JP6169316B2

JP6169316B2 - 改良型細胞組成物およびその作製方法

Info

Publication number: JP6169316B2
Application number: JP2011523815A
Authority: JP
Inventors: ザイトリン，アンディ; ルソッティ，グレゴリー; ヒ−，シューヤン; パル，アジャイ; チェン，ホン，ジェイ．; ブリエバ，トーマス; ショアー，リアン; マーフィー，ブライアン
Original assignee: アンスロジェネシスコーポレーション
Priority date: 2008-08-20
Filing date: 2009-08-20
Publication date: 2017-07-26
Anticipated expiration: 2029-08-20
Also published as: EP3172963A1; KR20110050521A; IL211272A0; RU2563518C2; EP3539380A3; RU2011110455A; WO2010021714A2; IL267138B2; CN102186338A; ZA201101210B; JP2023011760A; US20190261623A1; IL211272A; US20100047213A1; CN105766891A; NZ591292A; JP2012500021A; IL252119B; AU2009283216B2; KR20170023194A

Description

本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００８年８月２０日に出願された米国仮出願第６１／０９０，５７７号の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく利益を主張するものである。

細胞、例えば、幹細胞および胎盤細胞、例えば、単離されたヒト接着性胎盤多分化能細胞、例えば、セクション５．３に記載の胎盤多分化能細胞、または胎盤灌流液から単離した細胞、例えば、胎盤灌流液から単離した全有核細胞を含む改良型組成物、例えば、医薬組成物、およびこの組成物を作製するための改良方法が本明細書で提供される。

細胞組成物、例えば、幹細胞組成物は、いくつかの生理的欠陥、例えば、骨髄置換の魅力的な療法となっている。このような組成物を必要とする個体に投与するための、細胞、例えば、幹細胞の改良型製剤が必要とされている。

細胞、例えば、単離胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞、胎盤多分化能細胞、増殖可能であり少なくとも２つの異なる細胞型、例えば、骨形成原および軟骨形成細胞型に分化する能力を有する胎盤細胞、または胎盤灌流液から単離した細胞、例えば、胎盤灌流液から単離した全有核細胞を含む組成物、例えば、個体への投与に適する細胞を含む組成物、及び当該組成物を作製する改良方法が本明細書で提供される。これらの改良方法は、細胞の凍結前保存処理、凍結保存、および解凍に対する特別なステップおよび特別な組成物を使用する。特定の実施形態では、改良方法は、凍結保存細胞の解凍後塊を低減または除去する。好ましい実施形態では、改良型組成物は胎盤多分化能細胞を含む。

一実施形態では、組成物を作製する方法であって、（ａ）細胞を、デキストランおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む溶液と接触させて細胞含有溶液を形成するステップ、（ｂ）細胞含有溶液を濾過して濾過済み細胞含有溶液を形成するステップ、（ｃ）場合によって、濾過済み細胞含有溶液を、デキストランを含む第１の希釈溶液で、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個の細胞に希釈するステップ、および（ｄ）場合によって、濾過済み細胞含有溶液を、デキストランを含む第２の希釈溶液で希釈するステップを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、（ｂ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１５×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｃ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｃ）は、（ｂ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｃ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、（ｂ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｃ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個の細胞である。具体的な実施形態では、ステップ（ｄ）のデキストランを含む溶液はヒト血清アルブミンを含まない。具体的な実施形態では、濾過済み細胞含有組成物の細胞をステップ（ｄ）の前に凍結保存する。特定の実施形態では、細胞数がステップ（ａ）の後に１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。特定の実施形態では、細胞数がステップ（ａ）の後に１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。

いくつかの実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の溶液中の前記デキストランは、２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のデキストランである。いくつかの実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の溶液中の前記デキストランは、約１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％のデキストランである。第１の希釈溶液または第２の希釈溶液中の前記デキストランは、任意の分子量のデキストラン、例えば約１ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１２５ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約７５ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、または約１ｋＤａ〜約２５ｋＤａの分子量を有するデキストランであってよい。いくつかの実施形態では、第１の希釈溶液または第２の希釈溶液中のデキストランは、約１ｋＤＡ〜約１０ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、または約６０ｋＤａ〜約８０ｋＤａの分子量を有する。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストランはデキストラン１である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液中の前記デキストランはデキストラン１である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストランはデキストラン７０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液中の前記デキストランはデキストラン７０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストランはデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液中の前記デキストランはデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン４０は、２．５％〜１０％デキストラン４０である。いくつかの実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の溶液中の前記デキストラン４０は、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のデキストラン４０である。いくつかの実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の溶液中の前記デキストランは、約１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４０は、５．０％デキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４０は、５．５％デキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン４０は、１０％デキストラン４０である。

他の実施形態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりに多糖を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、マルトデキストラン（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のマルトデキストリン）、トレハロース（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のトレハロース）、またはヘタスターチ（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のヘタスターチ）を含む。他の実施形態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、スクロース（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のスクロース）、ヘパリン（例えば、５５ＵＳＰ単位／１ｍＬのヘパリン）、またはグリコーゲン（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のグリコーゲン）を含む。特定の実施形態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりにマルトデキストランを含む。別の特定の実施形態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりにトレハロースを含む。別の特定の実施形態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりにヘタスターチを含む。

別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１〜１７％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％または１７％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約４〜１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約３．１２５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１６．８７５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約１〜１７％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％または１７％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約４〜１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約３．１２５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約１６．８７５％のＨＳＡである。

他の実施形態では、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＢＳＡ）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＦＢＳ）を、前記溶液中でＨＳＡに加えて、またはＨＳＡ以外に、すなわちＨＳＡの代わりに使用することができる。

いくつかの実施形態では、第１の溶液中のＨＳＡとデキストラン、例えばデキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０の比は、約６：１のＨＳＡ：デキストランと約１：２．６のＨＳＡ：デキストランの間である。いくつかの実施形態では、ＨＳＡとデキストランの比は、約６：１、５．５：１、５：１、４．５：１、４：１、３．５：１、３：１、２．５：１、２．０：１、１．５：１、１：１、１：１．５、１：２または１：２．６のＨＳＡ：デキストランである。いくつかの実施形態では、第１の溶液中のＨＳＡとデキストラン、例えばデキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０の比は、約３．１３％のＨＳＡ／８．２５％のデキストランである。いくつかの実施形態では、第１の溶液中のＨＳＡとデキストラン、例えばデキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０の比は、約１６．８８％のＨＳＡ／２．７５％のデキストランである。特定の実施形態では、第１の溶液中のＨＳＡとデキストラン、例えばデキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０の比は、約１０％のＨＳＡ／５．５％のデキストラン、例えばデキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０である。

別の具体的な実施形態では、ステップ（ａ）の前記溶液または細胞含有溶液は凍結保護剤を含む。より具体的な実施形態では、前記凍結保護剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。特定の実施形態では、ステップ（ａ）に挙げた溶液は、約１％〜約１５％、約２．５％〜約１５％、約２．５％〜約１０％、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％または約１０％〜約１５％のＤＭＳＯを含む。特定の実施形態では、ステップ（ａ）に挙げた溶液は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＤＭＳＯを含む。特定の実施形態では、ステップ（ａ）に挙げた溶液は約５％のＤＭＳＯを含む。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液は凍結保護剤をさらに含む。より具体的な実施形態では、前記凍結保護剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。特定の実施形態では、前記第１の希釈溶液は、約１％〜約１５％、約２．５％〜約１５％、約２．５％〜約１０％、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％または約１０％〜約１５％のＤＭＳＯをさらに含む。特定の実施形態では、前記第１の希釈溶液は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＤＭＳＯをさらに含む。特定の実施形態では、前記第１の希釈溶液は、約５％のＤＭＳＯをさらに含む。

具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液は、約５．５％のデキストラン４０、約１０％のＨＳＡ、および約５％のＤＭＳＯを含む。

特定の実施形態では、前記方法は、細胞および約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のデキストラン、例えばデキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０を含む組成物を生成する。別の特定の実施形態では、前記方法は、細胞および約７．５％〜約９％のデキストラン、例えばデキストラン４０を含む組成物を生成する。別の具体的な実施形態では、前記方法は、１ミリリットル当たり約１．５×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり約３．７５×１０^６個の細胞を含む組成物を生成する。別の具体的な実施形態では、前記方法は、１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり約５．０±１．５×１０^６個の細胞を含む組成物を生成する。他の具体的な実施形態では、方法は、１ミリリットル当たり約１．０×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり１５×１０^６個の細胞、例えば１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり１５×１０^６個の細胞を含む組成物を生成する。別の具体的な実施形態では、前記方法は、約１％のＨＳＡ〜約１５％のＨＳＡを含む組成物を生成する。別の具体的な実施形態では、前記方法は、約１％のＨＳＡ〜約１０％のＨＳＡを含む組成物を生成する。

組成物を作製する方法であって、（ａ）５．５％デキストラン４０および１０％ＨＳＡを含む溶液中の複数の細胞を７０μＭ〜１５０μＭフィルターで濾過して濾過済み細胞含有溶液を形成するステップ、（ｂ）場合によって、濾過済み細胞含有溶液を５．５％のデキストラン４０、１０％のＨＳＡ、および５％のＤＭＳＯで、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個の細胞に希釈するステップ、（ｃ）細胞を凍結保存するステップ、（ｄ）細胞を解凍するステップ、および（ｅ）濾過済み細胞含有溶液を１０％デキストラン４０で希釈して前記組成物を生成するステップを含む方法が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１５×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１５×１０^６個未満の細胞を含む場合、濾過は任意選択である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞を含む場合、濾過は任意選択である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個未満の細胞を含む場合、濾過は任意選択である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｅ）は、濾過済み細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で１：１〜１：５（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｅ）は、濾過済み細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む。より具体的な実施形態では、ステップ（ａ）の細胞含有溶液は、凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、例えば、約２％〜約１５％のＤＭＳＯを追加的に含む。特定の実施形態では、ステップ（ａ）に挙げた溶液は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＤＭＳＯを追加的に含む。特定の実施形態では、ステップ（ａ）に挙げた溶液は、約５％のＤＭＳＯを追加的に含む。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）のフィルターは７０μＭ〜１００μＭフィルターである。

別の実施形態では、組成物を作製するための方法であって、（ａ）複数の細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、（ｂ）細胞を５．５％デキストラン４０に再懸濁するステップ、（ｃ）細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、（ｄ）細胞を、１０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン４０溶液に再懸濁して細胞含有溶液を生成するステップ、（ｅ）細胞含有溶液を４０μＭ〜１５０μＭフィルターで濾過して濾過済み細胞含有溶液を生成するステップ、（ｆ）場合によって、濾過済み細胞含有溶液を５．５％のデキストラン４０、１０％のＨＳＡ、および凍結保護剤、例えば、ＤＭＳＯ、例えば、５％のＤＭＳＯで、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個の細胞に希釈するステップ、（ｇ）細胞を凍結保存するステップ、（ｈ）細胞を解凍するステップ、および（ｉ）細胞含有溶液を１０％デキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希釈して前記組成物を生成するステップを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｆ）は、（ｅ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１５×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｆ）は、（ｅ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｅ）は、（ｅ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｄ）の後に細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満である場合、濾過は任意選択である。特定の実施形態では、ステップ（ｄ）の後に細胞数が１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個未満である場合、濾過は任意選択である。特定の実施形態では、ステップ（ｄ）に挙げた再懸濁が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞を含む細胞含有溶液をもたらす場合、ステップ（ｄ）に挙げた溶液は、凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、例えば、約２％〜約１５％のＤＭＳＯを含み、ステップ（ｆ）は実施しない。好ましい実施形態では、ステップ（ｅ）のフィルターは７０μＭ〜１００μＭフィルターである。

組成物を作製するための方法であって、（ａ）単離胎盤細胞、５．５％のデキストラン４０および１０％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む溶液を、目に見える細胞塊を除去するフィルターで濾過して、濾過済み単離胎盤細胞含有溶液を生成するステップ、（ｂ）場合によって、前記濾過済み単離胎盤細胞含有溶液を１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個の細胞にするのに十分な量の、５．５％のデキストラン４０、１０％のＨＳＡおよび５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む溶液で前記濾過済み単離胎盤細胞含有溶液を希釈するステップ、および（ｃ）前記濾過済み単離胎盤細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で希釈して前記組成物を生成するステップを含む方法が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１５×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個の細胞である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、前記濾過済み単離胎盤細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で、約１：１〜約１：１１の単離胎盤細胞含有溶液：デキストラン４０（ｖ／ｖ）の比で希釈することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、前記濾過済み単離胎盤細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で、約１：１〜約１：５の単離胎盤細胞含有溶液：デキストラン４０（ｖ／ｖ）の比で希釈することを含む。特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満である場合、濾過は任意選択である。特定の実施形態では、ステップ（ａ）後の細胞数が１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個未満である場合、濾過は任意選択である。具体的な実施形態では、前記フィルターは７０μＭフィルターである。別の具体的な実施形態では、前記フィルターは１００μＭフィルターである。別の具体的な実施形態では、ステップ（ａ）のフィルターは７０μＭ〜１００μＭフィルターである。

前述の方法のいずれかの具体的な実施形態では、組成物は医薬組成物である。

前述の方法のいずれかの別の具体的な実施形態では、方法は、生成した細胞組成物を１ミリリットル当たり約５×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり１×１０^８個の細胞に濃縮するステップをさらに含む。このような組成物は、例えば、それを必要とする個体への組成物の皮下投与に有用である。

別の態様では、細胞、例えば、幹細胞、単離胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含む組成物、例えば医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかによって組成物を作製する。本明細書において、一実施形態では、複数の細胞、例えば、幹細胞、単離胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含む組成物、例えば溶液が本明細書で提供され、前記組成物は１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり約５．０±１．５×１０^６個の細胞を含み、前記組成物は目に見える細胞塊は含まない（すなわち、マクロの細胞塊は含まない）、またはこのような目に見える塊は実質的に含まない。特定の他の実施形態では、組成物は、１ミリリットル当たり約１．０×１０^６個の細胞から１ミリリットル当たり１５×１０^６個の間の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個の細胞から１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の間の細胞を含む。特定の他の実施形態では、組成物は１ミリリットル当たり約２０×１０^６個未満の細胞を含む。

いくつかの実施形態では、前記組成物は、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のデキストラン、例えばデキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０を含む。具体的な実施形態では、前記組成物は約７．５％〜約９％のデキストラン４０を含む。具体的な実施形態では、前記組成物は約５．５％のデキストラン４０を含む。

他の実施形態では、前記組成物は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりに多糖を含む。特定の実施形態では、多糖は非グルコース糖サブユニットを含まないグルコースのポリマーである。他の実施形態では、前記組成物は、マルトデキストラン（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のマルトデキストリン）、トレハロース（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のトレハロース）、またはヘタスターチ（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のヘタスターチ）を含む。他の実施形態では、前記組成物は、スクロース（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のスクロース）、ヘパリン（例えば、５５ＵＳＰ単位／１ｍＬのヘパリン）、またはグリコーゲン（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のグリコーゲン）を含む。特定の実施形態では、前記組成物は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりにマルトデキストランを含む。別の特定の実施形態では、前記組成物は、デキストランに加えてまたはデキストランの代わりにトレハロースを含む。別の特定の実施形態では、前記組成物は、デキストランに加えてまたはデキストランの代わりにヘタスターチを含む。

別の具体的な実施形態では、前記組成物は約１〜約１７％のＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％または約１７％のＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約３．１２５％のＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約５％のＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約１０％のＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約１６．８７５％のＨＳＡを含む。

他の実施形態では、前記組成物は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＢＳＡ）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＦＢＳ）を、ＨＳＡに加えて、またはＨＳＡの代わりに含む。

いくつかの実施形態では、前記組成物は、凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、例えば約１％〜約１５％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約１％〜約５％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、約１％〜約１５％、約２．５％〜約１５％、約２．５％〜約１０％、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％または約１０％〜約１５％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＤＭＳＯを含む。特定の実施形態では、組成物は約５％のＤＭＳＯを含む。

具体的な実施形態では、前記細胞は凍結保存および解凍状態である。別の具体的な実施形態では、前記細胞は７０μＭ〜１００μＭフィルターによる濾過状態である。別の具体的な実施形態では、前記組成物は目に見える細胞塊を含まない。別の具体的な実施形態では、前記組成物は１０^６個の細胞当たり約２００個未満の細胞塊を含み、前記細胞塊は顕微鏡、例えば光学顕微鏡下でのみ目に見える。別の具体的な実施形態では、前記組成物は１０^６個の細胞当たり約１５０個未満の細胞塊を含み、前記細胞塊は顕微鏡、例えば光学顕微鏡下でのみ目に見える。別の具体的な実施形態では、前記組成物は１０^６個の細胞当たり約１００個未満の細胞塊を含み、前記細胞塊は顕微鏡、例えば光学顕微鏡下でのみ目に見える。

本明細書に記載の方法または組成物のいずれかの具体的な実施形態では、細胞は幹細胞、例えば、血液を流出させたヒト産後胎盤から単離した幹細胞である。特定の実施形態では、このような細胞は増殖状態である。前述の実施形態のいずれかの別の具体的な実施形態では、細胞は接着性細胞、すなわち、組織培養皿表面、例えば、組織培養プラスチック皿（非コーティング、または例えばフィブロネクチン、ラミニンなどでコーティングのいずれか）に接着する細胞である。接着性細胞の例には、例えば、本明細書に記載の接着性胎盤幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、線維芽細胞などがある。別の実施形態では、細胞はヒト細胞である。

別の実施形態では、前記細胞は胎盤灌流液から得た（例えば単離した）細胞である。より具体的な実施形態では、前記細胞は有核細胞、例えば、胎盤灌流液から得た全有核細胞である。特定の実施形態では、灌流によってそこから全有核胎盤細胞を得る胎盤は血液を流出させ、全有核胎盤細胞を回収するための灌流前に灌流させて残留血液を除去する。特定の他の実施形態では、灌流によってそこから全有核胎盤細胞を得る胎盤は血液を流出させているが、全有核胎盤細胞を回収するための灌流前に灌流させて残留血液を除去することはない。特定の他の実施形態では、灌流によってそこから全有核胎盤細胞を得る胎盤は血液を流出させず、全有核胎盤細胞を回収するための灌流前に灌流させて残留血液を除去することもない。

方法の別の具体的な実施形態では、前記細胞は幹細胞である。より具体的な実施形態では、幹細胞は成体幹細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞、胚生殖細胞、臍帯血幹細胞、羊水幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞または骨膜由来間葉系幹細胞である。別の実施形態では、前記細胞はナチュラルキラー細胞である。

別の具体的な実施形態では、前記細胞は単離胎盤細胞である。特定の実施形態では、単離胎盤細胞は単離胎盤幹細胞である。特定の他の実施形態では、単離胎盤細胞は単離胎盤多分化能細胞である。

特定の実施形態では、単離胎盤細胞は単離胎盤幹細胞である。特定の他の実施形態では、単離胎盤細胞は単離胎盤多分化能細胞である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋である。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞は胎盤幹細胞である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞は多分化能胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞は、神経系の表現型の細胞、骨形成原の表現型の細胞、または軟骨形成の表現型の細胞に分化する能力を有する。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００^＋である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０^＋またはＣＤ４５⁻である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０^＋またはＣＤ４５⁻である。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０^＋またはＣＤ４５⁻である。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０^＋およびＣＤ４５⁻である。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋、ＣＤ９０^＋、ＣＤ４５⁻細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ８０⁻およびＣＤ８６⁻である。

より具体的な実施形態では、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋細胞はさらにＣＤ２９^＋、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ５４^＋、ＣＤ８０⁻、ＣＤ８６⁻、ＳＨ３^＋またはＳＨ４^＋の１つまたは複数である。別のより具体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ４４^＋である。前述の単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞のいずれかの具体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ１１７⁻、ＣＤ１３３⁻、ＫＤＲ⁻（ＶＥＧＦＲ２⁻）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ^＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ⁻、および／またはプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）^＋の１つまたは複数である。

他の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ２００^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋；ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、およびＣＤ２００^＋；ＣＤ２００^＋およびＯＣＴ−４^＋；ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋；ＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋であり、胚様体またはＯＣＴ−４^＋の形成を可能にする条件下で集団を培養すると、前記単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、胚様体またはその任意の組合せの形成を可能にする条件下で集団を培養すると、前記単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、前記ＣＤ２００^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＣＤ２００^＋胎盤細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、およびＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、およびＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ４５⁻、ＯＣＴ−４^＋およびＣＤ２００^＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。

特定の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ８０⁻、ＣＤ８６⁻、ＣＤ９０^＋、ＣＤ１１７⁻、ＣＤ１３３⁻、ＣＤ２００^＋、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、ＳＨ４^＋、ＳＳＥＡ３⁻、ＳＳＥＡ４⁻、ＯＣＴ−４^＋、ＭＨＣ−Ｉ^＋、ＫＤＲ⁻（ＶＥＧＦＲ２⁻）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ^＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ⁻、ＰＤＬ１^＋またはＡＢＣ−ｐ^＋の１つまたは複数であり、この場合ＡＢＣ−ｐは胎盤特異的ＡＢＣ輸送タンパク質（乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）としておよびミトキサントロン耐性タンパク質（ＭＸＲ）としても知られる）である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、ＳＨ４^＋、ＳＳＥＡ３⁻、ＳＳＥＡ４⁻、およびＯＣＴ−４^＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、およびＳＨ４^＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、ＳＨ４^＋およびＯＣＴ−４^＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、ＨＬＡ−１^＋、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、ＳＨ４^＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋およびＡＢＣ−ｐ^＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、ＳＨ４^＋およびＯＣＴ−４^＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋、ＣＤ３４⁻、ＳＳＥＡ３⁻、およびＳＳＥＡ４⁻である。具体的な実施形態では、前記ＯＣＴ−４^＋、ＣＤ３４⁻、ＳＳＥＡ３⁻、およびＳＳＥＡ４⁻細胞はさらにＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、およびＳＨ４^＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋およびＣＤ３４⁻、およびＳＨ３^＋またはＳＨ４^＋のいずれかである。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４⁻、およびＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、またはＯＣＴ−４^＋のいずれかである。特定の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋およびＣＤ２００^＋である。

別の実施形態では、本明細書に記載の治療法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ１０^＋、ＣＤ２９⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ⁻、ＣＤ６２−Ｅ⁻、ＣＤ６２−Ｌ⁻、ＣＤ６２−Ｐ⁻、ＣＤ８０⁻、ＣＤ８６⁻、ＣＤ１０３⁻、ＣＤ１０４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ^＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン^低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４⁻、β２−マイクログロブリン^低、ＭＨＣ−Ｉ^低、ＭＨＣ−ＩＩ⁻、ＨＬＡ−Ｇ^低、および／またはＰＤＬ１^低の１つまたは複数である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は少なくともＣＤ２９⁻およびＣＤ５４⁻である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は少なくともＣＤ４４^＋およびＣＤ１０６^＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は少なくともＣＤ２９^＋である。

別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、同数の骨髄由来間葉系幹細胞より検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１またはｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、およびＺＣ３Ｈ１２Ａの１つまたは複数であり、前記骨髄由来間葉系幹細胞は、前記単離胎盤細胞が経ている継代数と等しい培養の継代数を経ている。より具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、（好ましくはＧｉｂｃｏからの）６０％のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）−ＬＧおよび（好ましくはＳｉｇｍａからの）４０％のＭＣＤＢ−２０１；（好ましくはＨｙｃｌｏｎｅＬａｂｓ．からの）２％ウシ胎児血清；１×インシュリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；（好ましくはＳｉｇｍａからの）１０^−９Ｍのデキサメタゾン；（好ましくはＳｉｇｍａからの）１０^−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート；（好ましくはＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓからの）表皮増殖因子１０ｎｇ／ｍＬ；および（好ましくはＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓからの）血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬを含む培地において約３〜約３５の集団倍加で培養すると、前記１つまたは複数の遺伝子を発現する。より具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、（好ましくはＧｉｂｃｏからの）６０％のＤＭＥＭ−ＬＧおよび（好ましくはＳｉｇｍａからの）４０％のＭＣＤＢ−２０１；（好ましくはＨｙｃｌｏｎｅＬａｂｓ．からの）２％ウシ胎児血清；１×インシュリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；（好ましくはＳｉｇｍａからの）１０^−９Ｍのデキサメタゾン；（好ましくはＳｉｇｍａからの）１０^−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート；（好ましくはＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓからの）表皮増殖因子１０ｎｇ／ｍＬ；および（好ましくはＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓからの）血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬを含む培地において約３〜約３５の集団倍加で培養すると、前記１つまたは複数の遺伝子を発現する。

別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞は、神経栄養増殖因子グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現する。

別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、その細胞の少なくとも５０％が前記単離胎盤細胞である細胞の集団内に含有される。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、その細胞の少なくとも７０％が前記単離胎盤細胞である細胞の集団内に含有される。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、その細胞の少なくとも８０％が前記単離胎盤細胞である細胞の集団内に含有される。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、その細胞の少なくとも９０％が前記単離胎盤細胞である細胞の集団内に含有される。特定の他の実施形態では、前記細胞集団中の胎盤細胞は、母方の遺伝子型を有する細胞は実質的に含まず、例えば、前記集団中の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の胎盤細胞が胎児の遺伝子型を有する、すなわち胎児起源である。特定の他の実施形態では、前記胎盤細胞を含む細胞の集団は、母方の遺伝子型を有する細胞は実質的に含まず、例えば、前記集団中の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の細胞が胎児の遺伝子型を有する、すなわち胎児起源である。

特定の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４^＋胎盤細胞、例えば造血胎盤細胞である。このような細胞は、胎盤組織から、例えば臍帯血を流出させ、灌流させて残留血液を除去した胎盤から得ることができる。特定の実施形態では、ＣＤ３４^＋胎盤細胞はＣＤ３８^＋である。特定の実施形態では、ＣＤ３４^＋胎盤細胞はＣＤ３８⁻である。特定の他の実施形態では、ＣＤ３４^＋胎盤細胞はＣＤ４５^＋である。具体的な実施形態では、胎盤細胞はＣＤ３４^＋、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５^＋である。

単離胎盤細胞の任意の前述の実施形態では、単離胎盤細胞は、増殖培地、すなわち増殖を促進するように処方した培地における培養中に、例えば増殖培地における増殖中に一般に分化しない。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、増殖するためのフィーダー層を必要としない。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、フィーダー細胞層の不在下での培養の結果として培養中に分化しない。

別のより具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、血液を流出させ、灌流させて残留血液を除去した産後胎盤、血液を流出させているが灌流させて残留血液を除去することはない産後胎盤、または血液を流出させておらず灌流させて残留血液を除去することもない産後胎盤の灌流によって得る。別のより具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、胎盤組織の物理的および／または酵素による破壊によって得る。

前述の方法の特定の実施形態では、単離胎盤細胞を、胎盤細胞バンクの構築の一部として濾過および凍結保存する。例えば、単離胎盤細胞を胎盤または胎盤組織から単離し、培養した後、例えばデキストラン、例えばデキストラン４０、例えば５．５％のデキストラン４０を含む溶液に再懸濁する。より具体的な実施形態では、溶液は凍結保存用の調製におけるＨＳＡおよび／またはＤＭＳＯをさらに含む。当該バンク中の凍結保存した単離胎盤細胞は、必要に応じて解凍し、例えば本明細書に記載するように１０％のデキストラン４０を含む溶液で希釈する。方法の特定の実施形態では、本明細書に記載の濾過および希釈法は単離胎盤細胞の初期単離の一部ではない。

特定の実施形態では、前記単離胎盤細胞は、血液を流出させ、灌流させて残留血液を除去した産後胎盤の灌流によって得る。別のより具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、胎盤組織の物理的および／または酵素による破壊によって得る。

ＨＳＡ、デキストラン４０およびＤＭＳＯの解空間、および細胞の生存および増殖に対する様々な成分濃度の影響を評価するための実験設計を示す三角図である。異なる割合（％）のＤＭＳＯを含む製剤に関する濾過保持アッセイ（ＦＲＡ）データを示す図である。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置での読み出し値として、充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）でデータを表す。アッセイ対照＝１００％デキストラン４０溶液、細胞染色剤含む、細胞含まず。ＨＳＡの異なる体積分率を含む細胞製剤に関するＦＲＡデータを示す図である。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置での読み出し値として、充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）でデータを表す。アッセイ対照＝１００％デキストラン４０溶液、細胞染色剤含む、細胞含まず。異なる割合（％）のＤＭＳＯ（０〜２０％）を含む細胞製剤に関する解凍後のトリパンブルーを用いた生存率を示す図である。様々な濃度のＤＭＳＯ（０〜２０％）の作用（function）としての解凍後の全細胞回収率を示す図である。ＭＴＳアッセイ（以下のセクション６．３．１を参照）によって評価した、異なる割合（％）のＤＭＳＯを含む様々な製剤の作用としての培養再建の図である。２５％ＨＳＡの異なる体積分率を含む細胞製剤の解凍後の細胞生存率を示す図である。ＨＳＡ体積分率の作用としての解凍後の全細胞回収率を示す図である。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）水性非放射性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の使用によって作製した、ＨＳＡの異なる分率の作用としての培養再建を評価したデータを示す図である。異なる濃度の製剤成分を含む製剤に関するビーズ反応アッセイによって評価した免疫抑制のレベルの図である。ＦＲＡアッセイにより決定した様々な凍結細胞密度（１〜４０×１０^６個の細胞／ｍＬ）の作用としての細胞凝集の図である。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置での読み出し値として、充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）でデータを表す。凍結細胞密度（１００万〜４０００万個の細胞／ｍＬ）の作用としての細胞凝集の図である。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置での読み出し値として、充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）でデータを表す。ＦＲＡアッセイにより決定した様々な分子量のデキストランの作用としての細胞凝集の図である。デキストラン１，０００、４０，０００および７０，０００（すなわち、それぞれデキストラン１、デキストラン４０およびデキストラン７０）にわたるＦＲＡシグナル等価。充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）でデータを表す。アッセイ対照＝１００％デキストラン４０溶液、細胞染色剤含む、細胞含まず。異なる分子量のデキストランを含む製剤にわたる解凍後の生存率を示す図である。異なる分子量のデキストランを含む製剤にわたる細胞回収率を示す図である。異なる分子量のデキストランを含む製剤にわたるＣＤ１０５^＋／ＣＤ２００^＋を示す図である。異なる分子量のデキストランを含む製剤にわたるビーズＴ細胞反応（ＢＴＲ）のデータを示す図である。異なる多糖を含む製剤にわたるＦＲＡにより測定した細胞凝集を示す図である。アッセイ対照＝１００％デキストラン４０溶液、細胞染色剤含む、細胞含まず。非デキストラン４０多糖で製剤化した細胞の解凍後の生存率を示す図である。充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）でデータを表す。異なる多糖を含む製剤の作用としての生存細胞回収率の図である。デキストラン４０、またはデキストラン４０の代わりにマルトデキストラン、スクロース、トレハロース、ヘパリン、ヘタスターチもしくはグリコーゲンを含む細胞製剤におけるＣＤ１０５^＋／ＣＤ２００^＋の発現を示す図である。デキストラン４０および６個の非デキストラン４０の異なる糖／多糖に関するＢＴＲデータを示す図である。１０％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む製剤にわたるＦＲＡにより測定した細胞凝集を示す図である。アッセイ対照＝１００％デキストラン４０溶液、細胞染色剤含む、細胞含まず。１０％ＨＳＡ、１０％ＢＳＡまたは１０％ＦＢＳを含む製剤にわたる細胞の解凍後の生存率の図である。１０％ＨＳＡ、４％ＨＳＡ、１０％ＢＳＡまたは１０％ＦＢＳを含む製剤にわたる解凍後の回収率を示す図である。１０％ＨＳＡ、４％ＨＳＡ、１０％ＢＳＡまたは１０％ＦＢＳを含む製剤にわたるＣＤ１０５^＋／ＣＤ２００^＋の発現により測定した細胞の同一性を示す図である。１０％ＨＳＡ、１０％ＢＳＡまたは１０％ＦＢＳを含む製剤にわたるＣＤ３４−／ＣＤ１０＋の発現を示す図である。１０％ＨＳＡ、４％ＨＳＡ、１０％ＢＳＡまたは１０％ＦＢＳを含む製剤にわたるＢＴＲアッセイにより測定した細胞機能を示す図である。骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に関する、ＦＲＡの細胞凝集の結果を示す図である。充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）でデータを表す。

５．詳細な説明
５．１定義
本明細書で使用する用語「約」は、例えば、言及する数字または値の１０％以内を意味する。

本明細書で使用する「マクロ細胞塊」は、拡大せずに目に見える、例えば裸眼で見える細胞の凝集を意味し、一般に約１５０ミクロンより大きい細胞凝集を指す。

本明細書で使用する「ミクロ細胞塊」は、拡大してのみ目に見える細胞の凝集を意味し、一般に約１５０ミクロンより小さい細胞凝集を指す。

本明細書で使用する用語「ＳＨ２」は、マーカーＣＤ１０５上のエピトープと結合する抗体を指す。したがって、ＳＨ２^＋と呼ぶ細胞はＣＤ１０５^＋である。

本明細書で使用する用語「ＳＨ３」および「ＳＨ４」は、マーカーＣＤ７３上のエピトープと結合する抗体を指す。したがって、ＳＨ３^＋および／またはＳＨ４^＋と呼ぶ細胞はＣＤ７３^＋である。

本明細書で使用する用語「単離細胞」、例えば「単離幹細胞」は、細胞が由来する組織、例えば胎盤の他の細胞から実質的に分離された細胞を意味する。その細胞と本来結合していた少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または少なくとも９９％の細胞が、例えば細胞の回収および／または培養中に細胞が除去される場合、細胞は「単離」されている。

本明細書で使用する「多分化能」は、細胞を指すとき、細胞が、必ずしも全てではないがいくつかの身体の細胞型、または全てではないがいくつかの身体の細胞型の特性を有する細胞に、分化する能力を有することを意味する。特定の実施形態では、例えば、軟骨形成または骨形成原細胞の特性を有する細胞のいずれかに分化する能力を有する単離多分化能細胞が、多分化能細胞である。

本明細書で使用する用語「単離細胞の集団」は、細胞の集団が由来する組織、例えば胎盤の他の細胞から実質的に分離された細胞の集団を意味する。

本明細書で使用する用語「胎盤幹細胞」は、形態、細胞表面マーカー、または初代培養後の継代数とは無関係に、哺乳動物の胎盤に由来する幹細胞または前駆細胞を指す。胎盤幹細胞は、血液、例えば臍帯血または胎盤血液からは得られず、かつ入手不能である。しかしながら、本明細書で使用する用語「胎盤幹細胞」および「胎盤多分化能細胞」は、栄養膜細胞、血管芽細胞、血液芽細胞、胚生殖細胞、胚幹細胞ではない胎盤幹細胞および胎盤多分化能細胞、または胚盤胞の内部細胞塊から得られる細胞、胚生殖隆起から得られる細胞、例えば胚生殖細胞は指さない。細胞が幹細胞の特性、例えば、１つまたは複数の型の幹細胞と関係があるマーカーまたは遺伝子発現プロファイル、培養中に少なくとも１０〜４０回複製する能力、３つの生殖層の１つまたは複数の細胞に分化する能力、成体（すなわち分化した）細胞の特性の欠如などを示す場合、細胞は「幹細胞」であると考えられる。用語「胎盤幹細胞」と「胎盤由来幹細胞」は同意義で使用することができる。本明細書で他に記さない限り、用語「胎盤」は臍帯を含む。本明細書で開示する胎盤幹細胞は、特定の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ（分化条件下で）分化する、ｉｎｖｉｖｏで分化する、または両方である。

本明細書で使用するように、細胞、例えば幹細胞は、そのマーカーがバックグラウンドを超えて検出可能であるとき特定のマーカーに「陽性」である。例えば、胎盤幹細胞は例えばＣＤ７３に陽性である。ＣＤ７３は、（例えば、アイソタイプ対照と比較して）バックグラウンドを超える検出可能な量で、胎盤幹細胞において検出可能であるからである。マーカーを使用して少なくとも１つの他の細胞型とある細胞とを区別することができるとき、または、存在時または細胞によって発現されるときにマーカーを使用して細胞を選択または単離することができるときも、その細胞はそのマーカーに陽性である。例えば抗体仲介の検出の状況で、特定の細胞表面マーカーが存在する指標としての「陽性」は、そのマーカーに特異的な抗体、例えば蛍光標識抗体を使用してマーカーが検出可能であることを意味する。「陽性」は、例えばサイトメーターにおいて、バックグラウンドを超えて検出可能であるシグナルを生成する量で、そのマーカーを示す細胞も指す。例えば、ＣＤ２００に特異的な抗体で細胞が検出可能に標識され、抗体からのシグナルが対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）のそれより検出可能に高い場合、細胞は「ＣＤ２００^＋」である。逆に、同じ状況での「陰性」は、バックグラウンドと比較して、そのマーカーに特異的な抗体を使用して細胞表面マーカーが検出不能であることを意味する。例えば、対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）より高い程度でＣＤ３４に特異的な抗体を用いて細胞を再現的に検出可能に標識できない場合、細胞は「ＣＤ３４⁻」である。抗体を使用して検出されない、または検出不能なマーカーは、適切な対照を使用する同様の形式で、陽性または陰性であると決定する。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、スロットブロットなどのＲＮＡを検出する方法によって決定される、細胞または細胞集団由来のＲＮＡ中で検出されるＯＣＴ−４のＲＮＡの量が、バックグラウンドを超えて検出可能である場合、その細胞または細胞集団はＯＣＴ−４^＋であると決定することができる。本明細書で他に記さない限り、分化集団（「ＣＤ」）マーカーは抗体を使用して検出する。ＯＣＴ−４のＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲを使用して検出可能である場合、ＯＣＴ−４が存在すると決定することができ、細胞は「ＯＣＴ−４^＋」である。

５．２細胞を含む改良型組成物および組成物の作製方法
細胞、例えば、幹細胞および胎盤幹細胞を含む組成物を作製する改良方法、およびそれによって生成する改良型組成物、例えば、医薬組成物が本明細書で提供される。細胞を含む組成物、例えば、液体形で投与可能な組成物は、例えば、細胞塊、特に裸眼で見える細胞塊（すなわち、マクロの細胞塊）を、個体への医薬組成物の投与の前に除去するとき、レシピエントによって一般に十分許容される。本明細書に記載の細胞、例えば、血液を流出させたヒト産後胎盤由来の幹細胞などの幹細胞、胎盤細胞を含む組成物を作製する方法は、個体に投与するとき実質的に十分許容される組成物を生成する。

一実施形態では、組成物を作製する方法であって、細胞を含む溶液を濾過して濾過済み細胞含有溶液を形成するステップ、例えば凍結保存前に、濾過済み細胞含有溶液を第１の希釈溶液で、１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個以下の細胞に希釈するステップ、および場合によって、生成した濾過済み細胞含有溶液を、デキストランを含む第２の希釈溶液で希釈して前記組成物を生成するステップを含む方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、組成物を作製する方法であって、細胞を含む溶液を濾過して濾過済み細胞含有溶液を形成するステップ、例えば凍結保存前に、濾過済み細胞含有溶液を第１の希釈溶液で、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個以下の細胞に希釈するステップ、および場合によって、生成した濾過済み細胞含有溶液を、デキストランを含む第２の希釈溶液で希釈して前記組成物を生成するステップを含む方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満である場合、濾過は任意選択である。

具体的な実施形態では、細胞は幹細胞である。より具体的な実施形態では、幹細胞は骨髄由来間葉系幹細胞、または成体幹細胞である。具体的な実施形態では、細胞は単離胎盤細胞である。より具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞である。別の具体的な実施形態では、細胞は胎盤灌流液由来の細胞、例えば胎盤灌流液由来の有核細胞である。胎盤灌流液細胞を得る方法は以下のセクション５．３．４に記載する。

具体的な実施形態では、第１の希釈溶液を用いた前記希釈と前記第２の希釈溶液を用いた前記希釈の間に、細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、第１の希釈溶液はデキストランおよびＨＳＡを含む。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストランは、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のデキストランである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストランは、デキストラン１である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液中の前記デキストランは、デキストラン１である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストランは、デキストラン７０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液中の前記デキストランは、デキストラン７０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストランは、デキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液中の前記デキストランは、デキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４０は、約２．５％のデキストラン４０〜約１０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４０は、約２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％または１０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４０は、約５．５％のデキストラン４０である。

他の実施形態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりに多糖を含むことができる。特定の実施形態では、多糖はグルコースのポリマー（２個以上のサブユニット）であり、グルコースではない糖サブユニットは含まない。他の実施形態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、マルトデキストリン（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のマルトデキストリン）、トレハロース（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のトレハロース）、またはヘタスターチ（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のヘタスターチ）の１つまたは複数を含む。他の実施形態では、第１および／または第２の希釈溶液は、スクロース（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のスクロース）、ヘパリン（例えば、約５５ＵＳＰ単位／１ｍＬのヘパリン）、またはグリコーゲン（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のグリコーゲン）の１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりにマルトデキストランを含む。別の特定の実施形態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりにトレハロースを含む。別の特定の実施形態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりにヘタスターチを含む。

別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１〜１７％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％または約１７％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約４〜１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約３．１２５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１６．８７５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液はＨＳＡを含む。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約１〜１７％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％または１７％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約４〜１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約３．１２５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約１６．８７５％のＨＳＡである。

別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液は凍結保護剤をさらに含む。より具体的な実施形態では、前記凍結保護剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。特定の実施形態では、前記第１の希釈溶液は約１％〜約１５％、約２．５％〜約１５％、約２．５％〜約１０％、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％または約１０％〜約１５％のＤＭＳＯをさらに含む。特定の実施形態では、前記第１の希釈溶液は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＤＭＳＯをさらに含む。特定の実施形態では、前記第１の希釈溶液は、約５％のＤＭＳＯをさらに含む。

別の具体的な実施形態では、前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン４０は約１０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、細胞を含む前記組成物は、約２．５％、３．０％、３．２５％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、または１０％のデキストランを含む。別の具体的な実施形態では、細胞を含む前記組成物は、約７．５％〜約９％のデキストランを含む。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、１ミリリットル当たり約１．５×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり約５．０×１０^６個の細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり約５．０±１．５×１０^６個の細胞を含む。具体的な実施形態では、前記第２の希釈溶液はＨＳＡを含まない。

本明細書で提供する方法に有用なデキストランは、約１ｋＤａと約１５０ｋＤａの間、例えば１ｋＤａ（デキストラン１）、約４０ｋＤａ（デキストラン４０）または約７０ｋＤａ（デキストラン７０）の分子量のデキストランであってよい。

別の具体的な実施形態では、細胞を含む溶液は凍結保護剤を含む。細胞を含む溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞を含む場合、第１の希釈ステップは省略することができ、特定の実施形態では、細胞を懸濁する溶液は、凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、例えば約２％〜約１５％のＤＭＳＯ、例えば約５％のＤＭＳＯを含むことができる。

別の実施形態では、組成物を作製する方法であって、（ａ）細胞、例えば、単離胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞もしくは胎盤多分化能細胞、または胎盤灌流液から単離した細胞、例えば、胎盤灌流液から単離した全有核細胞、デキストランおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む溶液を濾過して、濾過済み細胞含有溶液を形成するステップ、（ｂ）場合によって、前記濾過済み細胞含有溶液を、デキストランを含む第１の希釈溶液で、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個の細胞に希釈するステップ、および（ｃ）場合によって、濾過済み細胞含有溶液を、デキストランを含むがＨＳＡを含まない第２の希釈溶液で希釈し、それによって組成物を作製するステップを含む方法が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１５×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞である。前記濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞を含むいくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の希釈は省略し、ステップ（ａ）の溶液は凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、例えば約２％〜約１５％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個の細胞である。方法の具体的な実施形態では、ステップ（ｃ）の前に前記細胞を凍結保存する。特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満である場合、濾過は任意選択である。方法の具体的な実施形態では、ステップ（ｃ）の前に前記細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストランは、デキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液中の前記デキストランは、デキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４０は５．０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４０は５．５％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記細胞を含む溶液中の前記ＨＳＡは約１％のＨＳＡ〜約１５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液はＨＳＡを含む。より具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは５％のＨＳＡである。より具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液は凍結保護剤をさらに含む。より具体的な実施形態では、前記凍結保護剤は例えばＤＭＳＯ、例えば約２％〜約１５％のＤＭＳＯである。別の具体的な実施形態では、前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン４０は１０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、ステップ（ａ）の前記溶液は凍結保護剤を含む。

方法の一態様では、細胞を含む最終組成物中の細胞塊の数を、好ましくは凍結保存の前に、濾過を使用して低減またはゼロにする。細胞含有溶液中の細胞を凍結保存する特定の実施形態では、凍結保存の前に細胞含有溶液を濾過する。例えば、溶液中の細胞、例えば胎盤幹細胞を、凍結保存の前にフィルターを通過させて、目に見える細胞塊（細胞の凝集、すなわちマクロの細胞塊）を除去することが可能である。一実施形態では、濾過は、前記細胞を凍結保存する前に細胞含有溶液をフィルターで濾過することを含み、前記フィルターは約５０μＭ径と約１５０μＭ径の間の孔を含み（すなわち、フィルターは約５０μＭフィルター〜約１５０μＭフィルターである）、フィルターは細胞を含む溶液を濾過するのに適している。例えば、フィルターは、約５０μＭと約８０μＭの間、約６０μＭと約９０μＭの間、約７０μＭと約１００μＭの間、約８０μＭと約１１０μＭの間、約９０μＭと約１２０μＭの間、約１００μＭと約１３０μＭの間、約１１０μＭと約１４０μＭの間、または約１２０μＭと約１５０μＭの間の孔を含むフィルターであってよく、または５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５または１５０μＭフィルターであってよい。具体的な実施形態では、前記フィルターは７０μＭフィルターである。別の具体的な実施形態では、前記フィルターは１００μＭフィルターである。別の具体的な実施形態では、前記フィルターは約７０μＭフィルター〜１００μＭフィルターである。別の具体的な実施形態では、前記細胞含有溶液は解凍後に濾過し、さらに凍結前に濾過する。

他の特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。

様々な実施形態では、細胞、例えば、単離胎盤細胞を含む組成物を作製する方法は、１ミリリットル当たり約５０×１０^６、４０×１０^６、３０×１０^６、２０×１０^６、１５×１０^６、１０×１０^６、９．５×１０^６、９×１０^６、８．５×１０^６、８×１０^６、７．５×１０^６、７×１０^６、６．５×１０^６、６×１０^６、５．５×１０^６、５×１０^６、４．５×１０^６、４×１０^６、３．５×１０^６、３×１０^６、または２．５×１０^６個の細胞を超えない細胞を凍結保存するステップを含む。具体的な実施形態では、１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個以下の細胞で細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、１ミリリットル当たり約１５×１０^６個以下の細胞で細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、１ミリリットル当たり約５×１０^６個以下の細胞で細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、１ミリリットル当たり約５．０×１０^６個〜約７．５×１０^６個の細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、１ミリリットル当たり約５×１０^６個の細胞で細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個の細胞で細胞を凍結保存する。具体的な実施形態では、１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞で細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、前記細胞を解凍しデキストラン４０、例えば１０％のデキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）、例えば１：１〜１：５（ｖ／ｖ）に希釈したとき、１０^６個の細胞当たり２個以下の目に見える細胞塊（すなわちマクロ細胞塊）の形成をもたらす数で、前記細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、前記細胞を解凍し、デキストラン４０、例えば１０％のデキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）、例えば１：１〜１：５（ｖ／ｖ）に希釈したとき、目に見える細胞塊の形成をもたらさない数で、前記単離胎盤細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、前記細胞を解凍し、１０％のデキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）、例えば１：１〜１：５（ｖ／ｖ）に希釈したとき、１０^６個の細胞当たり約１５０、１４０、１３０、１２０、１１０または１００未満のミクロ細胞塊の形成をもたらす数で、前記細胞を凍結保存する。

別の実施形態では、組成物を作製する方法であって、例えば、凍結保存後に、細胞、例えば、単離胎盤細胞を、デキストラン４０を含む溶液と接触させるステップ、例えば、細胞を、デキストラン４０を含む溶液に再懸濁するステップまたは細胞を希釈するステップを含む方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、溶液は約２．５％のデキストラン４０〜約１０％のデキストラン４０（ｗ／ｖ）を含む。具体的な実施形態では、溶液は約５％のデキストラン４０〜約１０％のデキストラン４０（ｗ／ｖ）を含む。別の具体的な実施形態では、溶液は５．０％のデキストラン溶液または１０％のデキストラン溶液である。別の具体的な実施形態では、溶液は５．５％のデキストラン溶液または１０％のデキストラン溶液である。他の実施形態では、デキストランは、分子量、例えば約１キロダルトンと約１５０キロダルトンの間の平均分子量を有する。他の実施形態では、デキストランは、分子量、例えば約１ｋＤａと約１５０ｋＤａの間、約１ｋＤａと約１２５ｋＤａの間、約１ｋＤａと約１００ｋＤａの間、約１ｋＤａと約７５ｋＤａの間、約１ｋＤａと約５０ｋＤａの間、または約１ｋＤａと約２５ｋＤａの間の平均分子量を有する。他の実施形態では、デキストランは、分子量、例えば約１ｋＤａと約１０ｋＤａの間、約３０ｋＤａと約５０ｋＤａの間、または約６０ｋＤａと約８０ｋＤａの間の平均分子量を有する。他の実施形態では、溶液は約２％のデキストラン〜約２５％のデキストランを含む。具体的な実施形態では、前記溶液はＨＳＡを含まない。別の具体的な実施形態では、前記溶液は、前記細胞、例えば、前記胎盤幹細胞と密度が適合する。例えば溶液は、単離胎盤細胞の密度の５％、２％、１％、０．５％、０．２％または０．１％以内にある。別の具体的な実施形態では、溶液は前記細胞と密度が適合しない。

別の実施形態では、細胞、例えば、単離胎盤細胞を含む組成物を作製する方法は、（ａ）凍結保存前に前記細胞を含む細胞含有溶液を濾過するステップ、（ｂ）細胞を１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個の細胞で凍結保存するステップ、（ｃ）細胞を解凍するステップ、および（ｄ）細胞含有溶液をデキストラン４０溶液で約１：１（ｖ／ｖ）〜約１：１１に希釈するステップを含む。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）において約１５×１０^６個の細胞を凍結保存する。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）において細胞を１ミリリットル当たり最大１５×１０^６個の細胞で凍結保存する。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）において１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個を超えない細胞を凍結保存する。他の特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。より具体的な実施形態では、ステップ（ｂ）の細胞は、約５％〜約１０％のデキストラン４０およびＨＳＡを含む溶液中に凍結保存する。

別の実施形態では、組成物を作製する方法は、
（ａ）細胞、５．５％デキストラン４０溶液、および１０％ＨＳＡを含む溶液を７０μＭフィルターで濾過して濾過済み細胞含有溶液を生成するステップ、
（ｂ）濾過済み細胞含有溶液を、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯを含む溶液で、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個の細胞に希釈するステップ、
（ｄ）前記濾過済み細胞含有溶液中の細胞を凍結保存するステップ、
（ｅ）細胞を解凍するステップ、および
（ｆ）場合によって、濾過済み細胞含有溶液を１０％デキストラン４０で希釈するステップ
を含む。

特定の実施形態では、ステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞である。濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞を含む実施形態では、ステップ（ａ）の溶液は凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、例えば約１％〜約５％のＤＭＳＯを含み、ステップ（ｂ）は省略する。他の特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｆ）は、濾過済み細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｆ）は、濾過済み細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で１：１〜１：５（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物を作製する方法は、
（ａ）複数の細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、
（ｂ）細胞を５．５％デキストラン４０に再懸濁するステップ、
（ｃ）細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、
（ｄ）細胞を、１０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン４０溶液に再懸濁して細胞含有溶液を生成するステップ、
（ｅ）細胞含有溶液を、７０μＭフィルターで濾過して濾過済み細胞含有溶液を生成するステップ、
（ｆ）濾過済み細胞含有溶液を５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯを含む溶液中に、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個の細胞に希釈するステップ、
（ｇ）前記濾過済み細胞含有溶液中の細胞を凍結保存するステップ、
（ｈ）細胞を解凍するステップ、および
（ｉ）場合によって、濾過済み細胞含有溶液を１０％デキストラン４０で希釈するステップを含む。

特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞である。他の特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。ステップ（ｄ）の前記再懸濁が、１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞を含む細胞含有溶液を生成する実施形態では、ステップ（ｄ）の溶液は凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、例えば約１％〜約５％のＤＭＳＯを含み、ステップ（ｆ）は省略する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）は、濾過済み細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で１：１〜１：５（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）は、濾過済み細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む。

前述の方法のいずれかの具体的な実施形態では、組成物中のＤＭＳＯの最終濃度が約２．５％、２．０％、１．５％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％または約０．１％未満であるように、細胞を含む組成物からＤＭＳＯを実質的に除去する。ＤＭＳＯの除去は、例えば、細胞を遠心分離にかけその細胞を１０％デキストラン４０に再懸濁することによって実施することができる。このような遠心分離および再懸濁のステップは、１回または複数回繰り返すことができる。

前述の方法のいずれかの別の具体的な実施形態では、方法は、生成した細胞組成物を１ミリリットル当たり約５×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり１×１０^８個の細胞に濃縮するステップをさらに含む。このような組成物は、例えば、その必要性がある個体への組成物の皮下投与に有用である。

前述の方法のいずれかの別の具体的な実施形態では、細胞は胎盤幹細胞以外の細胞である。より具体的な実施形態では、例えば、細胞は幹細胞または非幹細胞であってよい。細胞が幹細胞である具体的な実施形態では、幹細胞は、例えば成体幹細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞、胚生殖細胞、臍帯血幹細胞、羊水幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞または骨膜由来間葉系幹細胞であってよい。別の具体的な実施形態では、細胞はナチュラルキラー細胞、例えばＣＤ３⁻、ＣＤ５６^＋ナチュラルキラー細胞である。

別の態様において、組成物、例えば医薬組成物が本明細書で提供される。特定の実施形態では、前述の方法によって組成物を作製する。特定の実施形態では、組成物は目に見える細胞塊、すなわちマクロの細胞塊を欠く。特定の他の実施形態では、組成物は、濾過しなかった組成物と比較して、ミクロ細胞塊（顕微鏡、例えば光学顕微鏡を用いてのみ目に見える塊）の数が相当減少した、例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％未満のミクロ細胞塊を含む。

一実施形態では、１０％デキストラン４０を含む溶液中に、複数の細胞、例えば、複数の単離胎盤細胞、または胎盤灌流液から単離した細胞、例えば、胎盤灌流液から単離した全有核細胞を含む、組成物、例えば医薬組成物が本明細書で提供され、前記組成物は１ミリリットル当たり約１．０±３×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり約５．０±１．５×１０^６個の細胞を含み、前記組成物は目に見える細胞塊を含まない（すなわちマクロの細胞塊を含まない）。いくつかの実施形態では、前記組成物は１ミリリットル当たり約１．５×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり約３．７５×１０^６個の細胞を含む。特定の他の実施形態では、組成物は１ミリリットル当たり約１．０×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞を含む。特定の他の実施形態では、組成物は１ミリリットル当たり約２０×１０^６個未満の細胞を含む。具体的な実施形態では、前記細胞は凍結保存および解凍状態である。別の具体的な実施形態では、前記細胞を７０μＭ〜１００μＭフィルターで濾過している。別の具体的な実施形態では、前記組成物はマクロの細胞塊を含まない。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、１０^６個の細胞当たり約２００未満のミクロ細胞塊を含む。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、１０^６個の細胞当たり約１５０未満のミクロ細胞塊を含む。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、１０^６個の細胞当たり約１００未満のミクロ細胞塊を含む。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満のＤＭＳＯを含む。

いくつかの実施形態では、組成物は約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のデキストラン、例えばデキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０を含む。具体的な実施形態では、前記組成物は約７．５％〜約９％のデキストラン４０を含む。具体的な実施形態では、前記組成物は約５．５％のデキストラン４０を含む。

他の実施形態では、前記組成物は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりに多糖を含む。特定の実施形態では、多糖は非グルコース糖サブユニットを含まないグルコースのポリマーである。他の実施形態では、前記組成物は、マルトデキストリン（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のマルトデキストリン）、トレハロース（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のトレハロース）、またはヘタスターチ（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のヘタスターチ）を含む。他の実施形態では、前記組成物は、スクロース（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のスクロース）、ヘパリン（例えば、５５ＵＳＰ単位／１ｍＬのヘパリン）、またはグリコーゲン（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のグリコーゲン）を含む。特定の実施形態では、前記組成物は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりにマルトデキストランを含む。別の特定の実施形態では、前記組成物は、デキストランに加えてまたはデキストランの代わりにトレハロースを含む。別の特定の実施形態では、前記組成物は、デキストランに加えてまたはデキストランの代わりにヘタスターチを含む。

別の具体的な実施形態では、前記組成物は約１〜約１７％のＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％または１７％のＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約３．１２５％のＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約５％のＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約１０％のＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約１６．８７５％のＨＳＡを含む。

細胞を含む組成物が本明細書でさらに提供され、前記組成物は本明細書で開示する方法の１つによって生成する。例えば一実施形態では、細胞を含む組成物が本明細書で提供され、前記組成物は、細胞を含む溶液を濾過して濾過済み細胞含有溶液を形成するステップ、例えば凍結保存前に、濾過済み細胞含有溶液を第１の希釈溶液で、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個の細胞に希釈するステップ、および生成した濾過済み細胞含有溶液を、デキストランを含むがＨＳＡを含まない第２の希釈溶液で希釈して前記組成物を生成するステップを含む方法によって生成する。特定の実施形態では、前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、前記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、前記希釈は１ミリリットル当たり約７．５×１０^６個の細胞である。他の特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。特定の実施形態では、第１の希釈溶液を用いた前記希釈と第２の希釈溶液を用いた前記希釈の間に細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、第１の希釈溶液はデキストランおよびＨＳＡを含む。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中のデキストランはデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液中のデキストランはデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４０は５．０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４０は５．５％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液はＨＳＡを含む。より具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液は凍結保護剤を含む。より具体的な実施形態では、前記凍結保護剤はＤＭＳＯである。別の具体的な実施形態では、前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン４０は約１０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、細胞を含む前記組成物は約７．５％〜約９％のデキストランを含む。別の具体的な実施形態では、細胞を含む前記組成物は１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり約５．０±１．５×１０^６個の細胞を含む。別の具体的な実施形態では、細胞を含む前記組成物は１ミリリットル当たり約１．５×１０^６個の細胞〜１ミリリットル当たり約３．７５×１０^６個の細胞を含む。

別の実施形態では、細胞を含む組成物は、（ａ）凍結保存前に前記細胞を含む細胞含有溶液を濾過して、濾過済み細胞含有溶液を生成するステップ、（ｂ）細胞を濾過済み細胞含有溶液中に１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個の細胞で凍結保存するステップ、（ｃ）細胞を解凍するステップ、および（ｄ）濾過済み細胞含有溶液をデキストラン４０溶液で約１：１〜約１：１１（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む方法によって作製する。特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。より具体的な実施形態では、ステップ（ｂ）の細胞は１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞で凍結保存する。より具体的な実施形態では、ステップ（ｂ）の細胞は、約５％〜約１０％のデキストラン４０およびＨＳＡを含む溶液中に凍結保存する。特定の実施形態では、ステップ（ｄ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞である。

別の実施形態では、細胞を含む組成物は、（ａ）細胞を、１０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン４０溶液に懸濁して細胞含有溶液を形成するステップ、（ｂ）細胞含有溶液を７０μＭフィルターで濾過するステップ、（ｃ）細胞含有溶液を、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯを含む溶液で、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個の細胞に希釈するステップ、（ｄ）細胞を凍結保存するステップ、（ｅ）細胞を解凍するステップ、および（ｆ）細胞含有溶液を１０％デキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む方法によって作製する。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞である。別の実施形態では、細胞を含む組成物は、（ａ）複数の細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、（ｂ）細胞を５．５％デキストラン４０に再懸濁するステップ、（ｃ）細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、（ｄ）細胞を、１０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン４０溶液に再懸濁するステップ、（ｅ）細胞を７０μＭフィルターで濾過するステップ、（ｆ）細胞を５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯ中に、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個の細胞に希釈するステップ、（ｇ）細胞を凍結保存するステップ、（ｈ）細胞を解凍するステップ、および（ｉ）細胞を１０％デキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む方法によって作製する。特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の前記希釈は約１０±３×１０^６個の細胞／ｍＬである。他の特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。

本明細書に記載の細胞を含む組成物、例えば医薬組成物は、哺乳動物幹細胞および哺乳動物非幹細胞を含めた任意の哺乳動物細胞を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞を含む組成物、例えば医薬組成物は、単離胎盤細胞、例えば本明細書に記載の任意の単離胎盤細胞を含むことができる（例えば、以下のセクション５．３を参照）。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋である。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞は胎盤幹細胞である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞は多分化能胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞は、神経系の表現型の細胞、骨形成原の表現型の細胞、または軟骨形成の表現型の細胞に分化する能力を有する。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００^＋である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０^＋またはＣＤ４５⁻である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０^＋またはＣＤ４５⁻である。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０^＋またはＣＤ４５⁻である。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０^＋およびＣＤ４５⁻である。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋、ＣＤ９０^＋、ＣＤ４５⁻細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ８０⁻およびＣＤ８６⁻である。

組成物の特定の他の実施形態では、前記単離胎盤細胞はＣＤ２００^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋；ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、およびＣＤ２００^＋；ＣＤ２００^＋およびＯＣＴ−４^＋；ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋；ＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋であり、胚様体またはＯＣＴ−４^＋の形成を可能にする条件下で前記集団を培養すると、前記単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、胚様体またはその任意の組合せの形成を可能にする条件下で前記集団を培養すると、単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、前記ＣＤ２００^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＣＤ２００^＋細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、およびＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、およびＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ４５⁻、ＯＣＴ−４^＋およびＣＤ２００^＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋細胞はＯＣＴ−４^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記ＯＣＴ−４^＋細胞はＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。本明細書に記載の、細胞を含む組成物内に含有することができる単離胎盤細胞は、以下のセクション５．３でより詳細に記載する。

本明細書で提供する組成物の他の具体的な実施形態では、細胞は胎盤幹細胞以外の細胞である。より具体的な実施形態では、例えば、細胞は幹細胞または非幹細胞であってよい。細胞が幹細胞である具体的な実施形態では、幹細胞は、例えば成体幹細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞、胚生殖細胞、臍帯血幹細胞、羊水幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞または骨膜由来間葉系幹細胞であってよい。別の具体的な実施形態では、細胞はナチュラルキラー細胞、例えばＣＤ３⁻、ＣＤ５６^＋ナチュラルキラー細胞である。

５．３単離胎盤細胞および単離胎盤細胞集団
本明細書で提供する組成物、例えば、医薬組成物において有用な単離胎盤多分化能細胞は、組織培養基質と接着し多分化能細胞または幹細胞の特性を有する、胎盤またはその一部分から入手可能である。特定の実施形態では、本明細書で開示する方法において有用な単離胎盤細胞は、非胎盤細胞型に分化する能力を有する。本明細書で開示する方法において有用な単離胎盤細胞は、胎児起源または母方起源のいずれかであってよい（すなわち、それぞれ胎児または母親のいずれかの遺伝子型を有してよい）。単離胎盤細胞および単離胎盤細胞の集団は胎児起源であることが好ましい。本明細書で使用する語句「胎児起源」または「非母方起源」は、単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団が、胎児と関係がある、すなわち胎児の遺伝子型を有する臍帯または胎盤構造から得られることを示す。本明細書で使用する語句「母方起源」は、細胞または細胞の集団が、母親と関係がある、例えば母方の遺伝子型を有する胎盤構造から得られることを示す。単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団は、胎児または母方起源のみである単離胎盤細胞を含むことができ、または胎児と母方両方の起源の単離胎盤細胞の混合集団を含むことができる。単離胎盤細胞、および単離胎盤細胞を含む細胞の集団は、以下で論じる形態、マーカー、および培養特性によって同定および選択することができる。本明細書で記載する方法および組成物中で使用するのに適した単離胎盤細胞は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号および米国特許第７，４６８，２７６号に記載された単離胎盤細胞を含むことができる。

５．３．１物理的および形態特性
本明細書に記載の単離胎盤細胞は、初代培養または細胞培養において培養すると、組織培養基質、例えば組織培養容器表面（例えば、組織培養プラスチック）、または細胞外マトリクスまたはラミニン、コラーゲン（例えば、天然または変性）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチンなどのリガンド、および細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））（ＢＤＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）でコーティングした組織培養表面と接着する。培養中の単離胎盤細胞は一般に線維芽細胞様、星状の外見を呈し、いくつかの細胞質突起が中心細胞体から広がる。しかしながら、これらの細胞は、同じ条件下で培養した線維芽細胞と形態学的に区別することができる。単離胎盤細胞は、線維芽細胞より多数のこのような突起を示すからである。形態学的に、単離胎盤細胞は、一般に培養中により円形の、または敷石状の形態を呈する造血幹細胞とも区別することができる。

５．３．２細胞表面、分子および遺伝子マーカー
単離胎盤細胞、例えば多分化能細胞または幹細胞、および単離胎盤細胞の集団は、幹細胞、または幹細胞を含む細胞の集団を同定および／または単離するために使用することができる複数のマーカーを発現する。本明細書に記載の単離胎盤細胞、および胎盤細胞集団（すなわち、２つ以上の単離胎盤細胞）は、胎盤、またはその任意の一部分（例えば、羊膜、絨毛膜、胎盤葉など）から直接得られる、胎盤細胞および胎盤細胞含有細胞集団を含む。単離胎盤細胞集団は、培養中の単離胎盤細胞の集団（すなわち、２つ以上）、および容器、例えばバッグ中の集団も含む。本明細書に記載の単離胎盤細胞は、栄養膜細胞、血管芽細胞、血液芽細胞、胚生殖細胞または胚幹細胞ではない。本明細書に記載の方法および組成物に有用である胎盤多分化能細胞は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号、および米国特許第７，０４５，１４８号および米国特許第７，４６８，２７６号に記載され、かつ以下に記載する。

本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、マーカーＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ２００、ＨＬＡ−Ｇ、および／またはＯＣＴ−４を一般に発現し、ＣＤ３４、ＣＤ３８、またはＣＤ４５は発現せず、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、およびＤＲ⁻である。さらに単離多分化能細胞は、一般にＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、ＣＤ４４^＋およびＣＤ３８^＋である。特定の実施形態では、細胞はＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−またはＡＢＣ−ｐ^＋の１つまたは複数である。単離胎盤細胞は、ＨＬＡ−ＡＢＣ（ＭＨＣ−１）を発現することもできる。これらのマーカーは任意の組合せで使用して、単離胎盤細胞、例えば、単離胎盤幹細胞または単離多分化能細胞を同定すること、および単離胎盤細胞と他の細胞型を区別することができる。単離胎盤細胞はＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現することができるので、それらは間葉系幹細胞様の特性を有する可能性がある。例えばＣＤ３４、ＣＤ３８および／またはＣＤ４５の発現の欠如によって、非造血幹細胞として単離胎盤細胞を同定する。

特定の実施形態では、単離胎盤細胞は単離胎盤幹細胞である。特定の他の実施形態では、単離胎盤細胞は単離胎盤多分化能細胞である。一実施形態では、単離胎盤細胞はフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋である。具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞は胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞は多分化能胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞は、神経系の表現型の細胞、骨形成原の表現型の細胞、または軟骨形成の表現型の細胞に分化する能力を有する。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００^＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＣＤ４５⁻またはＣＤ９０^＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ４５⁻およびＣＤ９０^＋である。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０^＋またはＣＤ４５⁻である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０^＋およびＣＤ４５⁻である、すなわち、細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ９０^＋、ＣＤ１０５^＋およびＣＤ２００^＋である。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ９０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋細胞はさらにＣＤ８０⁻およびＣＤ８６⁻である。

具体的な実施形態では、前に記載したＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋細胞のいずれかはさらにＣＤ２９^＋、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ５４^＋、ＳＨ３^＋またはＳＨ４^＋の１つまたは複数である。別のより具体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ４４^＋である。前述の単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞のいずれかの別の具体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ１１７⁻、ＣＤ１３３⁻、ＫＤＲ⁻（ＶＥＧＦＲ２⁻）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ^＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ⁻、および／またはＰＤＬ１^＋の１つまたは複数である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＣＤ１３^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ６２Ｅ⁻、ＣＤ６２Ｌ⁻、ＣＤ６２Ｐ⁻、ＳＨ３^＋（ＣＤ７３^＋）、ＳＨ４^＋（ＣＤ７３^＋）、ＣＤ８０⁻、ＣＤ８６⁻、ＣＤ９０^＋、ＳＨ２^＋（ＣＤ１０５^＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ^＋、ＣＤ１１７⁻、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン^低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４⁻、ＣＤ２００^＋、ＣＤ１３３⁻、ＯＣＴ−４^＋、ＳＳＥＡ３⁻、ＳＳＥＡ４⁻、ＡＢＣ−ｐ^＋、ＫＤＲ⁻（ＶＥＧＦＲ２⁻）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ^＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ⁻、ＨＬＡ−Ｇ^＋、またはプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）^＋、またはこれらの任意の組合せの１つまたは複数である。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＣＤ１３^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ^＋、ＣＤ６２Ｅ⁻、ＣＤ６２Ｌ⁻、ＣＤ６２Ｐ⁻、ＳＨ３^＋（ＣＤ７３^＋）、ＳＨ４^＋（ＣＤ７３^＋）、ＣＤ８０⁻、ＣＤ８６⁻、ＣＤ９０^＋、ＳＨ２^＋（ＣＤ１０５^＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ^＋、ＣＤ１１７⁻、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン^低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４⁻、ＣＤ２００^＋、ＣＤ１３３⁻、ＯＣＴ−４^＋、ＳＳＥＡ３⁻、ＳＳＥＡ４⁻、ＡＢＣ−ｐ^＋、ＫＤＲ⁻（ＶＥＧＦＲ２⁻）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ^＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ⁻、ＨＬＡ−Ｇ^＋、およびプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）^＋である。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％が、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞である。前記細胞集団中の細胞の少なくとも約７０％が、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞であることが好ましい。前記細胞の少なくとも約９０％、９５％、または９９％が、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋およびＣＤ１０５^＋胎盤細胞であることがより好ましい。具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００^＋である。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０^＋またはＣＤ４５⁻である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０^＋およびＣＤ４５⁻である。より具体的な実施形態では、前に記載した単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞のいずれかはさらにＣＤ２９^＋、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ５４^＋、ＳＨ３^＋またはＳＨ４^＋の１つまたは複数である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞、または単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤細胞はさらにＣＤ４４^＋である。前述の単離ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞を含む細胞集団のいずれかの具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらにＣＤ１３^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ６２Ｅ⁻、ＣＤ６２Ｌ⁻、ＣＤ６２Ｐ⁻、ＳＨ３^＋（ＣＤ７３^＋）、ＳＨ４^＋（ＣＤ７３^＋）、ＣＤ８０⁻、ＣＤ８６⁻、ＣＤ９０^＋、ＳＨ２^＋（ＣＤ１０５^＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ^＋、ＣＤ１１７⁻、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン^低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４⁻、ＣＤ２００^＋、ＣＤ１３３⁻、ＯＣＴ−４^＋、ＳＳＥＡ３⁻、ＳＳＥＡ４⁻、ＡＢＣ−ｐ^＋、ＫＤＲ⁻（ＶＥＧＦＲ２⁻）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ^＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ⁻、ＨＬＡ−Ｇ^＋、またはプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）^＋、またはこれらの任意の組合せの１つまたは複数である。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋細胞はさらにＣＤ１３^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ^＋、ＣＤ６２Ｅ⁻、ＣＤ６２Ｌ⁻、ＣＤ６２Ｐ⁻、ＳＨ３^＋（ＣＤ７３^＋）、ＳＨ４^＋（ＣＤ７３^＋）、ＣＤ８０⁻、ＣＤ８６⁻、ＣＤ９０^＋、ＳＨ２^＋（ＣＤ１０５^＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ^＋、ＣＤ１１７⁻、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン^低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４⁻、ＣＤ２００^＋、ＣＤ１３３⁻、ＯＣＴ−４^＋、ＳＳＥＡ３⁻、ＳＳＥＡ４⁻、ＡＢＣ−ｐ^＋、ＫＤＲ⁻（ＶＥＧＦＲ２⁻）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ^＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ⁻、ＨＬＡ−Ｇ^＋、およびプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）^＋である。

特定の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、ＳＨ４^＋、ＳＳＥＡ３⁻、ＳＳＥＡ４⁻、ＯＣＴ−４^＋、およびＡＢＣ−ｐ^＋の１つまたは複数、または全部であり、前記単離胎盤細胞は、胎盤組織の物理的および／または酵素による破壊によって得る。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋およびＡＢＣ−ｐ^＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋およびＣＤ３４⁻であり、前記単離胎盤細胞は、以下の特性、ＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、ＳＨ３^＋、ＳＨ４^＋、ＳＳＥＡ３⁻、およびＳＳＥＡ４⁻の少なくとも１つを有する。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、ＳＨ３^＋、ＳＨ４^＋、ＳＳＥＡ３⁻、およびＳＳＥＡ４⁻である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋、ＣＤ３４⁻、ＳＳＥＡ３⁻、およびＳＳＥＡ４⁻である。より具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋およびＣＤ３４⁻であり、かつＳＨ２^＋またはＳＨ３^＋のいずれかである。より具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋、ＣＤ３４⁻、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋である。別のより具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋、ＣＤ３４⁻、ＳＳＥＡ３⁻、およびＳＳＥＡ４⁻であり、かつＳＨ２^＋またはＳＨ３^＋のいずれかである。別のより具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋およびＣＤ３４⁻であり、ＳＨ２^＋またはＳＨ３^＋のいずれかであり、かつＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、ＳＳＥＡ３⁻、またはＳＳＥＡ４⁻の少なくとも１つである。別のより具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、ＳＳＥＡ３⁻、およびＳＳＥＡ４⁻であり、かつＳＨ２^＋またはＳＨ３^＋のいずれかである。

一実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ２００^＋またはＨＬＡ−Ｇ^＋である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ２００^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻またはＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ２００^＋またはＨＬＡ−Ｇ^＋単離胎盤細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下での、単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団中での胚様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、幹細胞または多分化能細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤幹細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、ＣＤ２００^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％が、ＣＤ２００^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞である。前記細胞集団中の細胞の少なくとも約７０％が、ＣＤ２００^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞であることが好ましい。前記細胞の少なくとも約９０％、９５％、または９９％が、ＣＤ２００^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞であることがより好ましい。単離集団の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はさらにＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻またはＣＤ４５⁻である。より具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋である。別の実施形態では、前記単離細胞集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したとき１つまたは複数の胚様体を生成する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞集団は幹細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である胎盤細胞は、ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、およびＣＤ２００^＋である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻またはＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。より具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、およびＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、およびＣＤ２００^＋胎盤細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下でその集団を培養すると、前記胎盤細胞の集団中での１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞は幹細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％が、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約７０％が、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約９０％、９５％、または９９％が、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤細胞である。前記集団の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻またはＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。より具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、およびＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると１つまたは複数の胚様体を生成する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞集団は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ２００^＋およびＯＣＴ−４^＋である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞はＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻またはＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で単離細胞を含む胎盤細胞の集団を培養すると、この集団による１つまたは複数の胚様体の生成を容易にする。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％の細胞が、単離ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞の少なくとも約７０％の細胞が、前記単離ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が、前記単離ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞である。単離集団の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はさらにＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、細胞集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると１つまたは複数の胚様体を生成する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、単離ＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻またはＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞はさらにＯＣＴ−４^＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００^＋である。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＯＣＴ−４^＋およびＣＤ２００^＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下でその集団を培養すると、前記細胞を含む胎盤細胞の集団中の胚様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞は、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％の細胞が、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団の少なくとも約７０％の細胞が、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約９０％、９５％、または９９％の細胞が、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞である。前述の集団の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻またはＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞はさらにＯＣＴ−４^＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００^＋である。より別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＯＣＴ−４^＋およびＣＤ２００^＋である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋であり、胚様体の形成を可能にする条件下で前記集団を培養すると、前記ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋細胞を含む単離胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻またはＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＯＣＴ−４^＋である。より具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＯＣＴ−４^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋である単離胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団であり、胚様体の形成を可能にする条件下で前記集団を培養すると、前記細胞を含む単離胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。様々な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％の細胞が、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団の少なくとも約７０％の細胞が、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約９０％、９５％、または９９％の細胞が、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞である。前述の集団の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻またはＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＯＣＴ−４^＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００^＋である。より具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＯＣＴ−４^＋およびＣＤ２００^＋である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、前記単離ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４^＋であり、胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると、前記細胞を含む単離胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、またはＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００^＋である。より具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、およびＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞は、ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、ＯＣＴ−４^＋である単離胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団であり、胚様体の形成を可能にする条件下で前記集団を培養すると、前記細胞を含む単離胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。様々な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％の細胞が、前記単離ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団の少なくとも約７０％の細胞が、前記単離ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が、前記単離ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞である。前述の集団の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻またはＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００^＋である。より具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４^＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、およびＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。

特定の他の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、ＳＨ４^＋、ＳＳＥＡ３⁻、ＳＳＥＡ４⁻、ＯＣＴ−４^＋、ＭＨＣ−Ｉ^＋およびＡＢＣ−ｐ^＋の１つまたは複数である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、ＳＨ４^＋、ＳＳＥＡ３⁻、ＳＳＥＡ４⁻、およびＯＣＴ−４^＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、およびＳＨ４^＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、ＳＨ４^＋およびＯＣＴ−４^＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、ＨＬＡ−１^＋、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、ＳＨ４^＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４^＋およびＡＢＣ−ｐ^＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、ＳＨ４^＋およびＯＣＴ−４^＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４^＋、ＣＤ３４⁻、ＳＳＥＡ３⁻、およびＳＳＥＡ４⁻である。具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４^＋、ＣＤ３４⁻、ＳＳＥＡ３⁻、およびＳＳＥＡ４⁻胎盤細胞はさらにＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、ＳＨ２^＋、ＳＨ３^＋、およびＳＨ４^＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋およびＣＤ３４⁻であり、かつＳＨ３^＋またはＳＨ４^＋のいずれかである。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４⁻であり、かつＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ５４^＋、ＣＤ９０^＋、またはＯＣＴ−４^＋のいずれかである。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、単離ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、およびＣＤ２００^＋胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、胎盤細胞を含む細胞の集団であり、前記細胞集団の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の細胞がＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤細胞である。前述の実施形態の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はさらにＣＤ９０^＋およびＣＤ４５⁻である。具体的な実施形態では、前記胎盤細胞または胎盤細胞の集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞または胎盤細胞の集団は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞の集団中の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の前記細胞が非母方起源である。

前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施形態では、前記細胞または集団は拡大状態であり、例えば、少なくとも、約、または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回継代しており、少なくとも、約、または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８または４０の集団倍化で増殖状態である。本明細書で開示する、単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は胎児起源である（すなわち胎児の遺伝子型を有する）。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である、胎盤細胞はＯＣＴ−４^＋であり、胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると、前記単離胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、またはＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はＣＤ２００^＋である。より具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、およびＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である、単離胎盤細胞は、単離ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ１３３⁻およびＣＤ３４⁻胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、単離胎盤細胞を含む細胞の集団であり、前記単離細胞集団の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の細胞が単離ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ１３３⁻およびＣＤ３４⁻胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ１３３⁻およびＣＤ３４⁻胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。他の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。他の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞の集団は母方の構成成分は実質的に含まず、例えば、前記単離胎盤細胞の集団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である、単離胎盤細胞は、単離ＣＤ１０^＋、ＣＤ１３^＋、ＣＤ３３^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ１１７⁻およびＣＤ１３３⁻胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、単離胎盤細胞を含む細胞の集団であり、前記細胞集団の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の細胞が単離ＣＤ１０^＋、ＣＤ１３^＋、ＣＤ３３^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ１１７⁻およびＣＤ１３３⁻胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、前記単離胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ１０^＋、ＣＤ１３^＋、ＣＤ３３^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ１１７⁻およびＣＤ１３３⁻胎盤細胞は非母方起源である、すなわち胎児の遺伝子型を有する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞の集団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である、単離胎盤細胞は、単離ＣＤ１０⁻、ＣＤ３３⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、およびＣＤ１１７⁻胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、単離胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団であり、前記細胞集団の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の細胞が単離ＣＤ１０⁻、ＣＤ３３⁻、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、およびＣＤ１１７⁻胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、単離ＣＤ１０⁻、ＣＤ１３⁻、ＣＤ３３⁻、ＣＤ４５⁻、およびＣＤ１１７⁻胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、単離ＣＤ１０⁻、ＣＤ１３⁻、ＣＤ３３⁻、ＣＤ４５⁻、およびＣＤ１１７⁻胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団であり、前記細胞集団の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の細胞がＣＤ１０⁻、ＣＤ１３⁻、ＣＤ３３⁻、ＣＤ４５⁻、およびＣＤ１１７⁻胎盤細胞を含む。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞はＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ３４⁻、およびＣＤ１３３⁻であり、さらにＣＤ１０^＋、ＣＤ１３^＋、ＣＤ３８^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ９０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋および／またはＨＬＡ−Ｇ^＋、および／またはＣＤ１１７に陰性である。別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、単離胎盤細胞を含む細胞の集団であり、前記集団中の少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または約９９％の細胞が、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ⁻、ＣＤ４５⁻、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１３３⁻であり、さらにＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２００および／またはＨＬＡ−Ｇに陽性であり、および／またはＣＤ１１７に陰性である単離胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、抗体結合により決定してＣＤ２００^＋およびＣＤ１０^＋である単離胎盤細胞、ならびに抗体結合とＲＴ−ＰＣＲの両方により決定してＣＤ１１７⁻である単離胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ１０^＋、ＣＤ２９⁻、ＣＤ５４^＋、ＣＤ２００^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋、ＨＬＡクラス１⁻およびβ−２−マイクログロブリン⁻である単離胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞である。別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、少なくとも１つの細胞マーカーの発現が間葉系幹細胞（例えば、骨髄由来間葉系幹細胞）より少なくとも２倍高い胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ^＋、ＣＤ６２−Ｅ⁻、ＣＤ６２−Ｌ⁻、ＣＤ６２−Ｐ⁻、ＣＤ８０⁻、ＣＤ８６⁻、ＣＤ１０３⁻、ＣＤ１０４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ^＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン^低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４⁻、β２−マイクログロブリン^低、ＭＨＣ−Ｉ^低、ＭＨＣ−ＩＩ⁻、ＨＬＡ−Ｇ^低、および／またはＰＤＬ１^低の１つまたは複数である単離胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は少なくともＣＤ２９^＋およびＣＤ５４^＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は少なくともＣＤ４４^＋およびＣＤ１０６^＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は少なくともＣＤ２９^＋である。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は単離胎盤細胞を含み、かつ前記細胞集団中の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の細胞が、ＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ^＋、ＣＤ６２−Ｅ⁻、ＣＤ６２−Ｌ⁻、ＣＤ６２−Ｐ⁻、ＣＤ８０⁻、ＣＤ８６⁻、ＣＤ１０３⁻、ＣＤ１０４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ^＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン^低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４⁻、β２−マイクログロブリン^低、ＭＨＣ−Ｉ^低、ＭＨＣ−ＩＩ⁻、ＨＬＡ−Ｇ^低、および／またはＰＤＬ１^低の１つまたは複数である単離胎盤細胞である。より具体的な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の細胞が、ＣＤ１０^＋、ＣＤ２９^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ４５⁻、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ^＋、ＣＤ６２−Ｅ⁻、ＣＤ６２−Ｌ⁻、ＣＤ６２−Ｐ⁻、ＣＤ８０⁻、ＣＤ８６⁻、ＣＤ１０３⁻、ＣＤ１０４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ^＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン^低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４⁻、β２−マイクログロブリン^低、ＭＨＣ−Ｉ^低、ＭＨＣ−ＩＩ⁻、ＨＬＡ−Ｇ^低、およびＰＤＬ１^低である。

単離胎盤細胞の特定の実施形態では、前記単離胎盤細胞は、増殖培地、すなわち増殖を促進するように処方した培地における培養中に、例えば増殖培地における増殖中に分化しない。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、増殖するためのフィーダー層を必要としない。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、単にフィーダー細胞層の欠如のため、フィーダー層の不在下での培養中に分化しない。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞は単離胎盤細胞であり、複数の前記単離胎盤細胞が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイにより評価してアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）に陽性である。このようなアッセイは当技術分野で知られている（例えば、ＢｏｓｔｉａｎａｎｄＢｅｔｔｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１７３、７８７、（１９７８）を参照）。具体的な実施形態では、前記ＡＬＤＨアッセイは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のマーカーとしてＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）（Ａｌｄａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、Ｏｒｅｇｏｎ）を使用する。具体的な実施形態では、前記複数の細胞は、前記細胞集団中の約３％と約２５％の間の細胞である。別の実施形態では、単離臍帯細胞、例えば多分化能単離臍帯細胞の集団が本明細書で提供され、複数の前記単離臍帯細胞が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の指標としてＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）を使用するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイにより評価して、アルデヒドデヒドロゲナーゼに陽性である。具体的な実施形態では、前記複数の細胞は、前記細胞集団中の約３％と約２５％の間の細胞である。別の実施形態では、単離胎盤細胞または単離臍帯細胞の前記集団は、ほぼ同じ数の細胞を有し同じ条件下で培養した骨髄由来間葉系幹細胞の集団より、少なくとも３倍、または少なくとも５倍高いＡＬＤＨ活性を示す。

前述の単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の細胞集団のいずれかの具体的な実施形態では、前記集団中の細胞、または少なくとも約９５％もしくは約９９％の細胞の核型は正常である。前述の胎盤細胞または細胞集団のいずれかの別の具体的な実施形態では、細胞、または細胞の集団中の細胞は非母方起源である。

任意の前述のマーカーの組合せを有する、単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞の集団は、任意の比で組み合わせることができる。任意の２つ以上の前述の単離胎盤細胞集団を組合せて、１つの単離胎盤細胞集団を形成することができる。例えば、単離胎盤細胞の集団は、前に記載したマーカーの組合せの１つによって定義される単離胎盤細胞の第１集団、および前に記載した別のマーカーの組合せによって定義される単離胎盤細胞の第２集団を含むことができ、前記第１集団と第２集団は約１：９９、２：９８、３：９７、４：９６、５：９５、１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、または約９９：１の比で組み合わせる。同様の形式で、任意の３個、４個、５個またはそれより多くの前に記載した単離胎盤細胞または単離胎盤細胞集団を組み合わせることができる。

本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、例えば、酵素による消化（セクション５．４．３参照）または灌流（セクション５．４．４参照）ありまたはなしで、胎盤組織の破壊によって得ることができる。例えば、単離胎盤細胞の集団は、臍帯血を流出させ、灌流させて残留血液を除去した哺乳動物胎盤を灌流するステップ、灌流溶液で前記胎盤を灌流するステップ、および前記灌流溶液を回収するステップであって、灌流後の前記灌流溶液が単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団を含むステップ、および前記細胞集団から複数の前記単離胎盤細胞を単離するステップを含む方法に従って生成することができる。具体的な実施形態では、灌流溶液は臍静脈と臍動脈の両方を通過させ、それが胎盤から滲出した後に回収する。別の具体的な実施形態では、灌流溶液は臍静脈と臍動脈を通過させ臍動脈から回収し、または臍動脈を通過させ臍静脈から回収する。

様々な実施形態では、胎盤の灌流から得る細胞の集団中に含有される単離胎盤細胞は、前記胎盤細胞集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％である。別の具体的な実施形態では、灌流によって回収される単離胎盤細胞は、胎児および母親細胞を含む。別の具体的な実施形態では、灌流によって回収される単離胎盤細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％胎児細胞である。

別の具体的な実施形態では、本明細書で提供するのは、灌流によって回収される、本明細書で記載する単離胎盤細胞の集団を含む組成物であり、前記組成物は、単離胎盤細胞を回収するために使用する灌流溶液の少なくとも一部分を含む。

本明細書で記載する単離胎盤細胞の単離集団は、組織破壊酵素で胎盤組織を消化して細胞を含む胎盤細胞の集団を得ること、および前記胎盤細胞の残りから複数の胎盤細胞を単離、または実質的に単離することによって生成することができる。胎盤の全部、または任意の一部分を消化して、本明細書で記載する単離胎盤細胞を得ることができる。具体的な実施形態では、例えば、前記胎盤組織は、胎盤全体、羊膜、絨毛膜、羊膜と絨毛膜の組合せ、または任意の前述の組合せであってよい。他の具体的な実施形態では、組織破壊酵素はトリプシンまたはコラゲナーゼである。様々な実施形態では、胎盤の消化から得る細胞の集団中に含有される単離胎盤細胞は、前記胎盤細胞集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％である。

遺伝子プロファイリングによって、単離胎盤細胞、および単離胎盤細胞の集団は、他の細胞、例えば間葉系幹細胞、例えば骨髄由来間葉系幹細胞と区別することができることを確認する。本明細書で記載する単離胎盤細胞は、１つまたは複数の遺伝子の発現に基づいて、例えば間葉系幹細胞と区別することができ、その発現は、骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、単離胎盤細胞中、または特定の単離臍帯幹細胞中において有意に高い。特に、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、１つまたは複数の遺伝子の発現に基づいて間葉系幹細胞と区別することができ、その発現は、同数の骨髄由来間葉系幹細胞より単離胎盤細胞中で有意に高く（すなわち、少なくとも２倍高い）、細胞を同等条件下で増殖するとき、１つまたは複数の遺伝子は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１またはｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、ＺＣ３Ｈ１２Ａまたは前述の任意の組合せである。例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号を参照のこと。より具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、ＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）、２％ウシ胎児血清（ＨｙｃｌｏｎｅＬａｂｓ．）、１×インシュリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）、１０^−９Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０^−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、表皮増殖因子１０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）、および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を含む培地において約３〜約３５の集団倍加で培養すると、前記１つまたは複数の遺伝子を発現する。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞特異的または単離臍帯細胞特異的な遺伝子はＣＤ２００である。

これらの遺伝子に関する具体的な配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１６１５（ＡＣＴＧ２）、ＢＣ０６５５４５（ＡＤＡＲＢ１）、（ＮＭ＿１８１８４７（ＡＭＩＧＯ２）、ＡＹ３５８５９０（ＡＲＴＳ−１）、ＢＣ０７４８８４（Ｂ４ＧＡＬＴ６）、ＢＣ００８３９６（ＢＣＨＥ）、ＢＣ０２０１９６（Ｃ１１またはｆ９）、ＢＣ０３１１０３（ＣＤ２００）、ＮＭ＿００１８４５（ＣＯＬ４Ａ１）、ＮＭ＿００１８４６（ＣＯＬ４Ａ２）、ＢＣ０５２２８９（ＣＰＡ４）、ＢＣ０９４７５８（ＤＭＤ）、ＡＦ２９３３５９（ＤＳＣ３）、ＮＭ＿００１９４３（ＤＳＧ２）、ＡＦ３３８２４１（ＥＬＯＶＬ２）、ＡＹ３３６１０５（Ｆ２ＲＬ１）、ＮＭ＿０１８２１５（ＦＬＪ１０７８１）、ＡＹ４１６７９９（ＧＡＴＡ６）、ＢＣ０７５７９８（ＧＰＲ１２６）、ＮＭ＿０１６２３５（ＧＰＲＣ５Ｂ）、ＡＦ３４００３８（ＩＣＡＭ１）、ＢＣ０００８４４（ＩＥＲ３）、ＢＣ０６６３３９（ＩＧＦＢＰ７）、ＢＣ０１３１４２（ＩＬ１Ａ）、ＢＴ０１９７４９（ＩＬ６）、ＢＣ００７４６１（ＩＬ１８）、（ＢＣ０７２０１７）ＫＲＴ１８、ＢＣ０７５８３９（ＫＲＴ８）、ＢＣ０６０８２５（ＬＩＰＧ）、ＢＣ０６５２４０（ＬＲＡＰ）、ＢＣ０１０４４４（ＭＡＴＮ２）、ＢＣ０１１９０８（ＭＥＳＴ）、ＢＣ０６８４５５（ＮＦＥ２Ｌ３）、ＮＭ＿０１４８４０（ＮＵＡＫ１）、ＡＢ００６７５５（ＰＣＤＨ７）、ＮＭ＿０１４４７６（ＰＤＬＩＭ３）、ＢＣ１２６１９９（ＰＫＰ−２）、ＢＣ０９０８６２（ＲＴＮ１）、ＢＣ００２５３８（ＳＥＲＰＩＮＢ９）、ＢＣ０２３３１２（ＳＴ３ＧＡＬ６）、ＢＣ００１２０１（ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５）、ＢＣ１２６１６０またはＢＣ０６５３２８（ＳＬＣ１２Ａ８）、ＢＣ０２５６９７（ＴＣＦ２１）、ＢＣ０９６２３５（ＴＧＦＢ２）、Ｂ０００５０４６（ＶＴＮ）、およびＢＣ００５００１（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）（２００８年３月現在）において見ることができる。

より具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、細胞を同等条件下で増殖するとき、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１またはｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡＭＩ、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣＩ２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、およびＺＣ３Ｈ１２Ａのそれぞれを、同数の骨髄由来間葉系幹細胞より検出可能に高いレベルで発現する。

より具体的な実施形態では、胎盤細胞集団は、骨髄由来間葉系幹細胞より検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現する胎盤細胞を選択することによって選択することができ、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１またはｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、およびＺＣ３Ｈ１２Ａからなる群から選択され、かつ前記骨髄由来間葉系幹細胞は、前記胎盤細胞が経ている継代数と等しい培養の継代数を経ている。より具体的な実施形態では、前記選択は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１またはｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮおよびＺＣ３Ｈ１２Ａを、骨髄由来間葉系幹細胞より検出可能に高いレベルで発現する細胞を選択することを含む。

前述の遺伝子の発現は、標準的な技法によって評価することができる。例えば、（１つまたは複数の）遺伝子の配列に基づくプローブを個別に選択することができ、従来の技法によって構築することができる。遺伝子の発現は、例えば、１つまたは複数の遺伝子に対するプローブを含むマイクロアレイ、例えば、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＵ１３３Ａ２．０アレイ、またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０（ＳａｎｔａＣｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で評価することができる。これらの遺伝子の発現は、特定のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の配列が改正される場合でさえ評価することができる。改正された配列に特異的なプローブは、よく知られている標準的な技法を使用して容易に作製することができるからである。

これらの遺伝子の発現レベルを使用して、単離胎盤細胞の集団の同一性を確認することができ、少なくとも複数の単離胎盤細胞を含む細胞の集団などを同定することができる。その同一性が確認される単離胎盤細胞の集団は、クローン、例えば単一の単離胎盤細胞から拡大した単離胎盤細胞の集団、または幹細胞の混合集団、例えば、多数の単離胎盤細胞から拡大した単離胎盤細胞のみを含む細胞の集団、または本明細書に記載する単離胎盤細胞、および少なくとも１つの他型の細胞を含む細胞の集団であり得る。

これらの遺伝子の発現レベルを使用して、単離胎盤細胞の集団を選択することができる。例えば、前述の１つまたは複数の遺伝子の発現が、同等の間葉系幹細胞の集団中よりその細胞集団由来のサンプル中で有意に高い場合、細胞、例えばクローン増殖細胞の集団を選択することができる。このような選択は、複数の単離胎盤細胞集団由来、その同一性が知られていない複数の細胞集団由来の集団などの選択であってよい。

単離胎盤細胞は、前記１つまたは複数の遺伝子、例えば間葉系幹細胞対照中での発現レベル、例えば、同数の骨髄由来間葉系幹細胞中での前記１つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較して、１つまたは複数のこのような遺伝子の発現レベルに基づいて選択することができる。一実施形態では、同数の間葉系幹細胞を含むサンプル中の前記１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、対照として使用する。別の実施形態では、特定条件下で試験する単離胎盤細胞の対照は、前記条件下における間葉系幹細胞中での前記１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを表す数値である。

本明細書に記載する単離胎盤細胞は、例えば、ＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ＨｙｃｌｏｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１×インシュリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）、１０^−９Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０^−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）、および１００Ｕペニシリン／１０００Ｕストレプトマイシンを含む培地中での初代培養中、または増殖中に、前述の特性（例えば、細胞表面マーカーおよび／または遺伝子発現プロファイルの組合せ）を示す。

前に記載した単離細胞の単離集団、および単離胎盤細胞の集団は、約、少なくとも、または最大１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１またはそれより多くの単離胎盤細胞を一般に含むことができる。本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞の集団は、例えばトリパンブルー色素排除試験法により測定して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の生存状態の単離胎盤細胞を含む。

５．３．３培養中の増殖
本明細書で記載する単離胎盤細胞の増殖は、任意の哺乳動物細胞に関して、増殖用に選択する個々の培地に一部分は依存する。最適条件下において、単離胎盤細胞は、典型的には３〜５日で数が倍になる。培養中、本明細書で記載する単離胎盤細胞は、培養支持体、例えば、組織培養容器の表面（例えば、組織培養皿プラスチック、フィブロネクチンコーティングプラスチックなど）に接着し、単層を形成する。

本明細書で記載する単離胎盤細胞の集団は、適切な条件下で培養すると、胚様体、すなわち接着性幹細胞層上で増殖した細胞の三次元集合体を形成する。胚様体内の細胞は、非常に初期の幹細胞、例えばＯＣＴ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４と関係があるマーカーを発現する。胚様体内の細胞は、本明細書で記載する単離胎盤細胞と同様に、典型的には培養支持体に接着しないが、培養中に接着性細胞に接着した状態である。胚様体細胞は生存が接着性単離胎盤細胞に依存する。胚様体は、接着性単離胎盤細胞の不在下で形成しないからである。したがって接着性単離胎盤細胞は、接着性単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団中での１つまたは複数の胚様体の増殖を容易にする。理論によって縛られることは望まずに、胚様体の細胞は、胚幹細胞が細胞のフィーダー層で増殖するのと同程度に接着性単離胎盤細胞で増殖すると考えられる。間葉系幹細胞、例えば骨髄由来間葉系幹細胞は、培養中に胚様体に発達しない。

５．３．４造血胎盤幹細胞
特定の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ３４^＋胎盤細胞、例えば造血胎盤細胞である。しかしながら、このようなＣＤ３４^＋細胞は、本明細書で使用する用語「多分化能」によって包含されない。このような細胞は、胎盤組織から、例えば臍帯血を流出させ、灌流させて残留血液を除去した胎盤から入手可能である。特定の実施形態では、ＣＤ３４^＋単離胎盤細胞はＣＤ３８^＋である。特定の実施形態では、ＣＤ３４^＋単離胎盤細胞はＣＤ３８⁻である。特定の他の実施形態では、ＣＤ３４^＋単離胎盤細胞はＣＤ４５^＋である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４^＋、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５^＋である。

５．３．５胎盤灌流液細胞
特定の実施形態では、本明細書で提供する方法によって製剤化する本明細書で提供する組成物の細胞は、胎盤灌流液から得られる細胞である。本明細書で使用する「胎盤灌流液から得られる細胞」は、胎盤灌流液から得た、例えば単離した全有核細胞、胎盤灌流液から得た有核細胞のサブセット、または胎盤灌流液から直接得た細胞から培養もしくは増殖した細胞を含む。胎盤灌流液は、胎盤細胞を得るための灌流前に、臍帯血を流出させ、灌流させて残留血液を除去した胎盤から得ることができる。胎盤灌流液は、臍帯血を流出させているが灌流させて残留血液を除去していない胎盤から得ることができる。胎盤灌流液は、臍帯血を流出させず灌流させて残留血液を除去していない胎盤から得ることができる。後の２つの実施形態では、胎盤細胞、例えば、胎盤灌流液からの有核細胞、例えば、胎盤灌流液からの全有核細胞は、胎盤血および／または臍帯血からの有核細胞を含む。胎盤灌流液を得るための方法、および胎盤灌流液から細胞を得るための方法は以下のセクション５．４．４に記載する。

５．４単離胎盤細胞を得る方法
５．４．１幹細胞回収組成物
本明細書でさらに提供するのは、胎盤細胞、例えば前のセクション５．２に記載した単離胎盤細胞を回収および単離する方法である。一般に、このような細胞は、生理的に許容される溶液、例えば幹細胞回収組成物を使用して哺乳動物胎盤から得る。細胞回収組成物は、「ＩｍｐｒｏｖｅｄＭｅｄｉｕｍｆｏｒＣｏｌｌｅｃｔｉｎｇＰｌａｃｅｎｔａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓａｎｄＰｒｅｓｅｒｖｉｎｇＯｒｇａｎｓ」という表題の関連米国特許出願公開第２００７／０１９００４２号中に詳細に記載される。

細胞回収組成物は、細胞、例えば本明細書に記載する単離胎盤細胞の回収および／または培養に適した任意の生理的に許容される溶液、例えば生理食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クレブス液、改変クレブス液、イーグル液、０．９％のＮａＣｌなど）、培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｈ．ＤＭＥＭなど）などを含むことができる。

細胞回収組成物は、回収時から培養時まで、単離胎盤細胞を保存する傾向がある、すなわち、単離胎盤細胞が死ぬのを防ぐ、または単離胎盤細胞の死を遅延させる、死滅する細胞集団中の単離胎盤細胞の数を減らすなどの、１つまたは複数の構成成分を含むことができる。このような構成成分は、例えば、アポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤またはＪＮＫ阻害剤）、血管拡張剤（例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、アドレノコルチコトロピン、コルチコトロピン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシンまたは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など）、壊死阻害剤（例えば、２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−ペンチルアミノ−マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、またはクロナゼパム）、ＴＮＦ−α阻害剤、および／または酸素含有ペルフルオロカーボン（例えば、臭化ペルフルオロオクチル、臭化ペルフルオロデシルなど）であってよい。

細胞回収組成物は、１つまたは複数の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ＲＮａｓｅ、またはＤＮａｓｅなどを含むことができる。このような酵素には、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼなど）、ジスパーゼ、テルモリシン、エラスターゼ、トリプシン、ＬＩＢＥＲＡＳＥ、ヒアルロニダーゼなどがあるが、これらだけには限られない。

細胞回収組成物は、殺菌的または静菌的に有効な量の抗生物質を含むことができる。特定の非制限的な実施形態では、抗生物質はマクロライド（例えばトブラマイシン）、セファロスポリン（例えばセファレキシン、セファラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、セフィキシムまたはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えばペニシリンＶ）またはキノロン（例えばオフロキサシン、シプロフロキサシンまたはノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施形態では、抗生物質はグラム（＋）および／またはグラム（−）細菌、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓなどに対して活性がある。

細胞回収組成物は、１つまたは複数の以下の化合物、アデノシン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）、Ｄ−グルコース（約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ）、マグネシウムイオン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）、一実施形態では、内皮完全性および細胞生存性を維持するのに十分な量で存在する、分子量２０，０００ダルトン超えの高分子（例えば、約２５ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌ、または約４０ｇ／ｌ〜約６０ｇ／ｌで存在する、合成または天然に存在するコロイド、デキストランまたはポリエチレングリコールなどの多糖）、抗酸化剤（例えば、約２５μＭ〜約１００μＭで存在する、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンＣまたはビタミンＥ）、還元剤（例えば、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭで存在するＮ−アセチルシステイン）、細胞へのカルシウムの進入を妨げる作用物質（例えば、約２μＭ〜約２５μＭで存在するベラパミル）、ニトログリセリン（例えば、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌ）、一実施形態では、残留血液の凝固の妨げを手助けするのに十分な量で存在する、抗凝固剤（例えば、約１０００単位／ｌ〜約１００，０００単位／ｌの濃度で存在するヘパリンまたはヒルジン）、またはアミロリド含有化合物（例えば、約１．０μＭ〜約５μＭで存在する、アミロリド、エチルイソプロピルアミロリド、ヘキサメチレンアミロリド、ジメチルアミロリドまたはイソブチルアミロリド）を含むこともできる。

５．４．２胎盤の回収および処理
一般に、ヒト胎盤は生後のその娩出直後に回収する。好ましい実施形態では、胎盤は、インフォームドコンセント後に患者から、および患者の完全な病歴を得て胎盤と関連付けた後に回収する。病歴は送達後に続くことが好ましい。このような病歴を使用して、胎盤またはそこから採取した幹細胞の二次的使用を調節することができる。例えば、病歴を鑑みて、胎盤に関する幼児のオーダーメイド医療に、または幼児の両親、兄弟または他の親戚に、ヒト胎盤幹細胞を使用することができる。

単離胎盤細胞を回収する前に、臍帯血および胎盤血を除去する。特定の実施形態では、送達後、胎盤中の臍帯血を回収する。胎盤には従来の臍帯血回収プロセスを施すことができる。典型的には、流注下でニードルまたはカニューレを使用して胎盤から採血する（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、米国特許第５，３７２，５８１号；Ｈｅｓｓｅｌら、米国特許第５，４１５，６６５号を参照）。ニードルまたはカニューレは通常臍静脈中に配置し、胎盤を穏やかにマッサージして胎盤からの臍帯血の流出を容易にすることができる。このような臍帯血の回収は市販用に実施することができる、例えば、ＬｉｆｅＢａｎｋＵＳＡ、ＣｅｄａｒＫｎｏｌｌｓ、Ｎ．Ｊ．、ＶｉａＣｏｒｄ、ＣｏｒｄＢｌｏｏｄＲｅｇｉｓｔｒｙａｎｄＣｒｙｏｃｅｌｌ。胎盤はさらなる操作なしで流注により出血して、臍帯血回収中の組織破壊を最小にすることが好ましい。

典型的には、胎盤は、例えば灌流または組織解離による臍帯血の回収および幹細胞の回収のため、分娩室または出生室から別の場所、例えば実験室に運ばれる。胎盤は、例えば、胎盤、および固定した近位臍帯を滅菌状態のジップロック式プラスチックバッグ中に置き、次いでそれを断熱容器中に置くことによって、（胎盤の温度を２０℃と２８℃の間に維持する）滅菌状態の、断熱輸送デバイスに運ばれることが好ましい。別の実施形態では、係属中の米国特許第７，１４７，６２６号に実質的に記載されたように臍帯血回収キットに胎盤を運ぶ。送達後４〜２４時間で胎盤は実験室に送達することが好ましい。特定の実施形態では、近位臍帯を、好ましくは臍帯血回収前に胎盤ディスクの挿入の４〜５ｃｍ（センチメートル）以内に固定する。他の実施形態では、近位臍帯を、臍帯血回収後ただし胎盤のさらなる処理前に固定する。

胎盤は細胞回収前に、滅菌条件下において、室温または５〜２５℃の温度（摂氏）のいずれかで保存することができる。胎盤は、胎盤を灌流させて任意の残留臍帯血を除去する前に、４〜２４時間、最大４８時間、または４８時間より長い時間の間保存することができる。一実施形態では、娩出後約０時間と約２時間の間に胎盤を採取する。胎盤は５〜２５℃の温度（摂氏）で抗凝固剤溶液中に保存することが好ましい。適切な抗凝固剤溶液は当技術分野でよく知られている。例えば、ヘパリンまたはワルファリンナトリウムの溶液を使用することができる。好ましい実施形態では、抗凝固剤溶液はヘパリンの溶液を含む（例えば、１：１０００溶液中に１％ｗ／ｗ）。採血した胎盤は、胎盤細胞を回収する前に最大３６時間保存することが好ましい。

哺乳動物胎盤またはその一部分は、概して前述のように回収し調製した後、任意の当技術分野で知られている方法で処理することができる、例えば、灌流または破壊することができ、例えば、１つまたは複数の組織破壊酵素で消化して単離胎盤細胞を得ることができる。

５．４．３胎盤組織の物理的破壊および酵素による破壊
一実施形態では、器官の一部または全部の物理的破壊によって、哺乳動物胎盤から幹細胞を回収する。例えば、胎盤、またはその一部分は、例えば、破砕する、せん断する、細分する、さいの目に切る、細切れにする、細かく砕くなどすることができる。次いで組織を培養して、単離胎盤細胞の集団を得ることができる。典型的には、胎盤組織は、例えば胎盤細胞回収組成物に使用して破壊する（セクション５．２および以下参照）。

物理的破壊および／または酵素による消化および幹細胞回収の前に、胎盤をいくつかの成分に切断することができる。胎盤幹細胞は、完全胎盤由来のものを含めて、羊膜、絨毛膜、臍帯、胎盤葉、またはこれらの任意の組合せの全部または一部から得ることができる。単離胎盤細胞は、羊膜および絨毛膜を含む胎盤組織から得ることが好ましい。典型的には、単離胎盤細胞は、胎盤組織の小さな塊、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または約１０００立方ミリメートル体積である胎盤組織の塊の破壊によって得ることができる。例えばトリパンブルー色素排除試験法により測定して、破壊法が複数、より好ましくは大部分、およびより好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の前記器官中の細胞を生存状態にするという条件で、任意の物理的破壊法を使用することができる。

幹細胞は一般に、娩出後の最初の約３日以内の任意の時間で、胎盤、またはその一部分から回収することができるが、娩出後約８時間と約１８時間の間が好ましい。

特定の実施形態では、単離胎盤細胞の増殖に適した組織培養培地中で、破壊した組織を培養する（例えば、単離胎盤細胞の培養を記載する以下のセクション５．５を参照）。

別の特定の実施形態では、単離胎盤細胞は胎盤組織の物理的破壊によって回収し、この場合物理的破壊は酵素による消化を含み、これは１つまたは複数の組織消化酵素を使用することによって実施することができる。胎盤、またはその一部分は物理的に破壊し、１つまたは複数の酵素で消化し、次いで生成した物質を細胞回収組成物に浸すか、または混合することもできる。

好ましい細胞回収組成物は、１つまたは複数の組織破壊酵素を含む。酵素による消化は、酵素の組合せ、例えば、マトリクスメタロプロテアーゼと中性プロテアーゼの組合せ、例えば、コラゲナーゼとジスパーゼの組合せを使用することが好ましい。一実施形態では、胎盤組織の酵素による消化は、マトリクスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、およびヒアルロン酸消化用の粘液酵素の組合せ、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、およびヒアルロニダーゼの組合せ、またはＬＩＢＥＲＡＳＥ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＣｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）とヒアルロニダーゼの組合せなどを使用する。胎盤組織を破壊するために使用することができる他の酵素には、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、またはエラスターゼなどがある。セリンプロテアーゼは血清中でアルファ２マイクログロブリンによって阻害される可能性があり、したがって、消化に使用する培地は通常無血清である。一般にＥＤＴＡおよびＤＮａｓｅを酵素による消化の手順中で使用して、細胞回収の効率を増大させる。消化剤を希釈して、粘性消化物内の細胞の捕捉を避けることが好ましい。

組織消化酵素の任意の組合せを使用することができる。組織消化酵素に関する典型的な濃度は、例えば、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＶについては５０〜２００Ｕ／ｍＬ、ジスパーゼについては１〜１０Ｕ／ｍＬ、およびエラスターゼについては１０〜１００Ｕ／ｍＬを含む。プロテアーゼは組合せで、すなわち２つ以上のプロテアーゼを同じ消化反応中で使用することができ、または同時に使用して胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞および胎盤多分化能細胞を切り離すことができる。例えば、一実施形態では、胎盤、またはその一部分を、例えば３０分間約１〜約２ｍｇ／ｍｌで適量のコラゲナーゼＩを用いて最初に消化して、次に３７℃において例えば１０分間約０．２５％の濃度で、トリプシンを用いて消化する。セリンプロテアーゼは、他の酵素の使用後に連続して使用することが好ましい。

別の実施形態では、胎盤細胞回収組成物に、または胎盤細胞回収組成物を用いた胎盤細胞の単離前に、その中で組織を破壊および／または消化する溶液に、キレート剤、例えば、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えることによって、組織をさらに破壊することができる。

消化後、消化物を例えば培養培地で三回洗浄し、洗浄した細胞は培養フラスコに接種する。次いで細胞は差次的接着によって単離し、例えば、生存性、細胞表面マーカー、分化などを特徴付ける。

胎盤全体、または胎盤の一部分が胎児細胞と母親細胞の両方を含む場合（例えば、この場合胎盤の一部分は絨毛膜または胎盤葉を含む）、回収する胎盤細胞は、胎児源と母親源の両方由来の、胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞の混合物を含み得ることは理解されよう。胎盤の一部分が、母親細胞を含まない、または無視できる程度数の母親細胞を含む場合（例えば羊膜）、回収する胎盤細胞は、ほぼ胎児胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞のみを含み得る。

胎盤細胞は、差次的トリプシン処理（以下のセクション５．４．５を参照）、次に１つまたは複数の新たな培養容器、新たな増殖培地中での培養、場合によって、次に第２の差次的トリプシン処理ステップによって、破壊した組織から単離することができる。

５．４．４胎盤灌流
胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞は、哺乳動物胎盤の灌流によって得ることもできる。胎盤細胞を得るための哺乳動物胎盤の灌流法は、例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｉｒｉ、米国特許第７，０４５，１４８号および米国特許第７，２５５，７２９号、および関連米国特許出願公開第２００７／０１９００４２号に開示されている。

例えば灌流溶液として細胞回収組成物を使用する、例えば胎盤血管系を介した灌流によって、胎盤細胞を回収することができる。一実施形態では、臍動脈と臍静脈の一方または両方を介して灌流溶液を通すことにより哺乳動物胎盤を灌流する。胎盤を介した灌流溶液の流入は、例えば胎盤への流注を使用して実施することができる。灌流溶液は、ポンプ、例えば蠕動ポンプを使用して胎盤に送ることが好ましい。例えば臍静脈は、滅菌済みチューブなどの滅菌済み接続装置に接続した、カニューレ、例えばＴＥＦＬＯＮ（登録商標）またはプラスチックカニューレでカニューレ処理することができる。滅菌済み接続装置は灌流マニホールドに接続する。

灌流のための調製では、臍動脈と臍静脈が胎盤の最高点に位置するような形式で、胎盤を配向する（例えば懸垂状態にする）ことが好ましい。胎盤血管系および周辺組織を介して灌流液を通すことにより、胎盤を灌流することができる。臍静脈への灌流液の通過および臍動脈からの回収、または臍動脈への灌流液の通過および臍静脈からの回収によって、胎盤を灌流することもできる。

一実施形態では、例えば、臍動脈と臍静脈を、例えば灌流溶液の貯蔵容器と柔軟なコネクターを介して接続したピペットに同時に接続する。灌流溶液は臍静脈および臍動脈に通す。灌流溶液は血管壁から胎盤の周辺組織に滲出および／またはそこを介して通過し、妊娠中の母親の子宮と結合した胎盤の表面から適切な開放容器中で回収する。灌流溶液を臍帯の隙間に導入し、母親の子宮壁と連結した胎盤壁中の隙間から流出または浸透させることも可能である。「パンニング」法と呼ぶことができるこの方法によって回収される胎盤細胞は、典型的には胎児細胞と母親細胞の混合物である。

別の実施形態では、灌流溶液は臍静脈を通過させ臍動脈からの回収し、または臍動脈を通過させ臍静脈から回収する。「閉回路」法と呼ぶことができるこの方法によって回収される胎盤細胞は、典型的にはほぼ全てが胎児細胞である。

それによって灌流液が母親側の胎盤から滲出した後にそれを回収する、すなわちパンニング法を使用する灌流は、胎児細胞と母親細胞の混合物をもたらすことは理解されよう。結果として、この方法によって回収される細胞は、胎児と母親の両方の起源の胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞の混合集団を含む。対照的に、それによって灌流液を１つまたは２つの胎盤血管に通し（１つまたは複数の）残りの血管を介してのみ回収する、閉回路法での胎盤血管系のみを介した灌流は、ほぼ全てが胎児起源である胎盤細胞集団の回収をもたらす。

閉回路灌流法は、一実施形態では、以下のように実施することができる。出生後約４８時間以内に産後の胎盤を得る。臍帯は固定しクランプで切断する。臍帯は廃棄することができ、または処理して例えば臍帯血幹細胞を回収することができ、および／または生体材料の生成用に臍帯膜を処理することができる。羊膜は灌流中に保持することができ、または例えば指による鈍的剥離を使用して、絨毛膜から分離することができる。灌流前に羊膜を絨毛膜から分離する場合、それを例えば廃棄、または処理して、例えば酵素による消化によって胎盤細胞を得ることができ、または例えば羊膜の生体材料、例えば米国出願公開第２００４／００４８７９６号に記載された生体材料を生成することができる。例えば滅菌済みガーゼを使用して、胎盤の全ての目に見える血塊および残留血液を清掃した後、臍帯血管を、例えば臍帯膜を部分的に切断して臍帯の断面を露出させることによって露出させる。血管を確認し、例えば各血管の切断末端に閉鎖型アリゲータクランプを挿入することによって開く。灌流デバイスまたは蠕動ポンプと接続した装置、例えばプラスチックチューブを、次いで胎盤動脈のそれぞれに挿入する。ポンプは目的に適した任意のポンプ、例えば蠕動ポンプであってよい。滅菌済み回収貯蔵容器、例えば２５０ｍＬ回収バッグなどの血液バッグと接続したプラスチックチューブを、次いで胎盤静脈に挿入する。あるいは、ポンプと接続したチューブを胎盤静脈に挿入し、（１つまたは複数の）回収貯蔵容器に対するチューブを胎盤動脈の一方または両方に挿入する。次いで胎盤を一定体積の灌流溶液、例えば約７５０ｍｌの灌流溶液で灌流する。次いで灌流液中の細胞を、例えば遠心分離によって回収する。

別の実施形態では、例えば、胎盤灌流液細胞を回収するための灌流は以下のように実施する。胎盤血を含有する（１つまたは複数の）胎盤を、例えば蠕動ポンプを使用して、滅菌０．９％ＮａＣｌ（例えば約７５０ｍＬ）をポンプで注入することにより胎盤血管系のみを介して灌流させ、生成した灌流液は回収バッグ中に回収する。灌流液からの細胞は例えば約４２０ｇでの遠心分離によって回収し、次に過剰な上清（ＮａＣｌ、血漿、抗凝固剤）を除去する。次いでヘタスターチを灌流液細胞に加えて３０％の希釈を得る。次いで灌流液細胞を、例えば約１時間、血漿抽出装置中に置いて赤血球を分離する。生成した血漿および有核細胞は回収バッグから分離し、血漿抽出装置中に再度置く。残りの細胞は、約２０ｍＬの最終体積中に５％ヒト血清アルブミンで再懸濁する。事前に混合したＤＭＳＯ／ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ（登録商標）（１：１ｖ／ｖ）を加えて約２４ｍＬの体積を得る。生成した細胞は凍結保存する。この方法の具体的な実施形態では、そこから灌流液を得る胎盤は臍帯血を流出させているが、胎盤細胞を回収するための灌流前に灌流しない。別の具体的な実施形態では、そこから灌流液を得る胎盤は臍帯血を流出させ、胎盤細胞を回収するための灌流前に灌流して残留血液を除去する。

一実施形態では、近位臍帯を灌流中に固定し、およびより好ましくは胎盤ディスク中への胎盤挿入の４〜５ｃｍ（センチメートル）以内に固定する。

胎盤細胞を回収するために使用する灌流液の体積は、回収する細胞の数、胎盤の大きさ、１つの胎盤から行う回収の数などに応じて変わる可能性がある。様々な実施形態では、灌流液の体積は、５０ｍＬ〜５０００ｍＬ、５０ｍＬ〜４０００ｍＬ、５０ｍＬ〜３０００ｍＬ、１００ｍＬ〜２０００ｍＬ、２５０ｍＬ〜２０００ｍＬ、５００ｍＬ〜２０００ｍＬ、または７５０ｍＬ〜２０００ｍＬであってよい。典型的には、胎盤は採血後に７００〜８００ｍＬの灌流液で灌流する。

数時間または数日間の行程にわたり複数回、胎盤を灌流することができる。胎盤を複数回灌流する場合、それを容器または他の適切な器中で無菌条件下に維持または培養することができ、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）を含むまたは含まない、および／または抗菌剤（例えば、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）；ストレプトマイシン（例えば、４０〜１００μｇ／ｍｌで）、ペニシリン（例えば、４０Ｕ／ｍｌで）、アンホテリシンＢ（例えば、０．５μｇ／ｍｌで）などの抗生物質）を含むまたは含まない、細胞回収組成物、または標準的な灌流溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」などの正常生理食塩水溶液））で灌流することができる。一実施形態では、灌流および灌流液の回収前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間、または２もしくは３日間以上、胎盤が維持または培養されるように、灌流液を回収せずに単離胎盤を一定時間維持または培養する。灌流胎盤はさらに１回または複数回、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間より長く維持することができ、例えば７００〜８００ｍＬの灌流液で２回目に灌流することができる。胎盤は１、２、３、４、５回以上、例えば、１、２、３、４、５または６時間毎に一度灌流することができる。好ましい実施形態では、胎盤の灌流および灌流溶液、例えば細胞回収組成物の回収を、回収する有核細胞の数が１００細胞／ｍｌ未満の範囲になるまで繰り返す。異なる時点における灌流液をさらに個別に処理して、時間依存性の細胞集団、例えば幹細胞を回収することができる。異なる時点からの灌流液をプールすることもできる。好ましい実施形態では、娩出後約８時間と約１８時間の間に１回または複数回幹細胞を回収する。

灌流は、前記溶液で灌流せず、かつ胎盤細胞を得るために（例えば、組織破壊、例えば酵素による消化によって）他に処理しなかった哺乳動物胎盤から入手可能な数より、有意に多い胎盤細胞の回収をもたらすことが好ましい。この文脈において、「有意に多い」は少なくとも１０％を超えることを意味する。灌流は、例えば胎盤、またはその一部分を培養した培養培地から入手可能な胎盤細胞の数より、有意に多い胎盤幹細胞をもたらす。

１つまたは複数のプロテアーゼまたは他の組織破壊酵素を含む溶液での灌流によって、胎盤から胎盤細胞を単離することができる。具体的な実施形態では、胎盤またはその一部分（例えば、羊膜、羊膜および絨毛膜、胎盤小葉または胎盤葉、臍帯、または前述の任意の組合せ）を２５〜３７℃にし、３０分間２００ｍＬの培養培地中で１つまたは複数の組織破壊酵素と共にインキュベートする。灌流液からの細胞を回収し、４℃にし、５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのジチオスレイトールおよび２ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む低温の阻害剤混合物で洗浄する。胎盤細胞は、低温の（例えば４℃）幹細胞回収組成物で数分後に洗浄する。

５．４．５胎盤幹細胞の単離、選別、および特徴付け
単離胎盤細胞、例えば、前のセクション５．３に記載した細胞は、灌流によって、または物理的破壊によって、例えば酵素による消化によって得ようと、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって他の細胞から初期に精製する（すなわち、それらから単離する）ことができる。このような遠心分離は、遠心分離速度などに関する任意の標準的なプロトコルに従うことができる。一実施形態では、例えば、胎盤から回収した細胞を、室温で１５分間５０００×ｇでの遠心分離によって灌流液から回収し、これは例えば汚染細胞片および血小板から細胞を分離する。別の実施形態では、胎盤灌流液を約２００ｍｌに濃縮し、Ｆｉｃｏｌｌで穏やかに層状にし、２２℃において２０分間約１１００×ｇで遠心分離にかけ、細胞の低密度界面層をさらなる処理用に回収する。

細胞ペレットは、新たな幹細胞回収組成物、または幹細胞の維持に適した培地、例えば２Ｕ／ｍｌのヘパリンおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＩＭＤＭ無血清培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ＮＹ）中に再懸濁することができる。全単核細胞分画は、例えば製造者の勧める手順に従いＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＮｙｃｏｍｅｄＰｈａｒｍａ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を使用して単離することができる。

灌流または消化によって得られる胎盤細胞は、例えばさらに、または初期に、例えば０．０５％トリプシンおよび０．２％ＥＤＴＡの溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．ＬｏｕｉｓＭＯ）を使用して、差次的トリプシン処理によって単離することができる。単離胎盤細胞は典型的には約５分以内にプラスチック表面から脱着し、一方他の接着性集団は典型的には２０〜３０分を超えるインキュベーションを必要とするので、差次的トリプシン処理は可能である。脱着した胎盤細胞は、トリプシン処理、および例えばトリプシン中和溶液（ＴＮＳ、Ｃａｍｂｒｅｘ）を使用したトリプシン中和後に採取することができる。接着性細胞の単離の一実施形態では、例えば約５〜１０×１０^６個の細胞のアリコートを、いくつかのＴ−７５フラスコ、好ましくはフィブロネクチンコーティングＴ７５フラスコのそれぞれに置く。このような実施形態では、細胞は市販の間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）（Ｃａｍｂｒｅｘ）で培養し、組織培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中に置くことができる。１０〜１５日後、ＰＢＳで洗浄することにより非接着性細胞をフラスコから除去する。次いでＰＢＳをＭＳＣＧＭと交換する。フラスコは様々な接着性細胞型の存在に関して、特に線維芽細胞様細胞の塊の同定および増殖用に毎日調べることが好ましい。

哺乳動物胎盤から回収する細胞の数および型は、例えば、フローサイトメトリー、細胞選別、免疫組織化学法（例えば、組織特異的または細胞マーカー特異的抗体を用いた染色）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）などの標準的な細胞検出技法を使用して形態および細胞表面マーカーの変化を測定すること、光学または共焦点顕微鏡を使用して細胞の形態を調べることによって、および／またはＰＣＲおよび遺伝子発現プロファイルなどの当技術分野でよく知られている技法を使用して、遺伝子発現の変化を測定することによってモニターすることができる。これらの技法を使用して、１つまたは複数の特定マーカーに陽性である細胞を同定することもできる。例えば、ＣＤ３４に対する抗体を使用して、前述の技法を使用して、細胞が検出可能な量のＣＤ３４を含むかどうか決定することができ、その場合細胞はＣＤ３４^＋である。同様に、細胞がＲＴ−ＰＣＲによって検出するのに十分なＯＣＴ−４のＲＮＡ、または成体細胞より有意に多いＯＣＴ−４のＲＮＡを生成する場合、その細胞はＯＣＴ−４^＋である。細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３４などのＣＤマーカー）に対する抗体、およびＯＣＴ−４などの幹細胞特異的遺伝子の配列は、当技術分野でよく知られている。

胎盤細胞、特にＦｉｃｏｌｌ分離、差次的接着、または両方の組合せによって単離した細胞は、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を使用して選別することができる。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、粒子の蛍光性に基づいて細胞を含めた粒子を分離するための、よく知られている方法である（Ｋａｍａｒｃｈ、１９８７、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、１５１：１５０〜１６５）。個々の粒子における蛍光成分のレーザー励起はわずかな電荷をもたらし、混合物からのプラスの粒子とマイナスの粒子の電磁気的分離を可能にする。一実施形態では、細胞表面マーカー特異的抗体またはリガンドを異なる蛍光標識で標識する。細胞は細胞選別器によって処理し、使用する抗体と結合するそれらの能力に基づく細胞の分離を可能にする。ＦＡＣＳにより選別した粒子は、９６ウエルまたは３８４ウエルプレートの個々のウエル中に直接置いて、分離およびクローニングを容易にすることができる。

一選別スキームでは、胎盤由来の細胞、例えば胎盤幹細胞および胎盤多分化能細胞を、マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＯＣＴ−４および／またはＨＬＡ−Ｇの発現に基づいて選別する。培養中のそれらの接着性に基づいて幹細胞を選択するための手順と関連して、これを実施することができる。例えば、接着性に基づく幹細胞の選択は、マーカーの発現に基づいた選別の前後に実施することができる。一実施形態では、例えば、それらのＣＤ３４の発現に基づき細胞を最初に選別し、ＣＤ３４⁻細胞は保持し、ＣＤ２００^＋ＨＬＡ−Ｇ^＋である細胞は全ての他のＣＤ３４⁻細胞から分離する。別の実施形態では、胎盤由来の細胞をそれらのマーカーＣＤ２００および／またはＨＬＡ−Ｇの発現に基づいて単離し、例えば、これらのマーカーのいずれかを示す細胞はさらなる使用のために単離する。例えば、ＣＤ２００および／またはＨＬＡ−Ｇを発現する細胞は、具体的な実施形態では、それらのＣＤ７３および／またはＣＤ１０５の発現、または抗体ＳＨ２、ＳＨ３もしくはＳＨ４によって認識されるエピトープ、またはＣＤ３４、ＣＤ３８またはＣＤ４５の発現の欠如に基づいてさらに選別することができる。例えば、一実施形態では、胎盤細胞は、ＣＤ２００、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５の発現、またはその欠如によって選別し、ＣＤ２００^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋、ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ３８⁻、およびＣＤ４５⁻である胎盤細胞は、さらなる使用のため他の胎盤細胞から単離する。

胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞の抗体介在の検出および選別に関して、特定マーカーに特異的な任意の抗体を、細胞の検出および選別に適した任意のフルオロフォアまたは他の標識と組合せて使用することができる（例えば、蛍光活性化細胞選別）。特異的マーカーに対する抗体／フルオロフォアの組合せには、ＨＬＡ−Ｇに対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合モノクローナル抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａから入手可能）、ＣＤ１０（ＢＤＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙＳｙｓｔｅｍｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）、ＣＤ４４（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＳａｎＪｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）、およびＣＤ１０５（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから入手可能）、ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＤ１１７、およびＣＤ１３に対するフィコエリスリン（ＰＥ）結合モノクローナル抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ３３およびＣＤ１０に対するフィコエリスリン−Ｃｙ７（ＰＥＣｙ７）結合モノクローナル抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ストレプトアビジンおよびＣＤ３８に対するモノクローナル抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびビオチニル化ＣＤ９０（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）があるが、これらだけには限られない。使用することができる他の抗体には、ＣＤ１３３−ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＫＤＲ−ビオチン（ＣＤ３０９、Ａｂｅａｍ）、サイトケラチンＫ−ＦＩＴＣ（ＳｉｇｍａまたはＤａｋｏ）、ＨＬＡＡＢＣ−ＦＩＴＣ（ＢＤ）、ＨＬＡＤＲ、ＤＱ、ＤＰ−ＰＥ（ＢＤ）、β−２−マイクログロブリン−ＰＥ（ＢＤ）、ＣＤ８０−ＰＥ（ＢＤ）およびＣＤ８６−ＡＰＣ（ＢＤ）があるが、これらだけには限られない。

使用することができる他の抗体／標識の組合せには、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（ペリジンクロロフィルタンパク質）、ＣＤ４４−ＰＥ、ＣＤ１９−ＰＥ、ＣＤ１０−Ｆ（フルオレセイン）；ＨＬＡ−Ｇ−Ｆおよび７−アミノ−アクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）、ＨＬＡ−ＡＢＣ−Ｆなどがあるが、これらだけには限られない。

本明細書で提供する単離胎盤細胞は、例えばＣＤ１１７またはＣＤ１３３に対するフィコエリスリン−Ｃｙ５（ＰＥＣｙ５）結合ストレプトアビジンおよびビオチン結合モノクローナル抗体を使用して、ＣＤ１１７またはＣＤ１３３に関してアッセイすることができるが、しかしながら、このシステムを使用すると、比較的高いバックグラウンドのため、細胞がそれぞれＣＤ１１７またはＣＤ１３３に関して陽性に見える可能性がある。

本明細書で提供する単離胎盤細胞は、１つのマーカーに対する抗体で標識し、検出および／選別することができる。胎盤細胞は、異なるマーカーに対する多数の抗体で同時に標識することもできる。

別の実施形態では、磁気ビーズを使用して細胞を分離することができる。細胞は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技法、磁気ビーズ（０．５〜１００μｍ径）と結合するそれらの能力に基づいて粒子を分離するための方法を使用して選別することができる。特定の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含めた、様々な有用な修飾を磁性ミクロスフェアに実施することができる。次いでビーズを細胞と混合して結合を可能にする。次いで細胞を磁場に通して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一実施形態では、これらの細胞を次いで単離して、他の細胞表面マーカーに対する抗体と結合した磁気ビーズと再度混合することができる。再度細胞を磁場に通して、両抗体と結合した細胞を単離する。次いでこのような細胞を、クローン単離用のマイクロタイター皿などの別々の皿中に希釈することができる。

単離胎盤細胞は、細胞形態および増殖特性に基づいて特徴付けおよび／または選別することもできる。例えば、単離胎盤細胞は、例えば培養中の線維芽細胞様の外見を有するとして特徴付けすることができ、および／またはそれに基づいて選択することができる。単離胎盤細胞は、胚様体を形成するその能力を有するとして特徴付けすることができ、および／またはそれに基づいて選択することもできる。一実施形態では、例えば、線維芽細胞様の形状である単離胎盤細胞はＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、培養中に１つまたは複数の胚様体を生成し、他の胎盤細胞から単離する。別の実施形態では、培養中に１つまたは複数の胚様体を生成するＯＣＴ−４^＋胎盤細胞を、他の胎盤細胞から単離する。

別の実施形態では、コロニー形成単位アッセイによって、単離胎盤細胞を同定および特徴付けすることができる。ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、ＶａｎｃｏｕｖｅｒＢｒｉｔｉｓｈＣｏｌｕｍｂｉａ）などのコロニー形成単位アッセイは当技術分野で一般に知られている。

単離胎盤細胞は、トリパンブルー色素排除アッセイ、フルオレセイン二酢酸取り込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取り込みアッセイ（生存率を評価するため）およびチミジン取り込みアッセイ、ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（増殖を評価するため）などの、当技術分野で知られている標準的な技法を使用して、生存率、増殖能力、および寿命に関して評価することができる。長期培養中の集団倍化の最大数の決定などの、当技術分野でよく知られている方法によって寿命を決定することができる。

単離胎盤細胞は、当技術分野で知られている他の技法、例えば望ましい細胞の選択的増殖（陽性選択）、望ましくない細胞の選択的破壊（陰性選択）、例えばダイズ凝集素を用いた混合集団中の差次的細胞凝集に基づいた分離、凍結−解凍手順、濾過、従来型およびゾーン遠心分離、遠心分離洗浄（カウンターストリーミング遠心分離）、単位重力による分離、向流分配、電気泳動などを使用して、他の胎盤細胞から分離することもできる。

５．５単離胎盤細胞の培養
５．５．１培養培地
単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞の集団、またはそこから胎盤幹細胞が増殖する細胞もしくは胎盤組織を使用して、細胞培養を開始する、または接種することができる。細胞は一般に、非コーティング状態、または細胞外マトリクスまたはラミニン、コラーゲン（例えば、天然または変性）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチンなどのリガンド、および細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））（ＢＤＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）でコーティング状態のいずれかの滅菌済み組織培養容器に移す。

単離胎盤細胞は、細胞、例えば幹細胞を培養するのに許容できるとして当技術分野で認められている、任意の培地中、および任意の条件下で培養することができる。培養培地は血清を含むことが好ましい。単離胎盤細胞は、例えば、ＩＴＳ（インシュリン−トランスフェリン−セレン）、ＬＡ＋ＢＳＡ（リノール酸−ウシ血清アルブミン）、デキストロース、Ｌ−アスコルビン酸、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ−ＬＧ（ダルベッコ改変最小培地、低グルコース）／ＭＣＤＢ２０１（ヒヨコ線維芽細胞基礎培地）、１％〜２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ−ＨＧ（高グルコース）、１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＨＧ、１０％ＦＢＳ、１０％ウマ血清、およびヒドロコルチゾンを含むＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地）、１０％ＦＢＳ、ＥＧＦ、およびヘパリンを含むＭ１９９、１０％ＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）およびゲンタマイシンを含むα−ＭＥＭ（最小必須培地）、１０％ＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）およびゲンタマイシンを含むＤＭＥＭなどにおいて培養することができる。

胎盤細胞を培養するために使用することができる他の培地には、ＤＭＥＭ（高または低グルコース）、イーグルの基礎培地、ＨａｍのＦ１０培地（Ｆ１０）、ＨａｍのＦ−１２培地（Ｆ１２）、Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、ＬｉｅｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地、ＭＣＤＢ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、最新ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ）、およびＣＥＬＬ−ＧＲＯＦＲＥＥがある。

例えば、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）；ウマ（馬）血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ））、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）、１つまたは複数の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インシュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびエリスロポイエチン（ＥＰＯ）、Ｌ−バリンを含めたアミノ酸、および細菌汚染を調節するための１つまたは複数の抗菌剤および／または抗真菌剤、例えば、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびニスタチンなどを含めた１つまたは複数の成分を、単独または組合せで培養培地に補充することができる。

単離胎盤細胞は、標準的な組織培養条件において、例えば組織培養皿またはマルチウエルプレートにおいて培養することができる。単離胎盤細胞は、懸滴法を使用して培養することもできる。この方法では、単離胎盤細胞を約５ｍＬの培地に１ｍＬ当たり約１×１０^４個の細胞で懸濁し、一滴または複数滴の培地を、組織培養容器、例えば１００ｍＬペトリ皿の蓋の内側に置く。滴は、例えばマルチチャネルピペッターからの、一滴、または複数滴であってよい。蓋を注意深く反転させ、一定体積の液体、例えば皿雰囲気中の水分含量を維持するのに十分な滅菌済みＰＢＳを含有する、皿の底部表面に置き、幹細胞を培養する。

一実施形態では、単離胎盤細胞は、単離胎盤細胞において未分化状態の表現型を維持するように作用する化合物の存在下で培養する。具体的な実施形態では、化合物は置換３，４−ジヒドロピリジモール［４，５−ｄ］ピリミジンである。より具体的な実施形態では、化合物は、以下の化学構造を有する化合物である：

化合物は、例えば、約１μＭ〜約１０μＭの濃度で、単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞の集団と接触させることが可能である。

５．５．２胎盤細胞の拡大および増殖
単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞の集団（例えば、幹細胞または幹細胞の集団と通常ｉｎｖｉｖｏで関係がある胎盤細胞の、少なくとも５０％から分離した胎盤細胞または胎盤細胞の集団）を得た後、細胞または細胞の集団をｉｎｖｉｔｒｏで増殖および拡大することができる。例えば、単離胎盤細胞の集団を、細胞が７０〜９０％の集合状態に増殖するのに十分な時間、すなわち細胞およびそれらの子孫が組織培養容器の培養表面積の７０〜９０％を占めるまで、組織培養容器、例えば皿、フラスコ、マルチウエルプレートなどにおいて培養することができる。

単離胎盤細胞は、細胞増殖を可能にする密度で培養容器に接種することができる。例えば、細胞は低密度（例えば、約１，０００〜約５，０００個の細胞／ｃｍ^２）〜高密度（例えば、約５０，０００個以上の細胞／ｃｍ^２）で接種することができる。好ましい実施形態では、空気中に約０〜約５体積パーセントのＣＯ_２の存在下で細胞を培養する。いくつかの好ましい実施形態では、空気中に約２〜約２５体積パーセントのＯ_２、好ましくは空気中に約５〜約２０体積パーセントのＯ_２で細胞を培養する。細胞は好ましくは約２５℃〜約４０℃、好ましくは３７℃で培養する。細胞はインキュベーター内で培養するのが好ましい。培養培地は固定状態であってよく、または例えばバイオリアクターを使用して攪拌してよい。胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞は、（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、Ｎ−アセチルシステインなどを加えて）低い酸化ストレス下で増殖させるのが好ましい。

約１００％未満、例えば７０〜９０％の集合状態を得た後、細胞を継代することができる。例えば、当技術分野でよく知られている技法を使用して、細胞を酵素により処理、例えばトリプシン処理して、組織培養表面からそれらを分離することができる。除去後、細胞をピペッティングし、細胞を計数し、約１０，０００〜１００，０００個の細胞／ｃｍ^２、好ましくは約５０，０００個の細胞／ｃｍ^２を、新たな培養培地を含有する新しい培養容器に継代する。典型的には、新しい培地は、そこから単離胎盤細胞を除去した同じ型の培地である。単離胎盤細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、または２０回以上継代することができる。

胎盤細胞塊の生成
産後胎盤から単離した細胞、例えば、前のセクション５．３に記載した単離胎盤細胞をいくつかの異なる方法で培養して、一組のロット、例えば一組の個別に投与可能な用量の単離胎盤細胞を生成することができる。このようなロットは、例えば、胎盤灌流液由来の細胞から、または酵素により消化した胎盤組織由来の細胞から得ることができる。複数の胎盤から得た数組の胎盤細胞のロットは、例えば長期の貯蔵用に、単離胎盤細胞の塊に並べることができる。一般に、組織培養プラスチック接着性胎盤細胞を胎盤材料の初期培養から得て接種培養物を形成し、それを制御条件下で増殖してほぼ同数の倍化から細胞の集団を形成する。ロットは一胎盤の組織に由来することが好ましいが、複数の胎盤の組織に由来してよい。

一実施形態では、胎盤細胞のロットを以下のように得る。最初に胎盤組織を、例えば切断によって破壊し、適切な酵素、例えばコラゲナーゼで消化する（前のセクション５．４．３を参照）。胎盤組織は、例えば一胎盤由来の羊膜全体、絨毛膜全体、または両方を含むことが好ましいが、羊膜または絨毛膜の一部分のみを含むことができる。消化した組織は、例えば、約１〜３週間、好ましくは約２週間培養する。非接着性細胞を除去した後、形成する高密度コロニーは、例えばトリプシン処理によって回収する。これらの細胞を回収し、好都合な体積の培養培地に再懸濁し、次いでこれらを使用して増殖培養物を接種する。増殖培養物は、別の細胞培養装置、例えばＮＵＮＣ（商標）によるＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｙの任意の配列であってよい。細胞は例えば１×１０^３、２×１０^３、３×１０^３、４×１０^３、５×１０^３、６×１０^３、７×１０^３、８×１０^３、９×１０^３、１×１０^４、２×１０^４、３×１０^４、４×１０^４、５×１０^４、６×１０^４、７×１０^４、８×１０^４、９×１０^４、または１０×１０^４個の幹細胞で増殖培養物を接種する任意の程度に細分することができる。約１×１０^３〜約１×１０^４個の細胞／ｃｍ^２を使用して、それぞれの増殖培養物を接種することが好ましい。増殖培養物の数は、そこから細胞を得る個々の（１つまたは複数の）胎盤に応じて、これより多数または少数であってよい。

増殖培養物は、培養中の細胞の密度が特定の値、例えば約１×１０^５個の細胞／ｃｍ^２に達するまで増殖する。細胞はこの時点で回収および凍結保存のいずれかが可能であり、または前に記載したように新しい増殖培養物に継代することができる。細胞は使用前に例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回継代することができる。集団倍化の累積数の記録は（１回または複数回の）増殖培養中維持されることが好ましい。細胞は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８または４０の倍化、または最大６０の倍化で増殖することができる。しかしながら、細胞集団を個々の用量に分ける前の集団倍化の数は、約１５と約３０の間であることが好ましい。細胞は増殖プロセスを通じて連続的に培養することができ、または増殖中に１つまたは複数の地点で凍結することができる。

個々の用量で使用する細胞は、後の使用のために凍結、例えば凍結保存することができる。個々の用量は、例えば１ｍｌ当たり約１００万個〜約５０００万個の細胞を含むことができ、合計で約１０^６個と約１０^１０個の間の細胞を含むことができる。

一実施形態では、したがって胎盤細胞塊は、第１の複数集団倍化でヒト産後胎盤由来の初代培養胎盤細胞を増殖すること、前記胎盤細胞を凍結保存してマスター細胞塊を形成すること、第２の複数集団倍化でマスター細胞塊から複数の胎盤細胞を増殖すること、前記胎盤細胞を凍結保存して作業用細胞塊を形成すること、第３の複数集団倍化で作業用細胞塊から複数の胎盤細胞を増殖すること、および前記胎盤細胞を個々の用量で凍結保存することを含み、前記個々の用量が胎盤細胞塊を集合的に構成する方法によって作製することができる。別の具体的な実施形態では、前記初代培養胎盤細胞は、胎盤灌流液由来の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記初代培養胎盤細胞は、消化胎盤組織由来の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記初代培養胎盤細胞は、胎盤灌流液由来および消化胎盤組織由来の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞初代培養物中の前記胎盤細胞の全てが同じ胎盤に由来する。別の具体的な実施形態では、この方法は、前記作業用細胞塊由来の前記複数の前記胎盤細胞からＣＤ２００^＋もしくはＨＬＡ−Ｇ^＋胎盤細胞またはＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤細胞を選択して、個々の用量を形成するステップをさらに含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０^４個〜約１０^５個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０^５個〜約１０^６個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０^６個〜約１０^７個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０^７個〜約１０^８個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０^８個〜約１０^９個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０^９個〜約１０^１０個の胎盤細胞を含む。

本明細書で提供する胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含む組成物を作製する方法は、前に記載した任意のステップで胎盤細胞塊の構築に組み込むことができる。一実施形態では、医薬組成物を、マスター細胞塊を生成した後、および前記マスター細胞塊からの１つまたは複数の作業用細胞塊の生成中、または前記作業用細胞塊からの胎盤細胞の増殖中に生成する。例えば、胎盤細胞を作業用細胞塊から解凍し、複数集団倍化で培養することができる。一実施形態では、望ましい数の細胞が生じるとき、または望ましい数の集団倍化が起こるとき、胎盤細胞は例えば遠心分離によって回収し、例えばデキストラン４０、例えば５．５％デキストラン４０を含む溶液に再懸濁することができる。特定の実施形態では、胎盤幹細胞を２回目に回収し、デキストランおよび凍結保護剤を含む溶液、例えば１０％ＨＳＡおよび５％ＤＭＳＯを含む５．５％デキストラン４０溶液に再懸濁し、凍結保存する。凍結保存した胎盤細胞は、例えば使用直前に、例えば前のセクション５．２に記載した組成物の最終生成の直前に解凍する。

胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含む組成物を生成する前述の方法を、胎盤細胞塊の生成および／または使用中に、例えば、胎盤細胞が凍結保存され得る各地点、または例えば、胎盤細胞を最終凍結保存前に個々の投与用に調製する地点で、および個体への投与前の解凍時に、一度使用することができる。

好ましい実施形態では、そこから胎盤を得るドナー（例えば母親）を少なくとも１つの病原体に関して試験する。母親が試験病原体に陽性反応を示す場合、胎盤由来の全ロットを廃棄する。このような試験は、初期細胞培養の確定前後を含めた胎盤細胞ロットの生成中、または増殖培養中の任意の時間で実施することができる。その存在に関して試験する病原体は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＩおよびＩＩ型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスなどを非制限的に含むことができる。

５．６胎盤細胞の保存
単離胎盤細胞、例えば前のセクション５．２に記載した単離胎盤多分化能細胞は、例えば回収中に保存することができる、すなわち、例えば本明細書に記載する方法を使用して、例えば回収中または本明細書に記載する組成物の生成前に、長期の貯蔵を可能にする条件下、または例えばアポトーシスまたは壊死による細胞死を抑制する条件下に置くことができる。

胎盤細胞は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる関連米国出願公開第２００７／０１９００４２号に記載されたように、例えばアポトーシス阻害剤、壊死阻害剤および／または酸素含有ペルフルオロカーボンを含む組成物を使用して保存することができる。一実施形態では、本明細書に示す細胞を含む組成物において使用する細胞集団を保存する方法は、アポトーシス阻害剤および酸素含有ペルフルオロカーボンを含む細胞回収組成物と前記細胞集団を接触させることを含み、前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触していない細胞集団と比較して、前記細胞集団中のアポトーシスを低減または予防するのに十分な量および時間存在する。具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤はカスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤はＪＮＫ阻害剤である。より具体的な実施形態では、前記ＪＮＫ阻害剤は前記細胞の分化または増殖を調節しない。別の実施形態では、前記細胞回収組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素含有ペルフルオロカーボンを分離相で含む。別の実施形態では、前記細胞回収組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素含有ペルフルオロカーボンをエマルジョン中に含む。別の実施形態では、前記細胞回収組成物は、乳化剤、例えばレシチンをさらに含む。別の実施形態では、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは細胞との接触時は約０℃と約２５℃の間である。別のより具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは、細胞との接触時は約２℃と１０℃の間、または約２℃と約５℃の間である。別のより具体的な実施形態では、前記接触は前記細胞集団の輸送中に実施する。別のより具体的な実施形態では、前記接触は、前記細胞集団の凍結および解凍中に実施する。

胎盤細胞の集団は、例えば、アポトーシス阻害剤および臓器保存用化合物と前記細胞集団を接触させることを含む方法によって保存することができ、前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触していない細胞集団と比較して、前記細胞集団中のアポトーシスを低減または予防するのに十分な量および時間存在する。具体的な実施形態では、臓器保存用化合物は、ＵＷ溶液（米国特許第４，７９８，８２４号に記載される；ＶｉａＳｐａｎとしても知られる；Ｓｏｕｔｈａｒｄら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ４９（２）：２５１〜２５７（１９９０）も参照）またはＳｔｅｍら、米国特許第５，５５２，２６７号に記載される溶液である。別の実施形態では、前記臓器保存用化合物は、ヒドロキシエチルスターチ、ラクトビオン酸、ラフィノース、またはこれらの組合せである。別の実施形態では、細胞回収組成物は、２相中またはエマルジョンとしてのいずれかで酸素含有ペルフルオロカーボンをさらに含む。

方法の別の実施形態では、灌流中に、アポトーシス阻害剤および酸素含有ペルフルオロカーボン、臓器保存用化合物、またはこれらの組合せを含む細胞回収組成物と胎盤幹細胞を接触させる。別の実施形態では、前記細胞は、組織破壊、例えば酵素による消化のプロセス中に接触させる。別の実施形態では、灌流による回収後、または組織破壊、例えば酵素による消化による回収後に、胎盤細胞を前記細胞回収化合物と接触させる。

典型的には、胎盤細胞の回収、濃縮および単離中は、低酸素および機械的ストレスによる細胞ストレスを最小化または排除することが好ましい。したがって、方法の別の実施形態では、細胞、または細胞集団を、前記保存中に６時間未満、回収、濃縮または単離中に低酸素状態に曝し、低酸素状態は正常血中酸素濃度未満である酸素濃度である。より具体的な実施形態では、前記細胞集団を、前記保存中に２時間未満前記低酸素状態に曝す。別のより具体的な実施形態では、前記細胞集団を、回収、濃縮または単離中に１時間未満、または３０分未満前記低酸素状態に曝す、または低酸素状態に曝さない。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団を、回収、濃縮または単離中にせん断応力に曝さない。

胎盤細胞は、本明細書で開示する一般的または具体的方法において、凍結保存することができる。一実施形態では、胎盤細胞を凍結保存するために使用する凍結保護剤はＤＭＳＯである。別の実施形態では、凍結保護剤はプロピレングリコール、例えば約１．５Ｍプロピレングリコールである。凍結保護剤は、例えばグリセロール、エチレングリコール、ポリフェノール（例えば、約３０〜約１２０ｐｐｍ）などであってもよい。他の実施形態では、凍結保護剤は、ＤＭＳＯ、トレハロース、およびデキストランの１つまたは複数のと組合せたウシ胎児血清、ヒト血清、またはヒト血清アルブミンである。具体的な実施形態では、凍結保護剤はヒト血清、ＤＭＳＯ、およびトレハロースであり、またはウシ胎児血清およびＤＭＳＯである。特定の実施形態では、胎盤細胞は、小容器、例えばアンプル中の、凍結保存培地中に凍結保存する。胎盤細胞は、凍結保存中約１℃／分で冷却することが好ましい。好ましい凍結保存温度は約−８０℃〜約−１８０℃、好ましくは約−１２５℃〜約−１４０℃である。凍結保存した細胞は、使用するために解凍直前に液体窒素に移すことができる。いくつかの実施形態では、例えば、アンプルが約−９０℃に達した後、それらを液体窒素貯蔵領域に移す。速度制御フリーザーを使用して凍結保存を行うこともできる。凍結保存した細胞は、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度で、好ましくは約３７℃の温度まで解凍する。

５．７細胞含有組成物
５．７．１胎盤細胞を含む組成物
本明細書、例えばセクション５．３に記載する胎盤細胞は、本明細書に記載する１つまたは複数の胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含むことができ、これらの細胞は胎盤、例えばヒト胎盤から単離されている。別の具体的な実施形態では、任意の前述の組成物はマトリクスを含む。より具体的な実施形態では、前記マトリクスは三次元骨格である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチンまたはビトロネクチンを含む。別のより具体的な実施形態では、マトリクスは、羊膜または羊膜由来生体材料である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは細胞外膜タンパク質を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは合成化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは生物活性化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記生物活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体、または５，０００ダルトン未満の有機分子である。

別の実施形態では、本明細書で提供する組成物、例えば医薬組成物において有用な組成物は、任意の前述の胎盤細胞、または任意の前述の胎盤細胞集団によって条件付けされる培地を含む。具体的な実施形態では、任意のこのような組成物は、胎盤に由来しない幹細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記幹細胞は胚性幹細胞である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は間葉系幹細胞である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は骨髄由来幹細胞である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は造血前駆細胞である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は体性幹細胞である。さらにより具体的な実施形態では、前記体性幹細胞は、神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞、または筋肉幹細胞である。

５．７．１．１医薬組成物
単離胎盤細胞の集団、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団は、医薬組成物内に含有される、またはその構成成分である。単離胎盤細胞は、個体に容易に投与可能である形、例えば、医学用途に適した容器内に含有される胎盤灌流液細胞または単離胎盤細胞に調製することができる。このような容器は、例えば、シリンジ、滅菌済みプラスチックバッグ、フラスコ、ジャー、またはそこから胎盤幹細胞集団を容易に分配することができる他の容器であってよい。例えば容器は、レシピエントへの液体の静脈内投与に適した、血液バッグ、または他のプラスチック製の、医学的に許容されるバッグであってよい。特定の実施形態では、容器は単離胎盤細胞集団の凍結保存を可能にする容器である。

一実施形態では、容器は、本明細書に記載する１つまたは複数の方法ステップの実施を容易にする、または可能にする容器である。例えば、細胞を含む組成物を生成する方法が、例えば、（ａ）前記細胞を、デキストランおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む溶液と接触させて細胞含有溶液を生成するステップ、（ｂ）溶液を濾過するステップ、（ｃ）前記細胞をデキストランを含む第１の希釈溶液で、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個の細胞に希釈するステップ、および（ｄ）前記細胞を、デキストランを含みＨＳＡを含まない第２の希釈溶液で希釈するステップを含む場合、細胞、例えば単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞を、例えばステップ（ｃ）と（ｄ）の間に容器中に置くことができ、容器は例えば、凍結保存を容易にする、および／または細胞を必要とする個体への細胞の送達を容易にする容器などである。特定の実施形態では、前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、前記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞である。他の特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。

例えば、単離胎盤細胞は、例えばバッグ、例えば血液バッグまたは同様のバッグ中に凍結保存することができ、解凍し、同じバッグ中に最終的に希釈することができる。別の実施形態では、細胞を含む組成物を生成する方法が、例えば、（ａ）複数の細胞、例えば胎盤灌流液細胞または単離胎盤細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、（ｂ）細胞を５．５％デキストラン４０に再懸濁するステップ、（ｃ）細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、（ｄ）細胞を、１０％のＨＳＡを含む５．５％デキストラン４０溶液に再懸濁するステップ、（ｅ）細胞を７０μＭ〜１００μＭフィルターで濾過するステップ、（ｆ）細胞を、５．５％のデキストラン４０、１０％のＨＳＡ、および５％のＤＭＳＯ中に１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞に希釈するステップ、（ｇ）細胞を凍結保存するステップ、（ｈ）細胞を解凍するステップ、および（ｉ）１０％デキストラン４０で細胞を１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希釈して前記医薬組成物を生成するステップを含む場合、例えば、凍結保存および／または細胞を必要とする個体への細胞の投与を容易にする容器中の細胞の配置は、ステップ（ｅ）後の任意のステップで例えば実施することができる。特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１〜５０×１０^６、１〜４０×１０^６、１〜３０×１０^６、１〜２０×１０^６、１〜１５×１０^６、または１〜１０×１０^６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０^６個の細胞である。他の特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。具体的な実施形態では、細胞、例えば単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞を、濾過後に容器中に置くことができ、次いで容器中で希釈、凍結保存、解凍し、および／または個体への投与前に最終的に希釈することができる。

本明細書で提供する組成物、例えば医薬組成物中の単離胎盤細胞は、１ドナー由来、または複数のドナー由来の胎盤細胞を含むことができる。単離胎盤細胞は、目的のレシピエントと完全にＨＬＡ適合状態、または部分的もしくは完全にＨＬＡミスマッチであってよい。

したがって、一実施形態では、本明細書で提供する組成物中の単離胎盤細胞を、その必要性のある個体に投与する。具体的には、前記単離胎盤細胞は、筋肉内、皮内、腹膜内、動脈内、皮下、静脈内または眼内投与する。一実施形態では、本明細書で提供する組成物中の単離胎盤細胞を、容器中に単離胎盤細胞を含む組成物の形で、その必要性のある個体に投与する。別の具体的な実施形態では、容器はバッグ、フラスコ、またはジャーである。より具体的な実施形態では、前記バッグは滅菌済みプラスチックバッグである。より具体的な実施形態では、前記バッグは、例えば、静脈内注入、ボーラス注射などによる前記単離胎盤細胞の静脈内投与に適している、それを可能にするまたは容易にする。バッグは、相互接続して投与前または最中の単離胎盤細胞と１つまたは複数の他の溶液、例えば薬剤の混合を可能にする、多数の内腔または区画を含むことができる。別の具体的な実施形態では、凍結保存前に、単離胎盤細胞を含む溶液は、組合せ細胞の凍結保存を容易にする１つまたは複数の化合物を含む。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は生理的に許容される水溶液中に含有される。より具体的な実施形態では、前記生理的に許容される水溶液は０．９％のＮａＣｌ溶液である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、前記細胞集団のレシピエントとＨＬＡ適合状態である胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記組合せ細胞は、前記細胞集団のレシピエントと少なくとも部分的にＨＬＡミスマッチである胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞は複数のドナーに由来する。

医薬組成物中の単離胎盤細胞は、本明細書に記載する任意の単離胎盤細胞であってよい。具体的な実施形態では、本明細書に記載する単離胎盤細胞は、容器中に含有されるＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋細胞である。具体的な実施形態では、本明細書に記載する単離胎盤細胞は、容器中に含有されるＣＤ２００^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋細胞である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、容器中に含有されるＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋細胞である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、容器中に含有されるＣＤ２００^＋、ＯＣＴ−４^＋細胞である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、容器中に含有されるＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋細胞であり、前記細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で胎盤細胞集団と共に培養すると１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、凍結保存され容器中に含有されるＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、ＨＬＡ−Ｇ^＋細胞である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は容器中に含有されるＯＣＴ−４^＋細胞であり、前記細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で胎盤細胞集団と共に培養すると１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。任意の前述の胎盤細胞の具体的な実施形態では、前記容器はバッグである。

様々な具体的な実施形態では、前記容器は、約、少なくとも、または最大１×１０^６個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０^６個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、１×１０^７個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０^７個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、１×１０^８個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０^８個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、１×１０^９個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０^９個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、または１×１０^１０個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞を含む。他の実施形態では、一回単位用量の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞は、様々な実施形態では、約、少なくとも、または最大１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１またはそれより多くの単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞を含むことができる。他の実施形態では、単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞の容器または用量は、１×１０^５〜５×１０^５個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０^５〜１×１０^６個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、１×１０^６〜５×１０^６個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０^６〜１×１０^７個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、１×１０^７〜５×１０^７個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０^７〜１×１０^８個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、１×１０^８〜５×１０^８個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０^８〜１×１０^９個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、１×１０^９〜５×１０^９個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０^９〜１×１０^１０個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、１×１０^１０〜５×１０^１０個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０^１０〜１×１０^１１個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、またはそれより多くの単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、レシピエント１キログラム当たり約２×１０^７〜約１０×１０^７個の細胞を投与するのに十分な数の、単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞を含む。

任意の前述の凍結保存集団の他の具体的な実施形態では、前記細胞は、約、少なくとも、または最大５回、最大１０回、最大１５回、または最大２０回継代した。任意の前述の凍結保存細胞の別の具体的な実施形態では、前記細胞は前記容器内で増殖させた。

本明細書で記載する胎盤幹細胞を含む医薬組成物は、本明細書で他の箇所に記載する、任意の単離胎盤細胞集団、または単離胎盤細胞型、または任意の組合せを含むことができる。医薬組成物は、胎児、母親、または胎児と母親両方の胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含むことができる。本明細書で提供する医薬組成物は、一個体または胎盤から、または複数の個体または胎盤から得る単離胎盤細胞をさらに含むことができる。

本明細書で提供する医薬組成物は、５０％以上生存状態である細胞（すなわち、集団中の少なくとも５０％の細胞が機能的または生存している）を含む細胞の集団を含む。集団中の少なくとも６０％の細胞が生存状態であることが好ましい。医薬組成物内の集団中の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が生存状態であることがより好ましい。

一実施形態では、医薬組成物は、実質的、または完全に非母型起源である、すなわち胎児の遺伝子型を有する、例えば少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％または約１００％が非母型起源である、単離胎盤細胞を含む。例えば、一実施形態では、医薬組成物は単離胎盤細胞の集団を含み、それらはＣＤ２００^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋；ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、およびＣＤ２００^＋；ＣＤ２００^＋およびＯＣＴ−４^＋；ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋；ＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋であり、胚様体またはＯＣＴ−４^＋の形成を可能にする条件下で前記胎盤細胞集団を培養すると、前記単離胎盤細胞集団を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、胚様体または前述の任意の組合せの形成を可能にする条件下で前記胎盤細胞集団を培養すると、前記単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の前記胎盤細胞集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の前記胎盤細胞は非母型起源である。別の実施形態では、医薬組成物は単離胎盤細胞の集団を含み、それらはＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋およびＣＤ３４⁻；ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋およびＣＤ３４⁻；ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋、ＣＤ３４⁻およびＣＤ９０^＋またはＣＤ４５⁻の少なくとも１つ；ＣＤ１０^＋、ＣＤ９０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋、ＣＤ３４⁻およびＣＤ４５⁻；ＣＤ１０^＋、ＣＤ９０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋、ＣＤ３４⁻およびＣＤ４５⁻；ＣＤ２００^＋およびＨＬＡ−Ｇ^＋；ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、およびＣＤ２００^＋；ＣＤ２００^＋およびＯＣＴ−４^＋；ＣＤ７３^＋、ＣＤ１０５^＋、およびＨＬＡ−Ｇ^＋；ＣＤ７３^＋およびＣＤ１０５^＋であり、胚様体；ＯＣＴ−４^＋の形成を可能にする条件下で前記胎盤細胞集団を培養すると、前記単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、胚様体；ＣＤ１１７⁻、ＣＤ１３３⁻、ＫＤＲ⁻、ＣＤ８０⁻、ＣＤ８６⁻、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ^＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ⁻および／またはＰＤＬ１^＋の１つまたは複数；または前述の組合せの形成を可能にする条件下で前記胎盤細胞集団を培養すると、前記単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の前記単離胎盤細胞は非母型起源である。具体的な実施形態では、医薬組成物は、胎盤から得られない幹細胞をさらに含む。

本明細書で提供する医薬組成物は、例えば生着を容易にする１つまたは複数の化合物（例えば、抗Ｔ細胞受容体抗体、免疫抑制剤など）、例えばアルブミン、デキストラン４０、ゼラチン、ヒドロキシエチルスターチ、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅなどの安定剤を含むことができる。

５．７．２造血胎盤細胞または胎盤灌流液細胞を含む組成物
本明細書で提供する組成物の特定の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４^＋胎盤幹細胞、例えば造血胎盤細胞または前駆細胞である。このような細胞は、胎盤組織から、例えば臍帯血を流出させ、灌流させて残留血液を除去した胎盤から入手可能である。特定の実施形態では、ＣＤ３４^＋胎盤幹細胞はＣＤ３８^＋である。特定の実施形態では、ＣＤ３４^＋単離胎盤幹細胞はＣＤ３８⁻である。特定の他の実施形態では、ＣＤ３４^＋単離胎盤細胞はＣＤ４５^＋である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４^＋、ＣＤ３８⁻およびＣＤ４５^＋である。特定の実施形態では、細胞は造血細胞である。より具体的な実施形態では、胎盤ＣＤ３４^＋細胞は造血細胞である。特定の実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞または造血細胞は胎盤灌流液から得る。特定の実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞または造血細胞は、胎盤組織の酵素による消化または物理的破壊によって得る。ＣＤ３４^＋細胞および造血細胞は、１つの胎盤から、または２つ以上の胎盤から得ることができる。

特定の実施形態では、本明細書で提供する方法によって製剤化した本明細書で提供する組成物の細胞は、胎盤灌流液から得た細胞である。本明細書で使用する「胎盤灌流液から得た細胞」は、胎盤灌流液から得た、例えば単離した全有核細胞、胎盤灌流液から得た有核細胞のサブセット、または胎盤灌流液から直接得た細胞から培養もしくは増殖した細胞を含む。胎盤灌流液は、胎盤細胞を得るための灌流前に、臍帯血を流出させ、灌流させて残留血液を除去した胎盤から得ることができる。胎盤灌流液は、臍帯血を流出させているが灌流させて残留血液を除去していない胎盤から得ることができる。胎盤灌流液は、臍帯血を流出させておらず灌流させて残留血液を除去してもいない胎盤から得ることができる。後の２つの実施形態では、胎盤細胞、例えば胎盤灌流液からの有核細胞、例えば、胎盤灌流液からの全有核細胞は、胎盤血および／または臍帯血からの有核細胞を含む。胎盤灌流液細胞は、１つの胎盤から、または２つ以上の胎盤から得ることができる。

５．７．３不死化胎盤細胞系
哺乳動物胎盤細胞は、増殖促進遺伝子、すなわち適切な条件下で、増殖促進タンパク質の生成および／または活性が外部因子により制御可能であるように、トランスフェクト細胞の増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含有する、任意の適切なベクターを用いたトランスフェクションによって、条件付きで不死化することができる。好ましい実施形態では、増殖促進遺伝子は、ｖ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ＳＶ４０高分子Ｔ抗原、ポリオーマ高分子Ｔ抗原、Ｅ１ａアデノウイルスまたはヒトパピローマウイルスのＥ７タンパク質だけには限られないが、これらなどの癌遺伝子である。

増殖促進タンパク質の外部制御は、外部制御可能なプロモーター、例えばトランスフェクト細胞の温度または細胞と接触する培地の組成を改変することによって、その活性を制御することができるプロモーターの制御下に、増殖促進遺伝子を置くことによって実施することができる。一実施形態では、テトラサイクリン（ｔｅｔ）制御遺伝子発現系を利用することができる（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５５４７〜５５５１、１９９２；Ｈｏｓｈｉｍａｒｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１５１８〜１５２３、１９９６を参照）。ｔｅｔの不在下において、このベクター内のｔｅｔ制御転写活性化因子（ｔＴＡ）は、ｐｈ_{ＣＭＶ−１}、ｔｅｔオペレーター配列と融合したヒトサイトメガロウイルス由来の最小プロモーターからの転写を強く活性化する。ｔＴＡは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌのトランスポゾン−１０由来ｔｅｔ耐性オペロンのリプレッサー（ｔｅｔＲ）と単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６の酸性ドメインの融合タンパク質である。低い、非毒性濃度のｔｅｔ（例えば、０．０１〜１．０μｇ／ｍＬ）は、ｔＴＡによる転写活性化をほぼ完全になくす。

一実施形態では、ベクターは、選択可能マーカー、例えば薬剤耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子をさらに含有する。細菌ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ^Ｒ）は、本発明の方法内で利用することができる１つのこのようなマーカーである。ｎｅｏ^Ｒを有する細胞は、例えば増殖培地に１００〜２００μｇ／ｍＬのＧ４１８を加えることなどの、当業者に知られている手段によって選択することができる。

レトロウイルス感染だけには限らないが、これを含めた当業者に知られている様々な手段のいずれかによって、トランスフェクションを実施することができる。一般に、ベクター用に生産者細胞系から回収した条件付き培地とＮ２サプリメントを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２の混合物とのインキュベーションによって、細胞培養物をトランスフェクトすることができる。例えば、前に記載したように調製した胎盤細胞培養物は、１体積の条件付き培地および２体積のＮ２サプリメント含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２における約２０時間のインキュベーションによって、例えば５日後にｉｎｖｉｔｒｏで感染させることが可能である。次いで選択可能マーカーを有するトランスフェクト細胞を、前に記載したように選択することができる。

トランスフェクション後、増殖を可能にする、例えば少なくとも３０％の細胞が２４時間の間に倍化するのが可能である表面で培養物を継代する。支持体は、ポリオルニチン（１０μｇ／ｍＬ）および／またはラミニン（１０μｇ／ｍＬ）でコーティングされた組織培養プラスチックからなるポリオルニチン／ラミニン支持体、ポリリシン／ラミニン支持体またはフィブロネクチンで処理した表面であることが好ましい。次いで培養物を３〜４日毎に増殖培地に供給し、増殖培地には１つまたは複数の増殖促進因子を補充してよい、または補充しなくてよい。培養物が５０％未満の集合状態（confluent）であるとき、増殖促進因子を増殖培地に加えることができる。

条件付き不死化胎盤細胞系は、８０〜９５％の集合状態時に、標準的な技法を使用して、トリプシン処理などによって継代することができる。いくつかの実施形態では、約２０代の継代まで、（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含有する細胞にＧ４１８を加えることによって）選択を維持することが有益である。細胞は長期の貯蔵用に液体窒素中に凍結することもできる。

クローン細胞系は、前に記載したように調製した条件付き不死化ヒト胎盤細胞系から単離することができる。一般に、このようなクローン細胞系は、標準的な技法を使用して、限界希釈またはクローニングリングの使用などによって単離し、増殖することができる。クローン細胞系は、一般に前に記載したように供給し継代することができる。

必要はないがクローンであってよい、条件付き不死化ヒト胎盤細胞系は、分化を容易にする培養条件下で増殖促進タンパク質の生成および／または活性を抑制することによって、一般に分化を誘導することができる。例えば、増殖促進タンパク質をコードする遺伝子が外部制御可能なプロモーターの制御下にある場合、条件、例えば温度または培地の組成を改変して、増殖促進遺伝子の転写を抑制することができる。前に論じたテトラサイクリン制御型遺伝子発現系に関して、テトラサイクリンを加えて増殖促進遺伝子の転写を抑制することによって、分化を実施することができる。一般に、４〜５日間で１μｇ／ｍＬのテトラサイクリンが分化を開始するのに十分である。さらなる分化を促進するために、追加的な作用物質を増殖培地に含めることができる。

５．７．４キット
別の態様では、本発明の単離胎盤細胞含有組成物の生成および／または投与用のキットが本明細書でさらに提供される。

一実施形態では、別個の容器中に、デキストラン、例えばデキストラン４０を含む１つまたは複数の溶液、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、および凍結保護剤を含む溶液を含むキットが本明細書で提供される。具体的な実施形態では、キットは複数の単離胎盤細胞、例えば凍結保存した単離胎盤細胞を含む。具体的な実施形態では、キットは、５．５％デキストラン４０（ｗ／ｖ）および１０％ＨＳＡ（ｗ／ｖ）を含む溶液を含む容器を含む。別の具体的な実施形態では、キットは、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡおよび５％ＤＭＳＯを含む溶液を含む容器を含む。別の具体的な実施形態では、キットは、１０％デキストラン４０の溶液を含む容器を含む。

別の実施形態では、キットは、細胞懸濁液を濾過するのに適したフィルター、または複数のフィルターを含む。具体的な実施形態では、キット中の１つまたは複数のフィルターは、約５０μＭ径と約１５０μＭ径の間の孔を含む。より別の実施形態では、フィルターは７０μＭフィルターである。別の具体的な実施形態では、フィルターは１００μＭフィルターである。

別の実施形態では、キットは、本明細書に記載する組成物の１つの生成または使用に適した、１つまたは複数のガラス製品またはプラスチック製品を含む。例えばキットは、例えば、細胞懸濁液、例えば単離胎盤細胞の懸濁液の凍結保存または希釈または送達に適した、プラスチックバッグを含むことができる。別の実施形態では、キットは、（１）例えば１つまたは複数のバイアル中に、複数の単離胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞、（２）例えば２〜３継代の前記単離胎盤細胞を培養するのに十分なプラスチック製品、（３）５．５％デキストラン４０（ｗ／ｖ）および１０％ＨＳＡ（ｗ／ｖ）を含む溶液を含む容器、（４）５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡおよび５％ＤＭＳＯを含む溶液を含む容器、（５）１０％デキストラン４０溶液を含む容器、および（６）細胞を含む溶液を濾過するのに適した約５０μＭ径と約１５０μＭ径の間の孔を含む１つまたは複数のフィルターを含む。

６．１単離胎盤細胞を含む投与可能な組成物を生成する改良方法
この実施例は、ヒトまたは動物に投与するための、均質で、高い生存能力の単離胎盤細胞を生成するための、凍結保存前後のヒトＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋単離胎盤細胞の製剤化を実証する。生成する組成物は、解凍後少なくとも４時間にわたり高い生存能力を示す単離胎盤細胞を含み、マクロの細胞塊は含まない。マウスの急性投薬試験は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスが、（呼吸困難、循環、および運動失調によって示される）いかなる心臓または肺毒性もなく、静脈内注入投与により以下に記載する最終製剤を使用して、マウス当たり少なくとも１５０万個の細胞（１ｋｇ当たり約７５００万個の細胞、２０グラムの平均重量を想定）の最大用量、および皮下投与により１ｋｇ当たり最大２億５０００万個の細胞に耐性があったことを実証し、以前の製剤に優る改良点を実証した。以下の実施例は、特定の表面マーカーを発現する単離胎盤細胞の製剤を記載するが、本明細書に示す結果は、これらの方法および製剤が、他の細胞、例えば、異なる表面マーカーを発現する哺乳動物細胞と共に使用することができ、それと適合性があることを示す。

細胞塊アッセイ
細胞塊（凝集体）を、マクロ細胞塊またはミクロ細胞塊として分類した。マクロ細胞塊およびミクロ細胞塊は、存在した場合、以下の手順に従い同定した。

マクロ細胞塊アッセイ
氷の小片のみが容器中に残るまで、細胞を３７℃の水浴中において容器中で解凍した。１６ゲージのニードルを備えるシリンジを使用して容器から細胞を取り出し、細胞は容器から５０ｍＬのコニカルチューブに分配した。マクロ細胞塊の有無は目視によって評価した。

ミクロ細胞塊アッセイ
細胞を計数して細胞濃度を決定した。次いで細胞を１０％デキストラン４０で４×１０^６個の細胞／ｍｌに希釈し、５０μＬの細胞、４０μＬの１０％デキストラン４０、および１０μＬの４０μＭの測定ビーズ溶液を１．７ｍＬのマイクロ遠心分離チューブに加えた。チューブの中身を穏やかに混合した。１０μＬの混合サンプルをスライドガラス上に置き、カバースリップで覆った。３個以上の細胞を含む全てのミクロ細胞塊を計数した。

使用した胎盤細胞は、本明細書に記載したように凍結保存前に４〜６回の継代を経た接着性胎盤細胞の集団を含有した、セルバンクから最初に得た。

２つの異なる単離胎盤細胞系を使用したｉｎｖｉｖｏ注射適合バッファーの比較のデータは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡ、および１％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）が、解凍後５時間の後にいずれも細胞の高い生存能力を維持することができることを示した。バッファー中の最終細胞濃度は２５×１０^６個の細胞／ｍｌであった。試験バッファーに関して細胞の高い生存能力を促進するため、ＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡを選択した。表１０ａおよび表１０ｂ中で実証されたように、高い生存能力が解凍後数時間維持され、さらに、名目上の表現型は解凍後３時間にわたり変わらなかった。解凍後製剤中の細胞の生存能力は、２６ゲージのニードルを介した細胞の継代後に有意に影響を受けることはなかった。この２つの実験中の細胞塊の決定は、使用したサンプル体積が少量であるため可能ではなかった。

表１ａおよび表１ｂのデータに基づいて、解凍後製剤は以下のように最終状態にした。細胞を３７℃において水浴中で解凍し、解凍バッファー（２．５％ＨＳＡ＋５％デキストラン４０）で即座に１：１（ｖ／ｖ）に希釈した。次いで細胞を４００ｇで５分間遠心分離にかけ、ＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡ＋１％ＨＳＡ中に再懸濁した。

マウスの生体内分布試験
前述の解凍後製剤をマウスの生体内分布パイロット試験において施用した。マクロの細胞塊は解凍後の細胞調製中に、特にＰｌａｓｍａｌｙｔｅを加えた後に観察した。この細胞調製によって、それぞれ５０万個の細胞の二回反復静脈内注入によりマウス（約２０ｇ）当たり１００万個の細胞の用量で、急性肺毒性を観察した。この２つの観察は、胎盤細胞製剤のさらなる調査を促した。

デキストラン４０ではなく、ＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡの添加後に顕著な細胞塊を誘導したマウスの生体内分布パイロット試験からの観察に基づいて、デキストラン４０は、この試験ではＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡ、ＨＳＡおよびＰＢＳと共に希釈培地として使用した。

ＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡ＋１０％ＨＳＡ＋５％ＤＭＳＯ中に事前に凍結した細胞を３７℃において水浴中で解凍し、それぞれのバッファーで１：７に希釈した。表２中のデータは、デキストラン４０およびＨＳＡが、試験した培地の中で最小数の細胞塊を誘導したことを示す。

細胞凝集体を解凍直後に様々な製剤において観察した。解凍後の細胞を１００μｍフィルターで濾過した濾過ステップの追加によって、細胞凝集体を排除した。２ロットの胎盤細胞を、個々の希釈剤と組合せて濾過の影響に関して試験した。解凍後４時間にわたり１０％デキストラン４０で細胞を１：１に希釈したとき、濾過後にマクロの細胞塊は形成されなかった。表３ａ〜３ｃを参照。さらに、生存率は依然として高かった。同様の結果をいくつか異なるロットの胎盤細胞で観察した。

前述の試験に基づき、解凍後の製剤胎盤細胞を以下の手順で単純化（simplify）した。細胞を最大３分間３７℃の水浴中で解凍し、次いで１００μＭストレーナーを介して濾過した。濾過した細胞を次いで１０％デキストラン４０で１：１（ｖ：ｖ）に希釈した。

凍結前製剤
細胞処理の凍結前の段階においても細胞塊を観察した。凍結培地、凍結細胞密度および懸濁濾過ステップを試験して、凍結前に細胞凝集体を低減および／または排除した。

凍結培地
前述の解凍後製剤におけるデキストラン４０の成功に基づいて、凍結培地としてのＰｌａｓｍａｌｙｔｅとデキストラン４０を比較した。ロット３からの細胞を、ＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡ＋１０％ＨＳＡ＋５％ＤＭＳＯ中、または５％デキストラン４０＋１０％ＨＳＡ＋５％ＤＭＳＯ中のいずれかに１ｍＬ当たり１７００万個の細胞の濃度で凍結した。細胞塊の存在は以下のように評価した。

これらの実験中でのデキストラン４０の使用は、ＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡの使用より、少ないマクロ細胞塊、少ないミクロ細胞塊、および高い細胞生存率をもたらした。これらの結果に基づいて、凍結培地としてデキストラン４０を選択した。

凍結細胞密度および凍結前濾過
マクロ細胞塊を排除しミクロ細胞塊を最小にするために、細胞密度および凍結前濾過を以下のように調べた。

表５ｂおよび５ｃに示す結果は、凍結前濾過が解凍後マクロの細胞塊形成を排除したことを明らかに示す。データは、高い細胞濃度、例えば２０×１０^６個の細胞／ｍｌを有するサンプルが、解凍後にミクロの細胞塊を形成する可能性がより高いことも示す。結果として、細胞塊形成に対する凍結細胞密度の影響をさらに調べた。

表６ｂおよび６ｃに示す結果は、７．５×１０^６個の細胞／ｍｌ以下での凍結密度は解凍後マクロの細胞塊を誘導しないことを実証する。さらに、１０×１０^６個の細胞／ｍｌまでの濃度で、ミクロ細胞塊の数はかなり少なく、２００未満のミクロ細胞塊／細胞１００万個であった。

前述の結果に基づいて、凍結前および解凍後製剤を以下のように作製した。凍結前製剤用に、液体培養物由来の胎盤細胞を２２０×ｇで５分間遠心分離にかけ、約７．５×１０^６個の細胞／ｍｌまで５％デキストラン４０中に再懸濁した。細胞は４００×ｇで１０分間遠心分離にかけ、次いで約７．５×１０^６個の細胞／ｍｌまで６％デキストラン４０および１０％ＨＳＡ中に再懸濁した。再懸濁した細胞は、次いで重力により７０μＭフィルターを通過させた。濾過した細胞は、次いで約７．５×１０^６個の細胞／ｍｌの濃度まで、５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯ中に希釈した。希釈した細胞は低温バッグ中に置き、凍結し、気相窒素下で保存した。解凍後製剤用に、凍結細胞を３７℃の水浴中で解凍し、次いで１：１〜１：５の細胞含有バッファー：デキストラン４０の様々な体積比で１０％デキストラン４０を用いて希釈した。

胎盤細胞製剤の評価
１．解凍後のマクロの細胞塊形成なし
５ロットの胎盤細胞を前述の製剤化法を使用して生成した（以下に記載したロット１１およびロット１２を含む）。解凍後のマクロの細胞塊は５ロットのいずれにおいても観察されず、ミクロ細胞塊の数は依然として少なかった。

２．表現型に対する影響なし
胎盤細胞の表現型は改良型製剤によって影響を受けなかった。製剤中の９０％を超える細胞が依然としてＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋およびＣＤ２００^＋であった。

３．ＧＬＰマウス試験
ロット１２の細胞はマウスの生体内分布試験に使用した。前述の製剤中の胎盤細胞を、単回および／または反復尾静脈注射として、オスとメス両方のＮＯＤ−ＳＣＩＤまたはオスのＣ５７ＢＬ／１０ＳｇＳｎＡｉ−Ｒａｇ２（ｔｍｉ）γｃ（ｔｍｉ）マウスに投与した。マウスは治療後第４、１４、２８または４７日で屠殺し、肺、肝臓、心臓、腎臓、脾臓、副腎、骨髄、および脳のサンプルを処理し、ｈＴＥＲＴがヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子である、ｈＴＥＲＴのＤＮＡ配列の存在に関してＱ−ＰＣＲによって分析した。静脈内投与後、ヒトＤＮＡを、投薬投与後第４日に屠殺したマウス中の肺、脳、心臓および／または肝臓のサンプルから単離した全ＤＮＡ中で検出した。最高レベルのＤＮＡは肺中で検出した。マウスは、いかなる心臓または肺毒性もなく、静脈内注入による１ｋｇ当たり２５００万〜１億個の細胞の投与に耐えることができた。ロット１１はマウスの発癌性試験に使用した。マウスには副作用を伴わずに１ｋｇ当たり最大２億５０００万個の細胞を皮下（ＳＣ）投与した。

６．２改良された投与可能な組成物
この実施例は、凍結保存後でさえ、ヒトまたは動物に投与するのに適した、均質で、高い生存能力の細胞を示す、ヒト多分化能組織培養プラスチック接着性ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤細胞の製剤化を実証する。製剤の細胞は、静脈内（intravenous）マウスモデルにおいて、形成される凝集体の量の平均４００倍の低下、および以前の製剤より約３倍改良された改良性最大耐量（ＭＴＤ）を示す（データ示さず）。以下の実施例は、特定の表面マーカーを発現する単離胎盤細胞の製剤を記載するが、本明細書に示す結果は、これらの方法および製剤が他の細胞、例えば、異なる表面マーカーを発現する哺乳動物細胞とともに使用することができ、また、当該哺乳動物細胞と適合性があることを示す。

（「製剤Ｂ」で表す）製剤は、５．５％（ｗ／ｖ）デキストラン４０、１０％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、および５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する溶液中に１０±３×１０^６個の細胞／ｍｌの濃度で、前述の細胞表現型の胎盤細胞を含む。本明細書で使用するＨＳＡおよびデキストラン４０は臨床等級であり、ＤＭＳＯはＧＭＰ等級である。

「製剤Ａ」で表すＰｌａｓｍａｌｙｔｅベースの製剤を記載し、表７中で、製剤Ｂ、デキストラン４０ベースの製剤と比較する。製剤Ｂの調製では７０μｍメッシュを介して懸濁液中の細胞を濾過するが、製剤Ａの調製では濾過しない。

製剤Ａを解凍すると有意な細胞凝集を観察した。後の調査によって、製剤培地の組成、および細胞の凍結濃度を含めたいくつかのパラメーターは、細胞凝集の重要な要因であったことを示した。最適化試験を実施して、製剤Ｂがこれらの細胞凝集効果を低減または排除することを具体的に示した。さらに、プロセスの一部として７０μｍメッシュを介した細胞懸濁液の濾過を導入して、製剤化中に細胞懸濁液のより良い対照を得た。

製剤化中の細胞凝集を定量化するために、フィルター保持アッセイを開発ツールとして考案し、これを使用して製剤Ａと製剤Ｂの両方によって生成した一連の胎盤細胞組成物群を比較した。これは特に重要となった。製剤Ｂにおける細胞凝集は、それが裸眼によってそれ以上確実に識別できない地点まで低減したからである。製剤Ａおよび製剤Ｂの代表群から分析した多数のサンプルの比較は表８中に示す。この方法は、フィルターのデジタル画像により、異なるサンプル由来のフィルター上に保持される予め染色した細胞凝集体を定量化し、凝集体によって覆われたフィルターの面積（「平均面積」）を報告する。表８中に示すように、製剤Ｂには製剤Ａより一貫して少ない面積範囲（凝集）があり、平均的な差は４００倍であった。データは、製剤Ｂに関する優れたプロセス制御および再現性も示す。ｉｎｖｉｖｏ試験に使用した２つの製剤の単離胎盤細胞組成物ロットも表１６中に示す。製剤Ａから製剤Ｂへの変更によって、静脈内ｉｎｖｉｖｏマウスモデルにおいて最大耐量（ＭＴＤ）が約３倍改善された（データ示さず）。

キー：「バッグ」は、そのロットに関する、解凍し試験した単離細胞組成物のバッグの数を示す。「フィルター」は、そのロットに関する、アッセイ反復の合計数を示す。「平均面積」は、フィルターに施用したピクセル／細胞１００万個単位の、そのロットに関するフィルターの平均面積範囲を示す。「ＳｔｄＤｅｖ」＝標準偏差、「ＣＶ」＝変動係数。

６．３改良された投与可能な組成物の特徴付け
この実施例は、ＨＳＡ、デキストラン４０、およびＤＭＳＯを含む医薬製剤のさらなる特徴付けを与える。以下に記載する１つまたは複数の実験中で使用する方法は以下の通りである。

細胞生存能力の評価：血球計またはＶｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のいずれかを使用して、トリパンブルー色素排除試験アッセイによって生存能力を評価した。生存能力は、全細胞中の生存細胞の割合（％）として表した。

細胞計数：血球計またはＶｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のいずれかを使用して細胞を計数した。細胞計数は１ミリリットル当たりの数百万個の細胞（ＭＭ／ｍＬ）として表す。

細胞凝集：細胞凝集の量を、細胞を染色しそれらを７０μｍフィルターに通すことによって細胞凝集の量を測定する、濾過保持アッセイ（ＦＲＡ）を使用して測定した。７０μｍより大きい細胞凝集体はフィルターを通過することができず、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して画像分析によって定量化する。データは充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）として表す。

フローサイトメトリー：フローサイトメトリーによって細胞マーカーＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１０５およびＣＤ２００のレベルに関して細胞を評価した。値は特定マーカー、またはマーカーの組合せに陽性および／または陰性である細胞の割合（％）として表す。

免疫抑制：以下に記載する製剤中の細胞の免疫抑制活性は、抗原性ビーズに対するＴ細胞応答を抑制する細胞の能力を測定する、ビーズＴ細胞反応（ＢＴＲ）アッセイを使用して評価した。

以下の実施例は、特定の表面マーカーを発現する単離胎盤細胞の製剤を記載するが、本明細書に示す結果は、これらの方法および製剤が、他の細胞、例えば、異なる表面マーカーを発現する哺乳動物細胞とともに使用することができ、また当該哺乳動物細胞と適合性があることを示す。

６．３．１ＤＭＳＯおよびデキストラン：ＨＳＡ比の特徴付け
この実施例は、細胞凝集、細胞生存能力および回収率、ならびに細胞表現型および機能に対する、ＨＳＡ、デキストラン、およびＤＭＳＯの濃度の変化による影響、ならびにデキストランとＨＳＡの比の変化による影響を記載する。

実験条件
細胞製剤に関する３成分（ＨＳＡ、デキストラン４０およびＤＭＳＯ）の解空間を、図１中の三角図に示す条件で調べた。実験条件は、２軸、一方はデキストラン：ＨＳＡ比を一定に保ちながら異なる割合（％）のＤＭＳＯを試験し（以下の製剤１〜４を参照）、他方はＤＭＳＯの割合（％）を一定に保ちながらデキストラン：ＨＳＡの比を変えて選択した（以下の製剤３、５〜８を参照）。

方法および材料
約１２００万個の凍結保存ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤多分化能細胞を、Ｎｕｎｃ（商標）１０−ｔｒａｙＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｉｅｓにおいて、以下の製剤のいずれか１つで、約１．２×１０^８個の細胞に増殖した。細胞は０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて室温で１０分間のインキュベーションによって採取した。解離した細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に２５０ｍＬの２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する５００ｍＬ遠心分離チューブに移した。次いで細胞を、ＳｏｒｖａｌｌＲＣ３ＢＰ遠心分離において、５００ｍＬチューブ中で１０４０ＲＰＭにおいて遠心分離にかけた。細胞は０．９％生理食塩水／５％デキストラン４０溶液に再懸濁した。次いで細胞を１０分間１４２０ＲＰＭにおいて遠心分離にかけ、以下の８製剤（デキストラン：ＨＳＡ比は製剤５〜８に関して「２５％ＨＳＡの体積分率」（ＶＦＨＳＡ）の単位で示す）の１つの１０ｍＬに懸濁した。
製剤１：２０％ＤＭＳＯ、８．５％ＨＳＡ、４．６％デキストラン４０
製剤２：１０％ＤＭＳＯ、９．５％ＨＳＡ、５．２％デキストラン４０
製剤３：５％ＤＭＳＯ、１０％ＨＳＡ、５．５％デキストラン４０（ＶＦＨＳＡ＝０．４）（対照製剤）
製剤４：０％ＤＭＳＯ、１０．５％ＨＳＡ、５．８％デキストラン４０
製剤５：５％ＤＭＳＯ、０％ＨＳＡ、９．５％デキストラン４０（ＶＦＨＳＡ＝０）
製剤６：５％ＤＭＳＯ、３．１２５％ＨＳＡ、８．２５％デキストラン４０（ＶＦＨＳＡ＝０．１２５）
製剤７：５％ＤＭＳＯ、１６．８８％ＨＳＡ、２．７５％デキストラン４０（ＶＦＨＳＡ＝０．６７５）
製剤８：５％ＤＭＳＯ、２３．７５％ＨＳＡ、０％デキストラン４０（ＶＦＨＳＡ＝０．９５）

以下のストック溶液：１００％ＤＭＳＯ（ＢｉｏｎｉｃｈｅＰｈａｒｍａ、Ｂｅｌｌｅｖｉｌｌｅ、Ｏｎｔａｒｉｏ）、２５％ＨＳＡ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）および０．９％生理食塩水中（Ｈｏｓｐｉｒａ、ＬａｋｅＦｏｒｅｓｔ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）の１０％デキストラン４０から製剤を調製した。

濾過保持アッセイ：濾過保持アッセイの使用によって細胞凝集を評価した。細胞濃度は濾過前に約１．２×１０^７個の細胞／ｍＬに調節した。濾過量（単位濾過面積当たりの細胞数）は約２．４×１０^８個の細胞／濾過で一定に保った。細胞は７．５×１０^６個の細胞／ｍＬの濃度で、Ｔｈｅｒｍｏ速度制御フリーザー中に−７０℃で凍結保存した。細胞は使用前に解凍し、サンプルは解凍直後に処理した。非希釈細胞懸濁液の１００μＬサンプルを解凍後に得て、９００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して二連（duplicate）で細胞計数を実施し、細胞１００万個当たりのピクセル数として報告した（多数のピクセルは多数の細胞凝集を示す）。

細胞生存能力アッセイ（ＭＴＳアッセイ）：細胞生存能力は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）非放射性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。製造者の指示に従い、９６ウエルプレート中の細胞は、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）（ＭＴＳ）およびフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、電子カップリング試薬と組合せた。ＭＴＳの細胞内生物学的還元によって生じた生成ホルマザン産物の、４９０ｎｍにおける吸光度を次いで決定した。

アネキシンウエルプレートアッセイ：解凍した細胞は、アネキシン−Ｖ標識溶液（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１８２８６８１００１）中に１×１０^５個の細胞／ｍＬの濃度に希釈した。１００μＬの細胞懸濁液を９６ウエルプレートに三連（triplicate）で加え、露光せずに室温で１５分間インキュベートした。１５分間後、それぞれのウエル内の３箇所の異なる位置を、明視野および蛍光下でイメージングした（４８８ｎｍの励起波長および波長５２８ｎｍで検出）。自動細胞計数ソフトウェア（Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ）を使用して、像当たりの全細胞を計数した。アポトーシス／壊死細胞集団は、それぞれの位置でアネキシン陽性細胞を計数すること（蛍光像）、およびそれぞれの位置における全細胞で割ること（明視野像）によって決定した。条件当たりのアポトーシス／壊死細胞集団は、３ウエルの３箇所の異なるウエル位置において計算した集団を平均することによって決定した。

結果
細胞凝集
ＤＭＳＯの割合（％）を、例えば０〜２０パーセントで変えた場合（製剤１〜４）、図２中に示すように、細胞凝集に対する影響は全く観察されなかった。全ＤＭＳＯ条件が、５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０および１０％ＨＳＡを含む対照製剤に関して観察した範囲内の凝集レベルを示した。ＨＳＡおよびデキストラン濃度も一定５％ＤＭＳＯ濃度で変え（図３）、条件はＨＳＡなし（ＨＳＡ体積分率＝０）〜デキストランなし（ＨＳＡ体積分率＝０．９５）の範囲であった。０．１２５〜０．９５の２５％ＨＳＡ（それぞれ、最終濃度３．１２５％〜２３．７５％のＨＳＡ）の体積分率にわたるＦＲＡ値は、最小の凝集を示した。ＨＳＡの存在下で観察した凝集のレベルは、５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０および１０％ＨＳＡを含む対照製剤以下であった。

解凍後の生存率および回収率
異なる割合（％）のＤＭＳＯ（０、５、１０および２０％）にわたる解凍後の生存率（図４）および解凍後の回収率（図５）を、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ自動細胞計数器を使用しトリパンブルー色素排除試験によって測定して、それぞれの製剤の凍結保護能力を評価した。解凍後の生存率はそれぞれ０％、５％および１０％のＤＭＳＯを含む製剤で９０％を超え、最大値は５％のＤＭＳＯで観察し、一方生存率は２０％のＤＭＳＯを含む製剤で７５％未満であった。培養再建（culture reestablishment）はＭＴＳアッセイによって測定した。培養再建は５％のＤＭＳＯで最大であったことを観察した（図６）。

２５％ＨＳＡの異なる体積分率、すなわち異なる比のデキストラン：ＨＳＡにわたる生存率プロファイルは図７〜９に示す。トリパンブルー色素排除試験により決定した解凍後の生存率は、様々な体積分率のＨＳＡにわたり８３．５％〜９８．５％の範囲の値を示した（図７）。最大値は０．４０分率の２５％ＨＳＡ、すなわち１０％のＨＳＡ：５．５％のデキストラン４０で得た。解凍後の細胞回収率も計算し、値は８０％〜１２０％の範囲であったが、少なくとも０．２体積分率の２５％ＨＳＡを含むサンプルは１００％〜１２０％の範囲の値を示した（図８）。ＭＴＳアッセイにより決定した培養再建のデータは、解凍後の生存率のそれと同様のプロファイルを示し、最大値は０．１２５分率の２５％ＨＳＡ、すなわち３．１３％のＨＳＡ：８．２５％のデキストラン４０で生じた（図９）。

トリパンブルー色素排除試験の生存率には、アポトーシス細胞を検出する能力はない。しかしながら、細胞の大きさ分布の分析は細胞健康状態の変化を示すことができる。ＤＭＳＯの不在下で凍結した細胞から解凍した細胞集団中のアポトーシス細胞の割合（％）を推定するために、解凍後のウエルプレートアネキシンアッセイを実施した。このアッセイによって、５％ＤＭＳＯ中で凍結したときの１５％のアポトーシス細胞と異なり、０％ＤＭＳＯ中で凍結した細胞の５１％がアポトーシス細胞であったと推定した（データ示さず）。

表現型および機能
細胞のＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋表現型を維持する能力を、フローサイトメトリーによって異なる割合（％）の成分について試験した。製剤２（１０％ＤＭＳＯ、９．５％ＨＳＡ、５．２％デキストラン４０）、製剤５（５％ＤＭＳＯ、０％ＨＳＡ、９．５％デキストラン４０）、製剤６（５％ＤＭＳＯ、３．１３％ＨＳＡ、８．２５％デキストラン４０）および製剤７（５％ＤＭＳＯ、１６．８８％ＨＳＡ、２．７５％デキストラン４０）、および対照製剤３中に製剤化した細胞は、この表現型をほぼ維持しており、８０．３％と８４．５％の間のＣＤ１０５^＋／ＣＤ２００^＋値を有していた。さらに、ＣＤ１０^＋／ＣＤ３４⁻の発現はそれぞれの製剤に関して９５％を超えていた。おそらく残骸がフローサイトメトリーアッセイに影響を与えたため、条件１、４および８は細胞の物理的特性の変化を示した。

細胞の機能は、抗原性ビーズに対するＴ細胞応答を抑制する細胞の能力を測定する、ビーズＴ細胞反応（ＢＴＲ）アッセイによって評価した（図１０）。製剤６（５％ＤＭＳＯ、３．１３％ＨＳＡ、８．２５％デキストラン４０）、および製剤７（５％ＤＭＳＯ、１６．８８％ＨＳＡ、２．７５％デキストラン４０）は、５％ＤＭＳＯ／１０％ＨＳＡおよび５．５％デキストラン４０を含む対照製剤３の１標準偏差以内で抑制があった。これらの３サンプルは、最高のトリパンブルー生存率および培養再建値を有していた。他のサンプルには、低レベルの抑制、減少したＭＴＳと一般に関係がある低減があった。

結論：
０〜２０％の範囲の濃度のＤＭＳＯを含む製剤は、５％ＤＭＳＯ、１０％ＨＳＡ、および５．５％デキストラン４０を含む対照製剤に関して観察したレベルと同程度の細胞凝集のレベルを示す。しかしながら、２０％のＤＭＳＯを含む製剤に細胞を凍結保存すると細胞生存率は低下し、０％のＤＭＳＯ中に凍結した細胞は、５％のＤＭＳＯ中に凍結した細胞と比較して、有意に増大したアポトーシスを解凍後に示した。５％および１０％のＤＭＳＯを含む製剤に関して、ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋表現型の感知され得る劣化はなかった。したがって、前述の結果は、５％〜１０％のＤＭＳＯを含む製剤の使用が、解凍後の生存率を維持するのに好ましいことを実証する。

ＨＳＡ：デキストランの比の変更に関して、２３．７５％のＨＳＡ、０％のデキストランを含む製剤は、解凍後の生存率および培養再建のある程度の低減を示し、一方解凍後の生存率、免疫抑制活性および再建値は、（ｉ）３．１３％のＨＳＡと８．２５％のデキストラン、（ｉｉ）１０％のＨＳＡと５．５％のデキストラン、および（ｉｉｉ）１６．８８％のＨＳＡと２．７５％のデキストランにおけるデキストラン：ＨＳＡ比を含む製剤に関して最高であった。したがって、これらの結果は、本明細書に記載する製剤のＨＳＡ：デキストラン比は、１０％ＨＳＡと５．５％デキストラン４０におけるＨＳＡ：デキストラン比を含む製剤と比較して、細胞生存率の感知され得る損失、解凍後の細胞回収、ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋表現型の劣化、または免疫抑制活性なしで、定義した範囲内で変えることができることを実証する。本明細書に示すデータは、少なくとも約６：１のＨＳＡ：デキストラン〜約１：２．６のＨＳＡ：デキストランのＨＳＡ：デキストラン比の作用範囲を支持する。

６．３．２凍結細胞密度の影響
この実施例は、細胞生存能力、ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋表現型、細胞凝集、および細胞の免疫抑制機能に対する、細胞濃度、例えば、１〜４０×１０^６個の細胞／ｍＬの範囲の凍結細胞密度の影響を記載する。

方法および材料
ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤幹細胞を３日間培養し、採取し、遠心分離にかけ、５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡを含む製剤に約３．５×１０^７個の細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁し、７０μｍフィルターで濾過した。濾過後細胞を前述の製剤に連続希釈して、滅菌済みバッグ中に、以下の細胞密度、１×１０^６個の細胞／ｍＬ、７．５×１０^６個の細胞／ｍＬ、１５×１０^６個の細胞／ｍＬ、および２０×１０^６個の細胞／ｍＬを含む細胞サンプルを作製した。細胞を別個に採取して、４．０×１０^７個の細胞／ｍＬを含む別個の細胞サンプルを作製した。４．０×１０^７個の細胞／ｍＬサンプルの細胞を、５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡを含む５ｍＬ製剤に約４．６×１０^７個の細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁し、７０μｍフィルターで濾過し、前述の製剤を使用して２０ｍＬバッグ中に４．０×１０^７個の細胞／ｍＬまで希釈した。４．０×１０^７個の細胞／ｍＬサンプルの１つの２０ｍＬバッグ、１×１０^６個の細胞／ｍＬ、７．５×１０^６個の細胞／ｍＬ、１５×１０^６個の細胞／ｍＬ、および２０×１０^６個の細胞／ｍＬサンプルの二連の２０ｍＬバッグ、およびそれぞれのサンプルの５本の２８０μＬバイアルを、速度制御フリーザーを使用して−７０℃に凍結した。これらのサンプルを後に解凍し、分析して（１）細胞計数、（２）生存率、（３）表現型、（４）細胞凝集、および（５）効能を含めた様々な細胞特性に対する凍結濃度の影響を決定した。

濾過保持アッセイ：濾過保持アッセイの使用によって細胞凝集を評価した。細胞濃度は濾過前に約１．２×１０^７個の細胞／ｍＬに調節した。濾過量（単位濾過面積当たりの細胞数）は約２．４×１０^８個の細胞／濾過で一定に保った。細胞は７．５×１０^６個の細胞／ｍＬの濃度で、Ｔｈｅｒｍｏ速度制御フリーザー中に−７０℃で凍結保存した。細胞は使用前に解凍し、サンプルは解凍直後に処理した。非希釈細胞懸濁液の１００μＬサンプルを解凍後に得て、９００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して二連で細胞計数を実施し、細胞１００万個当たりのピクセル数として報告した（多数のピクセルは多数の細胞凝集を示す）。

結果：
細胞計数／生存率
それぞれの解凍バッグから１〜２個の１ｍＬサンプルを、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、製造者の指示に従い生存細胞計数および生存率決定のために採取した。平均生存率は、約９７％で、全ての条件に関して一定状態であった。生存細胞計数は、初期凍結濃度に対応した（以下の表９参照）。

表現型
細胞のＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋表現型を維持する能力を、フローサイトメトリーによって異なる細胞密度にわたり試験した。表１０中に示すように、表現型は異なる凍結濃度間で変わらない。全ての条件に関して、ＣＤ２００^＋／ＣＤ１０５^＋の発現は約８６％で維持され、ＣＤ３４⁻／ＣＤ１０^＋の発現は約９９％で維持された。

細胞凝集
それぞれの条件の再現を濾過保持アッセイによって分析して、異なる凍結濃度における細胞凝集の程度を決定した（図１１）。二連のアッセイを１×１０^６個の細胞／ｍＬ、７．５×１０^６個の細胞／ｍＬ、１５×１０^６個の細胞／ｍＬ、および２０×１０^６個の細胞／ｍＬサンプルについて実施した。１つの細胞サンプルは４０×１０^６個の細胞／ｍＬサンプルで二連でアッセイした。４０×１０^６個の細胞／ｍＬサンプルは、試験した全細胞密度に関して最高の細胞凝集シグナルをもたらした。全ての他のサンプルは、５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ中に７．５×１０^６個の細胞／ｍＬで事前に凍結保存した対照サンプルを用いて観察した凝集の量以下であった。

他の、別個の細胞凝集アッセイを実施して、７．５×１０^６個の細胞／ｍＬおよび２０×１０^６個の細胞／ｍＬで、５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡを含む製剤中に凍結保存した細胞を試験した（図１２）。他のデータは２０×１０^６個の細胞／ｍＬで増大したシグナルを示し、２０×１０^６個の細胞／ｍＬで凍結した細胞は様々な細胞凝集の結果をもたらすことを示した。結果として、この濃度以上で凍結した細胞は凝集に関して高い能力を有する。これらのデータは、凝集は細胞濃度の増大と共に増大し、２０×１０^６個の細胞／ｍＬの凍結細胞密度は、７．５×１０^６個の細胞／ｍＬの凍結細胞密度と比較して細胞凝集の増大を示し得ることを実証する。

機能
それぞれの条件からのバイアルを混合白血球反応（ＭＬＲ）およびビーズＴ細胞反応（ＢＴＲ）分析に使用して、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖の抑制により測定して、様々な凍結細胞密度での細胞の免疫調節性を評価した。ＭＬＲの結果は、１５×１０^６個の細胞／ｍＬおよび４０×１０^６個の細胞／ｍＬでＣＤ４およびＣＤ８の抑制の低下を示したが、２０×１０^６個の細胞／ｍＬでの抑制は、１×１０^６個の細胞／ｍＬおよび７．５×１０^６個の細胞／ｍＬで観察した抑制と同程度であった。しかしながらＢＴＲの結果は、２０×１０^６個の細胞／ｍＬおよび４０×１０^６個の細胞／ｍＬでＣＤ４およびＣＤ８抑制の低下を示す。

結論：
前述の結果は、細胞の生存率およびＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋表現型は、凍結細胞密度の作用として変わらないことを実証する。しかしながら、２０×１０^６個の細胞／ｍＬの密度で凍結保存した細胞は、細胞凝集の可変的増大および免疫抑制活性の可変的低下を実証し、一方４０×１０^６個の細胞／ｍＬの密度で凍結保存した細胞は、細胞凝集の不変的増大および免疫抑制活性の不変的低下を示した。このように、細胞生存率またはＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋表現型を示す細胞数の感知され得る低下なしに、最大、例えば４０×１０^６個の細胞／ｍＬの密度で本明細書に記載する製剤中に細胞を製剤化することはできるが、１．０〜１５×１０^６個の細胞／ｍＬの範囲の凍結細胞密度が、解凍時の細胞凝集を最小にするのに好ましい。

６．３．３デキストランの分子量の影響
この実施例は、細胞凝集、生存率、回収率、ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋表現型および機能に対する、様々な分子量のデキストラン、例えば、デキストラン１（ＭＷ＝１０００）、デキストラン４０（ＭＷ＝４０，０００）およびデキストラン７０（ＭＷ＝７０，０００）の影響を記載する。

方法および材料
１２００万個の凍結保存ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤多分化能細胞を、Ｎｕｎｃ（商標）１０−ｔｒａｙＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｉｅｓにおいて、以下の製剤のいずれか１つで約１．２×１０^８個の細胞に増殖した。細胞は０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて室温で１０分間のインキュベーションによって採取した。解離した細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に２５０ｍＬの２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する５００ｍＬ遠心分離チューブに移した。次いで細胞を、ＳｏｒｖａｌｌＲＣ３ＢＰ遠心分離において５００ｍＬチューブ中で１０４０ＲＰＭにおいて遠心分離にかけた。細胞は０．９％生理食塩水／５％デキストラン４０溶液に再懸濁した。次いで細胞を１０分間１４２０ＲＰＭにおいて遠心分離にかけ、以下の１０ｍＬの製剤に懸濁した。
製剤１：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０（Ｈｏｓｐｉｒａ、ＬａｋｅＦｏｒｅｓｔ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、１０％ＨＳＡ（対照）
製剤２：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン１（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）、１０％ＨＳＡ
製剤３：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）、１０％ＨＳＡ
製剤４：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン７０（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）、１０％ＨＳＡ

濾過保持アッセイ：濾過保持アッセイの使用によって細胞凝集を評価した。細胞濃度は濾過前に約１．２×１０^７個の細胞／ｍＬに調節した。濾過量（単位濾過面積当たりの細胞数）は約２．４×１０^８個の細胞／濾過で一定に保った。細胞は７．５×１０^６個の細胞／ｍＬの濃度で、Ｔｈｅｒｍｏ速度制御フリーザー中に−７０℃で凍結保存した。細胞は使用前に解凍し、サンプルは解凍直後に処理した。非希釈細胞懸濁液の１００μＬサンプルを解凍後に得て、９００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して二連で細胞計数を実施した。

結果：
細胞凝集
それぞれの製剤内の細胞凝集を、濾過保持アッセイを使用して評価した。製剤２（デキストラン１）、製剤３（デキストラン４０）、および製剤４（デキストラン７０）は、５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、および１０％ＨＳＡを含む対照製剤以下の細胞凝集率を実証した（図１３）。

生存率および回収率
デキストラン１、デキストラン４０、またはデキストラン７０を含むサンプルに関する解凍後の生存率は９６．０％〜９７．７％の生存率の範囲であった（図１４）。同様に、解凍後の回収率は対照製剤のそれと同程度であり、細胞の生存率は対照製剤の９２％〜１０９％の範囲であった（図１５）。

表現型および機能
細胞のＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋表現型を維持する能力を、フローサイトメトリーによって異なるデキストラン分子量にわたり試験し、細胞の免疫抑制能力はＢＴＲアッセイにおいて試験した。試験した全ての製剤にわたるＣＤ２００^＋／ＣＤ１０５^＋の発現は８９．１％〜９１．６％の範囲であり、ＣＤ３４⁻／ＣＤ１０^＋の発現は全ての条件に関して９５％を超えた（図１６）。さらに、異なるデキストラン分子量にわたるＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の抑制は、デキストラン４０を含む標準対照製剤の４回の異なる反復実験から誘導した期待値の１標準偏差の範囲内であった（図１７）。

結論：
これらの結果は、細胞凝集、生存率、回収率、表現型または免疫抑制能力に影響を与えずに、本明細書に記載する製剤において、デキストラン１またはデキストラン７０をデキストラン４０と置換することができることを実証する。

６．３．４異なる多糖の影響
この実施例は、細胞の生存率および増殖に対する、細胞製剤中のデキストラン４０以外の多糖の影響を記載する。

方法および材料
１２００万個の凍結保存ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤多分化能細胞を、Ｎｕｎｃ（商標）１０−ｔｒａｙＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｉｅｓにおいて、以下の製剤のいずれか１つで約１．２×１０^８個の細胞に増殖した。細胞は０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて室温で１０分間のインキュベーションによって採取した。解離した細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に２５０ｍＬの２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する５００ｍＬ遠心分離チューブに移した。次いで細胞を、ＳｏｒｖａｌｌＲＣ３ＢＰ遠心分離において５００ｍＬチューブ中で１０４０ＲＰＭにおいて遠心分離にかけた。細胞は０．９％生理食塩水／５％デキストラン４０溶液に再懸濁した。次いで細胞を１０分間１４２０ＲＰＭにおいて遠心分離にかけ、以下の１０ｍＬの製剤に懸濁した。
製剤１：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ（対照）
製剤２：５％ＤＭＳＯ、５．５％マルトデキストリン、１０％ＨＳＡ
製剤３：５％ＤＭＳＯ、５．５％スクロース、１０％ＨＳＡ
製剤４：５％ＤＭＳＯ、５．５％トレハロース、１０％ＨＳＡ
製剤５：５％ＤＭＳＯ、５５ＵＳＰ／ｍＬヘパリン、１０％ＨＳＡ
製剤６：５％ＤＭＳＯ、３．３％ヘタスターチ、１０％ＨＳＡ
製剤７：５％ＤＭＳＯ、５．５％グリコーゲン、１０％ＨＳＡ

濾過保持アッセイ：濾過保持アッセイの使用によって細胞凝集を評価した。細胞濃度は濾過前に約１．２×１０^７個の細胞／ｍＬに調節した。濾過量（単位濾過面積当たりの細胞数）は約２．４×１０^８個の細胞／濾過で一定に保った。細胞はＴｈｅｒｍｏ速度制御フリーザー中に−７０℃で凍結保存した。細胞は使用前に解凍し、サンプルは解凍直後に処理した。非希釈細胞懸濁液の１００μＬサンプルを解凍後に得て、９００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して二連で細胞計数を実施した。

結果：
細胞凝集
それぞれの製剤内の細胞凝集を、濾過保持アッセイを使用して評価した。製剤２〜７は、５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、および１０％ＨＳＡを含む対照製剤以下の細胞凝集をもたらすと決定した（図１８）。トレハロースを含む製剤４、ヘパリンを含む製剤５、グリコーゲンを含む製剤７は、実質的に対照製剤未満の細胞凝集率を実証した。

解凍後の生存率および回収率
解凍後の生存率、生存細胞の回収率および細胞の大きさのデータを製剤１〜７のそれぞれにわたり評価して、製剤の凍結保護能力を評価した。解凍後の生存率は、トリパンブルー色素排除試験用Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって評価した。解凍後の生存率は９５．２％〜９８．６％の範囲であり、スクロースおよびグリコーゲンが範囲の下端であった（図１９）。対照デキストラン製剤は細胞の９８％の生存率をもたらした。解凍後の生存細胞の回収率を計算して、凍結／解凍プロセスにわたる細胞消失を理解し、値は異なる多糖にわたり８４％〜１１５％の範囲であった（図２０）。

表現型および機能
細胞のＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋表現型を維持する能力を、フローサイトメトリーによって異なる多糖にわたり試験した。製剤２〜４および６に製剤化した細胞は対照製剤１とほぼ同様にこの表現型を維持し、８９．４％〜９２．９％のＣＤ１０５^＋／ＣＤ２００^＋であった。ＣＤ１０^＋／ＣＤ３４⁻の発現はそれぞれの製剤に関して９５％を超えた。ヘパリン中に凍結した細胞の中で、８５．４％がＣＤ１０５^＋／ＣＤ２００^＋の表現型を維持した（図２１）。

細胞の機能は、抗原性ビーズに対するＴ細胞応答を抑制する細胞の能力を測定する、ビーズＴ細胞反応（ＢＴＲ）アッセイによって評価した。スクロースに製剤化した細胞は、デキストラン４０を含む標準対照製剤の４回の異なる反復実験から誘導した期待値の１標準偏差範囲内のそれと比較して、低下したＴ細胞抑制を示した（図２２）。他の多糖では、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞抑制は期待値の１標準偏差の範囲内にある。

結論：
細胞凝集、解凍後の生存率、解凍後の細胞回収率および表現型の維持に関して、マルトデキストリン、トレハロースおよびヘタスターチを含む製剤の使用は、デキストラン４０製剤の使用とほぼ同じ特性を有する胎盤細胞集団をもたらした。このように、スクロース、ヘパリンまたはグリコーゲンを含む製剤を使用して、ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤幹細胞を製剤化することはできるが、デキストラン４０、マルトデキストリン、トレハロースまたはヘタスターチを含む製剤の使用が好ましい。

６．３．５ＨＳＡのタンパク質代替の影響
この実施例は、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡおよび５％ＤＭＳＯ製剤において、ヒト血清アルブミン濃度を低減することができること、およびＨＳＡはウシ血清アルブミンまたはウシ胎児血清に置き換えることができることを実証する。

製剤１（Ｆ１）は５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡおよび５％ＤＭＳＯを含む。Ｆ１内のＨＳＡの役割を理解するため、および細胞組成物に対するその影響を理解するために、ヒト血清アルブミンに類似した類似タンパク質、すなわちウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む代替製剤を試験した。

方法および材料
１２００万個の凍結保存ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤多分化能細胞を、Ｎｕｎｃ（商標）１０−ｔｒａｙＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｉｅｓにおいて、以下の製剤のいずれか１つで約１．２×１０^８個の細胞に増殖した。細胞は０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて室温で１０分間のインキュベーションによって採取した。解離した細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に２５０ｍＬの２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する５００ｍＬ遠心分離チューブに移した。次いで細胞を、ＳｏｒｖａｌｌＲＣ３ＢＰ遠心分離において５００ｍＬチューブ中で１０４０ＲＰＭにおいて遠心分離にかけた。細胞は０．９％生理食塩水／５％デキストラン４０溶液に再懸濁した。次いで細胞を１０分間１４２０ＲＰＭにおいて遠心分離にかけ、以下の１０ｍＬの製剤に懸濁した。
製剤１：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ（対照）
製剤２：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、４％ＨＳＡ
製剤３：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＢＳＡ
製剤４：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＦＢＳ

濾過保持アッセイ：濾過保持アッセイの使用によって細胞凝集を評価した。細胞濃度は濾過前に約１．２×１０^７個の細胞／ｍＬに調節した。濾過量（単位濾過面積当たりの細胞数）は約２．４×１０^８個の細胞／濾過で一定に保った。細胞は、Ｔｈｅｒｍｏ速度制御フリーザー中に−７０℃で凍結保存した。細胞は使用前に解凍し、サンプルは解凍直後に処理した。非希釈細胞懸濁液の１００μＬサンプルを解凍後に得て、９００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して二連で細胞計数を実施した。

結果：
細胞凝集
濾過保持アッセイ（ＦＲＡ）によって測定した細胞凝集は、全条件に関して一平方ミリメートル当たり１００ピクセル以下であった（図２３）。しかしながら、１０％ＨＳＡおよび１０％ＢＳＡは、４％ＨＳＡおよび１０％ＦＢＳより明らかに少ない凝集をもたらしたようである。

それぞれの溶液の凍結保護能力を理解するために、解凍後の生存率、回収率および細胞の大きさを、トリパンブルー色素排除試験用Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の使用によって評価した。それぞれの条件にわたる解凍後の生存率はアッセイ変動性の範囲内であり、９５％〜９８％の生存率の範囲であった（図２４）。同様に、解凍後の細胞回収率は１０％ＨＳＡ対照のそれと同程度であり、値は１００〜１２７％の範囲であった（図２５）。

表現型および機能
細胞のＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋表現型を維持する能力を、フローサイトメトリーによって異なる製剤にわたり試験した。（図２６および２７）。製剤２〜４に製剤化した細胞は対照１０％ＨＳＡ製剤とほぼ同様にこの表現型を維持し、値は試験した細胞の８８．２％〜９３．５％であった。ＣＤ１０^＋／ＣＤ３４⁻の発現はそれぞれの製剤に関して９５％を超えた。

細胞の機能はビーズＴ細胞反応アッセイによって評価した。他の条件と比較して、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の抑制は細胞をＦＢＳに製剤化すると高まり、値は１０％ＨＳＡを含む標準対照製剤の４回の異なる反復実験から誘導した期待値の１．５標準偏差の範囲内であった（図２８）。全ての他の条件では、抑制は期待値の１標準偏差内であった。

結論：
前述の結果は、細胞生存能力の感知され得る消失、解凍後の細胞回収率、ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋表現型の劣化、または免疫抑制活性なしで、４％ＨＳＡ、１０％ＢＳＡ、または１０％ＦＢＳを１０％ＨＳＡに置き換えることができることを実証する。したがって、少なくとも約４％〜約１０％のＨＳＡ、ＢＳＡおよび／またはＦＢＳの範囲は、本明細書に記載する製剤に特に適している。

６．３．６異なる細胞型との適合性
この実施例は、骨髄由来間葉系幹細胞およびナチュラルキラー細胞を、胎盤多分化能細胞と同じ形式で製剤化することができることを実証する。したがって、この実施例は、胎盤多分化能細胞以外の他の細胞を、本明細書で示す形式で製剤化することができることを示す。

方法および材料
骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を増殖させ、以下の製剤を使用して採取した。
Ｆ１：３日間細胞を培養し、次に回収し、細胞を５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡに再懸濁し、細胞を７０μｍフィルターで濾過し、約７．５×１０^６個の細胞／ｍＬに細胞を凍結保存したもの。
Ｆ２：４日間細胞を培養し、次に回収し、細胞を５％ＤＭＳＯおよび１０％ＨＳＡを含むＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡに再懸濁したもの。

細胞は速度制御フリーザーを使用して−７０℃で凍結した。ＢＭＭＳＣは２０ｍＬバッグにおけるＦ２製剤中および１０ｍＬバッグにおけるＦ１製剤中に凍結保存し、ＣＤ３⁻、ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞は１０ｍＬバッグＦ２製剤中および１．５ｍＬバイアルＦ１製剤中に凍結保存した。これらのサンプルを後に解凍し、分析して細胞特性に対する凍結製剤の影響を決定した。

結果
生存率
解凍後サンプルを使用して、異なる条件下で凍結した細胞の生存率を決定した。ＢＭＭＳＣおよびＮＫ細胞の生存率は、凍結条件によって有意に影響を受けなかった。

表現型
ＮＫマーカーをアッセイして、ＮＫ表現型（ＣＤ３⁻、ＣＤ５６^＋）に対するＦ１およびＦ２製剤の影響を決定した。使用した２つの製剤は、ＮＫ表現型を示すＮＫ細胞の割合（％）に有意に影響を与えなかった。ＢＭＭＳＣはＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１６６、ＣＤ２００、Ｐａｎ−サイトケラチン、およびＫＤＲの発現に関しても分析した。これらのマーカーの発現、または発現の欠如が、Ｆ１またはＦ２製剤に製剤化したＢＭＭＳＣにおいて有意に変わることはなかった。

細胞凝集
濾過保持アッセイにおいて、２回のそれぞれのＢＭＭＳＣ製剤化、および１回アッセイのＮＫ製剤化を実施した。ＢＭＭＳＣ細胞とＮＫ細胞の両方に関してＦ１製剤化はＦ２製剤化より有意に少ない凝集をもたらしたが、しかしながら製剤Ｆ２の影響は、ＮＫ細胞に関してよりＢＭＭＳＣに関して顕著であった（図２９）。

結論：
前述の結果は、骨髄由来間葉系幹細胞およびナチュラルキラー細胞は、同じ製剤中にＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋胎盤多分化能細胞のそれと同様に細胞凝集、生存率および表現型を保持して５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ中に首尾よく製剤化することができることを実証する。さらに、胎盤多分化能細胞に関して、ＢＭＭＳＣおよびＮＫ細胞のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ含有製剤は有意に高い細胞凝集率を示し、このように、デキストラン含有製剤が好ましい。

均等物：
本明細書で開示する組成物および方法は、本明細書で記載する具体的な実施形態によって範囲が制限されない。実際、記載したもの以外に組成物および方法の様々な変更形態が、前述の記載および添付の図面から当業者に明らかとなる。このような変更形態は、添付の特許請求の範囲の範疇にあるものとする。

様々な刊行物、特許および特許出願を本明細書で引用し、それらの開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。

Claims

胎盤幹細胞を含む組成物を作製する方法であって、
（ａ）前記細胞を、デキストランおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む溶液と接触させて細胞含有溶液を形成するステップ、
（ｂ）細胞含有溶液をフィルターで濾過して該細胞含有溶液からマクロの細胞塊を除去するステップ、
（ｃ）前記細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個を超える細胞を含む場合、前記細胞を、デキストランを含む第１の希釈溶液で１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個以下の細胞に希釈するステップ、および
（ｄ）前記細胞をステップ（ｃ）の後に凍結保存し、それによって細胞を含む組成物を作製するステップ
を含む方法。
ステップ（ｄ）の前又は後に、細胞を含む組成物を、デキストランを含むがＨＳＡを含まない第２の希釈溶液で希釈するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記第１の希釈溶液または第２の希釈溶液中の前記デキストランがデキストラン４０である、請求項１又は２に記載の方法。
前記第１の希釈溶液および第２の希釈溶液中の前記デキストランがデキストラン４０である、請求項１又は２に記載の方法。
前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４０が５．５％デキストラン４０である、請求項３に記載の方法。
ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡが１０％ＨＳＡである、請求項１に記載の方法。
前記第１の希釈溶液がＨＳＡを含む、請求項１に記載の方法。
前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡが１０％ＨＳＡである、請求項７に記載の方法。
前記第１の希釈溶液が凍結保護剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記凍結保護剤がＤＭＳＯである、請求項９に記載の方法。
前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン４０が１０％デキストラン４０である、請求項３に記載の方法。
ステップ（ａ）の前記溶液が凍結保護剤を含む、請求項１に記載の方法。
前記細胞を含む組成物が約７．５％〜約９％のデキストランを含む、請求項１に記載の方法。
前記細胞を含む組成物が、１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０^６個〜約５．０±１．５×１０^６個の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
前記幹細胞が単離ヒト接着性胎盤幹細胞である、請求項１に記載の方法。
胎盤幹細胞を含む組成物を作製する方法であって、
（ａ）複数の単離ヒト接着性胎盤細胞を５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ溶液に懸濁して細胞含有溶液を形成するステップ、
（ｂ）細胞含有溶液を７０μＭフィルターで濾過して該細胞含有溶液からマクロの細胞塊を除去するステップ、
（ｃ）細胞含有溶液を５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯ中に約１０±３×１０^６個細胞／ｍＬ以下に希釈するステップ、
（ｄ）細胞を凍結保存するステップ、および
（ｅ）細胞を解凍して前記細胞を含む組成物を生成するステップ
を含む方法。
胎盤幹細胞を含む組成物を作製する方法であって、
（ａ）複数の単離ヒト接着性胎盤細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、
（ｂ）細胞を５．５％デキストラン４０に再懸濁するステップ、
（ｃ）細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、
（ｄ）細胞を、１０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン４０溶液に再懸濁して細胞含有溶液を形成するステップ、
（ｅ）細胞含有溶液を７０μＭ〜１００μＭフィルターで濾過して該細胞含有溶液からマクロの細胞塊を除去するステップ、
（ｆ）細胞含有溶液を５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯ中に約１０±３×１０^６個細胞／ｍＬ以下に希釈するステップ、
（ｇ）細胞を凍結保存するステップ、および
（ｈ）細胞を解凍して前記細胞を含む組成物を生成するステップ
を含む方法。
単離ヒト接着性胎盤細胞を含む組成物を作製するための方法であって、
（ａ）複数の単離ヒト接着性胎盤細胞を５．５％デキストラン４０および１０％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む溶液中に供給して、単離ヒト接着性胎盤細胞を含む溶液を形成するステップ、
（ｂ）前記単離ヒト接着性胎盤細胞を含む溶液を、目に見える細胞塊を除去するフィルターで濾過して濾過済み単離ヒト接着性胎盤細胞を生成するステップ、
（ｃ）前記濾過済み単離ヒト接着性胎盤細胞を１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞にするのに十分な量の、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡおよび５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む溶液で前記濾過済み単離ヒト接着性胎盤細胞を希釈するステップ、
（ｄ）前記単離ヒト接着性胎盤細胞を１０％デキストラン４０で、約１：１〜約１：１１の単離ヒト接着性胎盤細胞：デキストラン４０の比で希釈して前記組成物を生成するステップ、および
（ｅ）細胞を凍結保存するステップを含む方法。
前記フィルターが７０μＭフィルターである、請求項１に記載の方法。
前記フィルターが１００μＭフィルターである、請求項１に記載の方法。
前記細胞が単離ヒト接着性胎盤幹細胞である、請求項１に記載の方法。
前記単離ヒト接着性胎盤幹細胞がＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻およびＣＤ１０５^＋である、請求項２１に記載の方法。
前記ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻およびＣＤ１０５^＋細胞がＣＤ２００^＋である、請求項２２に記載の方法。
前記ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋およびＣＤ２００^＋細胞がＣＤ４５⁻またはＣＤ９０^＋のいずれかである、請求項２３に記載の方法。
前記ＣＤ１０^＋、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１０５^＋およびＣＤ２００^＋細胞がＣＤ４５⁻およびＣＤ９０^＋である、請求項２３に記載の方法。
単離ヒト接着性胎盤細胞を含む組成物を作製する方法であって、前記単離ヒト接着性胎盤細胞を、５．５％デキストランおよび１０％ＨＳＡを含む溶液と接触させるステップ、単離ヒト接着性胎盤細胞を濾過して該組成物からマクロの細胞塊を除去するステップ、前記単離ヒト接着性胎盤細胞を、１０％デキストラン４０（ｗ／ｖ）を含む溶液で１ミリリットル当たり約１０±３×１０^６個の細胞に希釈するステップ、および細胞を凍結保存するステップを含む方法。