JP2002530293A - 自己移植療法における細胞、培養方法およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、後に宿主生物の自家移植治療において使用するための細胞組成物を調製するための、罹病していない疾患宿主生物から得た細胞集団の使用を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、自己移植の治療法に関する。特に、時間的変化の後、例えば、移植
の必要性、すなわち、治療の必要性が生じた時、同宿主への引き続く移植のため
に、真核生物の組織または細胞の試料を健康な宿主生物から移動することに関す
る。生命活動を休止させた状態に保たれた細胞（すなわち休眠細胞）は、例えば
治療のために必要とされる将来に、操作および／または再生が可能である。生命
活動を休止させた状態の細胞試料はまた、操作および／または再生の前に、同一
の供給源となる生物から最初の試料採取を数回行うことによっても蓄積が可能で
ある。

【０００２】

【従来の技術】

培養における真核生物の細胞の維持と複製は何年にも渡って行われてきた。今
世紀初めの研究（Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4 (1907) 140; J. Exp. Med. 15
(1912) 516）は、動物またはヒトの組織の試料を取り出して、そこから、培養
条件に依存して様々な期間インビトロ培養で細胞を維持することが可能であるこ
とを示してきた。最も初期の培養法は、動物の組織または細胞を血液、または血
清のような血液成分に浸すことであった。血液または血清は培養される組織／細
胞試料の培地中の主要な構成成分であった。しかしながら、細胞のインビトロで
の必要性についての本発明者等の知識が増加したので、細胞／組織培養の培地に
おける血清または血液成分の使用は、培養において少なくとも数種の細胞のタイ
プを維持するのに必要な栄養分および補充物のすべてを備える十分に定義された
培地が現在利用できる場合にその量を減少させてきた（FreshneyのTissue Cultu
re of Animal Cells（Culture of animal Cells: A Manual of Basic Techiniqu
e, Wiley Liss, (1994）を参照）。

【０００３】 しかしながら、持続した期間の培養における真核生物の細胞の維持は常に行わ
れてきており、困難を伴ったままである。大きな問題は、多細胞生物から取られ
た真核生物の細胞を数日から数週間以上の長い間、初代培養において維持するこ
とが一般に可能ではないことである。これは、初代培養における細胞は限られた
寿命であることが原因である。しかし、ある場合においては、これらの維持は無
期限に延期されうる。例えば、単一の細胞、または、細胞の集まりは、インビト
ロ培養の環境において、その細胞が連続的な複製をし続ける遺伝的変化を起こす
ことができる。そのような遺伝的変化は、通常、細胞内のプロトオンコジーンを
オンコジーンになるように活性化する突然変異、および／または腫瘍抑制遺伝子
の活性を制限、または打ち消す突然変異を含む。そしてこれは、複製抑制の軽減
、および細胞の不死の創出につながる(Trends in Genetics 9 (1993) 138)。本
発明者の最新の理解は不死のオンコジーンの活性化が原因でなく、細胞自身の複
製を制限する細胞の能力を正常に制御している遺伝子の突然変異が原因で癌にな
ることを含んでいる。これらの遺伝的現象は、インビトロはもちろんインビボで
も起きるのだけれども、連続培養で維持される真核生物の細胞系の多細胞生物か
ら生まれている（Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Wi
ley Liss, 1944)。

【０００４】 細胞系を培養により維持することが可能であっても、連続した複製を行う細胞
の能力は、そうすることを不利に、または、望ましくないものにするかも知れな
い。供給源を取っておくために、もしも細胞を培養に必要とされるまで保存して
おくことが可能ならば、その方が良い。そのような保管を可能にする技術は、原
核生物についての研究からたくさんの情報を伴って発展してきた。

【０００５】 バクテリアやウイルスのような原核生物を使った初期の研究は、一度生き返る
、または生き返らせれば、休眠の段階から生き残り、および複製する能力に影響
を与えることなく、長い期間の休眠状態にしておけることが示された。原核生物
は凍結、凍結乾燥、乾燥、または、その後の凍結を伴ってまたは伴わないで様々
な有機または無機溶液に入れる、といった多数の方法を用いて休眠（生命活動を
休止させた状態）状態においておくことが示された。その溶液は、ジメチルスル
ホオキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、エーテル、グリセロール、ＰＢＳ（リン
酸でバッファー化した生理食塩水）、および、血清、またはこれらの混合、また
は、それに限らず貯蔵寿命を延ばすことができる他の物質の利用を含む。

【０００６】 原核生物を休眠状態に置く、または維持する方法の全てではないが多数は、真
核生物の細胞にも応用されてきた。

【０００７】 培養環境で維持している細胞は、インビトロでの細胞の操作を行うことができ
る。そして、この利点は、診断法の技術において細胞を基礎とするアッセイの発
展を導いてきた。これゆえ、休眠を誘導する前か、あるいは細胞の再生後のどち
らかの細胞培養は、基礎科学はもちろん、診断医学にとって重要な応用があるこ
とが示されてきた（Bone 22 (1998) 7; J Bone Min Res 13(1998)432）。

【０００８】 医学的な診断に加えて、細胞培養法はまた、医学の治療にも応用されてきた。
例えば白血病を病んでいる患者の場合、この病気を緩和する一つのアプローチは
、患者の腫瘍細胞を、放射線療法、化学療法および／または、外科的医術によっ
て根絶することである。しかしながら、全身性および／または転移性の病気に対
する唯一の実際的な処置であると表面上考えられている放射線療法と化学療法は
、患者の正常な造血細胞も、正常でない造血細胞も破壊、または実質上枯渇させ
る。したがって、患者の枯渇された正常な細胞をドナーの骨髄からのものと置き
換えることが標準的な治療である。ドナーはしばしばその「組織のタイプ」が患
者のものと同じである近い親戚であり、それゆえ、患者による拒絶反応が少ない
ようである(Adv Immunol 40 (1987) 379)。

【０００９】 宿主による移植された細胞の拒絶反応に加えて、移植片対宿主病（ＧＶＨ）の
可能性もある。骨髄のドナー試料のリンパ球の絶対多数は未成熟で、成熟の第一
次の過程の経験なしに、成熟した免疫反応を誘導することは不可能である。成熟
はリンパ球が胸腺を通って作用を受けて起こる。もしもドナーからの未成熟のリ
ンパ球が新しい宿主の胸腺を通って作用を受けるならば、それらは宿主を「自己
」として受け入れるであろう。しかしながら、ドナーのＴリンパ球の一部は自己
移植の前にドナーの胸腺を通って成熟が行われることは避けられない。そして、
その結果、レシピエントを他者と見なす。もしもその場合、成熟したドナーＴリ
ンパ球は、宿主の細胞を攻撃するようになり、ＧＨＶ病を引き起こす（Immunol
Rev 157 (1997) 79）。

【００１０】 移植片が宿主に拒絶反応する可能性を低下するために、例えば、ドナーの骨髄
試料は、移植の前に細胞の除去または溶解を見越して、成熟Ｔ細胞を特異的に認
識して結合する抗体と一緒に、トロール網で魚を捕るように集められる（Curr O
p Oncol 9 (1997) 131）。これゆえ、移植前のドナーヒト細胞のインビトロ培養
並びにそれらの操作は、自己移植の治療における認知された方法論であると思わ
れる。

【００１１】 白血病並びにリンパ腫のような病気の治療のために、患者に自己移植が必要と
される前に、首尾よくドナーの骨髄を供給することはしばしば、より実践的であ
る。このような場合には、ドナー骨髄の試料は例えば、凍結する前の試料へのＤ
ＭＳＯの付加によって休眠状態にされる。ドナー試料は移植のために使われるま
で、少しの劣化もなく、何年もの間凍結した状態に保たれる可能性がある。さら
には、ドナー細胞は凍結の前か後どちらかで、成熟したＴリンパ球の除去といっ
た操作が行われる。長期間骨髄試料を貯蔵できるということは、さまざまな白血
病ならびにリンパ腫を患う患者に対する治療プログラムを支援するドナー骨髄バ
ンクを設立することを可能にする（Bone Marrow Transpl 17 (1996) 197）。

【００１２】 ＧＨＶ病を引き起こすものがドナー骨髄における成熟したＴリンパ球であると
いう認識、並びにそれらをドナー骨髄から効果的に除去する技術の発展は、骨髄
の同種移植においてめざましい進歩を助長してきた。 定義として、同種移植は同種の異なったメンバー間で移植または自己移植され
た細胞または組織を意味する。異種移植は異なった種のメンバー間での組織／細
胞移植、自己移植は自己から自己への組織／細胞の移植を意味する。

【００１３】 リンパ腫並びに白血病の治療のために同種移植の実行を可能にする科学的進歩
以前は、骨髄移植は自己移植に限定されていた（Stem Cells 13 (Suppl 3) (199
5) 63）。これまでに定義してきたように、自己移植は、細胞／組織を一つの個
体から取り出し、同個体に移植し戻すことである。自己移植は平凡さを残してお
り、特に、身体の損傷を受けていない部分から皮膚を取り、損傷を受けた部分の
修復／再生を助けるために移植するという、やけどの治療に関連している（Burn
s 24 (1998) 46）。自己移植はまた、患者自身の骨が、例えば骨盤、肋骨または
顎から取り出され、例えば顔といった身体の他の部分の骨を増強／修復すること
に使用される整形外科においても一般的である（J Oral Maxillo Surg 54 (1996
) 420）。

【００１４】 白血病並びにリンパ腫の治療のための自己移植は、有利であり、不利である。
患者にとって鍵となる利点は、患者からの細胞／組織をその患者に戻したときに
、（患者によるか、移植片によるかの）拒絶反応の問題がないことである。しか
し、主要な不利な点は、引き続く移植のために取り出した移植細胞／組織は、罹
病した細胞を含んでいることである。これゆえ、自己移植の価値は、病気に冒さ
れていないドナーの組織を得るまたは、産出する能力に依存している。

【００１５】 定義によれば、白血病ならびにリンパ腫は、その血液並びにリンパ液の細胞を
冒す病気であり、医学的コンセンサスは、罹病した細胞の骨髄への供給または浸
潤が、不規則に起こること、特異的な骨髄の部位に影響を与えること、および／
または、病気の発症に遅れて起こるということである。これ故に、自己移植した
白血病／リンパ腫の患者の解釈は、ひとたびその患者が腫瘍細胞を破壊するため
に、放射線療法および／または化学療法によって治療されれば、本質的に病気に
冒されていない患者自身の骨髄を戻すことは可能であるに違いないということで
ある。

【００１６】 自己移植された試料が本質的に病気に冒されていないことをさらに確実にする
ことは数多くの方法による治療を可能にする。例えばそれは試料の残留腫瘍細胞
を分離および／または破壊することによって一掃される。例えば、一般的なパー
ジング法は、試料の腫瘍細胞を標識するための腫瘍細胞同定抗体を使うことであ
る。腫瘍細胞は蛍光標示式細胞分取のような細胞選別技術を使って取り除くこと
が可能である（Curr Op Hemotol 4 (1997) 423）。

【００１７】 しかしながら、ドナーの試料は、まだ現代の技術では完全に一掃できない何ら
かの病気の要素を含んでいるので、白血病並びにリンパ腫のような転移性または
全身性の病気の治療のための自己移植の価値には疑問も残されている。自己移植
片の質もまた、ドナー自身の病気の状態にも依存している。例えば、含まれる細
胞の型および活動の性質、骨髄に与える罹病した細胞の能力、並びに、ドナーの
試料が取られた病気の発症からの時間といったことである。そのようなわけで、
本質において、このような環境での自己移植の価値は、経験的であり、増殖性の
病気のさまざまな症状を呈する個々の患者間で有意に多様である。

【００１８】 治療法は進歩し続けており、本発明者等の病気の過程の多大なる理解は、本発
明者等が、本発明者等の病気並びに苦痛を緩和する治療上のアプローチを修正、
および焦点を定め直す助けとなっている。このような理解は、分子生物学の分野
における技術的改善によって非常に進んできた。本発明者等は、現在、分子レベ
ルでの病気の病原性を追跡することができ、そして、ある病気に罹らせる個々人
の遺伝子の構造の重要性を認識している。例えば、本発明者等は、ある人はその
遺伝子の構成のために、白血病や心臓病のような血管性の障害といった癌になり
やすいことに気づいている。彼らはまた、糖尿病や甲状腺機能低下症のような内
分泌および外分泌性の病気、年齢関連性の骨減少症、骨粗鬆症、関節炎および歯
周病のような骨格の障害はもちろん、アルツハイマー病並びにハンチントン舞踏
病のような神経変性の病気にも罹りやすい。これゆえ、現在では、衰弱させる病
気に罹りやすい個人を同定することが可能である。

【００１９】 さらに、体の免疫系、そして特に、ウイルス感染されたおよび腫瘍化した細胞
を認識し、殺傷する仕方についての本発明者等の知識は進歩し続けている。本発
明者等は、今や細胞に媒介される免疫を誘導するために、傷ついた細胞（例えば
、ウイルス感染された細胞または腫瘍細胞）は、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＴ
ＮＦ−αのような危険信号と一緒に、腫瘍またはウイルス性のエピトープに限定
されるＨＬＡ（ヒト白血球抗原）クラスＩを共に抗原提示するはずである。その
結果、免疫系の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、相互作用するキラーＴリンパ球（Ｃ
ＴＬ）集団に対する抗原を組み合わせて、Ｂ７並びにＩＬ−１２のような共刺激
性のシグナルを発現する。その共抗原提示は、活性化された細胞および免疫記憶
細胞両方のクローンの産出を引き起こす（Nature Medicine Vaccine Supplement
4 (1998) 525を参照せよ）。これらの付加的なシグナル非存在下で、傷ついた
細胞を認識するＨＬＡ−Ｉ抗原に限定されるT細胞は破壊または脱感作へと処理
される（体のプロセスは例えば自己免疫疾患の発生を避けるように進められるよ
うに見える）。そのような耐性の誘導は、無視、アネルギーまたは物理的欠損ど
れかの理由で生じる（Cold-Spring Harbour Symp Quant Biol 2 (1989) 807; Na
ture 342 (1989) 564; Cell 65 (1991) 305; Nature Med 4 (1998) 525）。腫瘍
細胞が危険および／または共刺激性信号を自動的に相互に免疫提示しないことが
今や明らかである。それゆえ、腫瘍を生み出すことはその腫瘍に対する細胞媒介
の免疫を供給するまさにその細胞の根絶につながる。白血病／リンパ腫または、
肉腫などの癌の症状を呈している患者は、これゆえ、それがないことで、腫瘍を
破壊する生得的な能力をすでに取り去っているようだ。しかしながら、もしも要
求されているＴリンパ球または、その試料が、増殖性の病気の発症の前に患者か
ら取り出されるならば、関連するＴ細胞の集団は、Ｔ−細胞の必要な共刺激のあ
と、病気を緩和するように、そこで患者に戻すことができる。

【００２０】

【発明が解決しようとする課題】

本発明はこの可能性についての本発明者等の認識に基づいている。すなわち、
必要性または要求が生じたときに、細胞／組織を健康な宿主生物から引き続く移
植のために、引き続く自家（自原）移植手順で同じ宿主生物に移すという概念で
ある。

【００２１】

【課題を解決するための手段】

故に、一つの態様として本発明は、前記宿主生物の引き続く自己移植治療にお
ける使用のための細胞組成の調製のために、罹病していない宿主生物から得られ
た宿主細胞集団の使用を提供する。 換言すれば、およびもう一つの態様として、本発明は自己移植治療の方法を提
供する。前記方法は罹病していない時に前記宿主から得られた宿主細胞集団から
調製された細胞組成で宿主生物に移植することを意味する。

【００２２】 特に、本発明のこの態様は、自己移植治療の方法を提供する。前記方法は、罹
病していない宿主生物から宿主細胞の集団を得ること、並びに前記宿主生物へ引
き続く移植のための前記宿主細胞集団から細胞組成を調製することからなる。 本発明のさらなる態様は、前記宿主生物の引き続く自己移植の使用のための罹
病していない宿主生物から得られる宿主細胞集団から成る細胞組成を提供する。 本発明の別の態様は、前記宿主生物の引き続く自己移植治療のための罹病して
いない宿主生物から得られる宿主細胞集団の使用を提供する。

【００２３】 宿主生物は、真核生物である。しかし好ましくは、動物であり、さらに好まし
くは哺乳動物、最も好ましくは、ヒトである。他の代表的な宿主生物は、ラット
、マウス、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ、およびウシを含む。

【００２４】 本明細書において、「罹病していない」という用語は、生物が健康であるとい
う状態を記載するのに用いる。すなわち、なんらかの病気や障害を被っていない
こと、または、前記の病気または障害のいずれの症状も現れていないこと、すな
わち、無症候性、または前臨床的状態であるということである。特に、宿主生物
が病気または障害を被っていない、またはその症状を示していないことであり、
これは、引き続き、移植の手順によって処理する計画を持っていることである。

【００２５】 さらに、本発明のある態様においては、宿主生物は好ましくは、なんらかの特
定の病気または障害に罹っていない、または、その危険性がないことである。す
なわち、好ましくは、後に病気または障害となる何らかの予測的症状または兆候
を示していないことである。同様に、宿主生物は、好ましくは予測または予期さ
れる状態を生じさせるどんな障害または破損も被らないことである。本発明の背
景にある重要な考え、または概念は、予測されるもしくは疑われるまたは予想さ
れる病気または状態よりも、むしろ将来的な可能性または予測できない出来事、
または、偶然単独に生じる出来事に対する使用のために、ある段階にある宿主生
物から宿主細胞を収集、すなわち集めることである。ある段階というのは、特別
な障害または、病気が発生するという直接的な予測、暗示または、疑いがない時
である。

【００２６】 たとえ、宿主の体の他の部分や範囲もしくは細胞または組織が病気または障害
に冒されていても、宿主生物の体の「罹病していない」部位または部分から細胞
を取り除くこともまた、含まれる。

【００２７】 本発明の好ましい態様において、細胞は、いずれの病気または障害が発生する
またはその兆候を示す前に、宿主生物から得られる。そして、宿主生物が一般的
に良好な健康状態であるときにさらに好ましく、且つ、いずれにしても免疫無防
備状態でないことが好ましい。

【００２８】 都合良くは、それゆえ、宿主細胞は宿主生物が若いとき、好ましくは青年期、
または成年初期に得られる。ヒトの場合、細胞の試料採取は、約１２歳から３０
歳の年齢で行われ、むしろ１５歳から２５歳が好ましい。特に好ましくは、試料
採取の年齢は１６から１７歳以上の範囲である。例えば、１６から３０歳、１７
から３０歳、あるいはことによっては１８から３０歳の年齢の範囲である。これ
ゆえ、細胞は宿主生物が成熟または成熟に達しつつあるけれども、加齢の進行中
または明らかに老化が始まる前に得られることが好ましい。特に、宿主生物の免
疫系が成熟または十分に発達していることが好ましく、有利である。しかしなが
ら、これらの範囲以外での細胞の獲得は含まれている。そして、細胞は例えば、
幼年期の宿主生物から、少年期の中〜後期から、もしくは、乳児期からでさえ、
または、もっと年をとった個体からも、彼らが「罹病していない」状態で居続け
る限りは、出生後どのライフステージにおいても得られる。故に、胎児の宿主生
物は本発明から除外され、胎児の細胞の試料採取は含まれない。

【００２９】 例えば、臍血液を試料採取するのに対して、本発明の利点は、誕生後またはよ
り加齢した宿主からの細胞を採取することで、多様な試料を集めることを可能に
し、それにより、十分な数の細胞を蓄積する機会を増大する点である。それに加
え、若年またはより加齢した宿主からの試料採取は、インフォームドコンセント
を提供するといったような倫理上の必要を克服する。

【００３０】 青年期または成人の宿主生物からの試料採取は、採取された細胞、特に血液か
ら取得される細胞が、ガン細胞やウイルス感染細胞などの変態細胞個体群を認識
し得る貴重な成熟Ｔ細胞をより多い割合で含んでいるであろうことからより好ま
しい。このように、血液試料を用いるのは、成熟した免疫システムを持つ（すな
わち胎児でなく、または後期誕生）個体から取得される点で有利である。

【００３１】 “自己移植”という用語は、ここでは宿主細胞が取り出された同一生体（すな
わち同一個体）への移植を意味するために使われる。このように自己移植［自己
対自己］または自己移植術が予定される。 “移植”は、細胞の生体への導入を含むどの方法にも適用される。このように
、当該分野で知られている移植または移植術のどんな形態も含まれている。

【００３２】 “移植療法”とは、細胞の移植を含むどの方法にも適用される。治療学上の（
例えば治療のまたは対症のまたは症状緩和の）療法と、予防的な（すなわち予防
または保護的な）療法のどちらにも当てはまる。このように、“移植療法”とい
う用語は、いずれの理由にせよ、それについて必要な、またはそれについて必要
が予期され、または期待され、または疑われる、宿主生物への細胞の移植を含ん
でいる。有利なことに、移植療法は病気、または、結果として例えば癌や感染症
、または体調の悪化（例えば神経退化的な）に発展したり発展する恐れのある不
調を、治療または軽減することである。

【００３３】 宿主細胞は宿主生物のどの細胞であってもまたはどの細胞を含んでいても良く
、個体の細胞と身体のどの組織中にも含まれる細胞の両方を含み、身体分泌液と
固体組織の両方を含んでいる。“宿主生物”という用語はここでは誕生後の身体
を意味し、per se.身体の一部ではない“廃棄”または”使い捨て”の組織は含
まない。従って、臍の緒や胎盤は含まれない。しかしながら、宿主生物の、実在
する体のどの部分も、宿主細胞の供給源として使用されても良い。代表的な細胞
は、このように造血性細胞、例えば血液細胞、脾臓細胞、胸腺細胞、または骨質
の骨髄細胞；神経組織細胞（すなわち神経系の細胞）；肝臓細胞；膵臓細胞；皮
膚細胞；毛髪細胞；内蔵細胞；筋芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、線
維芽細胞、及びそれらの前駆体、またはいずれの身体器官または組織の細胞、に
由来する骨髄間質細胞を含んでいる。身体から細胞を移動するより好ましい部位
は、骨質の骨髄、骨質の骨髄間質、神経組織、内部の器官組織または皮膚組織を
含む。未分化細胞及び部分的にまたは完全に分化した細胞、例えば幹細胞、前駆
体または前駆物質の細胞、または完全に分化した細胞、の両方を含む、分化の異
なる段階にあるすべての細胞のタイプが含まれている。

【００３４】 幹細胞または前駆体細胞は発明に応じて特に含まれており、多機能性の幹細胞
、およびすでに特別な経路または分化の経路と関係づけられている幹または前駆
体細胞、の両方を含んでいることになる。特別な記載は造血性幹細胞と神経幹細
胞、骨髄間質幹細胞、内臓幹細胞、皮膚幹細胞および他の上皮性細胞についてな
されるあろう。

【００３５】 発明によると、より好ましい細胞のタイプはリンパ球、特にＴリンパ球（Ｔ細
胞）であり、身体内のどの都合の良い供給源、好都合なことに血液、骨質の骨髄
、胸腺、リンパ腺または脾臓、からでも手に入れることができる。成熟Ｔリンパ
球が特に好ましい。

【００３６】 他のより好ましい細胞のタイプと供給源は、骨髄間質由来であろう骨芽細胞、
軟骨芽細胞腫、軟骨芽細胞、脂肪細胞および繊維芽細胞を含む。 さらに、他の好ましい細胞タイプおよび供給源は、脳および脊髄からの神経細
胞タイプ（例えば線条体の、皮質性の、運動ニューロン性の、ドーパミン作動性
の、ノルアドレナリン作動性の、セロトニン作動性の、コリン作動性の細胞）、
または中枢および末梢神経システムからのグリア細胞タイプ（例えばオリゴデン
ドロサイト、シュワン細胞、アストロサイトおよびミクログリア）を含む。

【００３７】 移植療法により治療される病気および不調は、人間に知られているどの病気ま
たは不調であってもよい。このようにいずれの病気状態、不健康、不調、または
身体の異常が含まれている。例えば、細菌、カビ、またはウイルス感染などの病
原性活性から生じる病気を例とする感染症、または例えば原生動物または他の寄
生生物など他のあらゆる生体による感染症；あらゆる悪性または前悪性状態；増
殖または超増殖状態；または、身体の細胞または組織において、機能性、または
他の傷害または異常性、例えば異常な遺伝子発現または細胞または組織の損傷（
たとえば加齢、傷害、外傷または感染などの内的または外的な原因で誘導または
引き起こされたにせよ）、または突発性の病気（パーキンソン氏病）、から発生
、または由来、または関連する、どんな病気、についても言及している。

【００３８】 好都合なことに、本発明は特に慢性状態（すなわち慢性の病気および不調）の
治療に有用である。

【００３９】 代表的な病気または不調は、このように、（身体の固体組織（例えば前立腺ま
たはほ乳類の腫瘍）の、造血性組織の、または他の個体細胞の、あらゆるガン、
特に白血病、またはリンパ腫、血管性の不調、特に神経退行状態を含む神経不調
、内分泌と外分泌の病気、骨格の不調、上述したように、加齢または老化に伴う
あらゆる症状、を含む。骨粗鬆症および骨関節炎に関しては、特別の記載がされ
るであろう。

【００４０】 ガンの治療は、発明のより好ましい態様を示し、身体のいずれの細胞または組
織のガンを含む。発明はいずれか一つのタイプのガン（例えば白血病、リンパ腫
、上皮細胞のガン、または肉腫）に限定されるわけではなく、また、特定の発ガ
ン遺伝子、または ras、myc、myb、fos、fas、網膜芽細胞腫、ｐ５３などといっ
た腫瘍サプレッサー遺伝子エピトープまたはＨＬＡクラスＩ抗原に限定した様式
で提示される他の腫瘍細胞マーカーエピトープに限られるわけではない。胸、胃
、大腸、直腸、肺、肝臓、子宮、精巣、卵巣、前立腺、といったすべての癌、お
よび神経膠腫、アストロサイトマス、神経芽細胞腫、といった脳腫瘍、横紋筋肉
腫および繊維肉腫といった肉腫が、本発明による治療に対し含まれている。

【００４１】 さらに好ましい発明の態様は、感染症、特にウイルス感染症の治療であり、潜
伏期を持つＨＩＶおよび他の感染症が含まれている。

【００４２】 宿主生物から得られる、または移動される宿主細胞の全個体群は、一つないし
それ以上の細胞を含むか、または身体から移動された組織試料を含んでいるとい
ってよい。

【００４３】 宿主細胞の全個体群は、発明に準じて、続いて行われる宿主生物への移植手続
きに使用されるが、宿主生物から取り出されて後、都合のよい、または希望する
、いずれの時に使用してもよい。言い換えれば、個体から取り出された組織また
は細胞試料は、治療の必要が生じる将来の時点で、使用してもよいのである。有
利なことに、しかしながら、本発明では、細胞移転後、例えば３ヶ月から数年（
例えば８０年まであるいはそれ以上）の延長時間の間隔をおいた時点での、移植
を可能にしている。このように、発明は、健康的な、病気にかかっていない細胞
を良好な健康状態または、良好な免疫状態にある時に個体から取り出しておき、
多数年の後、問題が発生した時にその個体の治療のために使用することを可能に
する。移植を続いて行うまでの、より好ましい、または代表的な時間の間隔は、
このように６ヶ月から７０年、１から５０年、そして１から３０年、もしくは５
から３０年を含む。慣例的な冷凍保存条件と方法はそのような期間を認めている
。（Scand. J. Haematol. 10 （1977） 470; Int. J. Soc. Exp. Haematol. 7
（1979） 113）

【００４４】 宿主細胞の全個体群は宿主細胞の生体から、いずれの都合のよい方法で取得ま
たは移動させてもよい。これは細胞や細胞が得られる身体の部位によって決まる
。

【００４５】 最近の進歩は、植皮術のために細胞を取得する過程で築き上げられてきた。分
子生物学の出現は、健康と病気における細胞の成長や機能に関する基礎生物学を
より明らかに理解するために役に立っている。例えば、造血作用を調節する試薬
の研究は、リンパ球の増殖および分化に影響を与える一連の因子の単離を導いて
きた。これらの成長因子には一連のインターロイキンシ、ＩＬ−１〜ＩＬ１８お
よびロイコトリエンといったサイトカイン；並びにＴＮＦ、ＴＧＦ、ＦＧＦ、Ｅ
ＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびその他といった増殖因子が含まれる。こ
れらの因子のうちいくつかは、現在医療に使用するために市販されており、リン
パ球細胞、特に末梢の血液の未成熟なＴ−リンパ球細胞の数を実質的に上昇させ
ることを示す因子もいくつかある。宿主生物への投与は、数日後に効果が見られ
るとしても、膨大な数の目的の細胞、例えば未成熟なＴリンパ球を骨髄の採取を
必要とせず、宿主の血液から直接選別できるようになったことを意味する（Stem
Cells 15 (1997) 9）。血液からリンパ球を取り出す技術は、患者から血液を取
り出し、それを細胞分離機を通過させ、それから患者に戻す、という一連の操作
をすべて実質的には同時に行うことにより、何年もの間に利用できるようになっ
てきた（Practical Immunology, 3rd Edition, Blackwell, Scientific Publica
tions, 1989）。

【００４６】 生体組織検査法は、また、他の細胞タイプ、または他の部位からの細胞の移動
を容易にするために使用してもよい。例えば、実施例５では、脳細胞を取得する
方法を記述している。内臓試料は、例えば胃、腸または直腸から、内視鏡的な生
体組織検査法によって取得してもよい。繊細な針吸引が、甲状腺または他の組織
に対して使用される。

【００４７】 希望する細胞タイプを選択的に細胞単離する方法も可能であり、造血性の未分
化細胞を選択的に単離するためには、例えば JP-A-10033165（要旨）を参照する
こと。

【００４８】 取り出された宿主細胞全個体群は、続いて移植を行う（すなわち、移植のため
の細胞構成を準備する）ために、既知あるいは望ましいどのような方法によって
も、貯蔵され、培養され、処理され、操作され、または取り扱われることができ
る。細胞の取り扱い方法、培養と貯蔵方法は当該分野ではよく知られ、文献に広
く記載されており、標準的な方法をどれでも使うことができる。細胞は都合のよ
いまたは望ましい、例えば当該分野で知られているどんな培養液中で貯蔵されて
もよい。（例えば細胞培養に必要なことは上述の Freshyney'sを、リンパ球の調
製には WO 98/33891 を参照）。

【００４９】 都合のよいことに、宿主細胞全個体群は、休眠状態にしてもよい。“休眠”と
いう用語は、ここでは、生気を停止させた状態または鬱血状態のどの状態も含ん
で用いられており、この状態に達する方法は当該分野では上述したようによく知
られている。任意の方法を使用することができる（例えば上述のFreshney'sを参
照）。このように細胞は静止の、不活性もしくは非増殖状態に保たれるか、また
は維持される。

【００５０】 より好ましい方法によると、細胞はできれば−１６０℃以下の温度に凍結され
る。 休眠状態を得るより好ましい方法は、細胞をヘリウム（Ｈｅ）の沸点、すなわ
ち約−２６９℃またはそれ以下、に凍結することである。

【００５１】 このように、別の態様において、本発明は休眠状態の細胞を作製および／また
は維持する方法と、前記の細胞を−２６９℃またはそれ以下の温度で凍結させる
ことを含む前記の方法を提供する。 上述の方法により取得した休眠状態の細胞個体群も、発明の一部分を形成する
。

【００５２】 上述の Freshney's に記載されているように、細胞は適切な培養液（例えば５
〜１０％ ＤＭＳＯを含む）に懸濁され、例えば１分１℃の割合で−７０℃まで
制御しながら冷却されてから、液体／ガス窒素中で冷却される。このような慣例
的な方法は、細胞をヘリウム／窒素混合体またはヘリウム中で冷却するために応
用することができる。

【００５３】 （すなわちより低い温度）を用いることにより、細胞の長期的な生存率が改善
されることを示す結果が得られている。例えば１０〜２０年以上増殖する時、こ
の生存率の増強は細胞の貯蔵を成功させるために重要であろう（以下実施例６を
参照）。

【００５４】 休眠状態の細胞を作製および／または維持する選択的な方法には、４℃で冷却
することも含まれている。

【００５５】 必要であれば、細胞は、例えば操作または修飾プロセス（後述参照）の一部分
として培養されるし、または、細胞の数を増加させるために培養されてもよい。
例えば、細胞は当該分野でよく知られている方法に従って、継体されてもよい。
培養は、休眠期間の前または後、またはその両方である。

【００５６】 移植に先立ち、細胞は何らかの方法、例えば遺伝的に、または機能的におよび
／またはそれらの分化を誘導または操作することにより、選択的に修飾または処
理されてもよい。その上、上述したように、このことは当該分野では周知であり
、どんな既知のまたは標準的な方法が用いられてもよい。（例えば、WO 98／068
23、WO 98／32840、WO 98／18486 を参照）。このような修飾または操作は、休
眠状態の前または後、またはその両方に行うことができる。順序および／または
操作の数は融通が利くので、修飾／操作は時間的に制約されない。

【００５７】 このように、遺伝的な介入は、1つまたはそれ以上の遺伝子の発現を調節また
は修飾すること、例えば遺伝子発現の増加または減少、１つまたはそれ以上の遺
伝子の不活性またはノックアウト、遺伝子置換、１つまたはそれ以上のヘテロ遺
伝子の発現など、を含む。細胞は、幹細胞への核移行のための核の供給源として
も使用される。

【００５８】 細胞は、成長および／または活性など、または分化などの状態を修飾したりす
る因子、例えばサイトカイン、成長因子などにさらされたり、接触してもよい。
細胞は、分離または選択的な単離、望ましい細胞タイプの濃縮、または望まない
細胞を一掃するために処理されてもよい。

【００５９】 このように、例えばＴ細胞修飾方法については上で論議されており、それによ
ってＴ細胞は移植に先立って、共に刺激される。

【００６０】 選択的に、造血細胞は、活性化Ｔ細胞および記憶Ｔ細胞の両方を生産するよう
に、ＨＬＡクラスＩに限定される腫瘍抗原およびＢ７および／またはＩＬ１２と
共に共存している。試料はその後、病気が始まる前に予防的な治療として、宿主
生物に戻すことができる。選択的に、共存している抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、
活性化および／または記憶Ｔ細胞と一緒に宿主に戻すことができる。選択的に、
細胞はインビトロで、宿主に戻される前に、適当な破壊シグナルおよび共刺激分
子と共に共存し、宿主の腫瘍にさらされてもよい。本発明者（等）の WO 96／15
238 に関しては、Ｔリンパ球療法を意図しており、宿主のＣＴＬは、元に戻す前
に腫瘍を認識するように遺伝的に修飾されている。本項における選択は、休眠ま
たは結合の期間の前、または後のどちらかに、造血細胞同士の間での機能的な相
互作用を提供する。

【００６１】 休眠に続いて、細胞は移植に用いられるのに先立って、再生される。再び、こ
れは、当該分野で知られている都合のよいどの方法によっても取得されるし、い
かなる細胞の再生または蘇生の方法が用いられてもよい。

【００６２】 好都合なことに、例えば、実施例に記述するように、細胞を解凍および／また
は希釈することによって再生細胞を得ることができる。再生の技術は、当該分野
でよく知られている（例えば上述のFreshney's を参照）。細胞を入れた容器を
３７℃の水中で、ゆっくり撹拌することによって、細胞は解凍され、その後ＤＭ
ＳＯ濃度が１％またはそれ以下になるように、例えば培養液、または患者の血清
などにより希釈される。細胞は、即座にまたは培養で回復した後、移植されるこ
とが可能である。再生は例えば予防法または治癒的療法において細胞の利用価値
を再構築するようにデザインされる。

【００６３】 本発明は、病気にかかっていない個体からの組織試料が、休眠状態になっても
よいという認識に関係している。組織は、後日必要な時に再生され、同じ個体に
戻される。患者から摘出した後１、２、３、４、５、６ヶ月、それ以上、または
１、２、３、４、５、６年、それ以上経ってから、病気を緩和したり防ぐために
、病気の進行を遅らせるために、または患者中に残っている正常なまたは損傷を
受けた組織の機能を増大および／または維持するために、再生組織の移植術は行
われる。本発明は、患者がすでに病気を持っているという点で、例えば白血病患
者の骨髄細胞を凍結すること、例えば小児白血病患者の治療に先んじて配偶子、
例えば精液を凍結することとは、明らかに区別される。また、同じ理由から、例
えば続いて行われる手術の時など、後で利用するために凍結保存された血液を提
供する患者からも区別される。付け加えるならば、そのような血液試料を戻すた
めに、保存する持続期間は、通常せいぜい１ヶ月である。同様に、異常を診断さ
れていない個体が、海外旅行の前に自分たちで将来的に利用するための凍結保存
用血液を提供することを選ぶかもしれない。そのような利用法は、交通事故や他
の外傷によって生じる急性失血後の血液量不足症の処置を含んでいるかもしれな
いが、これは再び約１ヶ月の短い保存期間のためだけにあり、例えば慢性の病気
といった将来の病気に使われるために計画されるわけではない。

【００６４】 本発明の特に有利な応用のいくつかを同定することができる。はじめに、白血
病やリンパ腫といった血液不調の兆候があるが、試料採取に先だってはまだ発症
していないか無症候性の個体に対し、本発明は有望な治療方法を提供する。現在
は健康である個体に対しても、組織試料または多様な組織試料（例えば骨髄また
は血液）を供給するために有益である。試料（群）は、それらが将来使用される
時点まで、異常な、または失われた組織／細胞を置換／増大するために、また試
料を採取した後に、罹病しそうな病気を軽減するために、休眠状態に維持される
。本発明は、例えば白血病などにかかりやすい環境におかれている、例えば発電
所の労働者などに対しても適応性がある。本発明は、白血病やリンパ腫、または
充実性腫瘍といった病気において、回顧的な他家移植または自己移植が治癒的な
働きをすると推奨するすべての伝統的な教義に反している。他のタイプの前兆に
ついても、本発明の視野の範囲に含まれており、例えば疑わしい状況の危険を暗
示する家族歴などの他の要因がある場合である。

【００６５】 本発明の別の有利な使用は、ＨＩＶ感染または疾患の治療における利用である
。故に、ＣＤ４⁺細胞は、健康であるかまたは罹病していない時に個体から収集
し、後にＨＩＶ感染の兆候あるかもしくはＡＩＤＳが発症した時、またはＣＤ４ ⁺ 細胞数が減少した時に前記個体に移植するために貯蔵することができる。その
ような手法は、ＨＩＶに感染する危険性に置かれそうなライフスタイルの個人に
は魅力的でありうる。

【００６６】 また、老化過程は個人を疾病感受性にするとよく認識されている。この感受性
の根拠は、老化の過程におけるＴ細胞およびＢ細胞の数／活性の顕著な減少に起
因する免疫機能の欠質にある（Meah Aging Dev (1996) 219; Science 273 (199
6) 70; Mech Aging & Dev 96 (997) 1）。

【００６７】 さらに、本発明は、ＨＬＡクラスＩ抗原−制限の腫瘍エピトープ提示に応答し
ての細胞障害性Ｔリンパ球の活性の下方調節に関連する最近の発見の観点から、
特に有用であり得る。

【００６８】 疾病感受性は、年配の患者が例えば病院において手術を受けるときに、彼らが
深刻または致命的な結果を伴う日和見感染症にかかる傾向がある場合に特に関連
する。骨髄および／または血液試料を患者から生存中のより早い時期、例えば患
者の免疫系が成熟しているが、非易感染性であるような青年または成人の早い時
期に採取し、次いで休眠状態で維持し、再活性化して患者に注入して、患者の免
疫系を増強させることができる。そのような手法は、手術後に患者の免疫系を増
強して、日和見感染により引き起こされる術後の合併症の可能性を減少させる方
法を提供する。さらに、本発明は、例えば年配の患者が疾病に対してより感受性
であるときに予防的治療として使用することができる。

【００６９】 本発明が特に有用性を有すると見られる別の領域は、個体が糖尿病、甲状腺機
能低下症もしくは副甲状腺機能低下症などの年をとってからの内分泌障害、また
は加齢に関連する骨障害[osteopaenia]、骨粗鬆症、変形性関節症、リウマチ様
関節炎をもたらす骨格物質の欠失もしくは減少、および歯周病に対して感受性で
ある場合である。組織／細胞試料を個体から採取し、休眠状態にて貯蔵し、次い
で個体の内分泌／骨格状態が必要であると示されたときに、場合によりインビト
ロで増幅させた後に個体に再注入することができる。

【００７０】 神経幹細胞が成人の脳にも存在するという最近の発見は、例えば脳の脳室の表
面からの試料採取は、そのような幹細胞のインビトロでの増殖を可能にして、多
量の神経細胞の集団を提供しうることを意味している。次いで、これらは、神経
疾患または障害、例えばパーキンソン病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、
脳卒中障害、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病、クロイツフェ
ルト‐ヤーコプ病または他の神経変性障害に罹病またはその症候がでた、同じ個
体に移植するための材料の供給源として用いることができる。さらに、本発明は
遺伝物質を用いた神経変性疾患の治療に特に有利である。これは、ドナー細胞を
休眠の前か後の何れかにて遺伝子工学的に改変することができる、例えば将来ま
たは現在において疾病の異常な遺伝物質の作用を無効にする、打ち消す、変化さ
せるまたは逆にすることができるためである。例えばハンチントン舞踏病におい
ては、ハンチントンをコードするＩＴ１５遺伝子が異常に多数のＣＡＧ反復を包
含している（Cell 72 (1993), p.971）。この優性遺伝子をインビトロで不活性
化または不能にして、正常なものと置換することができる（J. Neuro Sci.: 18
(1998) p.6207; Bioassy 20 (1998), p.200）。故に、本発明は、移植可能な、
そしてこの場合には細胞の機能性、分化または遺伝子型を先立って改変したおよ
び改変していない自己移植可能な材料を提供することにより神経変性性疾患の治
療において明白な利点を有している（PNAS 89 (1992, p.4187）。類似の原理は
他の疾病または障害の治療に応用される。

【００７１】 本発明はまた、細胞／組織試料を専門的な研究所に輸送して、患者に戻す前に
操作（例えば遺伝子改変、例えば幹細胞への核移植）する必要がある場合におい
て利点を有している。患者を試料採取した場所において細胞を遺伝学的にもしく
は機能的に、または表現型的に処理／改変することができないことがたびたびあ
りうる。もし可能であっても、その方法はすぐには開始することができない。試
料を休眠状態におくことは、方法の管理について適切なときに、例えば細胞の休
眠前または蘇生後であるが、患者に戻す前の何れかにおいて必要とされる細胞操
作を実施しうるためにその手法に著しく有利である。

【００７２】 本発明はまた、単一のドナーからの試料が複数必要な場合に有利であると理解
される。本発明を用いて第１の試料に対する複数の試料添加（即ち２回以上）に
よりストックを集めることができ、これらの全ては、例えば治療に使用するため
の完全な収集物またはその部分を再活性化の前に休眠状態におかれる。自己移植
のためのドナー組織は、トランスジェニック動物を含む動物由来とすることがで
きる。そのような動物には、ラット、マウス、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ
およびウシが包含されるが、これらに限定されない。

【００７３】 本発明はまた、例えば WO 96／14401（トランスジェニック生物およびその使
用）および WO 96／14400（遺伝子改変した神経細胞）に記載されるように、患
者に戻されることが決まっている全ての細胞／組織中に陰性選択マーカーの組込
みを包含しうるが、その内容は本明細書にて引用することにより組み入れられる
。

【００７４】 本発明を、次の図面を参照して下記の非限定的な実施例においてより詳細に説
明する： 図１は、Ｘ線照射したラットの生存における凍結保存した自家白血球の再注入
の効果を示すヒトスグラムである（照射後の生存したラットの数／時間（週））
。ラットは、ＳＰＦ（特定病原体未感染）条件下において維持した。５mlの白血
球を照射の２週間前に全てのラットから心臓に刺すことにより取り出した。白血
球は、５つの血液試料から上述のように調製し、次いで標準的方法を用いて凍結
保存した（実施例１を参照）。時間が０の時に、全てのラットを８ＧｙのＸ線照
射に供した。照射後２週間に、５匹のラット（塗りつぶしたバー）は解凍した白
血球細胞の自己移植体を注入し、対照の動物（斜線バー）は自家血しょうベヒク
ルのみを受容した。２日後、全てのラットをＳＰＦ条件下から取り出し、主要な
飼育施設に戻した。日和見感染により死んだ動物を監視した。実験は、白血球の
照射したラットへの注入が感染による死から免疫欠失動物を保護したことを示し
ている。

【００７５】 図２は、研究の全期間である移植後６ヶ月までの移植ラットにおける自家の、
操作されたＴリンパ球の保持を示すヒストグラムである（ラットの数／時間（月
））。５ｍｌの末梢血を１０匹の各ラットから心臓に刺すことにより取り出した
。実施例１に記載するようにして試料から白血球を濃縮し、遺伝子工学的にハイ
グロマイシン耐性遺伝子（WO 96／15238）を含有させた。細胞を上述のように凍
結保存した。凍結保存６ヶ月後、細胞を解凍して、自家再注入を実施した。ハイ
グロマイシン耐性遺伝子をコードするＤＮＡの存在を、３ヶ月間隔でＰＣＲによ
り分析した。実験は、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する細胞が連続的に存
在したことを示している。

【００７６】 図３は、遺伝子工学的工程を凍結保存段階の前ではなく後に実施したこと以外
は図２に記載したのと同じ研究の結果を示すヒストグラムである。ハイグロマイ
シン耐性遺伝子をコードするＤＮＡの存在を、３ヶ月間隔でＰＣＲにより分析し
た。保存前の操作工程を用いて見出されたのと同様な結果が得られ、宿主に戻さ
れた後に細胞の生存が延長されたことを示している。

【００７７】

【実施例】

実施例１ 冷凍保存ドナー細胞の将来の自己移植による感染からの生存 (ｉ) 採取試料 雌雄双方のウイスターラットをこの調査に使用した。多くの標準操作を用いて
骨髄試料または末梢血試料のいずれかを抽出した（後記参照）。これらの操作に
関する参考文献は、ヒトまたは動物外科テキスト、例えば Waynforth および Fl
ecknell によるテキスト（Experimental and Surgical Technique in the Rat，
2nd Edition，Academic Press, 1992）に見出すことができる。

【００７８】 (ii) サンプリングの方法 簡単に云えば、動物をクロロホルムで麻酔し、ハロタンで麻酔を維持した。標
準操作を用いて骨髄細胞および／または血液細胞を採取した。全てのサンプリン
グは麻酔下で行った。血液は心臓穿刺により採取するか、または頚静脈を露出し
、それより血液を抽出することにより採取した。骨髄は後肢切断術後に大腿骨か
ら、並びにその切断した後肢の脛骨および腓骨から抽出した（Practical Immuno
logy，3rd Edition，Blackwell Scientific Publications，1989）。骨髄サ
ンプリングの場合には、ラット大腿骨および／または脛骨を露出し、次いでラッ
ト用の使い捨て骨吸引用針もしくはイスラム（Islam）骨髄収穫針またはそれら
の同等物を用いて骨髄細胞を除去した。その骨のいくつかの領域を採取して、将
来の必要のために骨髄細胞の適当な収穫物を得た。あるいはまた、ＣＦＵ−Ｆ（
コロニー形成単位繊維芽細胞）型の骨細胞のサンプリングに特に有利である肋骨
生検を行った。ヒトの場合には、通常、腸骨稜を採取する。

【００７９】 (iii) 骨髄細胞の調製 一旦獲得したら、骨髄細胞を培地に懸濁し、本質的にはヒト細胞サンプリング
に関する既述（Bone 22 (1998)，7）のようにして脂肪質から分離した。得られ
た細胞懸濁液を一般の容器に移し、１０分間静置し、その後頂上に浮かんだ脂肪
沈積物を除去した。骨髄誘導細胞を遠心分離管に移し、１００×重力(ｇ)で５分
間回転し、細胞を収穫した。培地および脂肪沈積物を再度除去し、細胞ペレット
を新培地５ml中に再懸濁した。再懸濁した細胞を７０％ Percoll 勾配上に載せ
、４６０ｇで１５分間遠心分離した。遠心分離後に、必要な骨髄細胞を含有する
、その勾配容量の頂上２５％を除去した。この懸濁液に等容量の新培地を加え、
その懸濁液を１００ｇで１０分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを新培地
に再懸濁し、それらの細胞を１９ゲージ針に数回通すことにより単一の細胞溶液
を得た。次いで生存細胞の数をトリパンブルー（１％w/v）エックスクルージョ
ンにより測定した。

【００８０】 別法として、採取した骨髄細胞からの脂肪細胞の分離を全く行わずに、全試料
を休眠用に調製した。造血に起源する組織および間葉に起源する組織の両組織は
、骨髄サンプリングにより得ることができるので、免疫系細胞の外に、骨芽細胞
、軟骨細胞、筋芽細胞、繊維芽細胞および／または含脂肪細胞を生み出すことが
できる細胞もまた得ることができる。間葉細胞は、例えば、それらの付着性性質
を利用することにより分離することができる。採取した細胞を標準組織培養プラ
スチック容器に種々の長さの時間、入れると、間葉細胞集団がプラスチックに付
着し、造血細胞が懸濁液中に得られる。次いでその上澄み液を注ぐことによって
上記種々の細胞型を物理的に分離することができる。 上記操作の全ては当業者によく知られている。

【００８１】 (iv) 末梢血サンプリング 単核球（白血球）の適当な試料は、二者択一的に、末梢血サンプリングにより
得た。移植用に適切な末梢血単核球を造る末梢血には造血幹細胞、Ｔリンパ球の
前駆細胞および成熟Ｔリンパ球が存在することは、よく認識されている。

【００８２】 末梢血はまた、サンプリング前に、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）も
しくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはヘモポエ
チンのいずれかを９６時間、腹腔内注射したラットから採取した。その末梢血単
核球を、Ｇ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦ投与の１〜４日後に採取した。Ｇ−ＣＳＦお
よびＧＭ−ＣＳＦは、造血Ｔリンパ球、それらの前駆細胞および幹細胞並びにそ
の他の血液細胞を含有する末梢血単核球集団を増加させることが示された。すな
わち、この手法は、身体からそれらを除去する前に、生体内において、その後の
移植に必要とされる細胞の存在を増加させるのに役立つ。血液成分分離による血
液のサンプリングの３〜４日前に、例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ヘモポエ
チンまたはそれらの組合せのような作用因子を使用することは、ヒト治療のため
の末梢血幹細胞を得るのに今日用いられている方法であって、本発明で使用する
ことができる（Stem Cells 15 (1997) 9）。

【００８３】 (ｖ) 採取した細胞の単離および保存 未処置またはＧＭ−ＣＳＦ／Ｇ−ＣＳＦ処置のラットのいずれかからの末梢血
を採り、標準操作を用いて白血球を直接調製した。簡単に云えば、血液試料をヘ
パリンで凝血防止した管の中に入れ、所定の密度勾配での分画遠心により高純度
リンパ球調製物を得た。遠心分離後に、はっきりと見ることができる白血球含有
軟膜（白血球バンド）を新しい低温保存容器に移した（Practical Immunology,
3rd Edition, Blackwell Scientific Publications, 1989）。

【００８４】 あるいはまた、収集した骨髄細胞試料（非分離試料、または相異なる細胞型−
例えば脂肪／非脂肪、間葉／造血の各細胞に分離された試料）を新しい低温保存
容器に入れた。

【００８５】 血液または骨髄試料に２０％v/v ＤＭＳＯ（または５〜５０％のＤＭＳＯ容量
の変化量）を加えて、ＤＭＳＯ濃度を約８.２５％（または８〜５０％のＤＭＳ
Ｏ容量の変化量）にする最終容量を得た。次いで各試料を冷蔵し、そして１〜２
分毎に摂氏約１度を失うように徐々に冷凍して約−５０℃にした。 次いで必要
とされるまで、それらを約−１９６／２６９℃での長期保存のために気／液相の
窒素／ヘリウム、または気体および／または液体窒素次いで気体および／または
液体ヘリウムに移した。 採取したラットに回復のため数週間を与えてから、その後の処置を施した。

【００８６】 (vi) 免疫系の補充 採取した１０匹のラットからなる一群は、放射線感受性の細胞集団を破壊する
ためにアブレーシブ用量（８Ｇｙ）の全身照射を受けた。与えられた放射線量は
、放射線感受性の高い免疫系を危険にさらし、その結果各動物が、処置後まもな
く感染で容易に死亡することが分かっている（Practical Immunology, 3rd Edi
tion, Blackwell Scientific Publications, 1989）。胸腺の除去が、同様の結
果を有することがある。

【００８７】 骨髄細胞または白血球を、３７℃水のビーカー中で低温バイアルを温和に振と
うしながら凍結から解凍した。次いで培地を加えて、そのＤＭＳＯを例えば１０
倍に希釈し、そして４００ｇでの遠心分離により細胞を温和にペレット化した。
それらの細胞を、注入により動物に戻す前に、少量の自家血漿中に再度懸濁した
。 １０匹の照射された動物の中、５匹は照射の２週間後に自己移植を受けた。全
ラットを、動物ユニットの主要収容施設に戻した。 ３ヶ月以内に５匹の自己移
植されなかったラットは感染により死亡したが、５匹の自己移植されたラットは
全て、その後の６ヶ月の調査に生き残った（図１参照）。

【００８８】 実施例２ 遺伝子操作した保存冷凍ドナーリンパ球の自己移植 雌雄双方のウイスターラットをこの調査に使用し、実施例１に記載のようにし
て骨髄細胞および／または末梢血単核球の各試料を得た。単核球を遺伝子操作し
てＴ細胞受容体のａ鎖およびｂ鎖を発現させた。それらは一緒になるとMage １
腫瘍抗原を認識した。その遺伝子構築はまた、その操作した細胞にハイグロマイ
シン耐性をも与える。それは、さらに WO 96／15238−Targeted T-lympocytesに
記載されており、参照によりここに組み込まれる。

【００８９】 次いでその遺伝子操作した細胞の各試料を、実施例１に記載のようにして生き
返らす／回復させる前に、６ヶ月間低温保存し、そして自己移植片として使用し
た。自己移植片を有するラットを、移植後の種々の時間において犠牲にし、それ
らの全血液を心臓穿刺により採取した。遺伝子操作した細胞のみに存在するハイ
グロマイシン耐性遺伝子をコードするゲノムＤＮＡを、既述（PCR A Practical
Approach, IRL Press, 1991参照）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により検
出した。簡単に云えば、末梢血単核球を所定の密度勾配での分画遠心により単離
した。その軟膜を分離し、そしてゲノムＤＮＡをフェノール／クロロホルムでの
抽出、次いでエタノールでの沈殿および滅菌水中での再懸濁により調製した（Sa
mbrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold S
pring Harbour Laboratory Press, 1989）。そのゲノムＤＮＡは、ハイグロマイ
シン耐性遺伝子の２７２塩基対配列を認識するように設計されたオルゴヌクレオ
チドプライマーの存在下においてＰＣＲで増幅した（McPherson et al., PCR. A
Practical Approach, IRL Press, 1993 for PCR conditions 参照）。サイズ1.
023kbの、ハイグロマイシン遺伝子配列を検出するハイグロマイシンプライマー
は下記のとおりであった： ＧＡＡＴＴＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＡＣ（左プライマー ５′−３′) ＧＡＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＣＴＣＧＴＡＴＴ（右プライマー ５′−３′)

【００９０】 ＰＣＲ生成物の試料を４％アガロースゲルを介して電気泳動にかけ、そのゲル
を臭化エチジウムで染色後にＵＶ透照によってそのハイグロマイシン耐性遺伝子
の２７２塩基対断片を同定した。そのラット血液試料中のハイグロマイシン遺伝
子を同定できる能力は、時間に関して、図２に示されている。

【００９１】 実施例３ 保存冷凍ドナーリンパ球の遺伝子操作および自己移植 実施例３は、自己移植用細胞を遺伝子操作前に低温保存した以外は、実施例２
と同様に実施した。試料を、自己移植前に実施例１に記載のようにして解凍した
。自己移植における遺伝子発現維持の結果は、時間に関して、図３に示されてい
る。

【００９２】 実施例４ 若ラットおよび老ラットの骨髄間質性細胞の同系ないし自己移植 これらの調査にはスプラクダウレイ（Spraque Dawley）ラットを使用した。骨
髄細胞（１ml当たり２×１０⁶の細胞）の懸濁液を、若ラット（８週齢）および
老ラット（６０週齢）から採った肋骨（さらにまた大腿骨）の生検より調製した
。細胞試料を４００×重力で遠心分離にかけ、得られた細胞ペレットを自家血漿
の１０％ＤＭＳＯ中に再懸濁し、続いて液体窒素および／または次いで液体ヘリ
ウム中に低温保存した。

【００９３】 低温保存後３ヶ月〜２年に細胞試料を生き返らせ、培地中に２×１０⁶細胞／m
lで懸濁した。それぞれの試料懸濁液に一つの多孔性ハイドロキシアパタイト（h
ydroxyapataite）ディスクを加え、２４時間放置してそれに細胞を付着させ、細
胞／ＨＡの複合物を得た。次いでこれらの複合物を自己または同系いずれかの移
植片として皮下移植した。８週後にそれらの移植片を除去し、組織分析並びにオ
ステオカルシンおよびアルカリホスファターゼの測定に付した。

【００９４】 実験群は以下のとおりであった。 (１) ８週齢の若ラットから採取した骨髄細胞を多孔性ハイドロキシアパタイト
（ＨＡ）とともに２４時間インキュベートして、骨髄細胞／ＨＡ複合物を得た。
次いでそれらの複合物を（ａ）自己移植するか、または（ｂ）同一齢のラットに
、または（ｃ）６０週齢のラットに、または（ｄ）１０４週齢のラットに同系移
植した。

【００９５】 (２) ６０週齢の老ラットから採取した骨髄細胞を多孔性ハイドロキシアパタイ
トとともに２４時間インキュベートして、骨髄細胞／ＨＡ複合物を得た。次いで
それらの複合体を（ａ）自己移植するか、または（ｂ）８週齢のラットに同系移
植するか、または（ｃ）６０週齢のラットに同系移植するか、または（ｄ）１０
４週齢のラットに同系移植するかのいずれかを行った。

【００９６】 (３) ８週齢の若ラットから採取した骨髄細胞を、前述のように低温保存した。
９６週の低温保存の後に細胞を生き返らせ、多孔性ハイドロキシアパタイトとと
もに２４時間インキュベートして、骨髄細胞／ＨＡ複合物を得た。次いでそれら
の複合物を（ａ）自己移植する（採取したラットは１０４週齢である）か、また
は（ｂ）１０４週齢のラットに同系移植するか、または（ｃ）８週齢のラットに
同系移植するかのいずれかを行った。

【００９７】 (４) ６０週齢の老ラットから採取した骨髄細胞を記載したよう低温保存した。
４４週の低温保存の後に細胞を生き返らせ、多孔性ハイドロキシアパタイトとと
もに２４時間インキュベートして、骨髄細胞／ＨＡ複合物を得た。次いでそれら
の複合物を（ａ）自己移植する（採取したラットは１０４週齢である）か、また
は（ｂ）１０４週齢のラットに同系移植するか、または（ｃ）８週齢のラットに
同系移植するかのいずれかを行った。

【００９８】 結 果 組織学的定性分析によれば、自己移植または同系移植のいずれかで、新しい骨
形成を誘発させ得る若骨髄細胞と老骨髄細胞との間の能力には、明確な相違が証
明された。老骨髄細胞／ＨＡの複合物の４０％は、若ラットまたは老ラットのい
ずれかに移植した場合、骨形成を全く示さなかった。一方、若骨髄細胞からなる
全ての複合物では骨が形成された。その結果は、骨髄細胞が低温保存され、そし
て移植前に生き返らせられた場合の複合物と同一であった。

【００９９】 若骨髄細胞および老骨髄細胞から形成された各複合物間のオステオカルシン発
現およびアルカリホスファターゼ活性の相違は、非常に有意であった。平均的に
は、オステオカルシン発現は、老細胞含有複合物と比べると、若細胞含有複合物
では８〜１０倍高かった。若細胞を含有する複合物対老細胞を含有する複合物と
の間での、発現されたオステオカルシンの８〜１０の比率は、低温保存および生
き返らせのために、または自己移植よりもむしろ同系移植のために有意に変化し
なかった。

【０１００】 アルカリホスファターゼもまた、若細胞または老細胞のいずれかを含有する各
複合物の間で変化することが見られた。若細胞含有複合物は、老細胞の複合物の
４〜６倍のアルカリホスファターゼ活性を有した。オステオカルシン調査と同様
に、この比率の有意な変化は、各複合物の形成前の細胞の低温保存により、また
は自己移植よりもむしろ同系移植のために全く起こらなかった。

【０１０１】 下記表１は、種々の群に見られたオステオカルシン発現の比率を開示している
。

【表１】 表 １ グループｘ／グループｙ 比 率 １ａ／１ｂ １.３ １ａ／１ｃ １.４ １ａ／１ｄ １.５ ２ａ／２ｂ ０.９ ２ａ／２ｃ １.４ ２ａ／２ｄ １.６ ３ａ／３ｂ １.０ ３ａ／３ｃ １.０ ４ａ／４ｂ １.３ ４ａ／４ｃ ０.９ １ａ／２ａ ９.７ ３ａ／４ａ ９.８ １ａ／３ａ １.４ ２ａ／４ａ １.４

【０１０２】 下記表２は、種々の群に見られたアルカリホスファターゼ発現の比率を開示し
ている。

【表２】 表 ２ グループｘ／グループｙ 比 率 １ａ／１ｂ １.１ １ａ／１ｃ １.３ １ａ／１ｄ １.３ ２ａ／２ｂ １.３ ２ａ／２ｃ １.５ ２ａ／２ｄ １.８ ３ａ／３ｂ １.１ ３ａ／３ｃ ０.９ ４ａ／４ｂ １.３ ４ａ／４ｃ ０.９ １ａ／２ａ ５.８ ３ａ／４ａ ５.９ １ａ／３ａ １.１ ２ａ／４ａ １.１

【０１０３】 若ラットおよび老ラットからの各骨髄細胞の骨形成能力並びに骨グラ（ｇｌａ
）タンパク質およびアルカリホスフォターゼ活性における同様の相違が、それぞ
れ、同系ラットを用いたInoue氏等（1997）によって報告されている。しかし、I
noue氏等は、若細胞および老細胞の骨形成能力に及ぼす低温保存の効果、並びに
若細胞および老細胞の骨形成能力のこの明確な相違が、自己移植の場合にも当て
はまるかどうかについては報告していない。

【０１０４】 実施例５ 成熟ラットへの神経細胞の自己移植 ３ヶ月齢の成熟ラットを定位固定フレームに入れ、ブレグマレベルにある側脳
室の上に横たわっている頭蓋骨の領域を除去した。平滑末端の滅菌ガラスミクロ
ピペット（ＩＤ＝１００mm）を中線の外側１.４mmにある脳の中に挿入した。そ
のピペットを脳側室の背側部分中に下げ、その点において、吸引を制御しながら
、少量の脳脊髄液（ＣＳＦ）を回収した。さらに吸引を制御しつつ、そのピペッ
トをさらに下げて、脳側室の各側に存在する神経組織の脳室層、脳室下層および
その他の層を通過させた。組織、細胞およびＣＳＦの懸濁液を、そのピペットの
大径部分に収集した。生検の終了時に、その懸濁液を摩砕し（時々、事前に例え
ばトリプシンで酵素消化を行う）、そして培地含有の小さな組織培養フラスコ中
に排出した。このような培地は、Ｌ−グルタミン（２mM）、ペニシリン：ストレ
プトマイシン（１００IU／ml：１０mg／ml）および１０ng／mlの表皮性生長因子
（ＥＧＦ）、５ng／mlの塩基性繊維芽細胞生長因子（ＦＧＦ）等を含有する調製
原液（PNAS USA 76 (1979) 514; J Neurophysiol 40 (1981) 1132）の補給され
たダルベッコの変形イーグル培地およびハムＦ１２（Ham's F12）（５０／５０v
/v）の混合物からなる。時には、複製神経細胞との膜間共培養またはそのような
細胞からのならし培地も、新たに分離された成熟細胞の生存を助けるのに使用し
た。

【０１０５】 複製しつつある細胞のクラスターは拡大し、そして４〜６個の部分に区分化し
次いで再び平板培養することにより“継代した”（passaged）。これにより長期
の拡大が可能になった。細胞クラスターまたはそれらより誘導された機械的に分
離した細胞を、この段階または分化（後記参照）後のいずれかに、慣用方法で１
０％ＤＭＳＯ含有培地中に冷凍した。次いでそれらを気／液相窒素中に入れ、次
に気／液相ヘリウム中で１年間長期保存した。

【０１０６】 解凍した冷凍複製細胞または分離した複製クラスター由来の細胞を回転培養管
中で再び平板培養し、ＥＧＦなし以外は同一の培地中で次の数日間分化させた。
いくつかの細胞は、融合性（しかし依然として複製）線条体細胞で条件付けされ
た培地の存在下で分化して、支持因子と分化−指向／誘発因子の両因子を得た。
その後、得られたそれらの分化した細胞クラスター（約百万個の細胞）を、一方
的に１０日前にイボテン酸の線条体内注入により損傷をきたした最初のドナーラ
ットに注入した。 あるいはまた、これらの細胞を前述のように冷凍し、次いで
解凍し、損傷をきたしたその線条体に注入した。３ヵ月後、各動物を潅流により
固定し、それらの移植片を免疫組織化学法により分析した。

【０１０７】 生き残った移植片は、全ての移植された動物に見出された。それらの移植片は
、依然として、有髄繊維束が大部分増殖することができない領域として明らかに
区別することが可能ではあったけれども、宿主線条体に十分一体化した。生存移
植片の割合は、ドナー細胞がいずれの段階で冷凍されたかによっては影響されな
かった。実際、冷凍操作を経た細胞を有する動物は、非冷凍細胞よりも大きな移
植片を持ち、そしてそのような移植細胞中の神経線維の発現もまた、より強くて
かつ広範囲にわたっているようであった。同様に、いくらかのＧＦＡＰ発現をそ
の移植片中に見ることができた。

【０１０８】 実施例６ １年後の細胞生存力に及ぼす保存温度の効果 示された型の各細胞の適量の二つをテキストに記載の手法で冷凍し、１分当た
り１℃で冷却する１時間の終了時に、液体窒素中に１時間入れた。その時間に、
適量の各一対の一方をテキストに記載の手法で解凍し、次いで臭化エチジウム排
出（exclusion）／アクリジンオレンジ混入を用いて、細胞生存力について分析
した（Brain Res 331 (1985)251）。他方の適量を約１年間液体ヘリウム中に入
れ、次いで解凍し、同一の方法により細胞生存力を評価した。結果は下記表３に
示されているとおりである。各図は、６個の試料対の平均およびＳＥＭであり、
液体窒素中での１時間後に生き残った細胞の割合として表示されている。より低
い温度が、長期間の細胞の生存力の、小さいがしかし有意な強化をもたらすこと
が可能であることが分かるであろう。

【０１０９】

【表３】

【０１１０】 実施例７ ２年後の細胞生存力に及ぼす保存温度の効果 細胞の適量を２年間液体ヘリウム中に保存して、実施例６の“１年”調査を繰
り返した。次いで細胞を解凍し、細胞生存力を実施例６に記載のようにして評価
した。結果は表４に示されているとおりである。各図は、６個の試料対の平均お
よびＳＥＭであり、液体窒素中での１時間後に生き残った細胞の割合として表示
されている。２年間の保存後に、同様に良好な生存力の結果を得ることができる
ことが分かるであろう。

【０１１１】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｘ線照射したラットの生存における凍結保存した自家白血球の再注入の効果を
示すヒトスグラムである。

【図２】 研究の全期間である移植後６ヶ月までの移植ラットにおける自家の、操作され
たＴリンパ球の保持を示すヒストグラムである。

【図３】 遺伝子工学的工程を凍結保存段階の前ではなく後に実施したこと以外は図２に
記載したのと同じ研究の結果を示すヒストグラムである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年２月１４日（２００１．２．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２４】 本明細書において、「罹病していない」という用語は、宿主生物が病気または
障害を被っていない、またはその症状を示していない状態を記載するのに用いら
れ、これは、引き続き、移植の手順によって処理する計画を持っていることであ
る。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年７月３日（２００１．７．３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２６】 たとえ、宿主の体の他の部分や範囲もしくは細胞または組織が病気または障害
に冒されていても、宿主生物の体の「罹病していない」部位または部分から細胞
を取り除くこともまた、含まれる。必要とされることは、取り除かれた細胞自体
が健康であること、すなわち、上記した定義の意味内において「罹病していない
」ことである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/02 Ａ６１Ｐ 19/02 19/10 19/10 25/00 25/00 31/18 31/18 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/10 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 4B065 AA92X AA94X AB01 BA02 BA30 BD09 CA44 4C081 AB01 AB11 BA12 CD34 4C087 AA01 AA02 BB34 BB43 BB44 BB45 BB46 CA04 MA01 NA14 ZA01 ZA96 ZA97 ZB21 ZB26 ZB33 ZB35 ZC55

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞を疾病または障害の進行または症状発現前に宿主生物か
   ら得、後の宿主生物の疾病または障害の自己移植治療において使用する細胞組成
   物を調製するための、罹病していない宿主生物から得た宿主細胞集団の使用。
2. 【請求項２】 宿主生物の疾病または障害の自己移植療法であって、その方
   法が罹病していないときに宿主生物から得た宿主細胞集団から調製した細胞組成
   物を宿主生物に移植することからなり、その際、細胞を疾病または障害の進行ま
   たは症状発現前に宿主生物から得ることを特徴とする方法。
3. 【請求項３】 細胞を疾病または障害の進行または症状発現前に宿主生物か
   ら得る、後の宿主生物の疾病または障害の自己移植治療において使用するための
   、罹病していない宿主生物から得た宿主細胞集団からなる組成物。
4. 【請求項４】 疾病または障害が進行しうるという予測、示唆または嫌疑が
   ない段階で宿主細胞を宿主生物から収集する、請求項１〜３のいずれか１項に記
   載の使用、方法または組成物。
5. 【請求項５】 移植療法が治療的である、請求項１〜４のいずれか１項に記
   載の使用、方法または組成物。
6. 【請求項６】 宿主生物がヒトである、請求項１〜５のいずれか１項に記載
   の使用、方法または組成物。
7. 【請求項７】 細胞を得る時期において宿主生物が少年、青年または成人で
   ある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用、方法または組成物。
8. 【請求項８】 細胞を得る時期において宿主生物の免疫系が成熟している、
   請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用、方法または組成物。
9. 【請求項９】 細胞を得る時期において宿主生物の免疫系が非易感染性であ
   る、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用、方法または組成物。
10. 【請求項１０】 宿主細胞集団が幹細胞または前駆細胞からなる、請求項１
    〜９のいずれか１項に記載の使用、方法または組成物。
11. 【請求項１１】 宿主細胞集団が成熟細胞からなる、請求項１〜９のいずれ
    か１項に記載の使用、方法または組成物。
12. 【請求項１２】 宿主細胞集団が造血組織または骨髄間質由来である、請求
    項１〜１１のいずれか１項に記載の使用、方法または組成物。
13. 【請求項１３】 宿主細胞集団が神経組織由来である、請求項１０に記載の
    使用、方法または組成物。
14. 【請求項１４】 宿主細胞集団がＴリンパ球細胞からなる、請求項１〜１２
    のいずれか１項に記載の使用、方法または組成物。
15. 【請求項１５】 Ｔリンパ球細胞が成熟Ｔリンパ球である、請求項１４に記
    載の使用、方法または組成物。
16. 【請求項１６】 宿主細胞集団が血液から得られたものである、請求項１〜
    １５のいずれか１項に記載の使用、方法または組成物。
17. 【請求項１７】 治療が慢性症状の治療である、請求項１〜１６のいずれか
    １項に記載の使用、方法または組成物。
18. 【請求項１８】 治療が癌の治療である、請求項１〜１６のいずれか１項に
    記載の使用、方法または組成物。
19. 【請求項１９】 治療が神経変性疾患の治療である、請求項１〜１６のいず
    れか１項に記載の使用、方法または組成物。
20. 【請求項２０】 治療が骨粗鬆症または変形性関節症の治療である、請求項
    １〜１６のいずれか１項に記載の使用、方法または組成物。
21. 【請求項２１】 治療がＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの治療である、請求項１
    〜１６のいずれか１項に記載の使用、方法または組成物。
22. 【請求項２２】 宿主細胞集団が休眠状態で維持される、請求項１〜２１の
    いずれか１項に記載の使用、方法または組成物。
23. 【請求項２３】 宿主細胞集団が遺伝子工学的に改変された細胞からなる、
    請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用、方法または組成物。
24. 【請求項２４】、宿主細胞集団が培養細胞からなる、請求項１〜２３のいず
    れか１項に記載の使用、方法または組成物。
25. 【請求項２５】 休眠中の幹細胞、前駆細胞またはＴリンパ球細胞を作製お
    よび／または維持する方法であって、幹細胞、前駆細胞またはＴリンパ球細胞を
    −２６９℃またはそれ以下の温度で凍結することからなる方法。
26. 【請求項２６】 幹細胞または前駆細胞が、造血組織、骨髄間質または神経
    組織由来である、請求項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 Ｔリンパ球細胞が造血組織または骨髄間質由来である、請
    求項２５に記載の方法。
28. 【請求項２８】 請求項２２に記載の方法により得られる休眠中の幹細胞、
    前駆細胞またはＴリンパ球細胞の集団。