CN103563888B

CN103563888B - 细胞冻存液

Info

Publication number: CN103563888B
Application number: CN201310526658.1A
Authority: CN
Inventors: 邵谊
Original assignee: BEIJING YONGTAI IMMUNITY APPLICATION TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING YONGTAI IMMUNITY APPLICATION TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-10-31
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2033-10-31
Also published as: WO2015062267A1; CN103563888A

Abstract

本发明提供一种可临床安全使用的用于冻存人类细胞的细胞冻存液，其包含2-8重量％的人血白蛋白、5-10体积％的二甲基亚砜、3.3-5.1重量％的右旋糖酐-40和2.75-4.25重量％的葡萄糖。

Description

细胞冻存液

发明领域

本发明涉及细胞治疗领域，具体涉及一种可安全用于临床的细胞冻存液。

发明背景

免疫细胞治疗已日渐成为肿瘤临床常规治疗的重要辅助手段之一，在临床上广泛使用。在免疫细胞制备或临床应用过程中，一定情况下需要将细胞冷冻保存于液氮，一段时间后再用于继续培养或临床直接回输。实验室常用的细胞冻存液或市售细胞冻存液中通常需要添加异种血清或异种蛋白，因此在用于免疫细胞治疗时存在引入污染和过敏原的风险。而临床用于冻存脐带血干细胞的细胞冻存液，在冻存免疫细胞时，存在复苏后细胞活性差的缺点。本领域存在对高效的、可安全用于临床的细胞冻存液，特别是免疫细胞冻存液的需要。

发明内容

本发明提供一种用于冻存人类细胞的细胞冻存液，其包含2-8重量％的人血白蛋白、5-10体积％的二甲基亚砜、3.3-5.1重量％的右旋糖酐-40和2.75-4.25重量％的葡萄糖。

具体实施方式

本发明提供了一种临床安全性高、成本低、能很好保持冻存细胞活性的细胞冻存液，其用于冻存人类细胞。

本发明的细胞冻存液的主要活性成分包括右旋糖酐-40(Dextran-40)、人血白蛋白(HSA)和二甲基亚砜(DMSO)。其中Dextran-40可以维持渗透压和PH值，提供适宜细胞存活的介质环境。用于配制本发明的细胞冻存液的右旋糖酐-40可以例如是药用级别的右旋糖酐-40葡萄糖注射液(四川科伦药业，其中含6％Dextran-40和作为辅料的5％葡萄糖)。人血白蛋白为营养性保护剂。市售的人血白蛋白通常为20％人血白蛋白溶液。DMSO为小分子有机化合物，渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成对细胞的损害。

在一些实施方案中，本发明的细胞冻存液包含2-8重量％的人血白蛋白、5-10体积％的二甲基亚砜、3.3-5.1重量％的右旋糖酐-40和2.75-4.25重量％的葡萄糖。优选地，本发明的细胞冻存液包含4重量％的人血白蛋白、5体积％的二甲基亚砜、4.5重量％的右旋糖酐-40和3.75重量％的葡萄糖。本发明的细胞冻存液中还包含药物学可接受的溶剂，包括但不限于注射用水或注射用生理盐水。在本发明实施例中，使用商品化的右旋糖酐-40葡萄糖注射液(含6％Dextran-40和5％葡萄糖)和20％人血白蛋白溶液可以方便地配制本发明的细胞冻存液，无需额外添加溶剂。

现有技术中的冻存液，通常需要含有异种血清或蛋白，例如胎牛血清(FBS)，其成分复杂并存在引入污染和过敏原的风险，不适合于临床使用。本发明的用于冻存人类细胞的细胞冻存液不含非人源的血清或蛋白质，因此具有高临床安全性。相反，本发明的细胞冻存液使用了人血白蛋白，能够实现冻存细胞高达约80-95％的复苏活率。在一实施方案中，使用本发明的细胞冻存液能够实现淋巴细胞约80-95％的冻存复苏活率。

本发明的细胞冻存液适用于冻存人类细胞，包括但不限于外周血单个核细胞、淋巴细胞(包括活化淋巴细胞)、脐血干细胞、外周血造血干细胞、骨髓造血肝细胞和人来源的细胞系(如HepG11、A549、SK-BR-3等人体肿瘤细胞系)等。所述细胞可以是直接分离自人体的细胞也可以是经体外扩增的细胞。冻存后复苏的细胞，例如活化淋巴细胞，可以继续培养扩增或临床直接回输进行疾病治疗，例如肿瘤治疗。

本发明的细胞冻存液适于冻存较广浓度范围的细胞。例如，可以0.5×10⁷/ml-2.5×10⁷/ml的浓度冻存细胞。

本发明的细胞冻存液易于保存并具有较长的货架期。例如，本发明的细胞冻存液可以在配制后立即使用或在配制后保存至少3个月后再使用，其可以在低温保存(例如2～8℃)也可以在室温保存，所述保存条件不会降低本发明细胞冻存液的效果。

本发明还提供了冻存细胞的方法，其包括：

a)向细胞加入本发明的细胞冻存液，获得细胞悬浮液；

b)将所获得的细胞悬浮液程序冷冻，然后移入液氮保存。

对细胞悬浮液进行程序冷冻的方法为本领域技术人员所熟知，例如，依照厂商说明使用美国Nalgene程序降温盒进行程序冷冻。

下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。

实施例

实施例1、三种不同细胞冻存液的比较

1.实验设计

以实验室常用细胞冻存液(胎牛血清+DMSO，后文简称对照冻存液A；见司徒振强等《细胞培养》)为对照，比较本发明人开发的细胞冻存液(细胞冻存液C)和脐带血造血干细胞常用冻存液(Dextran-40+DMSO，后文简称脐血冻存液B；Rubinstein等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA，Vol.92，pp.10119-10122，Oct1995)对于经两次传代培养的淋巴细胞的冷冻保存性能。

2.实验方法

2.1外周血单个核细胞的分离和接种培养

采集3个健康供者的外周血，45mL/人，无菌条件下使用Ficoll-PaquePREMIUM密度梯度离心获得外周血单个核细胞(后文简称PBMC)，用生理盐水洗涤细胞三次。最后用5mL无血清细胞培养基(英国IMMUNOTECHNKLtd，无血清IMSF100细胞培养基)重悬细胞沉淀，吹打混匀后进行细胞计数。根据计数结果，用50mL已加入细胞因子(IL-2750-1500U/ml、IL-71-30U/ml以及INF-γ750-1500U/ml)的无血清细胞培养基重悬1～4×10⁷PBMC接种到已包被活化抗体(抗CD3抗体)的细胞培养瓶中，置于细胞培养箱内进行培养(温度37℃和CO₂浓度5％)。

2.2活化并进行两次细胞传代

接种培养3天后，将细胞培养瓶从细胞培养箱内取出，补充50mL已加入细胞因子(IL-2750-1500U/ml、IL-71-30U/ml以及INF-γ750-1500U/ml)的无血清细胞培养基(IMSF100)进行细胞传代。第一次传代操作后第二天，将细胞培养瓶从细胞培养箱内取出，再补充100mL已加入细胞因子的无血清细胞培养基进行第二次细胞传代。

2.3配制冻存液并进行细胞计数

第二次传代操作后第二天，按照下表配制三种细胞冻存液：

表1三种冻存液配方

胎牛血清(FBS)：Gibco；

DMSO：SIGMA，D2650；

右旋糖酐40葡萄糖注射液：含6％Dextran-40和5％葡萄糖，四川科伦药业；

20％人血白蛋白(HSA)：广东双林生物制药。

将细胞培养瓶从细胞培养箱内取出，拍打混匀瓶内细胞悬液，用移液管吸取约0.5mL用于细胞计数。根据计数结果，各供者的细胞分装出三份细胞悬液，每份细胞数量为2×10⁷。

2.4收集细胞并冻存

将分装出的细胞悬液离心后弃去上清，振开细胞沉淀，分别用1.8mL如前述配制好的三种冻存液重悬后加入到2mL细胞冻存管中。迅速将细胞冻存管放入已加好异丙醇的细胞程序降温盒(美国Nalgene)中，放入-80℃超低温冰箱过夜，第二天将细胞冻存管转入液氮保存。

2.5复苏细胞并进行细胞计数和活性检测

冻存细胞在液氮中保存48h后取出，在37℃迅速水浴解冻，用移液管将细胞转入之前预温好的40ml细胞培养基中。吹打混匀后取0.5mL细胞悬液进行细胞计数和活性检测。

3.实验结果

实验结果示于下表2。使用脐血冻存液B的样品复苏后细胞数量和活率明显低于另外两组(p＜0.001)，而使用冻存液C与对照冻存液A无显著性差异(p＞0.05)。由此可见，冻存液C用于临床用免疫细胞冻存性能最佳。

表2三个供者的样品分别使用三种冻存液复苏前后细胞数量和活性

表中“A、B和C”分别三种冻存液的样品。“1、2和3”分别表示三个供者的样品的试验结果。

实施例2、对细胞冻存液配方的优化

1实验设计

调整实施例1中的冻存液C配方中各成分组成(如下表3)，通过试验比较寻找最优化浓度比例。实验方法同实施例1。

表3对冻存液C进行优化

组别	20％HSA(v/v)	DMSO(v/v)	右旋糖酐40葡萄糖注射液(v/v)
				1	10％	5％	85％
2	20％	5％	75％
				3	30％	5％	65％
4	40％	5％	55％

2实验结果

实验结果见下表4。其中第2组实验结果(即实施例1中的冻存液C)最优，但其他组也均优于脐血冻存液B。

表4.修改的冻存液C的实验结果

组别	冻存前细胞数量(×10⁷)	复苏细胞数量(×10⁷)	细胞活率(％)
				1	2.05	1.77	84.9
2	2.05	2.01	95.4
				3	2.05	1.89	91.5
4	2.05	1.63	82.9

实施例3、对不同浓度的细胞的冻存效果

1.实验设计

分别使用实施例1中配制的冻存液C冻存不同浓度的细胞，检测复苏后细胞数量和活性，对冻存液C的适用细胞浓度范围进行研究。

2.实验方法

细胞传代培养、冻存后复苏等操作如实施例1。按照实施例1的冻存液C配方配制细胞冻存液50ml。将细胞培养瓶从细胞培养箱内取出，拍打混匀瓶内细胞悬液，用移液管吸取0.5mL用于细胞计数。根据计数结果，分装出三份细胞悬液，每份细胞数量参照下表：

表5.不同的细胞冻存浓度

将分装出的三份细胞悬液离心后弃去上清，振开细胞沉淀，分别用1.8mL之前配制好的冻存液C重悬成三种不同浓度，立即转入到2mL细胞冻存管中。迅速将细胞冻存管放入已加好异丙醇的细胞程序降温盒中，放入-80℃超低温冰箱过夜，第二天将细胞冻存管转入液氮保存。

3.实验结果

实验结果见下表6。使用实施例1中的冻存液C以0.56×10⁷/ml、

1.11×10⁷/ml、2.22×10⁷/ml三种浓度冻存的细胞复苏后活性无显著性差异(p＞0.05)。因此，在约0.5×10⁷/ml-约2.5×10⁷/ml细胞浓度范围内，实施例1中的冻存液C均能较好的保持冻存细胞的活性。

表6使用实施例1中的冻存液C按照三种浓度冻存细胞复苏前后细胞数量和活性

上表中示出来自3个供者的细胞采用0.56、1.11、2.22×10⁷/ml三种细胞浓度冻存的实验结果。

实施例4、储存温度和时间对冻存液效果的影响

1.实验设计

分别在不同时间配制冻存液并在不同温度下避光保存，检测冻存复苏后的细胞数量和活性，从而对冻存液的保存时间和冻存性能进行研究。

2.实验方法

按照以下时间表配制四次实施例1的细胞冻存液C，每次配制两份，分别于2～8℃和室温避光保存：

表7细胞冻存液的不同保存条件

细胞传代培养、冻存后复苏等操作如实施例1。将细胞培养瓶从细胞培养箱内取出，拍打混匀瓶内细胞悬液，用移液管吸取约0.5mL用于细胞计数。取出如表7配制保存的7组细胞冻存液。根据计数结果，将每个细胞悬液分成7等份，每份细胞数量约为2×10⁷。离心后弃去上清，振开细胞沉淀后分别用7组冻存液重悬，将重悬液转入2mL细胞冻存管中，每管1.8mL。迅速将细胞冻存管放入已加好异丙醇的细胞程序降温盒中，放入-80℃超低温冰箱过夜，第二天将细胞冻存管转入液氮保存。

3.实验结果

实验结果如下表8所示。实施例1的冻存液C配制后在2～8℃和室温条件下分别避光保存1、2、3个月，其冻存细胞性能没有显著性差异(p＞0.05)。由此可见，冻存液C在2～8℃和室温保存条件下效期至少为3个月。

表8不同温度保存不同时间(1、2、3个月)的冻存液冻存细胞复苏前后细胞数量和活性

上表中“LT和RT”分别表示保存于2～8℃和室温条件下的冻存液。“1、2和3”表示冻存液保存时间为“1、2、3个月”。此表中结果为三个供者样品检测结果均值。

Claims

1.一种用于冻存人类淋巴细胞的细胞冻存液，其包含4重量％的人血白蛋白、5体积％的二甲基亚砜、4.5重量％的右旋糖酐-40和3.75重量％的葡萄糖。

2.权利要求1的细胞冻存液，其不含非人源的血清和蛋白质。

3.权利要求1的细胞冻存液，其在2-8℃或室温保存。

4.权利要求1的细胞冻存液，所述细胞冻存液具有至少3个月的货架期。

5.冻存人类淋巴细胞的方法，其包括：

a)向细胞加入权利要求1-4任一项的细胞冻存液，获得细胞悬浮液；

b)将所获得的细胞悬浮液程序冷冻，然后移入液氮保存。

6.权利要求5的方法，其中所述细胞悬浮液中的细胞浓度是0.5×10⁷/ml-2.5×10⁷/ml。