CN105076113B - 免疫细胞的冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞生物学领域，具体公开了免疫细胞的冻存方法。本发明所述免疫细胞的冻存方法，X‑VIVO15无血清培养基重悬单个核细胞，缓慢加入同体积的冻存液，制成细胞冻存悬液，降温至‑80℃后，‑196℃超低温冻存。实验表明，采用本发明所述免疫细胞的冻存方法冻存的细胞复苏后在细胞活率、细胞增殖数量上明显优于常规冻存方案冻存的细胞复苏得到的细胞，而对K562细胞的杀伤能力与未冻存细胞相当，保持了细胞的杀伤活性。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及免疫细胞的冻存方法，尤其涉及免疫细胞冻存及冻存后复苏的方法。
背景技术
免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色。免疫细胞包括吞噬细胞和淋巴细胞，淋巴细胞中的T细胞、B细胞是发挥特异性免疫的主要细胞群。从血液中分离出来的单个核细胞包括：T细胞、B细胞、NK细胞和DC细胞等，是免疫细胞治疗中的初始细胞来源，经各类细胞因子诱导扩增培养，得到一群具有高效杀伤活性的免疫细胞群。
目前免疫细胞的培养主要应用于肿瘤细胞免疫治疗。肿瘤细胞免疫治疗是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。肿瘤自体细胞免疫疗法适用于多种实体肿瘤，包括恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等实体瘤手术后防止复发，也可以用于多发性骨髓瘤、B淋巴瘤和白血病等血液系统恶性肿瘤的复发，对于大多数细胞免疫治疗的适应人群还可以用于上述肿瘤的进一步巩固治疗，达到延长生存期、提高生活质量和抑制肿瘤恶化的目的。
常见的免疫细胞治疗种类包括NK细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞、TIL细胞、LAK细胞、CART细胞等。所有这些经诱导和扩增培养的免疫细胞，他的初始细胞来源都是外周血或脐血的单个核细胞，而且是直接分离培养。随着年龄的增长，免疫细胞在体内的活性也会随之降低，所以在年轻时期冻存具有较高活性的免疫细胞，对于未来罹患肿瘤相关疾病的治疗可以起到很好的保障。因此免疫细胞冻存及冻存后的复苏培养具有非常大的意义。
目前，细胞冻存主要是采取-196℃超低温条件下的保存方案，在超低温条件下，细胞的代谢功能停滞，但并未死亡。而细胞复苏则主要采用冻存细胞在37℃快速解冻的方法，以恢复细胞的活性和功能。但是现有的免疫细胞冻存方法冻存过程中易形成冰晶损伤细胞，复苏后细胞活率低、细胞增殖数量不足、细胞易老化。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种免疫细胞的冻存方法。采用本发明所述免疫细胞的冻存方法冻存的免疫细胞复苏后细胞活率高、细胞增殖数量大、细胞不易老化。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种免疫细胞的冻存方法，X-VIVO15无血清培养基重悬单个核细胞，缓慢加入同体积的冻存液，制成细胞冻存悬液，降温至-80℃后，-196℃超低温冻存。
其中，在一些实施方案中，本发明所述的免疫细胞的冻存方法中所述冻存液由DMSO、自体血浆和X-VIVO15培养基组成，DMSO：自体血浆：X-VIVO15培养基的体积比为1:2:2。
在一些实施方案中，本发明所述的免疫细胞的冻存方法中所述冻存液预先于2-8℃预冷，以降低DMSO溶于冻存液时升温对细胞的损伤。
在一些实施方案中，本发明所述的免疫细胞的冻存方法中所述细胞冻存悬液中冻存密度为冻存密度为4×106cell/mL-6×106cell/mL。
在一些实施方案中，本发明所述的免疫细胞的冻存方法中所述自体血浆预先经56℃灭活30min，0.22μm滤膜过滤。
在一些实施方案中，本发明所述的免疫细胞的冻存方法中所述降温速度为：
温度＞-25℃时，1℃/min～2℃/min；
-25℃≥温度>-80℃时，5℃/min～7℃/min。
在一些优选实施方案中，本发明所述免疫细胞的冻存方法采用程序降温仪进行降温。
按照本发明，所述免疫细胞的冻存方法中所述免疫细胞的种类为本领域技术人员熟知的任意一种免疫细胞即可，并无特殊的限制。本发明中所述免疫细胞优选为NK细胞、CIK细胞或DC细胞。
本发明所述免疫细胞的冻存方法，X-VIVO15无血清培养基重悬单个核细胞，缓慢加入同体积的冻存液，制成细胞冻存悬液，降温至-80℃后，-196℃超低温冻存。实验表明，采用本发明所述免疫细胞的冻存方法冻存的细胞复苏后在细胞活率、细胞增殖数量上明显优于常规冻存方案冻存的细胞复苏得到的细胞，而对K562细胞的杀伤能力与未冻存细胞相当，保持了细胞的杀伤活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例6中初始分离的PBMC细胞中NKT细胞表面标记物CD3CD56表达情况图；
图2示实施例6中组2培养的NKT细胞表面标记物CD3CD56表达情况图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供进行详细说明。
实施例1：单个核细胞的分离
1.抽取外周血20mL，加到50mL离心管中，700g离心10min；
2.吸取上层血浆8-9mL至15mL离心管备用，下层血液加2倍体积的生理盐水稀释；
3.取新的50mL离心管，加入15mL淋巴细胞分离液，缓慢加入稀释后的血液，保证分层清晰。
4.700g离心20-30min，离心升降速降为零。
5.提取中间白膜层细胞，即得单个核细胞，加生理盐水清洗两遍，计数，细胞量为2×107-3×107。
实施例2、本发明所述免疫细胞冻存方法
1.自体血浆56℃灭活30min，0.22μm滤膜过滤，备用。
2.按DMSO：自体血浆：X-VIVO15培养基体积比为1:2:2的比例配制冻存液1，置于2-8℃冰箱预冷。
3.用2-3mL X-VIVO15无血清培养基重悬单个核细胞，缓慢加入同体积的冻存液1，制成4-6mL细胞冻存悬液，分4-6管冻存，每管1mL，冻存密度为：4×106cell/mL-6×106cell/mL。
4.用程序降温仪降温至-80℃，转入液氮罐冻存。
实施例3、常规冻存方法
按DMSO:FBS：X-VIVO15无血清培养基体积比为1:2:7的比例配制冻存液，冻存液重悬单个核细胞后液氮冻存。
实施例4、复苏方法及复苏后培养方法
细胞冻存管在37℃两分钟内解冻细胞，离心沉淀细胞后，直接加X-VIVO15无血清培养基重悬细胞，添加100-1000U/mL的IL-2、100-1000U/mL的OKT3、100-1000U/mL的IL-15、100-1000U/mL的IL-21进行NKT细胞培养。
实施例5：对比实验
按照实施例1所述方法抽取40mL外周血，分离得到4×107-8×107个单个核细胞。共6个管分成3组进行冻存，每组两管，每管1mL，细胞密度为5×106cell/mL。具体分组如下：
组1：采用实施例3所述冻存方案冻存，1个月后采用实施例4所述复苏及培养方法进行培养；
组2：采用实施例2所述冻存方案冻存，1个月后采用实施例4所述复苏及培养方法进行培养；
组3：2管细胞不进行冻存，直接按常规培养方法进行培养；
统计各组复苏后的细胞量及活率结果如表1所示。各组复苏培养后细胞增殖情况如表2所示。
表1各组复苏后的细胞量及活率
由表1结果可见，组2复苏后细胞量高于组1，组2复苏后细胞活率也高于组1，表明采用本发明所述冻存方法复苏后细胞量和活率高于常规冻存方法。
表2各组NKT细胞培养后细胞增殖情况
由表2结果可见，组1在第4天细胞未增殖，第12天细胞部分死亡；而组2细胞增殖明显，和组3的未经冻存直接培养得到的细胞量无统计学差异。表明采用本发明所述冻存方法复苏后细胞大量增殖，接近直接分离培养得到的细胞量；
以初始分离的PBMC细胞作为对照，对组2培养的细胞的细胞表面标志物进行检测，结果如图1-2所示。
图1-2的结果显示，NKT效应细胞为CD3+CD56+的细胞群，初始分离的PBMC中，CD3+CD56+细胞群只有2％，组2细胞中CD3+CD56+细胞群为24.9％。表明本发明所述免疫细胞的冻存方法经复苏培养后可以获得更高纯度的NKT效应细胞。
同时对组2和组3培养的细胞对K562细胞的杀伤能力进行检测，结果如表3所示。
表3组2、组3培养的NKT细胞对K562细胞的杀伤实验
由表3结果可见，组2、组3的细胞对K562的杀伤能力效果相当。说明本专利的免疫细胞冻存后复苏培养方案保持了细胞的杀伤活性。
Claims (6)
1.免疫细胞的冻存方法，X-VIVO15无血清培养基重悬单个核细胞，缓慢加入同体积的冻存液，制成细胞冻存悬液，降温至-80℃后，-196℃超低温冻存；所述冻存液由DMSO、自体血浆和X-VIVO15培养基组成，DMSO：自体血浆：X-VIVO15培养基的体积比为1:2:2。
2.根据权利要求1所述的冻存方法，所述冻存液预先于2-8℃预冷。
3.根据权利要求1所述的冻存方法，所述细胞冻存悬液中冻存密度为4×106cell/mL-6×106cell/mL。
4.根据权利要求1所述的冻存方法，所述自体血浆预先经56℃灭活30min，0.22μm滤膜过滤。
5.根据权利要求1所述的冻存方法，所述降温速度为：
温度＞-25℃时，1℃/min～2℃/min；
-25℃≥温度>-80℃时，5℃/min～7℃/min。
6.根据权利要求1所述的冻存方法，所述免疫细胞为NK细胞、CIK细胞或DC细胞。
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