ES2262346T3 - Celulas, procedimientos de cultivo y su uso en terapia de trasplantes autologos. - Google Patents

Abstract

Uso de una población celular huésped de células linfocitarias sanas, maduras, obtenidas de la sangre de un organismo huésped sano para la preparación de una composición celular de uso en una posterior terapia de trasplante terapéutico autólogo de una enfermedad o trastorno de dicho organismo huésped, en el que las células se obtienen a partir del organismo huésped antes de que se desarrolle o manifieste la enfermedad o el trastorno.

Description

Células, procedimientos de cultivo y su uso en terapia de trasplantes autólogos.

La presente invención se refiere a una terapia de trasplante autólogo y en concreto a la extracción de muestras de células o tejidos eucarióticos de un organismo huésped sano para posterior trasplante a ese huésped, después de un cambio temporal en el huésped, por ejemplo cuando surge la necesidad, por ejemplo, una necesidad terapéutica. Las ventajas son que las células mantenidas en animación suspendida (es decir células latentes) pueden manipularse y/o revitalizarse en una fecha futura cuando sea necesario, por ejemplo para terapia. Las muestras celulares en un estado de animación suspendida también pueden acumularse realizando diversos ciclos de recogida de muestras primarias del/de los mismo(s) organismo(s) fuente antes de la manipulación y/o revitalización.

El mantenimiento y la replicación de células eucarióticas en cultivo se practican desde hace años. Diversos estudios de principios de este siglo (Proc. Soc. Exp. Biol.. Med. 4 (1907) 140; J. Exp. Med. 15 (1912) 516) han demostrado que es posible extraer muestras de tejido animal o humano y mantener las células de las mismas en cultivo in vitro durante varios espacios de tiempo según las condiciones de cultivo. Los primeros cultivos consistían en sumergir tejido o células animales en sangre, o componentes sanguíneos como suero. La sangre o el suero eran el componente principal del medio en el que se cultivaban las muestras de tejido/célula. No obstante, como nuestro conocimiento sobre los requisitos in vitro de células ha aumentado, el uso de suero o componentes sanguíneos en un medio de cultivo de célula/tejido se ha reducido hasta el punto de que ahora existen medios completamente definidos que proporcionan todos los nutrientes y complementos necesarios para mantener al menos algunos tipos de célula en cultivo (véase por ejemplo la obra de Freshney, Tissue Culture of Animal Cells, (Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Wiley Liss, 1994)).

No obstante, el mantenimiento de células eucarióticas en cultivo durante periodos suspendidos siempre ha estado y sigue estando cargado de dificultades. El problema más importante es que generalmente no es posible mantener células eucarióticas tomadas de organismos multicelulares en cultivo primario durante más de unos cuantos días a semanas. Esto ocurre porque las células en cultivo primario tienen un periodo de vida limitado. En algunos casos, sin embargo, su mantenimiento puede prolongarse indefinidamente. Por ejemplo, una única célula, o un grupo celular, puede experimentar cambios genéticos que le permitan mantener replicación celular continua en un entorno de cultivo in vitro. Normalmente, estos cambios genéticos implican mutaciones que activan proto-oncogenes para que se conviertan en oncogenes, y/o mutaciones que limitan o niegan la actividad de genes supresores tumorales, lo que conduce a la pérdida de inhibición de la replicación y al desarrollo de inmortalidad celular (Trends in Genetics 9 (1993) 138). Nuestro conocimiento actual implica que las células tumorales originan cánceres no a causa de la activación súbita de oncogenes inmortalizadores sino a causa de mutaciones en genes que normalmente regulan la capacidad celular de limitar su propia replicación. Estos acontecimientos genéticos, que tienen lugar in vivo e in vitro, han conducido a la generación de organismos multicelulares de líneas celulares eucarióticas que pueden mantenerse en cultivo continuo (Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Wiley Liss, 1994).

Aunque es posible mantener líneas celulares en cultivo, su capacidad de experimentar replicación continua puede hacer que resulte inconveniente o indeseado el hecho de hacerlo. Para ahorrar recursos, sería preferible poder almacenar células hasta que fueran necesarias para cultivo. Se han desarrollado tecnologías que permiten este almacenamiento, con mucha información que surge de estudios con organismos procarióticos.

El primer trabajo con organismos procarióticos como bacterias y virus mostró que era posible mantenerlos en un estado de latencia durante largos periodos de tiempo sin afectar a su capacidad de sobrevivir y replicarse una vez reanimados, o revitalizados, de su estado de latencia. Se mostró que los organismos procarióticos pueden ponerse en estado de latencia (animación suspendida) utilizando una serie de procedimientos como congelación, congelación-secado, secado o poniéndolos en varias soluciones orgánicas o inorgánicas con o sin congelación posterior. Las soluciones incluyen dimetilsulfóxido (DMSO), etanol, éter, glicerol, cloruro sódico tamponado con fosfato, y suero, o mezclas de las mismas, o con cualquier otra sustancia que pueda prolongar la vida en almacenamiento pero no está limitada a ellas.

Muchos de los procedimientos, si no todos, para poner o mantener células procarióticas en un estado de latencia también se han aplicado a células eucarióticas.

Mantener células en un entorno de cultivo permite llevar a cabo manipulaciones en células in vitro, y esta ventaja ha conducido al desarrollo de ensayos basados en células en tecnología de diagnóstico. Por consiguiente, se ha mostrado que el cultivo celular, ya sea antes de inducir a latencia o después de la revitalización celular, tiene aplicaciones importantes para la medicina de diagnóstico así como para la ciencia básica (Bone 22 (1998) 7; J Bone Min Res 13 (1998) 432).

Además de a diagnosis médicas, los procedimientos de cultivo celular también se han aplicado a terapias médicas. Por ejemplo, en casos en que los pacientes padecen leucemia, una técnica para aliviar la enfermedad es erradicar las células tumorales del paciente mediante radioterapia, quimioterapia y/o cirugía. No obstante, la radioterapia y la quimioterapia, que aparentemente son los únicos tratamientos prácticos para enfermedades sistémicas y/o metastásicas, también pueden destruir o mermar las células normales hematopoyéticas no tumorales del paciente. Por consiguiente, es una práctica normalizada sustituir las células normales mermadas del paciente por las de la médula ósea de un donante. A menudo el donante es un pariente cuyo tipo de tejido es similar al del paciente, y por consiguiente es menos probable que el paciente rechace el tejido del donante (Adv Immunol 40 (1987) 379).

Además de la posibilidad de que el huésped rechace las células injertadas, también existe el problema potencial de la enfermedad del injerto contra el huésped (GVH). La gran mayoría de linfocitos en una muestra de médula del donante son inmaduros e incapaces de obtener una respuesta inmunitaria desarrollada sin experimentar primero un proceso de maduración. La maduración tiene lugar cuando los linfocitos se procesan a través del timo. Si se procesan linfocitos inmaduros del donante a través del timo del nuevo huésped, aceptarán al huésped como "propio". No obstante, es inevitable que una proporción de linfocitos T del donante experimenten maduración a través del timo del donante antes del trasplante, y, por consiguiente, pueden considerar al receptor como extraño. Si ese es el caso, los linfocitos-T maduros del donante pueden intentar atacar a las células del huésped lo que conduce a la enfermedad GVH (Immune Rev 157 (1997) 79).

Para reducir la posibilidad de que el injerto rechace al huésped, las muestras medulares del donante pueden arrastrarse con, por ejemplo, anticuerpos que reconocen específicamente y se fijan a las células T maduras que permiten su extracción o lisis, antes del trasplante (Curr Op Oncol 9 (1997) 131). Por consiguiente, puede verse que el cultivo in vitro de células humanas del donante y su manipulación antes del injerto es un procedimiento reconocido en terapia de trasplante.

Para el tratamiento de enfermedades como leucemias y linfomas es con frecuencia más práctico proporcionar médula del donante mucho antes de que sea necesario para trasplantarla al paciente. En estos casos, la muestra medular del donante se pone en estado latente por ejemplo añadiendo DMSO a la muestra seguido de congelación de la muestra. La muestra del donante puede mantenerse en un estado congelado, potencialmente, durante muchos años antes de utilizarlo como injerto, con muy poco deterioro. Además, las células del donante pueden manipularse, por ejemplo extraer los linfocitos-T maduros, ya sea antes o después de la congelación. La capacidad de almacenar las muestras medulares durante largos periodos ha permitido establecer bancos de donantes de médula para apoyar los programas de tratamiento para pacientes con varias leucemias y linfomas (Bone Marrow Transpl 17 (1996) 197).

El reconocimiento de que eran los linfocitos-T maduros de la médula del donante los que causaban la enfermedad de GVH, y el desarrollo de las tecnologías para extraerlos eficazmente de la médula del donante, ha ayudado a hacer avances significativos en el aloinjerto de médula ósea.

Por definición, aloinjerto significa injertar o trasplantar células o tejido entre distintos miembros de la misma especie; un xenoinjerto es un trasplante de tejido/células entre miembros de distinta especie; y un autoinjerto es un injerto de tejido/célula de un paciente al mismo paciente.

Antes de los avances científicos que hicieron factible el autoinjerto para el tratamiento de linfoma y leucemia, el trasplante de médula ósea estaba limitado al autoinjerto (Stem Cells 13 (Suppl 3) (1995) 63). Como se ha definido anteriormente, en el autoinjerto se extraen células/tejido de un individuo, y se injertan otra vez en el mismo individuo. El autoinjerto sigue siendo de uso frecuente, y es particularmente relevante en el tratamiento de quemaduras en las que se extrae piel de las zonas ilesas del cuerpo y se injerta para ayudar a reparar/regenerar las áreas de la piel dañadas (Burns 24 (1998) 46). El autoinjerto también es común en cirugía ortopédica en la que se coge el hueso del propio paciente por ejemplo de la pelvis, de la costilla o de la barbilla y se utiliza para aumentar/reparar el hueso en otra zona del cuerpo, por ejemplo la cara (J Oral Maxillo surg 54 (1996) 420).

El autoinjerto para el tratamiento de leucemias y linfomas tiene ventajas e inconvenientes. La ventaja clave para el paciente es que no hay problema de rechazo (ni por parte del paciente ni por parte del injerto) cuando se devuelven al paciente las células/tejidos del paciente. El principal inconveniente, sin embargo, es que las células/el tejido injertados extraídos para injerto posterior pueden contener células enfermas. El valor del autoinjerto, por consiguiente, depende de la capacidad de obtener o producir tejido del donante que esté sano.

Las leucemias y los linfomas, por definición, son enfermedades que afectan a las células de la sangre y la linfa y el consenso médico es que sembrar o infiltrar células enfermas en la médula ósea puede suceder de forma irregular, puede involucrar zonas específicas de la médula ósea, y/o ocurrir tarde en el comienzo de la enfermedad. Por lo tanto, el fundamento para el autoinjerto en pacientes con leucemia/linfoma es que, una vez que el paciente se ha tratado con radioterapia y/o quimioterapia para destruir las células tumorales, debería ser posible devolverles su propia médula ósea básicamente sana.

Para garantizar todavía más que la muestra autoinjertada es básicamente sana, puede tratarse de varias formas. Por ejemplo, puede purgarse separando/destruyendo las células tumorales residuales en la muestra. Un procedimiento de purga común, por ejemplo, es aplicar anticuerpos que identifican las células tumorales para localizar las células tumorales en la muestra, después pueden extraerse las células tumorales utilizando tecnología de clasificación celular como la clasificación celular activada por fluorescencia (Curr Op Hermatol 4 (1997) 423).

No obstante, el valor del autoinjerto para el tratamiento de enfermedades metastásicas o sistémicas como la leucemia o el linfoma sigue siendo cuestionable, puesto que la muestra del donante todavía puede contener algún elemento de la enfermedad que no puede purgarse completamente con las tecnologías actuales. La calidad del autoinjerto también dependerá del estado de la enfermedad en el material del donante, por ejemplo el tipo y la naturaleza agresiva de las células implicadas, la capacidad de las células enfermas para sembrar la médula, y el momento del comienzo de la enfermedad en que se tomó la muestra del donante. En esencia, pues, el valor de un autoinjerto en estas circunstancias es empírico y variará considerablemente entre los pacientes individuales que presentan varios síntomas de enfermedad proliferativa.

Siguen haciéndose avances en la terapia, y nuestro mayor conocimiento de los procesos de enfermedad nos ayuda a modificar y replantear nuestras técnicas terapéuticas para aliviar la enfermedad y el sufrimiento. Este conocimiento ha avanzado mucho gracias a las mejoras tecnológicas en el campo de la biología molecular. Actualmente estamos en posición de seguir la patogénesis de las enfermedades a un nivel molecular, y reconocer la importancia de la estructura genética de un individuo para predisponerlo a ciertas enfermedades. Por ejemplo, somos conscientes de que algunos individuos, a causa de su estructura genética, son propensos a cánceres, por ejemplo, leucemias y trastornos vasculares como cardiopatía. También pueden estar predispuestos a enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y la corea de Huntington, así como a enfermedades endocrinas y exocrinas como la diabetes y el hipotiroidismo, y trastornos del esqueleto como la osteopenia asociada a la edad, la osteoporosis, la artritis y la enfermedad periodontal. Por consiguiente, a través de pruebas genéticas, ahora se puede identificar a aquellos individuos con predisposición a sufrir enfermedades debilitadoras.

Además, nuestro conocimiento del sistema inmunitario del cuerpo, y en concreto de la forma en que reconoce y mata células tumorales e infectadas por virus, sigue avanzando. Ahora sabemos que para obtener inmunidad celular, una célula desencadenante (por ejemplo una célula tumoral o infectada por virus) debe copresentar un tumor limitado a HLA de clase 1 o un epitopo viral con señales de peligro como GM-CSF y/o TNF-\alpha, para que las células presentadoras de antígeno (APC) del sistema inmunitario expresen señales coestimuladoras como B7 y IL-12 conjuntamente con el antígeno a la población de linfocitos-T citotóxicos interactivos (CTL). La copresentación conduce a la producción de clones de las células activadas y de memoria (para revisar véase Nature Medicine Vaccine Supplement 4 (1998) 525). En ausencia de estas señales adicionales, las células-T limitadas al antígeno HLA-I que reconocen las células desencadenantes se procesan para destrucción o desensibilización (un proceso corporal presumiblemente dispuesto para evitar el desarrollo de por ejemplo una enfermedad autoinmune). La inducción de esta tolerancia es causada o bien por ignorancia, o bien energía o deleción física (Cold-Spring Harbour Symp Quant Biol. 2 (1989) 807; Nature 342 (1989) 564; Cell 65 (1991) 305; Nature Med 4 (1998) 525). Ahora es evidente que las células tumorales no copresentan automáticamente peligro y/o señales coestimuladoras. Por tanto, la manifestación de un tumor puede conducir a la erradicación de las muchas células que proporcionan inmunidad celular contra el tumor. Por consiguiente, un paciente que presenta un cáncer, leucemia, un linfoma o sarcoma, etc., ya puede haber eliminado su capacidad innata para destruir el tumor, por defecto. No obstante, si se hubieran extraído los linfocitos-T requeridos, o una muestra de los mismos, del paciente antes del comienzo de la enfermedad proliferativa, ahora podría devolverse la población relevante de células-T al paciente, tras la coestimulación necesaria de células-T, para aliviar la enfermedad.

La presente invención está basada en nuestro reconocimiento de esta posibilidad, concretamente el concepto de extracción de células o tejidos de un organismo huésped sano para posterior trasplante al mismo organismo huésped en un procedimiento de trasplante autólogo (autogénico), cuando surge la necesidad o el deseo de hacerlo. En un aspecto, la presente invención proporciona así el uso de una población celular huésped de células linfocitarias sanas, maduras obtenidas de la sangre de un organismo huésped sano para la preparación de una composición celular para uso en terapia de trasplante autólogo terapéutico de una enfermedad o trastorno de dicho organismo huésped, en el que las células se obtienen del organismo huésped antes de que se manifieste o desarrolle el trastorno o la enfermedad.

También se describe un procedimiento de terapia de trasplante autólogo, comprendiendo dicho procedimiento la obtención de una población de células huésped de un organismo huésped sano; y la preparación de una composición celular de dicha población celular huésped para posterior trasplante a dicho organismo huésped.

La memoria descriptiva también describe una composición celular que comprende una población celular obtenida de un organismo huésped sano para uso en la posterior terapia de trasplante autólogo de dicho organismo huésped.

El organismo huésped puede ser un organismo eucariótico, pero preferentemente será un animal, más preferentemente un mamífero, y más preferentemente un ser humano. Otros organismos huésped representativos incluyen ratas, ratones, cerdos, perros, gatos, ovejas, caballos y ganado.

El término "sano" se utiliza en este documento para describir un estado en el que el organismo huésped no padece, o no muestras síntomas, de enfermedad o trastorno, que se pretende tratar posteriormente mediante el procedimiento de trasplante.

Además, en algunas formas de realización de la invención, el organismo huésped no está preferentemente predispuesto a, o expuesto a riesgo de, ninguna enfermedad o ningún trastorno en concreto por ejemplo, no muestra preferentemente ningún síntoma o ninguna manifestación que prediga una enfermedad o un trastorno posterior. Asimismo, preferentemente el organismo huésped no padece ninguna herida o daño que pueda dar lugar a una dolencia anticipada o esperada. Una idea o concepto principal detrás de la presente invención es recoger o recolectar las células huésped del organismo huésped en una etapa en la que no hay pronóstico, indicio, o sospecha directos de que pueda desarrollarse una enfermedad o un trastorno concretos, para uso contra un posible acontecimiento futuro o imprevisto, o un acontecimiento que puede ocurrir simplemente por casualidad, más que por enfermedad o dolencia pronosticada, sospechada o anticipada.

También se incluye la extracción de células de una zona o área "sana" del cuerpo del organismo huésped, aunque otras áreas o zonas del cuerpo o células o tejidos del cuerpo puedan verse afectadas por una enfermedad o un trastorno. Lo que se requiere es que las células extraídas no estén enfermas es decir, "están sanas" como se ha definido anteriormente.

Las células se obtienen del organismo huésped antes de que se desarrolle o manifieste alguna enfermedad o algún trastorno, y más preferentemente cuando el organismo huésped goza en general de buena salud, y preferentemente no está inmunocomprometido de alguna forma.

De forma ventajosa, por consiguiente, las células huésped se obtienen de organismos huésped cuando son jóvenes, preferentemente en la adolescencia o a principios de la edad adulta. En el caso de seres humanos, el muestreo de células a edades de aproximadamente 12 a 30 años, preferentemente de 15 a 25. Especialmente preferentemente, el muestreo es en la edad de 16 ó 17 hacia adelante, por ejemplo en un intervalo de edad de 16 a 30 años, 17 a 30 años o 18 a 30 años, o quizás de 18 a 35 ó 40 años. Así se prefiere que las células se obtengan cuando el organismo huésped está maduro, o alcanzando la madurez, pero antes de que el proceso de envejecimiento o senectud haya comenzado de forma significativa. En concreto, se prefiere y es ventajoso que el sistema inmunitario del organismo huésped esté maduro o plenamente desarrollado. No obstante, se incluye la obtención de células fuera de los intervalos, y las células pueden obtenerse en cualquier etapa de vida posnatal por ejemplo de organismos huésped jóvenes, por ejemplo a mitad o finales de la infancia, o incluso en niños, o de individuos más viejos, mientras estén sanos. De esta manera se excluyen los organismos huésped fetales de la presente invención y no se incluye la muestra de células fetales.

Contrariamente al muestreo de sangre umbilical, por ejemplo, la ventaja de la presente invención es que coger las células de huéspedes posnatales o más viejas permite recoger muestras múltiples, aumentando por consiguiente la oportunidad de almacenar el número suficiente de células. Además, el muestreo de huéspedes jóvenes o más viejos supera los requisitos éticos como proporcionar consentimiento informado.

Se prefiere el muestreo de organismos huésped adolescentes o adultos puesto que las células muestreadas, de sangre en concreto, contendrán una mayor proporción de valiosas células-T maduras capaces de reconocer poblaciones celulares aberrantes, como células cancerígenas o células infectadas por virus. Así, cuando se utilizan las muestras sanguíneas, es ventajoso que se tomen de un individuo con un sistema inmunitario maduro (es decir no fetal o
neonatal).

El término "autólogo" se utiliza en este documento para referirse a que el trasplante es en el mismo organismo (es decir, el mismo individuo) del que se han extraído las células huésped. Así, se pretende el trasplante autogénico (de un paciente al mismo paciente) o autoinjerto.

"Trasplante" se refiere a cualquier procedimiento que implica la introducción de células en un organismo. Así, se incluye cualquier forma de trasplante o injerto conocido en la técnica.

"Terapia de trasplante" se refiere a cualquier procedimiento que implica trasplante de células. Se cubre tanto la terapia terapéutica (por ejemplo, curativa o paliativa, o que alivie los síntomas) como la terapia profiláctica (es decir, preventiva o protectora). Así, el término "terapia de trasplante" incluye el trasplante de células a un organismo huésped que necesita las mismas, o con necesidad anticipada, esperada o sospechada de las mismas, por cualquier motivo. De forma ventajosa, la terapia de trasplante es tratar o aliviar una enfermedad o trastorno que posteriormente desarrolla, o amenaza, por ejemplo, un cáncer o una infección, o una dolencia degenerativa (por ejemplo, neurodegene-
rativa).

El término "organismo huésped" como se utiliza en este documento significa el cuerpo posnatal, y no incluye tejido "residual" o "desechable" que no forman parte del cuerpo en sí mismos. Así, no se incluye el cordón umbilical y la placenta. No obstante, puede utilizarse cualquier parte del cuerpo real del organismo huésped como la fuente de las células huésped.

Un tipo de célula linfocitaria preferido según la invención es el linfocito-T (una célula-T). Se prefieren concretamente los linfocitos-T maduros.

La enfermedad o el trastorno que pueden tratarse mediante terapia de trasplante pueden ser cualquier enfermedad o trastorno conocido por el hombre. Así se incluye cualquier condición de dolencia, enfermedad, trastorno o anormalidad del cuerpo. Puede hacerse mención por ejemplo, de las infecciones, por ejemplo enfermedades que surgen de actividad patogénica, por ejemplo infecciones bacteriales, fúngicas o virales, o infecciones por cualquier otro organismo, por ejemplo organismos unicelulares u otros parásitos; cualquier dolencia maligna o premaligna; dolencias proliferativas o hiperproliferativas; o cualquier enfermedad o enfermedades que surgen o derivan de o están asociadas a otra alteración o anormalidad funcional, en las células o los tejidos del cuerpo, por ejemplo, expresión aberrante del gen o daño de la célula o el tejido (ya sea inducido o causado por causas internas o externas, por ejemplo, envejecimiento, herida, trauma o infección, etc.), o enfermedades idiopáticas (por ejemplo, la enfermedad de Parkinson).

De forma ventajosa, la presente invención tiene utilidad concreta en la terapia de dolencias crónicas (es decir, enfermedades o trastornos crónicos).

Así las enfermedades o trastornos representativos incluyen cualquier cáncer (ya sea de tejidos sólidos del cuerpo (por ejemplo, tumores de mama o de próstata), o de tejidos hemopoyéticos u otras células individuales, en concreto leucemias o linfomas, trastornos vasculares, trastornos neurales que incluyen en concreto dolencias neurodegenerativas, enfermedades endocrinas o exocrinas y trastornos del esqueleto, como se ha tratado anteriormente, o cualquier dolencia asociada al envejecimiento o a la senectud. Puede hacerse mención especial a la osteoporosis y a

\hbox{la osteoartritis.}

Una forma de realización preferida de la invención representa usos de la invención para la terapia del cáncer, e incluye cánceres de cualquier célula o tejido del cuerpo. La invención no está limitada a un tipo cualquiera de cáncer (por ejemplo, leucemia, linfoma, carcinoma o sarcoma), ni está limitada a oncogenes específicos o epitopos de gen tumoral supresor como ras, myc, myb, fos, fas, retinoblastoma, p53, etc. u otros epitopos marcadores de células tumorales que se presentan en un modo limitado a antígeno HLA de clase I. La presente invención incluye para la terapia todos los cánceres de pecho, estómago, colon, recto, pulmón, hígado, útero, testículo, ovario, próstata o tumores cerebrales como gliomas, astrocitomas y neuroblastomas, sarcomas como rabdomiosarcomas y fibrosarcomas.

Otra forma de realización preferida de la invención es el uso de la invención para la terapia de infecciones, concretamente infecciones por virus, incluyendo VIH y otras infecciones que pueden tener una fase latente.

La población celular huésped que se utiliza según la invención para un procedimiento posterior de trasplante al organismo huésped, puede utilizarse en cualquier momento adecuado o deseado después de la extracción del organismo huésped. En otras palabras, una muestra de tejido o célula extraída de un individuo puede utilizarse en una fecha futura cuando se necesite para uso en terapia. De forma ventajosa, no obstante, la invención permite que el trasplante posterior se realice en un intervalo de tiempo más largo tras la extracción celular, por ejemplo, de 3 meses a varios años (por ejemplo, hasta 80 años o más). Así, la invención permite extraer células sanas, no enfermas de un individuo cuando goza de buena salud, o de buen estado inmunológico y utilizarlas, muchos años después, para terapia de un individuo, cuando se desarrolla un problema. Así los intervalos de tiempo representativos preferidos para trasplante posterior incluyen de 6 meses a 70 años, de 1 a 50 años, y de 1 a 30 años o de 5 a 30 años. Las condiciones y los procedimientos de criopreservación convencional permiten dichos periodos (Scand J. Haematol. 10 (1977) 470); Int. J. Soc. Exp. Haematol. 7 (1979) 113).

La población celular huésped puede obtenerse o extraerse del organismo celular huésped de cualquier modo adecuado. Ello depende de las células y la localización en el cuerpo del que deben obtenerse.

Recientemente se han hecho avances sobre el modo en que pueden obtenerse las células para posterior injerto. La llegada de la biología molecular nos ha ayudado a entender más claramente la biología básica del crecimiento y el funcionamiento celular en estado sano y enfermo. Por ejemplo, las investigaciones sobre los agentes que regulan la hematopoyesis han conducido al aislamiento de una serie de factores que influyen en la proliferación y diferenciación de linfocitos - éstos incluyen las citoquinas, como la serie interleucina IL-1-IL-18 y los leucotrienes; y factores de crecimiento como TNF, TGF, FGF, EGP, GM-CSF, G-CSF y otros. Una serie de estos factores están ahora disponibles comercialmente para uso clínico, y se ha demostrado que algunos aumentan considerablemente el número de células linfocitarias y, en concreto, de linfocitos-T inmaduros en la sangre periférica. Su administración al organismo huésped significa que, tras unos días para permitir un efecto, es posible filtrar grandes cantidades de las células de interés directamente de la sangre del huésped sin la necesidad de muestrear la médula (Stem Cells 15 (1997) 9). La tecnología para extraer linfocitos de la sangre, extrayendo sangre del paciente, pasándola a través de un separador de células y después devolviéndola al paciente, todo ello simultáneamente de forma virtual, ha sido válida durante muchos años (Practical Immunology, 3ª edición, Blackwell Scientific Publications, 1989).

La población celular extraída puede almacenarse, cultivarse, manejarse, manipularse, o tratarse de cualquier forma conocida o deseada para posterior trasplante (es decir, para preparar la composición celular para trasplante). Los procedimientos de manejo, cultivo y almacenamiento de células son bien conocidos en la técnica y se describen ampliamente en la bibliografía, y puede utilizarse cualquier procedimiento normalizado. Las células pueden almacenarse en cualquier medio apropiado o deseado, por ejemplo como se conoce en la técnica. (Véase por ejemplo, la obra de Freshney (mencionada anteriormente) sobre requisitos de las células huésped y el documento WO 98/33891 para la preparación de linfocitos).

La población celular huésped puede ponerse apropiadamente en un estado de latencia. El término "latencia" como se utiliza en este documento incluye cualquier estado de animación suspendida o estasis, y los procedimientos para lograrlo son bien conocidos en la técnica, como se ha descrito anteriormente. Puede utilizarse cualquiera de los procedimientos conocidos (véase por ejemplo la obra de Freshney mencionada anteriormente). Así, las células pueden aguantarse o mantenerse en un estado quiescente, inactivo o no proliferativo.

Según un procedimiento preferido, las células se congelan preferentemente a una temperatura inferior a -160ºC.

Un medio concreto preferido de lograr la latencia es congelar las células al punto de ebullición del helio (He), es decir aproximadamente a -269ºC o inferior.

Así, en otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para hacer y/o mantener latentes las células linfocitarias, comprendiendo dicho procedimiento la congelación de dichas células a una temperatura de o inferior a -269ºC.

Como se describe en la obra de Freshney (mencionada anteriormente), las células pueden estar suspendidas en un medio apropiado (por ejemplo que contenga 5-10% de DMSO) y enfriadas a una velocidad controlada, por ejemplo de 1ºC a -70ºC por minuto, después en N_{2} líquido/gaseoso. Estos procedimientos convencionales pueden adaptarse para enfriar las células en mezclas de He/N_{2} o He.

Se han obtenido resultados que muestran que utilizando (es decir la temperatura inferior) pueden obtenerse mejoras en la viabilidad a largo plazo de las células. Cuando se multiplica por 10-20 años por ejemplo, esta mejora en la viabilidad puede ser importante en el almacenamiento satisfactorio de las células (véase ejemplo 6 más adelante).

Los procedimientos alternativos para lograr y/o mantener la latencia celular incluyen enfriamiento a 4ºC.

Si se desea se pueden cultivar las células, por ejemplo como parte de un proceso de tratamiento o modificación (véase más adelante) o pueden ampliarse es decir, pueden cultivarse para aumentar el número de células. Por ejemplo, las células pueden experimentar un pase, según procedimientos bien conocidos en la técnica. El cultivo puede hacerse antes o después del periodo de latencia o en ambos momentos.

Antes del trasplante, las células también o alternativamente pueden manipularse o modificarse de algún modo, por ejemplo, genéticamente o funcionalmente y/o por inducción o modulación de su diferenciación. De nuevo, como se ha descrito anteriormente, es conocido en la técnica y puede utilizarse cualquier procedimiento conocido o normalizado. (Véanse por ejemplo, los documentos WO 98/06823, WO 98/32840 y WO 98/18486). Esta modificación o manipulación puede llevarse a cabo antes o después de la latencia, o en ambos momentos. Las modificaciones/manipulaciones no están limitadas temporalmente, porque la secuencia y/o el número de manipulaciones es flexible.

Así, las intervenciones genéticas pueden incluir la regulación o modificación de la expresión de uno o más genes, por ejemplo, el aumento o la reducción de la expresión del gen, la desactivación o eliminación de uno o más genes, la sustitución del gen, la expresión de uno o más genes heterólogos, etc. También pueden utilizarse las células como fuente de núcleos para transferencia nuclear en células madre.

Pueden exponerse o ponerse en contacto las células con factores, por ejemplo citoquinas, factores de crecimiento, etc. que pueden modificar su crecimiento y/o actividad, etc, o su estado de diferenciación, etc. Las células también pueden tratarse para separar o aislar selectivamente o enriquecer tipos de células deseados o para purgar células no deseadas.

Así, por ejemplo se ha tratado anteriormente un procedimiento de modificación de célula-T, en el que las células-T se coestimulan antes del trasplante.

Alternativamente, las células hematopoyéticas pueden copresentarse con antígeno tumoral limitado a HLA de clase 1 y B7 y/o IL12, para producir células activadas y células-T de memoria. Entonces la muestra puede devolverse al organismo huésped antes del comienzo de la enfermedad, como una terapia profiláctica. Alternativamente, las células que presentan antígenos que se copresentan (APCs) pueden ser devueltas al huésped junto con las células T activadas y/o de memoria. Alternativamente, las células pueden exponerse al tumor huésped in vitro con señales adecuadas de peligro y copresentación de moléculas coestimuladoras, antes de devolverse al huésped. Como con nuestro documento WO 96/15238 dirigido a terapia de linfocitos-T, el CTL del huésped puede modificarse genéticamente para reconocer el tumor antes de la sustitución. Las alternativas en este párrafo proporcionan interacciones funcionales entre células hematopoyéticas ya sea antes o después de un periodo de latencia o combinación.

Después de la latencia, se revitalizan las células antes de utilizarlas en el trasplante. Una vez más, esto puede lograrse de cualquier modo apropiado conocido en la técnica, y puede utilizarse cualquier procedimiento para revitalizar o reanimar las células.

Esto puede lograrse apropiadamente, por ejemplo, arrastrando y/o diluyendo las células, por ejemplo, como se describe en los ejemplos. Se conocen ampliamente técnicas para revitalizar en la técnica (véase por ejemplo la obra de Freshney citada anteriormente). Las células pueden arrastrarse mediante agitación suave del recipiente que contiene las células en agua a 37ºC, seguido de dilución de DMSO en 1% o menos, por ejemplo, con medio, o suero del paciente, etc. Las células pueden implantarse inmediatamente o después de la recuperación en cultivo. La revitalización está pensada para restablecer la utilidad de las células, por ejemplo en profilaxis o terapia curativa.

La invención se refiere al reconocimiento de que una muestra de tejido de un individuo sano puede ponerse en un estado de latencia. El tejido puede entonces revitalizarse y devolverse al mismo individuo cuando se necesite en una fecha posterior. Se pretende injertar el tejido revitalizado 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más meses o 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más años después de su extracción del paciente para aliviar o proteger contra enfermedades, para ralentizar el progreso de la enfermedad, o para aumentar y/o apoyar el funcionamiento del tejido restante normal, o dañado, del paciente. La invención se distingue claramente de la congelación de células de la médula ósea de pacientes con por ejemplo, leucemia, y de la congelación de gametos, por ejemplo, esperma, antes del tratamiento de pacientes con por ejemplo, leucemia infantil, porque los pacientes ya están enfermos. También se distingue de pacientes que proporcionan sangre para almacenamiento refrigerado para posible uso posterior, por ejemplo, en una operación posterior, por el mismo motivo. Además, comúnmente la duración del almacenamiento para el posible retorno de esta muestra de sangre es de hasta un mes. Igualmente, individuos sin ninguna anormalidad diagnosticada pueden escoger proporcionar sangre para almacenamiento refrigerado antes de viajar al extranjero para uso prospectivo. Este uso puede incluirse en tratamiento de hipovolemia tras mucha pérdida de sangre, esto puede ocurrir después de un accidente de tráfico u otros traumas, pero de nuevo se trata de un corto periodo de tiempo de almacenamiento de aproximadamente un solo mes y no se pretende un uso en enfermedades futuras por ejemplo, una enfermedad crónica.

Puede identificarse una serie de aplicaciones especialmente ventajosas de la invención. En primer lugar, para individuos con propensión a trastornos sanguíneos como leucemia o linfoma pero que no han sucumbido, o no presentan sus síntomas, a la enfermedad antes del muestreo, la invención proporciona un procedimiento terapéutico prospectivo. Sería beneficioso para estos individuos en el presente sanos proporcionar una muestra de tejido o múltiples muestras de tejido (por ejemplo, médula ósea o sangre). La/s muestra/s podría(n) mantenerse en un estado de latencia hasta su uso en una fecha futura para sustituir/aumentar tejidos/células perdidos o aberrantes y aliviar la enfermedad que podrían contraer después de tomar la muestra. La invención también puede aplicarse a individuos cuyos entornos los predispone a por ejemplo leucemia, por ejemplo, trabajadores en centrales eléctricas. La invención está en contra de todas las enseñanzas convencionales, que aconsejan aloinjertos o autoinjertos retrospectivos para proporcionar una intervención curativa en enfermedades como leucemia y linfoma o tumores sólidos. También se incluyen otros tipos de predisposición dentro del alcance de este aspecto de la invención, como efectivamente hay otros factores por ejemplo, la historia familiar que puede ser indicio de un riesgo de una dolencia
sospechosa.

Otra utilidad ventajosa de la invención es el tratamiento de la infección o enfermedad por VIH. Así, pueden recogerse células CD4^{+} de un individuo cuando está sano o no infectado, y almacenarlas para posterior trasplante en dicho individuo cuando se manifiesta la infección por VIH o cuando se desarrolla SIDA, o cae el recuento de células CD4^{+}, etc. Este procedimiento puede ser atractivo para un individuo con un estilo de vida. que puede ponerle en riesgo de contraer la infección por VIH.

Además, es bien reconocido que el proceso de envejecimiento hace que los individuos sean más susceptibles a la enfermedad. Parece que la base para la susceptibilidad se halla en la pérdida de función inmunitaria que resulta de un descenso considerable de número/actividad de células T y B durante el envejecimiento (Mech Ageing & Dev 91 (1996) 219; Science 273 (1996) 70; Mech Ageing & Dev 96 (1997) 1).

Además, la invención puede considerarse especialmente ventajosa a la luz de recientes descubrimientos relacionados con la regulación a la baja de la actividad de linfocitos-T citotóxicos en respuesta a la presentación de epitopo tumoral limitado al antígeno HLA de clase I.

La susceptibilidad a la enfermedad es especialmente pertinente cuando pacientes ancianos están sujetos a por ejemplo, cirugía en un entorno hospitalario, en el que son propensos a infecciones oportunistas con consecuencias serias o incluso mortales. Las muestras medulares y/o sanguíneas tomadas mucho antes en vida del paciente, como durante la adolescencia o a principios de la edad adulta cuando su sistema inmunitario está maduro pero incomprometido, y mantenidas posteriormente en un estado de latencia, podrían revitalizarse y reinfundidas en el paciente para aumentar su sistema inmunitario. Esta técnica proporcionaría un procedimiento para aumentar el sistema inmunitario del paciente después de cirugía para disminuir la probabilidad de complicaciones postoperatorias causadas por infecciones oportunistas. Por consiguiente, la invención podría utilizarse como una terapia profiláctica, por ejemplo, para pacientes ancianos cuando son más susceptibles a la enfermedad.

Otro ámbito en el que se puede observar que la invención es especialmente ventajosa es cuando los individuos pueden tener predisposición más tarde en la vida a trastornos endocrinos como diabetes; hipotiroidismo o hipoparatiroidismo, o a la pérdida o enfermedad de material esquelético lo que conduce a osteopenia asociada a la edad, osteoporosis, osteoartritis, artritis reumatoide, y enfermedad periodontal. Podrían tomarse 4 muestras de célula/tejido de estos individuos, almacenarse en un estado de latencia, y entonces reinfundirlas otra vez, opcionalmente después de dilatación in vitro, en el individuo cuando su estado endocrino/esquelético indique una necesidad.

Además, la invención tiene especiales ventajas en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas con un componente genético. Ello es porque las células del donante pueden modificarse genéticamente, ya sea antes o después de la latencia para, por ejemplo, anular, negar, aliviar o invertir los efectos, futuros o actuales, del componente anormal heredado de la enfermedad. En la corea de Huntington, por ejemplo, el gen IT15 codificador de la hungtintina contiene un gran número anormal de repeticiones de CAG (Cell 72 (1993) 971). Este gen dominante puede desactivarse o anularse in vitro, y sustituida por la versión normal (J. Neuro Sci: 18 (1998) 6207; Bioessays 20 (1998) 200). Por consiguiente, la presente invención tiene claras ventajas en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, proporcionando material que puede injertarse (PNAS 89 (1992) 4187), y en este caso que puede autoinjertarse, ambos con y sin previa modificación de la funcionalidad, la diferenciación o el genotipo de la célula. Se aplicarían principios análogos en el tratamiento de otras enfermedades o trastornos.

La invención también tendría ventajas cuando deberían transportarse las muestras de tejido/célula a laboratorios especializados para experimentar manipulaciones (por ejemplo, modificaciones genéticas, por ejemplo, trasplante nuclear en células madre) antes de devolverlas al paciente. A menudo, no es posible tratar/modificar las células, ya sea genéticamente o funcionalmente, o fenotípicamente en el lugar en que se tomó la muestra al paciente. Aunque sea posible, puede que el proceso no se inicie inmediatamente. Poner la muestra en un estado de latencia, puede ser considerablemente ventajoso para el procedimiento, ya que las manipulaciones celulares que deben realizarse pueden llevarse a cabo en un momento adecuado para la gestión del proceso, por ejemplo, antes de volver latentes las células o después de resucitarlas, pero antes de que sean devueltas al paciente.

La invención también se considerará ventajosa cuando se necesite una multiplicidad de muestras de un único donante. Podría utilizarse la invención para construir una reserva mediante adiciones de muestra múltiple (es decir, 2 o más) a la primera muestra, poniéndose todas ellas en estado de latencia antes de revitalizar una parte de las mismas, o la recolección completa para uso, por ejemplo, en terapia. El tejido del donante para autoinjerto puede ser de animales incluyendo animales transgénicos. Estos animales incluirían, pero no estarían limitados a, ratas, ratones, cerdos, perros, gatos, ovejas, caballos y ganado.

La invención también puede incluir la incorporación de un marcador de selección negativo en todas las células y todos los tejidos destinados a ser devueltos al paciente como se ha descrito, por ejemplo, en los documentos WO 96/14401 (Organismos transgénicos y sus usos), y WO 96/14400 (Células neurales genéticamente modificadas).

Ahora se describirá la invención con más detalle en los siguientes Ejemplos no limitadores, con referencia a los dibujos en los que:

la Figura 1 es un histograma que muestra el efecto de reinfusión de glóbulos blancos autólogos criopreservados en supervivencia de ratas irradiadas con rayos X (números de ratas supervivientes frente a Tiempo (semanas) tras irradiación). Las ratas se mantuvieron bajo condiciones SPF (libres de patógenos específicos). Se extrajeron cinco ml de sangre total mediante punción cardiaca a todas las ratas dos semanas antes de la irradiación. Se prepararon como se ha descrito anteriormente los glóbulos blancos de cinco muestras sanguíneas y después se criopreservaron utilizando procedimientos normalizados (véase el Ejemplo 1). A tiempo cero, se dio 8 Gy de irradiación con rayos X a todas las ratas. Dos semanas después de la irradiación se realizó una infusión a cinco ratas (barras continuas) con injertos autólogos de glóbulos blancos descongelados y los animales de control (barras discontinuas) recibieron injertos autólogos de glóbulos blancos descongelados y los animales de control (barras discontinuas) recibieron sólo portador mitólogo de plasma. Dos días después, se sacó a todas las ratas de las condiciones SPP y se devolvieron al animalario principal. Se controló la muerte de animales por infección oportunista. El experimento demuestra que la reinfusión de glóbulos blancos en ratas irradiadas protege a estos animales con sistema inmunitario reducido de muerte por infección.

la Figura 2 es un histograma que muestra el mantenimiento en ratas injertadas de linfocitos-T artificiales autólogos, hasta seis meses después del injerto, todo el periodo de estudio (números de ratas frente a tiempo (meses)). Se extrajeron cinco ml de sangre periférica a cada una de las diez ratas mediante punción cardiaca. Los glóbulos blancos se enriquecieron de las muestras como se ha descrito en el Ejemplo 1 y después se modificó mediante ingeniería genética para contener el gen de resistencia a la higromicina (documento WO 96/15238). Se criopreservaron las células como se ha descrito anteriormente. Seis meses después de la criopreservación, las células se descongelaron y se realizó la reinfusión autóloga. Se analizó la presencia de ADN que codifica el gen de resistencia a la higromicina mediante PCR con intervalos de tres meses. El experimento muestra la presencia continua de células que contienen el gen de resistencia a la higromicina.

la Figura 3 es un histograma que muestra los resultados de un estudio idéntico al que se describe en la Figura 2, salvo que la etapa de modificación mediante ingeniería genética se realizó después, preferiblemente que antes de la etapa de criopreservación. Se analizó la presencia de ADN que codifica el gen de resistencia a la higromicina mediante PCR con intervalos de tres meses. Se obtuvieron resultados similares a los hallados con una etapa de ingeniería de pre-preservación, que indicaban la supervivencia prolongada de las células después de volver al huésped.

Ejemplo 1 Supervivencia a la infección mediante injerto autólogo prospectivo de células del donante almacenadas en congelación (i) Muestras tomadas

En este estudio se utilizaron ratas Wistar, machos y hembras. Se emplearon una serie de procedimientos normalizados para extraer muestras medulares o muestras de sangre periférica (véase más adelante). Pueden hallarse referencias a estos procedimientos en textos sobre cirugía animal y humana como en el de Waynforth y Flecknell (Experimental and Surgical Technique in the rat, 2ª edición, Academic Press, 1992).

(ii) Procedimientos de muestreo

En resumen, se anestesiaron animales con cloroformo y se mantuvo la anestesia con halotano. Se muestrearon células de médula ósea y/o células sanguíneas utilizando procedimientos normalizados. Todo el muestreo se realizó bajo anestesia. La sangre se muestreó mediante punción cardiaca, o mediante exposición de la vena yugular seguido de extracción de sangre de la misma. Se extrajo médula del fémur después de amputación de una pata trasera; y de la tibia y del peroné de la pata trasera amputada. (Practical Immunology, 3ª edición, Blackwell Scientific Publications, 1989). Para el muestreo de médula se expuso el fémur de la rata y/o la tibia y se extrajo células de la médula utilizando una(s) aguja(s) desechable(s) de aspiración de hueso o una aguja Islam de colecta de médula ósea, o equivalentes a la misma, para ratas. Se muestrearon diversas zonas del hueso para proporcionar una recogida adecuada de células medulares para futuras necesidades. Alternativamente, se realizó una biopsia de costilla que fue especialmente ventajosa para el muestreo de células óseas del tipo CFU-F (unidades formadoras de colonias de fibroblastos). Para los humanos, se muestrea normalmente la cresta iliaca.

(iii) Preparación de célula medular

Una vez obtenidas, las células medulares se suspendieron en medio de cultivo y se separaron de materiales adiposos esencialmente como se ha descrito anteriormente para muestreo celular humano (Bone 22 (1998) 7). La suspensión celular resultante se transfirió a un recipiente universal y se permitió que permaneciera inalterada durante 10 minutos (min), transcurrido este tiempo se extrajeron los sedimentos cebados que habían flotado hacia la parte superior. Se transfirieron las células derivadas de la médula a un tubo centrífugo y se centrifugó a una gravedad de 100 x (g) durante 5 min para recoger las células. El medio y los sedimentos cebados se extrajeron otra vez y se volvió a suspender el sedimento celular en 5 ml de medio de cultivo nuevo. Las células resuspendidas se cargaron en un gradiente con 70% de Percoll que se centrifugó a 460 g durante 15 m. Después de la centrifugación, se extrajo el 25% superior del volumen de gradiente, que contenía las células medulares requeridas. Se añadió un volumen equivalente de medio nuevo a esta suspensión y se centrifugó la suspensión a 100 g durante 10 min. El sedimento celular resultante se volvió a suspender en un medio nuevo y se obtuvo una solución única celular pasando las células a través de una aguja de calibre 19 varias veces. Entonces se determinó el número de células viables mediante exclusión con azul de Trypan (1% w/v).

Alternativamente, no se llevó a cabo la separación de las células cebadas de las células medulares muestreadas, y se preparó toda la muestra para la latencia. Los tejidos derivados de forma hematopoyética y derivados de forma mesenquimal podrían obtenerse mediante muestreo medular de forma que también podrían obtenerse, además de células del sistema inmunitario, células capaces de originar osteoblastos, condroblastos, mioblastos, fibroblastos y/o adipositos. Las células mesenquimales pueden separarse, por ejemplo, aprovechando sus propiedades adherentes. Poner las células muestreadas en frascos normalizados de plástico para cultivo de tejido, durante varios periodos de tiempo, conduce a la adherencia de la población celular mesenquimal al plástico, dejando las células hematopoyéticas en suspensión. Entonces pueden separarse físicamente los distintos tipos de células decantando el
sobrenadante.

Todos los procedimientos precedentes son ampliamente conocidos por aquellos expertos en la materia.

(iv) Muestreo de sangre periférica

Se obtuvieron muestras adecuadas de células mononucleares (glóbulos blancos), alternativamente, mediante muestreo de sangre periférica. Es bien reconocido que las células madre hematopoyéticas, progenitoras de linfocitos-T y linfocitos-T maduros residen en la sangre periférica que hace que las células mononucleares de sangre periférica sean adecuadas para trasplante.

También se muestreó sangre periférica de ratas a las que se les había administrado una(s) inyección(es) intraperitoneal(es) de factor estimulante de colonias de granulocito (G-CSF) o de factor estimulante de colonias de granulocito-macrófago (GM-CSF) o hemopoyetina durante periodos de hasta 96 horas antes del muestreo. Se muestrearon las células mononucleares de sangre periférica de 1 a 4 días después de la administración de G-CSFIGM-CSF. Se ha observado que el G-CSF y el GM-CSF aumentan la población celular mononuclear de sangre periférica que comprende linfocitos-T hematopoyéticos y sus progenitores y células madre, así como otras células sanguíneas. Por consiguiente, esta técnica ayuda a aumentar, in vivo, la abundancia de células requeridas para posterior trasplante antes de extraerlas del cuerpo. El uso de agentes como G-CSF, GM-CSF, hemopoyetina o combinaciones de los mismos 3-4 días antes del muestreo de sangre mediante aféresis es un procedimiento utilizado actualmente para obtener células madre de la sangre periférica para terapia humana y puede utilizarse en la invención (Stem Cells 15 (1997) 9).

(v) Aislamiento y almacenamiento de células muestreadas

Se tomó la sangre periférica de otras ratas que no se habían tratado o que no se habían tratado con GM-CSF/G-CSF, y se prepararon glóbulos blancos utilizando directamente procedimientos normalizados. En resumen, se pusieron muestras de sangre en tubos heparinizados y preparaciones de linfocitos de gran pureza obtenidas mediante centrifugación diferencial en un gradiente de densidad. Tras centrifugación, se movió el glóbulo blanco, que contenía capa leucoplaquetaria (banda celular blanca) claramente visible, a un recipiente nuevo de criopreservación (Practical Immunology, 3ª Edición, Blackwell Scientific Publications, 1989).

Alternativamente, se pusieron las muestras de células medulares recogidas (ya sean muestras no separadas o muestras separadas en distintos tipos de células, por ejemplo, cebadas/no cebadas, células mesenquimales/hematopoyéticas) en recipientes nuevos de criopreservación.

Se añadió plasma autólogo que contenía 20% v/v de DMSO (o variaciones del volumen de DMSO de 5-50%) a las muestras medulares o sanguíneas para un volumen final que llevó la concentración de DMSO a aproximadamente 8,25% (o variaciones del volumen de DMSO de 8-50%). Después se refrigeraron y congelaron lentamente las muestras para perder aproximadamente un grado Celsio cada 1-2 min hasta que alcanzaron aproximadamente los 50ºC. Después se transfirieron a nitrógeno/helio en etapa gaseosa/líquida, o nitrógeno gaseoso y/o líquido seguido de helio gaseoso y/o líquido para almacenamiento a largo plazo a aproximadamente menos 196ºC/269ºC hasta que se requiera.

Se dejaron pasar varias semanas para que las ratas muestreadas se recuperaran antes de experimentar más tratamiento(s).

(vi) Reaprovisionamiento del sistema inmunitario

Un grupo de 10 ratas muestreadas recibió una dosis ablativa (8 Gy) de irradiación corporal total para destruir las poblaciones celulares sensibles a la radiación. Se observó que la dosis de radiación administrada comprometía el sistema inmunitario que es altamente sensible a la radiación, de forma que los animales morían rápidamente por infección poco después del tratamiento (Practical Immunology, 3ª Edición, Blackwell Scientific Publication, 1989). La extracción del timo puede tener un efecto similar.

Se descongelaron las células medulares o los glóbulos blancos mediante agitación suave del criovial en un vaso de precipitado con agua a 37ºC. Después se añadió un medio para diluir el DMSO, por ejemplo 10 veces, y se sedimentaron suavemente las células mediante centrifugación a 400 g. Se volvieron a suspender las células en un volumen bajo de plasma autólogo antes de volver al animal mediante infusión.

A 5 de los 10 animales irradiados se les practicó injertos autólogos dos semanas después de la irradiación, y todas las ratas volvieron al animalario principal. En los tres meses siguientes, las 5 ratas no autoinjertadas murieron por infección, pero las 5 autoinjertadas sobrevivieron los seis meses siguientes al estudio (véase Figura 1).

Ejemplo 2 Injerto autólogo de linfocitos del donante modificados mediante ingeniería genética y almacenados en congelación

Se utilizaron ratas Wistar machos y hembras en el estudio y se obtuvieron muestras de células medulares y/o de células mononucleares de sangre periférica como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las células mononucleares se modificaron mediante ingeniería genética para expresar las cadenas a y b del receptor de células-T que, cuando se combinaron, reconocieron el antígeno tumoral Mage 1. La construcción genética también proporcionó resistencia a la higromicina a las células modificadas mediante ingeniería y se describe con más detalle en el documento WO 96/15238, Linfocitos-T identificados, que se incorpora en este documento.

Después se criopreservaron muestras de células modificadas mediante ingeniería durante periodos de hasta seis meses antes de revitalizarlas/reanimarlas como se describe en el Ejemplo 1 y se utilizaron como injertos autólogos. Las ratas con injertos autólogos se sacrificaron en diversos momentos después del injerto, y se les extrajo la sangre mediante punción cardiaca. Se detectó el ADN genómico que codifica el gen de resistencia a la higromicina, presente sólo en las células modificadas mediante ingeniería, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como se ha descrito anteriormente (PCR A Practica) Approach, IRL Press, 1991). En resumen, se aislaron las células mononucleares de sangre periférica mediante centrifugación diferencial en un gradiente de densidad. Se separó la capa leucoplaquetaria y se preparó el ADN genómico mediante extracción fenol/cloroformo seguido de una precipitación de etanol y una resuspensión en agua estéril (Sambrook y col., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989). Se amplió el ADN genómico mediante PCR en la presencia de oligonucleótido cebador diseñado para reconocer una secuencia de 272 pares de base del gen de resistencia a la higromicina (véase McPherson y col., PCR. A Practica) Approach, IRL Press, 1993 para las condiciones de la PCR). Los cebadores de la higromicina que detectan una secuencia del gen de la higromicina con un tamaño de 1,023 kb eran los siguientes:

GAATTCAGCGAGAGCCTGAC	(cebador izquierdo 5' - 3')
GATGTTGGCGACCTCGTATT	(cebador derecho 5' - 3')

Se sometió a electroforesis una muestra del producto de la PCR en un gel de agarosa al 4% y el fragmento de 272 pares de base del gen de resistencia a la higromicina identificado por transiluminación ultravioleta después de teñir el gel con bromuro de etidio. En la Figura 2 se proporciona la capacidad de identificar el gen de la higromicina en las muestras de sangre de la rata a lo largo del tiempo.

Ejemplo 3 Modificación mediante ingeniería genética e injerto autólogo de linfocitos del donante almacenados en congelación

El ejemplo 3 se realizó como el Ejemplo 2, salvo que se criopreservaron las células para el injerto autólogo antes de modificarlas mediante ingeniería genética. Se descogelaron las muestras como se ha descrito en el Ejemplo 1 antes del autoinjerto. En la Figura 3 se proporcionan los resultados del mantenimiento de la expresión del gen en el autoinjerto a lo largo del tiempo.

Ejemplo 4 Injerto autólogo y singénico de células estromales medulares en ratas jóvenes y viejas

Para estos estudios se utilizó una línea consanguínea de ratas Sprague Dwaley. Se prepararon suspensiones de células de médula ósea (células 2x10^{6} por ml) de biopsias de costilla (también de fémur) tomadas de ratas jóvenes (de 8 semanas de edad) y ratas viejas (de 60 semanas de edad). Se centrifugaron muestras celulares a 400 x de gravedad y el/los sedimento(s) celulares resultantes se suspendieron en DMSO al 10% en plasma autólogo seguido de criopreservación en nitrógeno líquido y/o seguido de helio líquido.

Se revitalizaron las muestras celulares desde 3 meses hasta 2 años después de la criopreservación y se suspendieron en medio de cultivo a 2x10^{6} por ml. Se añadió un único disco de hidroxiapatito poroso a cada suspensión de muestra y se dejó durante 24 horas para permitir que las células se adhirieran al mismo, lo que produjo un compuesto celular/HA. Después se implantaron los compuestos de forma subcutánea como injertos autógenos o singénicos. Se extrajeron los injertos pasadas 8 semanas y se sometieron a análisis histológico, y mediciones de fosfatasa alcalina y osteocalcina.

Los grupos experimentales fueron los siguientes:

(1)

Se incubaron células medulares muestreadas de ratas jóvenes de 8 semanas de edad con hidroxiapatito poroso (HA) durante 24 horas para formar un compuesto de célula medular/HA. Después, los compuestos se injertaron o bien (a) de forma autógena o bien (b) de forma singénica a las ratas de la misma edad o (c) a ratas de 60 semanas de edad, o (d) a ratas de 104 semanas de edad.

(2)

Se incubaron células medulares muestreadas de ratas viejas de 60 semanas de edad con hidroxiapatito poroso durante 24 horas para formar un compuesto de célula medular/HA. Después, los compuestos se injertaron o bien (a) de forma autógena o bien (b) de forma singénica a ratas de 8 semanas de edad o (c) de forma singénica a ratas de 60 semanas de edad, o (d) de forma singénica a ratas de 104 semanas de edad.

(3)

Se criopreservaron como se ha descrito células medulares muestreadas de ratas jóvenes de 8 semanas de edad. Tras 96 semanas de criopreservación, se revitalizaron las células y se incubaron con hidroxiapatito poroso durante 24 horas para formar un compuesto de célula medular/HA. Después, los compuestos se injertaron o bien (a) de forma autógena (teniendo las ratas muestreadas 104 semanas de edad) o bien (b) de forma singénica a ratas de 104 semanas de edad o (c) de forma singénica a ratas de 8 semanas de edad.

(4)

Se criopreservaron como se ha descrito células medulares muestreadas de ratas viejas de 60 semanas de edad. Tras 44 semanas de criopreservación, se revitalizaron las células y se incubaron con hidroxiapatito poroso durante 24 horas para formar un compuesto de célula medular/HA. Después, los compuestos se injertaron o bien (a) de forma autógena (teniendo las ratas muestreadas 104 semanas de edad) o bien (b) de forma singénica a ratas de 104 semanas de edad o (c) de forma singénica a ratas de 8 semanas de edad.

Resultados

Análisis histológicos cualitativos mostraron una clara diferencia entre la capacidad de las células medulares jóvenes y viejas para inducir a nueva formación ósea en los injertos autógenos y singénicos. El 40% de los compuestos de células medulares/HA viejas no mostraron formación ósea cuando se injertaron a ratas jóvenes o viejas, mientras que se formó hueso en todos los compuestos que comprendían células medulares jóvenes. El resultado fue idéntico para los compuestos en los que las células medulares se habían criopreservado y revitalizado antes del injerto.

Las diferencias en la expresión de osteocalcina y la actividad de la fosfatasa alcalina entre los compuestos formados a partir de células medulares jóvenes y viejas fueron considerablemente grandes. Como promedio, la expresión de osteocalcina fue 8-10 veces más alta en los compuestos que comprendían células jóvenes en comparación con los compuestos que comprendían células viejas. La proporción 8-10 de osteocalcina expresada entre los compuestos que comprendían células jóvenes en comparación con los compuestos que comprendían células viejas no varió de forma significativa debido a la criopreservación y revitalización, o porque fuera un injerto singénico más que un injerto autólogo.

También se observó que la actividad de la fosfatasa alcalina variaba entre los compuestos que comprendían células jóvenes o viejas. Los compuestos que comprendían células jóvenes tenían 4-6 veces la actividad de la fosfatasa alcalina de los compuestos de células viejas. De forma similar al estudio de osteocalcina, la criopreservación de células antes de formar los compuestos no produjo ningún cambio significativo en esta proporción; ni porque fuera un injerto singénico más que un injerto autólogo.

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La Tabla 1 siguiente describe las proporciones de expresión de osteocalcina observada entre los distintos grupos:

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Grupo x/Grupo y \+  \hskip2cm  \+ Proporción\cr \+\+\cr 
1a/1b \+ \+ 1,3\cr  1a/1c \+ \+ 1,4\cr  1a/1d \+ \+ 1,5\cr  2a/2b \+
\+ 0,9\cr  2a/2c \+ \+ 1,4\cr  2a/2d \+ \+ 1,6\cr  3a/3b \+ \+
1,0\cr  3a/3c \+ \+ 1,0\cr  4a/4b \+ \+ 1,3\cr  4a/4c \+ \+ 0,9\cr 
1a/2a \+ \+ 9,7\cr  3a/4a \+ \+ 9,8\cr  1a/3a \+ \+ 1,4\cr  2a/4a \+
\+
1,4\cr}

La Tabla 2 siguiente describe las proporciones de la expresión de fosfatasa alcalina observada entre los distintos grupos:

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Grupo x/Grupo y \+  \hskip2cm  \+ Proporción\cr \+\+\cr 
1a/1b \+ \+ 1,1\cr  1a/1c \+ \+ 1,3\cr  1a/1d \+ \+ 1,3\cr  2a/2b \+
\+ 1,3\cr  2a/2c \+ \+ 1,5\cr  2a/2d \+ \+ 1,8\cr  3a/3b \+ \+
1,1\cr  3a/3c \+ \+ 0,9\cr  4a/4b \+ \+ 1,3\cr  4a/4c \+ \+ 0,9\cr 
1a/2a \+ \+ 5,8\cr  3a/4a \+ \+ 5,9\cr  1a/3a \+ \+ 1,1\cr  2a/4a \+
\+
1,1\cr}

Utilizando ratas singénicas, Inoue y col. (1997) han presentado de forma independiente diferencias similares en la capacidad de formar hueso, y en la actividad de la fosfatasa alcalina y de la proteína Gla del hueso, entre células medulares de ratas jóvenes y viejas. No obstante, Inpue y col. no han presentado los efectos de la criopreservación en la capacidad osteogénica de células jóvenes y viejas, ni si esta clara diferencia en la capacidad osteogénica de células jóvenes y viejas sigue siendo cierta para los injertos autógenos.

Ejemplo 5 Injerto autólogo de células neurales a ratas adultas

Se pusieron ratas adultas de 3 meses de edad en un marco esterotáxico, y se extrajo la zona del cráneo que cubre el ventrículo lateral a nivel de bregma. Se insertó una micropipeta (ID = 100 mm) de vidrio estéril con extremo romo en el cerebro 1,4 mm lateral a la línea media. La pipeta se bajó hasta la parte dorsal del ventrículo lateral, punto en el que, con succión controlada, se extrajo una pequeña cantidad de fluido cerebroespinal (CSF). Se bajó más la pipeta, todavía con succión controlada, de forma que pasó a través del tejido ventricular, subventricular y de otras capas de tejido neural situadas a cada lado del ventrículo lateral. Se recogió una suspensión de tejido, células y CSF en la parte mayor del diámetro de la pipeta. Al final de la biopsia se trituró la suspensión (algunas veces con digestión enzimática previa con por ejemplo tripsin) y se expulsó en un frasco pequeño de cultivo de tejido que contenía medio. Este medio comprendía una mezcla de medio de Eagle modificado de Dulbecco y el F12 de Ham (50/50 v/v) complementado con glutamina-T (2 mM), penicilina:estreptomicina (100 IU/ml:10 mg/ml) y solución madre modificada (PNAS USA 76 (1979) 514: J Neurophysiol 40 (1981) 1132) que contenía 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 5 ng/ml de factor básico de crecimiento del fibroblasto (FGF), o similares. Algunas veces, también se utilizó cocultivo de transmembrana con células neurales replicativas o medio condicionado de estas células para ayudar a la supervivencia de las células adultas recién disociadas.

Se amplió el grupo de células replicativas y se efectuó un pase seccionándolas en 4-6 partes y después se volvieron a poner en placa. Esto permite una ampliación prolongada. Se congelaron los grupos de células, o las células disociadas mecánicamente que derivan de los mismos, o bien en este estado o bien tras diferenciación (véase más adelante), en un medio que contenía 10% de DMSO o utilizando procedimientos convencionales. Después se pusieron en nitrógeno en estado gaseoso/líquido seguido de almacenamiento prolongado en helio en estado gaseoso/líquido durante periodos de hasta o inclusive un año.

Se volvieron a poner en placa las células replicativas congeladas una vez descongeladas, o las células de grupos replicativos disociados en tubos planares y se dejaron diferenciar en el mismo medio, pero sin EGF, durante los días siguientes. Se diferenciaron algunas células en presencia del medio condicionado con células estriatales confluentes (pero todavía replicativas) para proporcionar factores de apoyo y de inducción/dirección a la diferenciación. A partir de entonces, se inyectaron los grupos celulares diferenciados resultantes (aproximadamente 1 millón de células) en las ratas donantes originales lesionadas 10 días antes de forma unilateral mediante inyección intraestriatal de ácido iboténico. Alternativamente, se congelaron las células como se ha descrito anteriormente, y después se descongelaron y se inyectaron en el estriato lesionado. Tres meses después se examinaron los animales mediante perfusión, y se analizaron los injertos mediante inmunohistoquímica.

Se hallaron trasplantes supervivientes en todos los animales injertados. Los implantes se habían integrado bien en el estriato huésped, aunque todavía podían estar claramente marcados como una zona en la que mayoritariamente no crecerían fascículos de fibra mielínica. La proporción de injertos supervivientes no se vio afectada por la posibilidad de que las células del donante hubieran sido congeladas en alguna etapa. Es más, aquellos animales con células que habían pasado por un proceso de congelación poseían más injertos que las células no congeladas, y la expresión de neurofilamentos en estas células injertadas también parecía ser más intensa y amplia. Igualmente, podían observarse algunas expresiones de GFAP en el injerto.

Ejemplo 6 Efectos de la temperatura de almacenamiento en la viabilidad celular transcurrido un año

Se congelaron partes alícuotas por duplicado de las células del tipo que se ha mostrado mediante procedimientos que se han descrito en el texto, y después de 1 hora de enfriamiento a 1ºC por minuto se pusieron en nitrógeno líquido durante 1 hora. En ese momento, se descongeló una parte alícuota de cada par mediante los procedimientos que se han descrito en el texto, y se analizó la viabilidad celular utilizando exclusión de bromuro de etidio/incorporación de naranja de acridina (Brain Res 331 (1985) 251). La otra parte alícuota se puso en helio líquido durante aproximadamente un año, y después se descongeló y se valoró la viabilidad celular con el mismo procedimiento. En la tabla 3 más adelante se muestran los resultados. Los números son el medio y el SEM de 6 pares de muestra, y se expresan como una proporción de las células supervivientes tras 1 hora en nitrógeno líquido. Se verá que la temperatura más baja puede conducir a un aumento pequeño pero significativo de la viabilidad de las células a largo plazo.

TABLA 3

	Condición de almacenamiento
Tipo de célula	Nitrógeno líquido	Helio líquido
Línea celular neural humana	90,17\pm1,64	97,55\pm0,43
Glóbulos blancos humanos	87,61\pm2,38	96,90\pm0,92
Células estromales medulares humanas	89,85\pm1,39	97,13\pm0,77

Ejemplo 7 Efectos de la temperatura de almacenamiento en la viabilidad celular transcurridos dos años

Se repitió el estudio de "un año" del Ejemplo 6, almacenando una parte alícuota de células en helio líquido durante dos años. Después se descongelaron las células y se valoró la viabilidad celular como se ha descrito en el Ejemplo 6. En la Tabla 4 se muestran los resultados. Los números son el medio y el SEM de 6 pares de muestra, y se expresan como una proporción de las células supervivientes después de 1 hora en nitrógeno líquido. Se verá que, tras dos años de almacenamiento pueden obtenerse similares buenos resultados de viabilidad.

TABLA 4

Tipo de célula	Nitrógeno líquido	Helio líquido
Línea celular neural humana	89,28\pm2,51	97,08\pm1,32
Glóbulos blancos humanos	88,19\pm0,96	96,98\pm1,41
Células estromales medulares humanas	86,20\pm1,67	97,56\pm0,93

Claims (18)

1. Uso de una población celular huésped de células linfocitarias sanas, maduras, obtenidas de la sangre de un organismo huésped sano para la preparación de una composición celular de uso en una posterior terapia de trasplante terapéutico autólogo de una enfermedad o trastorno de dicho organismo huésped, en el que las células se obtienen a partir del organismo huésped antes de que se desarrolle o manifieste la enfermedad o el trastorno.

2. Un uso según la reivindicación 1, en el que dichas células huésped se recogen de dicho organismo huésped en una fase en que no hay predicción, indicio o sospecha directos de que se desarrolle dicha enfermedad o trastorno.

3. Un uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho organismo huésped es un ser humano.

4. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho organismo huésped es joven, adolescente o adulto, en el momento en que se obtienen las células.

5. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el sistema inmunitario de dicho organismo huésped está maduro, en el momento en que se obtienen las células.

6. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el sistema inmunitario de dicho organismo huésped está incomprometido, en el momento en que se obtienen las células.

7. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichas células linfocitarias son linfocitos-T.

8. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha terapia es terapia de una dolencia crónica.

9. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha terapia es terapia para cáncer.

10. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha terapia es para infección por VIH o SIDA.

11. Un uso según la reivindicación 10, en el que dicha población celular huésped comprende células CD4^{+}.

12. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha población celular huésped se mantiene en un estado de latencia.

13. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha población celular huésped comprende una célula modificada genéticamente.

14. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que, tras extracción del huésped y antes del trasplante, dicha población celular huésped se almacena congelando las células.

15. Un uso según la reivindicación 14, en el que la población celular huésped se congela a aproximadamente -269ºC o inferior.

16. Un procedimiento para volver y/o mantener latentes las células linfocitarias, comprendiendo dicho procedimiento la congelación de dichas células linfocitarias a una temperatura de -269ºC o inferior.

17. Un procedimiento según la reivindicación 16, en el que dichas células linfocitarias se obtienen de la sangre.

18. Un procedimiento según la reivindicación 16 ó 17, en el que dichas células linfocitarias son linfocitos-T.