CN105142650B - 自体骨髓源性干细胞的快速输注 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种方法及组合物，所述方法及组合物作为心血管病症的辅助治疗，用于骨髓源性干细胞的抽吸、处理、检测和输注。更具体地，本发明提供了用于骨髓源性干细胞的抽吸、分析、处理、输注物制备和输注的方法及组合物，特别地在快速即时检测环境中，其中所述骨髓的离心分离和光学监控分离产生预期浓度和粘度下的预期细胞产品。

Description

自体骨髓源性干细胞的快速输注
相关申请
本申请主张于2013年1月12日提交的美国临时申请，申请序列号为61/751846的优先权，所述申请公开的内容以引用方式全文明确地并入于此。
技术领域
本发明涉及一种快速即时检测(point-of-care)的方法和具有细胞群的组合物，所述快速检测方法用于对个体抽吸、分离、检测和递送预设剂量和粘度的获取自骨髓的细胞群及附带的因子(accompanying factors)；所述包含于组合物中的细胞群包括骨髓干细胞和/或祖细胞、抗凝剂以及37℃测量时小于或等于5.0厘泊(cP)的粘度。
背景技术
心血管疾病(CVD)是全球发病和死亡的首要原因。2008年，估计有1730万人死于CVD，占全球死亡总数的30％。在这些死者中，估计730万人死于冠心病，620万人死于脑卒中。更值得注意的是，低收入和中等收入国家不相称地被影响，推动对代替慢性药物治疗方案的再生疗法的需求，这种再生疗法必需以消除对高成本实验基础设施或血管导管实验室广泛多小时使用的需求的形式提供。超过80％的CVD死亡发生在低收入和中等收入国家，在男性和女性中几乎均等地发生。在CVD的病程中，动脉中发展出斑块损伤，其导致血管狭窄，并且在重症患者中，所述斑块病变脱落(break open)，在心脏、脑或肢体的重要部位产生血流阻断(缺血)。若短期内通过再灌注治疗，以及进一步在有或没有胞外因子的存在下通过成体组织源性干细胞的输注进行治疗，这种缺血是可能被逆转的。尽管医学治疗以及血管重建策略已有重大进展，但是若在早期不引入生物修复干预，患有急性心肌梗死(AMI)、慢性心力衰竭(CHF)、严重肢体缺血(CLI)和缺血性脑损伤(脑卒中)的特定患者的预后仍会不良。
与再灌注一起，辅助干细胞疗法对缺血性损伤所造成的心脏、脑和肢体受损组织的修复和再生已显示出潜在有效性。可从不同来源分离出这些干/祖细胞，其中一个来源是骨髓。自体的，骨髓源性为一种情况，外周血源性为第二种情况，脂肪源性为第三种情况，这类成体干/祖细胞规避了与胚胎干细胞相关的道德和法律问题。此外，它也终止了疾病传播和免疫排斥的风险。自体干细胞(具体是脂肪或外周血，最具体是骨髓源性细胞产品)的再生潜能受所采用的抽吸、处理和递送技术的高度影响。抗凝剂在再生细胞治疗的整体功效中起到了非常重要的作用，且长时间暴露于抗凝剂中已显示出对细胞的“干性(stemness)”具有负面的影响。在抽吸注射器和处理装置中使用抗凝剂让骨髓保持在非凝固态，使得干/祖细胞适当地分层、分离及输注以治疗临床病症。抗凝剂也在不同程度上抑制微血栓(microthrombae)的形成，若其被注入患者体内可能导致不良事件。也能理解的是在蛋白质或细胞(“生物制剂”)的存在下，任何化学个体的加入都可能对所述生物制剂的结构或功能具有影响。因而，所用的抗凝剂、所用的浓度以及细胞暴露于抗凝剂中的时间单独地、潜在地、累计地对干细胞治疗功效和安全性的整体效果起到至关重要的作用。理想的干细胞相容的抗凝剂必须处于最优的浓度比率平衡，以在一段限定的时间内维持细胞治疗浓缩物或输注物处于抗凝态，以完成介入步骤，并减少或消除血管内血栓的形成同时最小化围手术期出血和干细胞调控(modulation)的风险。
肝素是骨髓抽吸中最常用的抗凝剂。但是已被报道肝素会干扰干细胞和/或祖细胞的移动和归巢机制(homing mechanism)，从而削弱这些细胞的功能治疗能力。此外，肝素与围手术期出血的高发率有联系，这可能与它们不能和连于凝块上的凝血酶(clot-boundthrombin)结合相关。更进一步地，在体内通过将肝素与血小板因子-4(PF-4)结合，所述肝素可被灭活。对肝素-PF-4复合物表达抗体的某些个体暴露于肝素时，会经历肝素诱导的血小板减小症(HIT)。
抗凝骨髓抽吸物处于异源混合物(包括造血干细胞(“HSC”)、间充质干细胞(MSC)、内皮祖细胞(“EPC”)、CXCR4阳性细胞、白血球(“WBC”)、红血球(“RBC”)、血小板(“PLT”)、含血清蛋白和代谢物的血浆(“PLASMA”)和脂肪(“FAT”))中，且不适用于以原始抽吸物形式直接递送到患者的血管系统中。此外，为了可重现的病人到病人的治疗功效以便正确地限定治疗细胞混合物的一致性(constituency)，以及为了制备治疗细胞浓缩物的安全的剂量特定体积(dose specific volume)，必须在短时间内从无效的和非预期的细胞与脂肪中纯化、分离或捕获治疗有效的细胞(HSC、MSC、WBC、EPC和CXCR4阳性细胞)，以在即时检测中产生浓缩的治疗剂量的细胞及因子。
细胞的纯化，具体是包含所需HSC、EPC、MSC和其他干/祖细胞的WBC的纯化，历史上通过如下方法完成：将所述细胞置于封闭装置(containment device)中，并在重力下使用基于化学密度的方法或基于自动的不含化学品的系统采用标准离心分层。在一段限定的时间内，源自红骨髓和间质的骨髓细胞在特定的重力(“g力”)下，将依据它们各自的密度分层，从而自下而上在所述封闭装置中产生细胞层，其中RBC(最稠密的)在底部，随后是有核的RBC和VSEL、WBC、PLT、PLASMA和FAT。两种方法都简单地获得血沉棕黄层，其典型地被限定为RBC/成核RBC部分之上和PLT部分之下的细胞层。
理想的细胞纯化流程包含闭合的最小化操控步骤(closed minimallymanipulated procedure)，用于从不需要的成熟RBC中快速分层与分离所需的HSC、EPC、MSC以及其他干/祖细胞，这些细胞在本文中也可被称为干细胞或MNC或祖细胞或骨髓浓缩物富集的祖细胞(BMCEPC)；并以PLASMA注满所需细胞成分至出于安全考虑的合适的体积和粘度，并通过干细胞友好的装置(如整体交换(over the wire)球囊导管或器官内递送套管)有效地递送至血管系统。
通过导管操作递送干细胞是向近端受累器官输注细胞的理想方法。但是，经导管传输的细胞在若干方面对所需细胞可能具有潜在的负面影响。首先，细胞承受变化的剪切应力，这取决于它们与内腔壁接近度、注射速率、内腔半径及流体的粘度；其次，由于内腔是聚合物基质，其可潜在地影响细胞和细胞膜，其通过活化、结合或脱落而产生的接触会是重要的。
经导管递送干细胞至血管系统期望通过如下方法实现：在外周血管中引入血管内导管，并通过充气血管内囊，在一定预设时间内减缓或阻止血流，在导管尖的近端或末端的目标器官中诱导暂时性缺血。这种缺血改善干和祖细胞到缺血组织的归巢，并增加细胞引发一个或多个过程的机会，所述过程包括但不限于：组织整合、细胞融合、细胞分化和/或旁分泌因子释放。通过对顺应性或非顺应性囊充气以减少或阻止血流来最佳诱导缺血，同时加倍注意从而最小化任何源自囊增压的内皮壁损伤。
因此，需要一种改善的方法和组合物，用于骨髓细胞的抽吸、处理和递送，以使骨髓源性干细胞为缺血性疾病的血管再生和/或器官修复提供安全和有效的辅助治疗。
发明内容
已开发出快速和有效的方法及完备的即时检测试剂盒，其用于在短于90分钟的时间内对分离自骨髓的自体干细胞及因子的抽吸、处理和输注。在一些实施方案中，用于骨髓采集和处理的方法包括一定量或浓度的抗凝剂，优选是比伐卢定，其最小化凝块形成的时间达90分钟，而不影响干细胞治疗的功效。
本发明所描述的一些实施方案产生了预期的包括干细胞和/或祖细胞的混合物，所述混合物包含血沉棕黄层干细胞和/或祖细胞，如与取自骨髓的普通细胞群相比，具有减少或降低量的红细胞(RBC)的造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)、内皮祖细胞(EPC)和CXCR4阳性细胞。
本发明所描述的一些实施方案提供了在即时检测环境中的快速细胞输注物分析，保证了用于细胞治疗的充足而有活力的剂量。
本发明所描述的一些实施方案，在受控的粘度和流速下通过手动或计量机制输注细胞群，所述细胞群含有一定粘度下的骨髓源性干细胞和/或祖细胞，所述粘度在正常人体温度下测量(如：37℃时粘度为5.0cP、4.5cP、4.0cP、3.5cP、3.0cP、2.5cP、2.0cP、1.5cP或1.0cP)，以确保有活力的和有效的细胞剂量可经导管注射被递送，同时最小化剪切应力。
本发明所描述的一些实施方案，经导管输注上文所述的细胞群混合物，所述导管包括适当和安全的囊充气控制机制。
一些实施方案包含了除氯化钠缓冲剂外作为唯一添加的化学品的抗凝剂。在一些实施方案中所述抗凝剂是比伐卢定。与许多抗凝剂不同的是，比伐卢定产生很少溶血或不产生溶血。
本发明的实施方案也包括一次性离心细胞分层装置，其可具有可控的阀门，能够对电机驱动的开关位置做出响应或可具有密度功能分离装置，以可采集位于所述装置之上或之下的骨髓源性细胞群。一些实施方案包括了任选的装载固件，用于控制多层区域特定细胞群的问询(interrogation)和采集，其通过光源透射值对预设光单元的响应不同或密度等于目标细胞密度对质量比率的等密度分离装置驱动，上述一些实施方案还包括用于核实特定细胞群或细胞剂量和特定群粘度的快速分析仪器，以及血管内囊导管，其中对位于目标器官近端的所述囊在规定时限内进行充气，阻止80-100％的血流以诱发缺血。在一些实施方案中，所采集的细胞和因子的受控最低细胞剪切输注导致减轻程度的细胞凋亡或其他细胞死亡，所述输注经套管腔，以0.5mL-2.5mL每分钟的速度由装置进行控制或计量，所述装置例如是机械泵或可解释为在线式手动压力计的手动控制法。
本公开通过引用进一步总结得到下述实施方案：
1.一种组合物，其包括：
(a)包含骨髓干细胞和/或祖细胞的第一细胞群，
(b)抗凝剂，以及
(c)缓冲水溶液和/或自体血清和/或自体血浆成分，
其中所述组合物具有的粘度在37℃测量时不大于5.0厘泊(cP)。
2.实施方案1所述的组合物，其中含有骨髓干细胞和/或祖细胞的所述第一细胞群是自体的。
3.实施方案2所述的组合物，其中含有骨髓干细胞和/或祖细胞的所述第一细胞群源自所述患者骨骼中的髓腔。
4.实施方案3所述的组合物，其中所述骨骼是髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、胸骨或肋骨。
5.实施方案3所述的组合物，其中包含骨髓干细胞的所述第一细胞群源自髂嵴腔中的髓腔。
6.实施方案1-5中任一项所述的组合物，其中所述抗凝剂选自由香豆素、维生素K拮抗剂、间接凝血酶抑制剂、肝素、因子Xa抑制剂、直接凝血酶抑制剂、巴曲酶、血红素(hemetin)、纯化的植物提取物、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐和硝基血红素(nitrophorin)组成的组。
7.实施方案1-6中任一项所述的组合物，其中所述抗凝剂是直接凝血酶抑制剂。
8.实施方案1-5中任一项所述的组合物，其中所述抗凝剂包含比伐卢定。
9.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定提供自具有1mg/mL-50mg/mL的浓度的储备溶液。
10.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定提供自具有5mg/mL-35mg/mL的浓度的储备溶液提供。
11.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定提供自具有10mg/mL-25mg/mL的浓度的储备溶液提供。
12.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定提供自具有18mg/mL-22mg/mL的浓度的储备溶液提供。
13.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定提供自具有20mg/mL的浓度的储备溶液提供。
14.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定以1mg/mL-3mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
15.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定以1.5mg/mL-2.5mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
16.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定以1.8mg/mL-2.2mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
17.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定以2mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
18.实施方案1-17中任一项所述的组合物，其中在37℃测量的所述粘度是1.0cP-5.0cP。
19.实施方案1-17中任一项所述的组合物，其中在37℃测量的所述粘度为1.8cP-3.0cP。
20.实施方案1-17中任一项所述的组合物，其中在37℃测量的所述粘度为2.0cP-2.5cP。
21.实施方案1-17中任一项所述的组合物，其中在37℃测量的所述粘度为3.1cP-5.0cP。
22.实施方案1-21中任一项所述的组合物，其中所述缓冲水溶液包含离子盐。
23.实施方案1-21中任一项所述的组合物，其中所述缓冲水溶液包含氯化钠。
24.实施方案1-21中任一项所述的组合物，其中所述缓冲水溶液包含氯化钠，且所述组合物中所述氯化钠的量是0.9％。
25.实施方案1-24中任一项所述的组合物，其中包含骨髓细胞的所述细胞群包括单核细胞，所述单核细胞包含至少一种干细胞和/或祖细胞，所述干细胞和/或祖细胞选自由造血干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞和CXCR4阳性细胞组成的组。
26.实施方案1-25中任一项所述的组合物，其中包含骨髓细胞的所述细胞群包含至少107个单核细胞。
27.实施方案1-25中任一项所述的组合物，其中包含骨髓细胞的所述细胞群包含不多于109个单核细胞。
28.实施方案1-25中任一项所述的组合物，其中包含骨髓细胞的所述细胞群包含至少104个造血干细胞。
29.实施方案1-25中任一项所述的组合物，其中包含骨髓细胞的所述细胞群包含至少5×102个间充质干细胞。
30.实施方案1-25中任一项所述的组合物，其中包含骨髓细胞的所述细胞群包含至少5×102个内皮祖细胞。
31.实施方案1-25中任一项所述的组合物，其中包含骨髓细胞的所述细胞群包含至少5×103个CXCR4阳性细胞。
32.实施方案1-31中任一项所述的组合物，其中包含骨髓细胞的所述细胞群含有至少107个到不多于109个单核细胞、至少104个造血干细胞、至少5×102个间充质干细胞、至少5×102个内皮祖细胞和至少5×103个CXCR4阳性细胞。
33.实施方案1-32中任一项所述的组合物，其中所述组合物在流速为2.5mL/min下递送一小时后显示出的细胞凋亡或其它细胞死亡率不超过约40％，所述递送通过内腔尺寸大约为0.36mm的导管和使用保持压力为28.39psi，柱塞力为4.85lbf的5mL注射器进行。
34.实施方案1-32中任一项所述的组合物，其中所述组合物经导管递送，若所述导管承受的最大剪应力不超过9101/秒，递送一小时后显示的细胞凋亡或其它细胞死亡率不超过约40％。
35.一种制备再生细胞组合物的方法，其包括：
(a)提供包含骨髓干细胞和/或祖细胞的第一细胞群；
(b)混合抗凝剂与所述第一细胞群，以便生成包含所述第一细胞群和抗凝剂的组合物；
(c)富集包含所述细胞群和抗凝剂的所述组合物中的骨髓干细胞，以便生成包含富集的骨髓干细胞和/或祖细胞的第二细胞群。
(d)分离包含含有富集的骨髓干细胞和/或祖细胞的所述第二细胞群中的部分；并
(e)使用液体调节所述部分的粘度至37℃测量时不大于5.0cP，以便制备所述再生细胞组合物。
36.实施方案35所述的方法，其中包含骨髓干细胞和/或祖细胞的所述第一细胞群包含从骨髓抽吸的细胞。
37.实施方案36所述的方法，其中从骨髓抽吸的所述细胞通过抽吸针进行抽吸，所述抽吸针的针/套管针为8-14型(gauge)。
38.实施方案36中所述的方法，其中从骨髓抽吸的所述细胞通过抽吸针进行抽吸，所述抽吸针的针/套管针为10-12型。
39.实施方案36所述的方法，其中从骨髓抽吸的所述细胞通过抽吸针进行抽吸，所述抽吸针的针/套管针为11型。
40.实施方案35-39中任一项所述的方法，其中抽吸的所述细胞在小于20psi的负压下通过针/套管针进行抽吸。
41.实施方案35-39中任一项所述的方法，其中抽吸的所述细胞在小于15psi的负压下通过针/套管针进行抽吸。
42.实施方案35-39中任一项所述的方法，其中抽吸的所述细胞在小于10psi的负压下通过针/套管针进行抽吸。
43.实施方案35-39中任一项所述的方法，其中抽吸的所述细胞在小于5psi的负压下通过针/套管针进行抽吸。
44.实施方案35所述的方法，其中所述液体是自体血浆成分。
45.实施方案35所述的方法，其中所述液体是自体血清或血浆成分，其包含液体，从所述液体中分离出所述部分，其包括含有富集的骨髓源性干细胞和/或祖细胞的所述第二细胞群。
46.实施方案35所述的方法，其中在从个体中得到所述包含骨髓干细胞和/或祖细胞的第一细胞群之前，所述抗凝剂与包含骨髓干细胞和/或祖细胞的所述第一细胞群接触。
47.实施方案35所述的方法，其中在从所述个体中得到包含骨髓干细胞和/或祖细胞的所述第一细胞群之后，所述抗凝剂与包含骨髓干细胞和/或祖细胞的所述第一细胞群接触。
48.实施方案47中所述的方法，其中通过手动搅拌含有所述第一细胞群和所述抗凝剂的容器，将所述抗凝剂与所述第一细胞群至少部分地混合。
49.实施方案48所述的方法，其中所述搅拌包括滚动所述容器。
50.实施方案35-49中任一项所述的方法，其中所述抗凝剂包括比伐卢定。
51.实施方案50所述的方法，其中所述比伐卢定以1mg/mL-3mg/mL的浓度提供。
52.实施方案50所述的方法，其中所述比伐卢定以1.8mg/mL-2.2mg/mL的浓度提供。
53.实施方案50所述的方法，其中所述比伐卢定以2.0mg/mL的浓度提供。
54.实施方案35-49中任一项所述的方法，其中在37℃测量的所述粘度是1.0cP-5.0cP。
55.实施方案35-49中任一项所述的方法，其中在37℃测量的所述粘度是1.8cP-3.0cP。
56.实施方案35-49中任一项所述的方法，其中在37℃测量的所述粘度是3.1cP-5.0cP。
57.实施方案35-49中任一项所述的方法，其中所述液体是包含离子盐的缓冲水溶液。
58.实施方案57所述的方法，其中所述缓冲水溶液包含氯化钠。
59.实施方案58所述的方法，其中所述再生细胞组合物中所述氯化钠的量为0.9％。
60.一种在个体中改善缺血或与缺血相关症状的方法，其包括：
识别个体，其具有缺血或与缺血相关的症状；
向所述个体提供一种组合物，其包括：
(a)含有骨髓干细胞和/或干细胞祖细胞的第一细胞群，
(b)抗凝剂，以及
(c)缓冲水溶液和/或自体血清和/或自体血浆成分，
其中，所述组合物具有的粘度在37℃测量时为不大于5.0厘泊(cP)；且
确定缺血或与缺血相关的所述症状的改善，如通过在所述个体中测量或观察血流的增加、左心室射血分数的改善、心输出量的改善、心脏瘢痕形成的减少、心脏重构的改善、血管发生的增加、血管分布的增加、神经瘢痕形成的改善或免截肢(amputation-free)生存率的增加。
61.实施方案60所述的方法，其中得到包含骨髓干细胞的所述第一细胞群后，向所述个体提供所述组合物不超过2小时。
62.实施方案60所述的方法，其中得到包含骨髓干细胞和/或祖细胞的所述第一细胞群后，向所述个体提供所述组合物不超过90分钟。
63.实施方案60所述的方法，其中得到含有骨髓干细胞和/或祖细胞的所述第一细胞群后，向所述个体提供所述组合物不超过60分钟。
64.实施方案60-63中任一项所述的方法，其中在所述个体的缺血组织中的血流被阻断1-3分钟。
65.实施方案60-64中任一项所述的方法，其中在所述个体的缺血组织中的血流被阻断2分钟。
66.实施方案64-65中任一项所述的方法，其中所述血流被充气囊阻断。
67.实施方案66所述的方法，其中所述囊被充气以阻断所述囊远端至少80％的血流。
68.实施方案60-67中任一项所述的方法，其中所述组合物以不大于2.5mL每分钟的速度提供给所述个体。
69.实施方案60-68中任一项所述的方法，其中提供给所述个体的所述组合物不经受超过9101/秒的最大剪应力。
70.实施方案60-69中任一项所述的方法，其中所述组合物通过内腔尺寸约0.36mm的导管提供给所述个体。
71.实施方案60-70中任一项所述的方法，其中所述组合物以每剂5mL的剂量提供给所述个体。
72.实施方案60-70中任一项所述的方法，其中所述组合物以不超过表2参数组1的那些参数的一组参数条件提供。
73.实施方案60-70中任一项所述的方法，其中所述组合物以不超过表2参数组2的那些参数的一组参数条件提供。
74.实施方案60-70中任一项所述的方法，其中所述组合物以不超过表2参数组3的那些参数的一组参数条件提供。
75.实施方案60-70中任一项所述的方法，其中所述组合物以不超过表2参数组4的那些参数的一组参数条件提供。
76.实施方案60-70中任一项所述的方法，其中所述组合物以不超过表2参数组5的那些参数的一组参数条件提供。
77.实施方案60-70中任一项所述的方法，其中所述组合物以不超过表2参数组6的那些参数的一组参数条件提供。
78.实施方案60-71中任一项所述的方法，其中所述组合物以单份剂量提供。
79.实施方案60-71中任一项所述的方法，其中所述组合物以至少两份剂量提供。
80.实施方案60-71中任一项所述的方法，其中所述组合物以每剂5mL的四份剂量提供。
81.实施方案60-71中任一项所述的方法，其中所述组合物以每天单份剂量提供多天。
82.实施方案60-71中任一项所述的方法，其中所述组合物以每天至少两份剂量提供多天。
83.实施方案60-82中任一项所述的方法，其中向所述个体提供所述组合物，接着是在每剂提供后不超过5分钟的休息期。
84.实施方案60-82中任一项所述的方法，其中向所述个体提供所述组合物，接着是在每剂提供后不超过4分钟的休息期。
85.实施方案60-82中任一项所述的方法，其中向所述个体提供所述组合物，接着是在每剂提供后不超过3分钟的休息期。
86.实施方案60-82中任一项所述的方法，其中向所述个体提供所述组合物，接着是在每剂提供后不超过2分钟的休息期。
87.实施方案60-82中任一项所述的方法，其中向所述个体提供所述组合物，接着是在每剂提供后不超过1分钟的休息期。
88.实施方案83-87中任一项所述的方法，其中最后的休息期后，接着以不超过每分钟2.5mL的速度提供3mL剂量的追加液，以排空任何残留的细胞。
89.实施方案60-86中任一项所述的方法，其中所述组合物于血管内提供。
90.实施方案60-86中任一项所述的方法，其中所述组合物于肌内提供。
91.实施方案60-86中任一项所述的方法，其中所述组合物于动脉内提供。
92.实施方案60-86中任一项所述的方法，其中所述组合物于冠动脉内提供。
93.实施方案60-92中任一项所述的方法，其中所述组合物通过使用涂有生物相容材料的导管提供。
94.实施方案60-93中任一项所述的方法，其中所述组合物包括实施方案1-34中任一项的所述组合物。
95.实施方案60-93中任一项所述的方法，其中所述组合物包括根据实施方案38-61中的方法制得的任一再生细胞组合物。
96.实施方案60-95中任一项所述的方法，其中所述缺血为心肌缺血。
97.实施方案60-95中任一项所述的方法，其中所述缺血为危急的肢体缺血。
附图说明
图1：治疗方法的图示，在心脏导管插入操作中对于任意床旁治疗达到的理想的时间范围。
图2A：输注BMCEPC 3个月后用于计算心肌体积的一部分心脏MR叠加。
图2B：输注BMCEPC 3个月后的左心室透壁指数(transmurality index)。
图2C：输注BMCEPC 24个月后用于计算心肌体积的一部分心脏MR叠加。
图2D：输注BMCEPC 24个月后的左心室透壁指数。
图3A：本研究入组受试者编号为EHIRC/CLI-STEM-002的治疗前(左腿)的CT血管造影(典型实施例)，显示出差的血管分布。
图3B：本研究入组受试者编号为EHIRC/CLI-STEM-002的治疗12个月后(左腿)的CT血管造影(典型实施例)，与上图3A相比显示出改善的血管分布。
发明详述
本公开的实施方案的一些方面包括制备细胞群的方法，所述细胞群对缺血病症(例如：心肌缺血、肢体缺血)的转好或改善与传统细胞群相比显著地提升。已形成细胞群的特殊制剂及其使用方法，其出乎意料地改善了缺血病症(如：与传统方法相比，心肌缺血后左心室射出分数(LVEF)大于4倍的改善，以及肢体缺血后免截肢生存率多于25％的改善)。已经发现含有干细胞和祖细胞的传统细胞群不具有合适的粘度和/或抗凝剂，且不能以改善或提高细胞活力的方式递送至受试者。因此，本发明的一些方面涉及包含第一细胞群的组合物和递送方法，所述第一细胞群包括骨髓细胞和祖细胞、抗凝剂、缓冲水溶液和/或自体血清和/或自体血浆成分，其中所述组合物具有的粘度在37℃时测量时不大于5.0厘泊(cP)，所述递送方法使得组合物以不大于2.5mL/分钟的速率提供给受试者。
本公开的实施方案的一些方面包含骨髓抽吸的方法，其包括a)比伐卢定溶液的制备，b)以抗凝剂溶液填充针管，及c)将骨髓抽吸至装有所述抗凝剂的针管中。所述采集和处理骨髓的方法，进一步包括一定量的抗凝剂，其最小化凝块的形成达90分钟而不影响干细胞治疗的功效，并最小化不利的围手术期出血或凝血事件。一些实施方案的另一重要方面是在骨髓处理中，对任何异物或柠檬酸盐试剂的避免使用。
本公开的实施方案的一些方面包含含有骨髓干细胞和/或祖细胞的组合物。在某些情况下，对于特定的实施例，短语“骨髓干细胞和/或祖细胞”意在涵盖可能分化为特定细胞类型的骨髓细胞群，这不取决于它们是否会无限复制和/或产生生长因子和/或推动、贡献或促进血管的形成、血管直径的增加和/或组织中(例如，缺血组织)血流的增快。
若需要加入作为稀释剂并具有预期剂量和粘度限制内的血清，则更多的实施方案关注用于骨髓处理的快速分析和改善的技术，从而产生所需细胞产品的限定的混合物。采集的骨髓和处理的细胞产品的初始细胞计数将会在病人床旁快速地进行。所述细胞产品的混合物包括但不限于：造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)和/或根据用于CD34阳性细胞计数的ISHAGE指南确定的CD34阳性细胞；确定至少为谱系阴性/模糊(lineagenegative/dim)、CD45阴性/模糊和C73阳性细胞的间充质干细胞(MSC)和/或基质细胞；确定至少为CD45阴性/模糊、CD34阳性和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)阳性细胞的内皮祖细胞(EPC)；确定至少为谱系阴性/模糊、CD45阴性/模糊和CD184(CXCR4)阳性细胞的CXCR4祖细胞。所述祖细胞混合物也应具有集落形成能力，其通过对HSC/HPC、MSC/基质细胞和EPC的集落形成单位进行分析测定来评估。上文所述的细胞群包含各种各样的细胞类型，它们在损伤组织的整体治疗中协同工作。
与组合物一起，干细胞输注的剂量和配量方法属于实施方案。在即时检测环境中进行细胞混合物的快速检测，确保单核细胞(MNC)的范围是107-109个，其包括每剂不小于104个的HSC、每剂不小于5×102个的MSC、每剂不小于5×102个的EPC、每剂不小于5×103个的CXCR4阳性细胞，以及在华氏60°到华氏98.6°测量、普通人体温度下传输的处于1.0-5.0厘泊(cP)间的最终粘度，该粘度由细胞产品中的自体血浆滴定得到。作为辅助治疗，加工的细胞混合物的给药模式为以0.5mL-2.5mL每分钟的速度于肌内和/或血管内进一步输注。所述血管内途径进一步包括动脉内输注和静脉内输注；所述动脉内输注例如冠动脉内输注，通过采用至少含有两个独立内腔的导管进行，一个内腔用于递送细胞，其涂有生物相容性或生物惰性的聚合物，内径为0.012”-0.019”，另一个内腔用于对聚合物囊充气以限制血流；所述肌内给药模式包括心肌内、心外膜内、肌肉内给药等。
本公开的用于组合物及方法的原材料可以是骨髓。也涵盖了其它干细胞源。分离出干细胞的骨髓可选自由髂嵴、股骨、胫骨、胸骨、脊柱、肋骨和其他骨骼中的髓腔所组成的组。优选骨髓源是髂嵴。在一些实施方案中，干细胞和/或祖细胞源例如骨髓干细胞源对于将最终接受组合物的患者是自体的。在一些实施方案中，在开始骨髓抽吸之前，向抽吸注射器中填入抗凝剂溶液。许多抗凝剂来源被涵盖，例如香豆素、维生素K拮抗剂、间接凝血酶抑制剂、肝素、因子Xa抑制剂、直接凝血酶抑制剂、巴曲酶、血红素、纯化的植物提取物、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐和硝基血红素。优选抗凝剂是比伐卢定。
比伐卢定具有许多有益的性质，例如短半衰期(20分钟)和作用模式，其独立于许多其他的抗凝剂(例如肝素)其可被独立施用于进行获取干细胞源(如骨髓源)的外科介入手术的病人。在一些实施方案中，所使用抗凝剂(如比伐卢定)的浓度为0.9mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL、31mg/mL、32mg/mL、33mg/mL、34mg/mL、35mg/mL、36mg/mL、37mg/mL、38mg/mL、39mg/mL、40mg/mL、41mg/mL、42mg/mL、43mg/mL、44mg/mL、45mg/mL、46mg/mL、47mg/mL、48mg/mL、49mg/mL、50mg/mL、51mg/mL、52mg/mL、53mg/mL、54mg/mL或55mg/mL。在一些实施方案中，所使用的抗凝剂(如比伐卢定)的浓度处于1mg/mL-50mg/mL的范围内，优选5mg/mL-35mg/mL，更为优选10mg/mL-25mg/mL，最优选20mg/mL。例证性地说明，每个瓶中可包含250mg的比伐卢定，向其中加入5mL的无菌水以用于注射。可温和地旋转混合抗凝剂，如比伐卢定与水，例如直至所有材料溶解，溶液变得澄清。然后可抽吸所述溶液至无菌注射器中，例如20mL的无菌针管。可接着以0.9％的无菌氯化钠注入所述针管，例如，用于注射填充至12.5mL的刻度，以产生20mg/mL的最终浓度。然后可取三个无菌的20mL注射器，注入2mL的20mg/mL的比伐卢定溶液。而后可抽吸18mL的干细胞源至每个注射器中，以得到20mL的最终体积。每个注射器中抗凝剂(如比伐卢定)和抽吸的骨髓的最终浓度可以是2mg/mL。本领域普通技术人员知道用于骨髓抽吸的抽吸针头为7、8、9、10、11、12、13、14或15型，例如处于8-14型的范围，例如处于9-12型的范围，优选针头/套管针头是11型。干细胞和/或祖细胞源，如骨髓，被抽吸至针管或预先注入抗凝剂溶液的针管中，例如，使最终的累积体积达到120-180mL。所用抽吸注射器的体积可为4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL、16mL、17mL、18mL、19mL、20mL、21mL、22mL、23mL、24mL、25mL、26mL、27mL、28mL、29mL、30mL、31mL、32mL、33mL、34mL、35mL、36mL、37mL、38mL、39mL、40mL、41mL、42mL、43mL、44mL、45mL、46mL、47mL、48mL、49mL、50mL、51mL、52mL、53mL、54mL、55mL、56mL、57mL、58mL、59mL、60mL、61mL、62mL、63mL、64mL、65mL、66mL、67mL、68mL、69mL、70mL、71mL、72mL、73mL、74mL、75mL、76mL、77mL、78mL、79mL、80mL、81mL、82mL、83mL、84mL、85mL、86mL、87mL、88mL、89mL、90mL、91mL、92mL、93mL、94mL、95mL、96mL、97mL、98mL、99mL、100mL、101mL、102mL、103mL、104mL、105mL、106mL、107mL、108mL、109mL或110mL，优选地可落入5mL-100mL的范围，优选10-60mL、更优选20-50mL、最优选20mL。
对上文所述方法可做的修改不脱离本发明。例如，抽吸骨髓的切口可多于一处。在抽吸骨髓前可先向其注入一定量的抗凝剂溶液。下一步，通过在手掌间温和地滚动将抽取出的骨髓与抗凝剂溶液充分混合。骨髓而后被转移至用于分离骨髓组分的装置中，所述技术是已知的。
干细胞和/或祖细胞源，例如骨髓细胞，可从患者或受试者中移除，例如通过抽吸或切除。在一个优选实施方案中，所述干细胞源(如骨髓)通过抽吸移取。所述干细胞源(如骨髓)，例如抽吸出的骨髓，可以是自体的，且可于即时检测环境中被分析(无论是处理前还是处理后步骤)和处理。作为在即时检测环境中移取和检验的实施例是，首先采集120mL的抗凝骨髓。使用少量样品(小于0.5mL)快速地分析每mL样品中存在的有核细胞。若需要，采集30-60mL额外的骨髓样品用于处理，以得到所需的输注细胞剂量。在一些实施方案中，所述处理技术包括如下组分：(i)可处理骨髓的不同体积达200mL的单个无菌一次性的骨髓处理装置，(ii)控制模块，其含有至少一个重力传感器和一个或多个红外(IR)/光传感器，所述传感器与微处理器和电机相联接，后二者可控制所分离组分的流动、运动和区室化以使其进入独立的装置或区室中，(iii)用于控制模块的对接站(docking station)，将处理的数据从控制模块的硬件中传输至电脑，以及(iv)参数可编程控制的离心机。在一些实施例中，纯化装置包含至少一种上述组件。通过对本发明所述方法的实践，可从骨髓中分离干和祖细胞，以便优选的少于30分钟内在患者床旁制备出至少一种干细胞成分、一种血浆成分和一种红血球成分，其也可以充当自体血浆源。在一些实施方案中，干细胞成分、血浆成分和红血球成分在它们的粘度上可不同。在一些实施方案中，干细胞成分在37℃时具有的粘度可大于5.0cP，血浆在37℃时具有的粘度可小于5.0cP，比如在37℃时基本上小于5.0cP，这样在一些实施方案中可以向37℃时具有大于5.0cP粘度的干细胞成分中加入一定体积的血浆，使得含有干细胞成分和一定体积血浆的组合物在37℃时具有的粘度为5.0cP或更低。作为本发明有益地公开，滴定测量浓缩干细胞输注物(BMCEPC)粘度，以确保经导管运输时剪应力是受控的。可使用可能包括但不必须包括辅助软件的粘度计确定每单位(例如，厘泊(cP))干细胞的浓缩物粘度，并计算所需血浆的体积要求得到华氏98.6°或摄氏37°时处于1.8-5cP的优选范围的最终输注物。优选的输注物粘度是3.1cP-5.0cP，最优选输注物粘度是1.8cP-3.0cP，最优选输注物粘度是2.0cP-2.5cP，任何大于5.0cP的都不是优选的。在一些实施方案中，输注物粘度小于或等于或为下列数值间的任意数值：1.8cP、1.9cP、2.0cP、2.1cP、2.2cP、2.3cP、2.4cP、2.5cP、2.6cP、2.7cP、2.8cP、2.9cP、3.0cP、3.1cP、3.2cP、3.3cP、3.4cP、3.5cP、3.6cP、3.7cP、3.8cP、3.9cP、4.0cP、4.1cP、4.2cP、4.3cP、4.4cP、4.5cP、4.6cP、4.7cP、4.8cP、4.9cP或5.0cP。
干细胞源，例如骨髓，可使用例如一次性离心细胞分层装置将其分层，所述装置可具有能够对电机驱动的开关状态进行响应的控制阀，其也可具有密度功能分离装置，使得可获取所述装置之上或之下的骨髓源细胞群，虽然所述装置每个参数的变化与上文中所述参数一致，但是包括使用替代性装置或不使用如本公开的装置对细胞进行分层的装置的替代性选择也涵盖于此。一些实施方案包括任选的装载固件、快速分析仪和血管内置囊导管，所述装载固件用于在多层区域中控制特定细胞群的问询(interrogation)和采集，其通过光源透过率数值对预设光单元的响应不同或密度等于目标细胞密度对质量比率的等密度分离装置比来驱动；所述快速分析仪用于验证特定的细胞群或细胞剂量以及特定细胞群的粘度；所述血管内置囊导管对位于目标器官近端的所述囊进行指定时间的充气，阻止80-100％的血流以诱发缺血。在一些实施方案中，所采集的细胞和因子的受控最低细胞剪切输注导致减轻程度的细胞凋亡或其他细胞死亡，所述输注经套管腔以0.5mL-2.5mL每分钟的速度由装置进行控制或计量，所述装置例如是机械泵或可解释为在线式手动压力计的手动控制法。在一些实施方案中，细胞分级分离的有益实现基于下述分级分离方法：在2000x g下高速旋转15分钟，接着是在800x g下低速旋转5分钟，或其它变化，例如初次旋转为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分钟，初次g-力为1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500，第二次旋转时间为在40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或160的g-力下1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。
本发明所生成的组合物，如包含骨髓干细胞的细胞群，例如抽吸和处理的骨髓源性干细胞群，可以作为初级护理的辅助进行输注，例如对缺血(例如，心肌缺血和/或肢体缺血)响应的初级护理。在一些实施方案中，在组织变得缺血后不久输注所述干细胞组合物浓缩物，例如包含或不包含因子的经抽吸和处理的骨髓源干细胞和祖细胞群。在一些实施方案中，在组织缺血适应后输注所述干细胞组合物浓缩物，例如包含或不包含因子的经抽吸和处理的骨髓源干细胞群。在一些实施例中，缺血适应受梗阻的影响，如将血流停止于受累区域，例如使用整体交换(over the wire)充气囊充气以减少血流，或使用血流中其他可逆地活性阻塞物以阻塞或阻碍囊远侧的血流。在优选实施方案中，阻塞物如由导线引导的充气囊阻断80-99.99％的血流，例如大于或等于处于下列数值间的任意数值：80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或大于99％，或者在不超过三分钟的时间内，优选一分钟最优选两分钟。在短时组织缺血后，例如不超过三分钟的时间，优选一分钟最优选两分钟，接着以受控速率输注细胞，所述速率不超过2.5mL每分钟，例如0.5mL每分钟、0.6mL每分钟、0.7mL每分钟、0.8mL每分钟、0.9mL每分钟、1.0mL每分钟、1.1mL每分钟、1.2mL每分钟、1.3mL每分钟、1.4mL每分钟、1.5mL每分钟、1.6mL每分钟、1.7mL每分钟、1.8mL每分钟、1.9mL每分钟、2.0mL每分钟、2.1mL每分钟、2.2mL每分钟、2.3mL每分钟、2.4mL每分钟或达到2.5mL每分钟。
有益地公开了在高剪切率下输注，可能诱导本发明所生成的组合物(如干细胞组合物)中一大部分细胞凋亡/死亡，例如经抽吸和处理的骨髓源干细胞和/或祖细胞群。因此，在一些实施方案中，9101/秒的剪切率是所暴露的细胞的剪切率的上限。剪切率是导管直径和流速的函数。本公开有益地观察是，其中直径大约为0.36mm或0.014”、长度为1550mm且处于9101/秒的最大剪切率的导管，其对粘度为5cP的骨髓的输注应不超过2.5mL/min。可选地，在粘度大约为4cP，处于2.5mL/min的优选流速时，可在输注后一小时观察到(如通过细胞凋亡或其它细胞死亡)40％MNC的损失。因此，对于本发明中所生成组合物的输注的有益参数设置可包括组合物粘度为1.6-5cP、流速为0.5-2.5mL/min、内腔尺寸约为0.36mm，并使用5mL的针管我们可将保持压力在3.4-44.64psi，同时柱塞压为0.58-25.0lbf，并最小化所述组合物中的细胞凋亡和其它细胞的死亡，其中所述组合物可为干细胞组合物，例如经抽吸和处理的骨髓源干细胞和祖细胞群，作为辅助的初级护理进行输注，所述辅助的初级护理为对缺血进行响应的初级护理。观察到使用手动递送的含有高粘度组合物的输注物可对所应用的不同柱塞力更为敏感。因此，在一些实施方案中优选使用5mL的注射器，如在一些实施方案中与更大容量的注射器相比，其能降低给定压力下所需的力，在一些实施方案中可能是有益的，例如工效学有益地，用于促使递送速率的控制更加一致。
流速、粘度、压力、注射器尺寸和柱塞压力对剪切率影响的研究示于下表1中。
表1.
对于给定的9101/s的最大剪切率，粘度、压力、注射器尺寸和柱塞力的范围示于下表2中。
表2
参数组 粘度(cP) 压力(Psi) 注射器尺寸(mL) 柱塞力(lbf)
1 2 22.32 5 3.81672
2 4 44.64 5 7.63344
3 2 22.32 10 5.64696
4 4 44.64 10 11.29392
5 2 22.32 20 9.79848
6 4 44.64 20 19.59696
不同流速和粘度对细胞健康和潜能的影响示于下表3中。
表3
在一些实施方案中，所施加压力小于或等于或为下列数值间的任意数值：15psi、16psi、17psi、18psi、19psi、20psi、21psi、22psi、23psi、24psi、25psi、26psi、27psi、28psi、29psi、30psi、31psi、32psi、33psi、34psi、35psi、36psi、37psi、38psi、39psi、40psi、41psi、42psi、43psi、44psi、45psi、46psi、47psi、48psi、49psi、50psi、51psi、52psi、53psi、54psi、55psi、56psi、57psi、58psi、59psi或60psi。
在一些实施方案中，柱塞压力小于或等于或为下列数值间的任意数值：4lbf、5lbf、6lbf、7lbf、8lbf、9lbf、10lbf、11lbf、12lbf、13lbf、14lbf、15lbf、16lbf、17lbf、18lbf、19lbf、20lbf、21lbf、22lbf、23lbf、24lbf或25lbf。
输注于血管内和/或肌肉内进行。优选使用涂有生物相容材料的导管，于血管内输注，更为优选在动脉内，最优选在冠状动脉内。冠状动脉内递送可以是单计量或多计量或多天单计量或多天多计量。药剂有益的给药时间不超过两分钟，以防止进一步的缺血损伤，每剂给药后可跟随有休息期，此时输注位置暴露于血流中，例如1、2、3、4或5分钟的休息期，药剂可以单剂或一次两剂或一次三剂或一次四剂或一次多于四剂递送，在给药期间连续进行，而后也可加入3mL的追加液，在一些实施方案中流速不大于2.5mL/min，以排空导管内腔中任何残留的细胞，该过程可组成单独给药期或可在多个给药期中重复进行，如连续几天，或间隔1、2、3、4、5、6、7或多于7天的给药期。即：可以给一剂药不超过2分钟，接着是1分钟的休息期，或可给一剂药不超过2分钟，接着是2分钟的休息期，或可给一剂药不超过2分钟，接着是3分钟的休息期，或可给一剂药不超过2分钟，接着是4分钟的休息期，或可给一剂药不超过2分钟，接着是5分钟的休息期，或可给两剂药不超过2分钟，接着是各自1分钟的休息期，或可给两剂药不超过2分钟，接着是各自2分钟的休息期，或给两剂药不超过2分钟，接着是各自3分钟的休息期，或给两剂药不超过2分钟，接着是各自4分钟的休息期，或给两剂药不超过2分钟，接着是各自5分钟的休息期，或可给三剂药不超过2分钟，接着是各自1分钟的休息期，或可给三剂药不超过2分钟，接着是各自2分钟的休息期，或可给三剂药不超过2分钟，接着是各自3分钟的休息期，或可给三剂药不超过2分钟，接着是各自4分钟的休息期，或可给三剂药不超过2分钟，接着是各自5分钟的休息期，或可给四剂药不超过2分钟，接着是各自1分钟的休息期，或可给四剂药不超过2分钟，接着是各自2分钟的休息期，或可给四剂药不超过2分钟，接着是各自3分钟的休息期，或可给四剂药不超过2分钟，接着是各自4分钟的休息期，或可给四剂药不超过2分钟，接着是各自5分钟的休息期，在单次给药期内，全部给药后可接着加入1mL、2mL、3mL或多于3mL的追加液，以排空导管空腔中任何残留的细胞。
为了进行说明，可按2.5mL每分钟的速率对4剂每剂5mL(总20mL)的细胞产品进行输注，接着是1-5分钟的休息期，在总共12-28分钟后，以2.5mL每分钟的速度输注3mL的追加液，以排空单剂给药期间导管内腔中任何残留的细胞。
在第一组人类临床试验中，发现使用本发明所述的细胞群制剂，在心肌缺血后可得到显著改善的响应。通过观察LVEF中的改善临床测量心肌缺血后的改善。使用本发明所述方法制备的包含骨髓源性干细胞的细胞群，具有的粘度小于或等于或为1.0cP-5.0cP内的任意数值(如：1.0cP、1.5cP、2.0cP、2.5cP、3.0cP、3.5cP、4.0cP、4.5cP或5.0cP或其间的任何值)。使用制备再生细胞组合物的方法制备所述细胞群，所述再生细胞组合物的制备方法包括：(a)提供包含骨髓干细胞的第一细胞群；(b)混合抗凝剂与所述第一细胞群以生成包含所述第一细胞群和抗凝剂的组合物；(c)富集包含所述细胞群和抗凝剂的所述组合物中的骨髓干细胞，以制备包含富集的骨髓干细胞的第二细胞群；(d)分离含有所述第二细胞群的部分，所述第二细胞群包含富集的骨髓干细胞；并(e)使用液体调节所述部分的粘度至37℃时测量的粘度不大于5.0cP，以制得所述再生细胞组合物。向患有心肌缺血的患者经导管递送所述制剂，递送流速为小于2.5mL/min(如：小于或等于或为下列数值间的任意数值：0.5mL/min、1.0mL/min、1.5mL/min、2.0mL/min或2.5mL/min)。经过一段时间后测量患者的LVEF，发现根据本发明所描述方法制备的含有骨髓源性干细胞的细胞组合物的供给，相比于传统的骨髓源性干细胞群(参见，for a survey of conventional stem cellcomposition performance(传统干细胞组合物性能综览)，Delewi等人，(2013)，“Impactof intracoronary bone marrow cell therapy on left ventricular function in thesetting of ST-segment elevation myocardial infarction:a collaborative meta-analysis”(《ST段抬高性心肌梗死中冠状动脉内骨髓干细胞治疗对左心室功能的影响：协同荟萃分析》)，European Heart Journal(《欧洲心脏杂志》)，2013年9月11日，doi:10.1093/eurheartj/eht372)，提供了LVEF的4倍改善。
在第二组人类临床试验中，发现使用本发明所述的细胞群制剂可获得严重肢体缺血后的显著地改善的响应。通过观察改善的免截肢生存率临床测量严重肢体缺血的改善。使用本发明所述方法制备的包含骨髓源性干细胞的细胞群，其粘度小于或等于或为1.0cP-5.0cP内的任意数值(如：1.0cP、1.5cP、2.0cP、2.5cP、3.0cP、3.5cP、4.0cP、4.5cP或5.0cP或其间的任何值)。通过制得再生细胞组合物的方法制备所述细胞群，所述再生组合物的制备方法包括：(a)提供包含骨髓干细胞的第一细胞群；(b)混合抗凝剂与所述第一细胞群以生成包含所述第一细胞群和抗凝剂的组合物；(c)富集包含所述细胞群和抗凝剂的所述组合物中的骨髓干细胞，以生成包含富集的骨髓干细胞的第二细胞群；(d)分离含有所述第二细胞群的部分，所述第二细胞群包含富集的骨髓干细胞；并(e)使用液体调节所述部分的粘度至37℃时测量的粘度不大于5.0cP，以制备所述再生细胞组合物。向患有严重肢体缺血的患者经导管递送所述组合物，递送流速为小于2.5mL/min(如：小于或等于或为下列数值间的任意数值：0.5mL/min、1.5mL/min、2.0mL/min或2.5mL/min)。经过一段时间后确定患者的免截肢生存率，发现根据本发明所描述制备的含有骨髓源性干细胞的细胞组合物的供给，相比于传统的骨髓源性干细胞群，相比于列于下文实施例6中的包括采集技术CLI研究、严重肢体缺血中使用细胞移植的治疗性血管再生(TACT研究)和Amann等人的研究，提供了25％的免截肢生存率的改善。
因此，通过本公开的实践，相比于用于缺血(例如心肌缺血和肢体缺血)治疗的先前传统骨髓源性干细胞群的观察结果，人们可观察到巨大的改善。在一些实施例中可观察到相比于传统的包含骨髓干细胞的细胞群的制备，左心室射血分数(LVEF)的百分改善量为2倍、3倍、4倍或5倍或多于5倍。相类似的，在一些实施例中可观察到相比于传统的包含骨髓干细胞的细胞群的制备和递送，严重肢体缺血患者的免截肢生存率的改善百分数为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或大于24％。
实施例
实施例1-骨髓抽吸
用作原材料的骨髓是自体的。分离出干细胞的骨髓选自由髂嵴、股骨、胫骨、脊柱和肋骨或其他骨骼中髓腔组成的组。优选的骨髓源是髂嵴。在开始骨髓抽吸之前，向抽吸针管中填入抗凝剂溶液。每一瓶中含有250mg比伐卢定。为进行注射加入5mL的无菌水，并温和旋转小瓶至所有材料溶解。将所述溶液灌入20mL的无菌注射器中。为进行注射，向注射器中填入0.9％的氯化钠至12.5mL的刻度，以达到20mg/mL的最终浓度。而后，向三个无菌的20mL注射器中装入2mL的20mg/mL的比伐卢定溶液。每个注射器中抽吸18mL的骨髓以达到20mL的终体积。每个注射器中比伐卢定和抽吸骨髓的最终浓度为2mg/mL。所用抽吸针头/套管针头为11型。将骨髓抽吸至注射器或预装有抗凝剂溶液注射器中，使最终累积体积处于120mL-180mL之间。所用抽吸注射器为20mL注射器。
对上文所述方法可做出的修改不脱离本发明。例如，骨髓抽吸的切口可多于一处。在抽吸骨髓前可先向其注入一定量的抗凝剂溶液。在下一步中，通过手掌间温和地滚动将抽吸出的骨髓与抗凝剂溶液充分混合。然后将骨髓转移至可分离骨髓组分的装置中，所述技术是已知的。
实施例2-骨髓细胞的分析和处理
在即时检测环境中分析(无论在处理前还是处理后操作步骤)和处理抽吸的骨髓。首先采集120mL的抗凝骨髓。使用少量样品(小于0.5mL)快速分析每mL样品中存在的有核细胞。若需要，可采集30-60mL额外的骨髓样品用于处理，以得到所需的输注细胞剂量。处理技术包括如下组分：(i)可处理骨髓的不同体积达400mL的无菌一次性的骨髓处理装置，(ii)控制模块，其含有至少一个重力传感器和一个或多个红外(IR)/光传感器，所述传感器与微处理器和电机相联接，后二者控制分离组分的流动、运动和区室化以使其进入独立的装置或区室中，(iii)用于控制模块的对接站(docking station)，将处理的数据从控制模块的硬件中传输至电脑，以及(iv)参数可编程控制的离心机。
实施例3-骨髓的粘度与分析
滴定浓缩干细胞输注物的粘度，以确保经导管递送时剪应力是受控的。使用可能包括但不必须包括辅助软件的粘度计，确定每单位(例如厘泊)干细胞浓缩物的粘度，并计算要求得到华氏98.6°或摄氏37°时处于1.8-5cP的优选范围的最终输注物的所需血浆体积。优选的输注物粘度是3.1cP-5.0cP，最优选的输注物粘度是1.8cP-3.0cP或2.0cP-2.5cP。在患者床旁少于30min的时间内，自动或手动处理技术已生成干细胞组分、血浆成分和RBC组分，其充当自体血浆源。
实施例4-用于细胞产品输注的方案
作为辅助的初级护理，输注经抽吸的和处理的骨髓源性干细胞群。在组织缺血适应后输注包含或不包含因子的骨髓干细胞浓缩物。使用整体交换(over the wire)充气囊充气阻断受累区域的血流，以在不超过三分钟内，优选一分钟，最优选两分钟内，减少所述囊末端80-99.99％的血流。在短时组织缺血后，以受控速率输注细胞，所述速率不超过2.5mL每分钟。输注于血管内和/或肌肉内完成。优选输注是使用涂有生物相容材料的导管，于血管内进行，更为优选在动脉内，最优选在冠状动脉内。冠状动脉内的递送可为单计量或多计量或多天单计量或多天多计量。作为示例性地说明，可以在12-28分钟内输注4剂每剂5mL(总20mL)的细胞产品，随后是3mL的追加液，以排空导管内腔中任何残留的细胞。
实施例5-急性心肌梗死治疗中，作为辅助治疗的自体骨髓浓缩物富集的祖细胞 (BMCEPC)的安全性研究
43岁男性、无糖尿病、血压正常、非肥胖、抽烟，送入急诊室时呈现两小时胸痛史和AMI症状。入院时，观察到2mm心前导联ST段抬高，AMI进一步由生化血液实验确定。所述患者的左心室射血分数，LVEF，通过床旁二维超声心动图(2D ECHO)预估为约35％。使用常规技术进行初期经皮冠动脉介入治疗(PCI)，并在LAD近端放置单一药物洗脱支架，产生TIMI血流3级的结果。PCI后，患者在120小时的时间点通过多门控采集(multigated acquisition,MuGA)和超声心动图(ECHO)测量的LVEF仍<40％，其符合我们的入选标准，预测高于可接受的一年的死亡率。LVEF是心肌梗死(MI)后死亡率的一个重要指征，降低的LVEF对猝死和非猝死而言均是危险因素，其中LVEF小于等于≤30％的病人相比于LVEF>50％的病人在MI后1年死亡率的优势比为9.48，相比于LVEF为30-40％的病人的优势比为2.94，其中LVEF为40-50％病人的风险没有显著增加。
患者被告知其符合以自身(自体)骨髓干细胞进行AMIRST临床试验项目的入选标准。所述临床试验已在clinicaltrials.gov注册(NCT01536106)并被机构伦理委员会(IEC)(IEC批准#TIEC/2011/32/02)和干细胞研究机构委员会(IC-SCRT)批准。所述患者、主要研究员和临床研究员达成一致，获得同意。在PTCA/支架移植后第六天，患者被转移至心导管实验室，根据本发明中发明内容概述及详细描述，完成了AMIRST(急性心肌梗死快速干细胞治疗方案)。
全部步骤于90分钟内完成，由于训练血管外科医生收集骨髓造成延误而比预期时间延时30分钟。作为所有受试者入组前的初步安全性研究，对患者进行24个月的随访，并以标准诊断指标对其进行评估。未见包括再住院的主要不良心血管事件(MACE)的报道，证明了这项辅助治疗方法的安全性。患者的LVEF从接受AMIRST治疗时的36％(第0天)改善至AMIRST介入术24个月后的60.3％。应注意的是本研究中使用MuGA作为入组时测量技术。应谨慎对比MuGA和MRI LVEF的结果；不管怎样入组时的LVEF通过第二种方法(即ECHO)得以确定，3个月和24个月的LVEF结果由同一放射团队确定。
经书面同意，在MI后10天的最大窗口期内，患者在PCI后第6天被送至心导管实验室(手术室)，温和地到中度地使用0.2mcg/kg的芬太尼进行镇定，使用优选的采集细胞的11型Jamshidi针头从患者的髂嵴中抽吸骨髓。采用谨慎的骨髓抽吸技术以降低抽吸中外周血的污染。抽吸后，采用我们专有的即时检测技术平台处理骨髓以产生骨髓浓缩物富集的祖细胞(BMCEPC)。该细胞产品共含有3.54×108个BMMNC。使用双腔超低剖面PTA冠状动脉导管将导丝引入股动脉，使用“停-流”技术，在将全部最佳剂量的有核细胞远端递送至LAD中的支架之前，使患者具有四个独立的诱导缺血/祖细胞输注过程。完整的治疗过程于90分钟内在患者床旁完成。患者的血液和生化参数列于表4中。
表4
BMCePC治疗前后的临床实验数值
操作中没有不良事件(AE)或严重不良事件(SAE)的报道。细胞移植后，患者又进行了24小时的住院遥测，并被施予列于表5中的标准的心脏治疗。
表5
BMCePC治疗出院后的药物处方
药物 剂量 频率 药物类别
Ecosprin 150mg 口服，一日一次 抗血小板
Deplatt 75mg 口服，一日两次 抗血小板
Rosuva 20mg 口服，一日一次 他汀类
Pantacid 40mg 口服，一日一次 消化不良
患者被排定于在1、2、3、6、12和24个月进行随访以评估安全性主要终点和有效性二级终点，其包括MACE、LVEF、心输出量、心脏重构和生存质量的评估。由于患者未到场而未能完成12个月的随访，但其他所有的随访点都已完成。未见主要不良心脏事件(MACE)或再住院事件的报道。在进行AMIRST过程两周后，患者继续进行正常生活。在1个月随访时，进行23小时6分钟的HOLTER监控。未观察到室性异位，心脏变异性正常。在午夜观察到最慢的心动过缓发作(HR 53bpm，1分13秒)，中午观察到最快的心动过速发作(141bpm，1分2秒)。每次随访均检查心脏影像。所述心腔正常，未见心包积液迹象。
总的来说，该研究证明了在急性低LVEF梗死患者PTCA治疗后，本公开的骨髓抽吸、处理和输注方法学的安全性。图2A-D显示了BMCEPC输注后3和24个月得到的心脏MR图像。在24个月随访时，心脏MR的检查结果归纳为“基底和中腔前壁、前间壁、心尖前壁及心尖间隔壁和心尖心肌增强后心内膜下<25％到50％，以及75％透过性超增强的局部病灶，与缺血性梗死一致。
BMCEPC输注前的心脏MR成像所用设备不同于BMCEPC注射后3和24个月成像所用设备。因此，治疗前和治疗后3个月之间的LVEF的绝对定量等效测量应谨慎评估。同样，MuGA和ECHO扫描结果具有一定程度的用户依赖，每个结果都应被谨慎解读。
然而，已注意到在研究期间和3个月和24个月间的随诊时，LVEF中的相当的改善。BMCEPC输注后，LVEF从AMIRST治疗时的36％(第0天)改善为AMIRST介入后3个月的55.3％，在AMIRST介入后24个月时进一步由55.3％提升到60.3％，如表6所示。即，从第0天到第24个月患者表现出67.5％的上升。对于遭受ST抬高心肌梗死，再灌注(支架术)后射血分数低于40％的患者而言，这种改善程度被认为是非典型的。
表6
时间终点：左心室射血分数(LVEF)值和安全性
测量时间 方法 数值 MACE
时间第0天 2D Echo 36％ N/A
时间第6天 MuGA <40％ N/A
时间第7天 IC血管造影 <40％ 无
时间第3个月F/U cMRI 55.30％ 无
时间第24个月F/U cMRI 60.30％ 无
同一时段内心输出量(容积)也显示出从2.7l/min到3.4l/min的改善，其为次要终点。未观察到瘢痕尺寸的变化，其中心脏质量115.5gms，瘢痕质量11.5gms(大约为11％)。
如先前所公开的(Delewi等人，(2013)，“Impact of intracoronary bonemarrowcell therapy on left ventricular function in the setting of ST-segmentelevation myocardial infarction:a collaborative meta-analysis”(《ST段抬高性心肌梗死中冠状动脉内骨髓干细胞治疗对左心室功能的影响：协同荟萃分析》)，EuropeanHeart Journal(欧洲心脏杂志)，2013年9月11日，doi:10.1093/eurheartj/eht372))，对包含1641名患者(984细胞治疗，657对照组)的16项研究的荟萃分析报道，与对照组相比接受BMC治疗患者的LVEF的绝对改善提高了2.55％：[95％置信区间(CI)1.83-3.26，p值为0.001]。细胞治疗显著地降低了LVEDVI和LVESVI(分别为23.17mL/m2，95％CI：24.86到21.47，p＝0.001；22.60mL/m2，95％CI 23.84到21.35，p值0.001)。在55岁以下的患者中，LVEF的绝对改善被提高了稍多于3.38％，在基线LVEF<40％的患者中，LVEF值的绝对改善也被提高了稍多于5.30％。
因此，通过本公开实践观察到67.5％程度的改善或24.3个百分点的改善，比55岁以下，基线LVEF<40％的组的预期改善值(5.30％)大4倍以上，该研究中55岁以下组患者应是利用包含骨髓干细胞的细胞群，使用传统技术进行治疗的成员。
实施例6-60分钟快速床旁治疗降低无其他治疗选择的肢体缺血患者的截肢率
严重肢体缺血使美国、欧盟和印度次大陆总计预估2百万人遭受病痛，并导致每年大约500000例的截肢。美国总体的患病率(0.23％)和发生率(0.20％)随年龄和糖尿病状态而增长，且截肢后五年死亡率达到近50％。
患者的治疗方案根据本公开的概述和详述来完成。使用肝素作为抗凝剂。给出了治疗无其他治疗选择且遭受严重肢体缺血患者的治疗方法CLIRST(Critical LimbIschemia Rapid Stem cell Therapy，严重肢体缺血快速干细胞治疗)的Ib期临床试验的安全性和有效性结果。所述实验在12个月时达到了安全性主要终点以及有效性二级终点，未发生确定与治疗相关的严重不良事件，且在如下方面达到了统计学显著性：免截肢生存率(82.4％)、疼痛减轻(以0-10为量度，平均VAS计分治疗前为7.8±0.97，12个月随访为0.2±0.58，p＝0.0005)、6分钟步行距离(平均距离治疗前为14.5米±37.57，12个月随访为157米±100.92，p＝0.0039)，开放性伤口愈合(11名患者治疗前有或没有溃疡且具有坏疽，12个月随访时所有患者均既没有坏疽也没有溃疡)及TcPO2(经皮氧分压)等级(平均治疗前为14.66±6.93改善为35.75±17.04，p＝0.0032)。
此外，在先前研究中未被证实的是，本发明可见腿部治疗时血管再生的改善。侧副管数目(末端大腿p＝0.0156，近端小腿p＝0.0313)和血管尺寸(末端大腿p＝0.0156，近端小腿p＝0.0625)均观察到改善。图3A和3B描述了本研究中所治疗患者(patent)的侧副管尺寸和数目改善的图像。
单一示例性个体的上述结果的量化示于表7中，体现为受试者EHIRC/CLI-STEM-002的定性及定量的侧副管数据，如前后血管造影片，图3A和3B所示。综合结果的概观示于下表8中，所列数据为施用本方法实践所得的组合物之前和12个月之后的侧副管数目和侧副管尺寸。
用于定量的类别使用如下方式进行记分：分类记分(侧副管的数目)：0：无侧副管；1：1-3根侧副管；2：4-7根侧副管；3：＝>8根侧副管；分级记分(侧副管尺寸)：0：没有侧副管；1：＝<5根小；2：>5根小；3：＝<5根大±小；4：>5根大±小。
表7
表8.对14名严重肢体缺血，无其它治疗选择的患者(介入前和介入后12个月)进行肌肉内BMCEPC输注后的CT血管造影血管侧副管分级一览表。
标签公开独立研究入组17名患者，其中14人成功达到12个月免大截肢终点目标。使用20mL终产物中平均细胞剂量为8.04×108(±3.65×108)个细胞的BMCEPC(骨髓浓缩物富集的祖细胞)对患者进行治疗，在受累小腿低位进行肌肉内注射。此外，参与本研究的患者显示出大腿中部(p＝0.0547)、大腿末端(p＝0.0156)和小腿近端(p＝0.0313)改善的血管数目，以及大腿末端(p＝0.0156)、小腿近端(p＝0.0625)改善的血管尺寸。
使用BMCEPC进行肌肉内输注治疗后12个月的免截肢生存率一览示于下表9中。
表9
n(％)[N＝17]
总免大肢体截肢生存率 14(82.35)
总截肢 5(29.41)
大截肢 3(17.6)
小截肢 2(11.8)
本实施例与本领域已知的其他研究中的治疗方法的免截肢生存率的比较示于表10中。
表10
从示于表7中的先前研究结果比较观察到，根据本公开实践所观察到的82％的免截肢生存率，几乎比所报道的使用利用传统含有骨髓干细胞的细胞群的技术的先前研究的生存率高出近乎25％。
虽然上述本发明的说明书使本领域普通技术人员能制备和使用被认为是目前其中最好的实施方式，但那些本领域普通技术人员应该理解和领会本发明具体实施方式、方法和实施例的变化、结合和等同形式的存在。本发明因此不应受限于上述实施方案、方法和实施例，但限于本发明所要求的范围和精神中所有的实施方案和方法。

Claims (12)

1.一种组合物，其包括：
(a)包含骨髓干细胞和/或祖细胞的第一细胞群，
(b)抗凝剂，以及
(c)自体血浆，
其中所述组合物具有的粘度在37℃测量时为1.0-5.0厘泊(cP)。
2.权利要求1所述的组合物，其中包含骨髓干细胞和/或祖细胞的所述第一细胞群是自体的。
3.权利要求2所述的组合物，其中在37℃测量的所述粘度是1.8cP-3.0cP。
4.权利要求1所述的组合物，其中在37℃测量的所述粘度是1.8cP-3.0cP。
5.权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中包含骨髓细胞的所述细胞群包括单核细胞，所述单核细胞包含至少一种干细胞和/或祖细胞，所述干细胞和/或祖细胞选自由造血干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞和CXCR4阳性细胞组成的组。
6.权利要求1-5中任一项所述的组合物在制备用于治疗个体中缺血或与缺血相关症状的药物中的用途，当使用所述药物时，包括以下步骤：
识别个体，其具有缺血或与缺血相关的症状；以及
向所述个体提供所述组合物。
7.权利要求6所述的用途，其中得到包含骨髓干细胞的所述第一细胞群后，向所述个体提供所述组合物不超过2小时。
8.权利要求6所述的用途，其中得到含有骨髓干细胞和/或祖细胞的所述第一细胞群后，向所述个体提供所述组合物不超过60分钟。
9.权利要求6或7所述的用途，其中以不大于2.5mL每分钟的速度向所述个体提供所述组合物。
10.权利要求6-8中任一项所述的用途，其中所述缺血为心肌缺血。
11.权利要求6-8中任一项所述的用途，其中所述缺血为重症肢体缺血。
12.一种制备再生细胞组合物的方法，其包括：
(a)提供包含骨髓干细胞和/或祖细胞的第一细胞群；
(b)混合抗凝剂与所述第一细胞群，以便生成包含所述第一细胞群和抗凝剂的组合物；
(c)富集包含所述细胞群和抗凝剂的所述组合物中的骨髓干细胞，以便生成包含富集的骨髓干细胞和/或祖细胞的第二细胞群；
(d)分离包含含有富集的骨髓干细胞和/或祖细胞的所述第二细胞群的部分；并
(e)使用液体调节所述部分的粘度至在37℃时测量为1.0-5.0cP的粘度，以便制备所述再生细胞组合物。
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