CN105087472B - 一种诱导多能干细胞冻存液、其应用及冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物领域。本发明够提供了一种诱导多能干细胞冻存液，其应用及冻存方法。本发明的冻存液以IMDM/F12基础培养基为基质，每100mL诱导多能干细胞冻存液中包括以下体积浓度的组分：2～20v/v％DMSO；0.5～5v/v％右旋糖酐40；0.5～5v/v％白蛋白；1ng～1000ng Thiazovivin；余量为IMDM/F12基础培养基。所述冻存液不采用动物血清，避免了血清传播动物源性病原体的风险。而且，采用本发明的冻存液，冻存效果更好，细胞复苏后活率更高。冻存3个月后，用本发明冻存液冻存的iPS细胞复苏后细胞活率为91％以上，显著高于用传统冻存液的冻存效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种诱导多能干细胞冻存液、其应用及冻存方法。
背景技术
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)最初是日本人山中申弥(Shinya Yamanaka)于2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。诱导多能干细胞能够通过向体细胞中导入诱导基因，使体细胞重编程获得具有胚胎干细胞样特性的多能干细胞，也称为去分化。
随后世界各地不同科学家陆续发现其他方法同样也可以制造这种细胞。成功建立iPS细胞后，应用iPS细胞来治疗疾病是人们的最终目标。iPS细胞不仅可用于分化和移植，还可以提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的治疗方法。在体外,iPS细胞可定向诱导分化出多种细胞，比如神经干细胞、肝脏干细胞、心肌干细胞等，因此,iPS细胞在理论研究和临床应用等方面都极具应用价值。
细胞冻存是细胞长期保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。
细胞冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险。为了将细胞冻存、复苏过程中细胞的损伤降至最低，必须进一步优化化学和温度操作过程，但需要在冻存前加入一种或一种以上的冻存保护剂，在溶解后又将其去除。目前最常用的冻存保护剂为二甲基亚砜(DMSO)，这种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，减少胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。由于高浓度DMSO对细胞有毒性，还必须添加其他的液体成分，如血清、细胞培养基，以降低DMSO的浓度，减少对细胞的伤害。
目前，iPS细胞冻存液多采用为培养基配合胎牛血清及DMSO。但是胎牛血清源于动物，可能会含有一些动物源性病原体，这使iPS细胞应用于临床具有很大的风险。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种诱导多能干细胞冻存液、其应用及冻存方法。本发明的iPS细胞冻存液不采用动物血清免了血清传播动物源性病原体的风险，确保iPS细胞超低温冻存的安全性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种诱导多能干细胞冻存液，以IMDM/F12基础培养基为基质，每100mL诱导多能干细胞冻存液中包括以下体积浓度的组分：
2～20v/v％DMSO；
0.5～5v/v％右旋糖酐40；
0.5～5v/v％白蛋白；
1ng～1000ng Thiazovivin；
余量为IMDM/F12基础培养基。
本发明摒弃用动物血清作为冻存液成分之一，而是采用了安全性较好的右旋糖苷40、白蛋白及Thiazovivin，并联合DMSO，用于冻存iPS细胞，既避免了传播潜在病原体的风险，提高了细胞冻存的安全性，而且还确保了细胞的冻存效果。iPS细胞复苏后具有较高的活率，因此在临床上具有很大的使用价值。
在本发明中，以IMDM/F12基础培养基为基质，右旋糖苷40、白蛋白、Thiazovivin及DMSO通过复合作用，可以达到较好的冻存iPS细胞的效果。其中Thiazovivin为一种ROCK抑制剂，所述白蛋白优选为人学白蛋白。
在本发明的一些具体实施方案中，以IMDM/F12基础培养基为基质，每100mL诱导多能干细胞冻存液中包括以下体积浓度的组分：
2～20v/v％DMSO；
0.5～5v/v％右旋糖酐40；
0.5～5v/v％白蛋白；
1ng～1000ng Thiazovivin；
余量为IMDM/F12基础培养基。
作为优选的方案，包括：3～10v/v％DMSO。
作为优选的方案，包括：0.5～5v/v％右旋糖酐40。
作为优选的方案，包括：0.6～3v/v％白蛋白。
作为优选的方案，包括：1.1ng～100ng Thiazovivin。
在本发明的一些具体实施方案中，每100mL诱导多能干细胞冻存液中包括以下体积浓度的组分：
本发明还提供了所述诱导多能干细胞冻存液在冻存诱导多能干细胞中的应用。
本发明还提供了一种诱导多能干细胞的冻存方法，用所述的诱导多能干细胞冻存液冻存所述诱导多能干细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，冻存方法包括如下步骤：
将诱导多能干细胞悬液离心，去上清，然后与上述技术方案所述的诱导多能干细胞冻存液混合，分装，冻存。
在本发明的一些具体实施方案中，冻存方法具体为：将诱导多能干细胞悬液1500rmp离心5min，离心结束后，去上清后，缓慢加入所述诱导多能干细胞冻存液，轻轻吹打混匀后，分装，冻存。分装的冻存液每管为1.5mL，放入-80℃冰箱中过夜，次日移入液氮罐。作为优选的方案，所述诱导多能干细胞的冻存密度为1～10×106/mL。
与现有技术相比，本发明的诱导多能干细胞冻存液不采用动物血清，避免了血清传播动物源性病原体的风险。而且，采用本发明的冻存液，细胞复苏后活率更高，显示其更好的冻存效果。冻存3个月后，用本发明冻存液冻存的iPS细胞复苏后细胞活率为91％以上，显著(P＜0.05)高于用传统冻存液(培养基+胎牛血清+DMSO)的冻存效果。
附图说明
图1示采用冻存液A的细胞经复苏后的显微图片；
图2示采用冻存液B的细胞经复苏后的显微图片；
图3示采用本发明冻存液及传统冻存液的细胞经复苏后的增殖曲线；其中，为采用本发明冻存液的细胞经复苏后的增殖曲线；为采用传统冻存液的细胞经复苏后的增殖曲线。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明提供的诱导多能干细胞冻存液、其应用及冻存方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
诱导多能干细胞可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
右旋糖酐40原料为6％右旋糖酐40-氯化钠注射液(国森药业)。
10ug Thiazovivin(美国StemRD公司)用1ml DMSO溶解，配成1000倍的Thiazovivin储存液。
在68.23ml DMEM/F12基础培养基中加入16.67ml右旋糖酐40注射液、5ml白蛋白注射液、100ul Thiazovivin储存液，混匀；之后缓慢加入10ml DMSO溶液，混匀，置于4度冰箱保存备用。
实施例2
右旋糖酐40原料为6％右旋糖酐40-氯化钠注射液(国森药业)。
10ug Thiazovivin(美国StemRD公司)用1ml DMSO溶解，配成1000倍的Thiazovivin储存液。
在69.155ml DMEM/F12基础培养基中加入8.335ml右旋糖酐40注射液、2.5ml白蛋白注射液、10ul Thiazovivin储存液，混匀；之后缓慢加入20ml DMSO溶液，混匀，置于4度冰箱保存备用。
实施例3
右旋糖酐40原料为6％右旋糖酐40-氯化钠注射液(国森药业)。
10ug Thiazovivin(美国StemRD公司)用1ml DMSO溶解，配成1000倍的Thiazovivin储存液。
在29.66ml DMEM/F12基础培养基中加入33.34ml右旋糖酐40注射液、25ml白蛋白注射液、10ml Thiazovivin储存液，混匀；之后缓慢加入2ml DMSO溶液，混匀，置于4度冰箱保存备用。
实施例4
1.iPS细胞的冻存
将IPS细胞悬液转移至50mL离心管中，取20μL细胞悬液用细胞计数板计数，离心管配平后置于离心机内，1500rpm离心5min。
离心结束后，倒掉离心上清，用10mL一次性移液管缓慢地加入冻存液。根据细胞计数结果计算得出冻存液用量，冻存密度1×106cell/mL，每管1.5mL。
边添冻存液加边旋转离心管，轻轻吹打混匀后，分装到冻存管中。
标记冻存管，从冰箱中取出冻存盒，将冻存管置于冻存盒内，将冻存盒放传递窗内放入超低温冰箱(-80℃)中。
本实施例中选用的冻存液分别为冻存液1和冻存液2。
冻存液A为实施例1中得到的冻存液和传统配方的冻存液。冻存液B为传统配方的冻存液，即DMEM/F12基础培养基+10％DMSO+20％FBS。
2.iPS细胞的复苏
2.1把将要复苏的IPS细胞从液氮罐中取出，迅速用镊子夹住并放入已预热至37℃水浴锅中，来回摇晃使细胞悬液尽快溶解后将冻存管从冻存室的传递窗传进去。
2.2用巴氏吸管迅速将细胞悬液转移50mL离心管中，用10mL一次性移液管吸取15mL DMEM/F12基础培养基缓慢加入到50mL离心管中，边添加边旋转离心管，轻轻吹打混匀。
2.3用手动移液枪取20uL细胞悬液至EP管中进行计数，其余液体用50mL离心管配平后置于离心机内，1500rpm离心5min。
2.4根据细胞计数结果，用PSGro完全培养基(美国StemRD公司)调整细胞接种密度为7×104-8×104cell/ml，根据细胞总量选择接种培养皿规格及数量。
2.5 10cm培养皿接种步骤：接种细胞总量为7-8×105cell，用10mL一次性移液管接种10mL的细胞悬液至培养皿中，每皿添加100μL的1μg/mL EGF；15cm培养皿接种步骤：接种细胞总量为14-16×105cell，用25mL一次性移液管接种20mL的细胞悬液至培养皿中
2.6在培养皿盖上方做好标记(条形码、代数、批次、操作人、日期)，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养。
取6×106IPS细胞，分成6管，离心去除上清后，3管用冻存液1冻存，余3管用冻存液2冻存，冻存方法为本发明实施例4，冻存3个月后，参照实施例4的方法进行复苏，计算各管细胞活率，并进行培养，比较细胞形态、细胞增殖速度。
表1冻存3个月后，用本发明冻存液冻存的iPS细胞复苏后细胞活率
由表1可见，iPS细胞复苏后的活率比较，冻存液A冻存的细胞复苏后的活率明显高于冻存液B(P<0.05)。
图1和图2为细胞复苏后的培养照片，图1为采用冻存液A的细胞经复苏后的显微图片，图2为采用冻存液B的细胞经复苏后的显微图片，显示采用冻存液A后复苏的细胞汇合度高于采用冻存液B后复苏的细胞。
表2采用本发明冻存液及传统冻存液的细胞经复苏后的增殖速度比较
表2中，*P<0.05,与传统方法相比，采用本发明冻存液的细胞经复苏后的增殖速度显著高于采用传统方法冻存液的细胞复苏后的增殖速度。
图3采用本发明冻存液及传统冻存液的细胞经复苏后的增殖曲线。图3中，为采用本发明冻存液的细胞经复苏后的增殖曲线；为采用传统冻存液的细胞经复苏后的增殖曲线。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种诱导多能干细胞冻存液，其特征在于，每100mL诱导多能干细胞冻存液中包括以下体积浓度的组分：
2.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞冻存液在冻存诱导多能干细胞中的应用。
3.一种诱导多能干细胞的冻存方法，其特征在于，用如权利要求1所述的诱导多能干细胞冻存液冻存所述诱导多能干细胞。
4.根据权利要求3所述的冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：
将诱导多能干细胞悬液离心，去上清，然后与权利要求1所述的诱导多能干细胞冻存液混合，分装，冻存。
5.根据权利要求4所述的冻存方法，其特征在于，所述诱导多能干细胞的冻存密度为1～10×106/mL。
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