JP6727334B2

JP6727334B2 - 細胞の凍結保存のための培地組成物およびその使用

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Publication number: JP6727334B2
Application number: JP2018559661A
Authority: JP
Inventors: ファン・ユギョン; ミン・ボギョン; チェ・ハナ; キム・ヒョジン
Original assignee: グリーン・クロス・ラブ・セル・コーポレイション
Priority date: 2016-02-01
Filing date: 2017-01-25
Publication date: 2020-07-22
Anticipated expiration: 2037-01-25
Also published as: KR20180085796A; WO2017135631A1; US20230108578A1; CA3013187C; CN108934158A; JP2019504643A; EP3412149A1; EP3412149A4; AU2017215955A1; CN108934158B; AU2017215955B2; KR102175256B1; US20190037831A1; CA3013187A1

Description

本発明は、解凍後の優れた細胞回収率、細胞生存率、および細胞活性を示す、細胞の凍結保存のための培地組成物、および上記培地組成物と治療用細胞とを含む医薬組成物に関する。

かかる方法は、動物細胞を培養するための方法の開発と共に、タンパク質薬物の製造を含む種々の分野の生物学的研究に広く適用されてきた。動物細胞を使用してタンパク質薬物を製造する際に、長期間の細胞株の特性の維持を可能にする保存方法として、凍結保存が主に使用される。

凍結保存により、細胞培養および維持における難点を克服し、細菌、マイコプラズマ等からのコンタミネーションを防ぐことができる。さらに、細胞株の形質転換を防ぎ、実験および製造の再現性も確保することができる。

一般に、動物細胞は、凍結保存中に細胞損傷を受ける、すなわち、低温への細胞の暴露は、細胞器官および細胞機能の障害をもたらし得る。故に、凍結保存後の細胞同一性を確保するために、細胞の特性および生存率を維持することができる凍結保存方法の開発および検証を実施するべきである。

動物細胞の凍結保存のために使用される一般的な方法として、細胞膜を保護するために血清を補足した細胞培養培地に１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、細胞を徐々に冷却し、液体窒素中において−１９６℃で保管する。しかしながら、タンパク質製造のような過程におけるかかる方法の使用頻度は、血清の問題により減少しつつある。加えて、血清中の微量元素は細胞の生育に影響を及ぼすが、かかる元素を分析することは難しいという問題があり、かつ、該元素は製造時期および場所に応じて変化し得る。

加えて、血清のほとんどは動物由来であり、例えそれがヒト由来であっても、それはウイルス等による感染にさらされる。故に、細胞治療剤のような直接的な治療薬として、血清を含有する組成物を使用することにおける安全性の問題がある。

従って、本発明の発明者らは、動物細胞の長期凍結保存を可能にし、かつ、血清を含まない、故に細胞治療剤のための組成物として有用な、凍結保存のための培地組成物を確立し、本発明を完成させた。

従って、本発明の目的は、細胞の凍結保存のための培地組成物を提供することにある。

本発明の別の目的は、凍結保存のための上記培地組成物を含む医薬組成物を提供することにある。

本発明の１つの目的に従って、培地組成物の総体積に基づいて、１５〜５５ｖ／ｖ％のアルブミン、２０〜３０ｖ／ｖ％のデキストラン、２〜８ｖ／ｖ％のジメチルスルホキシドおよび１５〜５５ｖ／ｖ％の細胞培養培地を含む、細胞の凍結保存のための培地組成物が提供される。

本発明の別の目的に従って、本発明の培地組成物および活性成分としての免疫細胞を含む、がんまたは感染症を予防または処置するための医薬組成物が提供される。

本発明のまた別の目的に従って、本発明の培地組成物および活性成分としての幹細胞を含む、変性疾患および免疫関連疾患を予防または処置するための医薬組成物が提供される。

本発明に従い、細胞の凍結保存のための培地組成物中で細胞を凍結する場合、該細胞を解凍する時、細胞の生存率は高く、かつ、細胞の活性も維持される。加えて、本発明の培地組成物は、洗浄、分離等のような追加の処置を用いることなく、凍結保存された治療用細胞を対象へ投与することを可能にする。故に、該組成物は、細胞の凍結保存のための優れた培地組成物として、または優れた医薬組成物として使用され得る。

図１ａ−１ｄは、本発明の実施形態において調製された細胞の凍結保存のための培地組成物中で凍結させたＮＫ細胞を解凍し、ＩＬ−２と共に培養した後の回収率（図１ａおよび１ｃ）および生存率（図１ｂおよび図１ｄ）を示す。図２ａ−２ｄは、本発明の実施形態に従って調製された細胞の凍結保存のための培地組成物中で凍結させたＮＫ細胞のＫ５６２細胞に対する細胞毒性を示し、図２ａおよび２ｂは、該細胞の解凍直後の測定値を示し、図２ｃおよび図２ｄは、解凍およびＩＬ−２との培養後の測定値を示す。図３ａおよび３ｂは、本発明の実施形態において調製された細胞の凍結保存のための培地組成物中で凍結させたＨｕＴ７８細胞を解凍し、３日間培養した後に測定された細胞数（図３ａ）および生存率（図３ｂ）を示す。図４ａおよび４ｂは、本発明の実施形態において調製された細胞の凍結保存のための培地組成物中で凍結させたＫ５６２細胞を解凍し、３日間培養した後に測定された細胞数（図４ａ）および生存率（図４ｂ）を示す。

以下、本発明を詳細に記載する。

本発明は、全培地組成物に基づき、１５〜５５ｖ／ｖ％のアルブミン、２０〜３０ｖ／ｖ％のデキストラン、２〜８ｖ／ｖ％のジメチルスルホキシドおよび１５〜５５ｖ／ｖ％の細胞培養培地を含む、細胞の凍結保存のための培地組成物を提供する。

本明細書で使用される場合、「凍結保存」なる語は、凍結を介して長期間安定に細胞を維持することを意味する。一般に、細胞を培養する場合、１：１００００の比で変異が起こり、細胞が長期の継代培養を経る場合、細胞集団は変化し、元の集団とは異なるものになり得る。深刻な場合、細胞は、それ自身の特定の機能を継代培養により失い得る。さらに、細胞は、継代培養中にマイコプラズマ等に感染し得る。かかる問題のため、細胞凍結保存を実施して、それらの固有の特性を失う前に細胞を凍結および保存し、必要とされる時にそれらを使用する。

細胞凍結保存は、凍結保存されるべき細胞を凍結保護剤で処理することにより実施されてもよく、本発明の組成物は、凍結保護剤により細胞損傷を防ぐために、アルブミン、デキストラン、ジメチルスルホキシドおよび細胞培養培地を含み、それにより、細胞の凍結保存における安全性および安定性を改良する。

本明細書で使用される場合、「凍結保護剤」なる語は、−８０℃〜−２００℃の超低温で細胞を保管する場合に使用される物質を意味する。とりわけ、該物質は、凍結および解凍過程に不可避に伴うイオンと浸透圧との不均衡による氷結晶の形成および細胞損傷を最小限にすることができる。

本明細書で使用される場合、「アルブミン」なる語は、生物学的に活性を有する全ヒトアルブミンまたはヒトアルブミンの一部を意味する。アルブミンは、凍結保存において血清と等価な、またはより優れたアニマルフリー代替品として使用されることができ、細胞を安定化させるために、凍結保存のための組成物へ加えられる。

アルブミンは、米国国立健康機関（ＵＳＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）のＧｅｎＢａｎｋにおけるアクセッション番号ＡＮＣ９８５２０．１を有するタンパク質であってもよく、上記タンパク質に対して７０％以上、とりわけ８０％以上、より詳細には９５％以上、最も詳細には９８％以上の類似性を示すいずれかのアミノ酸配列を含み得る。加えて、上記アルブミンの生物学的活性と等価なまたは相当する生物学的活性を有する限り、部分的な配列が欠失し、修飾され、置換され、または加えられたアミノ酸配列を有するタンパク質バリアントも包含され得る。

本発明の組成物中に含有されるアルブミンの含量は、該組成物の総体積に基づき、１５〜５５ｖ／ｖ％、とりわけ１８〜４０ｖ／ｖ％、より詳細には２０〜３５ｖ／ｖ％であり得る。本発明の一実施形態によると、アルブミンの含量は、全組成物に基づき、２０ｖ／ｖ％、３５ｖ／ｖ％または５０ｖ／ｖ％であり得る。ここで、「ｖ／ｖ％」は、全組成物の体積に基づいた各構成要素の体積分率を意味する。

本明細書で使用される場合、「デキストラン」なる語は、Ｄ−グルコースのポリマーである多糖を意味する。デキストランは、重量平均分子重量に従って、デキストラン１、デキストラン４０、デキストラン７０等に分類されることができる。一実施形態において、デキストランはデキストラン４０であり得る。

本発明の組成物中に含有されるデキストランの含量は、該組成物の総体積に基づき、２０〜３０ｖ／ｖ％、とりわけ２３〜２７ｖ／ｖ％であり得る。本発明の一実施形態によると、デキストランの含量は全組成物に基づき２５ｖ／ｖ％であり得る。

本明細書で使用される場合、「ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）」は、細胞膜透過性凍結保存剤として使用される。それは、細胞膜を透過し、細胞内水と置き換わり、凍結中の氷結晶の形成を阻害する。

本発明の組成物中に含有されるジメチルスルホキシドの含量は、該組成物の総体積に基づき、２〜８ｖ／ｖ％、とりわけ４〜６ｖ／ｖ％であり得る。本発明の一実施形態によると、ジメチルスルホキシドの含量は全組成物に基づき５ｖ／ｖ％であり得る。

本明細書で使用される場合、「細胞培養培地」なる語は、糖、アミノ酸、種々の栄養素、無機物等のような、細胞の生育および増殖に不可欠な要素を含有する、インビトロでの細胞の生育および増殖のための混合物を意味する。該細胞培養培地は、例えば、細胞生育を維持するために調製される基礎培養培地、細胞からのタンパク質製造を促進するために調製される細胞培養製造培地、高い濃度で栄養素を濃縮することにより調製される濃縮培地のように、特定の細胞培養のために最適化され得る。

上記の細胞培養培地は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−アスパラギン一水和物、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物、ｉ−イノシトール、チアミン塩酸塩、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、ビオチン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、リボフラビン、ビタミンＢ１２、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、リン酸水素ナトリウム一水和物（ＮａＨ_２ＰＯ_４−Ｈ_２Ｏ）、硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ_４−５Ｈ_２Ｏ）、硫酸鉄七水和物（ＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ）、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ）、Ｄ−グルコース（デキストロース）、ピルビン酸ナトリウム、ヒポキサンチンＮａ、リノール酸、リポ酸、プトレシン２ＨＣｌおよびチミジンからなる群より選択される少なくとも１つの成分を含有し得る。

本発明によれば、細胞培養培地は、人工的な製造により調製されてもよく、または市販の培地を使用してもよい。該市販の細胞培養培地の例は、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＭＥＭ（最小必須培地）、ＢＥＭ（イーグル基礎培地）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、α−ＭＥＭ（α−最小必須培地）、Ｇ−ＭＥＭ（グラスゴー最小必須培地）、ｃｅｌｌｇｒｏＳＣＧＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ、ＡＩＭ−Ｖ等を包含する。

培養培地の含量は、組成物の総体積に基づき、１５〜５５ｖ／ｖ％、とりわけ３０〜５２ｖ／ｖ％であり得る。本発明の一実施形態によると、該培養培地の含量は、全組成物１００ｖ／ｖ％に基づき、２０ｖ／ｖ％、３５ｖ／ｖ％、または５０ｖ／ｖ％であり得る。

本発明の凍結保存のための組成物と共に保存されることができる細胞は、動物細胞であり得るが、本発明の組成物により安定に凍結保存されることができるいずれの細胞を使用することもできる。該細胞は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ネズミ、ウサギ等から得られてもよく、とりわけ、該動物から得られる免疫細胞、腫瘍細胞、臍帯血細胞、幹細胞、上皮細胞、一次細胞等であり得る。

加えて、本発明の凍結保存のための組成物は、バッファー、等張剤またはアポトーシス阻害剤をさらに含み得る。該バッファーは、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩、ヒスチジンおよびトリスからなる群より選択されるいずれか１つであり得る。一方、該等張剤は、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩、ヒスチジンおよびトリスからなる群より選択され得る。一方、該等張剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、マンニトール、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、マルトース、スクロース、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、トレハロース、およびグルコースからなる群より選択される１つであり得る。該アポトーシス阻害剤は、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、カタラーゼ、およびｚＶＡＤ−ｆｍｋからなる群より選択される１つであり得る。

本発明は、凍結保存のための組成物が加えられる細胞を凍結する工程を含む、細胞の凍結保存のための方法を提供する。

本発明に従う凍結保存のための組成物が加えられる細胞の凍結を、従来の方法、例えば、ガラス化凍結、緩慢凍結等により実施することができる。ガラス化凍結は、制御速度凍結（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｒａｔｅｆｒｅｅｚｉｎｇ）（ＣＲＦ）のような装置を用いて、１分あたり定速で温度を制御することにより細胞を凍結する方法である。温度が−８０℃に到達すると、凍結された細胞は窒素タンク中で保管される。一方、緩慢凍結は、細胞を含有している凍結保存のための組成物を含有しているバイアルを、イソプロピルアルコールを含有している凍結用コンテイナーボックス中に入れ、次いで、−７０℃以下の超低温フリーザー中で１２〜２４時間、定速で温度を下げることにより細胞を凍結する方法である。その後、該凍結細胞を液体窒素タンク中で保管する。

本発明の一実施形態によると、細胞の凍結保存のための方法は、ガラス化凍結であり得る。ガラス化凍結は、ＣＲＦを用いて、１）室温の細胞を４℃へ冷却すること；２）１分あたり−１℃で、−８℃へ冷却すること；３）１分あたり−２５℃で、−６５℃へ冷却すること；４）１分あたり１５℃で、−１４℃へ温度を上昇させること；５）１分あたり−１℃で、−４５℃へ冷却すること；および６）１分あたり−１０℃で、−９０℃へ冷却することにより実施される。

細胞の凍結保存のための上記の方法は、バイアル中において適当な濃度で細胞を含有することにより実施されることができる。細胞の濃度は、１バイアルあたり１ｘ１０^４〜１ｘ１０^８細胞／ｍｌ、とりわけ、１ｘ１０^５〜１ｘ１０^７細胞／ｍｌであってもよいが、該濃度は細胞型に応じて変化し得る。

本発明は、本発明の組成物および活性成分としての免疫細胞を含む、がんまたは感染症を予防または処置するための医薬組成物を提供する。

該組成物は、上記の細胞の凍結保存のための培地組成物と同様である。しかしながら、医薬組成物として使用する場合、含まれることができる細胞培養培地は、好ましくは、血清、フェノールレッドまたはβ−メルカプトエタノールのような無毒性物質を補足した培地である。従って、本発明の医薬組成物は、ヒト毒性を有さず、故に、解凍後、対象へ直接投与されることができる。

本明細書で使用される場合、「免疫細胞」なる語は、ヒトの体の免疫応答に関与する細胞を意味し、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および樹状細胞等を包含する。とりわけ、該免疫細胞はナチュラルキラー細胞であり得る。

上記がんは、膀胱がん、乳がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、甲状腺がん、子宮頸がん、中枢神経系がん、神経膠腫、肝臓がん、皮膚がん、膵臓がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、腎臓がん、肺がん、上皮性がん、血液がん、前立腺がん、軟部組織肉腫、多発性硬化症等を包含し得る。

本明細書で使用される場合、「感染症」なる語は、ウイルスまたは病原体の感染により引き起こされる病理学的状態を意味し、気道、血液、肌接触等により伝染または感染され得る全疾患を包含する。かかる感染症の例は、限定されないが、ＢおよびＣ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染、サイトメガロウイルス感染、ウイルス性呼吸器疾患、インフルエンザ等を包含する。

本発明は、本発明の組成物および活性成分としての幹細胞を含む、変性疾患を予防または処置するための医薬組成物も提供する。

本明細書で使用される場合、「幹細胞」なる語は、種々の細胞へ分化することができる多能性を有する細胞を意味する。かかる幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、骨髄幹細胞、間葉幹細胞、ヒト神経幹細胞、口腔粘膜固有層幹細胞等を包含し得る。とりわけ、該幹細胞は間葉幹細胞であり得る。

本明細書で使用される場合、「変性疾患」なる語は、組織の不可逆的な量的損失により、組織が元の機能を失った病理学的状態を意味する。かかる変性疾患は、限定されないが、脳神経疾患、虚血性疾患、皮膚損傷、骨疾患および変性関節炎等を包含する。

本発明は、本発明の組成物および活性成分としての間葉細胞を含む、免疫疾患を予防または処置するための医薬組成物も提供する。

本明細書で使用される場合、「免疫疾患」なる語は、過度のまたは不所望の免疫応答により組織が損傷した任意の病理学的状態を意味する。従って、「免疫学的疾患」なる語は、「過活動免疫疾患」と同じ意味を有し、「免疫疾患を予防または処置するための組成物」は、「免疫抑制剤」と同じ意味を有する。

かかる免疫疾患は、限定されないが、移植片対宿主疾患、移植片拒絶、慢性炎症性疾患、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および自己免疫疾患を包含する。

本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患」なる語は、免疫細胞が、自己と外来物質を区別することなく自己を攻撃する場合に生じる病理学的状態を意味する。自己免疫疾患は、限定されないが、リウマチ性関節炎、橋本甲状腺炎、グレーブス病、多発性硬化症、強皮症、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、白斑、ベーチェット病、クローン病、強直性脊椎炎、血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、自己免疫性貧血、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を包含する。

本発明に従う医薬組成物は、上記の活性成分に加えて、医薬上許容される添加物をさらに含み得る。

加えて、医薬組成物は、薬学の分野における従来の方法により、患者の体への投与に適した単位剤形中へ処方され得る。かかる目的に適した処方は、非経口投与製剤としての溶液もしくは懸濁液、または局所製剤としての軟膏を包含する。本発明の組成物を処方する場合、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤、賦形剤等を共に使用してもよい。

該組成物の投与量は、組成物全体に関して、体重１ｋｇあたり約１μｇ〜５０ｍｇであってもよく、免疫細胞および幹細胞のような治療用細胞の成人のための投与量は、１日あたり１〜１０^８、１０〜１０^５、および１０^２〜１０^３であり得る。上記の投与は、一度に、または１日数回に分割された投与量で実施されることができる。しかしながら、該投与量および投与回数は、患者の体重、年齢および性別、ならびに疾患の重篤度および投与経路のような因子を考慮して決定され得る。

本発明の形態
以下、本発明を後述の実施例、比較例および実験例を参照して詳細に記載する。しかしながら、後述の実施例、比較例および実験例は、本発明を説明することを意図されており、本発明の範囲はそれに限定されない。

実施例１−３．凍結保存のための培地組成物の調製
凍結保存のための培地組成物を調製するために、５ｍｌのＤＭＳＯ、２５ｍｌのデキストラン４０、５０ｍｌのＡｌｂｕｍｉｎＩｎｊｅｃｔｉｏｎ、および細胞培養培地として２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を混合した（実施例１）。また、実施例２および３において、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、ＢＩＯＮＩＣＨＥＰＨＡＲＭＡ、米国）、デキストラン４０（ＤａｉＨａｎＰｈａｒｍ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、ＡｌｂｕｍｉｎＩｎｊｅｃｔｉｏｎ（ＧｒｅｅｎＣｒｏｓｓ、韓国）およびＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、米国）を含有する凍結保存のための培地組成物を、実施例１におけるのと同じ方法により、しかし下記の表１中に示される量で調製した。

比較例１−６．凍結保存のための培地組成物の調製
上記の実施例に対する比較例として、５ｍｌのＤＭＳＯおよび９５ｍｌのＡｌｂｕｍｉｎＩｎｊｅｃｔｉｏｎを混合し、凍結保存のための培地組成物を調製した（比較例１）。また、比較例２−６において、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、ＢＩＯＮＩＣＨＥＰＨＡＲＭＡ、米国）、デキストラン４０（ＤａｉＨａｎＰｈａｒｍ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、ＡｌｂｕｍｉｎＩｎｊｅｃｔｉｏｎ（ＧｒｅｅｎＣｒｏｓｓ、韓国）およびＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、米国）を含有する凍結保存のための培地組成物を、実施例１におけるのと同じ方法により、しかし下記の表１中に示される量で調製した。

実験例１．凍結および解凍後のＮＫ細胞の評価
１．１．ＮＫ細胞の凍結および解凍
ＮＫ細胞を実施例１−３および比較例１−６において調製した凍結保存のための培地組成物中で凍結させ、次いで解凍して、凍結保存のための培地組成物を評価した。

初めに、単核細胞をヒト末梢血（ソウル国際大学病院、韓国）から単離した。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムを用いて、ＣＤ３陽性細胞を該単離単核細胞から除去し、その結果得られたものを種細胞として使用した。一方、２，０００ｃＧｙでガンマ線を照射した単核細胞をＮＫ細胞培養のための支持細胞として使用した。該種細胞および支持細胞を５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３および１ｖ／ｖ％の血清を補足したＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＳＣＧＭ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、ドイツ）中で、０．５Ｘ１０^６−１Ｘ１０^６細胞／ｍｌで維持された濃度で培養した。該培養を１４〜２１日間、３７℃および５％ＣＯ_２の条件下で実施した。

培養されたＮＫ細胞を回収し、１０分間、４℃および１，５００ｒｐｍの条件下で遠心分離した。得られたペレットをＲＰＭＩ１６４０培地を用いて洗浄し、細胞数をカウントした。該細胞を１５ｍｌチューブ中へ１ｘ１０^８細胞／チューブで分注し、次いで、ペレットを得るために上記と同じ条件下で遠心分離した。得られたペレットを実施例１−３および比較例１−６において調製された凍結保存のための組成物中で凍結した。

下記の表２中に示す条件下で、細胞を制御速度凍結（ＣＲＦ）に付し、細胞凍結を実施するために、凍結された細胞を蒸気ＬＮ２タンク中で、一定期間保管した。該凍結細胞を回収し、恒温槽中で３７℃で急速に解凍した。該細胞を１０％ウシ胎仔血清を補足した、細胞体積の１０倍に相当するＲＰＭＩ１６４０培地中へ懸濁させ、次いで、１０分間、４℃および１，２００ｒｐｍの条件下で遠心分離して細胞を得た。

１．２．ＮＫ細胞の培養
得られた細胞を５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２および１０％ウシ胎仔血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中へ再懸濁させ、２ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度を得た。再懸濁した細胞（１０ｍｌ）をＴ７５フラスコ中に分注し、培養の３日目に等体積の培地を加え、７日間培養した。

１．３．生存細胞数および生存率の試験
培養ＮＫ細胞の生存細胞数および生存率をＡＤＡＭ細胞カウンターＡｃｃｕｓｔａｉｎキット（ＤｉｇｉｔａｌＢｉｏ）を用い、製造業者のマニュアルに従って測定した。

初めに、実験例１．２において培養した細胞をカウントし、ＰＢＳを用いて１ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度へ希釈した。希釈された細胞を丸底９６ウェルプレートの２つのウェル中へ１４μｌ／ウェルで分注した。総細胞数を測定することができるＴ溶液の１４μｌを該２つのウェルの１つへ加え、希釈された細胞と混合し、次いで、該混合物の１４μｌを回収し、カウンターチップのＴパネル中に入れた。一方、死細胞数を測定することができるＮ溶液の１４μｌを該２つのウェルのもう１つへ加え、希釈された細胞と混合し、次いで、該混合物の１４μｌを回収し、カウンターチップのＮパネル中に入れた。該チップをＡＤＡＭカウンター中へ挿入し、生存細胞数を測定した。結果を図１ａ−１ｄ中に示す。

図１ａおよび１ｃ中に示される、凍結細胞の解凍およびその次のＩＬ−２との培養後の回収率は、下記の表３および４中に示された凍結時点でのバイアル中の細胞数に基づいた、解凍およびＩＬ−２との培養後の生存細胞数のパーセンテージとして示された。

一方、図１ｂおよび１ｄ中に示される、凍結細胞の解凍およびその次のＩＬ−２との培養後の回収率は、下記の表５および６中に示された総細胞数に基づいた生存細胞数のパーセンテージとして示された。

図１ａ−１ｄおよび表３−６中に示すように、実施例１−３の凍結保存のための培地組成物を使用した場合、７日の培養後、細胞回収率および生存率は７０％以上という高さであった。一方、ＤＭＳＯおよびＡｌｂｕｍｉｎＩｎｊｅｃｔｉｏｎ（比較例１）、ＤＭＳＯ、デキストラン４０、およびＡｌｂｕｍｉｎＩｎｊｅｃｔｉｏｎ（比較例２）、ＤＭＳＯ、デキストラン４０、および１５ｖ／ｖ％未満のＡｌｂｕｍｉｎＩｎｊｅｃｔｉｏｎおよびＲＰＭＩ１６４０（比較例３−６）を含有する凍結保存のための培地組成物は、低い細胞回収率および生存率をもたらした。

１．４．ＮＫ細胞活性の評価
実施例１−３および比較例１−６の凍結された培地中で凍結および解凍されたＮＫ細胞の細胞活性を試験するために、腫瘍細胞をＮＫ細胞で処理し、腫瘍細胞に対する細胞破壊能を試験した。ここで、実験例１．１において解凍直後に得られたＮＫ細胞の活性および実験例１．２において培養後に得られたＮＫ細胞の活性をそれぞれ評価した。

初めに、腫瘍細胞であるＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ、米国）を、１０％ウシ胎仔血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃および５％ＣＯ_２の条件下で培養した。該培養細胞をトリプシン処理により回収し、培養培地中で１ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度へ懸濁させた。次いで、１ｍＭカルセインＡＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を加え、３０μＭの終濃度を得た。該細胞を１時間、３７℃および５％ＣＯ_２の条件下で培養し、該腫瘍細胞を蛍光標識した。

標識した腫瘍細胞を１０ｍｌの培養培地を用いて洗浄し、１ｘ１０^５細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させ、次いで、９６ウェル丸底プレート中へ１００μｌ／ウェルで分注した。実験例１．１および実験例１．２において解凍直後および培養後に得られた細胞を、ＮＫ細胞（エフェクター細胞、Ｅ）とＫ５６２細胞（標的細胞、Ｔ）の比がそれぞれ１０：１、３：１および０．３：１となるように混合し、次いで、プレートへ１００μｌ／ウェルで加えた。ここで、自然放出のため、腫瘍細胞を等量の培地と共に加え、最大放出のため、腫瘍細胞を等量の２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と共に加えた。

混合物を４時間、３７°Ｃおよび５％ＣＯ_２の条件下で反応させ、次いで、３分間、４°Ｃで２，０００ｒｐｍで遠心分離した。次いで、得られた上清１００μｌを黒ウェルプレートへ移し、蛍光検出器を用いて３８５ｎｍ／４５０ｎｍの条件下で測定した。このようにして得られた蛍光測定値を用いて、ＮＫ細胞による腫瘍細胞の溶解率（％）を後述の等式（１）により算出し、図２ａ−２ｄ中に示し、下記の表７−１０中に示した。ナチュラルキラー細胞ドナー数は表７において６であり、ナチュラルキラー細胞ドナー数は表８において３である。

[式１]

図２ａおよび２ｂ、および表７および８中に示すように、凍結細胞の解凍直後の腫瘍に対する細胞毒性は、アルブミンの含量が１０％以下、もしくは７０％以上いずれかである場合、実施例と比較してより低いことが分かった。一般に、活性化免疫細胞を凍結すると、該細胞の機能は、細胞の活性の減少により減退することが知られる。しかしながら、解凍細胞は、凍結保存培地の組成に応じて、種々の程度の活性を維持することが分かった。とりわけ、実施例３において、細胞が凍結後に解凍された場合に最も高いＮＫ細胞活性が維持されることが分かった。

一方、一定期間の培養後の凍結細胞の腫瘍細胞に対する細胞毒性の試験の結果を図２ｃおよび２ｄ、および上記の表９および１０中に示し、これらは全実施例および比較例が類似の細胞毒性を示すことを示した。該結果は、培地中に加えられたＩＬ−２によって、減少したＮＫ細胞の活性の培養中の回復によるものであると予期された。

実験例２．解凍後の腫瘍細胞の評価
実施例１−３および比較例１−６において調製された凍結保存のための培地組成物を腫瘍細胞の凍結のために同様に用いることができるのかを試験した。

初めに、ヒトＴリンパ腫細胞ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ、米国）およびヒト白血病細胞Ｋ５６２（ＡＴＣＣ、米国）を、１０％ウシ胎仔血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地および２０％ウシ胎仔血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で３７°Ｃおよび５％ＣＯ_２の条件下でそれぞれ培養した。該培養細胞を回収し、各培養培地中で懸濁させた。次いで、該ＨｕＴ７８細胞およびＫ５６２細胞をバイアル中に入れ、それぞれ１ｘ１０^７細胞／ｍｌおよび４ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度で凍結させた。該細胞凍結は、上記の実験例１．１中に記載されたのと同じ方法により実施された。該凍結細胞を各培養培地中で再懸濁させ、該細胞を継代培養して１ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度を得、４日間、３７°Ｃおよび５％ＣＯ_２の条件下で培養した。

培養された細胞を、実験例１．３におけるのと同じ方法により生存細胞数および生存率について測定した。ＨｕＴ７８細胞の生存細胞数および生存率を図３ａおよび３ｂ中に示し、Ｋ５６２細胞のものを図４ａおよび４ｂ中に示した。

結果として、実施例１−３の凍結保存のための培地組成物中、および比較例２の凍結保存のための培地組成物中の腫瘍細胞ＨｕＴ７８およびＫ５６２細胞の生存細胞数および生存率は、図３ａ−４ｂ中に示されるように、類似していることが分かった。一方、比較例１の凍結保存のための培地組成物は、著しく低い生存細胞数および生存率を示した。

Claims

培地組成物の総体積に基づいて、１８〜４０ｖ／ｖ％の２０％のアルブミン溶液、２３〜２７ｖ／ｖ％の１０％のデキストラン溶液、４〜６ｖ／ｖ％のジメチルスルホキシドおよび３０〜５２ｖ／ｖ％の細胞培養培地を含む、免疫細胞の凍結保存のための血清を含まない培地組成物。
免疫細胞がナチュラルキラー細胞である、請求項１に記載の血清を含まない培地組成物。
細胞と共に対象に直接投与される、請求項１に記載の血清を含まない培地組成物。
請求項１に記載の血清を含まない培地組成物が加えられる細胞を凍結する工程を含む、細胞の凍結保存のための方法。
請求項１に記載の血清を含まない培地組成物および活性成分としての免疫細胞を含む、がんまたは感染症を予防または処置するための医薬組成物。
免疫細胞がナチュラルキラー細胞である、請求項５に記載の医薬組成物。
請求項１に記載の血清を含まない培地組成物および活性成分としての幹細胞を含む、変性疾患を予防または処置するための医薬組成物。
幹細胞が間葉幹細胞である、請求項７に記載の組成物。
変性疾患が、脳神経障害、虚血性疾患、皮膚損傷、骨障害および変性関節症からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項７に記載の組成物。
請求項１に記載の血清を含まない培地組成物および活性成分としての間葉幹細胞を含む、免疫疾患を予防または処置するための医薬組成物であって、ここで、該免疫疾患は、移植片対宿主疾患、移植片拒絶、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、炎症性疼痛、神経障害性疼痛および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群より選択される、医薬組成物。