含腸黏液的十二指腸黏膜層，與具有超出生理範圍滲透壓性質的培養液或溶液，在可誘導黏膜層細胞產生滲透性休克的條件下接觸； (b) 藉由機械、手術及/或化學方法移除或溶解至少一部分黏膜層或其細胞，留下及/或暴露可包括黏膜下層的剩餘部分； (d) 消化或分離該剩餘部分；以及 (e) 從該經消化的剩餘物中分離出一或多種BGSC或幹細胞/前驅細胞群。
10. 如請求項9所述之方法，其中藉由化學破壞法進行該移除，該化學破壞法包括使用乳化劑及/或界面活性劑。
11. 如請求項10所述之方法，其中該界面活性劑選自包含1-庚烷磺酸；N-月桂基肌胺酸、十二烷基硫酸鹽、1-辛烷磺酸和牛磺酸、苯扎氯銨、十六烷基吡啶、氯化甲基芐基銨、溴化十甲烯銨、烷基甜菜鹼、烷基醯胺基烷基甜菜鹼、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸鹽、磷脂醯膽鹼、N-癸基A-D-吡喃葡萄糖苷、N-癸基A-D-吡喃麥芽糖苷、N-十二基-B-D-麥芽糖苷、N-辛基B-D-吡喃葡萄糖苷、N-十四烷基B-D-麥芽糖苷、Tritons (Triton X-100）、Nonidet-P-40、泊洛沙姆188 (Poloxamer 188)、十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉及其組合之群組。
12. 如請求項10所述之方法，其中該乳化劑選自於包含b卵磷脂、單月桂酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯20）、單油酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯80）、單棕櫚酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯40）、單硬脂酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯60）、三硬脂酸聚氧乙烯去水山梨糖酯（聚山梨醇酯65）、磷脂酸銨、脂肪酸之鈉、鉀和鈣鹽、脂肪酸之鎂鹽、脂肪酸之單-和二甘油酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的乙酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的乳酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的檸檬酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的單-和二乙醯基酒石酸酯、脂肪酸之單-和二甘油酯的乙酸酯與酒石酸酯之混合物、脂肪酸之蔗糖酯、蔗糖甘油酯、脂肪酸之聚甘油酯、聚蓖麻油酸聚甘油酯、脂肪酸之丙烷-1,2-二醇酯、熱氧化大豆油與脂肪酸之單-及二甘油酯之反應物、硬脂醯-2-乳酸鈉、硬脂醯-2-乳酸鈣、單硬脂酸去水山梨糖酯、三硬脂酸去水山梨糖酯、單月桂酸去水山梨糖酯、單油酸去水山梨糖酯、單棕櫚酸去水山梨糖酯及其組合之群組。
13. 一種使用如請求項1、2、3或4所述之細胞治療涉及或影響肝臟、胰臟、胃、腸或其他內胚層組織的疾病或症狀之用途，用於人類及/或動物之自體或同種異體細胞或基因治療。
14. 一種使用如請求項5、6、7或8所述之細胞治療涉及或影響肝臟、胰臟、胃、腸或其他內胚層組織的疾病或症狀之用途，用於人類及/或動物之自體或同種異體細胞或基因治療。
15. 一種從個體的十二指腸、其一部分或從其中取出的樣本，分離出一或多種布隆納氏腺之幹細胞/前驅細胞(BGSC)的方法，包含： (a) 消化或分解十二指腸、其一部分或從其中取出的樣本，以提供經消化或經分解的細胞材料； (b) 從該經消化或經分解的細胞材料中獲得：(i)某種細胞或某一群細胞，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現一Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9、CK7、Lgr5、NIS、CD44及CK19之一或多者；及/或（ii）某種細胞或某一群細胞，其中至少一些或多數或大部分的細胞係表現SOX17和PDX1二者。

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