BRPI0923068A2 - uso de composições para tratamento de doenças e distúrbios de pulmão e pulmonares, as referidas composições, e kit - Google Patents

Abstract

uso de composições para o tratamento de doenças e distúrbios de pulmão e pulmonares, as referidas composições, e kit. a presente invenção refere-se a composições e métodos de usar células derivadas de tecido de cordão umbilical para estimular e sustentar angiogênese de tecido pulmonar, para melhorar o fluxo sanguíneo para o tecido pulmonar, para regenerar, reparar, e melhorar tecido pulmonar danificado por doença, distúrbio e/ou injúria pulmonar, e para proteger o tecido pulmonar de dano causado por doença, distúrbio e/ou injúria pulmonar em um paciente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USO DE COMPOSIÇÕES PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS E DISTÚRBIOS DE PULMÃO E PULMONARES, AS REFERIDAS COMPOSIÇÕES, E KIT. Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica benefício ao Pedido de Patente Provisional dos Estados Unidos N° 61/139.425, depositado em 10 de dezembro de 2008, os teores do qual está incorporado por referência aqui em sua totalidade. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de terapia regenerativa ou com base em célula para distúrbios, doenças e lesões pulmonares. Antecedentes da Invenção

Várias publicações incluindo patentes, pedidos publicados e artigos técnicos são citados ao longo da especificação. Cada destas publicações citadas está incorporada por referência aqui, em sua totalidade.

^{15 A doen}?^a Pulmonar, tanto crônica quanto aguda, continua sendo uma causa significante de morbidez e mortalidade em todo o mundo. A doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) é a quarta causa principal de morte no mundo (Spurzem e Rennard, Semin Respir Crit Care Med, 2005; 26: 142-153) e pode ser causada pelo estreitamento anatômico das vias aéreas 20 ou bloqueio das vias aéreas com muco que interfere com a respiração normal. Adicionalmente, a doença pulmonar intersticial, também conhecida como fibrose pulmonar, é classificada como uma doença restritiva que inclui uma variedade de distúrbios pulmonares crônicos. O controle da doença pulmonar crônica inclui terapia com fármaco, terapia de oxigênio, cirurgia, e 25 reabilitação pulmonar.

Ao mesmo tempo em que 90% dos pacientes de COPD são fumantes, somente 10% dos fumantes desenvolvem a doença, sugerindo que a predisposição genética pode ser um fator prognóstico importante. (Siafakas e Tzortzaki, Respir Med, 2002 Aug.; 96(8): 615-24). A doença pulmonar 30 do fumante é caracterizada por inflamação ativa crônica, hipersecreção com muco das vias aéreas, e enfisema (MacNee, Proc Am Thorac Soc, 2005; 2(4): 258-66; descrição 290-1) e é somente parcialmente reversível sob ces1/117

Relatório Descritivo da Patents? de Invenção para TRATAMENTO DE DOENÇAS E DISTÚRBIOS DE PULMÃO E PULMONARES.

..Relacionados

Este pedido reivindica beneficio ao Pedido de Patente Provisional dos Estados Unidos N° 61/139.425, depositado em 10 de dezembro de 2008, os teores do qual está incorporada por referência aqui em sua totalidade

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de terapia regenerativa ou com base em célula para distúrbios, doenças e lesões pulmonares. Antecedentes dajnyen^o

Várias publicações incluindo patentes, pedidos publicados e artigos técnicos são citados ao longo da especificação. Cada destas publicações citadas está incorporada por referência aqui, em sua totalidade.

A doença pulmonar, tanto crônica quanto aguda, continua sendo uma causa significante de morbidez e mortalidade em todo o mundo. .A doença pulmonar obstrutiva crônica (CORD) é a quarta causa principal de morte no mundo (Spurzem e Rennard, Semin Respir Cnt Care Med, 2005; 26: 142-153) e pode ser causada pelo estreitamento anatômico das vias aéreas ou bloqueio das vias aéreas com muco que interfere com a respiração normal. Adidonalmente, a doença pulmonar intersticial, também conhecida como fibroso pulmonar, é classificada como uma doença restritiva que incluí uma variedade de distúrbios pulmonares crônicos. O controle da doença pulmonar crônica inclui terapia corn fármaco, terapia de oxigênio, cirurgia, e reabilitação pulmonar.

Ao mesmo tempo em que 90% dos pacientes de COF^SD são fumantes, somente 10% dos fumantes desenvolvem a doença, sugerindo que a predisposição genética pode ser um fator prognóstico importante. (Siafakas e Tzortzaki, Respir Med, 2002 Aug ; 08(6): 615-24). A doença pulmonar do fumante è caracterizada por inflamação ativa crônica, hipersecreçâo com muco das vias aéreas, e enfisema (MacNee, Proc Am Thorac Soo, 2605; 2(4): 258-68; descrição 290-1) e é somente parcialmente reversível sob ces117 sação da hábito do fumar. (Spurzem e Rennard, Semin Respir Cat Care Med, 2005; .26; 142-153}. A inflamação das vias aéreas e parênqulma pulmonar desempenham urn papel importante na patogênese de doença pulmonar obstmtiva crônica. A fumaça de cigarro foi mostrada induzir a infla-5 mação pulmonar e finalmente levar ao COPD mesmo que a exposição à fumaça do cigarro tenha parado.

Enfisems é um dos fatores principais determinando a rnorbidade e mortalidade em doença pulmonar obstrubva crônica. Esta doença é caracterizada, por exemplo, pela perda de elasticidade do tecido pulmonar, de 0 destruição das estruturas que suportam cs tecidas pulmonares tal como alvéolos. e destruição de capilares que alimentam os alvéolos. Esta destruição pode ser causada por enzimas intlamatórías, por exemplo, eiastina. Enfisema è definido como o aumento do espaço de ar periférico no pulmão (incluindo alvéolos e bronquíolos respiratórios), que é acompanhado pela destrui5 çâo das estruturas da parede alveolar. A incidência de pacientes com enfl · suma aumentou nas décadas passadas como um resultado do aumento em poluentes ambientais, fumaça de cigarro, e outras exposições a substâncias nocivas. O padrão atual de cuidado hoje demonstra que somente o transplante de pulmão pode fornecer ramediação para enfisema grave. Nesse 0 aspecto continua uma necessidade de um método adequado e útil para tra tar, reparar e.fou melhorar o dano do pulmão em pacientes com enfíserna, tal como enfisema induzido por elastase

Os modelas de animal expostas a fumaça de cigarra foram estudados para investigar a patologia e a eficácia da várias intervenções tera5 pêuticas. infehzmente, estes estudos somente demonstraram sucesso limitada. Parte do problema é que as oepas de namundongo e rato geralmonte utilizadas mostram secreção mucosa e inflamação somente moderada em resposta a fumaça de cigarro. (Guerassimav, A, e autros, Am J Respir Crii Med, 2004 Nov. 1; 170(9); 97'4-80. Epub 2004 Jul. 28) e as lesões corres0 pendentes saa rapidamente reversíveis. Os roedores de laboratório saudáveis podem, portanto possuir uma capacidade extraordinária de compensar e regenerar a função pulmonar em seguida a uma lesão, que pode sustentar sua resistência relativa ao desenvolvimento de COPO. Recentemente foi mostrado que os ratos com hipersensibilídade espontânea geneticamente predispostos (SH) exibem fenótípos (par exemplo, inflamação sistêmica, hipercoaguiação, tensão oxidativa e função imune suprimida) que são também encontrados em pacientes de COPD. (Yü, 8, e outras., tahal Toxicol. Maio de 2008; 20(7): 623-33). Portanto, o modelo de rato de SH pode oferecer um modelo minis relevante de CQPD experimentai.

A doença pulmonar restritiva é uma das causas mais comuns de morbidez e mortalidade e tem três etiologias principais, câncer pulmonar, pneumonia e fibrose pulmonar. A fibrose pulmonar Idiopática (IPF) è uma doença incapacitaste caracterizada por dispnéia progressiva e está associada com uma taxa elevada de mortalidade, fibrose do tecido fixo progressiva, distorção arquitetural, e perda de função. (Ortiz. LA. e outros., Proc Natl Acad Sei U S A.< 8 de julho de 2003, 2003; 100(14). 8407-11. Epub 2003 Jun. 18). Um excesso de dtocinas profibróticas ou uma deficiência em citocinas antífibràticas esteve envolvido no processo patológico. Nos Estados Unidos, as estimativas de prevalência para fibrose pulmonar idiopática variam de três a seis casas por cem mil pessoas. Atualmente, nenhuma terapia eficaz, para reverter ou retardar o curso da doença está disponível. A maioria dos tratamentos. tal coma corficosteroides, imunossupressores. imunomoduladores, ou agentes antifibréticos, procura suprimir a inflamação, porem nenhum foi provado alterara progressão da doença de IPF. Portento, uma necessidade signifícante existe para o desenvolvimento de novas terapias visando retardai’ ou deter a fibrose ao mesmo tempo em que aumentando a regeneração e reparo de pulmão endógeno.

Descobriu-se que as céluias-tronco mesenquimals (MSCs) po dem se diferenciar em células epíteliais aiveclares em pulmões lesionados de camundongos feridos com bieomlcina (R1..M), e o enxerto de MSCs pode suprimir a inflamação e deposição de coíágeno em tecido pulmonar danificado. (Zhao. F. e outros, Transplant Proceedings, junho de 2008.; 40(5): 17001705: Ortíz. LA, e outros, Proc Natl Acad Sei U S A.. 8 de julho de 2003; 100(14):8407-1 1. Epub 2003 Jun, 18; Rojas e outras., Am J RespirCeil Mol

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Biol. 2805; 33:145). BLM é um antibiótico citostáticu corn atividade antitumor e è urn composto bem-reconhecido para estudar fibrose pulmonar em modelos de animal. Ele induz a lesão da célula epitelial alveolar e inflamação no pulmão, levando a fibrose pulmonar.

A lesão pulmonar aguda (All) e sindrome da angústia respiratória aguda (ARDS) também continuam sendo causas significantes de morbidez e mortalidade na rotina de cuidado intensivo. All e ARDS são doenças sérias caracterizadas pelo inicio abrupto de hípoxernia corn edema pulmonar difuso em resposta a lesão direta (por exemplo, alagamento, pneumonia, gases tóxicos inalados, e contusão pulmonar) ou lesão indireta (por exemplo, sep.se grave, transfusão, choque, e pancreatite). AI..I e ARDS são atualmente tratados por ventilação mecânica e cuidado sustentador.

A terapia cem célula é um dos campos mais excitantes em medicina translaoionai e està se desenvolvendo um uma nova plataforma terapêutica para tratar um vasto grupo de distúrbios clínicos. Durante os últimos cinco anus, o campo de terapias de célula em doença pulmonares continuou a crescer rapidamente. Vários estudos demonstraram a facilidade de empregar a terapia de célula para tratar doença pulmonar. Per exemplo, células progenitoras endotelíais circulantes (EPCs) podem contribuir corn a regeneração de vascuiatura pulmonar doente e estão sendo investigadas em pacientes com hipertensão pulmonar. (Diller, G P, e outros, Circulation, 2008 10 de junho, 117(23): 3020-3(), EPub 2 de junho de 2008), Além disso, recentes publicações demonstram que as células-tronco mesenquimais (MSCs) também suprimem a inflamação e lesão pulmonar e em vários modelos de oamundongos de doenças pulmonares mediadas imunes e inflamatórias. (Weiss, D J, e outros, Proc Am Thorac. Soc.. 15 julho de 2008; 5(5):637-67). A despeito destas descobertas promissoras, pouca atenção fui colocada sobre o desenvolvimento de uma terapia de célula para All.

Atualmente, há interesse no uso de céiulas-tronco, que? podem se dividir e se diferenciar, nu células do músculo de outras fontes, incluindo células dc músculo liso e esgueíetal. para ajudar no reparu ou reversão de dano de tecido devida ás doenças, distúrbios ou lesões pulmonares, O transplante de células-tronco poda ser utilizado come urna ferramenta dl nica para reconstituir um iecídoalvo, desse medo restaurando a funcionalidade fisiológica e anatômica. A aplicação de tecnologia de célula-fronco é amplamente variante, incluindo construção de tecido, liberação de terapia de gene.

e terapêuticos celulares, isto é, liberação de agentes biotcrapéutícas a um local-alvo através de células vivas exogena,mente fornecidas ou componentes celulares que produzem ou contêm tais agentes. A identificação de células -tronco estimulou a pesquisa visada na geração seletiva de tipos celulares específicos para medicina regenerativa.

Um fornecimento confiável, bern-caractenzado e abundante de populações substancialmente homogêneas de tais células tendo a capacidade de diferenciar em uma formação de tecido pulmonar, incluindo estruturas vasculares, seria uma vantagem em uma variedade de aplicações diagnosticas e terapêuticas para repare, regeneração, proteção e melhora do pulmão, e para melhora do fluxo sanguíneo e permute de oxígênío/COs antes, durante ou subsequente ao dano pulmonar devido ás doenças, distúrbios, e/ou lesões pulmonares.

Sumarie- da invenção

Um aspecto da invenção caracteriza métodos de tratar um pací20 ente tendo doenças, distúrbios, e/ou lesões pulmonares. Tais doenças, distúrbios, e/ou lesões incluem, porém não estão limitados a, doenças pulmonares obstrutívas crônicas (COP'D), fibrose pulmonar, lesão pulmonar aguda (A.Í..I), síndrome da angustia respiratória aguda (ARDS), e os danos associados a isto.

Um aspecto da invenção caracteriza um método de tratar um paciente tendo doença, distúrbio e/ou lesão pulmonar, o método compreendendo administrar ac paciente células derivadas da tecido de cordão umbilical em uma quantidade eficaz para tratar a doença, distúrbio e/ou lesão pulmonar, e dano associado a isto.

3b Em uma mudalidade particular-, a doença, distúrbio, e/ou lesão pulmonar é obstrutiva. restritiva, e/ou causada de lesões tais como aquelas associadas corn ou lavanda a AU e/c-u ARDS Ern certas modalidades, as células são induzidas in vitro a diferenciar-se em células de tecido pulmonar, por exemplo, músculo liso vascular, pericito, ou células de linhagem vascular do endotélio, antes da administração. Em outras modalidades, as células são geneticamente construídas para produzir um produto de gene que pro5 mova o tratamento de uma doença, distúrbio e/ou lesão pulmonar.

Em algumas modalidades do método, as células são administradas com peto menos um outro tipo de célula, que possa incluir as células do tecido pulmonar, por exemplo, células progenitoras do pulmão, células de músculo liso vascular, células progenitoras de músculo hso vascular, pericito.

células endotelíais vasculares, células progenitoras de endotélio vascular, ou outras células-tronco multipotentes ou pluripotentes. O outro tipo de célula poda ser administrado simultaneamente com. antes ou após as células derivadas do tecido de cordão umbilical.

Em outras modalidades, as células são administradas com pelo 15 menos urn outra agente, o qual pode ser um agente antitrombogênico, um agente anti-inflamatórío. um agente imunossupressor, um agente irnunomodulatório, pró-angiogênlco, ou um agente antíapopitótíco, por exemplo O outro agente pude ser administrado simultaneamente com. antes ou apôs as células derivadas do tecrdo de cordão umbilical.

As células são preferivelmente administradas ern ou próximas aos sítios da doença, distúrbio, e/ou lesão pulmonar, porém podem também ser administradas em locais disteis a tais sities. Eles podem ser administrados por injeção, infusão, um dispositivo vnpiantado no paciente, ou por implantação de uma matriz ou armação contendo as células. As células podem exercer um efeito trafico, tal como proliferação, no tecido pulmonar do paciente. As células podem induzir a migração de células do tecido pulmonar, por exemplo, células de músculo liso vascular, células endoteüaís vasculares. células progenitoras pulmonares, pericito. células progenitoras de músculo liso vascular, ou células progenitoras de endotélio vascular pare o sitio ou sítios de doença, distúrbio, e/ou lesão pulmonar.

Outro aspecto da invenção caracteriza composições farmacêuticas e kits para tratar um paciente tendo uma doença, distúrbio, e/ou lesão pulmonar, compreendendo um veiculo, diluente, e/ou tampão farmaueuticamente aceitáveis, e as células derivadas de tecido do cordão umbilical ou preparações feitas de tais células derivadas de tecido do cordão umbilical. Em algumas modalidades preferidas, as preparações compreendem FGF e HGF. As composições farmacêuticas e kits são designados e/ou formulados para praticar os métodos da invenção como descrito acima.

Da acordo com outro aspecto da invenção, as métodos descritos adma podem ser praticados utilizando uma preparação feita de células derivadas de tecido de cordão umbilical, em que a preparação compreende um lisaoto de célula de células derivadas de tecido de cordão umbilical, uma matriz extraoeluiar das células derivadas de tecido de cordão umbilical ou um meio condicionado no qual as células derivadas de tecido de cordão umbilical tenham crescido, È preferido que tais preparações compreendam FOF e HGF, Outro aspecto da invenção envolve praticar a invenção com produtos das células derivadas de tecido de cordão umbilical por exemplo, fatores trôficos.

Outros aspectos da invenção caracterizam as composições farmacêuticas e kits contendo preparações compreendendo Usados de célula, matrizes extracelulares ou meios condicionados das células derivadas de tecido de cordão umbilical. As composições podem também compreender um veículo, dilueale, atou tampão farmaceuticamente aceitável como conhecido na técnica.. Outros aspectos da invenção caracterizam o tratamento com composições farmacêuticas e kits compreendendo produtos das células derivadas de tecido de cordão umbilical.

Outras características e vantagens da invenção serão entendidas por referência á descrição detalhada e exemplos que seguem.

Breve Desonção.dos Desenhos

A figura 1 mostra a concentração de proteína total BALF: A proteína total foi medida utilizando um Ensaio de Proteína BCA Pierce. Cada ponto de dados representa medições obtidas de um único animal As linhas horizontais representam a média de todas as medições. Análise de teste t de Student foi realizada. Gs dados são mostrados na forma tabular abaixo (Tabela 8).

A figura 2a rnostra uma Anáfee da Gtoc/na/Qu/rn/octea cfe Hbmogerrafo de Po/rnão; as concentrações de vinte e duas citocinas/quimíocinas diferentes foram determinadas para homogenate de pulmão utilizando um kit. da 22 contas múltiplas de camundongo (Miliporo) seguindo 5 o protocolo do fabricante e analisadas utilizando a máquina BioRad Bioplex.

As barras de dados representam a média de seis amostras. Os dados são mostrados na forma tabular abaixo (figura 3),

A figura 2b mostra uma Aná/tee de Crtocrna/Qwm/oc/na de BALE: as concentrações de vinte e duas dtoclnas/quimíocinas diferentes 10 foram determinadas para BALF utilizando um kit de 22 contas múltiplas de camundongo (Millipore) seguindo o protocolo do fabricante e analisadas utilizando a máquina BioRad Bioplex. As barras de dados representam a média de seis amostras. Os dados são mostrados na forma tabular abaixo (figura 4).

A figura 3 mostra uma Arrá/Ae da C/focma/ Qu/mibsfoa de HoAs concentrações de vinte e duas citocinas/ quimíocínas diferentes foram determinadas para homogenato de pulmão utilizando um kit de 2.2 contas múltiplas de camundongo (Millipore) seguindo o protocolo do fabricante e analisadas utilizando a máquina BioRad Bioplex.

A figura 4 mostra uma anát/se de Çftecma/Qgfmteç/rra,de,BAtR as concentrações de vinte e duas citocinas/quimiocínas diferentes foram determinadas para BALF utilizando um kit de 22 contas múltiplas de camundongo (MiHipcre) seguindo o protocolo do fabricante e analisadas utilizando a máquina BioRad Bioplex.

Descrição Detalhada

Na seguinte descrição detalhada das modalidades ilustrativas, referência é feita aos desenhos acompanhantes que formam uma parte da mesma. Estas modalidades são descritas em detalhes suficientes para permitir que aqueles versados na técnica pratiquem a invenção, e é entendido 30 que outras modalidades podem ser utilizadas e que faixas lógicas, estruturais. mecânicas, elétricas e químicas podem ser feitas sem afastar-se do espírito ou escopo da invenção. Para evitar detalhes não necessários para

9/117 permitir que aqueles versados na técnica pratiquem as mudalidades descritas aqui, a descrição pede omitir cedas informações conhecidas por aqueles versados na técnica. A seguinte descrição detalhada, portanto, não deve ser considerada em um sentida lirnitanfe.

Vários termos sãu utilizados em toda a especificação e reivindicações. A tais termos deve ser dado seu significado comunm na técnica a menos que de outro modo indicado. Outros lermos espeaificamenfe definidos devem ser considerados de uma maneira de acordo com a definição fornecida aqui.

Tecido pulmonar” pode incluir, porém não está limitado a, todas as estruturas do tecido pulmonar e tecidos associados, incluindo, porém não limitado a, veias, artérias, vasos, capilares, e células do tipo que são parte de, ou associadas corn, tais estruturas; tecido pulmonar e pleural; e músculo íiso vascular, pencíto, e fenótipos e/ou linhagens endoteliais vasculares.

Como utilizado aqui, doenças, distúrbios e lesões pulmonares ou respiratórias”, incluem, porém não estão limitados a, doenças pulmonares obsirutivas, doenças pulmonares restritivas, infecções do trato respiratório (superior e inferior), tumores respiratórios, doenças da cavidade pleural, e doenças vasculares pulmonares, O dano para o tecida pulmonar causado 2.0 por estas doenças, distúrbios e/ou lesões pode ser caracterizado como dano pulmonar no escopo da presente invenção. Além disso, o tecido pulmonar danificado abrangido pela invenção inclui fadas as estruturas de tecido pulmonar e tecidos associados, incluindo veias, artérias, vasos, capilares, e células do tipo que são parte de, ou associado com, tais estruturas, Doen25 ças pulmonares obstrutivas” podem incluir COPD, fibrose cistica, bronquiectasia, bronquiohte, enfeema e aspergilose broncupulmonar alérgica. COPD, por exemplo, é causada por gases ou partículas nocivas (mais geralmerite de fumo),, que ativa uma resposta inflamafória anormal no pulrnão. A resposta inflarnatóna nas vias aéreas superiores é conhecida como bronquite crô30 nica, que- é diagnosticada dinicamonte quando pessoas regularmente tossem com expectoração. No alvéolo, a resposta inflamatória causa destruição do tecido do pulmão, um processo conhecido como enfiserna. Deve ser per

10/117 cebido que estes tecidos são aqueles associados com COPD uma vez que pertence a presente invenção. A etiologia de COPD inclui, porém não esià limitado a, fumo de tabaco, exposições ocupacionais ás poeiras do local de trabalho (per exemplo, mineração de carvão, mineração de ouro, a indústria têxtil de algodão e indústria química), poluição do ar, e genéticas.

Doenças pulmonares restritivas, como utilizado aqui, são também conhecidas como doenças pulmonares intersiiciais (ILDs). Muitas destas são diopáticas. Os exemplos incluem: fibroso pulmonar idiopátíca. pneumonia intersticial idiopátíca (vários tipos), sarcoidose. pneumonia eosinofílica, linfangioleiorniomatose, histiocitose de célula de Langerhan pulmonar, e proteinaose alveolar pulmonar. ILDs afetam o interstício do pulmão: epitélio alveolar, endotèiio capilar pulmonar, membrana basal, tecidos perivascularis e periiinfáticos, A maioria dos tipos de IIDs envolve fibrose.

Os tumores respiratórios incluem tumores tanto malignos quanto benignos. Os tumores malignos incluem, por exemplo, câncer pulmonar da célula pequena, câncer pulmonar da célula nâo pequena (adenocarcinoma, carcinoma da célula escamosa., e carcinoma não diferenciado da célula grande), linfoma, bem como outros cânceres. Os tumores benignos são raras, porém incluem hamartoma pulmonar e má formações congenitais, por exemplo.

Domo utilizado aqui, “lesão pulmonar aguda (ALI) é ama lesão pulmonar heterogênea difusa caracterizada por hipoxemia, edema pulmonar não cardlogènico. baixa complacência pulmonar e vazamento capilar frequente. All è causado por qualquer estimulo de inflamação local ou sistêmica. A slndrome da angústia respiratória aguda (ARDS) é mais grave do que All. Gomo utilizado aqui, ALI e ARDS podem ser caracterizados pelo inicio abrupto de hipoxemia com edema pulmonar difuso em resposta a lesão direta ou lesão indireta. Como utilizado aqui, lesão direta inclui, porém nâo está limitada a, lesões pulmonares decorrentes de episódios de afogamento, pneumonia, gases tóxicos inalados, contusões pulmonares. Como utilizado aqui, lesão indireto poda ser várias sepse, transfusão, choque, e pancreatite, por exemplo. Estas lesões que levam a ALI e ARDS resultam em rampimento da interface alveolar-capilar, vazamento de fiuido doo err? proteína no interstício e espaça alveolar, liberação extensiva de citocinas, e migração de neubofilos.

As doenças, distúrbios e lesões pulmonares abrangidas pelos métodos da presente invenção são conhecidos na técnica. As características de cada, incluindo comphcações. etiologies, e tratamentos associados, sâo conhecidas por· aqueles versados na técnica. Isto inclui doenças, distúrbios e lesões pulmonares não especifrcamente descritas aqui, uma vez que elas se aplicariam a doenças, distúrbios e lesões puimonares restritivos e obstruti10 vas.

As células utilizadas na presente Invenção sâa geralmente referidas como células pós-parto ou células derivadas de pés-parto (PPDCs). As células são mais específícamente células derivadas do umbigo ou células derivadas do cordão umbilical (UDC), ou ’’células derivadas do tecido do 15 cordão umbilical'' (IJTC) Aíèrn disso, as células podem ser descritas como sendo células-tronco ou progenltoras. o último termo sendo utilizado no sentido mais amplo. O termo 'derivado¹' ê utilizado para indicar que as células foram obtidas de sua fonte bsolôgíca e crescidas a de outro mada manipuladas m vdro (por exemplo, cultivadas em um meio de crescimento para ex20 pandir a população e/ou produzir a linhagem celular). As manipulações rn vrfro de células do tronco umbilical e as únicas características das células derivadas do umbigo da presente invenção são descritas em detalhas abai xo.

As células-tronco são células não diferenciadas definidas pela 25 capacidade de uma única célula tanto se autcmenovar. quanto se diferenciar produzir células progenies, incluindo progenitores autorrenovadores, progenitores não renovadores, e células terminaimente diferenciadas. As célulastronco são também caracterizadas par sus capacidade de se diferenciar m vfeu em células funcionais de várias linhagens celulares de múltiplas cama30 das de germinativas (endoderma. mesuderma e eotoderma), bem como para dar origens aos tecidos de múltiplas camadas germinativas em segusda aa transplante, e para contribuir substancialmente com a maioria, se não todos, os tecidos em seguida a injeção em blastocistos.

As células-tronoo são classificadas de acordo com seu potencial de desenvolvimento como: (1) totípotente; (2) píuripotente; (3) multipotente; (4) oligopotente; e (5) onipotente. As células totípotentes são capazes de dar 5 origem a todos os tipos de célula embriônica e extraembriônica. As células pluripotentes são capazes de dar origem a todos os tipos de célula embriônica. As células multipotentes incluem aquelas capazes de dar origem a um subgrupo de linhagens celular, porém todas em um tecido, órgão, ou sistema fisiológico particular; Por exemplo, as células-tranco hematopoiéticas (HSC) 10 podem produzir progênie que inclui HSC (autorrenovação), progenitores oil·· gopotentes restritas a células sanguíneas, e todos os tipos de célula e elementos (por exemplo, plaquetas) que são componentes normais do sangue. As células qua são oligopotent.es podem dar origem a um subgrupo mais restrito de linhagens celulares do que as céluías-tronco multipotentes. As 15 células que são onipotentes são capazes de dar origem a uma linhagem de célula única (por exemplo, células tronco espermatogènicas).

As células-tronco são também categorizados com base na fonte da qual eias são obtidas. Uma célula-tronco de adulto é geralmente uma célula não diferenciada multipotente encontrada no tecido compreendendo 20 múltiplos tipos de célula diferenciada. A oélula-ironco de adulto pode se autorrenovar. Sob circunstâncias normais, pode também se diferenciar para produzir os tipos de célula especializadas do tecido do qual ela se originou, e possivelmente outros tipos de tecido. Uma célula-tronco embriônica é uma célula pluripotente da massa celular interna de um embrião de estágio de 25 blastocisto. Uma célula-tronco fetal è uma que se origina de tecidos ou membranas teíais. Uma célula-tronco pós parto é uma célula muítipotenie ou pluripotente que se origina subslancialrnente do tecido extraem briônico disponível após o nascimento, isto é. o cordão umbilical. Descobriu-se que estas células possuem aspectos característicos de células-tronco pluripotentes, 30 incluindo proliferação rápida e o potencial para diferenciação em muitas linhagens de célula. As cèlulas-troncn pós-parto podem ser derivadas de sangue (por exemplo, como sâo aquelas obtidas de sangue do cordão umbi lical) go não derivadas do sangue (pur exempla, cama obtido dos tecidos não sanguíneos do cordão umbilical e placenta).

Vários termos são utilizados para descrever células em cultura, Cultura de célula refere-se geralrnenle ás células tornadas de um organis5 mo vivo e crescidas em condições controladas (em cultura ou cultivadas). Uma cultura de célula pnmâna é uma cultura de células. tecidos, ou órgãos tomadas diretamenfe de um(uns) organismo(s) antes da primeira subculture. As células são expandidas em cultura quando elas são colocadas em um meio de crescrmenlo sob condições que facilitem a divisão e/ou crescimento 10 de célula, resultando em uma população maior das células. Quando as células são expandidas em cultura, a taxa de proliferação celular é algumas vezes medida pela quantidade de tempo necessário para as células dobrarem de número. Isto é retendo como tempo de duplicação.

O termo linhagem celular geralmente refere-se a uma papula15 ção de células formada por urn ou mate subculíivos de uma cultura celular primária. Cada rodada de subcultivo é referida como uma passagem. Quando as células são subcultivadas, elas são referidas corno tendo sido passadas. Uma população específica de células, ou urna linhagem celular, é algumas vezes referida ou caracterizada paio número de vezes que ela tenha 20 sido passada. Por exemplo, uma população de célula cultivada que foi passada dez vezes pode ser referida corno uma cultura PIO. A cultura primária, isto é, a primeira cultura em seguida ao isolamento de células de tecido, é designada PO. Em seguida a primeira subculture, as células são descritas como uma cultura secundária (PI ou passagem 1).. Apôs a segunda subcuí25 tura, as células so tornam urna cultura terciária (P2 ou passagem 2), a assim por diante. Será entendido por aqueles versadas na técnica que podem haver' muitas duplicações de população durante o período de passagem: portanto o número de duplicações de população de uma cultura è maior do que o número de passagem. A expansão de células (teto è, o número de dupfica30 cues de população) durante o período entre a passagem depende de muitos fatores, incluindo, porém não limitado a, densidadeda semeacão, substrato, melo, condições de crescimento, e tempo entre a passagem.

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Diferenciação” é o processo pelo qual uma célula não especializada (não associado) ou monas especializada adquire as características de uma oéluia especializada, tal como uma célula nervosa ou urna célula do músculo, por exemplo, Uma célula diferenciada” é uma que tenha assumido 5 uma posição mais especializada (associada) na linhagem de urna célula. O termo associado, quando aplicado ao processo de diferenciação, refere-se? a uma célula que prosseguiu na série de reação de diferenciação para um ponto onde, sob circunstâncias normais, continuará a diferenciar em um tipo de célula específico ou subgrupo de tipos de célula, e não pode, sub circuns10 tãncias normais, se diferenciar em um tipo de célula diferente ou reverter para um tipo de célula menos diferenciado. Desdiferenciação refere-se ao processo pelo qual uma célula se reverte para uma posição means especializada (ou associada) na linhagem de urna célula. Como utilizado aqui, a “linhagem” de uma célula define a hereditariedade da célula, isto é, cujas célu15 Ias vêm de e cujas células podem dar origem a. A linhagem de uma célula coloca a célula dentro de um esquema hereditário da desenvolvimento e diferenciação.

Em um amplo sentido, uma célula progenitors é uma célula que tem a capacidade de criar progènie que são mais diferenciados do que o 20 próprio, e ainda mantém a capacidade de reabastecei' o conjunto de progenitores. Por esta definição, as células-lronco propriamente ditas são também células progonitoras. uma vez que são os precursores mais imediatos para células tenmlnaimente diferenciadas. Ao referir-se como células da presente invenção, como descrito em maiores detalhes abaixo, esta ampla definição 25 de célula progenitors pode ser utilizada. Em um sentido mais estreito, uma célula progenitora é geralmente definida como uma célula que é intermediária na série de reações de diferenciação, isto é, surge de uma célula-tronco e é intermediária na produção de um tipo de célula madura ou subgrupo de tipos de célula. Este tipo de célula progenitora é geral.mente não capaz de se 30 autorrenovar, Consequentemente, se este tipo de célula é referido aqui, eia será referida como uma ’’célula progenitora não renovadora ou como uma célula precursora ou progenitora intermediária”.

Vários termos são utilizados aqui com respeito au transplante de célula ou tecido; eu terapia de substituição de célula. Os termos “transferên cia de autólogo, transpiante de autólogo, ’’autoenxerto’’ e similares se referem aos tratamentos em que o doador de célula ou transplante é também o 5 recipiente de célula ou transplante. Os termos transferência alogeneica, ’'transplante alogeneico. aloenxerto” e similares referem-se aos tratamentos em que o doador de célula ou transplante é da mesma espécie como o recipiente, porém não é o mesmo indivíduo. Uma transferência de célula na qual as células do deader foram histocompatívelmente combinadas oom um 0 recipiente é algumas vezes referida como uma “transferência síngeneica.

Os termos ’’transferência xenogeneíca”, transplante xenageneic-c, ’’xenoenxerto e similares referem-se ao transplante em que o doador de célula ou transplante é de uma espécie diferente do que o recipiente.

Os termos ’’veículo farmaceuticamente aceitável ou ’’meio far5 maoeutica.mente aceitável que podem ser utilizados alternadamente com os termos 'Veículo biologicamente compatível ou meio biologicamente compatível geralmente refere-se a reagentes, células, compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que são não somente compatíveis com as células e outros agentes a serem administrados terapeuticamente, porém 0 também são, adequados para uso em contate cem os tecidos de seres humanos e animals sem toxicidade, irritação, resposta alérgica excessivas, ou outra complicação comensurada com uma relação de benefício/rísco razoável. Cume descrito urn maiores detalhes aqui, veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados para uso na presente invenção incluem materiais 115 quidos, semíssólldos (por exemplo, géis) e sólidos (por exemplo, armações e matrizes de célula, tubos, folhas e outros tais materiais conhecidos na técnica e descritos era .maiores detalhes aqui), Estas materiais semissólídos e sólidos podem ser designados para resistir a. degradação no corpo (não biodegradável) ou eles podem ser designados para degradar no corpo (biode0 gradãvel, bioerosível). Um material biodegradável pode também ser biorreabsorvível ou breabsorvivei, isto é, pode ser dissolvido e absorvido em fluidos carpôreos (implantes solúveis ern água são um exemplo), ou degrada dos e por último eliminados do corpo, ou por conversão um outros materiais ou quebrados e eliminados através de série de reações naturais. A taxa de biodegradação pede variar de acordo corn a taxa de hberaçãc desejada uma vez implantada nu corpo,

Um rneiu condicionado é um rneiu nu qual uma célula especifica ou população de células foi cultivada, e em seguida removida. Quando as células são cultivadas em um rneiu, elas podem secretar fatores celulares que podem fornecer suporte tròtico a outras células. Tais fatures trôfioos in cluem, porém não estão limitados a, hormônios, citocínas. matriz extraceíular 10 (ECM), proteínas, vesículas, anticorpos, e grânulos. O meio contendo os fatures celulares é o rneiu corrdicionadu.

Geralmente, um fator tráfico é definido como uma substância que promove sobrevivência, crescimento, proliferação e/ou maturação de uma célula, ou estimula a afrvidade aumentada de uma célula.

Como utilizada aquç o termo meio de crescimento'' geralmente refere-se a um melo suficiente para cultiva de células derivadas de põsparto. Em particular, um meio atualmente preferido para o cultivo das células da Invenção compreende Meio Essencial Modificado de Dulbecco (DMEM). Particuiarmente preferida é DMEM com baixo teor de glucose (DMEM-LG) 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, Calif). O DMEMT..G é preferivelmente suplementado cum soro, mais preferivelmente soro bovino fetal ou soro humano. Tipicamente, 15% (v/v) de soro bovina fetal (por exemplo, soro bovino fetal definido, Hyclone, Logar? Utah) é adicionado, junta com antibióticos/antimicóticus (preferivelmente 100 Unidade/milílitro de penicihna, 100 miiigramas/mililitro 25 de est.raptumicina, e 0,25 micrograma/miliiitro de anfate-ricina B; (Invitrogen,

Carlsbad, Calif.)), e 0.001% (v/v) de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis Μα.). E.m alguns casos diferentes meios de crescimento são utilizados ou diferentes supiementaçoes são fornecidas, e estes são nurmaimente indicados no texto como suptementações para α rneiu de crescimento. Em certos 3Q meios quimicamente definidos as células podem ser crescidas sem soro presente de modo algum. Em tais casos, as células podem requerer certos fatores de crescimento, que podem ser adicionados ao meio para suportar e manter as células. Os fatores atualmente preferidos a sarem adicionados para o crescimento em meios livres de soro incluem um ou mais dentro bFGF. EGF, IGF-I, e PDGF. Em modalidades mais preferidas, dois, três ou todos os quarto fatores são adicionados ao rnelo químicamente definido ou livre de soro. Em outras modalidades, LIF è adicionado ao meio livre de soro para suportar ou melhorar o crescimento das células.

O termo condições de crescimento padrão, como utilizado aqui refere-se ao cultivo de células a 37*0. em uma atmosfera padrão compreendendo 5% de CO? e umidade relativa mantida em cerca de 100%. Ao mesmo tempo em que as condições anteriores são úteis para o cultivo, é para ser entendido que tais condições são capazes de ser variadas pelo versada o qual apreciará as opções disponíveis na técnica para cultivo de células.

O termo quantidade eficaz refere-se a uma concentração ou quantidade de um composto, material, ou composição, como descrito aqui, que é eficaz para obter um resultado biológico particular. Tais resultados incluem, porém não estão limitados á regeneração, reparo, ou melhora do tecido esqueletai, a melhora do fluxo sanguíneo, e/ou □ estímulo e/ou o suporte de angiagênese em pacientes com dano pulmonar de tais doenças, distúrbios e lesões no escopo desta invenção. Tal atividade eficaz pude ser obtida, por exemplo, administrando-se as células e/ou composições da presente invenção a pacientes com dano pulmonar corno descrito aqui. Com respeito a administração de UTC a um paciente m vivo, uma quantidade eficaz pode variar de tão pouca quanto varias centenas ou menos, a tanto quanto vários milhões ou mais. Em modalidades especificas, uma quantidade eficaz pode ser de cerca de 1CF a cerca de 10'' células mais especificamente. pelo menos cerca de IO⁴ células. Será apreciado que o número de células a ser administrado variará dependendo das especificidades da doença, distúrbio ou lesão pulmonar a ser tratada, incluindo, porém não limitado ao tamanho ou volume totalfárea de superfície a ser tratada, e a proximidade do sítio de administração ao local da região a ser tratada, entre outros fatores familiares com o biólogo medicinal.

Os termos tratar”, tratando ou tratamento'· refere-se a qual quer sucesso ou indícios de sucesso na atenuação ou melhora de urna lesão, patologia ou condição, incluindo qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo tal como moderação, remissão, diminuição de sintomas ou tornando a lesão, patologia, ou condição mais tolerável ao paciente, tornando mais lenta 5 a taxa de degeneração ou declínio, tornando o ponto final de degeneração menos debilítante, melhorando um bem-estar montai ou físico do paciente, ou prolongando a duração da sobrevivência, O tratamento ou melhora dos sintomas pode ser corn base nos parâmetros objetivos ou subjetivos; Incluindo os resultados de um exame físico, ou exame neurológico.

Os termos ''periodo eficaz, período de tempo eficaz ou condições efioaz.es” referem-se geralmente a um período de tempo ou outras condições controláveis (por exemplo, temperatura, umidade para métodos m who) necessár ias ou preferidas para um agente ou composição farmacêutica para obter seu resultado pretendido,

Qs termos indivíduo. paciente ou sujeito são utilizados alternadamente aqus, e referem-se aos animais, preferivelmente mamíferos, e mais preferivelmente humanos, os quais são tratados com as composições farmacêuticas ou terapêuticas ou de acordo com os métodos descritos aqui.

O termo matnz. coma utdiz.ado aqui geralmsnfe refere-se a ma20 feriais biodegradáveis efou biorreabsorvíveis que são administrados como células a um paciente, A matriz pode agir como uma armação temporária até que substituída por células recentemente crescidas, tais como, músculo esqueletai, pericito, músculo liso vascular, ou tecido endotelial vascular. Em algumas modalidades, a rnatriz pode fornecer a liberação prolongada de fa25 fores tráficos ou outros .agentes utilizados em conjunto com as células e pode fornecer uma estrutura para o desenvolvimento de crescimento de tecido no paciente. Em outras modalidades, a matriz simplesmente fornece uma armação temporária para o desenvolvimento de tecido. A matriz pode estar na forma particuiada (macroparficuias maiores do que 10 microns em diâme30 tro ou microparticuias menores do que 10 microns em diâmetro), ou pode estar na forma de um implante tridimensiorrai estruturalmente estável (por exemplo, uma armação) A matriz pode ser urna suspensão, hídrogel ou uma

19/117 estrutura tndimensional tal como um cubo, cilindro, tubo, bloco, película, folha ou urna forma anatômica apropriada.

O termo armação como utilizado aqui geralmente refere-se a uma estrutura porosa tridimensional que fornece um modelo para arescimen5 1o de célula. .A armação é feífa de- rnatenais biodegradáveis e/ou bíorreabsorvíveis que se degradam com o passar do tempo no corpo. A duração de tempo levada para a armação degradar pode depender do peso molecular dos materiais. Desse modo, o material de peso molecular mais elevado pode resultar ern armações de polímero que mantém sua Integridade estrutural 10 durante períodos mais longos de tempo; ao mesmo tempo em que os pesos moleculares mais baixos resultam em liberação rnais lenta e vidas de armação mais curtas. A armação pude ser feita por qualquer meio conhecido na técnica. Os exemplos de polímeros que podem ser utilizados para formar a armação incluem os polímeros naturais e sintéticos.

O termo isolado como utilizado aqui geralmente refere-se a uma oèlula que foi separada de seu ambiente natural. Este ierrno inclui separação física bruta de seu ambiente natural, por exemplo, remoção do animal doador. Em modalidades preferidas, uma célula isolada não está presente em um tecido, isto é, a célula é separada ou dissociada das células 20 vizinhas corn a qual ela está normaknente ern contato. Preferivelmente, as células são administradas corno urna suspensão de célula. Gomo utilizada aqui, 3 frase suspensão de célula inclui células que estão em contato com um meio e que tenham sido dissociadas, por exemplo, submetendo-se um pedaço de tecido a trtturação suave.

Em suas várias modalidades descritas aqui, a presente invenção caracteriza métodos e composições farmacêuticas para tratamento de doenças, distúrbios e/ou lesões pulmonares que utilizam células progenít.oras e populações de célula derivadas de tecidos pós-parto, tecidos do umbigo em particular. Estes métodos e composições farmacêuticas são designados pa30 ra estimular e sustentar a angiogênese, para melhorar o fluxo sanguíneo, para regenerar, reparar, e melhorar tecido pulmonar danificado per uma doença, distúrbio e/ou lesão pulmonar, e/ou para proteger o tecido pulmonar de tais doenças, distúrbios e/ou lesões. As células, populações da célula e preparações compreendendo Usados de célula, meios condicionadas e similares. utilizados nas preparações farmacêuticas e métodos da presente invenção são descntos em detalhes nas Publicações de Patente US N^os. 2005/00322.Ü9, 2005/0058631 e 2005/0054098, e também aqui abaixo.

De acordo com as métodos descritos aqui. um cordão umbilical de mamífero é recuperado até ou logo após o térmico de uma gravidez de pré-termo ou termo completo, por exemplo, após expulsão do nascimento. O tecido pés-parto pode ser transportado do sitia de nascimento para um laburatòrio em um recipiente estéril tal somo um frasco, béquer, prato de cultura, ou bolsa. O recipiente pude ter uma solução ou meio, incluindo, porém uãc· limitada a ruma solução de sal, tal corno Meio Eagles .Modificado de Dulbecco (DME.M) (também conhecido como Melo Essencial Mínimo de Dulbecco) ou salina tamponada de fosfato (F’BS), ou qualquer soluças utilizada para o transporte de? órgãos utilizados para transplante, tal como solução de University of Wisconsin ou solução perfluoruqulmíca, Um ou mais agentes antibióticos e/ou antimicòticos, tais como, porém não limitados a, penicilina, estreptomicina, anfotericina 8, gentamicina, e nistatina, podem ser adicionados ao meio ou tampão. O tecida pés-parto pude ser enxaguado com uma solução antiooagulante tal como solução contendo heparina. E preferível manter o tecido em cerca de 4 a coroa de 1CEC antes da extração do UTC. É ainda rnais preferível que o tecido nãe seja congelado antes da extração do UTC.

O isolamento do UTC preferivelmente ocorre em um ambiente asséptico. O cordão umbilical pode ser separado da placenta por meios conhecidos na técnica. O sangue e resíduos são preferivelmente removidas da tecido pós-parto antes do isolamento de UTC. Por exemplo, o tecido pésparto pode ser lavado com solução de tamponarnento, incluindo, porém não limitado a salina tamponade de fosfato O tampão de lavagem também pode compreender um ou mais agentes antimicòtico e/ou antibiótico, incluindo, porém não limitado a penicilina, estreptumicina, anfotericina 8, gentamicins, e nistatina.

O tecido pós-parto compreendendo um cordão umbilical, ou um

21/117 fragmento ou seção do mesmo, è preferivelmente desagregada por força mecânica (forças de picadura ou cisalhamento). Em uma modalidade atualmente preferida, o procedimento de Isolamento também utiliza um processo de digestão enzlmàiioa. Muitas enzimas são conhecidas na técnica por se5 rem úteis para o isolamento de células individuais de matrizes de tecido complexas para facilitar o crescimento e.m cultura. As enzimas de digestão variam de fracamente digestiva (por exemplo, deoxirribonucleases e a protease neutral, dispase) para fortemenfe digestivo (por exemplo, papaína e tripsina), e estão comercia imente disponíveis, Uma lista não exaustiva de tais 10 enzimas incluem atividades de enzima muoolítlca, meíaloproleases, proteases neutras, serina proteases (tais como tripsina, químiotrípsina, ou elastase), e deoxírribonucíeases. Atualmente preferidas são atividades de enzima selecionadas de metaloproteases, proteases neutras e atividades muoolíücas. Por exemplo, colagenases são conhecidas por serem úteis para isolar 15 várias células de tecidas. Deoxirribanucieases podem digerir DNA de fita única e podem minimizar a formação de grumo de célula durante o isolamento. Métodos preferidos envolvem tratamento enzimático com colagenase e dispose, ou colagenase, dispase, e niaiuronidase O técnico versado apreciará que muitos tais tratamentos de enzima são conhecidos na técnica para 20 isolar células de várias fontes de tecido, e é bernequipado para auxiliar novas e adicionais enzimas ou combinações de enzimas para sua utilidade no isolamento das células da invenção. Os tratamentos de enzima preferidos podem se?· de cerca de 0,5 a duas horas de duração ou mais longos. Ern outras modalidades preferidas, o tecido é incubado em cerca de- 37'C duram 25 te o tratamento de enzima da etapa de dissociação.

As células isoladas podem ser utilizadas para iniciar, ou semear, culturas de célula. As células isoladas são transferidas para vasos de cultura de tecido estéreis não revestidos ou revestidas com matriz extracelular ou ügantes tais como laminina, colâgeno (nativo, desnaturade ou reticulado), 30 gelatina, ffbronectlna, e outras proteínas de matriz exfrace.lular. As células são cultivadas em qualquer meio de cultura capaz de sustentar o crescimento da célula tal como, porém não limitado a, DME.M (glicose elevada ou bai

22/11 xa), DMEM avançada, QMEM/.MCDB 201, meia basal de Eagle, meio FIO de Ham (FIO), meio F-2 de Ham (F 12), mala de Dubelcco modificada de iscove, Meie de crescimento de célula-tronco mesenquirnal (MSCGM), DMEM/F12. RPMl 1640, e meio livre de soro/veiculo vendido sob o name comercial CELL-GRO-FREE (Mechatch, inc., Herndon, Va.), O meio de cultura pode ser suplementado com um ou mais componentes incluindo, por exemplo, soro bovina fetal (FBS), preferivelmente cerca de 2-15% (v/v); soro equino (ES); saro hurnano (HS); beta-meroaptoetanol (8ME ou 2-ME), preferivelmente cerca de 0,001% (v/v); um ou mais fatores de crescimento, por exemplo, fator de crescimento derivado de píaqueta (PDGF), fator do crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fíbrcblasto (FGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator-1 de crescimento semelhante a insulina (IGF-l), fator inibidor de ieucócitc (LIF) e eritropoietína (EPO); aminoécidos, incluindo L-vahna: e um ou mais agentes antibióticos e/ou ardímicòtico para controlar a contaminação miorobiana, tal como penicilina

G, sulfato de estreptornicina, anfolericina B, gentamicina, e nistatina. sozinho ou em combinação. O maio der cultura preferivelmente compreende meio de crescimento (por exemplo, DMF-M corn baixo teor de glicose, sara, BME: e um agente antibiótico).

As células são semeadas em vasos de cultura em urna densidade para permitir o crescimento da célula. Em ume modalidade preferida, as células são cultivadas em cerca de 0 a cerca de 5 por cento em volume de CQ,> no ar. Em algumas modalidades preferidas, as células são cultivadas em cerca de 2 a cerca de 25 per cento de O? em ar. preferivelmente cerca de 5 a cerca de 20 por cento de O₂ em ar. As células preferivelmente são cultivadas em uma temperatura de cerca de 25 a cerca da 40^:’C e mais preferivelmente são cultivadas em 37^:>C, As células são preferivelmente cultivadas em uma incubadora.. O meio na vasa de cultura pode ser estético ou agitada, por exempla, utilizando um biorreator, O UTC ê preferivelmente crescido em baixa tensão oxidaíiva (por exemplo, cam a adição de glutationa, vitamina C, catalase, vitamina E, N-aceiilcisteina). ‘Baixa tensão oxidative, como utilizada aqui, refere-se às condições de nenhum ou mínimos danos de radicais livres às células cultivadas.

Os métodos para s seleção do meio de cultura mais apropriado, preparação de meio, e técnicas de cultura de célula são bem-conhecidos na técnica e são descritos em uma variedade de fontes, incluindo Doyle e outros.. (eds.), 1995, Cell & Tissue Cultura: laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester: e Ho e Wang (eds.), 1991, Animal Cell Bioreactors, Butterworth-Heinemann, Boston, que estão Incorporados aqui por referência.

Em algumas modalidades da invenção, o UTC é passado, ou removida para um recipiente de cultura separada contendo meio fresco do mesmo ou um diferente tipo como aquele utilizado inicialmente, onde a população de células pode ser mitoticamente expandida. As células da invenção podem ser utilizadas ern qualquer ponto entre a passagem 0 e senescência. As células preferivelmente são passadas entre cerca de 3 e cerca de 25 vezes, mais preferivelmente são passadas cerca de 4 a cerca de 12 vezes, e preferivelmente são passados 10 ou 11 vezes A clonagem e/ou subclanagem podem ser realizadas para confirmar que uma população clonal de células foi isolada.

Em alguns aspectos da invenção, os tipos diferentes de célula presentes nu tecido põs-parfo são fraoionados em subpopulações das quais o UTC pude ser isolada. 0 fracionamento ou seleção pude ser realizada- utilizando técnicas padrões para separação celular incluindo, porém não limita do a, tratamento enzimátíco para dissociar o tecido pós-parto em suas células componentes, seguido por clonagem e seleção de tipos de célula especificas, incluindo, porém não limitados a: seleção com base nos marcadores murfológicos e/au bioquímicos; crescimento seletivo de células desejadas (seleção positiva): destruição seletiva de células indeseiadas (seleção negativa); separação cam base em agiutmabilidade de célula diferencial na população misturada coma, por exemplo, son? aglutinína da saia: procedimentos de congelamento-descongelsmento; propriedades de aderência diferencial das células na população misturada; filtraçac·; oentrifugação convencional e zonal; elutriação centrífuga (centrifugação contracorrente); separação de gravidade de unidade; distribuição contracorrente; eletroforese; e classifica24/117 cão de célula ativada por fluorescência (FACS).

O meio de cultura é mudado quando necessário. Por exemplo, cuidadosamente aspirando-se o meio do prato com uma pipeta, e reabastecendo com meio fresco. A incubação é ermtirmada até que um numero sufi5 ciente ou densidade de células se acumule no prata. Por conseguinte, qualquer seção de tecido original expíantado que existe pode se? removido e as células restantes separadas do prato por tripsinização utilizando técnicas padrões ou utilizando-se um raspador de célula. Após tripsinizaçác, as células são coletadas, removidas para meio fresco e incubadas como acima Em 10 algumas modalidades, o meio é mudado pelo menos uma vez em aproximadamente 24 horas pós-tnpsinização para remover qualquer célula flutuante. As células restantes em cultura são consideradas serem UTC,

O UTC pode ser oriooonservado. Consequentemente. em uma modalidade preferida descrita em maiores detalhes abaixa, o UTC para 15 transferência autôíoga (para a mãe ou criança) pode ser derivada de tecidos pós-parto apropriados em seguida ao nascimento de uma criança, em seguida crioconsenrado de modo a estar disponível no evento que mais tarde são necessários para transporte.

O UTC pode ser caracterizado, por exempla, por características 20 de crescimento (par exemplo, capacidade de duplicação de população, tem po de duplicação, passagens para senescencia), análise de cariòtipo (por exempla, cariòtipo normal; linhagem maternal ou necaatai). cstometha de fluxo (por exemplo, análise de FACS), imuno-hístoquímica e/ou imunocitoquimlca (por exemplo, para detecção de epitopes), perfil de expressão de 25 gene (par exemplo, disposições de fragmento de gene; reação em cadeia de polsmemse (por exemplo, PCR de transcriptase reversa, PCR de tempo mal e PCR convencionai)), as disposições de proteína, secreção de proteína (por exemplo, por ensaio de coaguíação de plasma ou análise de meso condicionado por PDC, par exemple, por Ensaio Irnunossorvente Ligado a Enzima 30 (ELISA)), reação de liníbcito misturada (por exemplo, como medido de estimulação de PBMCs), e/ou outros métodos conhecidos na técnica.

Os exemplos de UTC derivados de tecido do umbigo foram de25/117 positados com a Coleção de Cultura do Tipo Americano em 10 de Junho de 2004, e designado Números de Acessão ATCC como segue: (1) designação de cepa UMB 022803 (P7) foi designada N°. de Acessão PTA-6067; e (2) designação de cepa UMB 022803 (P17) foi designado ο N. de Acessão 5 PTA-6068.

Em várias modalidades, o UTC possui uma ou mais das seguintes características: (1) elas requerem L-valina para crescimento em cultura; (2) elas são capazes de crescer em atmosferas contendo oxigênio de cerca de 5% a cerca de 20%; (3) elas têm o potencial para pelo menos cerca de 40 10 duplicações em cultura antes de atingir senescência; e (4) elas se prendem e expandem em vasos de cultura de tecido que são não revestidos, ou que são revestidos com gelatina, laminina, colágeno, poliornitina, vitronectina ou fíbronectina.

Em certas modalidades o UTC possui um cariótipo normal, que é 15 mantido quando as células são passadas. Os métodos para cariotipagem estão disponíveis e são conhecidos por aqueles versados na técnica.

Em outras modalidades, o UTC pode ser caracterizado por produção de certas proteínas, incluindo: (1) produção de pelo menos um fator de tecido, vimentina, e alfa-actina do músculo liso; e (2) produção 20 de pelo menos um dentre marcadores de superfície de célula CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 e HLA-A₅B, C, quando detectados por citometria de fluxo. Em outras modalidades, o UTC pode ser caracterizado por falta de produção de pelo menos um dentre marcadores de superfície de célula CD31, CD34, CD45, CD80, CD86 25 CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G, e HLA-DR, DP, DQ, quando detectado por citometria de fluxo. Particularmente preferidas são as células que produzem pelo menos dois dentre: fator de tecido; vimentina; e alfaactinia do músculo liso. Mais preferidas são aquelas células produzindo ^{t0das as três proteínas: fator de} tecido; vimentina; e alfa-actinia do mús30 culo liso.

Em outras modalidades, o UTC pode ser caracterizado nnr

26/117 blasto, uma célula-tronco mesenquimal, ou uma célula da medula óssea da cnsta iliaca, é aumentado para um gene codificando pelo menos um dentre: interleucina 8; reticulon 1; ligante 1 de quimiocina (motivo C-X-C) (atividade de estimulação de crescimento de melonoma, alfa); ligante 6 de 5 quimiocina (motivo C-X-C) (proteína quimiotática de granulócito 2)· ligante 3 de quimiocina (motivo C-X-C); e fator de necrose de tumor, proteína alfa-índuzida 3.

Em ainda outras modalidades, o UTC pode ser caracterizado por expressão de gene, que relativo a uma célula humana que é um fi10 broblasto, uma célula-tronco mesenquimal, ou uma célula da medula ossea da crista iliaca, é reduzida para um gene codificando pelo menos um dentre: homeobox 2 de estatura pequena; proteína 2 de 27 kDa de choque térmico; ligante 12 de quimiocina (motivo C-X-C) (fator 1 derivado de célula estromal); elastina (estenose aórtica supravalvular, síndro15 me de Williams-Beuren); mRNA de Homo sapiens·, cDNA DKFZP586M2022 (de clone DKFZp586M2022); homeo box 2 da mesènquima (homeo box específico de interrupção de crescimento); homólogo 1 de homeobox sine oculis (Drosophila); cristalina, alfa B; ativador associado desgrenhado de morfogênese 2; proteína DKFZP586B2420; simi20 lar a neuralina 1; tetranectina (proteína de ligação de plasminogênio)· tres homólogas de src (SH3) e domínio rico em cisteina; colesterol 25hidroxilase; fator 3 de transcrição relacionado com runt; receptor de interleucina 11, alfa; realçador de C-endopeptidase de procolágeno; homólogo 7 frizado (Drosophila); gene hipotético BC008967; colágeno, tipo 25 VIII, alfa 1; tenascina C (hexabraquiona); proteína 5 de homeobox de iroquois; hefaestina; integrina, beta 8; glicoproteína 2 de vesículo sinápbco; neuroblastoma, supressão de tumorigenicidade 1; proteína 2 de ligação de fator de crescimento semelhante a insulina, 36 kDa; cDNA FLJ12280 fís de Homo sapiens, clone MAMMAI 001744; fator 1 seme30 lhante ao receptor de citocina; canal ativado por cálcio de condutância pequena/intermediário de potássio, subfamilia N. memhrn a·

27/117 homólogo 2 de homeobox de sine oculis (Drosophila); proteína KIAAI 034; proteína 5 de membrana associada a vesícula (miobrevina); proteína 1 de matriz extracelular semelhante a fibulina contendo EGF; resposta 3 de crescimento precoce; homeo box 5 menos distal; proteína hipoté5 tica FLJ20373; família 1 de aldo-ceto reductase, membro C3 (3-alfa hidroxiesteroide deidrogenase, tipo II); biglican; co-ativador transcricional com motivo de ligação de PDZ (TAZ); fibronectina 1; proencefalina; mtegrina, beta-tipo 1 (com domínios de repetição semelhante a EGF)' clone EUROIMAGE 1968422 de cDNA de inserção de tamanho natural 10 de mRNA de Homo sapiens; EphA3; proteína KIAA0367; receptor C de peptideo natriurético/ciclase C de guanilato (receptor C de peptideo atrionatnurético); proteína FLJ 14054 hipotética; mRNA de Homo sapiens; cDNA DKFZp564B222 (de clone DKFZp564B222); tipo proteína 3 de interação com BCL2/adenovirus EIB 19 kDa; proteína 1 de ligação de 15 AE; e polipeptideo 1 de Vila de subunidade de oxidase de citocroma c (músculo).

Em outras modalidades, o UTC pode ser caracterizado por secreção de pelo menos um dentre: MCP-I, IL-6; IL-8, GCP-2; HGF; KGF; FGF, ΗΒ-EGF; BDNF; TPO; MIPIb; I309; MDC; RANTES; e TIMPI Em al gumas modalidades, o UTC pode ser caracterizado por falta de secreção de pelo menos um dentre: TGF-beta2; ANG2; PDGFbb; MIPIa; e VEGF, como detectado por ELISA.

Em algumas modalidades preferidas, o UTC é derivado de tecido de cordão umbilical substancialmente livre de sangue, são capazes de 25 autorrenovação e expansão em cultura, requer L-valina para o crescimento, pode crescer em pelo menos cerca de 5% de oxigênio, e compreende pelo menos uma das seguintes características: (1) o potencial para pelo menos cerca de 40 duplicações em cultura; (2) a capacidade de se prender e se expandir em um vaso de cultura de tecido não revestido ou um revestido 30 com gelatina, laminma, colágeno, poliornitina, vitronectina, ou fibronectina· (3) produção de vimentina e alfa-actina de músculo liso; (4) produção de CD 1Ω

28/117 vo a uma célula humana que é um fibroblasto, uma céíula-tronco mesenquímal, ou uma célula da medula óssea da crista ilíaca, é aumentado para um gane codificando interleucma 8 e retíciJlon 1. Em algumas modalidades, tal UTC não produz CD45 e CD117.

O UTC descrito acima pode ser utilizado em métodos para tratar um paciente tendo doença vascular periférica, pode ser utilizada em campassgães farmacêuticas para tratar doença vascular periférica, por exempla, em que talo composições compreendem as células tendo estas características e um veiculo farmaceuticamenle aceitável, e pode ser utilizada em kits para a 1Q fabricação, uso e prática de tais métodos e composições farmacêuticas como descrito e exemplificado aqui. Além disso, o UTC como descrito anima pude ser utilizado para gerar meios de cultura de célula condicionados ou para fazer preparações tais como extratas de célula e frações subceíuiares que podem ser utilizadas para fabricar, utilizar, e praticar tais métodos e 15 composições farmacêuticas como descrito e exemplificado aqui.

Eot modalidades preferidas, a célula compreende dais ou mais do crescimento listado acima, produção de marcador de proteína/superfície, expressão de gene ou características de secreção de substância. Mais preferida é uma célula compreende ado, três, quarto, cinca ou mais das caracte20 rísikas, Ainda mais preferidos sâo UTC compreendendo seis, sete, oito au mais das características. Atualmente ainda mais preferida é uma célula compreendendo todas as características acima.

Entre as células que são atualmente preferidas para uso com a invenção em vários de seus aspectos são UTC tenda as características des25 critas acima, e mais partícularmerite, aqueles em que as células têm cmlòtipos normais e mantêm eariàtipos normais com a passagem, a também em qua as células expressam cada dos marcadores CD10, CD13, CD44, GD73, CD90, PDGFr-alfa, a HL.A-A,B,C, e em que as células produzem proteínas imunologícamente detectáveís que correspondem aos marcadores listados. Ainda 30 mais preferidas são aquelas células que, além da anterior, não produzem proteínas que correspondem a quaisquer das marcadores CD31 . CD34, CD45, CDT17, CD141, ou HLA-DR.DP,DQ, como detectado por citometria de fluxo.

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Cedas células tendo o potencial de diferenciar ao longo das linhas levando a vários fenótipos são instáveis e desse modo podem espontaneamente diferenciar. Presentemente preferidas para uso com a invenção são as células que não espontaneamente diferenciam, por exemplo, ao Ion5 go das linhagens de mioblasto, músculo esqueletal, músculo liso vascular, pericíto, hemangíogênico, angiogênica, vasculogênica, ou endoteiial vascular, As células proferidas, quando crescidas em meio de crescimento, são substancialmente estáveis com respeito aos marcadores de célula produzidos em sua superfície, e com respeito ao padrão de expressão de vários 10 genes, por exemplo, como determinado utilizando um teste de diagnostico médico vendido sob o nome comercial GENECHIP (Affymetrix, inc., Santa Ciara, Calif). As células continuam substancialmente constantes, por exemplo, em suas características de marcador de superfície sobre a passagem s através de múltiplas duplicações de população,

Outro aspecto da invenção caracteriza o uso de populações de um UTC descrito acima. Em algumas modalidades, a população de célula pode ser heterogênea. Uma população de célula heterogênea da invenção pode compreender pelo menos corna de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%. 80%, 90%, ou 95% da UTC da invenção. As populações de célu20 Ia heterogêneas da invenção podem também compreender célulastronco ou outras células progenitcras, tais como miobiastos ou outras células progenitoras do músculo, hemangíoblastos, ou células precursoras do vaso sanguíneo; ou pode também compreender células do músculo esqueletal completamente diferenciadas, células do músculo liso, pericito, ou células endoteli2.5 ms do vaso sanguíneo ffm algumas modalidades, a população é substancíalmente homogênea, isto é, compreende subslancialmente somente o UTC (preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99% ou mais UTC). A população de célula homogênea da invenção pode compreender células derivadas do umbigo. As populações homogêneas de células derivadas do umbigo são preferivelmente livres de células de linhagem maternal. A homogeneidade de uma população de célula pode ser obtida por qualquer método conhecido na técnica, per exemplo, por classificação de célula (por exemplo,

30/117 cifometria do fluxo) ou por expansão clonal de acordo com métodos confieaides, Desse modo, as populações de UTC homogêneas pretendas podem compreender uma linhagem celular clonal de células derivadas de pos-parto. Tais populações são particuiarmeate úteis quando um clone de célula corn 5 funcionalidade altamente desejável foi isolado.

Também fornecido aqui é o uso de populações de células incubadas na presença dei um ou mais fatores, ou sob condições, que estimulam a diferenciação de célula-tronco ao longo de uma série de reações de músculo liso vascular, endotehal vascular, ou pericito. Tais fatores são conhecí10 dos na técnica e o técnico versado apreciará que a determinação de condições adequadas para diferenciação pode ser realizada com experimentação de rotina. A otimização de tais condições pode ser realizada par análise e desígnios experimentais estatísticos, por exemplo, metodologia de superfície de resposta permite a otimização simultânea de múltiplas variáveis em uma 15 cultura biológica, (ás fatores atualmente preferidos incluem, porém não estão limitados a. fatores de crescimento ou tròfleos, quimiocinas, citocinas, produtos celulares, agentes de desmetilaçào, e outros estímulos que são agora conhecidos ou mais tarde determinados para estimular a diferenciação, por exemplo, de céiulas-tronco ao íongo de linhagens ou série de reações de 20 céiulas-tronco ao longo de linhagens ou série de reações angíogênicas, hem.angiugênicas. vasculogénioa, músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito. nu endotelial vascular.

O UTC pode tambérn ser geneticamente modificado para produzir produtos de gene terapeuílcamerite úteis, para produzir agentes angíogé25 nicos para facilitar ou suportar o crescimento ou a formação de vaso sanguíneo adicionai, ou para produzir fatores para recrutar células progenitoras endatelims para a área de dano pulmonar. As células progenitoras endoteliaís facilitam vasculogênese e fluxo sanguíneo, particularmente em seguida a um evento ísquêmico. (ürbich D e Dimmeler S. Ciro. Res., 2004; 95.343-53). 30 Os fatores que desempenham um papel no recrutamento de célula oadotelíai incluem, porém não estão limitados a, VEGF. fator-1 derivado estremai (SDF -l), eritropoieiina (EPO), G-CSF. estatiuas, estrogenic, PPAR-y. CXCR4. FGF. e HGF. A modificação genética pode ser realizada utilizando qualquer de uma variedade de vetores incluindo. porém não limitada a, vetares virais integrantes, por exemplo, vetar de retrovirus ou vetores virais ade no-associãdos; vetores de replicaçao de não interação, por exemplo, vetores 5 de vírus de papiloma. vetores de SV40, vetores adenovirals; ou vetores virais de replioação defeituosa. Outros métodos de introduzir DNA em células incluem α use de lipossomas, elefroporação. uma pistola de partícula, ou por injeção de DNA direta.

As células hospedeiras são preferivelmente transformadas ou transfectadas corn DNA controlada par, ou em associação operatóna oam, um nu mais elementos de controle de expressão apropriadas tais coma sequências promotoras ou realçadoras, termínadores de transcrição, sítios de polladenilação, entre outros, e um marcador seleciunávei. Qualquer promoter pode ser utilizado para direcionar a expressão do gene inserido. Fc-r e15 xemplo. os promotores virais incluem, porém não estão limitadas ao promotor/realçador de CMV, SV 40, papílomavirus, vírus de Epstein-Bau ou promotor da gane de elastina, Em algumas modalidades, os elementos de controle utilizadas para controlar a expressão da gene de interesse podem permitir a expressão regulada do gene de modo que o produto seja sintetizado 20 somente quando necessária fo vivo. Se a expressão transitória for desejada, promotores constitutivos são preferivelmente utilizados em um vetor de não integração e/ou de replicação defeituosa. Alternativamente, os promotores induziveis pndem ser utilizados para direcionar a expressão do gene Inserido quando necessário. Os promotores induziveis incluem, porèrn não estão limi25 fades àqueles associados com metalotionelna e proteínas de choque térmico.

Em seguida a introdução do DMA estrangeiro, as células construídas podem ser permitidas crescer em meios enriquecidos e em seguida comutados para meias seletivos. O marcador seleoionável no DMA estran3(1 geiro confere resistência á seleção e permite que as células estavelmente integrem o DMA estrangeiro corna, por exemplo, em um plasmídeo, em seus cromossomas e crescem para formar focos que, sucessivarnente, podem ser danados e expandidas em linhagens celulares. Este rrsétodo pode ser vantajosamente utilizado para construir linhagens celulares que expressam o produto de gene.

As células da invenção podem ser geneticamente construídas para expressão de '^:nocaute^:í ou redução de fatores que promovem a inflamação ou rejeição no sitio do implante, Técnicas moduladoras negativas para a redução de níveis de expressão de gene-alvo ou níveis de atividade de produto de gene-alvo são descritas abaixo. Modulação negativa, como utilizado aqui, refere-se a uma redução no nível e/ou atividade de produto de 10 gene-alvo relativo ao nivel e/ou atividade do produto de gene-alvo na ausência do tratamento modelador. A expressão de um gene nativo para uma célula do músculo esqueletal. célula de músculo liso vascular, pehcrto, célula endc-tehal vascular, nu células progenitoras das mesmos pode ser reduzida ou nocauteada utilizando várias técnicas incluindo, por exemplo, inibição de 15 expressão ínatívando-se o gene utilizando a técnica de recombínaçâo de homólogo. Tipicamente, um exon codificando uma região Importante da proteína (ou um exon 5’ para aquela região) é interrompida por um marcador seleeionável positivo, por exemplo, neo, prevenindo a produção de rnRNA normal do gene-alvo e resultando na inativaçao do gene. Um gene pode 20 também ser inativo oriando~se uma deleção ern parte de um gene, ou por deleção do gene total. Ao utilizar uma construção com duas regiões de homologla para o gene-alvo que estão distantes no genome, as sequências que intervém as duas regiões podem ser delatadas. (Mombaerts e outros, Proc,. Nat, Acad. Soí. U.S.A,, 1991; 88:3084-87). Antissenso, DNAzimas, ri25 bozímas, RNA de interferência pequena (siRNA) e outras tais moléculas que inibem a expressão do gene-alvo podem também ser utilizadas para reduzir o nival de atividade de gene-alvo. Por exemplo, as moléculas de RNA de antissenso que rnsbem s expressão de complexos de gene de histocompati· biiidade principal (H.I..A) foram mostradas serem mais versáteis com respeito 30 ás respostas imunes. Entretanto, além disso, as moléculas de hélice tripla podem ser utilizadas na redução do nível da atividade de gene-alvo.

Em outros aspectos, a invenção uíílíza iísados celulares e fra33/117 cues solúveis em célula preparadas do um UTC, ou populações de célula heterogêneas ou homogêneas compreendendo um UTC, bem sumo um UTC ou populações dos mesmos que foram geneticamente modificadas ou que furam estimuladas para se diferenciar ao longa de uma série de reações 5 de músculo esqueletal, músculo liso vascular, periclto, ou endotélio vascular.

Tais lisados e frações dos mesmos têm muitas utilidades, O uso da fração solúvel de lisado de UTC (isto é, substancialmente livre de membranas) m Wvo, por exemplo, permite que o ambiente intracelular benéfico seja utilizado alogeneiuamerríe em um paciente sem introduzir uma quantidade apreciável 10 das proteínas de superfície de célula mais provavelmente para ativar' a rejeição, ou outras respostas imunológícas adversas. Os métodos de Usar células são bem-conhecldos na técnica e incluem vários meios de rompimento mecânico, rompimento enzimático, ou rompimento químico, ou combinações dos mesmos. Tais lisados de célula podem ser preparados de células dire15 iamente em seu meio de crescimento, e desse modo contém fatures de crescimento secretados e similares, ou eles podem ser preparados de células lavadas livras dc melo em, por exemplo, PBS ou outra solução. As células lavadas podem ser ressuspensas ern concentrações maiores do que a densidade de população original se preferido,

Em uma modalidade, os lisados de célula inteira são preparados, por exemplo, rompendo-se as células sem separação subsequente de frações de célula. Em outra modalidade, uma fração de membrana de célula é separada de uma fração solúvel das células por métodos de rotina conhecidos na técnica, por exemplo, centritúgação, flltração, ou métodos similares.

Os lisados de célula ou frações solúveis em célula preparados de populações de células derivadas de pós-parto podem ser utilizados ao estado em que se encontram, também concentrados por, por exemplo, ultraflltração ou liofllização, ou ainda secos, parcialmente purificados, combinados com díluentes ou veículos farmaceutioamente aceitáveis corno são co30 nhecidos na técnica, ou combinados oom outras compostos tais corno biológicos, por exemplo, composições de proteína farmaceutioamente úteis. Os lisados de célula ou frações des mesmos podem ser utilizados rn wtro ou m

34/117 v/Vo₍ sozinho ou. por exemplo, cem células vivas autóícgas ou singemmuas. Os lísados. se introduzidos te vivo, podem ser introduzidos localrnenfe em um sítio de tratamento, ou remotamente para fornecer, por exemplo, fatores de crescimento celular necessários a um paciente.

Em uma outra modalidade, o UTC pode ser cultivado te wfro para produzir produtos biológicos em alta produção. Um UTC que naturalmente produz um produto biológico particular de interesse (por exemplo, um fator tráfico), ou que foi geneticamente construído para produzir um produto biológico, pode ser clonalmente expandido utilizando as técnicas de cultura des1G catas aqui. Altemativamente. as células podem ser expandidas em um meio que induz a diferenciação para urna, linhagem do músculo esquelatal. músculo liso vascular, perfeito, ou linhagem endotelial vascular. Em cada caso, os produtos biológicos produzidos peda céiuta e seoretados no meio podem ser facilmente isolados do meio condicionado utilizando técnicas de separa15 ção padrão, por exemplo, tal como precipitação de proteína diferencial, crornatografia de permuta de ion. cromatografia de filtração de gel. eletroforese, e HPLC, para designar alguns, Um bíorreator pode ser utilizado para tomar vantagem do método de fluxo para alimentar, por exemplo, uma cultura tridimensional te vitro. Essencialmente, guando meios frescos são passados 20 através da cultura tridimensional, o produlo biológico é lavado da cultura e pode em seguida ser isolado do escoamento, como anima.

Altemativamente. um produlo biológico de interesse pode permanecer na célula e, desse modo, sua coleção pode requerer que as células sejam lisadas, como descrito acima. O produlo biológico pode em seguida 25 ser purificado utilizando qualquer uma ou mais das técnicas listadas acima.

Em outras modalidades, a invenção utiliza meio condicionado de UTC cultivado para uso te wtro e te vivo como descrito abaixo, O uso do meio condicionado de UTC permite que cs fatores iróflcos benéficos secretados pelo UTC sejam utilizados alogeneicamente em um paciente sem in30 troduzír células intactas que poderíam ativar rejeição, ou outras respostas imunológícas adversas. O meio condicionada é preparada por cultura de células em um meio de cultura, ern seguida removendo as células do meio

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O meia condicionado preparada de populações de células derivadas do cordão umbilical pude ser utdizado no estado em que se encontra, também concentrado, por exemplo, par ultrafiltração ou liofilizaçãa, ou ainda seca, paraialmente purificado, combinado com veículos ou diluentes farrna5 oeutícarnente aceitáveis como são conhecidos na técnica, au combinados com outros compostos tais como biológicos. por exempla, composições de pruteiría farmaceutíoarnente úteis. O meia condicionado pode ser utilizado rn vtoo ou <7? vivo, sozinho ou combinada cara células vivas autúlagas ou singeneicas, por exemplo. O meio condicionado, se introduzido to vrvo, pode 10 ser introduzido localmente em um sítio de tratamento, ou remotamente para fornecer tatores tróficos ou de crescimento celular necessários a um pacien··

Em outra modahdade, uma matriz extraceiular (ECM) produzida por cultivo do UTC em substratos líquidas, sólidas ou semissôhdos é prepa15 rada, coletada e utilizada como uma alternativa para implantar células vivas em um indivíduo em necessidade de repara ou substituição de tecido. O UTC é cultivado to v.dro, em uma estrutura tridimensional como descrito em qualquer lugar aqui, sob condições tal que uma quantidade desejada de ECM seja secretada na estrutura. As células compreendendo o novo tecido 20 são removidas, e o ECM processado para uso adicional, por exemplo, como uma preparação injetável. Para realizar isto, as células na estrutura são mortas e qualquer resíduo celular é removida da estrutura. Este processo pode ser realizado da vários modos diferentes. Por exemplo, o tecido vivo pode ser congelado instantaneamente em nitrogênio liquida sem um criocoaser25 vanfe, ou o tecido pode ser imerso em água destilada estéril de mod-a que as células estourem em resposta a pressão osmõtica.

Uma vez que as células foram mortas, as membranas celulares podem ser rompidas o os residues celulares removidos por tratamento com um enxágue detergente suave, tal como EDTA, CHAPS ou um agente zvate30 riôníco Alternativamente, o tecido pode ser enzimaticamente digerido e/ou extraído cam roagent.es que quebram as membranas celulares e permite a remoção de teores de célula Os exemplos de tais enzimas incluem, porém não estão limitados a, híaluronidase, dispase, proteases, e nucleases, Os exemplos de detergentes incluem detergentes não tônicos tais corou, por exemplo, álcool de poiiéter de alquilarila (TRITON X-IOQ), ootlfenòxí palie·· tôxi-etanol (Rehm e Haas, Filadélfia, Pa ), I3RU-35, um éter de laurila de polietoxietanol (Atlas Chemical Co., San Diego, Calif), polissorbato 20 (TWEEN 20), urn monolaurato de sorbitan de pphetoxietanul (Rohm e Haas, Filadélfia, Pa.), éter de laurila de polietileno (Rohm e Haas, Filadélfia, Pa,); e detergentes iônicos tais corno sulfato de dodecila de sódio, aícoòís aiífâticos superiores sulfatados, aloanos sulfonados e alguslaremos suifonados contendo 7 a 22 átomos de carbono em uma cadeia ramificada ou não ramificada.

A coleção do ECM pode ser realizada em uma variedade de modos, dependendo pelo menos em parte se o novo tecido foi formado em uma estrutura tridimensional que é biodegradável ou não biodegradável, como no caso de metais. Por exemplo, se a estrutura far não biodegradável, o ECM pode ser removido submetendo-se a estrutura a sonicaçao, iates de água de alta pressão, raspagem mecânica, ou tratamento suave com detergentes ou enzimas, ou qualquer combinação dos acima.

Se a estrutura for biodegradável, o ECM pode ser coletado, por exemplo, permitindo-se a estrutura degradar ou dissolver na solução. Alternativamente, se a estrutura biodegradável for composta de um material que possa sozinho ser injetado junto com o ECM, a estrutura β o ECM podem ser processados em total para injeção subsequente. Alternatívamente, o ECM pode ser removido da estrutura biodegradável por quaisquer dos métodos descritos acima para coleção de ECM de uma estrutura não biodegradável. Todos os processos da coleção são preferivelmente designados de modo a não desnaturar o ECM.

Após ter sido coletado, o ECM pode ser processado também. Por exemplo, o ECM pode ser homogeneizado para partículas finas utilizando técnicas bem conhecidas na técnica tais cume por somcação., de made que passa passar através de uma agulha cirúrgica. Os componentes do ECM podem também ser reticulados, se desejado, por irradiação gama. Preferivelmente, o ECM pode ser irradiado entre 0,25 a 2 mega rads para esteri lízar e reticular ο ECM A reticulação química utilizando agentes que sejam tóxicos, tal cerno glutaraldeídc, é possível. porém não geralmente preferido.

As quantidades e/ou relações de proteínas, tais cerno vários tipos de oolágeno presente no ECM, podem ser ajustadas misturando-se o ECM produzido pelas células da invenção cem ECM de um ou mais outros tipos de células. Além disso, as substâncias biologicamente ativas tais como proteínas, fatores de crescimento e/ou fármacos, podem ser Incorporadas no ECM. As substâncias biologicamente ativas exemplares incluem fatores de crescimento de tecido, tal como TGF-beto, e similares, que promovem cura e reparo de tecido no sítio da injeção. Tais agentes adicionais podem ser utilizados em quaisquer das modalidades descritas aqui acima, por exemplo, com lisados de célula total, frações de célula solúveis, ou outras componentes purificadas e produtos produzidas pela UTC

Em outro aspecto, a invenção fornece composições? farmacêuticas que utilizam o UTC. populações de UTC, componentes e produtos do UTC em varies? métodos para o tratamento de lesão ou dano causado por um episódio isquêmíco perrférico. Certas modalidades abrangem composições farmacêuticas compreendendo células vivas (UTC sozinho ou misturado com outros tipos de células). Outras modalidades abrangem composições farmacêuticas compreendendo componentes celulares de UTC (por exemplo, lisados de célula, frações de célula solúveis, meio condicionado. ECM ou componentes de quaisquer dos anteriores) ou produtos (por exemplo, fatores tróficus e outros fatures biológicos produzidas naturaimente pelo UTC ou através de modificação genética, meio condicionado de cultura de UTC). Os componentes de UTC a produtos que podem ser utríizados na presente mvenção são descritos nas Publicações de Patente U 8. Ν^ΟΪ' 2005/0032209, 2005/0058631 e 20Q5/Q054098, e estão incorporados aqui por referência. Em outros casos, a composição farmacêutica pude também compreender outros ingredientes ativos, tais como agentes antiinflamatôrios, agentes antiapoptóticos. antioxidantes, fatores de crescimento, fatores miotrófteos ou fármacos rniorregenerativos ou mioprotetores come conhecido na técnica.

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As composições farmacêuticas compreendendo células vivas de UTC são tipicamente formuladas como composições liquidas, semissólidas (por exemplo, géis) ou sólidas (por exemplo, matrizes, armações e similares, como apropriado para construção de tecido vascular ou pulmonar). As composições líquidas são formuladas para administração por qualquer rotina aceitável conhecida na técnica para obter liberação de células vivas para os tecidos vasculares ou pulmonares alvos. Tipicamente, estes incluem injeção ou infusão, de um modo difuso, ou alvejado para o sítio de lesão, dano, ou angústra pulmonar, por uma rotina de administração inclumdo, porém não limitado a, liberação intramuscular, intraverrosa, ou intra-artenal através de uma seringa com agulhas e/ou caíeteres com ou sem dispositivos de bomba.

As composições farmacêuticas compreendendo células vivas em um veiculo semissólíde eu sólido são tipicamente formuladas para implante cirúrgica no sítio da lesão, dano, ou angústia pulmonar. Será apreciado que composições líquidas também possam ser administradas por procedimentos cirúrgicos Em modaüdades particulares, composições farmacêuticas sernissc-lidas ou solidas podem compreender géis semipermeáveis, treiiças, armações celulares e similares, que podem ser não biodegradáveis ou biodegradáveis, Por exemplo, em certas modalidades, pode ser desejável ou apropriado sequestrar as células exógenas de seus entornas,, para ainda permitir que as células secretern a liberem moléculas biológicas (por exemplo, fatores núotrófícos, fatores angiclròficos, ou fatores de recrutamento de célula progenitors endotelial) para cercar as células do tecido pulmonar ou vascular. Nestas modalidades, as células podem ser formuladas corno implantes autônomos compreendendo uma população de célula eu UTC- vivo compreendendo um U TC cercado por uma barreira não degradável. seletivamente permeável que fisicamente separa as células transplantadas do tecido hospedeiro. Tais implantes são algumas vezes referidos como irnunoprotetores”, uma vez que eles têm a capacidade de prevenir células e macrornoléculas tmunes de matarem as células transplantadas na ausência de ímunossupressão farmacclogícamenfe induzida.

Em outras modalidades, diferentes variedades de géis e redes

39/117 degradáveis são utilizadas para uma composição farmacêutica da invenção. Por exemplo, os materiais degradáveis particularmente adequados para formulações de liberação prolongada incluem polímeros biocompatlvels, tais coma ácido poli(láctico}, polí (ácido íáctíoo ácide-cogiicólico), meiiicelulose, 5 ácido hialurôníco, coíágeno e similares.

Em outras modalidades, pode ser desejável ou apropriada liberar as células sobre ou dentro de uma armação ou matriz biodegradável, preferivelmente bsorreabsonríve! ou bioabsorvlvel Estes, biomateriais tipicamente tridimensionais, contêm as células vivas presas à armação, dispor10 sas na armação, ou incorporadas em uma matriz extracelular capturada na armação, Uma vez implantados na mgião-alvo do corpo, estes implantes ficam integrados com o tecido hospedeiro, em que as células transplantadas gradua Imente ficam estabelecidas. (Vide, por exemplo, Tresco, P A, e outros., Adv. Drug Delivery Rev., 2000; 42'3-27; veja, também, Hutmacher, D 15 W, J. Biomater, Sei. Polímero Edn., 2001; 12.107-174),

A matriz biooompatível pode ser compreendida de polímeros biodegradáveis naturais, naturais modificados ou sintéticos, incluindo tiomopullmeros, copolímeros e polímeros de bloco, bem como combinações das mesmos. E notado que um polímero é geralmente nomeado com base no 20 monômero do qual è sintetizado.

Os exemplos de polímeros biodegradáveis cu classes de polímero adequadas incluem fibrina, coiàgeno, eíasttea, gelatina, vitronectins, fíbronectina, laminha, Irombina. poli(aminoácído), celulose oxidada, tropoelastína, seda, ácidos ribcnucíeicos, ácidos deoxirnbouucieíeos, proteínas, 25 polínucleotideos, matrizes de membrana de base reconstituída, amidos, dextranas, alginates, hialuronate, quítma, quitosana, agarose, pollssacarideos, àcído hiaiurôníeo, polifácído láctico), polí(áoido glicólico), poltetiieno glieul, tecido desceiuiarizado, pepiidoos de automontagem, pohpeptldeos. glicosarninogííoanos, seus derivados e misturas dos mesmos. Tanto para ácido glí30 cólico quanta para ácido làcflco, um dímero cíclico intermediário é tipicamente preparado e purificado antes da poíimenzaçào. Estes dimeros intermediários são chamados glísolida e lactida, respectivamente. Outros polímeros biodegradáveis ou classes de polímero úteis incluem, sem limitação, poíiésteres alifáticcs, oxalates de po:i(alquiíeno), policarbonatas derivadas de tirasina., poli-iminocarbonafos. poliortoésteres. políoxaèsteres, paliarnidaesteres, poüoxaésteres contendo grupos amina. poíi(fumaraio de propíleno), pulídio5 xanonas. políoarbonatos, palioxalatos, pnli(alfa-hidoxiàcídos). pbli(ésteres), paliuretano, éster do poii(uretano). éter de poN(uretanoj_s poííanldretos, polia·· cetatos, pohcaprolactonas, pnli(artoêsferes), poliaminoàcídos. poliamidas e misturas e copolimeros dos mesmos. Os polímeros biodegradáveis úteis adicionais incluem, sem limitação, estereopoümeros de ácido L- e D-iácfioo, 10 copolimeros de bfô(para-carboxifenòxí) propane e ácido sebácico, copolimeros de ácido sebácico, copolimeros de caprolactona. copolimeros de ácido paíi(láctico)/ácido pali(gíiuóijco)/políetíienoglicoí, copolimeros de poliuretano e copolímeras de ácido poli(íãctica), de alfa-amincácídos, copolimeros de alfa-aminoácidcs e ácido caproico, copolimeros de glutamato de affa-benzila 15 e polietileno gíiuul, copolimeros de sucinato a polifglicóis), pallfosfazeno, po~ ii(hidroxialcanoatos) e mistura dos mesmos. Os sistemas binário e ternàrio também são contemplados.

Em gerai, um polímero biodegradável adequada para uso como a matriz, é desejavelmente configurado de modo que: (1) tenha propriedades 20 mecânicas que sejam adequadas para a pretendida aplicação; (2) permaneça sufícientemente intacta até que o tecido tenha crescido e curado; (3) não invoque resposta ínflamatãria ou tóxica; (4) seja metabolizada ao corpo apôs cumprir sua finalidade; (5) seja facilmente processado no produto finai desejado a ser formado, (6) demonstre a meia-vida aceitável; e (7) seja facilmeo25 te esterilizado..

Em um aspecto da invenção, o polímero bíocompatível utilizado para formar a matriz está na. forma de um hidrogel. Ern geral, os hidrogéis são materiais polimérious reticulados que podem absorver mais do que 20% de seu peso em àgua ao mesmo tempo em que mantendo uma estrutura 30 tridimensional distinta. Esta definição inclui polímeros reticulados secas que dilatarão em ambientes aquosos, bem como materiais dilatavais em águo. Um hospedeiro da polímeros hidrofilícos pude ser retículado para produzir

41/117 hidrugéis, quer o polímero seja de origem biológica, semissintéfíca, ou total· mente sintética. O hidregel pode ser produzido de um material polimérico sintético. Tais polímeros sintéticos podem ser adaptados a uma faixa de propriedades e uniformidade de lote para lote previsível, e representa urna 5 fonte confiável da material que geralmente é livre de questões de imunogenioidade. As matrizes podem incluir hidrogéis formados da peptídeo de automontagem, tais como aqueles descritos nas Patentes dos Estados Unidos N^;?s 5.670.483 e 5.955.343, Pedido de Patente dos Estados Unidos N'^;í 2002/0160471. e Pedido PCT N° WO 02/062969.

As propriedades que tornam os hidrogéis valiosos em aplicações de liberação de fármaco incluem o grau de dílatação de equilíbrio, cinéticos de absorção, permeabilidade de solute, e suas características de desempenha rd wo. A permeabilidade aos compostos depende em parte do grau de dílatação ou teor de água e da taxa de biodegradaçâo. Uma vez quer a força 15 mecânica de um gei declina na proporção da direção para o grau de dilatação, está também dentro da contemplação da presente invenção que o bidrogel pude ser preso a um substrato de modo que o sistema de campôsita realce a força mecânica. Em algumas modalidades, o hidrogel pode ser impregnado em um substrato poroso, de modo que ganhe a força mecânica do 20 substrato, junta oom as propriedades de liberação úteis do hidrogel.

Os exemplos não limitantes de armação ou matriz (algumas vezes referido coletivamente como ’’estrutura'^-) que pode .ser utilizada na presente invenção incluem estruturas têxteis tais como tecelagens, malhas, tranças, não dançadas, e malhas deformadas; espumas porosas, espumas 25 semíporosas, películas ou folhas perfuradas, microparticulas, contas, e esferas e estruturas de composite sendo uma combinação das estruturas anima. As mentas não trançadas podem, por exempla, ser- formadas uiihzando fibras compreendidas de um copolirnero absorvivel sintético de ácidos glicólicos e lácticos (PC-WPLA), vendidos sub u norne comercial suturas de VICR30 YL (Ethicon, Inc., Somerville, N.J.). As espumas, compostas de, por exemplo, copolirnero de poli(epsHoncaprolactona)/pQli{âcido glicólico) (PCL/PGA), formada por processos tais como secagem por congelamento, ou liofilizaçâo.

2/Η 7 como descrito na Patente dos Estadas Unidos M 6.355.699, também podem ser utilizados. Os hidmgéís tais como peptídeos de automonfagem (por exemplo, RAD 16) também podem ser utilizados. As redes degradavais de formação fo sito são também adequadas para uso na invenção. {Vide, por exemplo, Anseth, K 8 e outros, J. Controlled Release, 2002: 78:199-209; Wang, D. e outros, Biomaterials, 2093; 24:3969-3980; Publicação de Patente dos Estados Unidos 2002/0822676), Elites materiais de formação m s/tu são formulados como fluidos adequados para injeção, em seguida podem ser induzidos a formar um hídrogei por uma variedade de meios tal como mu10 dança na temperatura, pH, e exposição á luz fo s/te ou to v?Vo.

Em outra, modalidade, a estrutura è ura feltro, que pode ser composto de um fio de mulfiflfa feito de um material bioabsorvívei, por exemplo, copolimeros ou misturas de PGA. PLA, PCL. ou ácido hialurônico. O fio è feito em um feltro utilizando técnicas de processamento de têxteis pa15 drões consistindo em pregueação, corte, cardação e costura. Em outra modahdade. as células são semeadas em armações de espuma que podem ser estruturas de composite

Em muitas das modalidades mencionadas acima, a estrutura pode ser moldada em uma forma útil, tal como que de um vaso sanguíneo.

Além disso, será apreciado que UTC possa ser cultivado em dispositivos implantavais ou cirúrgicos nau degradavais, pré-formados, por exemplo, de uma maneira correspondendo àquela utilizada para preparar bobinas endovascuíares de GDC contendo fibroblasts, por exemplo. (Marx, WF, e outros, Am. J. Neuroradiol, 2901; 22:323-333),

A matriz, armação ou dispositivo pode ser tratado antes da inoculsçâo das células para realçar a ligação da célula. Por exemplo, antes da inoculação, as matrizes de náilon podem ser tratadas com 0,1 molar de ácido aoétícoe incubadas em polilisina, P8S, e/ou colágeno para revestir o náilon. Poliestireno pode ser similarmente tratado utilizando ácido sulfúrico, As superficies externas de uma estrutura podem também ser modificadas para melhorar a ligação e crescimento de células e diferenciação de tecido, tal como por revestimento plasmáfíoes da estrutura ou adição de urna ou mais proteínas (por exemplo, colágenos, fibras elásticas, fibras reticulates}, glicoproteínas, giícosaminoglicanas (por exemplo,, sulfato de heparina, condroítina-4-sulfato, condroitina-6~sulfato, sulfato de dermatan, sulfato de queratina), os materiais genéticos tais oomo citocinas e fatores de crescimento, urna 5 matriz rxdular, e/ou outros materiais, incluindo, porém não limitado a, gomas de gelatina, alginates, ágar, agarose, e de planta, entre outros fatores afetando a diferenciação e sobrevivência de célula..

As estruturas contendo UI C são preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser crescidas 10 livremente em um vaso de cultura para subconfluéncia ou confluência, levan tado da cultura e inoculado na estrutura. Os fatores de crescimento pedem ser adicionados ao meio da cultura antes, durante ou subsequente à inoculação das células para ativar a diferenciação e formação de tecido, se desejado, Altemativamente, as estruturas sozinhas podem ser modificadas de 15 modo que o crescimento das células desta seja realçado, ou de mudo que o risco de rejeição do implante seja reduzido. Deese mode, um ou mais campastes biologicamente ativos, incluindo, porém não limitado a, compostos anti-inflamatòfios, ímunossupressores ou fatores de crescimento, podem ser adicionados à estrutura para liberação local.

Um UTC, partes de um UTC ou populações de célula compreendendo um UTC, ou componentes de ou produtos produzidos por um UTC, podem ser utilizados ern uma vanedade de modos para suportar e facilitar o reparo, regeneração, e melhora da células e tecidos pulmonares, para melhorar o fluxo sanguíneo, e estimular e/ou suportar angiogénese, especial25 mente em pacientes de doença pulmonar. Tais utilidades abrangem métodos to y/fra, ex v/vo e to wvo.

Em uma modalidade, como descrito acima, o UTC pode ser cultivada to ytoo para produzir produtos biológicos que são ou naturalmente produzidos pelas células, ou produzidos pelas células quando induzidos a 30 diferenciação em tecido pulmonar, ou produzidos pelas células através de modificação genética. Por exemplo, descobriu-se que TIMPI, TPO, KGF. HGF, FGF, H8EGF, BONF, MIPlb, MCPI, RANTES, 1309. TARC, MDC, e IL-44/117 •8 são secretários de células derivadas do umbigo crescidas em meio de crescimento. (Vide os Exemplos). Além disso, os fatores para recrutamento de célula progemiora endoteiial tal como VEGF, SDF-I, EPO, G-CSF, estatínas, estrogênio, PPAR-γ, e CXGR4 podem ser produzidos pelo UTC e pc5 dem ser secretários no meio de crescimento. Outros fatores tráficos, como ainda não detectado ou não examinado, de uso no reparo e regeneração do tecido pulmonar ou vascular, são prováveis de serem produzidos pelo UTC e possivelmente secretários no meio.

Neste respeito, outra modalidade da invenção caracteriza o uso 10 do UTC para produção de meio condicionado, de um UTC não diferenciado ou de um UTC incubado sob condições que estimulam a diferenciação em uma linhagem de tecido pulmonar ou vascular. Tais meias condicionados são contemplados para uso em cultura m vdre ou ex vivo de células precursoras de tecido pulmonar, ou rn vrvu para suportar as células transplantadas 15 compreendendo populações homogêneas de um UTC ou populações heterogêneas compreendendo um UTC e progeniiores de tecido pulmonar ou vascular, eu para recrutar células progenitoras endoteliais para o sítio de lesão pulmonar, per exemplo.

Ainda outra modalidade compreende o uso de lisados de célula 20 UTC, frações de célula solúveis ou componentes dos mesmos, ou ECM ou componentes dos mesmos, para urna variedade de propósitos. Corno mencionado acima, alguns des4.es componentes podem ser utilizados em composições farmacêuticas. Em outras modalidades, um lisado de célula ou ECM é utilizado para revestir ou de outro modo tratar as substâncias ou rfls25 positivos a serem utilizados cirurgicamente, ou para implantação, ou para propósitos ex v/vo, para promover a oura ou sobrevivência de células ou tecidos contatados no curso de tais tratamentos. Em algumas modalidades preferidas, tais preparações feitas de um UTC compreendem FGF e HGF.

Em outra modalidade, um UTC è utiteado vantajosamente em 30 coculturas /n vdru para fornecer o suporte trófico para outras células, em particular, células do tecido pulmonar, por exemplo, células progenitoras do músculo esqueietal, células de músculo liso vascular, células progenitoras

45/117 de musculo liso vascular, perfeita, células endotellaís vasculares, ou células progenitoras de endotélio vascular. Ern algumas modalidades preferidas, o suporte frófica é proliferação das células. Para cocultura, pude ser desejável para o UTO e as outras células desejadas serem cocultivados sub condições nas quais os dois tipos de célula estão em contato. Isto pude ser obtido, por exemplo, semeando-se as células como urna população heterogênea de células em meio de cultura eu sobre um substrato de cultura adequado. Alternativamente, o UTC pude primeiro ser crescido para confluência, e em seguida servirá corno um substrato para α segundo tipo de célula desejado em cultura. Nesta ultima modalidade, as células podem também ser fisicamente separadas, por exemplo, por uma membrana ou dispositivo similar, tal que o outro tipo de célula possa ser removido e utilizado separadamente, em seguida ao perioda de cocuitura. O uso do UTC em cocultura para promover expansão e diferenciação de tipos de célula de tecido pulmonar ou vascular pode encontrar aplicabilidade na pesquisa e em áreas clínícas/terapêutieas. Por exemplo., cooulturas de UTC podem ser utilizadas para facilitar o crescimento e diferenciação de tecido pulmonar, por exemplo, músculo liso vascular. pericito, ou células endoteliais vasculares, em cultura, para propósitos de pesquisa básicos ou para uso em ensaios de avaliação de fármaco, por exemplo. As cocuituras de UTC também podem ser utilizadas para expansão ex vivo de. por exemplo, progenitores de músculo liso vascular, pericito, ou endotélio vascular para administração posterior para propósitos terapêuticas. Tecida pulmonar, por exemplo, músculo liso vascular, pericito, ou células prcgeniforas de endotélio vascular, pode ser colhido de um paciente, expandida ex wo em cocultura com UTC, em seguida retomado para aquele paciente (transferência autóloga) ou outro paciente (transferência síngeneica ou alogenefea). Nestas modalidades, será apreciado que, em seguida a expansão ex wvo, a população misturada de células compreendendo o UTC e tecido pulmonar, por exempla, progenltares òo músculo liso vascular, pericito, ou endotélio vascular, pode ser administrada a um paciente em necessidade do tratamento. Alternativamente, em situações onde a transferência autóloga é apropriada uu desejável, as populações de célula oucultivadas

46/117 podem ser fisicamente separadas em cultura, permitindo a remoção do tecido pulmonar autõlogo, por exemplo, progeortores do músculo liso vascular, ou endotéiio vascular; para administração ac paciente.

Como descrito nas Publicações de (atente dos Estados Unidos

N® 2005/0032209, 2005/0058631, 2005/0054098 e 2005/0058630, UTC. e componentes e produtos dos mesmos, foram mostrados serem eflcazmente transplantados no corpo, e para melhorar o fluxo sanguíneo e reduzir a necrose de tecido em um modelo animal aceito, Estas descobertas, junto com as descobertas apresentadas na presente invenção, suportam as modahda10 des preferidas da invenção, em qr.se o UTC è utilizado em terapia de célula para tratar lesão ou dano pulmonar reparando-se ou regenerando-se o tecido pulmonar e/ou tecido vascular em um paciente de dano pulmonar, ou rneIhorando-se o fluxo sanguíneo ou estímulando-se efou suportando-se angiogênese em um paciente de dano pulmonar. Em uma modalidade, o UTC é transplantado em um looal-alvo no corpo, especialmente em ou próximo do local do dano pulmonar, onde o UTC pode cs diferenciar em um ou mais dos fenótípos de tecido pulmonar, por exemplo., fenõtipos de músculo liso vascular. pericito, ou endotéiio vascular, o UTC pode fornecer suporte frófico para tecido pulmonar, por exemplo, progenitores de célula de músculo liso vascu20 lar, penoito, ou célula endotelial vascular e/ou células do tecido pulmonar, /n s/te. o UTC pode produzir fatores para recrutar as células progenitoras endoteiiais para o sitio da lesão pulmonar, ou o UTC pode exercer um efeito benéfico em dois ou mais daqueles modos, entre outros, O UTC secreta fatores trófteos incluindo, porém não limitadas a GFGFrn, IL-6, 11-8, HGF, IGF-I,

TPO, e similares. O UTC pode ajudar no recrutamento de células progenitoras vasculares tais como angioblastos pana estimular nova formação de vaso sanguíneo

O UTC pode exerce?' efeitos tráficos no corpo do paciente ao qual eles são administrados. Por exemplo, o UTC pode exercer efeitos tròfl30 uos em células do tecido pulmonar, por exemplo, células de músculo iíso vascular, células endoteliais vasculares, pericito, ou células progenitoras, dos mesmos. Em algumas modalidades preferidas, o efeito trófeo é a proh

47/117 feraçâo de tais células. G UTC pode também induzir migração de células na corpo do paciente ao qual elas são administradas. Tal migração pode facilitar o reparo, regeneração e tratamento de doenças, distúrbios, e/ou lesões pulmonares, tais como CORD, AU, ARDS, e fibrose pulmonar. Par exemplo, 5 um UTC administrado em ou próximo de um sitio de dano pulmonar pode induzir rnigração de células para o sitio de dano pulmonar para reparar, regenerar, ou de oul.ro modo tratar o tecido doente e seus arredores. O UTC então administrado pode induzir migração de células do tecido pulmonar, por exemplo, células de músculo liso vascular, células endoteliais vasculares, 10 pedcito, ou células progeaitoras, dos mesmos. Em modalidades preferidas, os UTC induzem migração de células endoteiials vasculares e/ou células progenítoras de endotélio vascular para o sítio, ou pelo menos próximo do sitio do dane pulmonar. Em algumas modalidades, a migração é induzida ou suportada por FGF e/ou HGF, preferivelmente FGF e HGF expresso pelo 15 UTC, As preparações feitas do UTC, incluindo lisados da célula, frações subceluiares, produtos, e similares, também podem ser utilizadas para tratar doença, distúrbios e/ou lesões pulmonares. Tais preparações podem ser formuladas com os veículos farmaceuiicamente aceitáveis tais como aqueles descritos e exemplificados aqui, e administrados aos pacientes em quanti20 dades eficazes para tratar doença, distúrbios e/ou lesões pulmonares. Em mc-dahdades preferidas, as preparações feitas do UTC compreendem FGF e HGF.

As modalidades da invenção especificas são direcionadas para repara., regeneração a substituição direta de, ou o suporte do reparo, rege25 neraçãu, ou substituição de vasos sanguíneos, para o tratamento de lesão ou dano pulmonar,

O UTC pode ser administrado sozinho (par exemplo, como populações substancialmente homogêneas) ou como misturas com outras células. Como descrito acima, o UTC pode ser' administrado quando formulado 30 em uma preparação farmacêutica com uma matriz ou armação, ou corn veículo convencional farmaceutícamente aceitável. Onde o UTC á administrado com nutras células, elas podem ser administradas simultaneamente ou se

48/117 quencialmente oom as outras células (ou antes ou apôs as outras células). As células que podem ser administradas em conjunto com o UTC incluem, porém não estão limitados a, miócitos, células do tecido pulmonar células progenitoras do músculo esqueieíal, células de músculo ilso vascular, céluo Ias progenitoras de músculo liso vascular, perldfo, células endotellais vasculares, ou células progenitoras de endotélío vascular, e/ou outras célulastronco multipotentes ou plunpoteníes. As células de diferentes tipos podem ser misturadas com o UTC imediatarnente ou logo antes da administração, ou elas podem ser cocultivadas juntas durante um período de tempo antes 10 da administração.

O UTC pode ser administrado com outros tármacos benéficos ou moléculas biológicas, ou outros agentes ativos, tais como agentes antiinflamatórios. agentes arrtíapoptóiicos, antioxidantes, fatores de crescimento, fatores angiogêracos. ou fàrmacos miooegenef ativos ou mioprotetores coma 15 conhecido na técnica. Quando o UTC é administrado com outros age-nte-s, eles poder?? se administrados juntos em u?Y?a única composição farmacêutica. ou em composições farmacêuticas separadas, simultaneamente ou sequencialmente com os outros agentes (gm antes ou após a administração dos outros agentes). Os outros agentes podem ser uma parte de um regime 20 de tratamento que começa ou antes do transplante e contínua d?.?rante todo o curso de recuperação, ou pode ser «melado no memento do transplante, ou ainda após o transplante, como um médico versado na técnica considera apropriado.

Em uma modalidade, o UTC é administrado como células r?âo di25 ferenciadas, isto é, quando cultivadas em meio de crescimento. Alternativamente, o UTC pode ser administrado em seguida á exposição em cultura às condições que estimulam a diferenciação para um tenòtipo de tecido pulmonar desejado, por exemplo, fenótrpos do músculo liso vascular, perlcito, ou endotélío vascular.

ΊΟ As células da ?nvenção podem se?' cirurgicamente implantadas, injetadas, liberadas (por exemplo, por modo de um cateter, seringa, desvio, stent, microcaieier, ou bomba), ou de outro modo administradas diretamente

49/117 ou indiretamente ao sitio da tesão, dano, ou angustia pulmonar. As rotinas de administração das céiuias da invenção, ou composições da mesma, in cluem, porém não estão limitados a, íntravenosa. intramuscular, subcutânea, intranasal, íníratecal, intracísternal, ou através de seringas com agulhas ou 5 cateteres com ou sem cs dispositivos de bomba.

Quando as células são administradas em dispositivos semissólidos 01/ sólidos, o implante cirúrgico em um local preciso no corpo é tipica mente um meio adequado de administração. As composições farmacêuticas liquidas ou fluídas, entretanto, podem ser administradas através do sangue, 10 ou diretamerite no tecido pulmonar afetado (por exemplo, em toda uma área uifusarnente afetada, tal como seria o caso para ALI ou ARDS difuso). A migração do UTC: pode ser guiada por sinais químicos, fatores de crescimento, ou: caí pai nas.

.As células derivadas de tecido de cordão umbilical, ou composi-15 ções e/ou matrizes compreendendo as células derivadas de tecido de cordão umbilical, podem ser liberadas para o sítio através de um micro caieter, intraoateterização, ou através de uma minibomba. O veiculo, exdpiente ou portador pode ser qualquer daqueles conhecidos por serem farmaoeuticamente aceitáveis para administração a um paciente, particularmente local20 mente no sitio no qual a diferenciação celular deve ser induzida. Os exemplos incluem meios líquidos, por exemplo, Meio de Eagle Modificado da Dulbeccos (DMEM), salina estéril, salina estéril tamponada de fosfato, meie de Leibovitz (1.15, invitrogen, Carlsbad, Calif), dextrose em água estéril, e qualquer outro líquido tlsiologícarnente aceitável.

Outras modalidades abrangem métodos de tratar lesão ou dano pulmonar administrando-se composições terapêuticas compreendendo um veículo farmaceuiícamente aceitável e componentes celulares de UTC (por exemplo, Usados de célula ou componentes dos mesmos) ou produtos (por exemplo, iróficos e outros fatores biológicos produzidos naturalmente pelo 30 UTC ou através de modificação genética, meio condicionado de cultura de UTC). ou meio de crescimento de UTC ou produtos purificados de mero de crescimento. Em modalidades preferidas, os fatores biológicos são FGF e

J

50/11

HGR Estes métodos podem também compreende administrar outros agentes ativos, tais somo fatores de crescimento, fatores angiogênicos ou fármacos miorregenerativos ou mioprotetores como conhecido na técnica.

Os regimes e formas de dosagem para administrar o UTC ou quaisquer das outras composições terapêuticas ou farmacêuticas como descrito aqui são desenvolvidos de acordo com a boa prática módica, levando em consideração a eonrfiçãe do pacienta individual, por exemplo, natureza e extensão da lesão eu dano do evento de danificação pulmonar. idade, sexo, peso corporal e condição médica geral, e outros fatores conhecidos pelos W médicos. Desse modo, a quantidade eficaz de uma composição farmacêutica a ser administrada a um paciente é determinada por estas considerações como conhecido na técnica.

O UTC foi mostrado estimular PBMCs alogeneicos em uma reação de Imíôcito misturada. Consequentemente. o transplante alogeneico, ou 15 ainda xenogeneico, de UTC pode ser tolerado em alguns casos. Em algumas modalidades, o U TC sozinho fornece um efeito imunossupressor, desse modo prevenindo a rejeição do hospedeiro do UTC transplantado. Em tais casos, a imunossupressão fannacológíca durante a terapia celular pode -não ser necessária.

Entretanto. em outros casos pode ser desejável ou apropriado farmacoiogicamente irnunossuprimir um paciente antes de iniciar a terapia celular. Isto pode ser realizado através do uso de agentes imunossupresseres locais ou sistêmicos, ou pode ser realizado por liberação das células em um dispositivo encapsulado, corno descrito acima. Estes e outros meios para 25 reduzir ou eliminar uma resposta imune para as células transplantas são conhecidos na técnica. Como uma alternativa, o UTC pode ser geneticamente modificado para reduzírsua imunogenícidade, como mencionado acima.

A sobrevivência do UTC transplantado em um paciente vivo pode ser determinada através do uso de uma variedade de técnicas de varre30 dura, por exemplo, varredura de tomogrefia axial computadorizada (CAT ou CT), varreduras de ímageamento de ressonância magnética (IRM) ou de tomografia por emissão de positrons (TER). A determinação de sobreviveu51/117 cia de transplante pode também ser festa põs-morte removendo-se o tecido pulmonar ou tecido vascular, e examinando se visualmente ou através de um microscópio. Alternatívamente, as células pedem ser tratadas com manches que são especificas para células do tecido pulmonar, por exemplo, cé5 lulas de músculo liso vascular, pericito, ou células endoteiíaís vasculares. As células transplantadas podem também ser identificadas pela incorporação anterior de tintas traçadnras tais como mlcroesferas rotuladas por rodamina ou fluoresceins, azul resistente, microparticulas férricas, bisbenzamida ou produtos de gene repórter geneticamente introduzidos, tais como beta10 galactosidase ou beta-glucuronidase.

Ern outro aspecto, a invenção fornece kits que uf.ihzam o UTC, populações de UTC, componentes e produtos do UTC em vários métodos para estimular e/ou suportar angiogénese, para melhorar o fluxo sanguínea, para regenerar, reparar, e melhorar o tecido pulmonar lesionado ou danifica15 do por um evento de danificaçãa pulmonar, como descrito acima,. Onde usado para tratamento de dano ou lesão causado por uma doença pulmonar, distúrbios e/ou lesões, ou outro tratamento planejado, as kits podem incluir uma ou mais populações da célula, incluindo peto menos o UTC e um veiculo farrnaceuticamente aceitável (liquido, semissòiido ou sólido). Os kits tam20 bem opcionalmente podem incluir um meio de administrar as células, per exemplo, por injeção. Os kits também podem incluir instruções para dar? células, Kits preparados para uso de hospital de campo, tal como para uso militar, podem Incluir abastecimento para procedimento total incluindo armações de tecido, suturas cirúrgicas, e similares, ende as células devem ser utiliza25 das em conjunto corn o reparo de lesões agudas. Kits para ensaios e métodos rn v4.ro corno descrito aqui podem conter um ou mais de (1) um UTC ou componentes ou produtos do UTC, (2) reagentes para praticar o método fr? vrúo, (3) outras células ou populações de célula, quando apropriado, e (-4) Instruções para conduzir o método è? vero,

Os seguintes exemplos descrevem vários aspectos de modalidades da invenção em maiores detalhes, Estes exemplos sao pretendidos também ilustrar os aspectos da invenção descráa aqui Estes exemplos de vem ser considerados para limrtar o aspecto então exemplificado.

EXEMPLO 1

Eficácia Protetora Pulmonar em um Modelo de Camundongo de Lesão Pulmonar Aguda induzida por Hiperoxia

Este exemplo ilustra a eficácia de UTC humano (hUTC) (isolamento e oaroaterizaçâo de hUTC podem ser encontrados nos Exemplos 515) para realçar o reparo e regeneração pulmonar em um modelo de lesão pulmonar Induzida por hiperoxía, lsoíajrjento.de.CyHura„ç|e.CéJ.uJ.a.Umb(hGsi

IO As células derivadas do umbigo (UDC, hUTC) foram preparadas como descrito nas Publicações de Patente dos Estados Unidos LÃ' 2005/0032209, 2005/0058631 e 2005/0054098. As células foram cultivadas para a passagem desejada e em seguida criogenicamente conservadas. Modelo Animal

Camundongos C57BL/6 fêmeas (sete semanas de idade) foram obtidos de Ace Animals (Buyertown, PA), Imedíatarnente antes da injeção.. hUTC foram descongelados em 37^:;C (banho com água) e lavados duas vazes em salina tamponada de fosfate (PBS) e rossusper^sos em 1 rnL de PBS. As células foram contadas utilizando um hemocitômetro, A viabilidade 20 celular foi determinada por exclusão de tinta azul tripano. As células foram reconstituídas em urna concentração de 1x10^b células em 200 pí PBS.

O estudo descrito é resumido na Tabela 1-1 abaixo. Ne Dia 0, as células (1 x hUTC em 200 pl de PBS) ou veículo de PBS foram lentamente administradas aos camundongos per injeção na veia intravenosa utili25 zando uma seringa de 1 ml e uma agulha de 26-gauge e os animais foram em seguida expostos ao ar ambiente ou 90% de O;>. A exposição a 90% de O> foi realizada coiooando-se os animais em urna câmara BioSpherix (BioSphenx, LTD, Lacona, NY) que foi iniciada e equilibrada para 90% de Cb durante uma hora, O cuidado sustentador (suporte térmico e NutriGal) foi for30 necide diariamente para estes animais. As observações do animal mortalidade, sobrevivência, e porcentagem de concentrações de oxigênio para cada tanque foram registradas duas vezes por dia. No dia quatro pós-

tratamento, os animais foram autanízados utilizando 50 mg/mt da Nembutal (pentobarbital).

Grupo de tratamento	Tratamento atmosférico	Tratamento	Número de animais
1	Ar ambiente	PBS	12
2	90% de O?	PBS	12
	90% de O?	1e6 hUTC	12

Anáiíse.de Proteína Total por f lujdp de Lavagem BroncoaNeolar (BALF)

Para determinar a proteína total em cada amostra, BALL livre de célula toi analisado utilizando um Ensaio de Proteína BCA (Pierce). A analise foi completada utilizando o programa Scftmax 4.0 e os dados foram representados graficamente utilizando Software Graph Pad Prism,

Análise de.C.itoeinas/Químiociria de Homogenate Pulmonar a BALF iQ Para preparar BALF, 6 animais por' grupo de tratamento foram eutanizados e os pulmões foram lavados uma vez com 1,0 mL de PBS estéril (Invitrogen) e os tubos foram colocados em gelo úmido. O BALF foi centrifugado em 1(100 rpm durante 5 min e o fluído sobrenadante fui removido e utilizado para outra análise.

Para preparar os homogenates pulmonares, 6 animais por grupo foram eutarüzados, submetidos a perfusão de corpo total som PBS e os pulmões esquerdo foram dissecados e colocados em gela em tubos Lysing Matrix D e ern seguida centrifugados ern urn instrumento FastPrep em uma velocidade de 4,0 durante 40 segundos.

Os níveis de citocina/quimíocína em ambos sobrenadant.es de

BALF e homogenate pulmonar foram determinados utilizando um kit de 22 múltiplas contas de camundongo (MÜlipore) seguindo o protocolo do fabricante e analisados utilizando uma maquina de BioRad Bioplex. Os resultados furam representados graficamente e analisados utilizando Software

Graph Pad Prism.

Detecção de .Célula Humana

O RNA total foi isolado de tecidos de camundongo por Asura gen, bin., de acordo com os procedimentos operacionais padrões da companhia. A pureza e quantidade de amostras de RNA total foram determinadas por leituras de absorbânoia em 26() e 280 nm utilizando um espectrofotôrne·· üo NanoDrop ND-1000 UV, A integridade de ERA foi avaliada utilizando um 5 Bloanalísador Agilent.

Os ensaios específicos para humano para mRNA de GAPDH (Hs99999905„m1„GAPDH) foram utilizados para estimar o número de hUTC em tecido pulmonar de camundongo. As amostras para análise de RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) utilizando Ensaios TaqMarf' de tubo único 10 (Applied Biesysiems) foram processadas por Asuragen, Inc., de acordo com os procedimentos operacionais padrões da companhia. As diluições de RNA total furam transcritas reversas utilizando o Kit de Síntese de cDNA de Alta Capacidade TaqMan^ {Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante e em um volume de reação total de 20 microlitres por diluição. 50 15 ng de cDNA de influxo foi em seguida anaiisado por PCR, Todas as amplificações foram realizadas em tripllcata em um termocícllzador em tempo real ABI 7500 validada. Em seguida a incubação a 95^<:C durante 10 minutos, as amostras furam amplificadas em 40 ciclos de 95’C durante 15 segundos, em seguida 6(FC durante 1 minuto. O número falai da hUTC nos pulmões do 20 uarnundoago íoí estimado com base em uma curva padrão gerada analisando-se as quantidades conhecidas der RN A total de hUTC purificado.

Proteína Total da BA.I..F

Exposição a 90% de O? durante 4 dias resultou ear um aumento no teor de proteína total de BALÍ comparado com animais de controle de ar 25 ambiente (p < 0,01, figura 1, Tabelas 1-2). Além disso, houve uma diminuição estatisticamente significante na proteína de BALF total no grupa de tratamento hUTC de 99% de C); quando comparado como o grupo de tratamento de PBS de 90% (¾ (p < 0.05).

Tabelas 1-2. Concentração de paute/na tofed BALF. Proteína total foi medida utilizando Ensaio da Proteína Pierce BCA.

Grupo de tratamento	— — Número de Animal	s —............................................................................ Concentração de Proteína BALF Total (ug/dl)
	1	401,89
1	2	1006.68
s|:s ............................::::/;i^j://://::::::j	3	660,67
1	4	494.49
i	5	1432,64
iC”	6	76,23
Média Desvia padrão	678.77 437.77

Grupo de tratamento	Numere de Animai	.................................................................................... Concentração de Proteins BALF Total (ug/dl)
2	1	1701,60
2	..... 2	1438,46
2	3	1197,13
2	...... 4	2823,93
1b——	5	4482,76
11 .67.,	6	3174,32
Média		2469,70
Desvio padrão	1260,74

Grupo de tratamento	Número de Animal	Concentração de Proteína BALF lotai (ug/dl)
3		984,67
...................................................................................................................... 3	........................ ............ ............................................ ............ ................ 2	691,20
6Í|;iiij6 .....	|||1;^	1172,41
|3!|TTT66	111,431 .....	893,28
3		693.56
3	6	1359,95
Média		966,21
Desvio padrão		265.37

Análise de Citocina de Homogenate de Pulmao de BALF

Uma diminuição estatisticamente significant^ am fate? do oeratinõcilo de BALE (KC), eitooina Induzivel por interferon gama (IP-10), interleucina 1o (IL-lu) e fator-1 quimiotátteo de monôcito de homogenate de pulmão 6 (MCP -1) foi observada ern animais tratados corn hUTC e exposta a 90% de O? comparado a animais tratados com veiculo da PBS e exposto a 90% de O?_ (p < 0,02). (figuras 2a e 2b, figuras 3 e 4).

Enxerto de Célula Humana

No dia quatro, pòs-trstemento, os animais foram sacrificados, os 10 pulmões foram colhidos e o RNA total foi isolado para detecção de célula humana. Os resultados mostraram a presença de hUTC nc-s pulmões de animais tratados com hUTC. porém ausente dos pulmões de animais tratados com PBS (Tabela 1 -3).

Tabela 1-3. Defecção de Cè/ufe Humana. A presença de hUTC em pulmões de oamundnngo no dia quatro põs-tratamento foi determinada medindo-se as transcrições de mRNA de GAPDH específico humano utilizando PCR em tempo real. Os valores de limiar de ciclo (CT) menores do que 34 indicam que hUTC estão presentes no tecido pulmonar de camundongo. Nenhuma transcrição de rnRNA de hUTC detectada no tecido pulmonar de camundon20 go (Ausente). Transcrições de rnRNA de hUTC detectadas no tecido pulmo-

Grupo de Tratarnento	Valcv de CT Médio	HUTC em Pulmão de Camundongo
lilllr............................	36,1	Ausente
1	36,5	Ausente
2	IfZZ 'lÍ^^rZsZZ	Ausénte
2	34,4	.Ausente
3	26,2	Presente
Í3L	29,6	Presente
11 :::: S .......... :::: J ........	26.6	Presente
3	26,9	Presente
''	26.1	.....Presente
3	26.5	Presente

O efeito de administração infravenosa profilátlca de hUTC no desenvolvimento de lesão pulmonar aguda induzid?a por híperoxia em camunoongos foi avaliado. O nível reduzido de proteína total no BAl.f, em seguida a administração de hUTC em camundongos expostos a 90% de Q?_: sugere que hUTC foram capazes de reduzir vazamento/edema vascular induzido por híperoxia nc pulmão. Além disso, os dados mostraram que hUTC causou uma redução nos níveis de três quirniocinas importantes sugerindo inflamação reduzida no pulmão. Estes dados fornecem evidência que hUTC podem ser um importante agente terapêutico para o tratamento de doença 10 pulmonar.

EXEMPEO2

Eificácia Terapêutica em qm Modelo de Roedor de Doença Pulmonar Qbstruti va Crônica

Este exemplo ilustra a eficácia de hUTC para realçar reparo e regeneração de pulmão em um modelo de roedor de lesão pulmonar induzida por' fumo de cigano, Qs dados demonstram o valor terapêutico de hUTC para o tratamento de CORD preventivo.

Isolamento e Cultura de Célula do Umbigo

As nèlu ias derivadas do umbigo (U DC s. h UTCsi foram prepara 2(1 das como descrito nas Publicações de Patente dos Estados Unidos hT^s. 2()05/()()32209, 2005/0058031 e 2005/0054()90. As células foram cultivadas para a passagem desejada e em seguida criogenicamente conservadas. Modelo Animal

Ratos SH saudáveis, machos, de 12 a 15 semanas de idade se25 rão adquiridas da Charles River Laboratories, Raleigh, NC. Cada cepa de rato será randornizada por pesa corporal em três grupos (Tabela 2-1). Cs ratos SD em seguida serão expostas todo o carpa a fumaça de Tabaco (concentração de particulado total 75-85 rng/m(3)) ou ar ambiente filtrado durante 0 h/dia durante 15 dias (3 dias/semana).

Preparação depose

No dia 15, o tratamento do hábito de fumar serà terminado e o veiculo de hUTC ou PBS serà administrado, Imediatamente antes da inje * 7 ção, hUTC será descongelado a 37°C (banho com água), lavada duas vezes em salina tarnponada de fosfato (PBS) e ressuspensas um 1 mL de PBS, As células serão contatadas utilizando um hemocitômetro. A viabilidade de célula serà determinada por exclusão de azul triptano. As células serão reconsti5 íuídas nas concentrações apropriadas de 1e^fe células e 3e⁵ células em 2 ml..

de PBS. As células serão lentamente administradas através de injeção na veia da cauda durante um intervale de dois minutos.

Duas semanas após as injeções de veiculo ou hUTC, os animais serão sacrificados para colher o fluido de lavagem broucoalveoíar (BALF) (8 10 animais/grupo de tratamento) e tecido pulmonar (8 snimais/grupo de tratamento).

1 Grupo de Ira i temente	Atmosfera	Tempo de Administra ção	Tratamento
111(3'1	Ar Ambiente	0	PBS
2	Fumaça	0	PBS
|1( ::(1	Fumaça	0	1e£i hUTC
b.................	Fumaça	0	3efehUTC

Preparação.de BALF

Para preparar BALF, oito animais por grupo de tratamento serão eutanízados e os pulmões serão lavados uma vez com 1 ,0mL de PBS estéril (Invitroyen) e os tubos contendo BALF fresco serão colocados em gelo úmido. O BALF serà centrifugado em 1000 rpm durante 5 min e o fluido sobrenadante será removido e utdizado para outra anáhse.

Análise de Citecina de BALF

Os níveis de oitocinafquimtocma de BALE serão determinados utihzando um kit de 22 contas multiples de camundongo IMillipore) segurado o protocolo da fabricante e analisados utilizando uma máquina BioRad Bioplex. Os resultados serão representados graficamente e analisados utdizan25 do Software GraphPad Prism.

59/11

Analise ue Proteína Total de ^ALr

Para determinar a proteína total em cada amostra, HALF' livre de célula será analisada utilizando um Ensaio de Proteína BCA (Pierce). A análise será completada utilizando o programa Softmax 4.0 o os dados serão representadas graficamente utilizando Software Software Graph Pad Prism. iHistqtogia

Os pulmões serão colhidos de oito animais por grupo de tratamento. A metade de cada pulmão será fixado com 10% de solução de tampão neutro de formaldeído durante 2.4 horas,, desidratada em uma série de etanol graduado, embebida em parafina, e cortada em fatias da 5 pm. As seções de parafina serão manchadas com hematoxilina-eosina (HE) e Masson para análise histopatolôgica. A metade de pulmão restante será cangefeda instantaneamente e processada para MPO e detecção de célula tramaria (vide, abaixo);

At ívidade de Mialpperoxid ase ..(MPO)

Cerca de 200 mg da tecido pulmonar do lóbulo superior direito será homogenado em 20 mmol/L de tampão de fosfato de potássio (pH7,4) e ultracentrífugado. A precipitação será conservada a -70^:'C com HTAB para medição de MPO. A atividade de MPO em seguida será determinada. Isolamento de RNA

O RNA total será Isolado de todo o tecido pulmonar congelada instantaneamente por Asuragen, Irra., de acordo com os procedimentos operacionais padrões da companhia. A pureza e quantidade de amostras de RNA total será determinada por feituras da absorbância em 26Q e 280 nrn utilizando um espectrofotômetro Nanoürop ND-1000 UV. A integridade de RNA serà avaliada utilizando um Bioanalisadcr Agilent.

PêteÇ.Ção.de.Çêlute„^

Qs ensaios específicos de humano para mRNA de GAPDH (Hs99999905. m1... GAPDH) serão utilizados para estimar o número de hUTC no tecido pulmonar de camundongo. As amostras de análise RT- PGR quantitativa (qRTPCR) utilizaridu Ensaios de TaqMan^ de tubo único (Applied Biosystems) serão processadas por Asuragen, inc.., de acordo com os pro

60/117 sedimentos operacionais padrões da companhia. /As diluições ria RNA lotai serão transcritas reversas utilizando o K<f de Sintese de cDNA. de Alta Capacidade TaqMarP' (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante e em um volume de reação total de 20 microlitres por diluição. 50 ng de cDNA de influxo em seguida serão analisados por PCR. Todas as amplificações serão realizadas em triplicada em um termociclizador de tempo real ABI 7500 validado. Em seguida a incubação a 95^l’C durante 10 minutos, as amostras focam amplificadas em 4Q cicies de 95C durante 15 segundos, em seguida 6(TC durante 1 minuto.

Fibrose Pulmonar

Este exemplo ilustra a eficácia de hUTC para prevenir fibrose e realçar o reparo e regeneração do pulmão em um modelo de roedor de fibrose pulmonar induzdda par bleomicina (8L.M).

Isolamento de Cultura de Célula Umbilical Células derivadas do umbigo (UDC, hUTC) foram preparadas como descrito nas Publicações de Patente dos Estados Unidos N^C5< 2005/0032209. 2005/0058631 e 2005/0054098. As células foram cultivadas para a passagem desejada e em seguida criogenicamente conservadas.

Modelo Animal

Sessenta e quatro ratos Sprague-Dawtey adultos (2.00-250 g de peso corporal) serão obtidos e randomioarnente divididos em quatro grupos com dezesseis ratos em cada grupo. Os animais serão perfundidos intratecalmerrte com 5 mg/kg de BLM. Imediatamente ardes da injeção.. hUTC será descongelado a 37°C (banho com água), lavado duas vezes em salina tamponada de fosfato (PBS) e ressuspensos ern 1 mb de PBS. As células serão contatadas utilizando hemocitômetro. A viabilidade de célula será determinada por exclusão de azul fopano. As células serão reconstituídas na concentração apropriada em 2 ml de PBS. As; células serão lentamente administradas através de injeção na veia da cauda durante um intervalo de dois minutos. O desígnio do estudo è resumido na Tabela 3-1 abaixo.

61/117

Nos grupos de tratamento de hUTC, 0,1··χ10 1 x 10 ou 3x10' hUTC serão injetados na veia da cauda doze horas após a perfusão de BLM. O veículo da PBS sozinho será administrado de um modo similar somo aos grupos de tratamento de hUTC. Duas semanas após as injeções de veículo 5 ou hUTC. os animais serão sacrificados para colher o fluido de lavagem broncoalveolsr (BALF) (8 anímais/grupo de tratamento) e tecido pulmonar (8 animais/gmpo de tratamento).

Tabela 3-1.

Grupo de Tratamento	BLM (rng/kg)	Tratamento
lio : . . :)	5	PBS
Oil j	BiC .	0,1 e hUTC
3	5	1e& hUTC
4	5	3eehUTC

θ .Pfpparação de BAÍ..F

Para preparar BAI...F, oito animais por grupo de tratamento serão eutanizadus e es pulmões serão lavados uma vez com 1_:0 mi. de PBS estéril (ínvitrogen) e os tubos contendo BALF fresco serão colocados no gelo úmido. O BALF serà centrifugado em 1000 rpm durante 5 rnin e o fluido so15 brenadante será removido e utilizado para outra análise.

Análise de Citocina de BALF

Os níveis de oitocica/quimiocína de BALF serão determinados utihzando um kit de 22 contas múltiplas de camundongo (MiHipore) seguindo o protocolo do fabricante e analisados utilizando uma máquina BioRad 20 Bioplex. Gs resultados serão representados graficamente e analisados utilizando Software Graphpad Prism,

Anãjjse

Para determinar a proteína total em cada amostra. BALF livre de célula será analisado utilizando um Ensaio de Proteína BCA (Pierce). A anã25 liso será completada utilizando o programa Softmax 4.0 e os dados serão representados graficamente utilizando o Software Graph Pad Prism.

Ftistplpqia

Os pulmões serac colhidos de oito animais por grupo de traiamento. A metade de cada pulmão serà fixada com 1G% da solução de tampão neutra de fomiaideído durante 24 horas, desidratada em uma série de 5 efanol graduado, embebida em parafina, e cortada ern fatias de 5 pm. As seções de parafina serão manchadas com hematoxilina-eosina (HE) e Massen para análise hisfopatológrca. A metade do pulmão restante será congelada instantaneamente e processada para detecção de célula humana (vide, abaixo).

W Detecção de célula humana

RNA total será isolado de todo u tecido pulmonar congelado instantaneamente por Asuragen, Inc , de acordo com os procedimentos operacionais padrões da companhia. A pureza e quantidade de amostras de RNA total serão determinadas por leituras de absorbância em 260 e 2.80 nrn utili15 zando um espectrofotõrnetro NanoDrop ND-1000 ÜV. A integridade do RNA será avaliada utilizando um Bioanalisador Agilent.

Os ensaios específicos de humano para mRNA de G.APÜH (Hs99999905 ml GAPDH) serão utilizados para estimar o número da hUTC no tecido pulmonar de camundongo. .As amostras para análise de RT PCR 20 quantitativo (qRT-PCR) utilizando Ensaios TaqMan^ de tubo único (.Applied Biosysterns) serão processadas por Asuragen, Inc., de acordo com os procedimentos operacionais padrões da companhia. As diluições de RNA total serão trar'sscritas reversas utilizando o Kit de Síntese de cDNA de Alta Capacidade TaqMan^ (.Applied Biosyslems) de acordo com as instruções do fabn25 cante e em um volume de reação total de 20 microlitres por diluição. 50 ng de cDNA de influxo em seguida serão analisados por PCR. Todas as amplificações serão realizadas em tripiicata em um termucidizador em tempo real ABl 7500 validado Em seguida a irscubaçao a 95”C durante 10 minutos, as amostras serão amplificadas em 40 ciclos de G5^aC durante 15 segundos, em 30 seguida 6(FC durante i minuto.

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LXCMPL0 4

Eficácia Protetora Pulmonar em um Modelo da Roedor de Enflsema Induzida fòoi..£Wase

Este estudo demonstrará a eficácia de hUTC intravenosarnente 5 administrado no tratamento, rnelhora e/ou prevenção de enfisema induzida per elastase ern um modelo de roedor.

Os camundongos ou ratos C57BU6N serão anestesiados com éter ou injeção intraperitoneal de cetamína (96 mg/kg) e xilazina (1 mg/kg) e dada administração intranasal de 0,3 ou 1 ,2 umidade de elastase pancreática 10 porcina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U S A) Os camundongos de controle receberão administração intranasal de salina sozinha.

Duas a vinte e quatro horas após tratamento corn elastase, concentrações crescentes de células derivadas de tecido umbilical humano (hUTC) serão administradas através de injeção na veia da cauda. Corno 15 descrito na Tabela 4.1. 0,1χ10^δ, 1 x 10^e ou 3xW* hUTC, reconstituídos em veículo PBS. serão administrados em um volume total de 200ul, O veiculo da PBS, sen? hUTC será administrado de um modo similar corno nos grupos de tratamento de hUTC, Duas semanas apôs as injeções de veículo ou hUTC, os animais serão sacrificados para colher as amostras de tecido pul20 monar e fluido de lavagem broncoalveoíar (BALF), que será armazenado a -70^ftC antes das análises

Tabela 4.1. Desígnio Experimental.

Grupo de Tratamento		Tratamento I
||||||||||||||J	. ............. Ç:Ç:Ç:U.<<£:<<<<<<<' <<	PBS |
2	..........τχ xx |......	0,1 es de hUTC I
3		1e&dehUTC í
4..........	i	3 es de hUTC |
Análise.de BALF

Para preparar BALF, todos os animais serão eutanizados e os pulmões serão lavados uma vez com 1,0 ml. de PBS estéril (Invitrogen) e os tubos serão colocados em gele úmida. O DALE será centrifugado em 1000 rprn durante 5 min e o fluida sobrenadante será removido e utilizado para análise adicional

Os níveis de oítocína/qtemlocina em ambos sobrenadantes de homugenato de BALF e pulmão serão determinados utilizando um kit de 22 5 contas múltiplas de camundongo (Mlllipore) seguindo o protocolo tio fabricante e analisados utilizando uma máquina BioRad Bíoplex. Os resultados serão representados graficamente e analisados utilizando Software GraphBad Bnsm.....

.Análise de...Protela

Para determinar a proteína total em cada amostra. BALF livre de célula será analisado utilizando um Ensaio de Proteína BOA (Pierce). A análise será completada utilizando o programa Soflmax 4.0 e os dados serão representados graficamente utilizando Software Graph Pad Prism.

H isto log ia

As amostras de tecido pulmonar serão fixadas com 10% de solução de tampão neutra de formaldeído durante 24 horas, desidratadas em uma série de eianol graduado, embebidas e parafina, e cortada em fatias de 5 pm. As seções de parafina serão maneiradas com hematoxoíina-eosina (H&E) e Masson para análise? de histopatología.

Detecção de Célula Humana

RNA total serà isolado de tecidos de camundongo por Asuragen, Inc,, de acordo com os procedimentos operacionais padrões da companhia. A pureza e quantidade de amostras de RNA total serão determinadas por leituras de absorbãncia em 261) e 280 nm utilizando um espectrofotõmetro 2b NanoDrop ND-100C· UV. A integridade de RNA será avahada utilizando um Bica naüsador Agilent.

Os ensaios específicos de humano para mRNA de GAPDH (Hs99999905 jivl GAPDH) serão utilizados para estimar o número de hUTC no tecido pulmonar de camundongo. As amostras para analise de RT-PC-R 30 quantitativa (qRT-PCR) utilizando Ensaios TaqMan'^ de tubo único (Applied Biosystems) serão processadas por Asuragen, Inc., de acordo com os procedimentos operacionais padrões da companhia. As diluições de RNA total

55/117 serão transcritas reversa utilizando o Kit de Síntese de cDNA de Alfa Capacidade TaqMan'⁵ (Applied 8iosy.sf.ems) de acordo com as instruções do fabricante e em um volume de reação total de 20 microlitres por diluição. 50 ng de cDNA. de influxo em seguida serão analisados por PCR Todas as amplificações serão realizadas em tdpiicata em um termociclizador em tempo real ABl 7500 validado. Em seguida a incubação em 95'C durante 10 minutos, as amostras cerno amplificadas ear 40 ciclos de 95'C durante 15 segundos, em seguida 6CFC durante 1 minuto O número total de hUTC nos pulmões de carnundongo será estimado com base em uma curva padrão gerada por análise das quantidades conhecidas de RNA lotai de hUTC purificado, ProteinaI.otal.de.8ALF.

Uma diminuição estatisticamente signiflcante em concentração de proteins total BALF será observada em animais -ratados com hUTC comparada com animais tratados cem controle de veículo. Aiém disso, é possível que o acúmulo de neutrófilos slgnificanie seja observado em animais de controle de PBS, porém pode ser reduzido nos grupos de trata mento de hUTC.

Análise de Citocina de BALF/Proteína de Matriz Extraceiuiar

Uma diminuição estatisticamente signifícante em citocinas profibrõticas e/ou prò-infíamatôrlas será observada em animais tratados com hUTC comparados com animais tratados com controle de veiculo. Além disso. elastase aumentará o teor de ECM em fluido de lavagem broncoalveolar, um marcador para lesão pulmonar. Estes efeitos serão atenuados por tratamento com hUTC.

Análise;.HÍslpiôgiça

Tratamento de elastase resultará no desenvolvimento de áreas subpleurais de inflamação que abrangam uma porção significaste do parênqmma pulmonar. Aièrn disso, a perda de arquitetura dos brônquios e alveolar normal bem como vasculature será observada. A administração de hUTC logo após o desafio com elastase reduzirá a extensão da inflamação e dano no pulmão como evidenciado por grandes áreas de tecido não danificado com arquitetura alveolar normal.

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Enxerto de Célula Humana

As células humanas serão detectadas r»os pulmões de roedores tratadas cam h’JTC porém ausente de animais tratados com veiculo de PBS

EXEMPLO 5 isolamento de Células

Isolamento de célula umbilical Os cordões umbilicais foram obtidos de National Disease Research Interchange (NDRI, Filadélfia. PA). Os tecidos foram obtidos seguindo liberações normais. Os protocolos de isolamento de célula furam realizados asséptica mente em um cabo de fluxo iami10 nar. Para remover o sangue e os resíduos, o cordão foi lavado em salina tamponade de fosfato (PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) na presença de penicilina em 100 Unidades/miiílitro, estreptomicina em 100 míllgramas/mililitra a anfotedcína B em 0,25 micrograma/miiilitro (Invitrogen Carlsbad, CA). Os tecidos foram em seguida mecanicamente dissociados em 150 cm² de pia15 cas de cultura de tecido na presença de 50 mililitros de meio (DMEM de baixa teor de glicose ou DMEM de elevada teor de glicose; invitrogen) até que o tecido tenha sido picada em uma polpa tina. Os tecidos picados foram transferidos para tubos cônicos de <50 rnilihtrus (aproximadamente 5 gramas de tecido par tuba).

O tecido foi ern seguida digerido em melo de DMEM com baixo teor de glicose ou meio de DMEM com alto teor de glicose, cada contendo penicilina ern 100 Unidades/miiihtra, estreptomicina em 100 miíligramas/mililifro, anfotericina B em 0.25 micrograma/mililitra e as enzimas de digestão. Em alguns experimentos ama mistura de enzima de colagenase e 25 dispose foi utilizada (”C:D^,f) (colagenase (Sigrna, St Louis, MO), 500 Unidades/miiiktro; e dispase (invitrogen), 50 Unidades/milílitro, em melo com baixo teor da glicose de DMEM). Em outros experimentos uma mistura de colagenase, dispase e hiaiuronida.se (”CO'H') fci utilizada (C:D:H ~ colagenase. 500 Unidades/mililitro; díspase, 50 Unidades/mililitro; e hlaluronidase (Sigma).. 5

Unidades/mslilitro, em barxo fear de glicose de DMEM). Os tubos cônicos contenda o tecido, veiculo e enzrmas de digestão foram Incubadas a 37^<:C em um agitador urbrfal (Environ. Brooklyn, NY) em 225 rpm durante duas horas.

677117

Após a digestão, os tecidas foram centrifugados em 150 x g do·· rente 5 minutos, o sobrenadante foi aspirado. G pélete foi ressuspcnso em 20 mililitros de meio de crescimento (DMEbtbaixo teor de glicose e (invitrogen), 15 por cento (v/v) de soro bovino fetal (FBS; soro bovino fetal definida;

Lote hP. AND 18475; Hyclone. Logan, UT), 0,001% (v/v) de 2-rnercapfoetanc-l (Sigma), penicilina em 100 Unidades por mililitro, estreptomicina um 100 microgramas por mililitro, a anfoíerícina B em 0,25 micrograma por mililitro (cada de Invitrogen, Carlsbad. CA)) A suspensão de célula foi filtrada através de um Coador de Célula BD FALCON de náilon de 70-rnícrons (BD BioscL 10 ences, San dose, CA). Um adicional de 5 mililitros de enxágue compreendendo meio de crescimento foi passado através do coador, A suspensão de célula foi ern seguida passada através de um coador de célula de náilon de 40-micrômetros (BD Biosciences, San Jose, CA) e perseguida com um enxagua da um adicional de 5 mililitros de meio de crescimento.

O filtrado foi ressuspenso em meio de crescimento (volume total de 50 mililitros) e centrifugado em 150 x g durante 5 minutos. O sobrenadante foi aspirado e as células foram ressuspensas em 50 rnilihtros de mesa decrescimento fresca. Este processo foi repetido mais duas vezes.

Após a centrifugaçao final, c sobreriadante foi aspirada e a péle20 te de célula foi ressuspenso em 5 mililitros de meio de crescimento fresco. O numero de células viáveis foi determinado utilizando maochamento de azul tripano. As células foram em segmda cultivadas sob condições padrões.

As células isoladas de tecido de cordão umbilical foram semeadas em 5.000 cèlulas/cm⁴ em frascos T-75 revestidas com gelatina (Corning 25 Inc., Corning, NY) em meio de crescimento. Após dois dias, o meio gasto e as células não aderidas foram aspirados das frascos. As células aderentes foram lavadas com PBS três vezes para remover os resíduos e as células derivadas do sangue. As células foram em seguida reabastecidas cam main de crescimento e permitidas crescer para confluência (cerca de 10 dias de 30 passagem 0 a passagem 1). Em passagens subsequentes ide passagem 1 a 2 etc), células alcançaram subconfluência (75-85 por cento de confluência) em 4-5 dias. Para estas passagens subsequentes, as células foram semea das ent 5.000 celulas/cm², As células foram crescidas em uma incubadora umidificada nora 5 por canta da dióxido de carbono a 3TC.

Em algumas experiências, as células foram isoladas de tecidos de pós-parto ern meio com baixo teor de glicose de DM EM após digestão corn LIBERASE (2,5 miligramas por mililitro, Blendzima 3; Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN) e hiamronidase (5 Unidades/milihtro, Sigma). A digestão do tecido e isolamento das células fol coma descato para outras digestões de protease acima, entretanto, a mistura de Í..IBERASE/hiaiuronidase foi utilizada ao invés da mistura de C:D ou C:D:H. A digestão de tecida fai LIBERASE resultado no isolamento de populações de célula de tecido de pós-pario que expandiram facilmente.

Os procedimentos foram comparados para isolar células do cordão umbilical utilizando combinações diferentes de enzima. As enzimas comparadas para digestão incluíram: i) colagenase, li) dispase; ill) hiaiuroaldase: iv) mistura de colagenasetoispase (C.D), v) mistura de colagenase.hiaiuronidase (C:H); vi) mistura de dispase.hialuronidase (0:11), e vii) mistura de colagenase:díspase.niaiuronidase (C:D:H) As diferenças no isolamento de célula utilizando estas condições de digestão de enzima diferentes foram observadas (Tabela 5-1).

Outras tentativas foram feitas para isolar conjuntos de células de cordão umbilical por abordagens diferentes. Em um caso, o cordão umbilical foi fatiado e lavado com meia de crescimento para desalojar os coágulos de sangue e material gelatinoso. A mistura de sangue, material gelatinoso e meia de crescimento foi coletada e centrifugada ern 150 x g. O pé.lete foi ressuspenso e semeado em frascos revestidos com gelatina em meio de crescimento. A partir destes experimentos uma população de célula foi isolada a qual foi facilmente expandida.

As células também taram isoladas de amostras de sangue da cordão obtidas de NDRl O protocolo de isolamento utilizado foi aquele -do Pedido de Patente Internacional PCT/US2.002/029971 por Ho e outras. As amestras (50 mililitros e 10,5 mililitros, respectivamente) de sangue de cordão umbilical (NDRl, Filadélfia PA) furam misturadas com tampão de lise

69/117 (cloreto de amônio da 155 rnihmoíares esterilizado por filtro, 10 mil-molares de bicarbonate de potássio, 0,1 rnilimoiar de EDTA tamponade para pH 7,2 (todos os componentes de Sigma, St. Louis, MO)). As células foram lisadas em ama relação de 1:20 de sangue do curdac para tampão de lise. A suspensão de célula resultante foi vortexada durante 5 segundos, e incubada durante 2 minutos em temperatura ambiente. O Usado foi centrifugado (10 minutos a 200 x g). O pèlete de célula foi ressuspenso em Medo Essencial Mínimo Completo (Gibão, Carlsbad CA) contendo 11) por cento de soro bovino fetal (Hyclone, Logan UT), 4 milimolares de gíutamina (Mediatech Herndon, VA), penicilina em 100 Unidades por mihlitro e estrapfomicina em 100 mioragramas per mililitro (Gibco, Carlsbad, CA). As células lessuspensas foram centrifugadas (10 minutos em 200 x g), o subrenadante foi aspirado, e o pélete de célula foi lavado era meio completo. As células foram semeadas diretamente em frascos T75 (Corning. NY), frascos revestidas de lamínina 175, ou frascos revestidos de fibronectina T175 (ambos de Becton Dickinson, Bedford. MA).

Para determinar se as populações de célula podem ser isoladas sob condições diferentes e expandidas sob uma variedade de condições imedlatamente após o isolamento, as células foram digeridas em rneío de crescimento com ou sem 6,001 por cento (v/v) de 2-mercaptoetanol ((Sigma, St. Louis, MO), utilizando a combinação de enzima de C:D.H, de acordo com cs procedimentos fornecidos acima. Todas as células foram crescidas na presença de penicilina em 100 Unidades por mililitro e estreptomícins em 100 microgramas por mililitro. Sob todas as condições testadas as células se prenderam e expandiram bem entre as passagens 0 e 1 (Tabela 5-2). As células em condições 5-8 e 13-18 foram demonstradas proliferar bem até 4 passagens após a semeaçâo, ponto na qual alas foram arfosonservadas.

A combinação de C.D.H, forneceu a melhor produção de célula em seguida ao isolamento, e gerou células que expandiram para muito mais gerações em cultura do que as outras condições ( Tabela 5-1). Uma população de célula expandível não foi obtida utilizando colagenase ou hialuroaidase sozinho. Nenhuma tentativa foi feita para determinar se este resultado é

70/117 específico para a coíagenase que foi testada.

Tabela 5-1: Isolamento de células de tecido de cordão umbilical utilizando Çpmbinações de enzima yari^tes

Digestão de Enzima	Células Isoladas	Expansão de Célula
Qdagenase:	X	X
Dispase	+(>1Q h)	+
Hiaíuronidase	X	X
Colagenase: Dispose	·/ -/(<3h)
C olagenase; Hialu ron idase	-/+ (<3hj
Di spase: H ia luro nid ase	-/(>10 h;>	+
Coiagenase:Dispose? Hialuronidase	+w(<3h)	t-r /

principal. * ~ Bom, -h- ~ mudo bom, -/-) + ~ excelente, X - nenhum sucesso

As células se prenderam e expandiram bem ontre as passagens e 1 sob todas as condições testadas para crescimento e digestão da enzima (Tabela 5-2). Células em condições experimentais 5-8 e 13-16 proliferaram bem até 4 passagens após a semeação, ponto no qual elas foram crioconservadas. Todas as células foram crioconservadas para outra anãlise.

Tabela 5-2: Isolamento e Expansaáo de Cultura de Células Pós-Parto sob

QpOfligR^_;;Vanqntes:

Cí wi: · ç/;>		15¾ tfe bps	BMF		O j	Fatqrfe rfe éí'®sa- (TSStífo
1	OMEM-Lg	Υ	Υ ...	Υ		H
. X.	PMBMã	Υ	¥	: Υ		h
3	CMEM-Lg	¥	¥	Ν	Y
I f	PMEM-Lg	Υ	γ			u
	DMEM-Lg	Μ RW	: Υ'3	Ν (lYWWrép	(Υ/ ..Λ·	EOFtetàF (W.Wrfo: i
é	OME M-m		¥	Ν (Usrwsirvp	foifoT ,T	EGr·';FGF· {30 ng/ífo
7	M®k§	.Μ........	¥	Μ {EVx :>fY;ôtíí:3)	Y	FUFfWEGF
8	UMEM-Lg	5:	¥	N ((-'íí)rçx«;sgr»»}	rAOp/f'1	FPFG/VSGF
Òprilriri	OMEM-kg	¥	U	¥	:)ΥΥ:::5.......Ί	M
™L<::	OME.M-i.g	5p:::: 1/γ	Η	Y		U
::iT:S.....(3:	PMPA Aú	Íf)Í)5:)S)S5:	ύ	M	¥:	:G/::: 3 :: .....
	PMEM-Lg	¥		N		N
13	ÕMBOa	MW	,Α	M (LHíwVjgp	:Y3: ...........................	EGFZFGF r2Q
:Í3 s.....	OMEFfog		Ν	U ri..íí?nifm;s)	N(5%)	EGFAGl' (20 espW
m	OMEMTg	,'ΜΟΙ_______	Ν	U (FiSrsncOlfW	¥	PUrGA'EGF
:::/0::3:3:/	ipMaHè	»......	U	M (Flbíof^sáína}		POFGNEGF

As células nudeadas se prenderam e cresceram rapidamente.

Estes células foram analisadas por citometna de fluxo e foram similares às 5 células obtidas por- digestão de enzima.

As preparações contiveram piaquetas e células de sangue vermelhas. Nenhuma célula nudeada se prendeu e dividiu durante as 3 primeiras semanas. O meio foi mudado 3 semanas apôs a semeação e nenhuma célula foi observada se prender e cresce?'.

As populações de células podem ser isoladas do tecida umbilical eficientemente utilizando a combinação de enzima colagenase (uma meteloprotease). dispose (protease neutral) e hialuronidase (enzima mucoiítica que quebra o ácido hialurônico). LIBERASE, que é uma mistura de colagenase e uma protease neutra, também pode ser utilizada. Biertezíma 3, que ê cola genase (4 Unldades/grama de Wunsch) e terrnolisina (1714 Unidadss/graraa de cocaína). foi iambém utikzado junto com hisluronidase para isolar as células. Estas células se expandiram Facilmente sabre muitas passagens quando cultivadas em meio da expansão de crescimento em plástico revestida de 5 gelatina..

As células foram também isoladas de sangue residual nos cordões, porém não o sangue do cordão. A presença de células em coágulos de sangue lavados do tecido, que aderem e crescern sob as condições utíii/radas, pode ser devido ás células sendo liberadas durante o processo de 10 disseoção.

EXEMPLO 6

Cresçimer^^^

O potencial de expansão de célula de células derivadas do umbigo foi comparado corn outras populações dst céiulas-tronco isoladas. O 15 processo de expansão de célula para senesoéncia è referido como limite de Haytlick. (Hayfiick. L, J. Am. Geriatr. Soe, Wi ^:4: 22(1): 1-12; Iteyfück, L, Gerontologist. 1974; 14(1).37-45).

Os frascos plásticos de cultura de tecido foram revestidos adicionando-se 20 mililitros 2'% (p/v) de gelatina (Tipo B: 225 Bloom; Sigma, St 2.0 Louis, MO) a um frasco T75 (Corning Inc,, Corning, NY) durante 20 mmutos ern temperatura ambiente. Após remover a solução de gelatina, 10 milihtros de salina tamponade de fosfato (PBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram adicionados e em seguida aspirados.

Para comparação de potencial de expansão de crescimento as 25 seguintes populações de célula foram utilizadas; i) células-tronco mesenqulmais (MSC; Cambrex. Walkersville, MD); ii) células derivadas de adipose (Patente dos Estados Unidos bb 6.555.374 B1; Pedido de Patente dos Estados Unidos US2Q04D058412); iii) fibroblastos de pele dérmica normais (cc2509 teto N° 9F0844, Cambrex, Walkersville. MD), e Iv) células derivadas do 30 umbigo. As células foram inicialmente semeadas em 5.()0(} células/cm² em frascos T75 revestidos de gelatina errs meio de crescimento. Para passagens subsequentes, as culturas de célula foram tratadas como segue. Após tripsi

73/117 nização, células viáveis foram contadas apòs manchamonfu de azul tripamo. A suspensão de célula (50 microlitres) foi combinada nem azul tupano (50 microlitres, Sigma, St Louis MO). Os números de célula viáveis foram estimados utilizando um nemocitômetro

Em seguida a contagem, as células furam semeadas em 5.000 cé;u'ias/crn'· sobre frascos T75 revestido de gelatina em 25 mililitros de meio de crescimento fresco. As células foram crescidas em uma atmosfera padrão (5 por cento da dióxido de carbono (v/v)) a 37*0, O meio de crescimento fui mudada duas vezes por semana. Quando as células alcançarem cerca de 10 85 par acata de confluência elas foram passadas; este processo foi repetido até que as células alcançassem senescência.

Em cada passagem, as células furam tripsinizadas e contadas. A produção de célula viável, duplicações de população (In (células finais/células inicía;s)/in2), e tempo de duplicação (tempo em cultu15 ra/duphcaçâo de população) taram calculados. Para o propósito de determinar a expansão de célula ideal, o produto de célula total por passagem foi determinado multiplicando-se o produto total pelai passagem prévia pelo fator de expansão para cada passagem (Isto é, fator de expansão ~ células finais/células snicusss)..

O potencial de expansão de células bancadas na passagem 10 foi também testada. Um conjunto diferente de condições foi utilizado. Os fí broblastas de pele dérmica normal (co-2509 lote N” 9F0844: Cambrex, Walkersville. MD) e células derivadas do umbigo foram testados. Estas populações de células foram bancadas na passagem 10 previamente, tendo sido cultivadas em 5.000 células/cm/ em cada passagem para aquele porão. O efeito de densidade de célula nas populações de célula em seguida ao descongelamento na passagem 10 foi determinada. As células foram descongeladas sub condições padrões e contadas utilizado manchamento de azul tripano. As células descongeladas furam em seguida semeadas em 1.000 cé30 lulas/co? em meia de crescimento. As células foram crescidas sob condições atmosféricas padrões a 37*0. Q meio de crescimento faí mudada duas vezes por semana. As células furara passadas uma vez que elas alcançaram

74/117 cerca de 85% de confluência. As células foram subsequentemente passadas ate a senescência, isto é. até que elas não pudessem ser ainda mais expandidas. As células foram iripsinízadas e cantadas em cada passagem. O produto de célula, duplicação de população (In (células flnaís/células finais)/ln2) e tempo de duplicação (tempo em cultura)/duplícação de população) foram calculadas. O produto de célula total por passagem foi determinado multíplicando-se o produto total pelas passagens prévias pelo fator de expansão para cada passagem (isto é. fator de expansão ~ células finais/células iniciais),

O potencial de expansão de culturas de oêiula derivada de umbigo recentemente isoladas sob baixas condições de semeação de célula foi testado ern outro experimento. As células derivadas da umbigo tonam Isoladas como descrito em um exemplo prévio. As células foram semeadas em 1 QDO oélulas/cm^ e passadas como descrito acima até a senescência. As células foram crescidas sob condições atmosféricas padrões a 37C. O meia de crescimento foi mudada duas vezes por semana. As células foram passadas uma vez que elas alcançaram cerca de 85% de confluência. Em cada passagem, as células foram inpsimzadas e contadas por manchamento de azul tripano. O produto de célula, duplicação de população (In (célula frnal/célula iniciaQ/ln 2) e tempo de duplicação (tempo em cultura/duplicação de população) foram calculados para cada passagem. Q produto de célula total por passagem fui determinada mrãhpNcando-se o produto total pelas passagens prévias peto fator de expansão pare cada passagem (isto é. fator de expansão ~ célula finai/célula inicial). As células foram crescidas em gelatina e frascos revestidos de não gelatina.

Foi demonstrado que as condições de cultura de célula com baixo teor de 0? podem melhorar a expansão de célula em certas circunstâncias. (Vide, por exemplo. ÜS2004Ô005704). Para determinar se a expansão de célula de células derivadas do umbigo pode ser melhorada alterando-se as condições de cultura de célula, as culturas de células derivadas do umbigo foram crescidas em condições de baixa teor de oxigênio, As células foram semeadas em 5,000 células/cm^K' em meio de crescimento em frascos

revestidos de gelatina. As células foram inicialmente cultivadas sub condições atmosféricas padrões através da passagem 5, na qual elas furam transferidas para condições de cultura com baixo teor do oxigênio (5% de O_s),

Em outros experimentos as células furam expandidas em placas aâo revestidas, revestidas com colágeno, revestidas com fibroneotina, revestidas oom lamlnina, e revestidas com matrigel. As culturas foram demonstradas expandir bem nestas matrizes diferentes,

Z\s células derivadas do umbigo expandiram pare mais do que passagens gerando produtos de célula de > 1E17 células em 60 dias. Em 10 contraste. MSCs e fibroblastus senesceram após < 25 dias e <60 dias, respectivamente. Embora ambas células derivadas de adipesa e ementais tenham expandido durante quase 60 dias, elas geraram produtos de célula totais de 4.5E12 e 4.24E13 respectivamente. Desse modo, quando semeadas em 5.000 céiulasZam'^: sob condições experimentais utilizadas, as células 15 derivadas do urnbígu expandiram muito melhor r,1o que o outro tipo de células crescidas sob as mesmas condições (Tabela 6-1).

lábcte .6-1: Garaoterístiças de Crescimento para Diferentes Populações de Célula Crasçjdp para Seneççênçia

: -· · · - ............. Tipo de Célula	Senescéncía	Duplicações de Pupuiação Totais	Produto (Células Totais)
MSC	24 d	8	472E7
Célula Derivada Adrposa	57 d	24	4.5 E12
Fibroblastos	53 d	26	2,82 El 3
Umbilical	65 d	42	6.15 E17

As células de fibroblastos e derivadas de umbigo expandiram para mais do que 10 passagens gerando produtos de célula de > 1E11 células em 60 dias (Tabela 6-2). Sob estas condições tanto os flbrnblastos quanto as populações de célula derivada da umbigo envelheceram apôs 80 dias, completando >50 e >40 duplicações de população respectivamenie.

W117

Tabela..6-2.1 Çaraçtertsfcas..de .Cresoimento..para. Diferentes Popyjações de Célula Utilizando Expansão de Crescimento de Baixa Densidade de Passaoem 10 através da Senescêocía

A.svVX-ftWXÍW^VWWMAWWiW^W^^^

Tipo de Célula	I Senescêncía	Ϊ Duplicações	de i Produto (Célula
(N°. da Passagem)		; População Tc	riais i Totais)
ribroblastos (PIO)	I 80 dias	i 43.88	| 2,59 ET1
Umbilical r P10)	I 80 dias	I 53.8	i 1.25 E14

As células expandiram bem seb as condições de oxigênio roeu5 zido, entretanto, a cultura sob condições de oxigênio baixe não parece ter um efeito sígnificante na expansão do célula para células derivadas de pósparto. Estes resultados são preliminares no sentido que qualquer conclusão final a ser feita considerando o efeito de oxigênio reduzido seria mais bem extraída de experimentos em células em crescimento em baixo teor de oxi0 gênio de isolamento iniciai. As condições atmosféricas padrões já provaram ter sucesso para crescer números suficientes de células, e a cultura de baixo teor de oxigênio não é requerida paira o crescimento de células derivadas de pós-parto.

As condições de expansão de célula correntes de crescimento 5 de células derivadas do umbigo isoladas em densidades de cerca de 5.0G0 células/cmL em meio de crescimento em frascos não revestidos ou revestidos corn gelatina, sob oxigênio atmosférico padrão, são suficientes para gerar grandes números dei células na passagem 11 Além disso, cs dados sugerem que as células podem ser facilmente expandidas utilizando condições 0 de cultura de densidade mais baixa (por exemplo. 1 .()0(} céiulasfcm³). A expansão de célula derivada do umbigo em condições de baixo teor de oxigênio também facilita a expansão de célula, embora nenhuma melhora incrementai no potencial de expansão de célula já tenha sido observado quando utilizando estas condições para o crescimento. Atualmente, a cultura de cé5 lulas derivadas do umbigo sob condições atmosféricas padrão é preferida para gerar grandes grupos de células. Entretanto, quando as condições de cultura são alteradas a expansão de célula derivada do umbigo pode de ou tro mode ser alterada. Esta estratégia pode ser utilizada para realçar a capacidade prolifer;ativa e diferenoíatlva destas populações de célula.

Sob as condições utilizadas, ao mesmo tempo em que o potencial de expansão de MSC e oélulas derivadas adiposas é limitado, as células 5 derivadas do umbigo expandem facilmente para números maiores

EXEMPLO 7

ÇjB§£imentQ..de.Çélulas em Meio Contendo D-Valina

Foi reportado que o mero contendo D-valina ao invés da isoforma de L-vaíina normal pode ser utilizado para seíetivamente inibir o cresci10 mento de células em cultura semelhantes ao flbroblasto. (Hongpaisan, J, Cell Biol ínt, 2000; 24.1-7; Sordillo. L M, e outros. Cell Biol Ini Rep., 1988; 12.355-64). Os experimentos foram realizados para determinar se as células derivadas do umbigo puderam crescer em meio contendo D-vaíina.

As células derivadas do umbigo (PS) e fíbroblastas (P9) foram 15 semeadas em 5 000 cèlulas/on? em frascos T75 revestidos de gelatina (Corning, Coming, NY). Após 24 horas u meio foi removido e as células foram lavadas com salina iamponada de fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, Ca.) para remover o meio residual. O meio foi substituído com um meio de crescimento modificado (DMEM com D-vaíina (ordem especial Giboe). 15% (v/v) 20 de soro bovino fetal dializadu (Hyclone. Logan, UT), 0,001% (v/v) de betamercaptoetanul (Sigma), penicilina em 50 Unidades/rnilílitro e estreplomicina em 50 müligramas/mililitro (Gibco)).

As células derivadas da umbiga e células de flbroblasto semeadas no meio contendo D-valina não proliferaram, diferente das células se25 meadas em meio de crescimento contenda saro diaíizado. As células de fibroblastos mudaram morfologicamente, aumentando ern tamanho e mudando a forma. Iodas as células morreram e eventualmente se desprenderam da superfície do frasco após quatro semanas. Desse modo, pude ser concluído que as células derivadas de tecido de cordão umbilical requerem l-valina 30 para o crescimento celular e para manter a viabilidade por longo prazo. Lvalina é preferivelmente não removida do meia de crescimento para células derivadas de tecido de cordão umbilical.

Análise de Canótipo. das.Células

As linhagens celulares utilizadas em terapia de célula são preferivelmente homogêneas e livres de qualquer tipo de célula contaminant©. As células humanas utilizadas na terapia de célula devem ter um nérnero normal (46) de cromossomos com estrutura normal. Para identificar as linhagens celulares derivadas de umbigo que são homogêneas e livres de células de origem de tecido não umbilical, os cariótipos de amostras da célula foram analisados.

UTC da tecido pós-parto de um recém-nascido de sexo masculino foram cultivados em meios de crescimento. O tecido pós-parto de um recém-nascido do sexo masculino (X, Y) foi selecionado para permitir distinção entre células derivadas de recém-nascidos e células de origem materna (X,X). As células foram semeadas em 5.000 células por centímetro quadrado em meio de crescimento em urn basso T25 (Coming, Corning. NV) e expandiram para 80% de confluência. Um frasco T25 contendo células foi cheia até a gargalo com meio de crescimento. As amostras foram liberadas para um laboratório citogenético clinico par transportadora (o tempo de transporte estimado de laboratório para laboratório é uma hora). A análise do cromossoma foi realizada por Center for Human & Molecular Genetics na Escola de Medicina da Nova Jersey, Newark, NJ, As oèlulas foram analisadas durante rnetãfase quando os cromossomas são mais bem-visualizados. De vinte células em metáfase contada, cinco foram analisadas quanto ao número de caríòtipo homogêneo normal (dois). Urna amostra de célula foi caracterizada como homogênea se dois cariótipos foram observados, Uma amostra de célula foi caracterizada como heterogênea se mais do que dois cariótipos forem observados. As células der metáfase adicionais foram contadas e analisadas quando um numero de cariótipo heterogêneo (quatro) foi identificado.

fedas as amostras de célula enviadas para análise de crornos·· soma foram interpretadas pela equipe de laboratório de citogenética como exibindo uma aparência normal· Três das dezesseis linhagens celulares analisadas exibiram um fenótipo heterogêneo (XX e XY) indicando a presença de células derivadas tanto de origem neonatal quanto materna (Tabela 8-1).

Cada das amostras de célula toi caracterizada como homogênea. (Tabela SB ^:::: .... .... ^{::: ::::}

Tabela 8-'	. Resultados	de Cariótipos	de UTC.
Tecido	Passagem	Células de Metálase Contadas	Células de Metáfase A.nahsadas	.................................. Número de Cariótipos	T------------------ Cariótipos de ÍSCN
Umbilical	2.3	20	5	2	46, XX
Um- bilical	5	20	5	2	46, XY
............................. Umbilical	.................................... 3	20	5	2	46, X.X

A análise do cromossoma identificou UTC derivada de umbigo cujos cariótipos parecem normais quando interpretados por um laboratório de cltogenética clinico. A análise de cariõtipo também identificou linhagens celulares livres de células maternas, como determinado por uariótipo homogêneo.

EXEMPLO 9

Avaliação Citométrica de Fluxo de Marcadores de Superfície de Célula

A caracterização de proteínas de superfície de célula ou marcadores'' por CJtomeíria de fluxo pode ser utilizada para determinar uma identidade de linhagem celular. A consistência da expressão pode ser determina15 da de múltiplos doadores, e em células expostas para diferenciar as condições de processamento e cultura. As linhagens de célula pós-parto isoladas do umbigo foram caracterizadas por citcmetria de fluxo, fornecendo urn perfil para a identificação destas linhagens celulares.

As células foram cultivadas em meio de crescimento, em frascos 20 de cultura de tecido T75, TI 50, e T2.25 tratados com plasma (Corning, Corning, NY) ate confíuentes. As superficies de crescimento des frascos foram revestidas com gelatina incubando-se 2% (p/v) de gelatina (Sigma, St Louis, MO) durante 20 minutos em temperatura ambiente.

As células aderentes em frascos foram lavadas em salina tarn penada de fosfato (PBS); (Gibco, Carlsbad, MO) e desprendidas sorri tripsina/EDTA (Gibco). As células foram colhidas, centrifugadas e ressuspensas em 3% (v/v) de FBS em PBS em ama concentração de célula de 1x10^; por mililitro, Do acordo corn as especificações do fabricante, o anticorpo para o marcador de superfície de célula de interesse (vide abaixo) foi adicionado a 100 microlifros de suspensão de célula e a mistura foi incubada no escuro durante 30 minutos a 4^:'C. Após incubação, as células foram lavadas com PBS e centrifugadas para remover o anticorpo não ligado. As células furam ressuspansas em 500 microlitres de PBS e analisadas por citometria de fluxo, A análise de citometria de fluxo foi realizada com um instrumento de FACS ualíbuf (Becton Dickinson, San dose, GA).

Os seguintes anticorpos para marcadores de superfície de célula foram utilizados.

l).êbela.9-l; Anticorpos utilizados na caracterização de marcadores de superfície de célula de UDCs.

Wcso	FaUri;.arrk.:	SteíSrSíV:
CD id	30 WíW-qm-í Wrp, CA}	Btw
CP □	BB	55S.194
CD35	BO	3554-rs
CÍXnl	3D iqwríóngçii	55W1
(W	HD Ph&unAjm	$5547$
OM5RA	30 Phsnnhge;*	535^9
con	30	55(W?
am	3D Rwm&gen
aw?	30 Pte?rrrAu?s'B	ww
COMÍ	BD PhsaxHwxs
PWr-W	BD Pharmbigen	1WU
PLA-A. B, C	3D Pluvridrisvi	5W53
HLÂ-I7R, DP, IX>	BD Phsnxiifiges	55555$
tgG-FFFC	SipfVif (St Losris, MO·	FWd;
l.g(F Ft

i. C3U:;'i5

As células danvadas do umbigo furam analisadas nas passagens B, 15, e 2Ü.

Para comparar diferenças entre os doadores, as células derivadas de tecido de cordão umbilical de diferentes doadores foram comparadas com cada outra.

As células derivadas do umbigo cultivadas em frascos revestidos de gelatina taram também comparadas cam células derivadas dc umbigo cultivadas em frascas ruão revestidos.

Quatro tratamentos utilizados para isolamento e preparação de células foram comparados As células derivadas de tecido de pós-parto por 5 tratamento corn: 1) colagenase; 2) cclageaase/díspase; 3) colagenase/hialuronidase; e 4) colagenase/hialuronidase/dlspase foram comparadas.

As células derivadas do cordão umbilical nas passagens 8, 15, e 20 analisadas por citometna de fluxo todas expressaram CD10, CD 13, GD44, CD73, CD9G, PDGFr-aifa e HI..A-A, B, C, indicados par fluorescência 10 aumentada relativo ao controle de IgG. Estas células foram negativas para CD31, CD34, CD45, GD117, CD141, e HLA-DR, DP, DQ, indicado por valores de fluorescência de acordo com o controle de IgG.

As células denvadas de cordão umbilical isoladas de doadores separados analisadas par citometria de fluxo cada mostrou positivo para a 15 produção de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-affa e HLA-A, B, C, refletido nos valores aumentados de fluorescência relativo ao controle de IgG, Estas células foram negativas para a produção de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, e HLA-DR, DP, DQ com valores de fluorescência de acordo corn o controle de IgG.

As células denvadas de cordão umbilical expandiram ern frascos não revestidos e revestidos de gelatina analisadas par citumetria de fluxo foram todas positivas para a produção de CD1D, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, com valores aumentados de fluorescência relativo ao controle de IgG. Estas células foram negativas para a produção de 25 CD31, CD34, CD45. CD117, CD 141, e HLA-DR, DP, DQ, com valores de fluorescência de acordo com o controle de IgG.

A análise de células derivadas do cordão umbilical par citomeiria de fluxo estabeleceu uma identidade destas linhagens celulares, Estas células derivadas do cordão umbilical sao positivas para GD10, CD13, CD44, 30 CD73, COSO, PDGFr-alfa, e HLA-A,B,C; e negativas para CD31, CD34,

CD45, CD 117, CD 141 e HLA-DR, DP, DQ. Esta identidade foi consistente entre as variações em variáveis incluindo o doador, passagem, revestimento de superfície do vaso de cultura, enzimas de digestão, e camada placentaria. Algurrra variação nas faixas e médias da curva de histograms de valor de fluorescência individual foram observadas, porém fedas as curvas positivas sob todas as condições testadas foram normais e os valores de fiuoresaên5 cia expressos maiores do que o cuntrole de IgG, desse modo confirmando que as células compreendem uma população homogênea que tem expressão positiva dos marcadores.

EXEMPLO 10

Análise de.Células por Disposição de Oligonucleotídeo

As disposições de oliganudeotídeo foram utilizadas para comparar os perfis de expressão de gene de células derivadas de placenta e derivadas do umbigo com fibroblastos, células-tronca mesenquimais humanas, e outra linhagem celular derivada da medula óssea humana.. Esta análise forneceu uma caracterização das células derivadas de pòs-parto e identificou 15 marcadores moleculares únicos para estas células.

Céfo/ac derivadas de tecido de pds-pa,do. A placenta e o cordão umbilical humana furam obtidos de National Disease Research Interchange (NDRL Filadélfia.. PA) de liberações normais de termo completo com o consentimento do paciente. Os tecidos foram recebidos e as células foram isc20 ladas como descrito no Exemplo 5 apôs a digestão com uma mistura de C:D:H. As células foram cultivadas am meio de crescimento em frascos de cultura de tecida plásticos revestidos com gelatina. As culturas foram incu badas a 37^;'C corn 5% de CC₅.

Fibrob/astes. Os fibroblastos dérmicos humanos foram adquiri25 dos de Cambrax Incorporated (Walkersville, MD; Número do Lote 9E0844) e ATCC CRL- 1501 (CCD39SK), Ambas as linhagens foram cultivadas em meio DMEM/F12 (Invitragen, Carlsbad. CA) com 10% (v/v) de soro bovina fetal (Hyclone) e peoicilinafestreptomicina (Invitrogen)) As células foram crescidas em plástico tratado para tecido padrão.

Cétetes-áonco mesenqu/mars humanas (h.MSQ hMSCs foram adquiridas de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; Números do Lute 2F1655, 2F1656 e 2F1657) e cultivadas de acordo cam as especificações do

83/117 fabricante em Meio MSCGM (Cambrex). As células foram crescidas em plástico de cultura de tec;do padrão em 37' C com 5% de COa.

Cé/a/as da merfuíá óssea da casto rfeca Aurnana pCE.ML A medula óssea de crista ííiaca humana foi recebida de NDRI com o oonsentimen5 to do paciente. A medula fui processada de acordo com 0 método descrito por He, e outros. (WQQ3/025149). A medula foi misturada com tampão de liso (NrUCI a 155 mM, KHCCA.a 10 mM, e EDTA a 0,1 mM< pH 7.2) em uma relação de 1 parte de medula óssea para 20 partes de tampão de iise. A suspensão de céiuia foi vortexada. incubada durante 2 minutos em tempera10 turn ambiente, e centrifugada durante 10 minutos em 500 x g. O sobrenadante foi descartado e o pêlete de célula foi ressuspeaso em Mein-alfa Essencial Mínimo (ínvitrogen) suplementado com 10% (v/v) de saro bovino fetal e glutamina a 4 mM. As células foram centrifugadas novamente e o pêlete de célula foi ressuspenso em rneio Fresco. As células mononucleares viáveis 15 foram contadas utilizando exclusão de azul tripano (Sigma. St Louis, MO).

As células mononucieares foram semeadas em frascos de cultura de tecidos plásticos em 5 x 10* oélulas/cm. As células foram incubadas a 37¾ com 5% de CO·? em O₂ atmosfenco padrão ou em 5% de O_;;. As células foram cultivadas durante 5 dias sem uma mudança de melo. O meio e células não 20 aderentes foram removidas após 5 dias de cultivo. As células aderentes foram mantidas em cultura.

As culturas ativamente crescentes de células foram removidas dos frascas com um raspador de célula em salina tamponada de fosfato fria (PBS). As células foram centrifugadas durante 5 minutos em 300 x g. O so25 bremadanfe foi removido e as células foram ressuspensas em PBS fresco e centrifugada novamente. O sobrenadante foi removido e o pátete de célula foi smediatamente congelada e armazenado a -30¾. O mRNA celular foi extraído e transcrito em cDNA. O cDNA foi em seguida transcrito em cRNA o rotulado com bic-fina. O cRNA rotulado com bictina foi híbridizado com dis30 pcslçôcs de oüganucteotideo Affymetrix GENECHIP HG-U133A (Affymetrix, Santa Clara, CA) As hibridizaçbes e coleção de dados foram realizadas de acordo com as especificações do fabricante.. A análise de dados foi realizada utilizando software de computador Análise de Signíficáncia dei Microdisposições (SAM) versão 1.21 (Tusher. V.G. e outros, 2001, Proc. Natl. Acad. Sol.

USA 98: 5116-5121) As licenças para o software de análise estão disponíveis através do Documento de Licenciamento de Tecnologia, Stanford Uni5 versiíy, e mais informação está disponível na World Wide Web no site da internet Professor Tibsmrani’s no Dep't of Statistics, Stanford University («w-slá Stanford edu/H/bs/S’A M/).

Quatorze diferentes populações de células foram analisadas neste estudo. As células, junto com a informação de passagem, substrato de 10 cultura, e meios de cultura sao listadas na Tabela 1()--1.

Iabel.a...10-l Células analisadas paio estuda de micradisposição, As linhagens de células são listadas por seu código de identificação janto com a passagem no tempo da anáhse, substrato de crescimento de célula, e meios

Pí-puiação -te càii/U	Passsgas·	Substrato	Máíõ
Umbilical, i	2	Gelatina	OMEM. 15% F8S. 2-BME
Umbilical p4210S)	3	Gelatins	DMEM 1S% FBS. 2-BME
Umbliicai m? 1003	,.t„ .....______________	ÊsúàlW	DMEM. 1S% FSS, 2-HME
piaosnta (0422Q31	J2.....................	Gíiiatina	iWm W Μ, 2-BME
pi«1)SS W»9; ........................	A....................	Gmavrui	DMEM, 15% FBS, 2-8ME
Pbceríta (WIP03)	(<·:<< s:: 3: -p	GàidWa	OMEM. 16% FBS. 2-13ME
ICBM (0702.03) (5% 0?)	3	Plástico	MEM 10% PBS
ÍCBM (002703) (&Q Os)	5	Plãsb-m	MBV 10% FBS
	5	P&S&CO	MEM 10% F8S
	'*> o << ........... o	Plástim	fetSCGM
hMSC (Lot 2Ρΐβ58)	3	Plástico	MSéGM
IÍÍBÍllÍ:llÍPÍÍ2fc^	iãif/ZxLxíif:''	Piaxa	MSCGM
hFibrubiastc (OFOtelX)	0.........	ffcta	DMEM-F12. 10% FBS
_	4	Pièstico	DMEM-F12. 10% F8S

Qs dados furam avaliadas por análise de componente principal com software SAM corno descrito acima. A análise revelou 290 genes que foram expressos em diferentes quantidades relativas nas células testadas, Esta análise forneceu comparações relativas entre as populações.

A tabela 10-2 mostra as distâncias euclidianas que foram calouladas para a comparação dos pares de célula. As distâncias euclidianas foram cun'? base na enmparaçãu das células cum base ííos 290 genes que foram diferentemenfe expressos entre ns tipos de célula. A distância euclidiana é inversamente pmpordenal a similaridade entre a expressão dos 290 5 genes

Tabela...10-2,. As distâncias euclidianas para os pares de célula. A distância euclidiana foi calculada para os tipos de célula utilizando os 200 genes que foram expressos difçrermialrnente entre cs linos de célula. A similaridade

Çélulaa é layqrçantente prgporcionte.à .distância emJidianm

Par de célula	D is tâ ncia eunt ? d ? a na
IC8M-HMSC	24,71
PLACENTA-UMBILICAL	25,52
ICBM-FIBROBLASTO	36,44
ICBM-PLACENTA	37.09
1-ÍBROBI.ASTO-MSC	39.63

ICBM-UMBÍLICAL	40,15
Fibrublasto-Ümbiiioal	41.59
MSQ-PI..ACEN1A	42,64
MSC-UMBILICAL	46.86
ICBM-PLACENTA	4-8,41

As Tabelas 10-3, 10-4, e 10-5 mostram a expressão de genes aumentada em células derivadas de placenta (Tabela 10-3), aumentada em células derivadas do cordão umbilical (Tabela 10-4). e reduzida em células derivadas der cordão umbilical e placenta (Tabela 10-5)

Tabela J.0-3. especfeqmnente..rt.Fnirtntrttics na.exgressag nos célula^ derivadas de pfeçentg guandu comparado cum as outras linhagens de célula ensaiadas.

Genes aumentados om çélDas denvadas da píaceuta

ID tíw Conjun ·· Nome do gano Número de to de Sonda Acessao NCBl

20S732„at	Leséica tipo Ü. (domísiõ dá rdadrrheotmohtu .dá- carbei- dmto. dependente de cífco). membro 2 da sj-iperfarniha (indí.mdb par atswgW	AF07GS42
2ÜW7....S..,at	Tumor T de ÍÒróS	NMJ323426
207016„S„at	Famiha de aidside desidrogenase membro A2	AR01S22B
2QÔ307.Jt	Reniuís	NM„000537
210004 at	Receptor 1 de tipopmtema ce baixa densidade oxidada (semeihante a lecdna}	AFÜ3S77S
214993„at	//amo sapram;, oíoneiMAGE.41?9õ71. mRNA. rxfe par- eial	AFW0Ó42
2021 ?8 ,.at	Proteína dnase C, zela	NM..002744
2097BS at	Proteins hipotética. [)KF-'Zp664F013	AL 136863
23413 5... St	Sub-reguiado ern nãrioer ovanano 1	NM..0143S0
2.13642 _at	rnRNA de Homo sapiens; cONA DKFZp54>'Kl 113 (se done DKFZp647K1113)	A124B»

Tabela. 10-4, Genus que são especificamente aumentados na expressão em çêjulas derivadas do cordão umbilical quando comparado com as outras Ηahãgeas..de_;çé;ula ensaiadas.

Genes aumentados em células derivadas do umbigo
ID do Conjunto de Sonda	Nume do gene	Numero de Auessão NC- Bí.................
202859..x....at	Interleucina 8	NM....000584
2115O6....S...at	interieucína 8	AF04333?
210222...$... at	Retícuíon 1	BC000314
204470. at	Ligante 1 de quimiocina (motivo C-X-C) (ahvsdade de estimulação de crescimento de melanoma)	NM 001511
206336 at	Ligante 6 de quimiocina (motivo C-X-C) (proteína 2 quimiotáiica de granulõcito)	NM...002993
207850...at	Ligante 3 de quimiocina (motivo C-X-C)	NM...002090
203485 .at	RetiCiJlon 1	NM....021136
202644 S at	Fator de necrose de tumor, proteína 3 alfainduzida	NM...006290

TabelaJ.Cones que foram diminuídos na expressão nas células de çar.Çlão..umbi.í.iç<.e..píaçe^^ gnaaiadam

Genes diminuídos em células derivadas do umbigo e placenta
ID do Conjunto de Sonda	Nome do gene	Número de Acessao NO- Ji!/...i!jj3........
210135 S at	Homeobox 2 de estatura curia	AF’022654,1
205824 at	Proteína 2 de 27 kDa de choque térmico	NM 601541.1
2G9687mat 203666 at	Ligante 12 de quimiocina (motivo G-X-G) (fator 1 der-vado de célula estrema!)	IH9495J
l..igante 12 de quimiocina (motivo C-X-C) (fator 1 derivado de célula estremai)	............................... NM. ...600609,1
212670 ai	elastins (estenose aòrtíva supravalvular, sindrome de Williams-Beuren	AA4 79278
213381 at	mRNA de Homo sapiens; cDNA DKFZp547K 1113 (de clone DKFZp586M2022)	.............................................; N91149
206201...S...at 2...............	Horneobox 2 de mesénquima (homecbox específica de interr upção do crescimento)	NM. 005924,1
205817...at	Homólogo 1 de horneobox sine oeuiis (Dmsophrfe?)	NM... .005982,1
209283,„at	cristalina, alia B	AF007162,1
212793 at	ativador associado desgrenhado de morfogênese2	BF513244
213486 at I proteins DKFZP586B242C	AL.050143,1
209763 at	similar a neuralina 1	ALG49176
205200,..at	Tetraneclina (proteína de ligação de plasm!nogênlo)	NM...Q03278.1
205743....at	domínio rice ern cisterna e très homologies src (SH3)	NM... 003149,1
206921 S at	gene 1 de translocação de oéluia B, antiproh-	NM 001731,1 |

89/117

(forres diminuídos em células donvadas du umbigo e plauenü?	·· ................ j
ID do Conjunto de Sonda	Nome du gene	Numero de Acessão NC- BI
	ferativu
206932 at	oolesterol 25 -hidroxilase	NM....003956,1
204198 S at	fetor 3 de transcrição relacionado oom runt	AA54163Ό
219747 at	proteína hipotética FLJ23191	NM 024574,1
204773 .at	.receptor de intedeuoina 11 , alfa	NM 004512.1
202465 at	reaiçadcr de procolágeno G-endopeptidase	NM 092593,2
203700 S at	homólogo 7 trisadc (Drasep/?//a)	NM 003507,1
212736 at	(fone hipotética BC008967	BE299456
1O87M	Colàgeno, Tipo VIU. alfe 1	BE877796
201646 at	Tenasolna C (hexabraquiona)	NM. .002160.1
2.10239 at	proteína 5 de Iroquois hameobcx	U9()3Ü4,1
203903 S at	Hefaestina	NM 014799.1
205816 at	integrína, beta 8	NM 002214,1
203069 at	gfooprateina 2 de vesicate siaáptiao	NM 014849,1
213909 at	Homo saptens: cDNA FUI2280 tis, clone MAMMA1001744	AU147799
206315 at	fatar 1 semelhante ao receptor de citocína	NM 004750.1
2.04401. ...at	canal cativado par cálcic de condutãncia pequena/íntermediãna de potássio, suhfamika N, membro 4	NM_ 002250.1
216631 at	integrina. alfa 7	AKQ22548,1
209663 8 at	integnna, alfa 7	AR)72132,1
213125 at	proteins DKFZP586U51	AW007573
202133-at	coativador transcriuional cum motivo de ligação de PDZ (TAZ)	AA081084
206511 S at	homólogo 2 de homeobox sine oculis (Drosoph/te)	NM 016932,1
213435 at	proteína KIAA1G34	AB028957J

Genes dirnínuidos em células derivadas do umbigo e placenta
ÍD do Can-	Nome do gene	Número de Acessão NC- Bl
junto de
Sonda
206115_at	resposta 3 de crescimento precoce	NM 094430,1
213707 S at	homecbux 5 menos distal	NM 005221,3
218181 S at	proteína hipotética FLJ20373	NM 017792.1
209180 at	família 1 de aldo-ceto reductase, membro G3	AB018530.1
	(3-alfa hidroxiesteroide deidrogenase. tipo II)	............
213905 X at	Biglicano	AA345258
201261 X at	Bigiicano	800(52416.1
202132mat	coativador transcricional com motivo de ligação de PDZ (TAX)	AA081084
214701 S at	fibronectins 1	AJ276395.1
2T3791 at	Proencefatina	NM 006211.1
2O5422..S„at	lafegrina. beta tipo 1 (onm domínios de repetição tipo EGF)	NM 004791.1
214927 at	Clone de cDNA de inserção de tamanho natural de mRNA de Hemo sapiens LURCH-	AL359052.1
	MAGE 1968422
206070 S at	EphA3	AF213459,1
212805 at	proteína KIAA0367	ABD02365.1 ί
219789 at	receptor C de peptideo natnurètico/guaníisto cidase C (receptor C de peptideo alriunai.rlu-	AI62830Q |
	rettó):	1·· ««
219054 al	proteína hipotética FJL14054	NM 0.24563,1
213429 at	mRNA de Homo sap/ens. cDNA	AW025579
	clone DKFZp^	.............................................;
2O4929..S...al	Proteína 5 de membrana associada à vesícu- la (miobrevina)	NM 006634:1 ::2.. 2^
201843 S at i__________________________________________	Proteína 1 de matriz extracelular semelhante a flbuíina contendo EGF	NM... 004105,2

Genets diminuídos em células denvadas do umbigo a placeriía
ID do Con-	Nome do gene	Número de Aoessão NC- 81
junto de
Sonda
221478,al	BCL2/adenovírus E1B 19kDa interagindo cem proteína tipo 3	AL132665.1
201792 at	proteína 1 de ligação de AE	NM 001129,2
204570 at	pohpeptíden 1 de subunidade Vila de eitocroma c oxidase (músculo)	NM 001864,1
201621 at	neuroblastoma, supressão de tumorígeraoidade 1	NM _005380,1
202718 at	proteína 2 de ligação de Fator de crescimento	NM 00059'7,1

Tabelas 10-6, 10-7, e 10-8 mostram a expressão de genes aumentados em Fibroblastos humanos (Tabela 10-6), células ICBM (Tabela ΙΟΥ), e MSCs (Tabela 10-8).

Tabela 16-6. Genes, .gíáe fefam aurnentedgs ryn expressão ern fibrgblastus Qyân^o^ctooaradg^c^nxas outras lirvsagens ^9T^MÍg.Pl1é9^âé·.

...........................' -'........................................................................................... Genes aumentados em tibroblastos

fosfatase 2 de especificidade dual

proteína KIAA0527

cDNA Homo sapiens: FLJ23224 tis. clone ADSU02206

dineína, atoplàsmico, polipeptídeo 1 intermediário

ancirina 3, nodo de Ranvier (ancirina G)

inibina, beta A (Actlvina Zv activins AB alfa polipeptídeo)

ectonucieolideo oirofosfatase/fosfodiesterase 4 (função putativa)

Proteína KLAA1 053 Proteína 1A associada ao microtubule Proteína 41 de dedo de zinco Proteína HSPC019

cDNA Homo sapiens: FLJ23564 fís, clone LNG10773

mRNA Homo sapiens; cDNA DKFZp564A072 (de clone DKFZ.p564A072)

proteína UM (similar ao enigma de ligação de proteína cínase C de rato) inibidor de realçador de gene de pelipepUdee leve de capa ern células B, proteína associada ao complexo de cinase

proteína hipotética FLJ22004

sequência de mRNA humano (clone QTG-A4·}

E.STs< Moderadamerãe similar ao fator 2 semelhante do receptor de citocina; precursor de receptor CRL2 de citocina

transformação do tátor de crescimento; beta 2

proteins hipotética MGG29643 antígeno identificado por anticorpo monoclonal MRG QX-2

proteína de retínopatia ligada a X putativa

tabela 10-7. Genes que foram aumentadas na expressão nas células derivadas de ICBM quando comparados com outras linhagens de célula ensaiadas

Genes aumentados em células ICBM « proteína de repetição de ancirina card isca * ORF de região de classe l de MHC * integrlna, alfa 10 « proteína hipotética FLJ22362.

* UDE-N-acetíl-alfa-Ü-galactasaminarpolipeptideo N-acetilgalaofosaminiítransferase 3 (GalN Ac-T3) * F^roteina 44 induzida por interferon * SR¥ (região Y de determinação do sexoj-caíxa 9 (disptesia campoméiica. reversão de sexo autossòrnica) * proteína 1-1 associada a ceratina * hipocalcina tipo 1 * denteado 1 (sindrame de Alagdle) » proteogliano 1, grânulo secretor

Tabela 10-8. Genes que foram aumentados na expressão nas células MSC

Genes aumentados em células MSG * ínterleucina 26 «- maltase-glicoarnilase (alfa-giicaskfose) * subfamilia 4 de receptor nuclear, grupo A, membro 2.

* homólogo de- oncogene viral de osteossarcoma de munno de v-fos FBJ * proteína hipotética DC42 * subfamília 4 de receptor nuclear, grupo A, membro 2 » homólogo B de oncagene viral de osteossarcoma de murino de FSJ * proteína 1 de série de reações de sinalização induzível por de WNT1 « sequência de transformação derivada de linhagem celular MGF.2 « canal de potássio, subfamilia K, membro 15 * tmmeopruteína 1 de classe pareada de cartilagem * CDNA de Homo sapiens FIJI 2232 íis, clone MAMMA 1801206 * CDNA de /-forno sapterts FU34668 fís, done I..IVER2.G00775 * jun B proto-oncogene « Ct.L de célula B/linfoma 6 (proteína do dedo de zinco 51) * pr-glema do dedo de zmco 36, tlp-o C3H, homólogo (camuradongo)

94/117

O presente exemplo foi realizado para fornecer uma caracterização molecular das células derivadas de cordão umbilical e placenta. Esta análise incluiu células derivadas de três cordões umbilicais diferentes e très placentas diferentes. O estudo também incluiu diferentes linhagens de fibro·· 5 blastos dérmiccs, três linhagens de cékdas-tronco mesenquimals, e três linhagens das células da medula óssea de crista iliaca. O rnRNA que foi expresso por estes células foi analisado em ume disposição de oligonudeoudeo GENECHIP que conteve sondas de ohgonucíeotideo para 22.900 genes.

A análise revelou que as transcrições para 29Q genes estavam 10 presentes ara diferentes quantidades nestes cinco tipos de célula diferentes. Estes ganes incluam dez genes que são especificamente aumentados nas células derivadas de placenta e sete genes especificamente aumentados nas células derivadas do cordão umbilical. Descobriu-se que cinquenta e quatro genes têm níveis de expressão menores em células derivadas de 15 placenta e derivadas de tecido de cordão umbilical.

A expressão de genes selecionados foi confirmada por PCR_; como mostrada no Exemplo 11. As células derivadas de pós-parto geralmente. e células derivadas do umbigo, em particular, tern perfis de expressão de gene distintos, por exemplo, quando comparado com outras células huma20 nas, tal coma as células derivadas da meduia óssea e fibroblastos testados eXcMPLQ.ll

Marcadores de Célula

Os perfis da expressão de gene de células derivadas de cordão 25 umbilical humano foram comparados corn aqueles de células derivadas de outras fontes utilizando um Affynietrix GENECHIP, Seis genes assinatura” foram identificados.' receptor 1 de L.DL oxidado, irdedeucina-8 (IL-8), renina, retiaulon, ligante 3 de receptor de qmmiocina (ligante 3 Ü.XC). e proteína 2 quimiotàtica de granutócitos (GGP-2Í. Estes genes de assinatura” foram 30 expressos em níveis relativamente elevados em células derivadas do umbigo.

Os procedimentos descritas neste exemplo foram conduzidos

95/117 para verificar os dados de rnsoredisposição e comparar os dados com expressão de gene e proteína, bem como para estabelecer uma série de ensaios seguros para detecção de identificadores únicos para células derivadas do umbigo.

As células derivadas do umbigo (quatro isolados), e fibroblastus dérmicos humanos normais (NHDF; neonatal e adulto) foram crescidas em mem de crescimento em frascos T75 revestidos corn gelatina. As célulasfronco mesenquimais (MSGs) foram crescidas em kit Bullet de meio de crescimento de célula-ironco mesenquimal (MSCGM: Cambrex, Walkerville, MD).

Para experimentos com IL-8, as células foram descongeladas de nitrogênio liquido e semeadas em frascos revestidos com gelatina em 5.000 cèlulas/cm'; crescidas durante 48 horas em meio de crescimento o em seguida crescidas também durante 8 horas em 10 mililitros de meio de privação de soro (baixo teor de glicose de DMEM (Gibco, Carlsbad. CA), penicilina (50 Unidades/rnililitro), esfreptomicina (50 microgramas/miliiitroj/Gibco} e 0,1% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA; Sigma, St. Louis, MO)]. RNA foi em seguida extraido e os sobrenadanles furam centrifugados em 150 x g durante 5 minutos para remover os resíduos de célula. Os sobrenadantes foram congelados a -80^:‘G até a análise de ELISA,

As células derivadas de tecido de cordão umbilical, bem como ábrobiastos humanos derivados de prepúcio humano neonatal, foram cultivadas em meio da crescimento em frascos T75 revestidas com gelatina. As células foram congeladas na passagem 11 em nitrogênio líquido. As células furam descongeladas e transferidas para tribos centrífugos de 15 mililitros. Após a uentrifugação em 1-50 x g durante? 5 minutos, o sobrenadante foi descartado. As células foram ressuspensas em 4 mililitros de meso de cultura e contadas As células furam crescidas em um frasco de 75 crrd contendo 15 mililitros de meio de crescimento em 375.000 célula/frasco durante 24 horas. Q meio foi mudado para um rneio de privação de soro durante 3 horas. O meso de privação de soro foi coletado no final da incubação, centrifugado em 14.000 x g durante 5 minutos e armazenado em ~20^vC,

Para estimar u número de células em cada frasco, 2 milihtros de fupsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, CA} foram adicionados a cada frasco. Apôs as células desprenderem do frasco, a atividade de íhpsína fui neutralizada com 8 mililitros de meio de crescimento. As células forem transferidas para 5 um tubo centrifugo de 15 mililitros e centrifugadas em 150 x g durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido e 1 mílihtru de mere de crescimento foi adicionado a cada tubo para ressuspender as células. C número de célula fui determinado earn um hernocitâmetro.

A quantidade de IL-8 secretada pelas células no meio de priva10 ção de soro foi analizada utilizando os ensaias ELISA (R&u Systems, Min neapolis, MN). Todos os ensaios furam conduzidos de acordo com as instr u ções fornecidas pelo fabricante..

O RNA. foi extraído de fibroblastos e células derivadas de cordão umbilical cunfluente, ou para a expressão de IL-8, de células tratados como 15 descrito acima. As células furam Usadas com 350 miurohtros de tampão RLT contendo beta-rrreruaptuetanol (Sigma, St. Louis, MO) de acordo cura as instruções do fabricante (RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, CA). O RNA fui extraído de acordo com as instruções do fabricante (RNeasy Mini Kit. Qiagen. Valencia, CA) e submetido ao tratamento corn DNase (2,7 Unida20 des/amastra) (Sigma St. Louis. MO). RNA foi eluida com 50 microlitres dei água tratada cam DEPC e armazenada a -30^í:C. O RNA foi também extraído de cordão umbilical humana. O tecida (30 miligramas) for suspenso em 700 micrulítros de tampãa RLT contenda beta-mercaptoetanol As amostras foram mecanicamente humugeneizadas e a extração de RNA prosseguiu de 25 acordo corn a especificação do fabricante. O RNA foi extraído com 50 microlitres de água tratada com DEPC e armazenada a -80°C.

O RNA foi transcrito reverso utilizando hexâmetros aleatórios com us reagentes de transcrição reversa TaqMan (Applied Biosystems, Faster City. CA) a 25^ÇC durante 10 minutos, 37C durante 60 minutes, e 95^:>C 30 durante 10 minutos. As amostras foram armazenadas a -2()ⁿC.

Os genes identificadas por mlarodisposição de cDNA como unicamente regulado em células do cordão umbilical (genes de assinatura

97/117 induindo receptor de 1..DL oxidado, ir?teiieucina-8, renina, e retioufor?). foram também investigados utilizando BCR am tempo real e convencional.

BCR foi rsaiszado em amostras de cDNA utilizando os produtos de expressão de gene vendidos sob o nome comercial produtos de expres5 sao de gene Assays on-Demand (Applied Biosystems). O receptor de LDL oxidado (Hs00234028); renina (HsQO 166915); reticulon (Hs00382515); ligante 3 de CXC (Hs00171Q61); GCP-2 (Hs00505742); iL-8 (Hs00174103); e GAPDH foram misturadas cent mistura master de POP e cDNA TaqMan Universal de acordo oom as instruções do fabricante (Applied Biosystems) 10 utilizando um sistema de detecção de sequência 7()0(} com software ABI

Prism 7060 SDS (Applied Biasysbmis). As condições de ciclo térmicas foram inioialmente 50*0 durante 2 minutos a 95*C durante 10 minutos, seguido por 46 ciclos de 95*C durante 15 segundos e 6Q^t!C durante 1 minuto. Os dados de PCR foram analisados de acordo con? as especificações dc? fabricante 15 (Usar Buílatir? n° 2 de Applied Biosystems for ABI Prism 7700 Sequence Detention System).

O PCR convencional foi realizado utilizando um /ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer Applied Biasystems, Boston. MA) para confirmar os resultados de BCR em tempo real O PCR tai realizado utilizando 2 m?cralítros 20 de solução de cDNA (1x Tag polimerase (nome comercial AMPLITAQ GOLD) tarnpão de reação de PCR de mistura universal (Applied Biasystems) e desnaturação inicial a 94* C durante 5 rnmutos. A amplificação foi otimizada para cada conjunta de iniciador Para II..-8, licante 3 CXC, e reüculon (94*C durante 15 segundos, 55*C durante 15 segundos e 72*C durante 30 segun25 dos para 3D ciclos); para rensna (94*0 durante 15 seg?.sndos_: 53*C durante segundos e 72*0 durante 30 segundos para 38 ciclos); para receptor de LDL oxidado e GAPDH (94^:>C durante 15 segundos, 55*C durante 15 segundos e 72’C durante 30 segundos para 33 ados). Os inlasadores utilizados para amplificação são listados na Tabela 11-1. ,A concentração de iniciado?’ 30 na reação de PCR finai fas 1 {'nicromolar exceto para GAPDH que foi 0,5 micromolar. Os sniciadares de GAPDH foram os mesmas como para PCR em tempo real, exceto que a sonda TaqMar? do fabricante r?ao fni adicionada a

98/117 reação de PCR final As amostras foram separadas ern 2% (p/v) de gel agarose e manchadas com brometo de etídio (Sigma, St. Lours, MO). As imagens foram capturadas em película 667 (Universal Twlnpack, WVR International, South Plainfield. NJ) utilizando câmera de comprimento focal fixo PO5 LAROID (VVVR International South Plainfield, NJ).

Tabela 11-1' Inicradores Utilizados

a.	Nome dos loioiedores	inícíadures
Receptor LDl. oxidado	$: S’- GAGAAA foCAAAGAGCAÁATÜG-1	(SEQ ID Nc:1)
	A; 3 'Ά GA A l VJ ΑΑΛ AC í i K, A A i AG G - à'	(SEQ ID tT> 2)
Renína	S; 3’-TCTFC0AT<KT?CC GATTCe Τ'	(SEQ ID
	A: $-0ΆΑΏ CfotiCAATC l d Qí IC -T	(SEQ ID fcF 4}
Rericuion	A S!v 1'1 ACAA.nCAU'tr;)CAOAAAArfo- :í	(SEO ID Nfi 5)
	A: S'-.StR'A.VsCATFGiSAACC.-'t.r'AOCCU'	(SEQ ID fo‘A)
Nferleucma-b	S'. |R I'CTGCAGCK'TGTGWAaGOC*	(SEC ID NT7)
	A: .$5<TTCAAAMCTTC.'K!í’>ACAAír--.V	(SEQ ID NTS)
Ugíinte 3 de qUmindne (CXC)	S; y - CCCACGa3ACGCTaTXMs	(SEQ ID NTS)
	Afo'-itTTGICaGi IW cocc-r	(SEQ ID
		NT 10)

As células derivadas do cordão umbilical foram fixadas com 4% (p/v) de paraformalderdo frio (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) durante 10 minutos em temperatura ambiente.. Um isolado de cada das células derivadas 10 do cordão umbilical na passagem 0 (P0) (diretamente após o isolamento) e passagem 11 (P11) (dois isolados de células derivadas da cordão umbilical) e fibrobíastos (P11) foram utilizados. A rmunudtoquimrca fur realizada utilizando anticorpos direcionados contra os seguintes epitopos; vimentina (1:500. -Sigma, St Louis. MO), desmina (1:150, Sigma ··· aumentado contra 15 coelho: ou 1:300; Chemicon, Temecula, CA - aumentado contra camundongo), alfa-actina de músculo liso (SMA; 1:400; Sigma), oitoceratína 18 (CKI 8; 1:400; Sigma), Fator von Willebrand (vWF; 1:200: Sigma), e CD34 (CD34 humano Ciasse HI; 1:100: DAKOCytornation, Carpinteria, CA). Além disso, os seguintes marcadores foram testados na passagem 11 de células deriva das de cordão umbilical: GRQaifa anti-humano-PE (1.IDO: Becton Dickinson. Franklin Lakes, NJ). GCP-2 anti humano (1:100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz. CA). receptor 1 de LDL oxidado anfi-humano (ox-LDL Rl; 1.100; Santa Cruz Biotech), e NOGA-A anti-humane (1 :100: Santa Cruz, Biotech).

As culturas foram lavadas com salina tamponada de fosfato (PBS) e expostas a uma solução de bloqueio de proteína contendo PBS, 4% (v/v) de soro de cabra (Chemican, Temecula, CA), e 0,3% (v/v) de Triton (Triton X100; Sigma, St. Louis, MO) durante 30 minutes para acessar os antigenos Intracelulares. Onde o epitopo de interesse fui localizado na superfície de célula (CD34, ox-LDL RI), Triton X-100 foi omitido em todas as etapas do procedimento para prevenir perda de epitope. Além disso, em casos onde o anticorpo primário foi aumentado contra cabra (GGP-2, ox~l..DL. Rl, NOGO-A), 3% (v/v) de soro de asno foi utilizado no lugar de som de cabra era todo o processo. Os anticorpos primárias, diluídos em solução de bloqueio, foram em seguida aplicados às culturas durante um período de 1 hora em temperatura ambiente. As soluções de anticorpo primárias foram removidas e as culturas foram lavadas com PBS antes da aplicação de soluções de anticorpo secundárias (uma hora em temperatura ambiente) coritertdo bloqueio junto com IgG antioamundongo de cabra- Texas Red (1'250; Molecular Probes, Eugene, OR) e/ou IgG anticoelho de cabra- Alexa 488 (T250; Molecular Probes) ou IgG anticabra de asno-FÍTC (1:15(), Santa Gruz. Biotech). As culturas foram em seguida lavadas e 10 mlcromolares de DARI (Molecular Probes) aplicados durante 10 minutos para visualizar os núcleos da célula.

Em seguida ao imunornanchamento, a fluorescência foi visualizado utilizando um filtro de fluorescência apropriado em um microscópio epiflucrescenle invertido Olympus (Olympus. Melville, NY). Em todas os casos, o manchamento positivo representou sinal de fluorescência actma do manchamento de controle ande u procedimento total descrito acima foi seguido com a excegão de aplicação de uma solução de anticorpo primária (sem c 1 controle). As imagens representativas foram capturadas utihz.andc uma vrdeocâmera de cor digital e software ImagePro (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Parrs amostras triplamente manchadas, cada imagem foi íomada utilí zando sornente um filtre de emissão de cada vez. As montagens ern camadas foram então preparadas utilizando software Adobe Photoshop (Adobe, San dose, CA),

As células aderentes nos frascos foram lavadas em salina tampanada de fosfato (PBS) (Gibco. Carlsbad, CA) e desprendidas com Tripslna/EDTA (Gibco, Carlsbad. CA), As células foram colhidas, centrifugadas, e ressuspensas em 3% (v/v) de PBS em PBS em uma concentração de célula de 1x10'/mililitro, Alíquotas da cem mlcrolítros foram liberadas para os tubos cônicos. As células maneiradas para antlgenos intracelulares foram permeabilizadas oure tampão Perm/de lavagem (8D Pharmingen, San üiego, CA). O anticorpo for adicionado às alíquotas como pelas especificações do fabricante, e as células foram incubadas no escuro durante 30 minutos a 4¾. Após incubação, as células foram lavadas com PBS e centrifugadas para remover o anticorpo em excesso. As células requerendo urn anticorpo secundário foram ressuspens.es em 100 mirxoütros de 3% de PBS. O anticorpo secundário foi adicionado como pala especificação do fabricante, e as células furam incubadas no escuro durante 30 minutos a 4^yC. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e cenfnfugadas para remover u anticorpo secundário em excesso. As células lavadas foram ressuspensas em 0.5 mililitro de PBS e analisada por' cit-omerria de fluxo. Os seguintes anticorpos furam utilizados: receptor 1 de LDL oxidado (sc-5813; Santa Cruz, Biotech), GROa (555042: BD Phanningen, Bedford, MA), igG de Camundungo capa, (P-4685 e M-5284; Sigma), e IgG de cabra contra asno (cc-3743; Santa Cruz, Biotech.). Análise de clfametria de fluxo foi realizada com FACScalibur (Becton Dickinson San Jose, CA).

Cs resultados de PCR em tempo real para genes de ’’assinatura selecionados reahzado em cDNA de células derivadas de cordão umbilical humano., fibroblastos de adulto e neonatal, e oélulas-trunco mesenquímais (MSCs) indicam que ambas expressões de receptores de reticulon e LDL oxidado furam mais elevadas em células derivadas do umbigo quando comparado com as outras células. Os dadas obtidos de PCR em tempo real furam analisados pelo método AACT e expressos em uma escala íogaritmica.

Nenhuma diferença sigtaficarite nos níveis de expressão de ligante 3 de CXC e GDF-2. foi encontrada entre as células de pós-parto a contrates. Os resultados de PCR em tempo real foram confirmados por PCR convencional O sequendamento de produtos de PCR também vahdou estas observações. Nenhuma diferença signífíoanfe no nível de expressão de ligante 3 de CXC foi encontrado entre as células de põs-pario e os controles utilizando iniciadures de ligante 3 de CXC de PCR convencionai listados na Tabela 11-1.

A expressão da cítocir^, IL-8 em células derivadas de tecido de cordão umbilical fui elevada em ambas as células cultivadas em meio de crescimerdo e privadas de soro derivadas de tecido de cordão umbilical, Todos os dadas de PCR de tempo real furam validados cum PCR convencionai e por sequenciamento dos produtos de PCR.

Após u crescimento nos meios livres de soro, os meios condicionados furam examinados quanto á presença de IL-8. As quantidades maiores de IL-8 foram detectadas em meios nos quais as células do umbigo foram crescidas (Tabela 11-2) Nenhuma IL-8 foi detectada nu meio no qual os fibrubiastus dérmicos humanos foram crescidos.

............................................

Típu <fe célula	M
Rbroblastos humanos	ND........... ......
l&ulado de Placenta 1	........
Isolado UMBC 1	2058,42 ± 144,67
Isolado de Placenta 2	ND
Isolado UMBC 2	2358.86 * 22,73
isolado de Placenta 3 (normal O-.}	1727 ±8,63
Isolado de Placenta 3 (Cu baixo, W/O LIME)	264,92 ± 9,88
Os resultados do ensaio ELISA pare intedeucina-8 (IL-8) realizados nas células derivadas do cordão umbilical e placenta barn cornu fibroblastus de pele bumaria, Os valores são apresentadas aqui como plcograma/milhão de células, n~2 sem N.D. ~ Não Detectado

As células derivadas do cordão umbilical humano na passagem 0 foram sondadas para a produção de proteínas selecionadas por análise imunocitoquímica. Imediatamente após o isolamento (passagem 0), as células furam fixadas cum 4% de paraformaldeido e expostos aus anticorpos

102/117 para seis proteínas: Fator de von Willebrand, CD34, citoceratina 18. desmina, aifa-actina de musculo liso, e vimentina As células derivadas de cordão umbilical foram positivas para alfa-actins de músculo liso e vimeritina. com o padrão de manchamento consistente através da passagem 11.

A produção de GROaifa, GCP-2, receptor 1 de LDL oxidado e retículon (NOGO-A) em células derivadas de cordão umbilical na passagem 11 foi investigada por imunocitoquímíca. As células derivadas de cordão umbilical fomm GCP-2 positiva, porém a produção de GRO alfa não foi detectada por este método. Além disso, as células foram NOGO-A positive.

O acordo entre os níveis de expressão de gene medidos por rnicrodisposição e PCR (tanto convencionai quanta em tempo real) foi estabelecido para quatro genes: receptor 1 de LDL oxidado, renina, reticulon, e 11..8. A expressão destes genes foi díferencíalrnente regulada no nível de mRNA nas células derivadas de cordão umbilical, corn IL-δ também diferencial15 mente regulada na nível de proteins. A expressão diferencial de GCP-2 e ligante 3 de CXC não foi confirmada no uivei de mRNA. Embora este resultado não suporte es dados originaknente obtidas do experimento de microdispusição, isto pode ser devido a uma diferença na sensibilidade das metodoiogias.

As células derivadas do cordão umbilical humano na passagem foram sondadas para a expressão de alfa-actina de músculo liso e vimentina. e taram positivas para ambas. O padrão de manchamento tui conservado através da passagem 11.

Em conclusão, as dadas de mRNA completo pelo menos parci25 aimente verificam os dadas obtidas dos experimentos de microdíspusiçãa. ε.ΧΕ(ΜΡΕ0.12

Caracterização Imune-histoquimica de Fenótipps Celulares

Os feriòtipos de células encontradas em tecida de cordão umbilical humana furam analisados por imuno-histaquímíoa.

O tecido de cordão umbilical humano foi colhido e fixado par imersão em 4% (p/v) de paraformaldeído durante a noite a 4°C A imunorjstoqulmica foi realizada utilizando anticorpos direcionados contra os se

103/117 guintes epitopas (vida. Tabela 12-1): vimentina (1:500; Sigma.. St. Louis, MO), desmina (1.15(1, aumentada contra coelho: Sigma: ou 1:300, aumentado contra camundango; Chemicon. Temecula, CA). alfa-actina de musculo liso (SMA, 1 .400; Sigma), dtogueratina 18 (CKt 8; 1:400; Sigma), Fator de 5 von Willebrand (vVVF; 1:200; Sigma), e CD34 (Casse HI de CD34 humano;

1:100: DAKOGytomaticn, Carpinteria, CA), Além disso, os seguintes marcadores furam testadas: GROalfa-PE anti-humana (1.100; Beaton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). GCP-2 antr-humann (1:100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA). receptor 1 de L.DL. oxidado anti-hurnano (ox-LDL. Rl: 1:100; Santa 10 Cruz Bic-tech), e NQGÍ3-A anti-humana (T.W0; Santa Cruz Biotech). Qs espécimes fixos taram aparadas com um bistun e colocadas em composto embebida de OCT (Tissue-- Tek OCT; Sakura, Torrance, CA) em um banha de gela seen cantando etanol. Cs blocos congeladas furam em seguida secronados (10 microns e espessura) utilizando um criustato padrão (Leica Mi15 crosystems) e montados em lâminas de vidro para manchamento.

Imuno-histuquimica foi realizada similar aos estudos prévias. (Par exemplo, Messina e outros, Exper. Neurol. 2003; 184: 816-829). As seções de tecido furam lavadas cam salina tampoaada de fosfato (PBS) e expostas a uma solução de bloqueia de proteína contendo PBS. 4% (v/v) de 20 soro de cabra (Chernican, Temecula, CA), e 0,3% (v/v) de Triton (Tritan X100; Sigma) durante uma hora para acessar os antígenos intracelulares. Em casos onde a epitope de interesse seria localizado na superfície da célula (CD34, ox-LDL Ri). triton fai omitido em Iodas as etapas do procedimento para prevenir a perda de epitepa. Além disso, em casos crate o anticorpo 25 primário fui aumentado contra cabra (GCP-2, cx-LDL RI, NQGO-A). 3% (v/v) de soro de asno foi utilizado no lugar de soro de cabra em todo o procedimento. Os anticorpos primárias, diluídas em solução de bloqueio, foram em seguida aplicados às seções, durante um período de 4 horas em temperatura ambiente. As soluções de anticorpo primãno foram removidas, e as cultu3Q ras lavadas com PBS antes da aplicação de soluções de anticorpo secundário (1 hora em temperatura ambiente) contendo bloco junto com exas Red de IgG-T anticamundango de cabra (1:250; Molecular Probes, Eugene, OR)

104/117 e/ou IgG-Alexa 488 anticoelho de cabra (1:250; Molecular Probes) ou IgGFi'TC ar-Licabra de asne (1:150; Santa Cruz Biotech). As culturas foram lavadas, e 10 micrornolares de DAPI (Molecular Probes) furam aplicados durante 10 minutos para visualizar os núcleos da célula,

Em seguida ao imunumanchamenfo, a fluorescência foi visualizada utilizando o filtro de fluorescência apropriado em um microscópio epifluorescente invertido Olympus (Olympus. Melville, NY). O manchamenfo positivo foi representado por sinal de fluorescência acima do maachamento de controle. As Imagens representativas foram capturadas utilizando uma 10 videocãmera de cor digital e software ImagePro (Media Cybernetics. Carlsbad, CA). Para amostras de manchas triplas, cada imagem foi tomada utilizando somente um filtro de emissão de cada vez. As montagens em camada foram em seguida preparadas utilizando software Adobe Photoshop software (Adobe, San Jose. CA),

Anticorpo	Concentração	Vendedor
Vimentina	1:500	Sigma, St. louis, MO
Desmiria (rb)	1:150	Sigma
Desmlna (rn)	1:300	Chemicon, Temecula, CA
aifa-actina de músculo liso	1:400	Sigma
(SMA)
Citoqueratina 18 (CK18)	1:400	Sigma
fator de von Willebrand	1:800	Sigma
(vWF)
GD34 III	1:100	DakoCytomation, Carpinteria,
		CA
QROalfa-PE	1:100	BD, Franklin Lakes, NJ
GCP-2	1:100	Santa Cruz Biotech
Ox-LDL RI	1.100	Sarda Cruz Biotech
NOGO-A	1100	Santa Cruz Biotech

Os marcadores de vimentina, desmina, SMA, CK18, vWF, e

CD34 foram expressos em um subgrupos das células encontradas no cor

105/117 dão umbihoal (dados não mostrados). Em particular, as expressões de vWF e CD34 foram restates aos vasos sanguíneos contidos no cordão. As células CD34* ficaram na camada mais interna (lado do lumen}. A expressão de vimentina foi encontrada em ioda a matriz e os vasos sanguíneos do cordão. SMA foi limitado á matriz e as paredes externas da artéria e vete, porém nâo contido nos vasos sozinhas. GK18 e desmina foram observados nos vasos sozinhos, desmina sendo restrita ás camadas do meia e externas.

Nenhum destes marcadores foi observado no cordão umbilical (dados não mostrados).

Vimentina, desmina, alfa-actína de músculo liso, citoqueratína 18, Fator de von Willebrand, e CD 34 são expressos em células em cordão umbilical humano, Com base nos estudos de caracterização in vitro mostrando que somente vimentina e alfa-actína de músculo liso são expressos, os dados sugerem que o processo corrente de isolamento de célula derivada do cordão umbilical colhe uma subpopulação de células ou que as células Isoladas mudam a expressão de marcadores para expressar vimentina e alfa-actma de músculo liso.

EXEMPLO 13

§.9.cre2ão.de.ÍL<oresJrófjços

A secreção de fatores tráficos selecionados de células derivadas do umbigo foi medida Os fatores foram selecionados os quais têm atividade angiogênica, por exemplo, fator de crescimento de hepatócito (HGF) (Rosen e outros, Ciba Found, Symp>., 1997: 212:215-26): proteína 1 químiolàtica de monécito (MCP-I) (Salcedo e outros. Blood, 2069: 96;34~40); interlsuaína-B (IL-8) (Li e outros, J, ImrnunoL, 2003, 179:3369-76); fator de crescimento de ceratlnúoito (KGF); fator de crescimento de fibroblasfo básico (PEGF); fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Hughes e outros, Ann. Thorac. Surg. 2004; 77-812-8): inibidor 1 de tecido de metatoproteinase de matriz (TlMPí): angiopoiefina 2 (ANG2); fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFbb); trombopoietlna (TPO); fator de crescimento epidérmico de ligação de heparins (HB- EGF); fator 1 alfa derivado de estremai (SDF-I alfa), atividade neurotrófica/neuroprote-tora (fator neurotròflco derivado de cérebro

106/117 (BDNF) (Cheng e outros, Dev Biol·. 2003; 258:319-33): intedeuoiaa-6 (IL-6): profeina-2 quimíotática de granuladio (GCP-2); fator beta2 de crescimento transformador (TGFbeta2)); ou atividade de quimiocina (proteína 1 sdfa inflamatòria de roacrófago (MlPI alfa); proteína 1 beta inflamaioda de macròfa5 go (MlPIbeta); quimioatraente-1 de mcnôcíto (MCP-lj; Ranies (regalado na ativação, célula T normal expressa ou secretada); 1309; quimiocma regulada por ativação e time (TARC); Eotaxina; quimiocina derivada de macrõfago (MDC): e (IL-8).

As células derivadas de cordão umbilical, bem como fibroblas tos humanos derivados de prepúcio humane neonatal, foram cultivadas ern meio de crescimento em frascos T75 revestidos com gelatina. As células furam choconsetvadas na passagem 11 e armazenadas em nitrogênio liquido Após g descongelamento, o meio de crescimento fei adicionado às células, seguido pur transferência para um tubo centrífugo de 15 mililitros e centrifu15 gaçao das células em 150 x g durante 5 minutos. O pélete de célula foi res suspenso em 4 mililitros de meie de crescimento, e as células furara contadas. As células forarn semeadas em 5.000 células/am' em frascos T75 cada contendo 15 mililitros de meio de crescimento, e cultivadas durante 24 horas. O meio foi mudado para um meio livre de soro (baixo teor de glicose de

DM EM (Gibco), 0,1% (peso/v) de albumins de soro bovino (Sigma), penicilina (50 Unldades/milllitro) e estreptomicina (50 mícrogramas/miiilitro. Gíbco)) durante 8 horas. O meto livre de soro condicionado foi coletado no final da incubação por centnfugação em 14.000 x g durante 5 minutos e armazenado a -20X.

Para estimar o número de células em cada frasco, as céldas foram lavadas com salina tamponada de fosfato (PBS) e desprendidas utilizando 2 mililitros de tripmna/EDTA (Gibco). A atividade de tripsína fui inibida pela adiçâc de 8 mililitros de meio de crescimento As células foram centrifugadas em 150 x g durante 5 minutes. O sobrenadante fai removido, e as cé30 lulas foram ressuspensas em 1 mililitro de Meio de crescimento. O número de célula foi estimado com um hemcciiômetro

As células foram crescidas a 37%) em 5% de dióxido de cerborro '107/117 e oxigênio atmosférico. A quantidade de MCP-1, 11.-6, VEGF, SDE-laifa, GCP-2_f IL-8, e TGF-beia2 produzidos por nada amostra de célula foi determinada por ELISZx (R&D Systems. Minneapolis. Μη,), Todos os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. Os valores apre5 sentados são picegramas por mililitro por milhão de células (rm-2, sem).

As quirniocinas (Ml PI alfa, MiPIbeia, MCP-1, Frames, 1309, TARO, Eetaxin, MDC, IL8)< BDNF. e fatores anglcgénicos (HGF. KGF, bFGF, VEGF, TIMPI. ANG2, PDGFbb, TPO. H8--EGF foram medidos utilizando Disposições Searchlight Proteome (Pierce Biotechnology Inc.). .As It) disposições de proteorna são ELlSAs sanduíches muliiplexados para a medição quantitativa de duas a dezesseis proteínas por poço. Xis disposições são produzidas manchando-se um padrão de 2 x 2, 3 x 3, ou 4x4 de quatro a dezesseis anticorpos de captura diferentes em cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida a um procedimento ELISA sanduíche, a placa total é 15 ímageada para capturar o sinal quimioluminescente gerado em cada ponto em cada poço da placa. O sinal gerado em cada ponto é proporcional à quantidade de proteina-alvo na amostra ou padrão original.

MCP-1 e IL-6 foram secretados por PPDCs derivados de umbigo e fibroblastos dérmicos (Tabela 13-1). SDF-lalfa e GCP-2 foram secretados 20 por fibroblastos. GCP-2 e II..-8 foram secretados por PPDCs derivados de umbigo T'GF-beta2 não fc-i detectado de qualquer tipo de célula por ELISA.

labeiaJS-l. Resultados de EL.ISA: Detecção de Fatores tróficos

”1 ........... 1 MCP-1	IL-O	VEGF	SDF- 101717	Ge PD	........................... íi.-a	...................·.; ; TGr teta
FíteslslaNò l	11 .	SI 13	29*2	1M1	2111	MD	Nb
Uíteilitelfb220pÒi I	1150*74	4234*289	NU	N0	1	2B3Í145	NÓ
	2794184	135S143	Mb	NO	2104*98	2303*23	lilL ::

Ensaio ELISA Mulfsplexado de Searchlight. TIMP1, TPO, K,GF\ HGF. FGF, HBEGF, BDNF, MiPIbetm MQ.P1, RANTES, 1309, TARC, MDC,

2.5 e 11.-3 foram secretados de PPDCs derivados de umbigo (Tabelas 13-2 e 133). Nenhum Ang2, VEGF, ou PDGFbb foi detectado.

Tube a 13-2. Resutlados do ensaio ELISA Multiplexado de Searchlight*' .’»«WW».w_vw.vAv.w.w.w<.v.vw.%%%w^^

	w:		PDNFbb	mo		HGF	FGF	VFGF		ãbNF
		NP .......	NO	230,5	.............	Np	Nb		..............	®Ν03:·..Ι
fit)))::):	57718.4	NO	NO	1240,0		55V.3	348,7	NO	(llfififi)	1C5.7 .1
03	, >tWA	NO	NO	1134,5 j	&0	135.8	30,8	w	5.4	MSA

Código. hF8 (Hbroblastus humanes), UI (PPDC derivado do umbigo (022803}). U3 (PPDC derivado do umbigo (071003)).

ND. Não Detectado.

R_:éSM_:l^dffç.d_:Q::bnsa_;ip_;|ySAJ4uftiptexadQ úe Searnhlighf''

		lilillil)	...NCRl .....	RAMTS			HsUxsrí	MOC	::ili:;...3ii..™
bFS		NU	WA	NO	NO .·:		NO	NO	204. S
xs		ÁC	1:Éká:,	NO	22.4	37.8	NO	m.s
	Nb				.ilil	............ 21.4	NO	-1.8	iosm.9

Código: 3FB (fibroblasios humanos). Ui (PPDC derivado do umbigo (022803)), U3 (PPDC derivado do umbigo (07101)3)).

ND: Não Detectado.

As células derivadas do umbigo segregaram vários fatores trófi10 cos. Alguns destes fatores tráficos, tais como HGF, bFGF, MCP-1 e IL-b, desempenham papéis importantes na angíogênese. Outros fatores trõficos, tais corno BDNF e II. -6, têm fatures importantes na proteção uu regeneração neural.

EKE.MPLO.14

MldEPlSOlã.. 4? Vfru

Linhagens celulares do cordão umbilical foram avaliadas m v#m para suas características imunuiògicas em um esforço para prognosticar a resposta imunoiôgíca, se houver, estas células elicianam no transplante in vrèo. Linhagens celulares pós-parto foram avaliadas por citometna de fluxo 20 para a expressão de HLA-DR, HLA-DP. HLA-DQ, CD80, CD86, e B74-I2.

Estas proteínas são expressas por células de apresentação de antigeno (APC) e são requeridas para a estimulação direta de células CD4* T que não receberam tratamento (Abbas & Licbtman, Cellular and Molecular Immuno logy. 5* Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171) As linhagens celulares foram também analisadas por citometna de fluxo para a expressão du HLAG (Abbas & Liohtman, supra); CD 178 (Coumans e outro, Journa/of /mmuno/og/ca/ Methods. 1999; 224. 185-196); e PD-1.2 (Abbas & Lichtman, supra;

Brown e outro. The Journo/ of /mmuho/o.gy. 2903; 170: 1257-1266) Para prognosticar a extensão a qua! as linhagens celulares derivadas de umbigo pôs parto eliciaram urna resposta imune m wvo, as linhagens celulares foram testadas ern uma reação de linfôcitc· misturada unidirecional (MLR).

As células foram cultivadas em meie de crescimento em frascos 0 T75 (Corning, Corning, NY) revestidos corn 255 de gelatina (Sigma. St. Loess,

MO) até que continentes.

As células foram lavadas com solução salina tamponada por fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) «a separadas com Tripsina/EDTA (Gíbco, Carlsbad, MO), As células foram colhidas, centrifugadas, e ressuspensas em 5 3% (v/v) de FBS em PBS em uma concentração de célula de 1x10^-' por mililitro. Anticorpo (Tabela 14-1) foi adicionado a cem microlitros de suspensão celular de acordo cor·? as especificações do fabricante e incubado no escuro durante 30 minutos a 4*C, Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e centrifugadas para remover o anticorpo não ligado. As células foram 0 ressuspensas em 500 microlitros de PBS e analisadas por citometria de fluxo usando um instrumento FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, GA)..

Tabela 14-1 Anticorpos

		dp ephsEys
HLA-DR,()P,DQ	BD Plw.mingeii (San Díe.gm CA)	555558
CD80	BD Pharmmgcn	5.57327
CD86	BD Pharmingeu	555605
B7-H2	BD Phurmingen	552502
.HLA-G	Abeam (Cambridgeshire, UK)	at? 7904-100
CDI78	Santa Cruz (San Cruz. CA)	sc-19581
PD-1.,2	BD Phan.'niugen	557846
CãiTXiuüòòm :iqG2z-;í;·	Sigma(St Lotus, MO)	F-6522
iaGIte-pis Burma	P-4685

Frascunetes crioconservados de PPDC derivadas de umbigo de passagem 10 rotulados corns linhagem celular ^!:A foram empacotados em gele seco e enviados para CTBR (Sennevílle, Quebec) para conduzir uma reação de linfócito misturada usando GTBR SOP n. CAC-031. Células? mononucieares de sangue periférico (PBMCs) foram coletadas de múltiplos doadores voluntários masculinos e femininos. Seis doadores da sangue voluntários humanos foram avaliadas para identificar um único doador aíogeneico que exibiu uma resposta à proliferação forte em uma reação da linfôclfo misturada com os outro?? cinco doadores de sangue. Este doador foi selecionado como os outros cinco doadores sangue. Este doador foi selecionado como o doador de controle positivo alogeneíco. Qs cinco doadores de sangue restantes furam selecionados como recipientes. PBMC alogeneica de esflmulador (doador), P8MC alogeneica, PBMC autóioga, e linhagens celulares pós-paria foram tratados som mítomicina C. Células estimuiadoras tratadas com mitomicina C e autóiogas foram adicionadas aos PBMCs respondedores (recipientes) e cultivadas durante 4 dias. Depois da incubação, (Hltimidina foi adicionada a cada amostra e cultivada durante 18 horas. Após a colheita, das células, o DNA radionotulado foi extraído, e a incorporação de [⁵H]-timidina foi medida usando um cantador de cintilação. As reações foram realizadas em íripiicaia usando placas de cultura de duas células com. três receptores por placa.

O índice de excitação para n doador alogeneíco (SIAD) foi calculado como a proliferação média do receptor mais doador alogeneíco tratado

111/117 corn mifomsoina C mvidido pela proliferação de referência do receptor. Q in dice de excitação das células pbs-parto fol calculado corno a proliferação média do receptor mais linhagem celular pós-parto tratada com mífomicina C dividido pela proliferação de referência do receptor.

Seis doadores de sangue voluntários humanos foram avaliados para identificar um único doador alogeneico que elidará uma resposta à proliferação forte em uma reação de (infóato misturada com cs outros cinco doadores de sangue. Este doador for selecionado como o doador de controle positivo alogeneico. Os cinco doadores de sangue restantes foram seleciolõ nados como recipientes. As linhagens celulares derivadas de cordão umbilical e de doador de controle positivo alogeneico foram tratadas com mílornicina G e cultivadas ern uma reação de llnfõoito mssiurada com os cinco receptores alogeneiccs individuals. As reações foram realizadas em triplicate usando duas placas de cultura de célula corn três receptores por placa (Ta15 bela 14-2), O índice de estimulação médio variou de 6,5 (placa 1) para 9 (placa 2) e os controles positivos de doador alogeneico variaram de 42.75 (placa 1) para 70 (placa 2) (Tabela 14-3).

1 7

*·

TabeJaJ4-3,hdioede estimu|ação.m^io.de.çé|u aloqeneico em uma reaçao de línfócitu misturada corn cinco receptores ategeneieos individuals.

índice de Estimulação Médio

	Recipiente	Umbigo
Placa 1 (receptores 1 -4)	42,75	6,5
Placa 2 (receptor 5)	78	9

Histogramas du células derivadas de cordas umbilical analisadas por citometría de fluxo mostram a expressão negativa de HLA-DR. DP.

DQ, CD80, CD86, e B7H2, corno notado por valor de fluorescência consistente oom o controle de tgG, indicando que as linhagens celulares derivadas de cordão umbilical necessitam das moiêouias de superfície de célula exigí10 das para diretamente estimular as PBMCs aiogeneicas (por exemplo, células

CD44- T).

As células umbilicais analisadas por ciíometria de fluxo foram positives para expressão de PD-L2, como refletido no aumento na fluorescência relativa ao controle de IgG. As células foram negativas para expres15 são de CD 173 e Hl.A-G, como notado por valores de fluorescência consistentes com o controle de IgG.

Nas reações de linfácito misturadas conduzidas com linhagens celulares derivadas de cordão umbilical, o índice de estimulação médio variou de 6,5 para 9. enquanto aquele des controles positivos aicgeneicos varia2Ô ram de 42,75 para 70. Linhagens celulares denvadas de cordão umbilical expressaram quantidades detestáveis das proteínas estimulantes HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ. CD80, CD86, e B7-H2, quando medidas por citometria de fluxo, Linhagens celulares umbilicais não expressaram as proteínas imur^ornoduladoras HLA-G e CD178. porém a expressão de PD-L2 foi detectada 25 por citometria de fluxo. PBMCs de doadores atogeneicas continham células de apresentação de antigeno expressam HLA-DP, DR. DQ, CD80. CD86, e B7-H2, desse modo permitindo a estimulação de iinfôcitos alugeneicos A ausência nas células derivadas de umbigo das moléculas de superfície de

115/117 ce u as cX θ ^{direta da} las CD4 T que não receberam tratamento, bem como a presença de D-L2, uma proteína imunomoduiadora, pode responder pelo baixo índice de estimulação por estas células em um MLR quando comparado aos controles alogeneicos.

A presente invenção não está limitada às modalidades descritas e exemplificadas acima. A invenção é capaz de variação e modificação denro do escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLO 15

Ensaio para Atividade de Telomerasp

Telomerase funciona para sintetizar as repetições de telômero que servem para proteger a integridade dos cromossomas e prolongar o peno o de vida repl.cativo das células (Liu, K, e outro, PNAS, 1999; 96 5147RNA ^{meraSe C}°^nSÍSte θ' ^d°^ÍS Pa+âo de telomerase

RNA (hTER) e transcriptase reversa de telomerase (hTERT). O regulamento telomerase é determinado por transcrição de hTERT porém não de de hTFPT^ea?a0 θ'^{11 Cadeia de P}°'^{i,nerase em tem}P° ^real (PCR) para mRNA de hTERT e desse modo um método aceito para determinar a atividade de telomerase das células.

Isolamento de Célula

JO

Experiências de PCR em tempo real foram realizadas para determinar a produção de telomerase das células derivadas de tecido de cordão umbilical humano. As células derivadas de tecido de cordão umbilical humano foram preparadas de acordo com os Exemplos 5-7 _e os exemplos menconados no Pedido U.S. N° de Série 10/877.012 (o pedido Ό12) Geralmente, os cordões umbilicais obtidos de National Disease Research Interchange (Philadelphia, Pa.) seguindo uma Hberação normal foram lavados para remover o sangue e resíduos e mecanicamente dissociados. O tecido °' em seguida incubado com enzimas de digestão incluindo colagenase ispase e h.aluromdase em meio de cultura a 37°C. Células derivadas de

116/117 quimatosas e fibroblastos de pele dérmicos normais (cc-2509 lote n° 9F0844) foram obtidos de Cambrex, Walkersville, Md. Uma linhagem celular de carcinoma embrionário testicular humano pluripotentes (teratoma) células nTetra-2 (NTERA - 2 cl.DI), (vide, Plaia e outro, Stem Cells, 2006; 24(3):531546) foi adquiridas de ATCC (Manassas, Va.) e foi cultivada de acordo com os métodos mencionados no pedido Ό12.

Isolamento de RNA Total

O RNA foi extraído das células usando kit RNeasy® (Qiagen, Valencia, Ca.). RNA foi eluido com 50 microlitros de água tratada com DEPC e armazenado a -80°C. RNA foi transcrito reverso usando hexâmeros aleatórios com os reagentes de transcrição reversa TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, Ca.) a 25°C durante 10 minutos, 37°C durante 60 minutos e 95°C durante 10 minutos. As amostras foram armazenadas a -20°C.

PCR em tempo real

PCR foi realizado em amostras de cDNA usando os Applied Biosystems Assays - On-Demand® (também conhecido como Ensaios de Expressão de Gene de TaqMan®) de acordo com as especificações do fabricante (Applied Biosystems). Este kit comercial é amplamente usado para analisar quanto à telomerase em células humanas. Brevemente, hTERT (gene de telomerase humano) (Hs00162669) e GAPDH humano (um controle interno) foram misturados com mistura principal de PCR Universal TaqMan® e cDNA usando um sistema de detecção de sequência 7000 com o software ABI prism 7000 SDS (Applied Biosystems). As condições de ciclo térmicas foram inicialmente 50°C durante 2 min e 95°C durante 10 min seguido por 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos e 60°C durante 1 min. Dados de PCR foram analisados de acordo com as especificações do fabricante.

Células humanas derivadas de tecido de cordão umbilical (ATCC Acesso N° PTA-6067), fibroblastos, e células-tronco mesenquimatosas foderivadas de tecido de cordão umbilical.

Ta^laJUM

	bTERT	18S RNA
Células umbilicais (022803)	NO
Fibroblastos	ND	4,

ND- não detectado; * sinal detectado

Células derivadas da tecida do cordão umbilical humano (isolado

02.2803, Al CC Acessa NE PTA-6067) e células nTera-2. foram analisadas e os resultados não mostraram nenhuma expressão de telomerase em dois lotes de hUTC enquanto a linhagem celular de teratoma revelou nível alio de expressão (Tabela 22-1).

Claims (22)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uso de células derivadas de tecido de cordão umbilical, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença, distúrbio, ou injúria pulmonar, e o dano causado desse modo, em que as células derivadas de tecido de cordão umbilical são derivadas de tecido de cordão umbilical humano substancialmente livre de sangue, são capazes de autorrenovação e expansão em cultura, tem o potencial de diferenciar-se em células de pelo menos um tecido pulmonar e são negativas para CD117.
2. 2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a doença, distúrbio ou injúria pulmonar é, ou é causado por, doenças ou distúrbios obstrutivos, doenças ou distúrbios restritivos, ou injúrias diretas ou indiretas.
3. 3. Uso de células derivadas de tecido de cordão umbilical, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento de doença pulmonar, em que as referidas células são derivadas de tecido de cordão umbilical humano substancialmente livre de sangue, são capazes de autorrenovação e expansão em cultura, são negativas para CD117 e CD45 e não expressam hTERT ou telomerase.
4. 4. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que as células derivadas de tecido de cordão umbilical não expressam hTERT ou telomerase.
5. 5. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que as células são induzidas in vitro a diferenciar-se em um tecido pulmonar.
6. 6. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que as células são administradas com pelo menos um outro tipo de célula.
7. 7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o outro tipo de célula é uma célula de tecido pulmonar selecionada de célula progenitora pulmonar, célula de músculo liso vascular, célula progenitora de músculo liso vascular, pericito, célula endotelial vascular, célula progenitora de endotélio vascular, ou outra célula-tronco multipotente ou plu- ripotente.
8. 8. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que as células são administradas com pelo menos um outro agente.
9. 9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o agente é um agente antitrombogênico, um agente anti-inflamatório, um agente imunossupressor, um agente imunomodulatório, um agente próangiogênico, ou um agente antiapopitótico.
10. 10. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as células são administradas aos sítios da doença, distúrbio ou injúria pulmonar.
11. 11. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que as células derivadas de tecido de cordão umbilical são administradas por injeção, infusão, um dispositivo implantado no paciente, ou por implantação de uma matriz ou armação contendo as células.
12. 12. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que as células exercem um efeito tráfico sobre tecido pulmonar do paciente.
13. 13. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que as células exercem um efeito trófico sobre o músculo liso vascular ou o endotélio vascular do paciente.
14. 14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o efeito trófico sobre o músculo liso vascular é a proliferação das células de músculo liso vascular.
15. 15. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o efeito trófico sobre o endotélio vascular é a proliferação das células endoteliais vasculares.
16. 16. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que as células induzem migração de uma ou mais células endoteliais vasculares, células progenitoras de endotélio vascular, células de músculo liso vascular, células progenitoras de músculo liso vascular, ou pericitos para os sítios da doença, distúrbio ou injúria pulmonar.
17. 17. Composição farmacêutica para tratar um paciente tendo uma doença, distúrbio ou injúria pulmonar, caracterizada pelo fato de que com- preende um veículo farmaceuticamente aceitável e células derivadas de tecido de cordão umbilical em uma quantidade eficaz para tratar a doença, distúrbio ou injúria pulmoriar, em que as células derivadas de tecido de cordão umbilical são derivadas de tecido de cordão umbilical humano substancialmente livre de sangue, são capazes de autorrenovação e expansão em cultura, tem o potencial de diferenciar-se em células de pelo menos um tecido pulmonar e são negativas para CD117.
18. 18. Kit para tratar um paciente tendo uma doença, distúrbio ou injúria pulmonar, caracterizado pelo fato de que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável, uma população de células derivadas de tecido de cordão umbilical e instruções para uso do kit em um método de tratar o paciente, em que as células derivadas de tecido de cordão umbilical são derivadas de tecido de cordão umbilical humano substancialmente livre de sangue, são capazes de autorrenovação e expansão em cultura, têm o potencial de diferenciar-se em células de pelo menos um tecido pulmonar e são negativas para CD117.
19. 19. Composição farmacêutica para tratar um paciente tendo uma doença, distúrbio ou injúria pulmonar, caracterizada pelo fato de que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma preparação feita de células derivadas de tecido de cordão umbilical, em que as células derivadas de tecido de cordão umbilical são derivadas de tecido de cordão umbilical humano substancialmente livre de sangue, são capazes de autorrenovação e expansão em cultura, têm o potencial de diferenciar-se em células de pelo menos um tecido pulmonar e são negativas para CD117.
20. 20. Kit para tratar um paciente tendo uma doença, distúrbio ou injúria pulmonar, o kit caracterizado pelo fato de que compreende a composição farmacêutica como definida na reivindicação 19.
21. 21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17 ou 19, caracterizada pelo fato de que as células derivadas de tecido de cordão umbilical não expressam hTERT ou telomerase.
22. 22. Kit de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que as células derivadas de tecido de cordão umbilical não expressam hTERT ou telomerase.