ES2629155T3

ES2629155T3 - Matrices de tejido que comprenden células madre placentarias, y métodos para su preparación

Info

Publication number: ES2629155T3
Application number: ES10183252.5T
Authority: ES
Inventors: Robert J. Hariri
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Current assignee: Clarity Acquisition II LLC
Priority date: 2001-02-14
Filing date: 2002-02-13
Publication date: 2017-08-07
Anticipated expiration: 2022-02-13
Also published as: CA2796875A1; JP2010000085A; US20200188446A1; CA2437957A1; IL157350A; JP2022022472A; IL157392A; EP1367892A4; ES2545899T3; HK1157383A1; EP1367892A1; US7311904B2; HK1059801A1; EP2338983B1; KR100973615B1; KR101132545B1; US20100260847A1; MX2017015530A; EP2316463A1; IL207024A0

Abstract

Un método de fabricación de una matriz de tejido, que comprende sembrar células madre placentarias aisladas sobre o dentro de una matriz de tejido, en donde las células madre placentarias aisladas no expresan antígenos MHC Clase 2, en donde dichas células madre placentarias son SSAE3-, SSAE4-, OCT-4+ y ABC-p +, en donde dichas células madre placentarias son obtenibles por: (a) exanguinación de una placenta; (b) perfusión de la placenta para eliminar sangre residual; (c) obtención de las células madre placentarias por perfusión de la placenta con una solución de perfusión; y (d) separación de dichas células madre placentarias de las demás células en dicha solución de perfusión por tripsinización diferencial.

Description

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DESCRIPCION

Matrices de tejido que comprenden celulas madre placentarias, y metodos para su preparacion Antecedentes de la invencion

1. Campo de la invencion

La presente invencion radica generalmente en el campo de la ingeniena tisular, y mas espedficamente es un medio para la obtencion de celulas madre para su siembra en armazones para la regeneracion o reparacion de tejido, hueso y otros organos.

2. Descripcion de la tecnica anterior

La escasez de donantes de organos humanos para trasplante es un problema creciente. A pesar de las agresivas campanas de sensibilizacion publica el numero de donantes de organos cualificados ha cambiado poco en los ultimos 20 anos mientras que la demanda ha crecido a un ritmo rapido. Ademas, el trasplante de organos alogenico esta aun asociado con una alta frecuencia de complicaciones debido al rechazo inmunologico. Los intentos de hacer frente a esta crisis han incluido el desarrollo de dispositivos de soporte de organos sinteticos ex vivo e implantables tales como dispositivos de bomba para soporte cardiaco y el uso de organos de otras especies (xenotrasplantes). El xenotrasplante que ha sido refinado para incluir el desarrollo de animales donantes quimericos todavfa sigue siendo imperfecto y estando sujeto a posibles consecuencias tales como la transmision de zoonosis.

Las celulas madre humanas son celulas precursoras totipotenciales o pluripotenciales capaces de generar una variedad de linajes celulares humanos maduros. Esta capacidad sirve como base para la diferenciacion celular y la especializacion necesaria para el desarrollo de organos y tejidos. El reciente exito en el trasplante de estas celulas madre ha proporcionado nuevas herramientas clmicas para reconstituir y/o complementar la medula osea despues de la mieloablacion debida a enfermedad, exposicion a sustancias qmmicas toxicas o radiacion. Existe una evidencia adicional que demuestra que las celulas madre pueden ser empleadas para repoblar muchos, si no todos, los tejidos y restaurar la funcionalidad fisiologica y anatomica. La evidencia hasta la fecha indica que las celulas madre multipotentes o pluripotentes estan dirigidas a diferenciarse a linajes espedficos de celulas maduras basandose en el entorno ffsico y bioqmmico en el que se liberan. Tambien existe evidencia de que estas celulas pueden migrar de tejidos normales a anormales o defectuosos y repoblar esas zonas de manera muy centrada y espedfica.

La aplicacion de celulas madre en la ingeniena tisular, la terapia genica y el tratamiento terapeutico celular tambien estan avanzando rapidamente.

Se han caracterizado muchos tipos diferentes de celulas madre de mairnferos. Por ejemplo, se conocen las celulas madre embrionarias, las celulas germinales embrionarias, las celulas madre adultas u otras celulas madre o celulas progenitoras comprometidas. Ciertas celulas madre no solo se han aislado y caracterizado, sino tambien se han cultivado en condiciones que permiten la diferenciacion en una medida limitada.

A pesar de los considerables avances realizados en el control de la diferenciacion de celulas madre a celulas y tejidos maduros, no se ha logrado el desarrollo real de la compleja arquitectura de los organos solidos. Por lo tanto, la ingeniena tisular ha prestado atencion a tejidos componentes en desarrollo y a continuacion al ensamblaje de esos componentes en estructuras utiles.

Por lo tanto es deseable proporcionar metodos para eliminar el contenido celular de los tejidos, mientras que se preserva la arquitectura de la matriz extracelular asociada a la comprension avanzada de las celulas madre, que se pueden sembrar con celulas para producir organos enteros con las caractensticas anatomicas y fisiologicas de los organos nativos.

Compendio de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo de fabricacion de una matriz de tejido, que comprende sembrar celulas madre placentarias aisladas sobre o dentro de una matriz de tejido, en donde las celulas madre placentarias aisladas no expresan antfgenos MHC clase 2, en donde dichas celulas madre placentarias son SSAE3-, SSAE4-, OCT-4+ y ABC-p+, en donde dichas celulas madre placentarias se obtienen por perfusion de una placenta mamffera con una solucion de perfusion, en donde dicha placenta ha sido exanguinada y perfundida para eliminar la sangre residual y en donde dichas celulas madre placentarias han sido separadas de otras celulas en dicha solucion de perfusion por tripsinizacion diferencial.

Ademas, la presente invencion se refiere a una matriz de tejido que comprende celulas madre placentarias humanas, que son SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ y ABC-p+.

Los organos solidos cadavericos son procesados para eliminar todos los componentes celulares vivos para conservar todavfa el armazon de la matriz extracelular subyacente en preparacion para la implantacion de celulas madre alogenicas que repueblan el armazon tridimensional del organo y restaurar la funcion anatomica y fisiologica

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normal para fines de trasplante de organos. En una realizacion preferida, las celulas se obtienen a partir de tejido placentario. El metodo para el procesamiento de organos solidos de cadaver agota selectivamente los componentes celulares del organo a la vez que preserva la arquitectura bioqmmica y tridimensional nativa de dicho organo. En el armazon del organo resultante o 'molde' se implantan despues las celulas madre multipotentes vivas de genotipo espedfico que son liberadas mediante inyeccion intraparenquimatosa o por medio del arbol vascular del organo. La liberacion de estas celulas se realiza de una manera que promueve la diferenciacion y la proliferacion de los tipos de celulas maduras normales del organo, estando guiados la distribucion y el ensamblaje celula a celula final por el armazon de la matriz extracelular. La repoblacion del armazon del organo se lleva a cabo bajo condiciones de cultivo de ambiente controlado que proporcionan la inmersion en y la perfusion con el medio de cultivo de tejidos formulado para liberar los niveles de nutrientes y metabolicos optimos necesarios para sostener el organo, a la vez que se simulan esas fuerzas biomecanicas que se encuentran in vivo. El sistema controla el estado fisiologico y metabolico del organo durante la repoblacion y la renovacion y ajusta las condiciones segun sea necesario para mantener el estado de equilibrio optimo. Los organos repoblados pueden se mantenidos a continuacion en estas condiciones de apoyo hasta el momento en que se puedan someter a ensayo y trasplantar.

La presente invencion se refiere a metodos de fabricacion de una matriz de tejido. Los metodos de la invencion abarcan el uso de celulas madre de tipo embrionario obtenidas a partir de una placenta que ha sido tratada para eliminar la sangre del cordon residual para sembrar una matriz y cultivada en las condiciones apropiadas para permitir que las celulas madre se diferencien y pueblen la matriz. Las matrices de tejido obtenidas por medio de los metodos de la invencion se pueden utilizar para una variedad de propositos, incluyendo fines de investigacion y terapeuticos.

De acuerdo con la presente invencion, las celulas madre de tipo embrionario se obtienen a partir de una placenta que se ha exanguinado y perfundido durante un penodo de al menos de dos a veinticuatro horas despues de la expulsion desde el utero para eliminar todas las celulas residuales. La placenta exanguinada se cultiva a continuacion en las condiciones apropiadas para permitir la produccion de celulas madre endogenas procedentes de la placenta.

Los metodos de la presente invencion se refieren al uso de celulas madre de tipo embrionario que se han originado a partir de una placenta para sembrar una matriz. Una vez obtenidas a partir de una placenta cultivada, las celulas madre de tipo embrionario se pueden caracterizar mediante varios metodos, incluyendo pero no limitados a, inmunoqmmica, y la presencia de marcadores de superficie celular concretos. Las celulas madre preferidas para ser utilizadas de acuerdo con la presente invencion pueden ser identificadas por la presencia de los siguientes marcadores de superficie celular: CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y APC-p+.

De acuerdo con los metodos de la presente invencion, las celulas madre se pueden diferenciar a linajes celulares espedficos, incluyendo los linajes adipogenico, condrogenico, osteogenico, neurogenico y hepatogenico. En otra realizacion de la invencion, puede ser preferible estimular la diferenciacion de celulas madre de tipo embrionario a un linaje concreto, antes de la siembra de las celulas en una matriz concreta. De acuerdo con esta realizacion, las placentas cultivadas se pueden estimular para producir celulas de un linaje concreto, mediante la introduccion en la placenta de celulas o tejidos exogenos del linaje deseado. Por ejemplo, antes de la siembra de celulas madre de tipo embrionario en una matriz u organo descelularizado para la propagacion y el crecimiento en el tejido del hngado, la placenta cultivada puede ser estimulada para producir celulas madre hepatogenicas mediante la introduccion de celulas o tejidos hepatogenicos exogenos en la placenta.

La presente descripcion tambien describe el uso de la placenta cultivada como biorreactor para estimular la propagacion de las celulas madre de tipo embrionario de un linaje concreto. Por ejemplo, la placenta cultivada se puede estimular para producir celulas madre de tipo embrionario que se han destinado a un linaje concreto, incluyendo, pero no limitado a, linajes adipogenico, condrogenico, osteogenico, neurogenico y hepatogenico. De acuerdo con este aspecto de la descripcion, la placenta cultivada se puede estimular para producir celulas de un linaje concreto, mediante la exposicion de la placenta cultivadas a celulas o tejidos exogenos del linaje deseado.

A modo de ejemplo, y no a modo de limitacion, con el fin de generar celulas de un linaje hepatico, la placenta se puede exponer a celulas de hngado. De acuerdo con esta realizacion, las celulas de hngado se introducen en la placenta por medio de varios metodos, incluyendo la inyeccion de las celulas del hngado en forma de una suspension de celulas individuales o en forma de islas de celulas en la vasculatura o directamente en la placenta. Despues de la introduccion de las celulas del hngado, la placenta se perfundina de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria para permitir la recuperacion de las celulas madre hepaticas a partir de la placenta.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es una vista en seccion transversal de la canulacion de la vena y la arteria de una placenta para perfundir la placenta y despues recoger el perfusato.

Las Figuras 2a-e son diagramas esquematicos que muestran la recogida, la fijacion, la perfusion, la recogida y el almacenamiento de una placenta drenada y perfundida.

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La Figura 3 es una seccion transversal esquematica de una placenta perfundida en un dispositivo para su uso como biorreactor.

La Figura 4 es un esquema de seleccion para la clasificacion de celulas recuperadas de una placenta perfundida. Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo de fabricacion de una matriz de tejido, que comprende sembrar celulas madre placentarias aisladas sobre o dentro de una matriz de tejido, en donde las celulas madre placentarias aisladas no expresan antfgenos MHC clase 2, en donde dichas celulas madre placentarias son SSAE3-, SSAE4-, OCT-4+ y ABC-p+, en donde dichas celulas madre placentarias se obtienen por perfusion de una placenta mairnfera con una solucion de perfusion, en donde dicha placenta ha sido exanguinada y perfundida para eliminar la sangre residual y en donde dichas celulas madre placentarias han sido separadas de otras celulas en dicha solucion de perfusion por tripsinizacion diferencial.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "biorreactor" se refiere a un sistema ex vivo para la propagacion de celulas, la produccion o expresion de materiales biologicos y el desarrollo o cultivo de celulas, tejidos, organoides, virus y microorganismos.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "celula madre embrionaria" se refiere a una celula que deriva de la masa celular interna de un blastocisto (p. ej., un embrion humano de 4 a 5 dfas de edad) y que es pluripotente.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "celula madre de tipo embrionario" se refiere a una celula que no deriva de la masa celular interna de un blastocisto. Segun se utiliza en la presente memoria, una "celula madre de tipo embrionario" tambien puede ser referida como "celula madre de la placenta". Una celula madre de tipo embrionario, sin embargo, puede ser una celula pluripotente, una celula multipotente, o una celula progenitora comprometida. De acuerdo con los metodos de la invencion, las celulas madre de tipo embrionario derivadas de la placenta se pueden recoger a partir de la placenta aislada una vez que se ha exanguinado y perfundido durante un penodo de tiempo suficiente para eliminar las celulas residuales.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "exanguinado" o "exanguinacion," cuando se utiliza con respecto a la placenta, se refiere a la eliminacion y/o drenaje de sustancialmente toda la sangre del cordon de la placenta. De acuerdo con la presente invencion, la exanguinacion de la placenta se puede lograr, por ejemplo, pero no a modo de limitacion, mediante drenaje, flujo de salida inducido por gravedad, masaje, compresion, bombeo, etc. La exanguinacion de la placenta se puede lograr adicionalmente mediante perfusion, aclarado o lavado de la placenta con un fluido que puede contener o no agentes, tales como anticoagulantes, para ayudar a la exanguinacion de la placenta.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "perfundir" o "perfusion" se refiere al acto de verter o hacer pasar un fluido sobre o a traves de un organo o tejido, preferiblemente el paso de fluido a traves de un organo o tejido con la fuerza o presion suficientes para eliminar cualquier celula residual, p. ej., celulas no ancladas procedentes del organo o tejido. Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "perfusato" se refiere al fluido recogido despues de su paso a traves de un organo o tejido.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "celula exogena" se refiere a una celula "foranea", es decir, una celula heterologa (es decir, una celula "no propia" derivada de una fuente que no sea el donante de la placenta) o una celula autologas (es decir, una celula "propia" derivada del donante de la placenta) que deriva de un organo o tejido distinto de la placenta.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "organoide" se refiere a una agregacion de uno o mas tipos de celulas reunidas en el aspecto superficial o en estructura real como cualquier organo o glandula de un organismo de marnffero, preferiblemente el cuerpo humano.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "celula multipotente" se refiere a una celula que tiene la capacidad de crecer en cualquier subconjunto de los aproximadamente 260 tipos de celulas del organismo de un mam^era. A diferencia de una celula pluripotente, una celula multipotente no tiene la capacidad de formar todos los tipos celulares.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "celula pluripotente" se refiere a una celula que tiene una versatilidad de diferenciacion completa, es decir, la capacidad de crecer en cualquiera de los aproximadamente 260 tipos de celulas del organismo de un mamffero. Una celula pluripotente puede ser auto-renovable, y puede permanecer latente o quiescente dentro de un tejido. A diferencia de una celula totipotente (por ejemplo, un ovulo fertilizado diploide), una celula madre embrionaria no puede formar normalmente un nuevo blastocisto.

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Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "celula progenitora" se refiere a una celula que esta destinada a diferenciarse en un tipo espedfico de celula o a formar un tipo espedfico de tejido.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "celula madre" se refiere a una celula maestra que puede reproducirse indefinidamente para formar las celulas especializadas de los tejidos y organos. Una celula madre es una celula evolutivamente pluripotente o multipotente. Una celula madre se puede dividir para producir dos celulas madre hijas, o una celula madre hija y una celula progenitora ("transitoria"), que a continuacion prolifera en las celulas del tejido maduro, totalmente formadas.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "celula totipotente" se refiere a una celula que es capaz de formar un embrion completo (p. ej., un blastocisto).

I. Matrices de tejido

Matrices de tejido descelularizadas

Una matriz de tejido xenogenico (o alogenico) se procesa para eliminar las celulas nativas y otros antigenos y restos celulares de la matriz de tejido descelularizada, y, opcionalmente, se trata para inhibir la generacion de nuevos sitios inmunologicos. Opcionalmente, esta matriz de tejido se puede tratar a continuacion con los factores de adherencia celular que se describen a continuacion para mejorar la union de las celulas a la matriz durante el proceso de repoblacion de la matriz de tejido con tales celulas nuevas. Se pueden obtener diferentes propiedades de la matriz resultante a traves de la seleccion de tipos de celulas utilizadas para la repoblacion de las matrices de tejido naturales, tales como la capacidad de sintetizar protemas de otro modo atfpica para el tejido natural en el sitio de implantacion o unica para ciertos grupos de edad. Estos injertos dbridos combinan las ventajas estructurales de injertos bioprotesicos con las capacidades funcionales y de regeneracion de los aloinjertos, asf como muestran una respuesta inmunitaria atenuada o nula, una propension limitada a la calcificacion, y una pequena estimulacion de tromboembolia.

Dependiendo del tipo de trasplante propuesto, si el destinatario es humano, el tejido u organo de trasplante inicial puede ser de origen no humano. Estos tejidos u organos se pueden obtener en mataderos autorizados de animales aptos para el consumo humano o de rebanos de animales domesticos mantenidos con el fin de proporcionar estos tejidos u organos. Los tejidos u organos se manipulan de una manera esteril, y cualquier diseccion adicional del tejido u organo se lleva a cabo bajo condiciones asepticas.

Despues de la recogida y la diseccion, este tejido puede ser esterilizado mediante la incubacion en una solucion de nutrientes tamponada esteril que contiene agentes antimicrobianos, por ejemplo, un antibacteriano, un antifungico, o un esterilizante compatible con el trasplante de tejidos. El tejido de trasplante esterilizado puede ser crioconservado a continuacion para su procesamiento adicional en un momento posterior o puede ser procesado adicionalmente de manera inmediata de acuerdo con las siguientes etapas de este proceso que incluyen una crioconservacion posterior de la matriz de tejido u otros productos tisulares del proceso.

En primer lugar el tejido se descelulariza. Se eliminan las celulas viables nativas, asf como otras estructuras o componentes celulares y acelulares que pueden provocar una respuesta inmunitaria adversa en el receptor del implante. Se conocen varios medios de reduccion de la viabilidad de las celulas nativas en tejidos y organos, incluyendo metodos ffsicos, qrnmicos, y bioqmmicos. Vease, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Num. 5.192.312 (Orton). Tales metodos pueden ser empleados de acuerdo con el procedimiento descrito en el presente documento. Sin embargo, la tecnica de descelularizacion empleada no debe dar como resultado la desorganizacion grosera de la anatoirna del trasplante de tejidos o alterar sustancialmente las propiedades biomecanicas de sus elementos estructurales. El tratamiento del tejido para producir una matriz de tejido descelularizada tampoco debe dejar un entorno de citotoxico que mitigue la posterior repoblacion de la matriz con celulas que son alogenicas o autologas para el receptor. Las celulas y los tejidos que son alogenicos para el receptor son aquellas que se originan con o se derivan de un donante de la misma especie que el receptor. Las celulas o tejidos autologos son aquellos que se originan con o derivan del receptor.

Se pueden utilizar fuerzas ffsicas, por ejemplo la formacion de hielo intracelular, para descelularizar tejidos para trasplante. Por ejemplo, la congelacion de la fase de vapor (baja tasa de disminucion de la temperatura) de las valvulas cardfacas intactas puede reducir la celularidad de las valvas de la valvula cardiaca en comparacion con la congelacion de la fase lfquida (rapida). Sin embargo, los procesos de congelacion lenta, en ausencia de crioprotector, pueden dar como resultado una desorganizacion del tejido tal como la rotura de los conductos de las valvulas cardfacas. Se pueden anadir materiales formadores de coloides durante los ciclos de congelacion- descongelacion para alterar los patrones de formacion de hielo en el tejido. Se puede anadir polivinilpirrolidona (10% p/v) e hidroxietilalmidon sometido a dialisis (10% p/v) a las disoluciones de crioconservacion convencionales (DMEM, DMSO al 10%, suero bovino fetal al 10%) para reducir la formacion de hielo extracelular permitiendo al mismo tiempo la formacion de hielo intracelular. Esto permite una medicion de la descelularizacion mientras que proporciona a la matriz de tejido cierta e proteccion frente al dano por el hielo.

Alternativamente, se pueden utilizar diversos tratamientos enzimaticos o qrnmicos de otro tipo para eliminar las celulas nativas viables a partir de tejidos u organos de implantes. Por ejemplo, la exposicion prolongada de las

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celulas a proteasas tales como la tripsina dan como resultado la muerte celular. Sin embargo, debido a que al menos una porcion de la molecula de colageno de tipo I es sensible a una variedad de proteasas, incluyendo la tripsina, este no puede ser el enfoque de eleccion para injertos de colageno destinados al implante en lugares de alto estres mecanico.

Las combinaciones de diferentes clases de detergentes, p. ej., un detergente no ionico, Triton X-100, y un detergente anionico, dodecilsulfato de sodio, pueden romper las membranas celulares y ayudar a la eliminacion de restos celulares del tejido. Sin embargo, se deben tomar medidas para eliminar cualquier nivel de detergentes residuales en la matriz de tejido, con el fin de evitar la interferencia con la repoblacion posterior de la matriz de tejido con celulas viables.

La descelularizacion del tejido de trasplante se realiza preferiblemente mediante la administracion de una disolucion eficaz para lisar las celulas nativas en el tejido de trasplante. Preferiblemente, la disolucion es una disolucion hipotonica acuosa o de fuerza ionica baja formulada para lisar eficazmente las celulas de los tejidos nativos. Tal disolucion hipotonica acuosa puede ser agua desionizada o un tampon hipotonico acuoso. Preferiblemente, el tampon hipotonico acuoso puede contener aditivos que proporcionan condiciones sub-optimas para la actividad de las proteasas seleccionadas, por ejemplo colagenasa, que puede ser liberada como resultado de la lisis celular. Aditivos tales como los quelantes de iones metalicos, por ejemplo, 1,10-fenantrolina y acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), crean un ambiente desfavorable para muchas enzimas proteoltticas. Proporcionar condiciones sub-optimas para proteasas tales como la colagenasa, puede ayudar a la proteccion de la matriz de tejido de la degradacion durante la etapa de lisis. Se pueden lograr condiciones suboptimas para las proteasas mediante la formulacion de la disolucion de lisis hipotonica para eliminar o limitar la cantidad de iones de calcio y zinc disponibles en la disolucion. Muchas proteasas son activas en presencia de iones de calcio y de zinc y pierden gran parte de su actividad en entornos libres de iones de calcio y de zinc. Preferiblemente, la disolucion de lisis hipotonica se preparara seleccionando las condiciones de pH, la reduccion de la disponibilidad de iones de calcio y de zinc, la presencia de quelantes de iones metalicos y el uso de inhibidores proteolfticos espedfico para la colagenasa de manera que la disolucion lise de manera optima las celulas nativas a la vez que protege la matriz de tejido subyacente de la degradacion proteolttica adversa. Por ejemplo una disolucion de lisis hipotonica puede incluir una disolucion de agua tamponada, pH 5,5 a 8, preferiblemente de pH 7 a 8, libre de iones de calcio y de zinc y que incluya un quelante de iones metalicos tal como EDTA. Adicionalmente, tambien se puede emplear el control de los parametros de temperatura y tiempo durante el tratamiento de la matriz de tejido con la disolucion de lisis hipotonica, para limitar la actividad de las proteasas.

Se prefiere que el tratamiento de descelularizacion de la matriz de tejido tambien limite la generacion de nuevos sitios inmunologicos. Si bien el colageno es tfpicamente sustancialmente no inmunogenico, la degradacion enzimatica parcial de colageno puede conducir a un aumento de la inmunogenicidad. Por consiguiente, una etapa preferible de este proceso incluye el tratamiento del tejido con enzimas, tales como nucleasas, eficaces para inhibir el metabolismo celular, la produccion de protemas y la division celular sin degradar la matriz de colageno subyacente. Las nucleasas que se pueden utilizar para la digestion del ADN y ARN de la celula nativa incluyen tanto exonucleasas como endonucleasas. Una amplia variedad de las cuales es adecuada para uso en esta etapa del procedimiento y esta disponible comercialmente. Por ejemplo, las exonucleasas que inhiben eficazmente la actividad celular incluyen ADNasa I (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) y ARNasa A (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) y las endonucleasas que inhiben eficazmente la actividad celular incluyen EcoR I (SIGMA Chemical Company, St. Louis, MO) y Hind III (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO).

Es preferible que las nucleasas seleccionadas sean aplicadas en una disolucion de tampon fisiologico que contenga iones que sean optimos para la actividad de la nucleasa. Tales iones incluyen sales de magnesio y calcio. Tambien se prefiere que la concentracion ionica de la disolucion tamponada, la temperatura de tratamiento y la duracion del tratamiento se seleccionen para asegurar el nivel deseado de actividad nucleasa eficaz. El tampon es preferiblemente hipotonico para promover el acceso de las nucleasas al interior de las celulas del pavimento. Para el tratamiento de las celulas endoteliales endogenas del tejido de las valvulas cardfacas no humanas, concretamente las valvulas de origen porcino o bovino, el tejido se trata preferiblemente con un medio tamponado fisiologicamente compuesto por las nucleasas ADNasa I y ARNasa A. Preferiblemente, la disolucion de degradacion de nucleasa contiene aproximadamente de 0,1 microgramos/ml a 50 microgramos/ml, preferiblemente 10 microgramos/ml, de la nucleasa ADNasa I, y de 0,1 microgramos/ml a 10 microgramos/ml, preferiblemente 1,0 microgramos/ml, de ARNasa A. El tejido puede ser descelularizado por medio de la aplicacion de lo anterior a una temperatura de aproximadamente 20°C a 38°C, preferiblemente a aproximadamente 37°C (Centfgrados), durante aproximadamente 30 minutos a 6 horas, mientras que al mismo tiempo la generacion de nuevos sitios inmunologicos como resultado de la degradacion del colageno es limitada.

Otras digestiones enzimaticas pueden ser adecuadas para su uso en la presente memoria, por ejemplo, se pueden utilizar enzimas que interrumpan la funcion de las celulas nativas en un tejido de trasplante. Por ejemplo, se puede utilizar fosfolipasa, particularmente fosfolipasas A o C, en una disolucion tamponada, para inhibir la funcion celular rompiendo las membranas celulares de las celulas endogenas. Preferiblemente, la enzima empleada no debe tener un efecto perjudicial sobre las protemas de la matriz de tejido. Las enzimas adecuadas para su uso tambien se pueden seleccionar con respecto a la inhibicion de la integridad celular, y tambien incluyen enzimas que pueden interferir en la produccion de protema celular. El pH del vehmulo, asf como la composicion del vehmulo, tambien se

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ajustaran con respecto al perfil de actividad de pH de la enzima elegida para su uso. Por otra parte, la temperatura aplicada durante la aplicacion de la enzima al tejido se debe ajustar con el fin de optimizar la actividad enzimatica.

Despues de la descelularizacion, la matriz de tejido se lava para garantizar la eliminacion de los restos celulares que pueden incluir la protema celular, los lfpidos celulares, y acido nucleico celular, asf como cualquier resto extracelular tal como protemas solubles, Kpidos y proteoglicanos extracelulares. La eliminacion de estos restos celulares y extracelulares reduce la probabilidad de que la matriz de tejido de trasplante provoque una respuesta inmunitaria adversa del receptor en el momento del implante. Por ejemplo, el tejido se puede incubar en una disolucion salina equilibrada tal como Solucion Salina Equilibrada de Hanks (HBSS). La composicion del lavado con solucion salina equilibrada, y las condiciones en que se aplica a la matriz de tejido de trasplante se pueden seleccionar para disminuir o eliminar la actividad de la nucleasa u otra enzima utilizada durante el proceso de descelularizacion. Tal disolucion de lavado salina equilibrada no contendna preferiblemente sales de magnesio o de calcio, y el proceso de lavado puede incluir una incubacion a una temperatura de entre aproximadamente 2°C y 42°C, siendo lo mas preferible 4°C. La matriz de tejido de trasplante se puede incubar en la disolucion de lavado salina equilibrada durante un maximo de 10 a 12 dfas, con cambios en la disolucion de lavado cada segundo o tercer dfa. Opcionalmente, se puede incluir un agente antibacteriano, un antifungico o un esterilizante o una combinacion de los mismos, en la disolucion de lavado salina equilibrada para proteger la matriz de tejido de trasplante de la contaminacion con patogenos ambientales.

La matriz de tejido se puede conservar mediante crioconservacion. Los mecanismos de crioconservacion de tejidos son bien conocidos en la tecnica. Brockbank, K.G.M. Basic Principles of Viable Tissue Preservation. En: Transplantation Techniques and Use of Cryopreserved Allograft Caediac Valves and Vascular Tissue. D.R. Clarke (ed.), Adams Publishing Group, Ltd., Boston. pags. 9-23, comenta la crioconservacion de tejidos y organos.

La matriz de tejido, haya sido o no crioconservada, se puede tratar a continuacion para mejorar la adherencia y la migracion hacia el interior de las celulas alogenicas o autologas, in vitro, que se utilizara para repoblar el tejido de trasplante.

El grado de anclaje se incrementa mediante la adicion de suero (humano o bovino fetal, de union maxima con suero al 1%) y de fibronectina purificada al medio de cultivo. Cada una de las dos subunidades homologas de fibronectina tiene dos regiones de reconocimiento celular, la mas importante de las cuales tiene la secuencia Arg-Gly-Asp (RGD). Un segundo sitio, que se une a glicosaminoglicanos, actua de forma sinergica y parece estabilizar las interacciones celula-fibronectina mediadas por la secuencia RGD. El sulfato de heparina junto con el sulfato de condroitina son los dos glicosaminoglicanos identificados en las superficies celulares. El sulfato de heparina esta ligado a las protemas del nucleo (sindecano o hialuronectina) que pueden ser integrantes o abarcar la membrana. Los sitios de union celular para las glicoprotemas de la matriz extracelular se denominan integrinas y estas median la union fuerte de las celulas a los factores de adherencia. Cada factor de adhesion parece tener una integrina especializada aunque una sola integrina puede unirse a varios factores de la matriz extracelular. Los fibroblastos, cuando se adhieren a una fibronectina intacta (dominios celulares y de union a heparina) muestran una morfologfa contrafda con adherencias focales. Sin el dominio de union a la heparina, los fibroblastos se extenderan pero no lograran desarrollar adherencias focales.

Otro metodo por medio del cual se mejora el anclaje de la celula a la matriz es mediante incubacion de la matriz de tejido descelularizada en una disolucion nutriente que contiene protemas de la matriz extracelular, tales como fibronectina y un glicosaminoglicano durante un penodo eficaz para la union de la fibronectina a las superficies de la matriz de tejido de trasplante que se va a repoblar. Los tampones preferidos para su uso con fibronectina/glicosaminoglicano incluyen fosfato de sodio/glicerina/albumina de suero bovino (Suero Bovino Fetal, BIO Whittaker) y Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), (Gibco). Estos tampones se utilizan tfpicamente para proporcionar un pH fisiologicamente aceptable de aproximadamente 7,0 a 7,6. La presencia de las protemas de la matriz extracelular establece una superficie sobre la matriz de tejido a la que se adhieren las celulas que han sido elegidas para repoblar la matriz. El estfmulo de la protema de la matriz extracelular promueve la repoblacion de celulas en el injerto. Una fuente de fibronectina es a partir de sangre humana, procesada para limitar la contaminacion con virus. El glicosaminoglicano preferido es la heparina. La concentracion de glicoprotema utilizada como factor de adherencia para el tratamiento de la matriz de tejido puede variar de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 microgramos/ml, prefiriendose una concentracion de fibronectina de 10 microgramos/ml. La razon en peso preferida de fibronectina a heparina es de aproximadamente 10 partes de fibronectina a aproximadamente 1 parte de glicosaminoglicano, p. ej., heparina. Esto es optimo para la repoblacion de valvas de la valvula cardfaca porcina, pero puede variar de aproximadamente 0,1:1 a aproximadamente 10:0,1 dependiendo del tejido utilizado.

Se puede emplear una variedad de sustancias para mejorar la quimiotaxis celular, aumentando la tasa de movimiento direccional a lo largo de un gradiente de concentracion de la sustancia en disolucion. Con respecto a las celulas fibroblasticas, el factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de crecimiento transformante beta, y las moleculas de adherencia al sustrato, los colagenos fibrilares, los fragmentos de colageno, y la fibronectina son quimiotacticos para los fibroblastos. En contraste con la adherencia celular, la migracion de fibroblastos requiere la smtesis de protema de novo; la smtesis de protemas en celulas

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fibroblasticas normales es estimulada por la adherencia de las celulas a la fibronectina, por lo que se cree que los procesos de adherencia celular y migracion celular durante la repoblacion estan relacionados entre sf

Matrices de tejido sinteticas

Las matrices de tejido tambien se pueden formar de materiales sinteticos o naturales, tales como colageno o polilactida-co-glicolido. Se conocen varios de estos materiales. Por ejemplo, un metodo para la formacion de piel artificial mediante la siembra de una red fibrosa con celulas epidermicas se describe en la Patente de los Estados Unidos Num. 4.485.097 (Bell), que describe una red de colageno hidratada que, combinada con agentes contractiles tales como plaquetas y fibroblastos y celulas tales como queratinocitos, se utiliza para producir una sustancia similar a la piel. La Patente de los Estados Unidos Num. 4.060.081 (Yannas et al.) describe una membrana de multiples capas para su uso como piel sintetica que se forma a partir de un material de colageno modificado insoluble que es degradable muy lentamente en presencia de fluidos corporales y enzimas. La Patente de los Estados Unidos Num. 4.458.678 (Yannas et al.) describe un procedimiento para la fabricacion de un material similar a la piel en el que una red fibrosa biodegradable formada a partir de colageno entrecruzado con glucosaminoglucano se siembra con celulas epidermicas.

La Patente de los Estados Unidos Num. 4.520.821 (Schmidt) describe un enfoque similar para elaborar revestimiento para reparar defectos en el tracto urinario. Las celulas epiteliales se implantan sobre la superficie de una matriz polimerica sintetica impermeable a los lfquidos donde forman un revestimiento monocapa sobre la matriz.

Vacanti, et al., "Selective Cell Trasplantation Using Bioabsorbable Artificial Polymers as Matrices", J. Pediat. Surg. 23, 3-9 (1988) y Vacanti, "Beyond Trasplantation" Arch. Surg. 123, 545-549 (1988), describen un enfoque para la fabricacion de nuevos organos para el trasplante. Vacanti, et al., reconocieron que las celulas requieren una matriz para el anclaje y soporte si han de sobrevivir despues de la implantacion, que era esencial un numero mmimo de celulas para la funcion in vivo, y que la matriz debe ser suficientemente porosa para permitir que los nutrientes y gases alcancen todas las celulas sobre y dentro de la matriz por difusion, hasta que la estructura de celulas de la matriz se vascularice. Informan de que existen ventajas en la utilizacion de sustratos de polfmeros sinteticos biodegradables para formar un armazon que imita sus contrapartes naturales, las matrices extracelulares (MEC) del organismo, que sirven como soporte ffsico y como sustrato adherente para las celulas parenquimatosas aisladas durante el cultivo in vitro, y la posterior implantacion, degradandose a medida que las celulas comienzan a secretar su propio soporte MEC. Estas matrices tambien se han implantado y sembrado directamente, para formar nuevos tejidos.

II. Celulas que se sembraron sobre/dentro de los tejidos descelularizados

Las celulas madre humanas son celulas precursoras totipotenciales o pluripotenciales capaces de generar una variedad de linajes celulares humanos maduros. Esta capacidad sirve como base para la diferenciacion y la especializacion celulares necesarias para el desarrollo de organos y tejidos. El reciente exito en el trasplante de estas celulas madre ha proporcionado nuevas herramientas clmicas para reconstituir y/o complementar la medula osea despues mieloablacion debida a la enfermedad, exposicion a agentes qmmicos toxicos o radiacion. Existe una evidencia adicional que demuestra que las celulas madre se pueden emplear para repoblar muchos, si no todos, los tejidos y restaurar su funcionalidad fisiologica y anatomica. La aplicacion de celulas madre a la ingeniena de tejidos, la administracion de terapia genica y la terapia celular tambien esta avanzando rapidamente.

La obtencion de suficientes celulas madre humanas ha sido problematica por varias razones. En primer lugar, el aislamiento de las poblaciones de celulas madre de origen natural en tejidos adultos ha resultado tecnicamente diffcil, costoso y muy limitado en cantidad. En segundo lugar, la adquisicion de estas celulas a partir de embriones o de tejido fetal incluyendo abortos ha planteado muchas preocupaciones eticas y morales. La creencia generalizada de que el embrion y el feto humanos constituyen una vida independiente ha justificado una moratoria en el uso de tales fuentes para cualquier proposito. Las fuentes alternativas que no violan la inviolabilidad de la vida independiente son fundamentales para seguir avanzando en el uso de celulas madre clmicamente.

La sangre de cordon umbilical (sangre de cordon) es una fuente conocida de celulas madre progenitoras pluripotentes hematopoyeticas, que son crioconservados para su uso en la reconstitucion hematopoyetica. El uso de sangre de cordon para este proposito es bien conocido y se esta convirtiendo en un procedimiento terapeutico ampliamente utilizado. La tecnica convencional para la recoleccion de la sangre de cordon se basa en el uso de una aguja o canula que se utiliza con la ayuda de la gravedad para drenar la sangre del cordon umbilical de la placenta. Por lo general, la aguja o canula se coloca en la vena umbilical y la placenta se masajea suavemente para ayudar al drenaje de la sangre del cordon procedente de la placenta.

El solicitante ha descubierto de forma inesperada que la placenta despues del nacimiento contiene celulas quiescentes que se pueden activar si la placenta se procesa apropiadamente despues del nacimiento. Por ejemplo, despues de la expulsion del utero, la placenta se exanguina lo mas rapidamente posible para evitar o reducir al mmimo la apoptosis. Posteriormente, tan pronto como sea posible despues de la exanguinacion la placenta se perfunde para eliminar la sangre, las celulas residuales, las protemas, los factores y cualquier otro material presentes en el organo. La perfusion continua normalmente con producto de perfusion adecuado durante al menos

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dos a mas de veinticuatro horas. En varias realizaciones adicionales la placenta se somete a perfusion durante al menos 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, y 22 horas. En otras palabras, esta invencion se basa al menos en parte en el descubrimiento de que las celulas de la placenta despues del parto se pueden activar por exanguinacion y la perfusion durante un penodo de tiempo suficiente. Por lo tanto, la placenta se puede utilizar facilmente como fuente rica y abundante de celulas madre placentarias humanas, cuyas celulas se pueden utilizar para la investigacion, incluyendo el descubrimiento de farmacos, el tratamiento y la prevencion de enfermedades, en particular cirugfas o terapias de trasplante, y en la generacion de celulas, tejidos y organoides comprometidos.

Adicionalmente, de manera sorprendente e inesperada las celulas madre placentarias humanas producidas por la placenta exanguinada, perfundida y/o cultivada son celulas madre pluripotentes que se pueden diferenciar facilmente a cualquier tipo de celula deseado.

Se describen aqrn metodos de tratamiento y cultivo de una placenta aislada para su uso como biorreactor para la produccion y propagacion de celulas madre de tipo embrionario que se originan a partir de la placenta o de fuentes exogenas. Ademas, se describe aqrn el uso de una placenta cultivada como biorreactor para producir materiales biologicos, incluyendo, pero no limitados a, anticuerpos, hormonas, citocinas, y factores de crecimiento. Tambien se describen aqrn metodos de recoleccion y aislamiento de celulas madre y materiales biologicos procedentes de la placenta cultivada.

El metodo de la presente invencion implica perfundir y exanguinar de una placenta aislada una vez que esta ha sido eliminada del utero, para eliminar todas las celulas residuales. Tambien se describe aqrn el cultivo de la placenta aislada y exanguinada en las condiciones adecuadas para permitir la produccion y propagacion de celulas madre de tipo embrionarios.

El metodo de la presente invencion implica extraer y recuperar celulas madre de tipo embrionario incluyendo, pero no limitadas a celulas madre pluripotentes o multipotentes, de una placenta humana exanguinada. Las celulas madre de tipo embrionario tienen las caractensticas de las celulas madre embrionarias, pero derivan del embrion. Tales celulas son tan versatiles (p. ej., pluripotentes) como las celulas madre embrionarias humanas. De acuerdo con los metodos de la invencion, la placenta humana se utiliza despues del nacimiento como fuente de celulas madre de tipo embrionario.

De acuerdo con los metodos de la invencion las celulas madre de tipo embrionario se extraen de una placenta drenada por medio de una tecnica de perfusion que utiliza cualquiera o ambas de la arteria umbilical y la vena umbilical. La placenta se drena preferiblemente mediante exanguinacion y recogida de sangre residual (p. ej., sangre residual de cordon umbilical). La placenta drenada se procesa a continuacion de tal manera que se establece un entorno de biorreactor natural, ex vivo en el que se reclutan celulas madre de tipo embrionario residentes dentro del parenquima y el espacio extravascular. Las celulas madre de tipo embrionario migran hacia la microcirculacion drenada, vacfa donde, de acuerdo con los metodos de la invencion, se recogen, preferiblemente mediante lavado en un recipiente de recogida mediante perfusion.

Metodos de aislamiento y cultivo de placenta

A continuacion se describe, entre otras cosas, el metodo de recoleccion de las celulas madre de la placenta y otras celulas madre multipotentes a partir de una placenta. El presente solicitante describe este metodo en detalle en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos pendiente del solicitante con el Num. de Serie 10/004.942, presentada el 5 de Diciembre de 2001, que reivindica prioridad sobre la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos Num. 60/251.900, presentada el 6 de Diciembre de 2000, y referida a la solicitud de patente estadounidense pendiente con el numero de serie 10/004.942 que se hace referencia en esta solicitud.

Pretratamiento de la placenta

De acuerdo con los metodos de la invencion, una placenta (por ejemplo, una placenta humana) se recupera poco despues de su expulsion despues del nacimiento y, en ciertos aspectos descritos aqrn, se recupera la sangre del cordon en la placenta. En ciertos aspectos descritos aqrn, la placenta se somete a un proceso de recuperacion de sangre de cordon convencional. Dicha recuperacion de sangre de cordon se puede obtener comercialmente, tal como por ejemplo Lifebank Services, Bethesda, MD. La sangre del cordon puede ser drenada poco despues de la expulsion de la placenta. Alternativamente, la placenta se puede almacenar, preferiblemente durante no mas de 48 horas, antes de la recogida de sangre del cordon.

La placenta se recupera preferiblemente despues de la expulsion en condiciones asepticas, y se almacena en una solucion anticoagulante a una temperatura de 5 a 25 grados C (centfgrados). La soluciones anticoagulantes adecuadas son bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, se puede utilizar una solucion de heparina o warfarina sodica. En una realizacion preferida, la solucion anticoagulante comprende una solucion de heparina (1% p/p en una disolucion 1:1000). La placenta drenada se almacena preferiblemente durante no mas de 36 horas antes de recoger las celulas madre de tipo embrionario. La disolucion que se utiliza para perfundir la placenta para eliminar las celulas residuales puede ser la misma disolucion utilizada para perfundir y cultivar la placenta para la recuperacion de las celulas madre. Cualquiera de estos perfusatos puede ser recogido y utilizado como fuente de celulas madre de tipo embrionario.

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En ciertas realizaciones, el cordon umbilical proximal se pinza, preferiblemente a 4-5 cm (centimetre) de la insercion en el disco placentario antes de la recuperacion de la sangre del cordon. En otras realizaciones, el cordon umbilical proximal se pinza despues de la recuperacion de la sangre del cordon, pero antes del procesamiento adicional de la placenta.

Se pueden utilizar tecnicas convencionales para la recogida de sangre del cordon. Tfpicamente se utiliza una aguja o canula, con la ayuda de la gravedad, para drenar la sangre del cordon desde (es dear, exanguinar) la placenta (Boyse et al., Patente de los Estados Unidos Num. 5.192.553, expedida el 9 de Marzo de 1993; Anderson, Patente de los Estados Unidos Num. 5.372.581, titulada Metodo y aparato para la recogida de sangre placentaria, expedida el 13 de diciembre 1994; Hessel et al., Patente de los Estados Unidos Num. 5.415.665, titulada Dispositivo y metodo de pinzamiento, corte, y recoleccion de sangre del cordon umbilical, expedida el 16 de Mayo de 1995). La aguja o canula se colocan generalmente en la vena umbilical y la placenta se masajea suavemente para ayudar al drenaje de sangre del cordon procedente de la placenta.

Tfpicamente, la placenta se transporta desde la sala de partos o nacimientos a otra ubicacion, p. ej., un laboratorio, para la recuperacion de la sangre del cordon y/o el drenaje y perfusion. La placenta se transporta preferiblemente en un dispositivo de transporte esteril, aislado termicamente (manteniendo la temperatura de la placenta entre 20- 28°C), por ejemplo, mediante la colocacion de la placenta, con el cordon umbilical proximal pinzado, en una bolsa de plastico con cierre de cremallera esteril, que despues se coloca en un recipiente aislado, como se muestra en las Figuras 2a-e.

En una realizacion preferida, la placenta se recupera de un paciente mediante consentimiento informado y tambien se toma la historia medica completa del paciente antes, durante y despues del embarazo y se asocia con la placenta. Estos registros medicos se pueden utilizar para coordinar el uso subsiguiente de la placenta o de las celulas madre obtenidas de la misma. Por ejemplo, las celulas madre placentarias humanas se puede utilizar a continuacion facilmente para la medicina personalizada para el nino en cuestion, los padres, hermanos u otros parientes. De hecho, las celulas madre placentarias humanas son mas versatiles que la sangre del cordon. Sin embargo, hay que observar que la invencion incluye la adicion de las celulas madre placentarias humanas producidas por la placenta exanguinada, perfundida y/o cultivada a sangre de cordon de la misma o diferente placenta y cordon umbilical. La sangre del cordon resultante tendra un aumento de concentracion/poblacion de celulas madre humanas y por lo tanto es mas util para el trasplante p. ej., en los trasplantes de medula osea.

Exanguinacion de la placenta y eliminacion de celulas residuales

La invencion incluye la recuperacion de las celulas madre o progenitoras, que incluyen, pero no estan limitadas a celulas madre de tipo embrionario, de una placenta que es exanguinada, esto es, completamente drenada de la sangre del cordon restante despues del nacimiento y/o un procedimiento de recuperacion de sangre de cordon convencional. De acuerdo con los metodos de la invencion, la placenta se exanguina y perfunde con un fluido de perfusion acuoso adecuado, tal como un fluido isotonico acuoso en el que se disuelve un anticoagulante (p. ej., heparina, warfarina sodica). Tales fluidos isotonicos acuosos para la perfusion son bien conocidos en la tecnica, e incluyen, p. ej., una solucion de cloruro de sodio 0,9 N. El fluido de perfusion comprende preferiblemente el anticoagulante, tal como heparina o warfarina sadica, a una concentracion que sea suficiente para prevenir la formacion de coagulos de cualquier sangre del cordon residual. En una realizacion espedfica, se emplea una concentracion de 100 a 1000 unidades de heparina. En una realizacion, se pueden utilizar inhibidores de la apoptosis durante e inmediatamente despues de la exanguinacion y a continuacion estos agentes se pueden lavar de la placenta.

De acuerdo con los metodos de la invencion, la placenta se exanguina haciendo pasar fluido de perfusion a traves de una o ambas de la arteria umbilical y la vena umbilical, utilizando un flujo de gravedad en la placenta. La placenta se orienta preferiblemente (p. ej. suspende) en tal manera que la arteria umbilical y la vena umbilical se encuentren en el punto mas alto de la placenta. En una realizacion preferida, la arteria umbilical y la vena umbilical se conectan de forma simultanea, como se muestra en la Figura 1, a una pipeta que esta conectada a traves de un conector flexible a un deposito del fluido de perfusion. El fluido de perfusion se hace pasar a la vena y la arteria umbilicales y se recoge en un recipiente abierto adecuado de la superficie de la placenta que se adosa al utero de la madre durante la gestacion.

En una realizacion preferida, el cordon umbilical proximal se pinza durante la perfusion, y mas preferiblemente, se pinza a 4-5 cm (centimetres) de la insercion del cordon en el disco placentario.

En una realizacion, se utiliza una cantidad suficiente de fluido de perfusion que dara como resultado la eliminacion de toda la sangre del cordon residual y la posterior recoleccion o recuperacion de celulas placentarias, incluyendo, pero no limitadas a celulas madre de tipo embrionario y las celulas progenitoras, que permanecen en la placenta despues de la eliminacion de la sangre del cordon.

Se ha observado que cuando el fluido de perfusion se recoge primero de una placenta durante el proceso de exanguinacion, el fluido se colorea con los globulos rojos residuales de la sangre del cordon. El lfquido de perfusion tiende a aclararse a medida que avanza de perfusion y las celulas de la sangre de cordon residuales se lavan de la

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placenta. Generalmente son adecuados de 30 a 100 ml (mililitros) de fluido de perfusion para exanguinar la placenta y para recuperar una poblacion inicial de celulas de tipo embrionario de la placenta, pero se puede utilizar mas o menos fluido de perfusion en funcion de los resultados observados.

Cultivo de placenta

Despues de la exanguinacion y la perfusion de la placenta, se observa que las celulas madre de tipo embrionario migran a la microcirculacion exanguinada y perfundida de la placenta, donde de acuerdo con los metodos de la invencion, se recogen, preferiblemente mediante lavado en un recipiente de recoleccion mediante perfusion. La perfusion de la placenta aislada no solo sirve para eliminar la sangre residual del cordon sino que tambien proporciona a la placenta los nutrientes apropiados, incluyendo oxfgeno.

La placenta exanguinada drenada se puede cultivar como un biorreactor, es dedr, un sistema ex vivo para la propagacion de las celulas o la produccion de materiales biologicos. El numero de celulas propagadas o el nivel de material biologico producido en el biorreactor de placentario se mantienen en un estado continuo de crecimiento equilibrado mediante la eliminacion periodica o continua de una porcion del medio de cultivo o del fluido de perfusion que se introducen en el biorreactor placentario, y a partir de los cuales se pueden recuperar las celulas propagadas o los materiales biologicos producidos. El medio de nueva aportacion o el fluido de perfusion se introducen a la misma velocidad o en la misma cantidad.

El numero y tipo de celulas propagadas se pueden controlar facilmente mediante la medicion de los cambios en la morfologfa y los marcadores de la superficie celular utilizando tecnicas convencionales de deteccion de celulas, tales como la citometna de flujo, la clasificacion de celulas, la inmunocitoqmmica (p. ej., tincion con anticuerpos espedficos de tejido o espedficos de los marcadores celulares), la clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS), la clasificacion celular activada magneticamente (MACS), mediante el examen de la morfologfa de las celulas utilizando microscopfa optica o confocal, o mediante la medicion de los cambios en la expresion genica utilizando mecanismos bien conocidos en la tecnica, tales como la PCR y el perfilado de la expresion genica.

En un aspecto descrito aqrn, las celulas se pueden clasificar utilizando un clasificador de celulas activado por fluorescencia (FACS). La clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS) es un metodo bien conocido para la separacion de partfculas, incluyendo celulas, basado en las propiedades fluorescentes de las partfculas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165). La excitacion laser de los radicales fluorescentes en las partfculas individuales da como resultado una pequena carga electrica que permite la separacion electromagnetica de las partfculas positivas y negativas de una mezcla. En una realizacion, los anticuerpos espedficos de los marcadores de la superficie celular o los ligandos se marcan con distintas marcas fluorescentes. Las celulas se procesan a traves del clasificador celular, permitiendo la separacion de las celulas en base a su capacidad para unirse a los anticuerpos utilizados. Las partfculas clasificadas por FACS se pueden depositar directamente en pocillos individuales de placas de 96 pocillos o 384 pocillos para facilitar la separacion y la clonacion.

En otra realizacion, se pueden utilizar cuentas magneticas para separar las celulas. Las celulas se pueden clasificar utilizando una tecnica de clasificacion celular activada magneticamente (MACS), un metodo para la separacion de partfculas basado en su capacidad para unirse a cuentas magneticas (diametro 0,5-100 pm). Se puede llevar a cabo una variedad de modificaciones utiles en las microesferas magneticas, incluyendo la adicion covalente de anticuerpo que reconoce espedficamente una molecula de la superficie en fase solida de la celula o hapteno. A continuacion se aplica un campo magnetico, para manipular ffsicamente las cuentas seleccionadas. Despues se mezclan las cuentas con las celulas para permitir la union. Las celulas se hacen pasar a continuacion a traves de un campo magnetico para separar las celulas que tienen marcadores de la superficie celular. Estas celulas se pueden aislar despues y volver a mezclar con cuentas magneticas acopladas a un anticuerpo contra otros marcadores de superficie celular. Las celulas se hacen pasan de nuevo a traves de un campo magnetico, aislando las celulas que se han unido a ambos anticuerpos. Tales celulas se pueden diluir a continuacion en placas separadas, tales como placas de microtitulacion para el aislamiento clonal.

En realizaciones preferidas, la placenta que se va a utilizar como biorreactor es exanguinada y lavada en condiciones esteriles de manera que se elimina cualquiera de los contaminantes celulares coagulados adherentes y no adherentes. La placenta se desarrolla o se cultiva a continuacion en condiciones asepticas en un contenedor u otro recipiente adecuado, y se perfunde con una solucion de perfusato (p. ej., una solucion salina normal, tal como solucion salina tamponada con fosfato (PBS)) con o sin un anticoagulante (p. ej., tal como por ejemplo, heparina o warfarina sodica), y/o con o sin un agente antimicrobiano (p. ej., tal como un antibiotico).

El perfusato efluente comprende tanto perfusato que ha circulado, que ha fluido a traves de la circulacion placentaria, como perfusato extravasado, que exuda o pasa a traves de las paredes de los vasos sangumeos a los tejidos circundantes de la placenta. El perfusato efluente se recoge, y preferiblemente, se recogen los perfusatos tanto circulados como extravasados, preferiblemente en un receptaculo esteril. Se pueden llevar a cabo alteraciones de las condiciones en las que se mantiene la placenta y la naturaleza del perfusato para modular el volumen y la composicion del perfusato efluente.

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Los tipos de celulas se a^slan a continuacion del perfusato recogido mediante el empleo de mecanismos conocidos por los expertos en la tecnica, tales como por ejemplo, pero no limitados a centrifugacion en gradiente de densidad, separacion de celulas magneticamente, citometna de flujo, separacion de celulas por afinidad o tecnicas de adherencia diferencial.

En una realizacion, se coloca una placenta en un recipiente esteril y se lava con 500 ml de solucion salina normal tamponada con fosfato. El fluido de lavado se desecha a continuacion. Despues se canula la vena umbilical con una canula, p. ej., una canula de TEFLON7 o plastico, que se conecta a un aparato de conexion esteril, tal como un tubo esteril. El aparato de conexion esteril esta conectado a un manguito de perfusion, como se muestra en la Figura 3. El contenedor que contiene la placenta se cubre a continuacion y la placenta se mantiene a la temperatura ambiente (20-25 grados C) durante un penodo de tiempo deseado, preferiblemente de 2 a 24 horas, y preferiblemente, no mas de 48 horas. La placenta puede ser perfundida continuamente, con volumenes iguales de perfusato introducido y perfusato efluente eliminado o recogido. Alternativamente, la placenta se puede perfundir periodicamente, p. ej., a cada 2 horas o a las 4, 8, 12, y 24 horas, con un volumen de perfusato, p. ej., preferentemente, 100 ml de perfusato (solucion salina normal esteril con un suplemento con o sin 1.000 U/l de heparina y/o EDTA y/o CPDA (fosfato de creatina-dextrosa)). En el caso de la perfusion periodica, se introducen preferiblemente volumenes iguales de perfusato y se eliminan del entorno de cultivo de la placenta, de manera que un volumen estable de perfusato bana la placenta en todo momento.

El perfusato efluente que escapa a la placenta, p. ej., en la superficie opuesta de la placenta, se recoge y se procesa para aislar las celulas madre de tipo embrionario, las celulas progenitoras u otras celulas de interes.

Se pueden utilizar varios medios como fluido de perfusion para el desarrollo o el cultivo de la placenta, tal como DMEM, F-12, M199, RPMI, de Fisher, de Iscore, de McCoy y combinaciones de los mismos, con un suplemento de suero fetal bovino (FBS), suero humano completo (WHS), o suero de cordon umbilical humano recogido en el momento de la expulsion de la placenta.

En ciertas realizaciones, se induce la propagacion de las celulas madre de tipo embrionario mediante la introduccion de nutrientes, hormonas, vitaminas, factores de crecimiento, o cualquier combinacion de los mismos, en la solucion de perfusion. Se pueden anadir suero y otros factores de crecimiento a la solucion de perfusion o medio de propagacion. Los factores de crecimiento son generalmente protemas e incluyen por ejemplo, pero no se limitan a: citocinas, linfoquinas, interferones, factores estimuladores de colonias (CSF), interferones, quimiocinas, e interleucinas. Otros factores de crecimiento que se pueden utilizar incluyen factores de crecimiento hematopoyeticos humanos recombinantes, que incluyendo, por ejemplo, ligandos, factores de celulas madre, trombopoyetina (TPO), interleucinas, y factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF).

Los factores de crecimiento introducidos en la solucion de perfusion pueden estimular la propagacion de las celulas madre de tipo embrionario no diferenciadas, celulas progenitoras comprometidas, o celulas diferenciadas (p. ej., celulas hematopoyeticas diferenciadas). Los factores de crecimiento pueden estimular la produccion de materiales biologicos y moleculas bioactivas, incluyendo p. ej., pero no limitadas a, inmunoglobulinas, hormonas, enzimas o factores de crecimiento como se ha descrito previamente.

En un aspecto de la descripcion, la placenta se utiliza como un biorreactor para la propagacion de celulas endogenas (es decir, celulas que se originan a partir de la placenta), incluyendo pero no limitadas a, varios tipos de celulas madre de tipo embrionario pluripotentes y/o totipotentes y linfocitos. Para utilizar la placenta como biorreactor, esta se puede cultivar durante penodos de tiempo variables en condiciones esteriles mediante perfusion con solucion de perfusato como se describe en la presente memoria. En realizaciones espedficas, la placenta se cultiva durante al menos 12, 24, 36, o 48 horas, o durante 3-5 dfas, 6-10 dfas, o durante una a dos semanas. En una realizacion preferida, la placenta se cultiva durante 48 horas. La placenta cultivada debe ser "alimentada" periodicamente para eliminar el medio gastado, despoblar las celulas liberadas, y anadir medio de nueva aportacion. La placenta cultivada se debe almacenar en condiciones esteriles para reducir la posibilidad de contaminacion, y mantenerla bajo presurizacion intermitente y periodica para crear condiciones que mantengan un suministro adecuado de nutrientes a las celulas de la placenta. Se debe reconocer que la perfusion y el cultivo de la placenta pueden ser ambos automatizados e informatizados para la eficiencia y el aumento de la capacidad.

En otro aspecto descrito aqrn, la placenta se procesa para eliminar todas las celulas proliferantes endogenas, tales como celulas madre de tipo embrionario, y para permitir la introduccion y propagacion de celulas foraneas (es decir, exogenas) en el entorno de la placenta perfundida. La presente descripcion contempla una gran variedad de celulas madre o progenitoras que pueden ser cultivadas en el biorreactor placentario, incluyendo, p. ej., pero no limitadas a, celulas madre de tipo embrionario, celulas madre mesenquimales, celulas estromales, celulas endoteliales, hepatocitos, queratinocitos, y celulas madre o progenitoras para un determinado tipo de celula, tejido u organo, incluyendo, por ejemplo, pero no limitado a neuronas, mielina, musculo, sangre, medula osea, piel, corazon, tejido conectivo, pulmon, rinon, dgado y pancreas (p. ej., celulas de islotes pancreaticos).

Las fuentes de celulas madre mesenquimales incluyen medula osea, saco vitelino embrionario, placenta, cordon umbilical, piel fetal y adolescente, y sangre. Las celulas de medula osea se pueden obtener de la cresta ilfaca, femures, tibias, columna vertebral, costillas u otros espacios medulares.

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Los metodos para la destruccion selectiva, la ablacion o la eliminacion de celulas en proliferacion o division rapida de un tejido u organo son bien conocidos en la tecnica, p. ej., metodos de tratamiento de canceres o tumores. Por ejemplo, la placenta perfundida puede ser irradiada con radiacion electromagnetica, ultravioleta, rayos X, gamma- o beta- para erradicar todas las celulas endogenas, viables restantes. Las celulas foraneas que se van a propagar se introducen en el biorreactor placentario irradiado, p. ej., mediante perfusion.

Recoleccion de celulas de la placenta

Como se ha descrito anteriormente, despues de la exanguinacion y la perfusion de la placenta, las celulas madre de tipo embrionario migran a la microcirculacion drenada, vada donde son recogidas, preferiblemente recogiendo el perfusato efluente en un recipiente de recoleccion.

En realizaciones preferidas, las celulas cultivadas en la placenta se afslan del perfusato efluente utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la tecnica, tales como, por ejemplo, centrifugacion en gradiente de densidad, separacion de celulas magneticamente, citometna de flujo, u otros metodos de separacion o clasificacion celular bien conocidos en la tecnica, y se clasifican, por ejemplo, de acuerdo con el esquema mostrado en la Figura 4.

En una realizacion espedfica, las celulas recogidas de la placenta se recuperan del perfusato efluente mediante centrifugacion a X 00 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente, lo que separa las celulas de los restos contaminantes y las plaquetas. Los sedimentos celulares se vuelven a suspender en medio IMDM libre de suero que contiene 2U/ml de heparina y EDTA 2 mM (Gibco BRL, NY). La fraccion total de celulas mononucleares se aislo utilizando Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante y la fraccion de celulas mononucleares se volvio a suspender. Las celulas se contaron utilizando un hemocitometro. La viabilidad se evaluo mediante exclusion con azul de tnpano. El aislamiento de las celulas se consigue mediante "tripsinizacion diferencial", utilizando una solucion de tripsina al 0,05% con EDTA al 0,2% (Sigma, St. Louis MO). La tripsinizacion diferencial fue posible porque las celulas fibroblastoides se separaron de las superficies de plastico en el plazo de aproximadamente cinco minutos, mientras que las otras poblaciones adherentes necesitaron mas de 20-30 minutos de incubacion. Las celulas fibroblastoides separadas se recogieron despues de la tripsinizacion y la neutralizacion con tripsina, utilizando Solucion Neutralizadora de Tripsina ("TNS en sus siglas en ingles", BioWhittaker). Las celulas se lavaron en H.DMEM y se volvieron a suspender en MSCGM.

En otra realizacion, la placenta aislada se perfunde durante un penodo de tiempo sin recoger el perfusato, de manera que la placenta puede ser perfundida durante 2, 4, 6, 8, 10, 12, 20 y 24 horas o incluso dfas antes de recoger el perfusato.

En un aspecto descrito aqrn, las celulas cultivadas en el biorreactor de placenta se afslan de la placenta mediante la diseccion ffsica de las celulas de la placenta.

En un aspecto descrito aqrn, las celulas cultivadas en el biorreactor de placenta se afslan de la placenta mediante disociacion de los tejidos de la placenta o una porcion del mismo, y recuperacion de las celulas cultivadas mediante metodos de separacion o clasificacion celular conocidos en la tecnica tales como centrifugacion en gradiente de densidad, separacion de celulas magneticamente, citometna de flujo, etc.

En una realizacion preferida, la perfusion de la placenta y la recogida del perfusato efluente se repiten una o dos veces durante el cultivo de la placenta, hasta que el numero de celulas nucleadas recuperadas cae por debajo de 100 celulas/ml. Los perfusatos se agrupan y se someten a centrifugacion ligera para eliminar las plaquetas, los restos y las membranas celulares enucleadas. Las celulas nucleadas se afslan a continuacion mediante centrifugacion en gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque y despues del lavado, se resuspenden en H.DMEM. Para el aislamiento de las celulas adherentes, se colocan alfcuotas de 5-10 x 106 celulas en cada uno de varios matraces T-75 y se cultivan con Medio de Crecimiento de Celulas Madre Mesenquimales (MSCGM) disponible en el mercado obtenido de BioWhittaker, y se colocan en una incubadora de cultivo de tejidos (37°C, 5% de CO2). Despues de 10 a 15 dfas, las celulas no adherentes se retiran de los matraces mediante lavado con PBS. A continuacion el PBS se remplaza por MSCGM. Los matraces se examinan preferiblemente de manera diaria para determinar la presencia de diversos tipos de celulas adherentes y, en particular, para la identificacion y expansion de las agrupaciones de celulas fibroblastoides.

En otras realizaciones, las celulas recogidas de la placenta se criopreservan para su uso en un momento posterior. Los metodos para la crioconservacion de celulas, tales como las celulas madre, son bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, crioconservacion utilizando los metodos de Boyse et al. (Patente de los Estados Unidos Num. 5.192.553, expedida el 9 de Marzo de 1993) o Hu et al. (documento WO 00/73421, publicado el 7 de Diciembre de 2000).

Poblaciones de celulas obtenidas de o cultivadas en placenta

Las celulas madre de tipo embrionario obtenidas de acuerdo con los metodos de la invencion pueden incluir celulas pluripotentes, es decir, celulas que tienen una versatilidad de diferenciacion completa, que son autorrenovables, y

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pueden permanecer en estado latente o quiescentes en el tejido. Las celulas madre de tipo embrionario tambien pueden incluir celulas multipotentes, celulas progenitoras comprometidas, o celulas fibroblastoides.

En una realizacion preferida, las celulas madre de tipo embrionario obtenidas por medio de los metodos de la invencion son celulas madre pluripotenciales, quiescentes, viables que existen dentro de una placenta humana a termino y que se pueden recuperar despues del nacimiento con exito y la expulsion de la placenta, dando como resultado la recuperacion de tantas como mil millones de celulas nucleadas, que producen 50-100 millones de celulas madre multipotentes y pluripotentes.

Las celulas madre placentarias humanas proporcionadas por la placenta son sorprendentemente de tipo embrionario, por ejemplo, para estas celulas se ha identificado la presencia de los siguientes marcadores de la superficie celular: SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ y ABC-p+. Por lo tanto, la invencion abarca las celulas que no han sido aisladas u obtenidas de otra manera a partir de una fuente embrionaria pero que pueden ser identificadas por los siguientes marcadores: SSAE3-, SSAE4-, OCT-4+ y ABC-P+. En una realizacion, las celulas madre placentarias humanas no expresan antfgenos de Clase 2 del MHC.

Las celulas madre aisladas de la placenta son homogeneas, y esteriles. Adicionalmente, las celulas madre se obtienen facilmente de una forma adecuada para la administracion a seres humanos, es decir, son de calidad farmaceutica.

Las celulas madre de tipo embrionario preferidas obtenidas por medio de los metodos implicados en la invencion pueden ser identificadas por la presencia de los siguientes marcadores de superficie celular: CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y ABC-p+. Tales marcadores de superficie celular son determinados de forma rutinaria de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica, p. ej. mediante citometna de flujo, seguida de lavado y tincion con un anticuerpo anti-marcador de superficie celular. Por ejemplo, para determinar la presencia de CD-34 o CD-38, las celulas se pueden lavar en pBs y despues tenir doblemente con ficoeritrina anti-CD34 e isotiocianato de fluorescema anti-CD38 (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Se puede inducir la diferenciacion de las celulas madre de tipo embrionario obtenidas por medio de los metodos de la invencion a lo largo de linajes celulares espedficos, incluyendo adipogenico, condrogenico, osteogenico, hematopoyetico, miogenico, vasogenico, neurogenico, y hepatogenico. En ciertas realizaciones, se induce la diferenciacion de las celulas madre de tipo embrionario obtenidas de acuerdo con los metodos de la invencion para su uso en el trasplante y en protocolos de tratamiento ex vivo.

En ciertas realizaciones, se induce la diferenciacion de las celulas madre de tipo embrionario obtenidas mediante los metodos de la invencion a un tipo celular concreto y se manipulan geneticamente para proporcionar un producto genico terapeutico. Las celulas madre de tipo embrionario obtenidas por medio de los metodos descritos aqrn se pueden incubar con un compuesto in vitro que las induce a diferenciarse, seguido del trasplante directo de las celulas diferenciadas a un sujeto. De este modo, se describen aqrn metodos de diferenciacion de las celulas madre placentarias humanas utilizando medios de cultivo convencionales. Adicionalmente, la invencion incluye celulas hematopoyeticas, celulas neuronales, celulas fibroblasticas, celulas en hebra, celulas mesenquimales y celulas hepaticas.

Las celulas madre de tipo embrionario tambien se pueden cultivar adicionalmente despues de la recoleccion a partir de la placenta utilizando metodos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante el cultivo sobre celulas alimentadoras, tales como fibroblastos irradiados, obtenidos a partir de la misma placenta que las celulas madre de tipo embrionario o de otras fuentes humanas o no humanas, o en medios acondicionados obtenidos a partir de cultivos de tales celulas alimentadoras, con el fin de obtener cultivos continuos a largo plazo de celulas madre de tipo embrionario. Las celulas madre de tipo embrionario tambien se pueden expandir, ya sea dentro de la placenta antes de la recoleccion desde el biorreactor placentario ya sea in vitro despues de la recuperacion de la placenta. Las celulas madre de tipo embrionario que se van a expandir se exponen a, o se cultivan en presencia de, un agente que suprime la diferenciacion celular. Tales agentes son bien conocidos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan

а, los polipeptidos Delta-1 humano y Serrate-1 humanos (vease, Sakano et al., Patente de los Estados Unidos Num.

б. 337.387 titulada "Diferentiation-suppressive polypeptide", expedida el 8 de Enero de 2002), factor inhibidor de leucemia (LIF) y factor de celulas madre. Los metodos para la expansion de las poblaciones de celulas son tambien conocidos en la tecnica (veanse, p. ej., Emerson et al., Patente de los Estados Unidos Num. 6.326.198 titulada "Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoyetic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells", expedida el 4 de Diciembre de 2001; Kraus et al., Patente de los Estados Unidos Num. 6.338.942, titulada "Selective expansion of target cell populations", expedida el 15 de Enero de 2002).

Las celulas madre de tipo embrionario pueden ser evaluadas para determinar su viabilidad, su potencial de proliferacion, y su longevidad utilizando mecanismos conocidas en la tecnica, tales como el analisis de exclusion con azul de tnpano, el analisis de absorcion de diacetato de fluorescema, el analisis de absorcion de yoduro de propidio (para evaluar la viabilidad); y el analisis de absorcion de timidina, el analisis de proliferacion celular MTT (para

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evaluar la proliferacion). La longevidad se puede determinar por medio de metodos bien conocidos en la tecnica, tales como la determinacion del numero maximo de duplicacion de la poblacion en un cultivo prolongado.

En ciertas realizaciones, la diferenciacion de las celulas madre o celulas progenitoras que se cultivan en la placenta exanguinada, perfundida y/o de cultivada se modula utilizando un agente o composiciones farmaceuticas que comprenden una dosis y/o dosis eficaces despues de la administracion unica o multiple, para ejercer un efecto suficiente para inhibir, modular y/o regular la diferenciacion de una celula recogida de la placenta.

Los agentes que pueden inducir la diferenciacion de celulas madre o progenitoras son bien conocidos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, Ca2+, EGF, aFGF, bFGF, PDGF, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), TGF- p, citocinas (p. ej., IL-1 a, IL-1p, IFN-y, TFN), acido retinoico, transferrina, hormonas (p. ej., androgenos, estrogenos, insulina, prolactina, triyodotironina, hidrocortisona, dexametasona), butirato de sodio, TPA, DMSO, NMF, DMF, elementos de matriz (p. ej., colageno, laminina, sulfato de heparan, MatrigelJ), o combinaciones de los mismos. Ademas, los compuestos se pueden utilizar para modular la diferenciacion de las celulas recogidas de la placenta.

Los agentes que suprimen la diferenciacion celular tambien son bien conocidos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos Delta-1 humano y Serrate-1 humano (vease, Sakano et al., Patente de los Estados Unidos Num. 6.337.387 titulada "Diferentiation-suppressive polypeptide", expedida el 8 de Enero de 2002), factor inhibidor de la leucemia (LIF), y factor de celulas madre.

El agente utilizado para modular la diferenciacion se puede introducir en el biorreactor placentario para inducir la diferenciacion de las celulas que estan siendo cultivadas en la placenta. Alternativamente, el agente se puede utilizar para modular la diferenciacion in vitro despues de que las celulas hayan sido recogidas o retiradas de la placenta.

La determinacion de que una celula madre se ha diferenciado a un tipo de celula concreto se puede llevar a cabo por medio de metodos bien conocidos en la tecnica, p. ej., midiendo los cambios en la morfologfa y los marcadores de la superficie celular utilizando tecnicas tales como la citometna de flujo o la inmunocitoqmmica (p. ej., tinendo las celulas con anticuerpos espedficos de tejido o espedficos del marcador celular), examinando la morfologfa de las celulas utilizando microscopfa optica o confocal, o midiendo los cambios en la expresion genica utilizando mecanismos bien conocidos en la tecnica, tales como PCR y perfilado de la expresion genica.

En otra realizacion, las celulas cultivadas en la placenta son estimuladas para producir moleculas bioactivas, tales como inmunoglobulinas, hormonas, enzimas.

En otra realizacion, las celulas cultivadas en la placenta son estimuladas para proliferar, por ejemplo, mediante la administracion de eritropoyetina, citoquinas, linfoquinas, interferones, factores estimuladores de colonias (CSF), interferones, quimiocinas, interleucinas, factores de crecimiento hematopoyeticos humanos recombinantes incluyendo ligandos, factores de celulas madre, trombopoyetina (TPO), interleucinas y factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) u otros factores de crecimiento.

En otra realizacion, las celulas cultivadas en la placenta se manipula geneticamente, o bien antes, o bien despues de la recoleccion de la placenta, utilizando, por ejemplo, un vector viral tal como un vector adenoviral o retroviral, o mediante el uso de medios mecanicos tales como la absorcion de ADN mediada por liposomas o mediada qmmicamente.

Se puede introducir un vector que contiene un transgen en una celula de interes por medio de metodos bien conocidos en la tecnica, p. ej., transfeccion, transformacion, transduccion, electroporacion, infeccion, microinyeccion, fusion celular, DEAE dextrano, precipitacion con fosfato de calcio, liposomas, LIPOFECTINA, fusion de lisosomas, lfpidos cationicos sinteticos, uso de una pistola genica o un transportador de vectores de ADN, de manera que el transgen se transmita a las celulas hijas, p. ej., celulas madre de tipo embrionario o celulas progenitoras hijas producidas por la division de una celula madre de tipo embrionario. Para diversas tecnicas de la transformacion o transfeccion de celulas de mairnfero, veanse Keown et al., 1990, Methods Enzymol. 185: 527-37; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Tercera Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.

Preferiblemente, el transgen se introduce utilizando cualquier tecnica, con tal que esta no sea destructiva para la membrana nuclear de la celula u otras estructuras celulares o geneticas existentes. En ciertas realizaciones, el transgen se inserta en el material genetico nucleico mediante microinyeccion. La microinyeccion de celulas y estructuras celulares es comunmente conocida y practicada en la tecnica.

Para la transfeccion estable de celulas de mai^ero en cultivo, tales como el cultivo de celulas en una placenta, solo una pequena fraccion de celulas puede integrar el ADN foraneo en su genoma. La eficiencia de la integracion depende del vector y de la tecnica de transfeccion utilizados. Con el fin de identificar y seleccionar los integrantes, se introduce generalmente un gen que codifica un marcador seleccionable (p. ej., para la resistencia a antibioticos) en la celula madre de tipo embrionario anfitriona, junto con la secuencia genica de interes. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Las celulas transfectadas de forma estable con el acido nucleico introducido se pueden identificar mediante seleccion con farmacos (p. ej., las celulas que han incorporado el gen marcador seleccionable sobreviviran, mientras que las otras celulas moriran). Tales metodos son particularmente utiles en los metodos que

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implican la recombinacion homologa en celulas de mairnfero (p. ej., en las celulas madre de tipo embrionario) antes de la introduccion o el trasplante de las celulas recombinantes en un sujeto o paciente.

Se pueden utilizar varios sistemas de seleccion para seleccionar las celulas de tipo embrionario anfitrionas transformadas. En particular, el vector puede contener ciertos marcadores detectables o seleccionables. Otros metodos de seleccion incluyen, pero no se limitan a, la seleccion de otro marcador tal como: se pueden emplear los genes de timidina quinasa (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026), y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) del virus del herpes simple en celulas tk-, HGPRT- o aprt-, respectivamente. Asimismo, se puede utilizar la resistencia antimetabolitos como la base de seleccion para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); Gpt, que confiere resistencia al acido micofenolico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); Neo, que confiere resistencia al aminoglicosido G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al, 1984, Gene 30: 147).

El transgen se puede integrar en el genoma de la celula de interes, preferiblemente por integracion al azar. En otras realizaciones, el transgen se puede integrar por medio de un metodo dirigido, p. ej., mediante recombinacion homologa dirigida ("knock-in"), Chappel, Patente de los Estados Unidos Num. 5.272.071; y publicacion PCT Num. WO 91/06667, publicada el 16 de Mayo de 1991; Patente de los Estados Unidos Num. 5.464.764; Capecchi et al., expedida el 7 de Noviembre de 1995; Patente de los Estados Unidos Num. 5.627.059, Capecchi et al. expedida el 6 de Mayo de 1997; Patente de los Estados Unidos Num. 5.487.992, Capecchi et al., expedida el 30 de Enero de 1996).

En una realizacion espedfica, se utilizan los metodos de Bonadio et al. (Patente de los Estados Unidos Num. 5.942.496, titulada Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells, expedida el 24 de Agosto de 1999 y PCT WO 95/22611, titulada "Methods and compositions for stimulating bone cells" publicada el 24 de Agosto de 1995) para introducir acidos nucleicos en una celula de interes, tal como una celula madre o una celula progenitora cultivadas en la placenta, p. ej., celulas progenitoras oseas.

Usos de placenta cultivada como biorreactor

Se pueden utilizar celulas placentarias exanguinadas y/o cultivadas como biorreactor para el cultivo de celulas, tejidos y organos. El mesodermo placentario proporciona un entorno estromal ideal, que incluye una abundancia de moleculas pequenas y factores de crecimiento, lipopolisacaridos y protemas de la matriz extracelular, necesarios para la organogenesis y la neogenesis de tejidos.

En un aspecto descrito aqrn, la placenta puede estar poblada de cualquier tipo de celula concreto y utilizarse como biorreactor para el cultivo ex vivo de celulas, tejidos u organos. Tales cultivos de celulas, tejidos u organos se pueden cosechar y utilizar en trasplantes y protocolos de tratamiento ex vivo. En esta realizacion, la placenta se procesa para eliminar todas las celulas endogenas y para permitir la introduccion y propagacion de celulas foraneas (es decir, exogenas) en el entorno de la placenta perfundida. Los metodos para la eliminacion de las celulas endogenas son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la placenta perfundida se irradia con radiacion electromagnetica, ultravioleta, rayos X, beta o gamma para erradicar todas las celulas endogenos, viables restantes. Las celulas foraneas de interes que se van a propagar en el biorreactor placentario irradiado se introducen a continuacion, p. ej., mediante la introduccion de las celulas por medio de perfusion, a traves de la vasculatura o mediante inyeccion directa en la placenta.

En otro aspecto descrito aqrn, el biorreactor se puede utilizar para producir y propagar celulas, tejidos u organos quimericos novedosos. Tales quimeras se pueden crear utilizando celulas placentarias y uno o mas tipos de celulas adicionales como materiales de partida en un biorreactor. La interaccion, o "intercomunicacion" entre los diferentes tipos de celulas puede inducir patrones de expresion distintos de cualquiera de los tipos de celulas de partida. En otro aspecto descrito aqrn, por ejemplo, se genera una quimera autologa mediante la propagacion de celulas placentarias autologas del paciente en un biorreactor con otro tipo de celula derivado del mismo paciente. En otro aspecto descrito aqrn, por ejemplo, se puede generar una quimera heterologa mediante la adicion de celulas de un paciente, esto es, celulas de la sangre, a un biorreactor que tiene celulas placentarias heterologas. En otra realizacion mas, las celulas placentarias pueden derivar de un paciente, y un segundo tipo de celulas de un segundo paciente. A continuacion se recuperan celulas quimericas que tienen caractensticas fenotfpicas y/o geneticas diferentes de cualquiera de las celulas de partida. En una realizacion espedfica, las celulas heterologas son del mismo haplotipo, y las celulas quimericas se reintroducen en el paciente.

En otros aspectos descritos aqrn, el biorreactor se puede utilizar para potenciar el crecimiento de un tipo de celula concreto, ya sea de origen nativo o sintetico. En otros descritos aqrn, se utiliza la placenta como biorreactor para la propagacion de celulas endogenas (esto es, celulas que se originan a partir de la placenta), incluyendo pero no limitadas a, diferentes clases de celulas madre de tipo embrionario pluripotentes y/o totipotentes y linfocitos. En otro aspecto descrito aqrn, la placenta se incuba durante penodos variables de tiempo con una solucion de perfusato como se describe en la presente memoria. Tales celulas endogenas de origen placentario pueden ser transformadas para expresar recombinantemente un gen de interes, para expresar mutaciones, y/o pueden ser manipuladas para

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suprimir un locus genetico, utilizando la tecnolog^a "knock out" (inactivacion de genes). Por ejemplo, se puede suprimir un gen diana endogeno inactivando o "noqueando" el gen diana o su promotor utilizando recombinacion homologa dirigida (p. ej., veanse Smithies, et al., 1985, Nature 317, 230-234; Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51, 503-512; Thompson, et al., 1989, Cell, 5, 313-321). Por ejemplo, se pueden utilizar un gen diana no funcional, mutante (o una secuencia de ADN no relacionada absoluto) flanqueado por ADN homologo al gen diana endogeno (ya sea las regiones codificantes o las regiones reguladoras del gen diana), con o sin un marcador seleccionable y/o un marcador seleccionable negativo, para transfectar celulas que expresan el gen diana in vivo. La insercion del constructo de ADN, mediante recombinacion homologa dirigida, da como resultado la inactivacion del gen diana. Estos enfoques pueden ser utilizados para eliminar, sustituir o alterar la expresion de genes de interes en celulas, tejidos y/u organos. Este enfoque se puede utilizar para alterar el fenotipo de una celula, tejido, u organo, que pueden ser introducidos a continuacion en un sujeto humano.

En otras realizaciones, se puede inducir la diferenciacion de una celula de la placenta a un tipo de celula particular, ya sea ex vivo o in vivo. Por ejemplo, se pueden inyectar celulas madre de tipo embrionario pluripotentes en un organo danado, y para la neogenesis de organos y la reparacion de la lesion in vivo. Dicha lesion puede ser debida a tales condiciones y trastornos, incluyendo, pero no limitados a, infarto de miocardio, trastorno convulsivo, esclerosis multiple, derrame cerebral, hipotension, paro cardfaco, isquemia, inflamacion, perdida de la funcion cognitiva relacionada con la edad, dano por radiacion, paralisis cerebral, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Leigh, demencia por SIDA, perdida de memoria, esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad renal isquemica, trauma cerebral o de la medula espinal, bypass corazon-pulmon, glaucoma, isquemia retiniana, o trauma retiniano.

Las celulas madre de tipo embrionario aisladas de la placenta se pueden utilizar, en realizaciones espedficas, en la terapia de sustitucion enzimatica autologa o heterologa para el tratamiento de enfermedades o afecciones espedficas, incluyendo, pero no limitadas a enfermedades de almacenamiento lisosomal, tales como los smdromes de de Tay-Sachs, de Niemann-Pick, de Fabry, de Gaucher, de Hunter, de Hurler, asf como otras gangliosidosis, mucopolisacaridosis, y glicogenosis.

En otras realizaciones, las celulas se pueden utilizad como portadores de transgenes autologos o heterologos en la terapia genica para corregir errores innatos del metabolismo o para tratar el cancer, tumores u otras afecciones patologicas.

En otras realizaciones, las celulas se pueden utilizar en las terapias o protocolos de regeneracion o sustitucion de tejido autologo o heterologo, incluyendo, pero no limitados al tratamiento de defectos epiteliales de la cornea, reparacion de cartflago, dermoabrasion facial, membranas mucosas, membranas timpanicas, revestimientos intestinales, estructuras neurologicas (p. ej., retina, neuronas auditivas en la membrana basilar, neuronas olfativas en el epitelio olfativo), reparacion de quemaduras y heridas por lesiones traumaticas de la piel, o para la reconstruccion de otros organos o tejidos danados o enfermos.

Las celulas madre de tipo embrionario, las celulas progenitoras, las celulas foraneas, o las celulas manipuladas obtenidas a partir de una placenta como se describe aqrn se pueden utilizar en la fabricacion de un tejido u organo in vivo. Los metodos de la invencion incluyen el uso de celulas obtenidas de la placenta, p. ej. celulas madre de tejido embrionario, celulas progenitoras, o celulas madre o progenitoras foraneas, para sembrar una matriz y ser cultivadas en las condiciones apropiadas para permitir la diferenciacion de las celulas y el poblamiento de la matriz. Los tejidos y organos obtenidos por medio de los metodos descritos aqrn se pueden utilizar para una variedad de fines, incluyendo fines terapeuticos y de investigacion.

Usos de celulas madre de tipo embrionario

Las celulas madre de tipo embrionario descritas aqrn se pueden utilizar para una amplia variedad de protocolos terapeuticos en los que un tejido u organo del cuerpo, es aumentado, reparado o sustituido mediante el injerto, el trasplante o la infusion de una poblacion de celulas deseada, tal como una poblacion de celulas madre o de celulas progenitoras. Las celulas madre de tipo embrionario se pueden utilizar para sustituir o aumentar tejidos existentes, para introducir tejidos nuevos o alterados, o para unir entre sf tejidos o estructuras biologicas.

Por ejemplo, las celulas madre de tipo embrionario se pueden utilizar en protocolos de transplante terapeuticos, p. ej., para aumentar o sustituir celulas madre o progenitoras de organos o tejidos tales como Idgado, pancreas, rinon, pulmon, sistema nervioso, sistema muscular, hueso, medula osea, timo, bazo, tejido de la mucosa, gonadas, o pelo.

Las celulas madre de tipo embrionario se pueden utilizar en lugar de las clases espedficas de celulas progenitoras (p. ej., condrocitos, hepatocitos, celulas hematopoyeticas, celulas del parenquima pancreatico, neuroblastos, celulas progenitoras musculares, etc.) en los protocolos terapeuticos o de investigacion en los que se utilizanan tfpicamente celulas progenitoras.

Las celulas madre de tipo embrionario se pueden utilizar para el aumento, la reparacion o la sustitucion de cartflagos, tendones o ligamentos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las protesis (p. ej., protesis de cadera) estan recubiertas con constructos de tejido de cartflago de sustitucion desarrollados a partir de celulas madre de tipo embrionario. En otras realizaciones, se reconstruyen articulaciones (p. ej., rodilla) con constructos de tejido de

cartflago desarrollados a partir de celulas madre de tipo embrionario. Los constructos de tejido de cartflago tambien se pueden emplear en la cio^a reconstructiva mayor para diferentes tipos de articulaciones (para los protocolos, veanse, p. ej., Resnick, D., y Niwayama, G., eds., 1988, Diagnosis of Bone and Joint Disorders, 2a ed., wB Saunders Co.).

5 Las celulas madre de tipo embrionario se pueden utilizar para reparar el dano de tejidos y organos que resultan de enfermedad. En tal realizacion, se pueden administrar a un paciente celulas madre de tipo embrionario para regenerar o restaurar tejidos u organos que han sido danados como consecuencia de una enfermedad, p. ej., potenciar el sistema inmunologico despues de quimioterapia o radiacion, reparar tejido cardfaco despues de un infarto de miocardio.

10 En otras realizaciones, las celulas se pueden utilizar en terapias o protocolos de regeneracion o sustitucion de tejidos autologos o heterologos, incluyendo, pero no limitados al tratamiento de los defectos epiteliales de la cornea, reparacion del cartflago, dermoabrasion facial, membranas mucosas, membranas timpanicas, revestimientos intestinales, estructuras neurologicas (p. ej., retina, neuronas auditivas en la membrana basilar, neuronas olfativas en el epitelio olfativo), reparacion de quemaduras y heridas por lesiones traumaticas de la piel, el trasplante de cuero 15 cabelludo (pelo), o para la reconstruccion de otros organos o tejidos danados o enfermos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Analisis de tipos celulares recuperados de perfusato de placenta drenada

Este ejemplo describe el analisis de los tipos de celulas recuperados del perfusato efluente de una placenta cultivada de acuerdo con los metodos de la invencion.

20 Se anadieron 20 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) al lfquido de perfusion y se recogio una porcion de 10 ml y se centrifugo durante 25 minutos a 3000 rpm (revoluciones por minuto). El efluente se dividio en cuatro tubos y se coloco en un bano de hielo. Se anadieron 2,5 ml de una solucion de suero de ternera fetal al 1% (FCS) en PBS y los tubos se centrifugaron (140 minutos x 10 g (aceleracion debida a la gravedad)). El sedimento se resuspendio en 5 ml de FCS al 1% y se combinaron dos tubos. Se calcularon los mononucleocitos totales mediante 25 la adicion de los linfocitos totales y los monocitos totales, y multiplicando a continuacion el resultado por el volumen total de suspension celular.

La siguiente tabla describe los tipos de celulas obtenidos por perfusion de una placenta cultivada de acuerdo con los metodos descritos anteriormente.

: WBC 1000/ml Lym% MID% GRA% Volumen Total Num. de Celulas

CB: 10,5 43,2 8 48,8 60ml 6,3 X 108

(Sangre del cordon umbilical)

PP: 12,0 62,9 18,2 18,9 15 ml 1,8 X 108

(Placenta perfusion, temperatura ambiente)

PP2: 11,7 56,0 19,2 24,8 30 ml 3,5 X 108

(Placenta perfundida, 37 grados C)

Las muestras de PP fueron despues de Ficoll.

El numero total de celulas de PP despues de Ficoll fue de 5,3 X 108 y el numero de CB antes del procesamiento es de 6,3 X 108. Lym% indica el porcentaje de linfocitos;

MID% indica el porcentaje de globulos blancos de la sangre de gama media; y GRA% indica el porcentaje de granulocitos.

Ejemplo 2: Analisis de celulas obtenidas por perfusion e incubacion de la placenta

30 El siguiente ejemplo describe un analisis de celulas obtenidas por perfusion e incubacion de placenta de acuerdo con los metodos descritos aquf

Materiales y metodos

Los donantes de placenta fueron reclutados entre mujeres embarazadas que se inscribieron en programas de bancos privados de sangre de cordon umbilical y proporcionaron el consentimiento informado que permitfa el uso de 35 la placenta exanguinada despues de la recuperacion de la sangre del cordon para fines de investigacion. Todos los datos de los donantes son confidenciales. Estos donantes tambien permitieron el uso los datos ciegos generados a partir del procesamiento normal de sus muestras de sangre de cordon umbilical para la crioconservacion. Esto

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permitio la comparacion entre la composicion de la sangre del cordon recogida y el perfusate efluente recuperado utilizando el metodo experimental descrito a continuacion.

Despues de la exanguinacion de la sangre del cordon del cordon umbilical y la placenta, de acuerdo con los metodos descritos anteriormente, la placenta se coloco en un recipiente aislado, esteril a temperatura ambiente y se entrego al laboratorio en el plazo de 4 horas despues del nacimiento. Las placentas se descartaron si, en la inspeccion, teman evidencia de dano ffsico, tal como fragmentacion del organo o avulsion de los vasos umbilicales. Las placentas se mantuvieron a temperatura ambiente (23 mas/menos 2 grados C) o refrigeradas (4 grados C) en recipientes esteriles durante 2 a 20 horas. Periodicamente, las placentas se sumergieron y se lavaron en solucion salina esteril a 25 grados mas/menos 3 grados C para eliminar cualquier sangre de la superficie o residuo visible.

El cordon umbilical se corto transversalmente aproximadamente a 5 cm de su insercion en la placenta y los vasos umbilicales se canularon con cateteres de Teflon o polipropileno conectados a una via de fluido esteril permitiendo la perfusion bidireccional de la placenta y la recuperacion del fluido efluente. Los metodos descritos anteriormente permitieron llevar a cabo todos los aspectos de acondicionamiento, perfusion y recogida de efluente de la placenta en condiciones atmosfericas ambientales controladas, asf como la supervision en tiempo real de la presion intravascular y las velocidades de flujo, las temperaturas del nucleo y el perfusato y los volumenes de efluente recuperados. Se evaluo una gama de protocolos de acondicionamiento durante un periodo de posparto de 24 horas, y se analizo la composicion celular del fluido efluente por citometna de flujo, microscopfa optica y analisis de las unidades formadoras de colonias.

Acondicionamiento de la placenta

Las placentas de las donantes se procesaron a temperatura ambiente en un plazo de 12 y 24 horas despues del parto. Antes de su procesamiento, se eliminaron las membranas y se limpio de sangre residual el sitio materno. Los vasos umbilicales se canularon con cateteres elaborados con agujas mariposa de calibre 20 utilizados para la recogida de muestras de sangre.

Las placentas de las donantes se mantuvieron bajo condiciones variables en un intento de simular y mantener un entorno fisiologicamente compatible para la proliferacion y el reclutamiento de celulas madre de tipo embrionario residuales. La canula se lavo con medio IMDM libre de suero (GibcoBRL, NY) que contema 2 U/ml de heparina (Elkins-Sinn, NJ). La perfusion de la placenta continuo a una velocidad de 50 ml por minuto hasta que se recogieron aproximadamente 150 ml de perfusato. Este volumen de perfusato se marco como "fraccion temprana". La perfusion continua de la placenta a la misma velocidad dio como resultado la recoleccion de una segunda fraccion de aproximadamente 150 ml y se marco como "fraccion tardfa". Durante el curso del procedimiento, la placenta se masajeo suavemente para ayudar al proceso de perfusion y ayudar a la recuperacion de material celular. El fluido efluente se recogio desde el circuito de perfusion tanto mediante drenaje por gravedad como por aspiracion a traves de la canula arterial.

A continuacion las placentas fueron perfundidas con medio Eagle modificado de Dulbecco heparinizado (H.DMEM) (2U/ml) a una velocidad de 15 ml/minuto durante 10 minutos y los perfusatos se recogieron de los sitios maternos en el plazo de una hora y se contaron las celulas nucleadas. Los procedimientos de perfusion y de recogida se repitieron una vez o dos veces hasta que el numero de celulas nucleadas recuperadas cayo por debajo de 100/ml. Los perfusatos se reunieron y se sometieron a centrifugacion suave para eliminar las plaquetas, los desechos y las membranas de las celulas enucleadas. Las celulas nucleadas se aislaron a continuacion mediante centrifugacion en gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque y despues del lavado, se resuspendieron en H.DMEM. Para el aislamiento de las celulas adherentes, se colocaron alteuotas de 5-10 x 106 celulas en cada uno de varios matraces T-75 y se cultivaron con Medio de Crecimiento de Celulas Madre Mesenquimales (MSCGM) asequible comercialmente obtenido de BioWhittaker, y se colocaron en una incubadora de cultivo de tejidos (37°C, CO2 al 5%). Despues de 10 a 15 dfas, las celulas no adherentes se eliminaron por medio de lavado con PBS, que luego se sustituyo por MSCGM. Los matraces se examinaron diariamente para detectar la presencia de diversos tipos de celulas adherentes y, en particular, para la identificacion y la expansion de agrupaciones de celulas fibroblastoides.

Recuperacion y aislamiento de celulas

Las celulas se recuperaron de los perfusatos mediante centrifugacion a X 00 xg durante 15 minutos a temperatura ambiente. Este procedimiento sirvio para separar las celulas de los restos contaminantes y las plaquetas. Los sedimentos celulares se resuspendieron en medio IMDM libre de suero que contema 2 U/ml de heparina y EDTA 2 mM (Gibco BRL, NY). La fraccion total de celulas mononucleares se aislo utilizando Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante y la fraccion de celulas mononucleares se resuspendio. Las celulas se contaron utilizando un hemocitometro. La viabilidad se evaluo mediante exclusion con azul de tnpano. Aislamiento de las celulas mesenquimales se logro mediante "tripsinizacion diferencial", utilizando una solucion de tripsina al 0,05% con EDTA al 0,2% (Sigma, St. Louis MO). La tripsinizacion diferencial fue posible porque las celulas fibroblastoides se separaron de las superficies de plastico en el plazo de aproximadamente cinco minutos, mientras que las otras poblaciones adherentes necesitaron mas de 20-30 minutos de incubacion. Las celulas fibroblastoides separadas se recogieron despues de la tripsinizacion y la neutralizacion

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de la tripsina, utilizando Solucion Neutralizadora de Tripsina (TNS, BioWhittaker). Las celulas se lavaron en H.DMEM y se resuspendieron en MSCGM.

La citometna de flujo se llevo a cabo utilizando un aparato FACSCalibur Becton-Dickinson y se adquirieron anticuerpos monoclonales (mAb) marcados FITC y PE, seleccionados basandose en los marcadores conocidos para MSC (celulas madre mesenquimales) derivadas de medula osea, se adquirieron de los laboratorios BD y Caltag (South San Francisco, CA.), y se obtuvieron hibridomas productores de anticuerpos SH2, SH3 y SH4 y las reactividades de los mAb en sus sobrenadantes de cultivo se detectaron por medio de anticuerpos anti-raton de cabra F(ab)'2 marcados con FITC o PE. La diferenciacion del linaje se llevo a cabo utilizando medios de cultivo de induccion y mantenimiento disponibles en el mercado (BioWhittaker), utilizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Aislamiento de celulas madre de tipo embrionario placentarias

El examen microscopico de las celulas adherentes en los matraces de cultivo revelo tipos de celulas morfologicamente diferentes. Se observo que las celulas en forma de huso, las celulas redondas con nucleos grandes y numerosas pequenas vacuolas perinucleares, y las celulas en forma de estrella con varias proyecciones (a traves de una de las cuales las celulas en forma de estrella estaban unidas al matraz) se adhenan a los matraces de cultivo. Aunque no se hicieron intentos para caracterizar adicionalmente estas celulas adherentes, se observaron celulas similares en el cultivo de sangre de medula osea, cordon y periferica, y por lo tanto considero que no eran de tipo celula madre en la naturaleza. Las celulas fibroblastoides, que aparecieron finalmente como agrupaciones, eran candidatos a ser MSC (celulas madre mesenquimales) y se aislaron mediante tripsinizacion diferencial y se subcultivaron en matraces secundarios. La microscopfa de fase de las celulas redondeadas, despues de la tripsinizacion, revelo que las celulas eran altamente granuladas; indistinguibles de las MSC derivadas de medula osea producidas en el laboratorio o adquiridas de BioWhittaker. Cuando se subcultivaron, las celulas madre de tipo embrionario derivadas de placenta, en contraste con su fase mas temprana, se adhirieron en horas, adoptaron la forma fibroblastoide caractenstica, y formaron un patron de crecimiento identico al de las MSC derivadas de medula osea de referencia. Durante el subcultivo y la realimentacion, por otra parte, las celulas mononucleares debilmente unidas se lavaron y los cultivos se mantuvieron homogeneo y desprovistos de cualquier contaminante visible de celulas no fibroblastoides.

Resultados

La expresion de CD-34, CD-38, y otros marcadores de superficie asociados con celulas madre sobre las celulas mononucleares purificadas de la fraccion temprana y tardfa se evaluo por medio de citometna de flujo. Las celulas clasificadas, recuperadas se lavaron en PBS y a continuacion se tineron doblemente con ficoeritrina anti-CD34 e isotiocianato de fluorescema anti-CD38 (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

El aislamiento de las celulas se logro mediante el uso de la separacion de celulas magneticamente, tal como, por ejemplo, Auto Macs (Miltenyi). Preferiblemente, se lleva a cabo en primer lugar el aislamiento de celulas CD34+.

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo de fabricacion de una matriz de tejido, que comprende sembrar celulas madre placentarias aisladas sobre o dentro de una matriz de tejido, en donde las celulas madre placentarias aisladas no expresan antfgenos MHC Clase 2, en donde dichas celulas madre placentarias son SSAE3-, SSAE4-, OCT-4+ y ABC-p +, en donde dichas celulas madre placentarias son obtenibles por:

(a) exanguinacion de una placenta;

(b) perfusion de la placenta para eliminar sangre residual;

(c) obtencion de las celulas madre placentarias por perfusion de la placenta con una solucion de perfusion; y

(d) separacion de dichas celulas madre placentarias de las demas celulas en dicha solucion de perfusion por tripsinizacion diferencial.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicha solucion de perfusion comprende un anticoagulante.
3. El metodo de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la placenta se perfunde haciendo pasar la solucion de perfusion a lo largo de la arteria umbilical y/o la vena umbilical de dicha placenta.
4. El metodo de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la solucion de perfusion se recoge de la parte de la placenta que estaba unida a la pared del utero de la madre.
5. El metodo de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichas celulas madre placentarias se obtienen de una placenta que ha sido perfundida durante al menos 4 horas.
6. El metodo de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dichas celulas madre placentarias se obtienen de una placenta que ha sido perfundida durante al menos 12 horas.
7. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicha tripsinizacion diferencial comprende dejar que las celulas en dicha solucion de perfusion se unan a una superficie de plastico, seguido de tripsinizacion con 0,05% de tripsina durante aproximadamente 5 minutos para desunir las celulas, y recoleccion de dichas celulas desunidas, en donde dichas celulas desunidas son celulas madre placentarias aisladas.
8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dichas celulas madre placentarias aisladas han sido expandidas.
9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dichas celulas madre placentarias han sido geneticamente modificadas para expresar una protema.
10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dichas celulas madre placentarias aisladas han sido geneticamente modificadas con un vector viral o con un transgen integrado en el genoma de las celulas.
11. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha placenta es humana.
12. Una matriz de tejido que comprende celulas madre placentarias humanas, que son SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y ABC-p+.