CH635748A5

CH635748A5 - Procede d'obtention de cellules placentaires de brebis.

Info

Publication number: CH635748A5
Application number: CH1001377A
Authority: CH
Inventors: A Renonce A Etre Mentionne Inventeur
Original assignee: Cellorgan Laboratoires Sa
Priority date: 1977-08-16
Filing date: 1977-08-16
Publication date: 1983-04-29
Also published as: LU80105A1; NL7808492A; DE2835292A1; BE869016A; US4193992A; IT7826676A0; AT364079B; FR2400521B1; DE2835292C2; IT1097944B; ATA590578A; FR2400521A1

Description

L'invention décrite et spécifiée dans ce texte concerne un procédé de préparation de cellules placentaires défibrinées et lyophilisées à partir du placenta fœto-maternel de brebis et les cellules ainsi obtenues.

L'obtention de cellules ou des extraits de cellules placentaires est connue. Ces cellules ou extraits sont utilisés en médecine et/ou dans des produits de beauté.

Or, la titulaire a développé durant un temps assez long un procédé optimal pour la préparation de cellules placentaires lyophilisées.

Le procédé de préparation de cellules placentaires défibrinées et lyophilisées selon l'invention est caractérisé dans la revendication 1.

A part le procédé, sont revendiquées les cellules placentaires ainsi obtenues.

Le produit du procédé inventif est caractérisé par les propriétés générales suivantes:

Physiques

Caractères organoleptiques:

Poudre de couleur marron plus ou moins foncée, inodore, de saveur légèrement salée.

Solubilité:

A 20°C:

— Soluble dans l'eau: 0,140 g nécessite au minimum 5 ml d'eau. La solubilisation est lente et nécessite une agitation pendant environ 1 lh h à 2 h. La solution obtenue est brune, opalescente et a en fait l'aspect d'une très fine suspension.

— Insoluble dans: méthanol, acétone, tétrachlorure de carbone, éther, benzène.

A 37° C:

— Solubilité dans l'eau nettement améliorée (30 min avec agitation),

— Insoluble dans le méthanol, l'acétone, le tétrachlorure de carbone et l'éther,

— Très légèrement soluble dans le benzène.

pH:

Déterminer le pH sur une solution à 1 % p/V en protéine.

Lots

1

2

3

4

5

6

7

Valeurs

7,40

7,52

7,60

7,32

7,66

7,60

7,43

Toutes les valeurs sont inférieures à pH 7,7.

Pouvoir rotatoire:

Il n'a pas pu être mesuré compte tenu de l'opalescence des solutions du produit même diluées et défêquées par l'acide trichloracé-tique.

Résistivité:

Déterminée sur des solutions à 2%.

Lots

1

2

3

4

5

6

Q cm2/cm

253

212

215

277

182

240

Moyenne: 229,8+33,7

Les valeurs obtenues sont dispersées.

Spectroscopie:

Ultraviolette et visible:

Sur les essais réalisés sur les différents échantillons, nous avons noté une absorption intense dans l'ultraviolet lointain (200 à 225 nm) et très marquée aussi entre 225 et 280 nm. Cela tient à la teneur élevée en protéines du milieu:

— tous les aminoacides ont une absorption importante pour des A.=220 nm,

— la cystine absorbe à 240 nm,

— la tyrosine absorbe à 280 nm,

— les bases puriques et pyrimidiques des nucléoprotéides à 260 nm. Infrarouge:

Bien qu'il s'agisse d'un milieu complexe, nous avons réalisé des spectres à l'infrarouge du produit, après pastillage de celui-ci dans du bromure de potassium.

Les spectres obtenus, qu'il ne nous est pas possible d'interpréter dans les détails compte tenu de la complexité de la matière analysée, permettent cependant de souligner une homogénéité notable entre les échantillons traités.

Chimiques

Teneur en eau exprimée en grammes pour 100 g de substance:

Détermination par pesée après passage des échantillons à l'étuve à 104°C jusquà poids constant.

Lots

1

2

3

4

5

6

Résultats

3,23

4,20

3,85

4,70

3,70

4,02

Valeur moyenne: 3,95+0,49

Les résultats sont homogènes.

Cendres totales: exprimées en grammes pour 100 g de substance. Prise d'essai: 0,5 g - Technique «Pharmacopée française», 9e éd., pp. 2-300.

Lots

1

2

3

4

5

6

Résultats

9,85

9,00

8,68

9,90

9,50

9,25

Valeur moyenne: 9,37+0,48

Les résultats sont homogènes.

Azote total: exprimé en grammes pour 100 g de substance. Détermination de l'azote total par la méthode de Kjeldhal.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

635 748

Lots

1

2

3

4

5

6

Valeurs N

9,5

10,0

10,3

10,6

10,3

Teneur en protéines P N x 6,25

59,3

62,5

64,3

66,2

62,5

Valeurs moyennes : ^ 10,17 ± 0,38 [P = 62,88 ±2,29

Les teneurs en protéine, des échantillons analysés sont importantes. Les valeurs obtenues sont groupées et témoignent donc dans ce domaine d'une certaine homogénéité des lyophilisats étudiés. is

Azote non protéique: exprimé en grammes pour 100 g de substance.

Dosage de l'azote par la méthode de Kjedhal après dêprotéinisa-tion du milieu à l'acide trichloracétique à 20%.

Cette fraction azotée représente les peptides, les aminoacides et les autres composants azotés (urée, créatinine, etc.). Les valeurs obtenues sont, là encore, assez groupées et témoignent d'une certaine richesse du milieu en ce type de composé. 30

Electrophorèse de zone:

— Réalisée sur un appareil Beckman.

Les essais réalisés ont conduit à des résultats très divers en rapport avec la teneur élevée en protéine du milieu. Ils n'ont pas pu 35 être interprétés.

Glycogène: exprimé en grammes pour 100 g.

Technique de Good-Kramer et Somogyi.

«Techniques de laboratoire» de J. Loiseleur, tome I, fascicule 2, 4Q Masson 1963, p. 1363.

Pratiquement absence de glycogène dans les échantillons analysés.

Cela tient certainement au mode de préparation des lyophilisats. Biologiques

Essai réalisé conformément aux directives de «Pharmacopée française», 9e éd., pp. 2-238-243.

Les 6 échantillons étaient normaux du point de vue stérilité.

Substances pyrogènes:

Les essais définitifs n'ont pas été exécutés conformément aux indications de «Pharmacopée française», 9e éd., pp. 2-235-238. En effet, l'administration de 0,5 ml d'une solution de lyophilisât à 140 mg/5 ml par kilogramme d'animal avec 1 ml de solution isotonique apyrogène de chlorure de sodium dans la veine de l'oreille de lapin a entraîné dans les quelques minutes la mort des animaux.

Cette grande toxicité du médicament par voie veineuse est la conséquence de sa richesse en protéines. Celles-ci ont provoqué ces chocs responsables des mortalités observées.

Substances histaminiques :

Le titrage biologique a été réalisé conformément aux indications de «Pharmacopée française», 9e éd., pp. 2-244-246.

Aucun des 6 échantillons présentés ne possède une activité con-tracturante même à des concentrations élevées (10~3 au plus). Parfois (courbe N° 5), on assiste tardivement (1 à 2 min) à une élévation progressive du tonus de la préparation. Elle ne peut pas être mise sur le compte de l'histamine car:

— elle est inconstante au cours d'un même essai pour un même échantillon,

— elle est lente à se manifester, donc différente d'un spasme hista-minique qui se déclenche dès l'injection du produit dans la cuve. Cette modification de tonus doit être attribuée aux variations de la composition du liquide de survie par les fortes doses de lyophilisât riches en protéines: son brassage par les bulles d'air s'accompagne de la formation d'une mousse abondante dans le haut de la cuve.

Essai de toxicité anormale:

— Inspiré de «Pharmacopée française», 9e éd., pp. 11-246.

— Données expérimentales:

— solution à 2% dans du NaCl isotonique

— volume injecté: 0,5 ml par voie intrapéritonéale

— animaux: 5 souris femelles et 5 souris mâles

— tous les animaux doivent survivre et ne présenter aucun symptôme de maladie 6 d après l'injection

Lots

1

2

3

4

5

6

Résultats

0,02

traces traces

0,3

traces

0,1

Lots

1

2

3

4

5

6

Valeurs

3,85

3,32

4,02

3,50

3,78

4,02

Valeur moyenne: 3,75+0,28 25

Lots

1

2

3

4

5

6

Témoin

Résultats normal normal normal normal normal normal normal

(0,5 ml

de NaCl)

Les 6 échantillons sont normaux.

Dosages divers:

Eléments minéraux:

Dosage des principaux éléments: 60

Sodium: exprimés en milligrammes par gramme de substance - dosage par spectrophotométrie de flamme

65

Valeur moyenne: 32,23+6,19

Potassium: exprimés en milligrammes par gramme de substance - dosage par spectrophotométrie de flamme

Calcium: exprimés en milligrammes par gramme de substance

- dosage par spectrophotométrie d'absorption atomique

Lots

1

2

3

4

5

6

Valeurs

36,8

32,2

33,3

40,2

22,8

28,1

Lots

1

2

3

4

5

6

Valeurs

3,4

2,8

3,6

4,1

3,2

2,8

Valeur moyenne: 3,32+0,50

635 748

4

Lots

1

2

3

4

5

6

Valeurs

19,1

10,2

7,6

8,4

10,2

Lots

1

2

3

4

5

6

Valeurs

4,2

4,6

3,9

4,2

3,9

3,5

Valeur moyenne: 10,65+4,27

Magnésium: exprimés en milligrammes par gramme de substance

- dosage par spectrophotométrie d'absorption atomique

Valeur moyenne: 1+0,17

Zinc: exprimés en milligrammes par gramme de substance

- dosage par spectrophotométrie d'absorption atomique

Valeur moyenne: 4,05 + 0,37

L'ensemble des recherches montrent une relative homogénéité des échantillons avec une teneur moyenne en calcium élevée par rapport aux autres éléments et une teneur en zinc constante.

Recherche des métaux lourds:

— Réalisée suivant les normes de «Pharmacopée française», 8e éd., pp. 1569-1571.

15 — Les prises d'essai de 0,20 g ont été traitées suivant la méthode 4.

— Résultats exprimés en parties par millions (ppm).

Lots

1

2

3

4

5

6

Valeurs

0,12

0,10

0,11

0,12

Lots

1

2

3

4

5

6

Valeurs

12

8

14

10

7

14

Lots

1

2

3

4

5

6

Valeurs

1,0

1,2

0,9

0,8

0,9

1,2

20

Valeur moyenne: 0,12+0,01

Chlore: exprimés en milligrammes par gramme de substance - dosage à l'auto-analyzer Technicon (mercurimétrie)

Phosphore: exprimés en milligrammes par gramme de substance - dosage à l'auto-analyzer Technicon

Valeur moyenne: 10,8 + 2,9

25 Pour tous les échantillons, les valeurs obtenues sont inférieures à 15 ppm.

Acides aminés:

Ces analyses ont été réalisées sur appareil Technicon:

30

— séparation des acides aminés par Chromatographie sur colonne résines échangeuses d'ions,

— dosage après élution par colorimétrie avec la ninhydrine.

Les résultats sont exprimés en micromoles par gramme de 35 poudre.

Lots

1

2

3

4

5

6

Valeurs

26,7

33,2

28,0

28,7

33,2

35,0

Valeur moyenne: 30,80+3,41

N° échantillon

1

2

3

4

5

6

Acide aspartique

45,3

8,1

38,4

6,5

9,2

28,7

Thréonine

61,2

14,7

53,5

12,7

10,8

51,3

Serine

119,1

26,8

102,3

21,3

18,3

71,8

Acide glutamique

111,0

24,4

93,7

36,4

24,3

59,4

Proline

0

44,1

0

14,0

Glycocolle

75,0

17,7

65,7

19,0

11,7

51,0

Alanine

124,5

43,8

114,7

38,0

25,2

112,5

Lanine

99,1

25,2

88,8

19,8

16,5

107,7

Cystine

12,1

traces

0

1,2

traces

3,8

Méthionine

30,0

10,0

26,6

8,4

3,1

24,3

Isoleucine

81,1

19,6

69,3

12,0

59,4

Leucine

148,5

54,7

125,4

38,4

27,3

90,0

Ty rosine

58,5

28,5

53,2

24,7

14,5

39,3

Phénylalanine

74,2

28,0

66,2

21,9

13,7

52,0

Lysine

127,5

39,7

115,2

29,6

18,0

36,3

Histidine

31,7

8,1

29,0

5,8

4,9

30,5

Tryptophane

20,7

9,1

18,0

8,0

5,1

16,6

Arginine

92,7

35,0

non sortie

16,8

26,5

58,0

Citrulline

0

Carnosine

0

1 -Méthylhistidine

0

Total

1312,2

392,2

1104,1

320,5

241,1

906,6

Tous les acides aminés se retrouvent dans tous les échantillons à l'exception de la proline qui n'existe que dans les échantillons 3 et 6, et de la cystine qui n'existe pas dans l'échantillon 3 et que l'on retrouve à l'état de traces dans les échantillons 2 et 5.

Cependant, les teneurs des divers aminoacides, bien que non 65 négligeables (en moyenne 10%) varient considérablement d'un échantillon à l'autre. Cela tient certainement à la préparation (digestion trypsique plus ou moins poussée, lavage ultérieur plus ou moins intense).

5

635 748

Vitamines:

Thiamine:

— Dosage réalisé selon «Officiai methods of analysis of the Association of officiai agricultural chemists», p. 657.

— Résultats exprimés en microgrammes par gramme de substance.

Lots

1

2

3

4

5

6

Valeurs

0

traces traces

0

traces

0

Riboflavine:

— Dosage réalisé selon «Officiai methods of analysis of the Association of officiai agricultural chemists», p. 659.

Lots

1

2

3

4

5

6

Valeurs

0

traces

0

traces

Vitamine C:

— Dosage réalisé selon «Officiai methods of analysis of the Association of officiai agricultural chemists», p. 661. 25

Lots

1

2

3

4

5

6

Valeurs

0

traces

0

traces

0

Cette absence des facteurs vitaminiques Bj, B2 et C dans les échantillons analysés, bien qu'elles existent dans le placenta frais, est sûrement en rapport avec la technique de préparation du médicament (digestion trypsique, lavages, etc.) qui doit entraîner une élimination quasi totale de ces principes hydrosolubles non protéiniques.

Enzymes:

— Dosages des activités enzymatiques de: transaminases, phospha-tase, acides et alcalines, aldolase, créatine, Phosphokinase.

— Technique utilisée: tirée de «Techniques modernes de laboratoire et exploration fonctionnelle, 1.1, Lucien Hartmann, et de «Bio-chemical Test Combination», de Boehringer. La solution testée était à 0,35%. Cette dilution s'est révélée nécessaire à cause de la coloration.

— Transminases (TGO et TGP), dosage en ultraviolet: Hartmann, pp. 458-461.

— Aldolase (FDP), dosage en ultraviolet: Hartmann, pp. 465-466.

— Créatine, Phosphokinase ou CPK: Hartmann, pp. 462-464.

— Phosphatase acide: «Biochemica Test Combination», Boehringer.

— Phosphatase alcaline: «Biochemica Test Combination»,Boehringer.

1

2

3

4

5

6

Moyenne

TGO

14

12

22

16

22

15

16,8+4,2

TGP

1

2

1

1,3+0,5

Aldolase

0,1

0

0,2

0,1

0

0,07+0,08

CPK

0,2

0,1

0,3

0

0,2

0,1

0,15+0,1

Phosphatase acide

7

4

2

8

3

4,3 ±2,5

Phosphatase alcaline

25

20

25

23

25

23+2,4

— Résultats exprimés en milli-unités par millilitre de solution. L'ensemble des résultats indique une activité enzymatique non négligeable, compte tenu de la concentration en produit de la solution. L'existence de cette activité montre que, dans les protéines constitutives du médicament, certaines d'entre elles ont conservé leurs propriétés biologiques normales.

Hormones:

(Estradiol:

La recherche et l'essai de dosage ont été réalisés par Chromatographie sur couche mince en s'inspirant, pour ce qui est de l'extraction, de la technique de Wiriot et Henry, «Techniques modernes de laboratoire et explorations fonctionnelles», Hartmann, p. 596.

— 25 ml de solution à 2% ont été traités.

La CCM a été réalisée sur gel de silice G dans le système benzène/éthanol. La révélation s'est effectuée par pulvérisation d'acide sulfurique éthanol (V/V) puis étuvage à 105°C pendant 10 min. Dans ce cas, le Rf est le suivant: (Kurt Randeratte, «Chromatographie sur couches minces», 2e édition française, p. 142).

— Œstradiol: 0,30+0,03.

De toute façon, opérer toujours avec un témoin de référence (ß-œstradiol du commerce).

45 II a été possible de mettre en évidence dans tous les échantillons la présence d'œstradiol. La quantité d'œstradiol a pu être appréciée grossièrement par rapport à des témoins comme étant de l'ordre de 50 ng.

50 Phénolstéroïdes et hormones gonadotropes: évaluation biologique.

L'action utérotrophique de ces groupes d'hormones est connue. Elle a été recherchée par administration directe par voie sous-cutanée de solution du produit en s'inspirant de la technique de

5S Wiriot et Henry: «Techniques modernes de laboratoire et explorations fonctionnelles», Hartmann, p. 627.

Chaque échantillon a été testé sur 10 souris impubères d'un poids moyen de 15 g ayant reçu pendant 3 d, par voie sous-cutanée, 0,5 ml d'une solution à 1%.

60 Les résultats ont été les suivants :

Lots

1

2

3

4

5

6

Témoin

Nombre d'animaux positifs sur 10 traités

7

8

6

7

9

8

10

Poids de l'utérus (mg)

58,54+14,32

43,63 + 20,83

38,68± 10,17

42,50 ±15,65

39,10± 16,2

50,15 ±16,40

15,77 ± 2,15

635748

6

Pour chaque lot, le test s'est révélé positif (doublement du poids de l'utérus) et révèle donc une activité utérotrophique recherchée.

Examen microscopique des échantillons:

Technique:

— suspension épaisse en soluté physiologique,

— frottis sur lame,

— après séchage, coloration au May-Grünwald-Giemsa.

Résultats:

Lot 1: Très rares éléments cellulaires conservés. Masse anhiste avec de nombreux éléments grannulaires ou filamenteux de quelques microns, de type ergastoplasmique ou microsomial.

Lot 2: Sur un fond anhiste de nature protidique, très nombreux éléments en grains (0,5|i environ) et en courts flaments (2 à 3(i) provenant de la désintégration de la chromatine des noyaux.

— Des noyaux ovoïdes ou sphéroïdes se détachent sur le fond du frottis, en assez grand nombre, et leur structure chromatinienne est plus ou moins désintégrée, mais souvent elle reste sous la forme d'un réseau dense.

— Des cellules sanguines (monocluéaires ou polynucléaires) apparaissent de place en place. Parfaitement conservées, elles représentent environ 1 % des éléments nucléaires décrits ci-dessus. Lot 3: Analogue au lot 1.

Lot 4: Le fond anhiste est traversé par de très longs filaments cytoplasmiques (40 à 50 |i) bien conservés et formant un réseau lâche dans lequel apparaissent:

— d'une part, des noyaux en voie de lyse,

— d'autre part, des cellules sanguines indemnes (15% des éléments nucléaires).

Lot 5: Le fond anhiste ne montre que de rares formations en grains ou en filaments, ce qui traduit une faible désintégration nucléaire.

Les noyaux sont très nombreux, et 50% sont parfaitement conservés et entourés d'un cytoplasme à limites bien définies. Lot 6: Analogue au lot 5.

En résumé, milieu relativement inhomogène du point de vue microscopique. Très peu de cellules sont conservées entières. La désintégration cellulaire est plus ou moins marquée (importante dans les lots 1,2,3, plus discrète dans les lots 5 et 6). Cela tient sans doute au procédé de défibrination. Il serait certainement souhaitable de le normaliser d'avantage.

Au total, il apparaît donc que les produits analysés sont avant tout constitués d'homogénat de cellules placentaires, particulièrement riches en éléments protéiques.

Expertise de toxicologie des cellules placentaires défibrinées lyophilisées

Les animaux:

Rats:

— Lots témoins T

— Lot expérimental A: lyophilisât

— administré par voie sous-cutanée,

tous les 2 d (3 fois par semaine)

à la dose de 20 mg/kg, soit 10 D.T.J.H. *

— Lot expérimental B: lyophilisât

— administré par voie sous-cutanée,

tous les 2 d (3 fois par semaine),

à la dose de 100 mg/kg, soit 50 D.T.J.H.

Lapins:

— Lots témoins T

— Lot expérimental A:

— Lot expérimental B:

30

40

20 animaux 50

20 animaux

55

20 animaux 60 animaux 60

10 animaux 10 animaux 10 animaux

30 animaux

65

* D.T.J.H. = dose thérapeutique journalière humaine: 2 mg/kg soit, pour un adulte de 70 kg, 140 mg

La posologie retenue et la fréquence d'administration sont celles appliquées chez les rats.

Remarques: La voie d'administration et la posologie humaine sont celles qui nous ont été proposées par les laboratoires Cellorgan. En ce qui concerne la fréquence d'administration, nous l'avons choisie compte tenu du fait que, chez l'homme, est préconisée l'administration unique par voie intramusculaire de 140 mg de produit sec mis en solution dans 5 ml de soluté isotonique NaCl. Cette injection ne serait répétée éventuellement qu'au bout de plusieurs semaines ou de plusieurs mois.

Les doses retenues correspondent aux normes admises en matière d'expertise toxicologique à moyen terme:

— 1 dose moyenne, lots A: 10 D.T.J.H.

— 1 dose forte, lots B: 50 D.T.J.H.

Hébergement:

Les animaux ont été groupés ainsi:

— rats: 5 par cage suivant les lots et les sexes,

— lapins: cages individuelles.

Ils ont été régulièrement placés dans des cages à métabolisme afin de contrôler les urines et les fèces.

Enfin, ils ont été soumis à une phase d'acclimitation d'une durée de 8 d avant l'expérimentation, et nourris avec des aliments complets U.A.R.

Examens réalisés:

Réaction des animaux:

— contrôle de croissance par pesée des animaux: pesée individuelle effectuée 2 fois par semaine,

— manifestations cliniques: contrôle de l'état général, de l'activité, de la mortalité éventuelle; caractères des fèces et des urines,

— en fin d'expérimentation: mise à mort des animaux et autopsie.

Poids des organes:

— Les organes suivants ont été prélevés:

Corticosurrénales Rein Cœur

Foie Rate Testicules ou ovaires.

Examens histologiques: réalisés sur 50% des animaux.

— Organes examinés : estomac, iléon, foie, rein, rate, cœur, surrénales, thyroïde, testicule ou ovaire.

— Technique d'étude:

— fixation des organes au formol à 10%,

— inclusion et coupe à la paraffine,

— coloration de Lillie et Pasternak à pH 4.

Examen sanguin:

— Numération globulaire et formule leucocytaire réalisées sur tous les animaux:

— prélèvement de sang au niveau de la queue (rat), ou de l'oreille (lapin) en pipette de Potain, sur liquide de dilution de Marcano,

— numération des éléments figurés du sang en chambre hémati-métrique de N. Fiessinger,

— coloration des frottis par la méthode de May-Grünwald-Giemsa,

— hématocrite (lapins).

Examens biochimiques: réalisés sur 50% en moyenne des rats et sur la quasi-totalité des lapins.

Bilan biochimique général:

a) Constantes sanguines diverses:

— Cholestérol total:

— réaction de Liebermann

— auto-analyzer Technicon

— Urée:

— réaction colorée au diacétyle monoxime

— auto-analyzer Technicon

7

635 748

— Glycémie:

— réduction du ferricyanure de potassium

— auto-analyzer Technicon

— Protéines totales:

— réaction colorée du biuret

— auto-analyzer Technicon

— Albumines:

— réaction colorée par fixation quantitative de H.A.B.A.

— auto-analyzer Technicon

— Créatinine:

— réaction colorée avec l'acide picrique en milieu sodique

— auto-analyzer Technicon

— Acide urique:

— réaction colorée par réduction d'un complexe phospho-tungstique en un complexe phosphotungsteux autoanalyzer Technicon

— Bilirubine totale:

— formation d'azobilirubine

— auto-analyzer Technicon

— Chlore plasmatique (lapins)

— dosage par mercurimétrie

— auto-analyzer Technicon

— Sodium et potassium (lapins)

— spectrophotométrie de flamme b) Bilan hépatique:

— Transaminases sériques: S.G.O.T.

S.G.P.T.

— «Techniques modernes de laboratoire et explorations fonctionnelles», p. 492.

— Résultats exprimés en unités colorimétriques.

—■ Phosphatase alcaline:

— technique au paranitrophénylphosphate: «Biochemica Test Combination».

— résultats exprimés en milli-unités par millilitre.

— Glycogène hépatique:

— technique de Good-Kramer et Somogyi.

«Techniques de Laboratoire», de J. Loiseleur, 1.1, fascicule 2, Masson 1963, p. 1363.

Bilan urinaire:

— réalisé successivement sur les animaux au cours de la manipulation

— recherche des principaux éléments anormaux:

— albumine

— glucose

— sang

— corps cétoniques

Les examens biochimiques sanguins et le dosage du glycogène ont été effectués en fin de manipulation au moment de la mise à mort des animaux.

Le sang a été prélevé par ponction cardiaque.

La conclusion est la suivante:

En résumé, les cellules placentaires défibrinées lyophilisées analysées constituent un ensemble relativement homogène, représentés essentiellement par un homogénat de cellules placentaires lyophilisées, riche en protéine (60%).

La mise en évidence de facteurs hormonaux (phénolstéroïdes et hormones gonadotropes) peut être considérée comme une caractéristique de la nature placentaire du médicament.

Enfin, ces échantillons sont corrects du point de vue bactériologique, des substances histaminiques et de l'essai de toxicité anormale.

Examens de la toxicité aiguë des cellules placentaires défibrinées lyophilisées

Selon les règles habituellement admises, la toxicité aiguë d'un produit à expertiser doit être jugée sur deux espèces animales distinctes. Dans le cas présent, nous avons choisi la souris et le lapin. La dose humaine de référence indiquée est de 100 à 120 mg en injection unique, soit environ 2 mg/kg. La dose thérapeutique journalière humaine (D.T.J.H.) est donc de 2 mg/kg.

I. Souris

Le faible poids de la souris a permis de juger de la toxicité aiguë du produit en lui injectant par voie intramusculaire 2,5 g/kg, soit 1250 D.T.J.H. Technique: 8 ampoules contenant chacune 250 mg de placenta D Cellorgan sont vidées dans un récipient stérile dans lequel on ajoute une quantité suffisante de soluté physiologique pour un volume total de 40 ml. 1 ml contient 50 mg de placenta D.

25 souris sont réparties en 5 lots de 5 souris de même sexe et de même âge. Le poids moyen par lot est établi avant injection, au jour 10 et au jour 20 après injection.

10 souris témoins ne reçoivent pas d'injection. Elles sont réparties en 2 lots de 5 souris et pesées aux mêmes dates que les animaux en expérience.

Les souris en expérience sont pesées individuellement et reçoivent chacune en injection intramusculaire unique 2500 mg/kg de placenta D. Une souris de 32 g recevra par exemple 1,6 ml (0,8 ml dans chaque cuisse), soit 80 mg de placenta D, ce qui correspond à 2,5 g/kg.

11 n'y eut aucune mortalité ni chez les souris traitées, ni chez les témoins, pendant la durée de l'expérience. Deux souris traitées sont mortes accidentellement après le terme théorique fixé pour la fin de l'expérience, soit plus de 20 d après la date des injections.

Résultats: Poids moyen des souris

Avant injection

Jour 10

Jour 20

Loti

32

33,4

32

Lot 2

30

30,6

28,4

Lot 3

28,5

29,8

29,4

Lot 4

30

32,8

32

Lot 5

32

33,8

33

Moyenne:

30,5

32,1

30,2

Lot témoin 1

29

30

31,5

Lot témoin 2

29,5

30,5

32

II faut noter que le poids moyen des animaux en expérience a augmenté de 4,2% 10 d après l'injection pour se retrouver au niveau initial le jour 20.

Par contre, le poids moyen des lots témoins est resté pratiquement stationnaire.

II. Lapins

Le poids plus important des lapins ne permettait pas d'utiliser chez cette espèce des doses relatives aussi considérables que celles utilisées chez la souris. La dose utilisée a été ramenée à 60 D.T.J.H., soit 120 mg/kg.

Technique: un poids total de 4 g de placenta D est versé dans un récipient stérile où on ajoute une quantité suffisante de soluté physiologique pour un volume de 40 ml. 1 ml contient 100 mg de placenta D.

On utilise 12 lapins adultes. 3 lapins témoins ne recevront aucune injection. 9 lapins en expérience reçoivent chacun par voie intramusculaire 120 mg/kg de placenta D.

Tous les lapins ont été pesés à jeun avant injection, le jour 7, le jour 14 et le jour 21.

Résultats:

Avant injection

Jour 7

Jour 14

Jour 21

Lapin 1

2,400

2,450

2,700

2,900

Lapin 2

2,200

2,300

2,550

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

635 748

8

Résultats: (suite)

Avant injection

Jour 7

Jour 14

Jour 21

Lapin 3

2,000

2,200

2,450

2,900

Lapin 4

2,200

2,350

2,300

2,550

Lapin 5

2,400

2,450

2,600

2,750

Lapin 6

2,400

2,550

2,600

2,800

Lapin 7

1,800

2,000

2,100

2,300

Lapin 8

3,000

3,200

3,100

2,950

Lapin 9

3,000

3,300

3,350

3,570

Moyenne:

2,377

2,522

2,611

2,808

Lapin témoin 1

2,400

2,450

2,600

2,700

Lapin témoin 2

2,300

2,450

2,600

2,700

Lapin témoin 3

2,300

2,420

2,560

2,650

Moyenne:

2,333

2,423

2,570

2,670

Les lapins injectés n'ont présenté aucune réaction locale anormale. Le poids moyen des lapins a crû régulièrement, aussi bien chez les lapins en expérience que chez les lapins témoins. Un seul lapin, le N° 8, a accusé une légère perte de poids à la suite d'une crise de coc-cidiose.

Conclusions:

Les résultats de l'expérimentation poursuivie sur deux espèces animales, souris et lapins, ne traduisent aucune toxicité du produit sous contrôle.

Essais tératologiques des cellules placentaires défibrinées et lyophilisées

Des souris blanches, réparties en quatre groupes, ont été utilisées pour des expériences d'injection de placenta défibriné. Elles ont été choisies parmi les portées contemporaines, de manière à avoir sensiblement le même poids.

1er groupe: groupe témoin;

2e groupe: subit une injection de 1 g/kg après 8 d de gestation; 3e groupe: subit une injection de 1 g/kg après 11 d de gestation; 4e groupe: subit une injection de 1 g/kg après 14 d de gestation.

Parmi les souris injectées, aucune n'a montré de formation inflammatoire au point d'injection. Celle-ci produit généralement un stress temporaire, sans conséquence pour la vie de l'animal.

La durée de gestation est la même pour les souris injectées et les souris témoins, soit environ 20 V* d.

Poids moyen à la naissance.

Les souris témoins nous ont fourni un total de 84 souriceaux, de poids moyen 1,67 g.

Les souris injectées nous ont fourni:

8 d: 25 souriceaux de poids moyen 1,57 g 11 d: 35 souriceaux de poids moyen 1,60 g 14 d: 34 souriceaux de poids moyen 1,54 g

Aucun avortement ne s'est produit parmi les souris traitées. Après étude statistique, les différences de poids qui apparaissent à la naissance ne sont pas significatives.

L'augmentation de poids a été régulière, ainsi que l'indique la courbe ci-jointe. Les souris injectées n'ont montré aucun trouble, leurs descendants ont été suivis pendant six semaines. Au 42e jour, les résultats sont les suivants:

témoins: poids moyen 27,56 g 8 d: poids moyen 27,81 g 11 d : poids moyen 28,32 g 14 d: poids moyen 33,32 g

Les variations de poids ne présentent aucun caractère significatif.

Observations sur l'action des cellules placentaires défibrinées et lyophilisées, utilisées dans un topique sur des lésions cutanées torpides, d'origine diverse dont le détail est donné ci-dessous.

Les cellules placentaires sont contenues dans un médicament sous la forme d'un gel à usage externe.

La posologie suivie a été uniforme chez tous les malades d'une application quotidienne sans pansement, après un simple lavage de la plaie au sérum physiologique.

La grande majorité des malades était âgée. Il fut parfois nécessaire d'adjoindre à la médication locale par le gel des médications générales soit anti-infectieuses soit spécifiques d'un état général déficient. Ces médications adjuvantes sont indiquées sur chaque observation.

L'ensemble des observations est résumé dans les tableaux ci-dessous:

En résumé

Sur 26 observations, 24 sont à retenir. Dans l'observation N° 8, le traitement au gel n'a été appliqué que 3 d, le malade se plaignant de picotements douloureux après application. Mêmes plaintes du malade après application d'un autre topique. Il y a lieu de supposer une réaction plus subjective qu'objective de la part du malade. L'autre observation éliminée (N° 19) concerne un malade qui a refusé le traitement après deux applications, se plaignant de picotements locaux.

Chez tous les autres malades, la tolérance a été parfaite. Si nous reprenons les résultats en fonction de l'âge du patient, nous voyons:

Plus de 80

70-80

60-70

50-60

Moins de 50

Ulcères de jambe spontanés

1

2

1

2

1

après traumatisme

1

5

1

après exerese

de tumeur maligne

2

Escarres de décubitus

4

1

Brûlures

1

Les ulcères apparus spontanément se répartissent sur toute la gamme des âges.

Les ulcères post-traumatiques sont fréquents entre 60 et 70 ans. Les deux observations concernent des ulcères survenus sur des cicatrices d'exérèse de tumeur maligne sont dans la classe 70-80. Les escarres de décubitus apparaissent naturellement chez les malades les plus âgés.

L'âge chez les brûlures n'intervient pas dans l'étiologie.

Ulcères de jambe spontanés; sept malades — cinq résultats excellents (observations: 1, 3,13,22,24) — âge moyen 57 ans.

Deux résultats moyens (observations 4 et 20), âge moyen 80 ans.

Ulcères de jambes suite de traumatisme — huit malades :

Six résultats excellents (observations: 2, 5, 7,9,10,23), âge moyen 61 ans.

Deux résultats moyens (observations 12,25), âge moyen 57 ans.

Suite d'exérèse de tumeur maligne, deux observations (Nos 21 et 25):

Un résultat excellent (observations 21), âge 78 ans.

Un résultat moyen (observation 25), âge 77 ans.

Escarres de décubitus — cinq observations:

Quatre résultats excellents (observations 14,15,16,18), âge moyen 81 ans.

Un résultat moyen (observation 17), âge 83 ans.

Brûlures: Deux observations:

Un résultat excellent (observation 6), âge 54 ans.

Un résultat moyen (observation 11), âge 62 ans.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

635 748

Conclusion

La tolérance locale et générale a été parfaite chez 24 malades sur 26. L'efficacité du gel a été excellente dans 17 cas, moyenne dans 7 cas. On n'a jamais constaté d'inefficacité totale chez les malades ayant été traités un temps suffisant. Il nous paraît, par comparaison 5 avec des observations antérieures, qu'une longue pratique hospitalière nous a permis de faire, que le gel a une place de premier rang pour le traitement local des plaies atones.

Exemple

Préparation de cellules placentaires défibrinées et lyophilisées

C'est à partir du placenta fœto-maternel de brebis que sont préparées les cellules placentaires défibrinées.

Origine des brebis: Le troupeau dont proviennent les brebis a été is spécialement constitué depuis plus de 15 ans pour servir de réserve au laboratoire. Les animaux sont de race brun-noir du Jura. Le troupeau se reproduit sans apport extérieur. La ferme où est entretenu le troupeau se trouve à Treyvaux (Fribourg) et est sous contrôle vétérinaire constant. Régulièrement, deux fois par an, au prin- 20 temps et à l'automne, le troupeau est soumis à un traitement antiparasitaire tant interne qu'externe.

Les brebis réservées pour le laboratoire sont séparées vers la fin du quatrième mois de gestation. Une prise de sang, pratiquée dans les jours qui précèdent la mise à mort, permet les examens de labora- 25 toire dont on trouvera un exemple ci-joint. Les examens sont effectués par Veterinaria (Zurich). De plus, après la mise à mort, des frottis de cotylédons sont pratiqués pour confirmer l'absence de myagawanella.

30

Préparation des cellules placentaires

Les brebis sont sacrifiées à l'abattoir (Sutter) de Villeneuve (Vaud). Aussitôt après la mort, le sac utérin dans son entier est prélevé avec toutes les précautions d'asepsie voulues, transporté au laboratoire dans un container étanche et stérile.

Au laboratoire, le sac utérin est ouvert, le fœtus éliminé, et on procède à la récolte du placenta fœto-maternel (400 g). Les fragments recueillis sont immédiatement immergés dans du liquide de Ringer. Après plusieurs lavages pour éliminer les traces de sang, les fragments sont finement divisés aux ciseaux et mis dans une solution 40 acqueuse trypsinée à 5%. La digestion trypsique s'effectue à 38°C,

sous agitation constante, pendant une durée de 2 h à peu près.

Les cellules placentaires détachées sont extraites par filtration,

lavées à trois reprises en milieu de Hanks réfrigéré. La centrifugation à 1000 tr/min est pratiquée en centrifugeuse frigorifique maintenue à 45 38° C. Le dernier culot cellulaire est pesé, remis en suspension dans un minimum de liquide de survie pour pouvoir être facilement lyophilisé. La lyophilisation est poussée jusqu'à obtention d'un poids constant (3 g/cellule). La poudre ainsi obtenue constitue le produit de base du gel, qui est réparti en ampoules scellées sous azote ou sous vide et conservées à +4°C, le temps nécessaire aux contrôles de stérilité bactériologique d'une part, et aux contrôles biochimiques d'autre part.

Préparer séparément les solutions suivantes: Solution A

NaCl 320 g

KCl 16 g

MgS04, 7H20 8 g

CaCl2 5,6 g

Dissoudre successivement les sels dans de l'eau bidistillée, puis compléter avec eau bidistillée jusqu'à 2000 cm3.

Filtrer sur L. 3.

Solution B

Na2HP04,12 H20 6 g (ou Na2HP04,

KH2P04 2,4 g 2H20:2,4 g).

Glucose 40 g

Compléter avec de l'eau bidistillée jusqu'à L. 600 cm3. Ajouter 400 cm3 de solution de rouge de phénol à 0,1 % et filtrer sur L. 3.

Répartir séparément chaque solution par 100 cm3 dans des ballons de 250 cm3 bouchés caoutchouc et déposés à la chambre froide.

Milieu de survie

Peser dans un erlenmeyer de 500 cm3 :

100 mg 20 mg 300 mg 1 g

Dissoudre peu à peu dans environ 1000 cm3 d'eau bidistillée dans une fiole jaugée de 2000 cm3.

Ajouter: 100 cm3 solution A de Hanks (blanche)

100 cm3 solution B de Hanks (rouge)

20 cm3 Biotine 2 cm3 solution vitamine B 2 cm3 acide folique Compléter à 2000 cm3 avec eau bidistillée.

Liquide de Hanks 10 Solution mère

Acide ascorbique

Cystéine

Glutamine

Hydrolysat de caséine

R

Claims

635748 2 REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation de cellules placentaires défibrinées et lyophilisées, caractérisé en ce que:

on fragmente le placenta fœto-maternel de brebis sacrifiées à la fin du quatrième mois de gestation,

on immerge immédiatement les fragments recueillis dans du liquide de Ringer afin de les laver des traces de sang,

on divise finement lesdits fragments et les met dans une solution aqueuse trypsinée à 5%,

on laisse effectuer la digestion trypsique sous agitation, on sépare les cellules placentaires par filtration,

on lave lesdites cellules à la solution de Hanks réfrigérée, on sépare par centrifugation à basse température,

on suspend le fond obtenu à la centrifugation dans un minimum de liquide de survie, et on lyophilise la suspension jusqu'à l'obtention d'un poids constant.

2. Cellules placentaires défibrinées et lyophilisées, préparées par le procédé selon la revendication 1.