CN102573860A - 用于治疗肾脏损伤的造血干细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供了治疗患者的肾脏损伤的方法，所述方法包括以有效治疗肾脏损伤的量向患者施用造血干细胞(HSC)。在一些实施方案中，延迟施用HSC，即肾脏损伤之后并不立即施用HSC。在某些方面，在肾脏修复期开始期间向患者施用HSC。本文描述了本发明的其它实施方案和方面，包括有关方法和用于其中的组合物。

Description

用于治疗肾脏损伤的造血干细胞

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年10月2日提交的美国临时专利申请第61/248,316号的优先权，该申请以引用的方式整体并入。

发明背景

尽管肾脏具有极大的再生能力，但是现在急性肾脏损伤后或反复性和慢性肾脏损伤两者后的慢性肾病和肾衰竭是全球发病率和死亡率的主要原因[1-3]。此外，慢性肾病已经被鉴定为心血管疾病和心血管死亡的主要独立风险因子[4]。慢性肾病可表现为损伤后的不成功的或不完全的肾脏修复，当前很少有促进肾脏修复和再生的治疗[5]。

肾脏肾小管周微血管近来已受到越来越多的关注，因为该脆弱的血管系统在损伤后通常不能再生。这可易于造成慢性肾脏缺血[12-15]，引发慢性炎症，肾小管萎缩和间质纤维化(慢性肾病的标志)[13，14]。已经提出，损伤后肾小管周毛细血管不能成功再生对于发展为慢性肾病至关重要[12-14]。

骨髓干细胞的修复和生成血管的性质已受到大量关注[6-8]，对在肾脏疾病小鼠模型的若干研究已经表明，小鼠骨髓间充质基质细胞(MSC)可(可能通过旁分泌或全身分泌机制)预防或减少肾脏损伤[6，9，10]。然而，很少对造血干细胞(HSC)在肾脏修复中的可能的血管生成作用进行研究，并且没有研究确定在细胞疗法中收获人HSC以促进器官的修复和再生的可行性[11]。

因此，本领域中存在开发用于治疗肾脏损伤的方法的需求。

发明概述

本文所述的研究首次证明了人CD34+干细胞被募集至受损的肾脏中，并改善存活率、血管再生和功能恢复。利用构建的小鼠缺血再灌注损伤模型对人CD34+造血干细胞促进肾脏修复和再生的能力进行了研究。肾脏损伤后(倒如)全身性施用的HSC被选择性地募集至小鼠的受损的肾脏中并主要集中于血管中和其周围。该募集与修复增强的肾脏微血管、肾小管上皮细胞、增强的功能恢复和提高的存活率相关。在某些情况下，HSC在肾脏中获得早期髓样和淋巴样的分化标记物，并且还显示获得内皮祖细胞标记物，但保留了募集至肾脏后的高水平促血管生成的转录物的合成。尽管输注的纯化HSC含有少量的循环内皮祖细胞和偶有的内皮细胞，但是在小鼠毛细血管壁中鉴定了仅极少数的人内皮细胞，这表明HSC-介导的肾脏修复是通过旁分泌机制，而非血管置换。这些研究提出人HSC对于促进肾脏损伤后修复而言是有前景的治疗策略。

因此，本发明提供一种治疗患者的肾脏损伤的方法，该方法包括向患者施用造血干细胞(HSC)。将HSC以有效治疗肾脏损伤的量施用于患者，所述量在本文中有进一步描述。在本发明的某些实施方案中，延迟施用HSC；即，在肾脏损伤之后并不立即施用HSC。在本发明的一些方面中，在肾脏的修复期开始时，例如，损伤后至少约12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，向患者施用HSC。在其它实施方案中，在损伤后约24小时，或其后某段时间但在损伤后约14天之前，向患者施用HSC。关于HSC的施用时间的其它实施方案在本文中有详细描述。

本文进一步提供包括施用HSC的相关方法。例如，预防患有肾脏损伤患者的肾脏疾病或肾脏医学状况的方法，提高患有肾脏损伤的患者的存活率的方法，和预防患有肾脏损伤的患者的由肾脏疾病或肾脏医学状况造成的或与之相关的非-肾脏疾病或非-肾脏医学状况的方法。

在本发明的一些实施方案中，本发明方法中使用的HSC与药学上可接受的载体一起配制。因此，本发明提供一种药物组合物，其包含HSC群和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，该药物组合物包含任选地与HSC缀合的其它治疗剂或诊断剂。此类药物组合物可用于将治疗剂或诊断剂递送至受损的肾脏。因此，本发明还提供向患者的受损肾脏递送治疗剂或治疗剂的方法，该方法包括向该患者施用与治疗剂或诊断剂缀合的HSC。

在一些方面中，所述药物组合物包含异源细胞群，其中HSC(例如，CD34+HSC)构成该细胞群的至少约25％(例如，至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％)。本文中提供了本发明药物组合物及其用途的其它实施方案。

附图简述

图1显示了人造血干细胞被募集至NOD/SCID小鼠的缺血再灌注后受损的肾脏、脾和骨髓。(A)NOD/SCID小鼠(在IRI后第1天接受过继转移的人HSC)在IRI后第3天的肾脏的代表性共聚焦图像，显示出在肾小管周毛细血管(通过小鼠CD31标记表示)中的CMFDA标记的人细胞(箭头)。(B)示出IRI后第3天、5天和7天时，IRI后的肾脏和对照肾脏中鉴定的人HSC的数量的图。(C)NOD/SCID小鼠(IRI后24小时使用人HSC治疗)在IRI后第7天的肾脏中检测到的人HLA-I类(绿色，箭头)的代表性共聚焦图像。(D)示出IRI后第7天、14天和28天时，IRI后的肾脏和对照肾脏中每个切片中人HLA-I类细胞的数量。(E)IRI后第1天接受过继转移后，IRI后第3天脾中的CMFDA标记的人HSC的代表性共聚焦图像。(F)示出IRI后第3天、5天和7天时，脾脏中每个切片中CMFDA阳性细胞数量的图。(G)来自NOD/SCID小鼠(在IRI后第1天接受过继转移的HSC)在IRI后第7天肾脏中全部骨髓的CD11b(检测小鼠和人抗原)和人CD45的代表性流式细胞图。(H)示出在第1天和第2天时，小鼠骨HSC(E)中人CD45+细胞的百分比的图。注意：在(D)中，在严重受损的肾小管中具有大量的细胞碎片，(E)中程度要低很多。(F)示出接受媒介物或HSC(n＝3/时间点)小鼠的肾小管损伤指数的图。(G-H)IRI后第1天和第2天接受媒介物(G)或HSC(H)后，IRI后第28天的天狼猩红染色的肾脏的代表性图像。(I)示出接受媒介物或HSC(n＝3/时间点)后小鼠的纤维化面积的图。平均值±标准偏差。*P＜0.05，相比媒介物对照组(vehicle group)。(标尺＝50μm)。

图2显示肾脏缺血再灌注损伤后，向NOD/SCID小鼠过继转移的人HSC降低了死亡率并改善了肾功能。(A)损伤后第1天静脉注射PBS(媒介物，n＝16)或2.5×10⁶人HSC(HSC，n＝10)，双侧IRI后第1天、第2天和第7天时的血浆肌酸酐水平。数据用平均值±标准偏差表示，P值＜0.01。(B)对于损伤后第1天静脉注射PBS(媒介物)或2.5×10⁶人HSC(HSC)后的双侧IRI小鼠，在每个时间点的存活率曲线和数量。P值＝0.039。

图3显示了肾脏缺血再灌注损伤后，过继转移的人HSC减少了肾小管周毛细血管损失并降低了肾小管内皮的损伤。(A-B)在第1天和第2天接受媒介物(A)或HSC(B)后，IRI后第7天外髓部的小鼠CD31-标记的肾小管周毛细血管(PTC)的代表性图。注意：(A)中显著的PTC损失。(C)示出接受媒介物或HSC(n＝3/时间点)后，小鼠PTC指数的图。(D-E)来自IRI后第5天小鼠(第1天和第2天接受媒介物(D)或HSC(E))的外髓部的PAS染色肾切片的光图像。注意：(D)中严重受损的肾小管中存在大量的细胞碎片，(E)中程度要低很多。(F)示出接受媒介物或HSC(n＝3/时间点)后，小鼠肾小管损伤指数的图。(G-H)IRI后第1天和第2天接受媒介物(G)或HSC(H)后，IRI后第28天的天狼猩红染色的肾脏的代表性图。(I)示出接受媒介物或HSC(n＝3，每个时间点)后，小鼠的纤维化面积的图。平均值±标准偏差，*P＜0.05，相比媒介物对照组。(标尺＝50μm)。

图4显示人HSC在肾脏中的分化。外髓部的代表性共聚焦图像(A，C)和表观荧光(epifuorescence)图像(E)显示，在损伤后第1天接受静脉注射HSC，人CD45(A)、人CD68(C)和人CD3(E)在IRI后第5天肾中的细胞(箭头)中的表达，共标记以显示小鼠血管系统的mCD31(红色)。图表示出在IRI后的肾脏和对照的肾脏中鉴定的人CD45(B)、人CD68(D)和人CD3(F)细胞的数量。数据为平均值±标准偏差，n＝6/时间点。(G-H)NOD/SCID小鼠的IRI后第3天肾的代表性落射荧光图像，其中该NOD/SCID小鼠在第1天-第2天接受人HSC，其使用CMFDA(箭头)标记，使用抗人CD133(G)、CD146(H)和KDR(I)的抗体共标记。注意：抗-KDR抗体也检测到小鼠内皮(箭头)(标尺＝50μm)。

图5显示可在缺血性损伤和HSC灌注后的肾脏中检测到极少的人内皮细胞。(A-B)IRI后第28天肾的共聚焦图像，表明存在人CD31表达的细胞，其中这些细胞中的一些似乎整合到毛细血管中(箭头)(A)，但大多数为形态学上的单核细胞和共表达的hCD45(箭头)(B)。(C)示出损伤后第1天过继转移HSC后，在IRI后肾脏中人CD31表达细胞的数量相对于时间的图。(D)人血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)(箭头)而非小鼠vWF在IRI后肾脏中的细胞(缺乏人CD45表达)中的特异表达(标尺＝50μm)。

图6显示在肾脏缺血性损伤后，人HSC在肾脏中产生血管生成旁分泌因子。与GAPDH比较，HSC(白色)、过继转移前的HSC和过继转移后48小时由IRI肾脏纯化的HSC中促血管生成转录物的相对基因表达。注意：募集至肾脏的HSC保持很高水平的促血管生成转录物的表达。平均值±标准偏差，n＝6/组。(标尺＝50μm)。

图7显示了HSC在损伤后的修复中的功能的模型。HSC被募集至该受损的肾，在其中它们获得了CEP标记物CD 146，并集中在受损的毛细血管内和间质内。局部产生的细胞因子包括血管生成素、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子，通过旁分泌机制促进了细胞修复。

发明详述

本文公开的数据首次证明向患有肾脏损伤的哺乳动物施用的HSC的特异性定位，以及随后的受损的肾组织(包括但不限于肾小管周微血管)的修复，该修复由HSC所介导。因此，本发明提供治疗患者的肾脏损伤的方法，所述方法包括以有效治疗患者肾脏损伤的量向患者施用造血干细胞(HSC)。

本文使用的术语″治疗″以及由其衍生的词语并不必然暗示目标医学状况的100％或完全改善。而是，具有本领域的普通技术人员所认为的具有效益的各种程度的治疗效果。就此而言，本文所述的方法对肾脏损伤提供任意量或任意水平的治疗有益效果，从而″治疗″该损伤。例如，在许多方面，治疗肾脏损伤的方法包括下列的一种或多种：促进患者的受损肾脏的修复或再生、提高患者的存活、增强肾脏的功能恢复，或恢复肾脏的功能。在另一方面，由所述方法提供的治疗包括减轻由受损肾脏造成的一种或多种医学状况或症状。通过举例而非限制，本文所述的本发明方法实现下列的一种或多种：肾小管周微血管(例如，肾小管周毛细血管)的修复或再生增强、肾脏中的血管(例如，肾小管周微血管(例如，肾小管周毛细血管))的形成或稳定、受损肾脏中的血管生成的诱导，或肾小管上皮细胞的修复增强，从而减少肾脏的负性重构的发生。

肾脏损伤

在本发明的多个方面，提供的方法旨在治疗患者的肾脏损伤，其为由下列一种或多种中的任一种对肾脏所造成的任一损伤：缺血、毒素暴露、血管紧张肽转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张肽II受体阻断剂的使用、输血反应、肌肉损伤或创伤、手术、休克、低血压，或任一ARF或慢性肾病的病因，如在本文中进一步描述。

目标肾脏损伤包括对肾脏内存在的任何组织的损伤，包括但不限于髓质、皮质、肾锥体、叶间动脉、肾动脉、肾静脉、肾门、肾盂、输尿管、肾小盏、肾被膜、上端肾被膜、下端肾被膜、叶间静脉、肾单位、肾大盏、肾乳头、肾小球、鲍曼囊(Bowman’s capsule)，和肾柱的组织，该组织的损伤足以造成部分或全部功能丧失。受损的肾脏组织包括出现在肾脏中的任何一种或多种不同的细胞类型，包括但不限于肾小球壁细胞、肾小球足细胞、肾小球内系膜细胞、肾小球内皮细胞、肾近端小管刷状缘细胞、髓袢细段细胞、升支粗段细胞、远端肾小管细胞、肾集合管细胞，和间质肾细胞。在本发明的某些实施方案中，肾脏损伤包括对肾小管周微血管的损伤。在某些方面中，肾脏损伤包括对肾小管周毛细血管的损伤。在一些实施方案中，肾脏损伤包括对肾小管(管状)上皮细胞的损伤。

肾脏疾病肾病和肾脏医学状况的预防

尽管肾脏具有巨大的自我修复或自我再生的能力，但是肾脏损伤通常导致形成肾脏疾病或肾脏医学状况的倾向性增加。理论上，本文提供的治疗患者肾脏损伤的方法能够使得肾脏成功的修复和再生，使得患者不具有增加的形成肾脏疾病或肾脏医学状况的倾向性。因此，本发明还提供预防患有肾脏损伤的患者的肾脏疾病或肾脏医学状况的方法。该方法包括以有效预防肾脏疾病或肾脏医学状况的量向患者施用HSC。在一些实施方案中，所述量为有效治疗肾脏损伤的量，例如，有效恢复肾脏功能、有效再生肾小管周微血管的量。

本文使用的术语″预防″以及由其衍生的词语并不必然地指100％或完全预防。而是，具有本领域的普通技术人员所认为的具有潜在有益效果的各种程度的预防。就此而言，本文所述的预防方法提供了任意量或任意水平的肾脏疾病或肾脏医学状况的预防。在多个方面，所述预防方法为一种延迟、减缓、降低或减轻肾脏疾病或肾脏医学状况或其症状或医学状况的发作、形成、出现或进展的方法。

在一些实施方案中，预防的肾脏疾病肾病或肾脏医学状况为急性肾衰竭、慢性肾病、肾间质性纤维变性、糖尿病性肾病、肾小球肾炎、肾积水、间质性肾炎、肾结石(肾石病)、肾脏肿瘤(例如，维尔姆斯瘤、肾细胞癌)、狼疮肾炎、肾微小病变疾病、肾病综合征、肾盂肾炎、肾衰竭(例如，非急性肾衰竭和慢性肾病)。

急性肾衰竭

本文使用的术语“急性肾衰竭”与“急性肾脏损伤”或“ARF”同义，均指由于对肾脏的损害而造成的肾脏功能的快速丧失。ARF是一种复杂的综合征，其标志为由肾脏正常代谢的含氮(例如，血清肌酸和/或尿液排出物)和不含氮废物的水平的突然变化。ARF的症状和诊断在本领域中是已知的。参见例如Acute Kidney Injury，Contributions to Nephrology，Vol.156，Ronco等编，Karger Publishers，Basel，Switzerland，2007和Bellomo等，Crit Care 8(4)：R204-R212，2004。

在多个方面，取决于病因，ARF为肾前性ARF、内因性ARF或肾后性ARF。就此而言，肾前性ARF可由下列一种或多种所引起：血容量不足(例如，因为休克、脱水、体液丧失或利尿剂过量使用)、肝肾综合征、血管问题(例如，动脉粥样硬化性栓塞性疾病、肾脏静脉血栓形成、与肾病综合征有关)、感染(例如，脓毒症)、重度烧伤、死骨形成(例如由于心包炎、胰腺炎)，和低血压(例如由于抗高血压、血管扩张药的使用)。

内因性ARF可由下列一种或多种所引起：毒素或药物(例如，NSAID、氨基糖苷类抗生素、碘化造影剂、锂、磷酸盐肾病变(例如，与使用磷酸钠的结肠镜检查肠制备物相关)、横纹肌溶解(例如，由损伤(例如，挤压伤或严重挫伤)、他汀类药物、刺激剂的使用引起)、溶血、多发性骨髓瘤、急性肾小球肾炎。

肾后性ARF可由下列一种或多种所造成：药物(例如，抗胆碱能药)、良性前列腺肥大或前列腺癌、肾结石、腹部恶性肿瘤(例如，卵巢癌、结肠直肠癌)、导尿管堵塞以及引起结晶尿或肌球蛋白尿或膀胱炎的药物。

ARF可由患者中的缺血、毒素、血管紧张肽转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张肽II受体阻断剂的使用、输血反应、对肌肉的损伤或创伤、手术、休克和低血压而造成。引起ARF的毒素可为抗真菌剂或射线照相术的染料。此外，在一些实施方案中，ARF包括急性肾小管坏死或肾脏缺血再灌注损伤。

慢性肾病

在预防肾脏疾病肾病或肾脏医学状况的方法的一些实施方案中，肾病为慢性肾病(CKD)。在本文中所用的“慢性肾病”，也称为“慢性肾脏疾病”，是指在数月或数年期间肾功能的渐进性丧失。所治疗的CKD处于任一期，包括，例如，1期、2期、3期、4期或5期(也已知为被认定的CKD、晚期肾病(ESRD)、慢性肾脏衰竭(CKF)或慢性肾衰竭(CRF))。

CKD可由多种因素中的任一种所引起，包括但不限于急性肾脏损伤、急性肾脏损伤的病因、导致糖尿病性肾病的I型和II型糖尿病、高血压、肾小球肾炎(肾脏滤过系统的炎症和损伤)、多囊性肾病、导致镇痛性肾病的镇痛药(例如，对乙酰氨基酚、布洛芬)的使用(例如，定期和过长持续时间)、导致缺血性肾病的动脉粥样硬化、尿液流动被结石阻塞、前列腺肥大、狭窄(变窄)、HIV感染、镰状细胞病、海洛因滥用、淀粉样变性、肾结石、慢性肾脏感染和某些癌症。

非肾脏疾病和非肾脏医学状况的预防

已经鉴定慢性肾病为心血管疾病和心血管死亡的主要独立风险因子。理论上，本文所述的HSC的施用还可用于预防除了肾脏疾病或肾脏医学状况外的疾病或医学状况。因此，本文进一步提供预防患有肾脏损伤的患者的非肾脏疾病或非肾脏医学状况的方法，该非肾脏疾病或非肾脏医学状况由肾脏疾病或肾脏医学状况引起或与其相关。所述方法包括以有效预防非肾脏疾病或非肾脏医学状况的量向患者施用HSC。在某些实施方案中，非肾脏疾病或非肾脏医学状况为心血管疾病。

存活率提高

急性肾脏损伤之后或反复性和慢性肾脏损伤两者之后的慢性肾病和肾衰竭现在为全球发病率和死亡率的主要原因。理论上，本文所述的HSC的施用还可用于预防患有肾脏损伤的患者的死亡(提高存活率)。因此，本文在还提供提高患有肾脏损伤的患者的存活率的方法。所述方法包括以有效提高患者存活率的量向患者施用HSC。

造血干细胞(HSC)

出于本发明的目的，术语“造血干细胞”或“HSC”指产生血液细胞类型的多能干细胞，包括例如，髓系(单核细胞和巨噬细胞、中性白细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板、树突细胞)，和淋巴系(T-细胞、B-细胞、自然杀伤(NK)细胞)。HSC可为多能的、寡能的或单能的HSC。

获得HSC的方法和HSC的来源

HSC可以通过本领域中已知的任一方法获得。在一些实施方案中，HSC自供体分离。本文使用的术语″分离的(isolated)″是指已经从其自然环境中移除。HSC分离自任一含HSC的成人、胎儿或胚胎组织，在多个方面中包括但不限于骨髓、脂肪组织、血液、卵黄囊、脊髓组织(例如，肝、脾中、胎儿中，例如，胎儿肝、胎儿脾)、脐带血、胎盘，和主动脉-性腺-中肾。

HSC的供体为本文所述的关于患者的任一宿主。在一些方面，供体为哺乳动物。在具体方面，供体为人。在其它方面，HSC的供体与患者相同。就此而言，该HSC被认为与该患者是“自体同源的(autologous)”。在一些实施方案中，HSC的供体与该患者不同，但是该供体和患者属于同一物种。就此而言，该HSC被认为是“同种异体的(allogeneic)”。

在一些实施方案中，利用注射器和针头将HSC从供体(例如供体髋部)的骨髓中分离。在其它实施方案中，HSC分离自血液(例如，外周血)。在某些方面，HSC分离自使用细胞因子对供体进行预治疗后的血液，所述细胞因子诱导或促进HSC从骨髓向血液(例如外周血)的移动。在某些情况下，细胞因子为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或AMD-3100。

在一些实施方案中，HSC为原代细胞或新鲜分离的细胞。或者，HSC为培养的细胞、建立细胞系的细胞，和/或由冷冻的HSC储备液解冻得到。HSC可通过细胞库获得，例如，American Tissue CultureCollection(ATCC)、National Stem Cell Resource(NSCR)、National StemCell Bank(NSCB)，以及其它商业供应商。

在其它方面，进行其它步骤以获得特定的HSC群。HSC在一些实施方案中是纯化的。本文使用的术语″纯化的″是指纯度已增加，其中″纯度″为相对术语，并不必然地被理解为绝对纯度。在多个方面，例如，纯度为至少约50％，可为60％以上、70％以上或80％以上，或可为100％。因此，在一些实施方案中，本发明的HSC为异源细胞群的一部分或为基本上同源的细胞群的一部分。例如，在一些方面中，HSC为克隆的HSC群，其中该群的每个细胞与该群的另一细胞在遗传上不同。该异源细胞群包含其它类型的细胞(不同于HSC的细胞)。例如，在一些方面，该异源细胞群包含除HSC外的白细胞(髓系或淋巴系的白细胞)、红细胞、内皮细胞、循环内皮前体细胞、上皮细胞、肾细胞、肺细胞、骨细胞、中幼粒细胞、神经元、平滑肌细胞。作为另外的选择或除此之外，该异源细胞群仅包含HSC，但该HSC不是克隆的，例如，在遗传上没有区别。该异源HSC群具有不同的表型，如本文进一步所讨论。分离具有特定表型的细胞(例如HSC)的适宜方法在本领域中是已知的，并且包括例如利用光学流式分选仪(例如，荧光活性细胞分选(FACS))的方法和利用非光学流式分选仪(例如，磁激活细胞分选)的方法。

HSC表达的标记物

HSC具有HSC的任一表型特征。在一些实施方案中，HSC对谱系标记物(即，lin-)(的表达)为阴性。在一些情况下，HSC对下列的一种或多种(的表达)为阳性：CD34、CD38、CD90、CD133、CD105、CD45和c-kit。在一些情况下，HSC为CD34+，在其它情况下，HSC为CD45+。在其它方面，HSC为CD34+和CD45+。在某些实施方案中，一旦施用至患者，HSC的表型就发生变化。因此，在一些实施方案中，HSC为对标记物(例如，循环内皮祖细胞(CEP)标记物(在CEP上表达的标记物，例如CD146、CD133、CD34、CD117、CD31))的表达变成阳性的那些。

HSC任选地为异源细胞群的一部分，其中该群中至少25％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)的细胞具有特定的表型。在本发明的一些实施方案中，HSC为异源细胞群的一部分，其中至少25％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)的细胞为CD34+HSC。在本发明的一些实施方案中，HSC为异源细胞群的一部分，其中至少25％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)的细胞为CD45+HSC。在本发明的一些实施方案中，HSC异源细胞群的一部分，其中至少25％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)的细胞为HSC，其在施用至患者后变为CD146+HSC。

HSC的其它修饰步骤

在一些方面中，HSC在分离和/或纯化后被进一步修饰。在一个替代性方案中，将细胞在体外培养，以用于扩增HSC群、将基因递送到HSC中、分化HSC，或使化合物(如治疗剂或诊断剂)与HSC缀合。实施这些其它步骤的方法是本领域所熟知的。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N Y，2001；Ogawa等，Blood 81：2844-2853(1993)；美国专利7,144,731；Li等，FASEB J 15：586(2001)；Norol等，Experimental Hematology 35(4)：653-661(2007)；Verhoeyen和Cosset，Gene Transfer：Delivery and Expression of DNA and RNA，Friedmann和Rossi编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N Y，2007。

药物组合物

本文中描述的HSC被任选地配制成组合物，如药物组合物。因此，本发明提供包含HSC和药学上可接受的载体的药物组合物。所述载体为任何常规使用的载体，并且其仅受化学-物理考虑因素(例如，溶解性和与活性化合物缺乏反应性)以及施用途径的限制。本文中描述的药学上可接受的载体，例如，媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂，对于本领域的技术人员是公知的，并且公众可易于获得。在一方面，药学上可接受的载体是对活性成分(例如造血干细胞)化学惰性的载体，以及在使用条件下没有不利副作用或毒性的载体。载体的选择部分由包含药物组合物的具体药剂，以及所用药物组合物的具体施用途径确定。因此，本发明的药物组合物存在多种适宜的制剂。

施用途径

在一些实施方案中，含HSC的药物组合物被配制用于肠胃外施用、皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用、鞘内施用或腹膜内施用。在其它实施方案中，药物组合物通过鼻内、喷雾剂、口服、气溶胶、直肠或阴道施用。

施用HSC的方法在本领域中是已知的。参见，例如下列任一美国专利：5423778、5550050、5662895、5800828、5800829、5811407、5833979、5834001、5834029、5853717、5855619、5906827、6008035、6012450、6049026、6083523、6206914、6303136、6306424、6322804、6352555、6368612、6479283、6514522、6534052、6541024、6551338、6551618、6569147、6579313、6599274、6607501、6630457、6648849、6659950、6692738、6699471、6736799、6752834、6758828、6787357、6790455、6805860、6852534、6863900、6875441、6881226、6884427、6884428、6886568、6918869、6933281、6933286、6949590、6960351、7011828、7031775、7033345、7033603、7049348、7070582、7074239、7097832、7097833、7135172、7145055、7157080、7166280、7176256、7244242、7452532、7470425和7494644。

肠胃外

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物被配制为肠胃外施用。出于本发明的目的，肠胃外施用包括但不限于静脉内、动脉内、肌内、脑内、脑室内、心内、皮下、骨内、皮内、鞘内、腹膜内、膀胱内，和海绵体内注射或输注。

适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液(其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂，以及使得该制剂与目标受试者的血液等渗的溶质)、以及水性和非水性的无菌悬浮液(其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。在多个方面，该药物组合物通过药物载体中的生理学上可接受的稀释剂施用，如无菌液体或液体的混合物，包括水、盐水、含水葡萄糖及相关的糖溶液、二醇如丙二醇或聚乙二醇、甘油、醚类、聚(乙二醇)400、油类、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化脂肪酸甘油酯，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂，如皂类(soap)或去污剂、悬浮剂如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素，或羧甲基纤维素，或乳化剂和其它药物佐剂。

任选地用于肠胃外制剂的油类包括石油醚、动物油、植物油或合成的油类。油类的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林油，和矿物油。用于肠胃外制剂的适宜的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是适宜的脂肪酸酯的实例。

在一些实施方案中，肠胃外制剂包含防腐剂或缓冲剂。为了最小化或消除在注射部位处的刺激，此类组合物任选地包含一种或多种非离子型表面活性剂，其具有约12至约17的亲水亲油平衡值(HLB)。表面活性剂在此类制剂中的量通常在约5重量％至约15重量％的范围。适宜的表面活性剂包括聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯，如脱水山梨糖醇单油酸酯，以及通过环氧丙烷与丙二醇的缩合形成的环氧乙烷与疏水性碱的高分子量加合物。在多个方面中，肠胃外制剂存在于单剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)中，并且可在冷冻-干燥(冻干)条件下储存，仅需在使用前立即添加无菌液体赋形剂，例如注射用水。在某些情况下，即用注射溶液和悬浮液由此前描述的无菌粉末、颗粒和片剂制备。

注射制剂符合本发明。用于可注射组合物的有效药物载体的要求对于本领域的普通技术人员而言是公知的(参见例如Pharmaceutics andPharmacy Practice，J.B.Lippincott Company，Philadelphia，PA，Banker和Chalmers编，第238-250页(1982)，and ASHP Handbook on InjectableDrugs，Toissel，第4版，第622-630页(1986))。

细胞递送基质

在一些实施方案中，HSC通过细胞递送基质施用。在某些实施方案中，细胞递送基质包含含有胶原、纤维蛋白、壳聚糖、MATRIGEL、聚乙二醇、葡聚糖(包括可化学交联的或可光致交联的葡聚糖)等的任一种或多种聚合物和水凝胶。在某些实施方案中，细胞递送基质包含下列的一种或多种：胶原，包括收缩的和非收缩的胶原凝胶、水凝胶，包括但不限于纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、明胶、透明质酸、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖(包括适于可化学交联、可光致交联或两者的葡聚糖)、白蛋白、聚丙烯酰胺、聚羟基乙酸(polyglycolyic acid)、聚氯乙烯、聚乙烯醇、聚(正乙烯基-2-吡咯烷酮)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、亲水性聚氨酯、丙烯酸衍生物、普郎尼克如聚氧化丙烯和聚氧化乙烯共聚物、35/65聚(ε-己内酯)(PCL)/聚(羟基乙酸)(PGA)、

生物可吸收的构建体、

羟乙基乳酸聚酯910、自组装肽，以及不可吸收的材料如含氟聚合物(例如，

含氟聚合物)、塑料，和金属。

在一些情况下，基质包含不可降解的材料，例如但不限于膨体聚四氟乙烯(ePTFE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚氨酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、硅酮等，或选择性可降解材料，如聚(乳酸-乙醇酸共聚物；PLGA)、PLA或PGA。(还参见，Middleton等，Biomaterials 21：2335 2346，2000；Middleton等，Medical Plastics and Biomaterials，1998年3月/4月，第3037页；Handbook of Biodegradable Polymers，Domb，Kost，and Domb编，1997，Harwood Academic Publishers，Australia；Rogalla，Minim.InvasiveSurg.Nurs.11：6769，1997；Klein，Facial Plast.Surg.Clin.North Amer.9：205 18，2001；Klein等，J.Dermatol.Surg.Oncol.11：337 39，1985；Frey等，J.Urol.154：812 15，1995；Peters等，J.Biomed.Mater.Res.43：422 27，1998；和Kuijpers等，J.Biomed.Mater.Res.51：13645，2000)。

在一些实施方案中，基质包括生物相容性支架、格栅、自组装结构等，无论是否可生物吸收，是液体、凝胶或固体。此类基质在治疗性细胞治疗、外科手术修复、组织工程和伤口愈合领域中是已知的。在某些方面中，将基质用HSC预处理。在其它实施方案中，基质分布有与该基质或其空间紧密缔合的HSC细胞。HSC可黏附至基质或可被捕集或包含于基质空间内。在某些方面，当基质-HSC复合物中与基质紧密缔合的细胞正在生长，并且当用于治疗时，所述复合物刺激并支持患者自身肾脏细胞的生长、修复和/或再生，并同样刺激或支持适当的血管形成。基质-细胞组合物可以本领域中已知的任何的方式引入至患者体内，包括但不限于植入、注射、手术附着、与其它组织一起移植等。在一些实施方案中，基质在体内形成，或甚至更优选在原位形成，例如可原位聚合的凝胶可用于本发明。此类凝胶的实例在本领域中是已知的。

在一些实施方案中，将HSC接种在三维构架或基质上，如支架、泡沫或水凝胶，并经此施用。在某些方面，构架被构造成各种形状，如基本上扁平的、基本上圆柱状的或管状的，或者可为完全自由的形状，正如所考虑的校正结构可能要求或需要的。在某些方面，当需要时，将两个或多个基本上扁平的构架放置在另一个顶上并固定在一起，以产生多层构架。

可用于本发明此方面的基质的实例(例如支架)包括垫子(纺织的、编织的，且更优选无纺的)多孔的或半多孔的泡沫、自组装肽等。无纺垫子可(例如)利用由天然或合成聚合物构成的纤维所形成。在一些实施方案中，将以商标名

出售(Ethicon，Inc.，Somerville，N.J.)的可吸收的羟基乙酸和乳酸的共聚物(PGA/PLA)用于形成基质。如在第6,355,699号美国专利中讨论，通过如冷冻-干燥或冻干加工形成的例如由聚(ε-己内酯)/聚(羟基乙酸)(PCL/PGA)共聚物构成的泡沫也可用作支架。凝胶也形成本文使用的适宜的基质。实例包括可原位聚合的凝胶和例如由自组装肽构成的水凝胶。在一些方面，这些材料用作组织生长的支持物。原位形成的可降解网络构造也适用于本发明(参见例如Anseth，K.S.等，2002，J.Controlled Release 78：199-209；Wang，D.等，2003，Biomaterials 24：3969-3980；He等的美国专利公开2002/0022676)。在一些方面，将这些材料配制为适于注射的流体，然后通过多种方法(例如，温度、pH变化、光暴露)进行诱导，以原位或在体内形成可降解水凝胶网络。

在一些实施方案中，构架为毡(felt)，其可由生物可吸收材料(例如PGA、PLA、PCL共聚物或共混物，或透明质酸)所制成的多纤维纱线。在某些方面，利用由卷边、切削、梳理和针织组成的标准纺织加工技术将纱线制成毡。在某些方面，将HSC接种至可为复合材料结构的泡沫支架上。此外，在一些方面，将三维构架模制成有用的形状，如待修复、替换或扩张的肾脏中或其周围的特定结构。

可在接种HSC之前对构架进行处理以增强细胞附着。例如，在使用HSC接种前，尼龙基质用0.1M乙酸处理，并在聚赖氨酸、PBS和/或胶原蛋白中温育以涂覆尼龙。在一些方面，使用硫酸对聚苯乙烯进行类似处理。

在其它实施方案中，对三维构架的外表面进行改性以增强细胞的附着或生长和组织分化，如通过等离子涂布构架或添加一种或多种蛋白(例如，胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素)、细胞基质和/或其它材料，例如但不限于明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶等。

在一些实施方案中，支架包含使其不形成血栓的材料。在某些实施方案中，这些材料促进并支持内皮生长、迁移和胞外基质沉积。此类材料的实例包括但不限于天然材料如基膜蛋白如层粘连蛋白和IV型胶原、合成材料如ePTFE和嵌段聚氨酯脲硅酮，如

(ThePolymer Technology Group，Inc.，Berkeley，Calif.)。这些材料可被进一步处理以使得支架不形成血栓。此类处理包括抗血栓药如肝素，和改变材料的表面电荷的处理如等离子涂布。

在某些实施方案中，包含HSC的药物组合物包含细胞递送基质的任何组分成分，包括本文所述的任何组分。

剂量

出于本发明的目的，施用的药物组合物的量或剂量足以在合理的时间框架内在受试者或动物中实现例如治疗性响应或预防性响应。例如，药物组合物的剂量足以在从施用时间起约1至4天或更长的时期内，例如，5天、6天、1周、10天、2周、16至20天或更长时间内，治疗或预防肾脏缺血再灌注损伤。在某些实施方案中，时间段甚至更长。剂量通过具体药物组合物的效力和动物(例如，人)的状况以及要治疗的动物(例如，人)的体重所确定。

用于确定施用剂量的许多测定方法在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用测定方法来确定向哺乳动物施用的起始剂量，所述测定方法包括：在一组各施用不同剂量HSC的哺乳动物中，在向哺乳动物施用给定剂量的HSC时比较HSC定位至受损肾脏的程度。在施用一定剂量时，HSC定位至受损肾脏的程度可通过本领域中已知的方法测试，例如，本文所述的方法。

此外或可选择地，使用测定方法来确定向哺乳动物施用的起始剂量，所述测定方法包括：比较特定剂量的HSC在肾脏损伤后造成的肾小管周围毛细血管损失的减少程度、肾小管上皮细胞的再生程度、长期纤维化的预防程度、死亡率的减少程度，或肾功能的改善程度。此类测试描述于本文实施例中。

药物组合物的剂量还将由可能伴随施用具体药物组合物的任何副作用的存在、性质和程度来确定。典型地，主治医师将考虑各种因素(例如年龄、体重、总体健康状况、饮食、性别、要施用的药物组合物的治疗剂、施用途径和所治疗医学状况的严重程度)来确定用于治疗每个个体患者的药物组合物的剂量。通过举例但非对本发明构成限制，药物组合物的剂量可为使得至少约0.5×10⁶(例如，至少约1×10⁶、1.5×10⁶、2×10⁶、2.5×10⁶、3.0×10⁶、5.0×10⁶、10⁷、10⁸)个HSC被施用至患者。

施用时机

在所提供的方法中，将HSC在肾脏损伤的某一时间点施用至患者。在本发明的某些实施方案中，延迟施用HSC；即，在肾脏损伤后并不立即施用HSC(例如，在损伤后约30分钟之前、约1小时之前、约2小时之前、约3小时之前、约4小时之前、约5小时之前、约6小时之前、约7小时之前、约8小时之前、约9小时之前、约10小时之前、约11小时之前，或约12小时之前不施用)。

在本发明的一些方面中，在肾脏损伤的修复期开始时向患者施用HSC。本文使用的术语“肾脏损伤修复期”是指损伤后观察到肾再生响应的时间，该响应表示为例如细胞已被破坏后存在的肾单位的再生、具有嗜碱性、扁平鳞状细胞的肾小管的内衬(lining)、肾小管细胞的正常形态的恢复、上皮细胞再分化、运动、增殖或再分化、肾单元整体功能的恢复、肾功能的恢复。哺乳动物中的肾的修复期已经过充分论述。参见例如Reimschuessel，ILAR J42：285-291(2001)。在一些实施方案中，HSC在损伤后至少约12小时(例如，至少约14小时、至少约16小时、至少约18小时、至少约20小时、至少约21小时、至少约22小时、至少约23小时、至少约24小时、至少约25小时、至少约26小时、至少约28小时、至少约30小时、至少约32小时、至少约32小时、至少约34小时、至少约36小时、至少约38小时、至少约40小时、至少约42小时、至少约44小时、至少约46小时、至少约48小时、至少约50小时、至少约52小时、至少约54小时、至少约56小时、至少约58小时、至少约60小时、至少约62小时、至少约64小时、至少约66小时、至少约68小时、至少约70小时、至少约72小时)施用。

在其它实施方案中，在如上所述的时间点且在损伤后约14天前(例如，约13天前、约12天前、约11天前、约10天前、约9天前、约8天前、约7天前、约6天前、约5天前、约4天前、约3天前)向患者施用HSC。在一些实施方案中，在损伤后约24小时，或其后某段时间，但在损伤后约14天前向患者施用HSC。

在一些方面，在损伤后X时间后且在损伤后Y前施用HSC，其中X选自约20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、40小时、48小时、52小时、58小时、64小时、72小时、3.5天、4天、5天、6天、1周、8天、9天、10天，其中Y选自16天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、1周，其中X小于Y。在本发明的一些方面中，在损伤后约20、21、22、23、24小时施用HSC。

在本发明的一些实施方案中，HSC向患者施用一次以上。HSC可每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每周一次、每2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13或14天一次或每月一次施用。在一些实施方案中，在损伤后在损伤后约24小时(例如，在24小时)后施用HSC，且在损伤后约48小时(例如，在48小时)后再次施用。

控释制剂

在某些方面中，药物组合物被改良成储库形式，从而使得该药物组合物释放至要施用的身体的方式在时间和体内位点方面受到控制(参见例如美国专利No.4,450,150)。在多个方面中，储库形式为可植入的组合物，其包含治疗性或活性药剂和多孔或无孔材料，如聚合物，其中HSC被材料包封或扩散在整个材料，和/或降解无孔材料。然后将储库植入到体内的所需位置，并且HSC以预定速率从植入体释放。

因此，在某些方面中，药物组合物被改良成具有任何类型的体内释放特征。在本发明的一些方面中，药物组合物为立即释放、控制释放、持续释放、延长释放、延迟释放或两相性释放制剂。

缀合物

在本发明的一些实施方案中，HSC附着或连接到第二部分，例如治疗剂或诊断剂。这些实施方案的HSC作为靶向剂，因为HSC能够特异性定位于受损的肾脏组织。因此，本发明一方面提供包含附着至治疗剂或诊断剂的HSC的组合物。用于本文目的的适宜的治疗剂和诊断剂在本领域中是已知的，并且包括但不限于任何本文中所提及的药剂。

组合

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物(包含缀合物)单独施用。在其它实施方案中，药物组合物(包含缀合物)与其它治疗剂或诊断制剂组合施用。在一些实施方案中，药物组合物与已知用于治疗肾脏疾病或肾脏医学状况的其它治疗剂一起施用，包括例如细胞因子或生长因子、抗炎剂、TLR2抑制剂、ATF3基因或基因产物，和盐皮质激素受体阻断剂(例如，螺甾内酯)、溶血磷脂酸、2-甲基氨基色满(2-methylaminochroman)(例如，U83836E)、21-氨基类固醇(21-aminosteroid)(例如，lazoroid(U74389F))、三甲氧苄嗪、血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂或血管紧张肽受体阻断剂(ARB)，和苏拉明(suramin)。

在一些实施方案中，HSC与其它治疗剂一起施用，包括但不限于抗血栓形成剂、抗细胞凋亡剂、抗炎剂、免疫抑制剂(例如，环孢霉素、雷帕霉素)、抗氧化剂，或本领域中通常使用的治疗肾脏损伤或疾病的其它药剂，如伊罗地塞和雷公藤内酯、HMG-CoA还原酶抑制剂(例如，辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀和阿伐他汀)、细胞裂解物、可溶性细胞级分、膜富集细胞级分(membrane-enriched cellfractions)、细胞培养基(例如，条件培养基)，或胞外基质营养因子(例如，肝细胞生长因子(HGF)、成骨蛋白-7(BMP-7)、β-转化生长因子(TGF-β)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

患者类型

对于本文所述的本发明方法，该患者为任何宿主。在一些实施方案中，宿主为哺乳动物。如在本文中所用的术语″哺乳动物″指任何哺乳纲类的脊椎动物，包括但不限于任一单孔类、有袋类和胎盘类动物。在一些实施方案中，哺乳动物为啮齿目类哺乳动物，例如小鼠和仓鼠，和兔形目哺乳动物(例如家兔)之一。在某些实施方案中，哺乳动物来自食肉目动物，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。在某些实施方案中，哺乳动物来自于偶蹄目，包括牛科动物(奶牛)和猪科动物(猪)或奇蹄目，包括马科动物(马)。在一些情况下，哺乳动物为灵长目、Ceboids或Simoids(猴)或类人猿亚目(人和猿类)。在特定实施方案中，哺乳动物为人。

给出下列实施例仅仅是为了说明本发明，而不以任何方式限制其范围。

实施例

实施例1

下列材料和方法用于实施例2-7。

动物

使用8-10周龄的免疫缺陷非肥胖型糖尿病(NOD/SCID)雄性小鼠(NOD.CB 17-Prkdc^scid/J)(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)。注意：这些小鼠未患糖尿病，但是缺少功能性T细胞和B细胞。所有小鼠均在滤盖笼中饲养，且接受已消毒的食物和酸化水。所有实验方案由Harvard Center for Animal Research and Comparative Medicine批准。

人外周血CD34+细胞纯化和追踪

人外周血CD34+干细胞选自获自正常健康成人供体的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的血浆分离置换产物(目录号mPB026，AllCells，Berkeley，CA)。简言之，将G-CSF(10μg/kg/天)施用至供体连续5天以将CD34+细胞从骨髓动员至外周循环。在第5天和第6天对供体进行血浆分离置换以收集经动员的外周血单核细胞。利用ISOLEX 300iMagnetic Cell Positive Selection System(版本2.5，Baxter Healthcare，Deerfield，IL，USA)，根据仪器用户手册提供的方案使CD34+细胞从血浆分离置换产物中高度富集。纯化的细胞通过流式细胞术表征(见下)。富集的所选细胞在25℃保持于RPMI(含0.5％人血清白蛋白)中，并在48小时内使用。为了测试活力，2×10⁵个细胞的等分样品使用7-AAD(20μg/ml，20min，4℃，于100μl PBS中)标记，使用FACS缓冲液(PBS/5％BSA)洗涤，然后通过流式细胞术分析。在一些实验中，为了追踪全身施用后的HSC，将人CD34+细胞使用绿色荧光示踪剂5-氯甲基二乙酸萤光素(CMFDA，Invitrogen)标记，使用1μg/10⁷个细胞，在25℃于10ml的RPMI中30分钟。将过量的CMFDA在离心(250×g5分钟)后通过再悬浮于10ml 5％BSA(超纯)(Sigma)的RPMI(Invitrogen)而淬灭。再次离心后，将细胞再悬浮于1％BSA/RPMI(12.5×10⁶个/ml)。CMFDA标记并未使活力产生任何变化(利用7-AAD检测(未示出))。

动物模型

根据先前描述的方法改良肾脏的缺血-再灌注损伤[1]。简言之，在第0天，麻醉的雄性小鼠(8-10周龄)的肾通过手术切开侧腹而暴露，并且在36.8-37.3℃的体中心温度下，将手术钳置于一个肾或两个肾的肾动脉和静脉上。确认肾脏变得暗黑，然后置于腹膜后腔27分钟(单侧模型)或25分钟(双侧模型)。撤去手术钳，目测确认向肾再灌注，并封闭伤口。为了测试人HSC的效果，将这些具有单侧IRI肾脏损伤的小鼠分为两组。在治疗组(n＝6-10/组)中，肾脏损伤后的第1天和第2天，将200μl的细胞悬浮液(含2.5×10⁶个人CD34+细胞，使用CMFDA标记)通过尾部静脉静脉内输注。在对照组中，仅给予小鼠媒介物。在肾IRI第3、5、7、14和28天处死小鼠。

肾功能

为了评价肾功能，将具有两侧IRI肾脏损伤的小鼠(d0)随机分成两组。治疗组(n＝10)，在第1天和第2天，通过尾部静脉静脉内输注接受2.5×10⁶个人HSC。对照组(n＝16)仅接受媒介物。分析血样中的血浆肌酸酐，血样是利用先前描述的方法在损伤后第1、2、5、7、14和28天取自尾部静脉[1]。

损伤和修复的组织制备，免疫染色，成像和定量

对小鼠灌注冰冷的PBS，然后将器官在高碘酸盐-赖氨酸多聚甲醛(PLP)溶液中固定2小时，然后用18％蔗糖固定16小时，然后保持于最佳切割温度(OCT)培养基(用于冷冻组织的包埋培养基，以确保最佳切割温度和以在低温恒温器上切片前包埋组织)(-80℃)[2]，或将用于光学显微镜检查的组织在10％中性-缓冲的福尔马林中固定12小时，转移至70％乙醇中，然后加工用于石蜡切片(3mm)和切片，并使用过碘酸-希夫(PAS)或天狼猩红2染色。免疫荧光法标记在5mm冰冻切片上进行。为了检测在肾脏、脾和心脏中输注的人细胞，使用抗人白细胞抗原但对小鼠抗原没有交叉反应的抗体或CMFDA的荧光(直到第7天)。下列抗体用于其它地方描述的方法[1，2]：抗-I型人白细胞抗原(HLA)-ABC(FITC，1∶200，eBioscience)、抗-人CD45(FITC，1∶200，eBioscience)、大鼠-抗-人CD45(1∶200，Abcam)、抗-人CD68(FITC，1∶200，eBioscience)、抗-人CD3(FITC，1∶200，eBioscience)、抗-人CD31(FITC，1∶200，eBioscience)、兔-抗-人vWF(1∶200，Abcam)、抗-人CD 146(FITC，1∶100，Abcam)、生物素-抗-人CD 133(1∶100，Miltenyi)、兔-抗-人-CD 133(1∶100，CellSignaling)、山羊-抗-人KDR(1∶100，R&D Systems)和兔-抗-人KDR(1∶100，NeoMarkers)，接着为兔-抗FITC(1∶200，Invitrogen)、抗-大鼠Cy3或抗-兔Cy3或抗-山羊Cy3(1∶400，Jackson Immunosresearch)或抗-亲和素Cy3(1∶3000，Jackson Immunosresearch)。为了标记小鼠血管系统，使用大鼠-抗-小鼠CD31(1∶200，eBioscience)，其对人抗原没有交叉反应，接着为抗-大鼠Cy3(1∶400，Jackson Immunosresearch)。将切片使用1％多聚甲醛(PFA)固定后(post-fixed)，然后使用DAPI固定于Vectashield。肾小管周毛细血管损失和肾小管损伤分别通过评价抗-CD31-Cy3标记的肾脏切片或PAS染色的石蜡切片，利用如前所报道的盲法评分来确定[3]。简言之，图像通过通过在整个矢状断面(包括皮质和外髓部)连续数字成像(X200)捕捉(10-20图像)。将每一图像分为252正方形格子。为了计算肾小管周毛细血管损失，每一正方形(没有肾小管周毛细血管)评为正分；最终的评分表示为正分的百分比。为了评估肾小管损伤，每一正方形(存在的肾小管损伤(肾小管压扁、坏死、凋亡或出现脱落))评为正分。最终的评分为每一图像中具有正分的正方形的百分比，其为来自单个肾脏的所有图像的平均值。表观图像使Nikon TE2000显微镜，CoolSnap照相机(Roper Scientific，Germany)，且利用IP实验室软件(BD Biosciences，San Jose，CA)处理。共聚焦图像利用Nikon C1D-Eclipse共聚焦显微镜生成。投影图像由在0.1mm步长时获得的10Z-堆叠图像而生成。为了使得能够在切片之间进行比较，包含的共聚焦设置在切片之间保持恒定。

流式细胞术分析和分选

Isolex-富集的CD34细胞利用下列人抗体组合，利用先前描述的方法进行分析：抗-CD31-FITC(1∶100，BD)、抗-CD146-PE(1∶100，BD)、抗-KDR-FITC(1∶100，R&D Systems)、抗-CD45-FITC(1∶100，BD)、抗-CD140b-Alexa Fluor 488(1∶100，BD)、抗-CD29-PE(1∶100，BD)、抗-CD105-FITC(1∶100，R&D Systems)、抗-CD34-PE(1∶100，BD)、抗-CD99-FITC(1∶100，BD)、抗-CD144-PE(1∶100，R&D Systems)、抗-CD38-FITC(1∶100，BD)、抗-CD14-FITC(1∶100，BD)、抗-CD64-PE(1∶100，BD)、抗-CD61-PerCP(1∶100，BD)、抗-CD133-APC(1∶100，Miltenyi)、抗-CXCR4-APC(1∶100，BD)、抗-CD90-APC(1∶100，BD)、抗-CD117-APC(1∶100，BD)、抗-VEGFR1-APC(1∶100，R&D Systems)[1]。HSC的完全表征将在其它文献中论述(D.M.&A.C.未出版)。单细胞由肾脏、脾和骨髓如先前描述的那样制备[2]。简言之，将来自于肾脏、脾和骨髓的单细胞(1×10⁵个)再悬浮于FACS缓冲液中，并使用抗人CD45(FITC，1∶200，eBioscience)和小鼠CD 11b(PE，1∶200，eBioscience)的抗体培养30分钟。使用FACS洗涤缓冲液洗涤且再悬浮于200μl FACS缓冲液后，利用BD FACSCalibur流式细胞仪进行分析细胞。将使用CMFDA标记的人HSC在注射后第2天通过FACS分选法利用FACSaria直接进行分选[2]。将自肾脏分选的CMFDA+细胞立即溶解，并利用RNA Easy(Qiagen)系统纯化RNA，以用于实时PCR。

实时PCR

利用试剂盒(RNA Easy Qiagen)，按照制造商的说明由组织和细胞产生总RNA。纯度通过A260至A280确定。利用iScript和引物(包含无规六聚物和聚去氧胸苷核苷酸)由1μg总RNA合成cDNA[2]。人和小鼠样本的实时PCR利用ABI7900HT序列检测系统(PerkinElmer LifeSciences，Boston，Applied BioSystems，Foster City，CA)在SYBR-Green(SYBR Green PCR kit；Qiagen)的存在下，利用先前描述的方法进行[4]。特异性人GAPDH、HPRT1、血管生成素1(ANGPT1)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子1(IGF1)、白介素-8(IL8)、血小板源性生长因子b(PDGFb)、转化生长因子b 1(TGFb 1)、血管内皮生长因子(VEGF)、TIE1的引物/探针集来源于Sabiosciences。等量的cDNA用于RT-PCR反应，并与即用反应混合物(Sabiosciences)混合。所有的反应一式三份进行。实时PCR的优化按照制造商的说明进行。为了确定标准曲线，使用所有样本集，这些样本以四步log2连续稀释，并对样本进行同时操作。各反应的总体积为20μl，含有300nM正向引物和300nM反向引物和125ng的cDNA。对于各个反应进行适当的负对照。

统计分析

所有的值以平均值±标准偏差(SD)给出。使用Mantel-Cox Log-rank测试分析存活率。两组之间的比较通过未配对t-检验(双尾)进行。将配对t-检验用于直接比较动物或患病小鼠与假手术小鼠的左(IRI)和右(对照)肾。认为小于0.05的P值在所有的统计检验中是显著的。

实施例2

Isolex-纯化的G-Csf-动员的造血干细胞的表征

对来自造血肝细胞-动员的人供体CD34+富集的白细胞分析活力和纯度。经7-AAD排除99％以上的HSC存活(未示出)。96％以上的白细胞为CD45+、CD34+，表明它们为造血干细胞(HSC)(参见表1)。少数表达CD34，而非CD45。利用细胞表面标记物CD14、CD34、CD146、CD133、CD31、VEGFR2对富集的白细胞进行进一步表征，用于多向分化潜能的确证和假定内皮祖细胞的鉴定(参见表2)[19]。所述表征表明，除了HSC外，动员的人外周血CD34+细胞含有少量的循环内皮祖细胞(CEP)和极少数的循环内皮细胞(CEC)。

表1

表2

实施例3

缺血再灌注损伤后修复期间人造血干细胞被募集至肾脏

为了研究人HSC对肾修复的作用，我们起初确定了它们是否能够被募集至受损的肾。在起初研究中，损伤前静脉内输注使用CMFDA标记的2.5×10⁶个HSC不能导致注射之后24小时显著地募集(数据未示出)。接下来，我们在肾IRI之后第1天和第2天输注CMFDA-标记的HSC，并在损伤后第3、5、7天观察肾脏(图1A，B)，其中很多被募集的HSC能够在肾脏薄壁组织中检测到。很多集中于肾小管周毛细血管(PTC)内，但在血管周围位置中的毛细血管的边缘的外部检测到一些(图1C)。我们还注意到，在下列单侧IRI后，HSC少量但显著地募集至未受损的肾脏中(图1B)。然而，我们未能在心脏中检测到任何HSC(未示出)，这表明HSC向未受损的和受损的肾脏的特异性募集。由于考虑到CMFDA可能随时间变得稀释，我们在损伤后第1天和第2天将未标记的HSC输注至小鼠。这些未标记的细胞通过抗HLA-I类的抗体检测(图1C，D)。可在所有时间点于肾脏中易于检测到HLA-I类阳性细胞，但值得注意的是，IRI后第14天和第28天，HLA-I类+细胞存留在肾脏中(图1D)。正如所预期，在脾和骨髓中也鉴定到了HSC(图1E-H)，HSC存留在骨髓中，证据如下：IRI后第7天，骨髓中的HSC已经诱导髓样标记物CD11b(图1G)(表明HSC已结合了小鼠骨髓，并且小鼠现在为嵌合体型)。

实施例4

人造血肝细胞全身治疗减少缺血再灌注损伤后的死亡率并改善肾功能

为了确定募集至受损的肾脏中的HSC在修复期间是否具有任何功能性影响，我们将小鼠处理成双侧IRI(第0天)，接着在第1天和第2天静脉内输注人HSC。血浆肌酸酐在假手术小鼠(第0天，血浆肌酸酐值为0.05±0.06)中且在IRI后第1天、第2天和第7天进行评价。双侧肾IRI使得血清肌酸酐在24小时显著增加，并在48小时达峰值(图2A)。尽管在24小时(第一次注射的时间)的血浆肌酸酐水平在治疗组和媒介物组中没有差别，但是在48小时在已接受HSC的小鼠中血浆肌酸酐存在醒目且显著的降低(图2A)，而媒介物组的小鼠在此时具有持续高度升高的血浆肌酸酐水平。到第7天，在仍存活的小鼠中，媒介物组和治疗组均显示类似的血浆肌酸酐水平。这并不奇怪，因为IRI模型是一个恢复模型。然而，在媒介物组中，仅50％的小鼠存活至第7天(图2B)，而90％的接受人HSC的小鼠存活至第7天(图2B)。两组中的存活数目可见于图2B中。这些惊人的发现表明人HSC同时促进肾脏修复/再生并提高存活率。

实施例5

缺血再灌注损伤后人造血肝细胞治疗减少肾小管周毛细血管损失、促进肾小管上皮的再生和预防长期纤维化

为了研究HSC通过何种机制促进肾脏修复，我们分析了肾切片的肾小管周毛细血管(PTC)的损失和肾小管损伤的持续性(图3)。通过形态测定法对mCD31-标记的PTC的分析表明，在修复期的HSC治疗预防PTC损失(图3A-C)。然而，显著地，在14天和28天后的PTC损失没有区别，这表明存在促进PTC再生的内源性因素，但是HSC治疗减少了血管系统的早期损失。类似地，在IRI模型的修复期期间，HSC治疗降低了肾小管损伤的持续性(图3D-F)，这表明HSC直接或间接促进肾小管再生。我们先前已经证明，肾IRI能够导致持续性间质性纤维化(其为慢性肾病的先兆，且与进行性长期肾功能丧失密切相关)[14，20-22]。为了测试在受损的肾的修复期间全身性输注HSC是否能够实现对损伤的长期影响，我们对间质性纤维化进行定量(图3G-I)。在媒介物治疗的小鼠中，间质性纤维化在损伤后四周逐渐累积，但在那些已经接受HSC的小鼠中，间质性纤维化在第28天减少。

实施例6

缺血再灌注损伤后人造血干细胞在肾脏中获得早期淋巴样和髓样分化和内皮祖细胞标记物

HSC为髓系细胞、红细胞系细胞、巨核细胞系细胞和淋巴系细胞的来源。我们注意到，尽管很多HSC在损伤后第3天被募集至肾，保持细胞的数量至第7天逐渐下降，但是其后再次增加，直到损伤后第28天(图1)。我们标记了肾，用于人淋巴样和髓样定向(commitment)标记物(图4)。损伤后最早第3天，很多被募集的HSC已经获得了CD68或CD3，且诱导在未受损和受损的肾脏中是类似的(图4)。然而募集至肾的HSC至第7天也没有获得单核细胞的核形态，这些数据表明，在肾脏内存在对于淋巴系和髓系的早期局部定向。肾脏中的人细胞的数目在损伤后后期增加。我们在IRI肾后第14天和第28天观察到偶有的人细胞，具有中性白细胞的特征性核(未示出)。这些发现结合BM嵌合性的发现表明，人细胞在肾中的晚期增加反映了骨髓嵌合性或反映了肾脏中成熟细胞类型的局部分化。

为了进一步研究HSC在肾脏中的局部分化，使用标记物VEGFR2(KDR)、CD146和CD133标记切片，细胞表面表达与输注前的干细胞进行比较(表3)。尽管很少经动员的富集HSC表达KDR或CD146，但是大多数表达CD133。然而，在肾脏中在IRI后第3天，存在表型转化，因为几乎所有被募集的HSC表达CD146，但没有HSC表达CD133。KDR的表达在经动员的富集HSC中是类似的，与在那些被募集至肾中的进行比较。因为CD146已与CEP功能相关，我们的发现表明肾脏促进HSC分化(对CEP型功能)。

表3

实施例7

人造血干细胞主要通过旁分泌机制而有助于血管修复

为了进一步研究HSC对支持心血管生成的作用，我们最初确定了HSC是否分化为内皮细胞。利用抗CD31和人vWF(内皮细胞的两个标记物)的人-特异性抗体，我们在第7、14和28天鉴定了受损肾脏中的人CD31+细胞，而不是在较早的时间点(图5A，B，C)。因此，CD31表达并不符合最大化修复。偶有的CD31+HSC缺乏CD45表达，且发现于PTC壁，形态与内皮细胞一致(图5A)。然而，大量的CD31+人细胞还共表达CD45(图5B)或位于间质组织中，具有白细胞形态，与通过淋巴细胞和单核细胞的CD31表达一致，表明人CD31不是内皮的特异性标记物。利用抗人-vWF抗体(其与小鼠vWF没有交叉反应)的平行研究还鉴定了非常少的vWF+人细胞，其缺乏CD45表达(图5D)，这更加证实了偶有的人细胞确实变为功能性内皮细胞的结论。由于这些研究提供了证据，表明人CD34+细胞对于直接毛细管再生贡献很少，但是在所有HSC中存在CEP标记物CD146的显著诱导(表1)，我们测试了HSC是否通过旁分泌机制起作用。由此完全可得出，损伤后HSC位于血管内和血管周围。为了对此进行进一步研究，我们纯化了CMFDA-标记的HSC(其在IRI后第4天已经被募集至肾)，并通过RT-PCR分析它们的人特异性转录特性，将其与全身注射至小鼠前的HSC的转录特性相比较。HSC对于促血管生成细胞因子(包括ANG-1、FGF-2和VEGF-A)产生高水平的转录物，此外，对其在上皮细胞再生中的作用产生了高水平的HGF识别(图6)。显著地，那些被募集至肾的HSC显示出高度类似于促血管生成的细胞因子的转录活性，进一步支持了在血管生成中的旁分泌作用。

实施例8

本文中所述数据的讨论

人急性肾脏损伤持续导致高的死亡率，并且治疗选择有限，因此鉴定潜在的再生方法作为新的治疗策略是非常需要的。此外，不断有证据表明人急性肾脏损伤是以炎症、血管病变、内皮萎缩、纤维化和进行性功能丧失导致器官衰竭为特征的慢性肾病的先兆[2，14，22，23]。新的减轻肾脏损伤或增强修复和再生的策略不仅具有短期影响，而且也会预期改变肾功能的长期进程。此类治疗的长期结果不仅影响肾病，同时也影响心血管疾病，因为慢性肾病是心血管疾病的独立危险因子[4]。最近，已报道，成人外周血CD34+细胞和HSC能促进中风和骨损伤后血管再生和骨再生[16，24]。此外，在外源性施用的G-CSF的存在下，CD34+细胞能够扩增并转移至外周循环[25-27]，使得HSC更容易得到，且强化了临床细胞治疗的理论基础。

在本研究中，我们证明了，肾脏损伤后24小时全身性施用的人HSC被选择性募集至受损的肾脏中，并主要集中于血管系统中和其周围。这种募集与修复增强的微血管系统、肾小管上皮细胞、增强的功能恢复和提高的存活率，以及长期纤维化的预防相关。募集至肾脏后，HSC在肾脏中诱导早期淋巴样和髓样定向标记物，获得CEP标记物，但仍然维持高水平的促血管生成转录物的合成。尽管在募集至肾脏前，纯化的HSC含有少量的循环内皮祖细胞和偶有的循环内皮细胞，并且肾脏募集的HSC诱导CD146(与CEP分化一致)，但是我们在小鼠毛细血管壁中鉴定了非常少的人内皮细胞。结合这些数据表明HSC介导的肾脏修复是通过旁分泌机制，而非血管置换(图7)。

人HSC选择性地募集至单侧肾IRI模型中的受损的肾脏中，这表明受损的肾脏能选择性募集于外周循环的HSC。IRI后人HSC选择性募集至肾表明，细胞因子(包括基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和其受体CXCR4)的局部释放可能是重要的，且转录因子缺氧诱导因子-1(HIF-1)可在调节局部细胞因子诱导中起作用[28，29]。值得注意的是，在损伤开始(第0天)时全身性施用HSC导致不良的HSC募集，但是在修复期的开始时延迟施用HSC在引发募集方面是高度有效的。该募集模式类似于单核细胞流入肾中，而不像中性白细胞募集，这表明其它的单核因子可在HSC募集中起作用。我们先前在小鼠中的研究中指出不存在对于内源HSC自骨髓动员或募集至肾(简单响应于IRI)的证据，这表明HSC从其骨髓中正常利基(niche)的募集存在不充分的内源性信号[30]。因为向外周循环注射HSC导致有效募集至肾，所以HSC治疗克服了从骨髓利基释放中的常见障碍。少量的人HSC也被募集至IRI的单侧模型中的未受损的肾脏中。没有HSC被募集至同一小鼠中的心脏或肠中或至健康小鼠的肾中(未示出)。在对单侧IRI的响应中，该未受损的肾脏发生补偿性的变化，包括肥大和增生。因此，募集至受损肾脏的HSC促进血管生成或在没有损伤时起到保护作用是可能的。

IRI后至第14天和第28天，利用抗HLA-I类抗原的抗体检测肾脏中的HSC。HSC在肾脏中的停留随时间呈双峰分布，最低点出现在约第7天时。我们注意到，小鼠出现了骨髓嵌合现象，并且在第14天和第28天(不是更早)肾脏中的一些人细胞是中性粒细胞。因此，可能在肾脏损伤修复的前7-10天，HSC仍为干细胞，早期定向细胞或CEP，并随着修复进展缓慢从肾脏中消失，继而随后被成熟白细胞替代，这些成熟白细胞被募集于骨髓而不是来源于最初的体循环HSC。肾脏中人白细胞的后期增加与CD31的后期表达以及人中性粒细胞的出现与募集自嵌合骨髓的白细胞一致。然而，我们的数据明确指出在疾病的第1天和第2天输注HSC导致对纤维化的长期影响。根据当前的研究，还不明确长期纤维化的降低是否表明早期血管修复得到改善，或其是否表明在较晚的时间点肾脏中持续存在修复的人HSC群。

肾脏缺血性损伤以上皮损伤为特征。对肾小管周毛细血管(PTC)的损失未做充分描述。但是，源于一些严重急性肾脏损伤模型(缺血、毒素、短暂性(transient)血管紧张肽II)的数据证明，通常先于大量纤维化进展的毛细血管损失[14，15，31]和新生血管生成可能是保存血管结构和恢复器官功能方面的一个重要过程[12，13，32，33]。在这些研究中，我们还发现，IRI后即使只是相对轻度的肾脏损伤也会出现显著的PTC损失，且尽管在修复期间这些毛细血管会显著再生，但损伤后一个月血管系统仍在持续损失，表明肾脏在损伤后血管再形成方面有其内在缺陷[14]，不像其它器官如皮肤一样。我们的研究明确地表明，HSC在肾脏修复期间减少PTC的损失，且这与肾功能快速恢复和提高小鼠存活率相关。在我们的单侧IRI模型中，HSC介导的PTC再生不减轻28周时的长期PTC持续损失，然而其可影响在双侧IRI模型中看到的功能恢复和存活率，这表明在肾脏修复中早期血管修复是一重要过程。尽管HSC介导的血管修复的效力被限定于在损伤后的较早时间点，然而其在损伤后1个月仍然有预防纤维化进展的作用。需要做进一步的研究以了解早期HSC输注的长期作用是否是由于增强的周皮-内皮细胞的相互作用，此作用可能是肾间质纤维化进展中的一种重要的相互作用[34]。初步的研究显示IRI后第14天较晚施用小鼠HSC导致其募集较差，且几乎无证据支持其增强血管修复(未示出)，表明损伤后存在一限定期，在此期间HSC是有效的。

尽管肾IRI模型特征在于肾小管上皮细胞(尤其是近端肾小管细胞的S3段)的严重损伤和修复，但是似乎是，没有PTC再生，那些受损的肾小管由于持续性缺血将不会成功地再生[14，35]。我们的研究也显示HSC促进上皮细胞再生，如通过肾小管损伤评分和功能恢复评价。HSC对于促血管生成因子产生高水平的转录物，以及它们在肾脏中的位置(血管内和血管周围)表明在血管修复中的主要作用，其又促进了上皮细胞的修复。然而，对于HGF(已知其直接对于上皮细胞以及该上皮细胞修复的细胞因子WNT7b(未示出)具有促修复作用(Lin等正在投稿))的高水平的转录物表明，HSC在上皮细胞修复中可能具有直接的旁分泌作用，而与PTC修复无关。

同样，令人感兴趣的是，HSC快速地降低CD3+和CD68+在修复中的肾脏中的表达。不断有证据指出，对于T细胞和单核细胞衍生的细胞两者在损伤后的肾脏中的修复作用[36，37]。因此，HSC局部分化为修复的T细胞和修复的巨噬细胞也是可能的。需要进一步的研究以确定肾募集的HSC和成熟T细胞和单核细胞(来源于外周血)之间的差别[36，37]。

循环内皮细胞(CEC)和CEP通过直接形成成熟的内皮细胞在内皮细胞再生中的作用已经进行了大量的研究[18，38]。事实上，我们先前报道了在小鼠骨髓嵌合体中，少量的内皮细胞来源于肾IRI和修复之后的嵌合体的骨髓[30]。在一些研究中，使用启动子Tie2检测已经变为内皮细胞的白细胞导致事后解释分析出现问题，因为Tie2同时标记白细胞和内皮细胞[39]。因此，声称CEP变为内皮细胞可能言过其实。在这些当前的研究中，我们一致地发现，几乎所有被募集的人HSC保留了常见的白细胞标记物CD45，这与其它的公开数据相一致[11]。我们使用内皮标记物CD31来鉴别人内皮细胞，但CD31同样标记B细胞和单核细胞/巨噬细胞[40]，且在这些研究中证明其对于内皮细胞为非特异性的。然而，在毛细血管壁内鉴定了偶有的细胞，具有内皮形态、CD31的表达、血管性血友病因子(vWF)且缺失CD45[41]，与人内皮细胞一致。在我们最初表征的纯化的HSC中，存在少量的纯化的CEC(＜0.05％)[38，42]，和少量的CEP。在IRI后肾脏中，大多数的人HSC获得CEP标记物。因此，这些偶有的人内皮细胞来源于具有内皮细胞的CEP的细胞融合、极少CEC的掺入，或CEP的转分化是可能的。当然，人内皮细胞的出现不是肾脏PTC再生的有意义的机制。然而，我们的研究表明HSC和被募集至正在修复的肾中的HSC(具有CEP标记物)能够分泌血管生成因子，包括VEGF-A、HGF、ANG-1、IL-8、IGF-1和FGF-2，正如在其它研究中已经报导的那样[18，24，43]。所有的这些细胞因子被看作是强效的血管生成因子，且能够通过增加的血管生成促进肾脏修复[44-46]。结合HSC于肾脏中的血管内和血管周的位置，我们提出通过HSC的存活和肾修复两者的主要机制为通过旁分泌机制的PTC再生[24]。

总之，我们在此证明了，通过针对肾小管周毛细血管的旁分泌机制，全身性施用外周血经动员的人HSC降低了死亡率，促进了肾脏的快速肾修复和再生。这些发现支持人HSC作为用于治疗急性肾病以及在预防慢性肾病中的有前景的治疗策略。

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本文中涉及组合或治疗方法的所有描述还应当被理解为限定本发明的“用途”。例如，本发明包括水杨酸的来源在治疗本文所鉴定的医学状况或达到本文所鉴定的治疗目标(例如，降低有此需要的患者的血糖)中的用途。类似地，本发明也包括水杨酸的来源在制备用于此类治疗/目的的药物中的用途。

前述总结并不意欲限定本发明的每一方面，且其它方面在其它部分进行了描述，如发明详述。应将整个文件视为统一的公开，并且应当理解涵盖本文所述特征的所有组合，即使所述特征组合在本文件的同一句、同一段或同一部分中未被同时发现。

除了前述之外，作为附加的方面，本发明还包括以任何方式与上文专门提及的变化相比范围更窄的本发明的所有实施方案。对于描述为种属的本发明的方面，所有的单个物种均为本发明的单独考虑的独立方面。对于描述为范围的方面，具体地涵盖所有的子范围和各个值。

尽管申请人发明了本文所附权利要求的完整范围，但是本文所附权利要求并非意欲将其他人的现有技术工作涵盖到它们的范围内。因此，如果专利局或其他实体或个人向申请人指出法定现有技术涵盖在本发明权利要求范围内，则申请人保留按照适用的专利法修改权利要求以重新限定此权利要求的保护主题、从而由此权利要求的范围内专门排除这些法定现有技术或其明显变化的权利。由这些修改权利要求限定的发明也意欲作为本发明的方面。基于本申请的全文，本发明的其它特征和变化对于本领域的普通技术人员而言将是显而易见的，并且所有此类特征应当视为本发明的方面。

Claims (26)

1.一种治疗患者的肾脏损伤的方法，所述方法包括在损伤后至少约20小时且在损伤后约14天之前向所述患者施用一定量的造血干细胞(HSC)，其中所述量可有效治疗所述患者的肾脏损伤。

2.一种预防患有肾脏损伤的患者的肾脏疾病或肾脏医学状况的方法，所述方法包括在损伤后至少约20小时且在损伤后约14天之前向所述患者施用一定量的造血干细胞(HSC)，其中所述量可有效预防所述患者的肾脏疾病或肾脏医学状况。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述肾脏疾病或肾脏医学状况选自急性肾衰竭、慢性肾病和间质性纤维化。

4.一种提高患有肾脏损伤的患者的存活率的方法，所述方法包括在损伤后至少约20小时且在损伤后约14天之前，向所述患者施用一定量的造血干细胞(HSC)，其中所述量可有效提高所述患者的存活率。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述肾脏损伤造成所述患者肾脏中的肾小管周毛细血管损失。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述急性肾脏损伤由患者中的下列一种或多种造成：缺血、毒素、血管紧张肽转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张肽II受体阻断剂的使用、输血反应、对肌肉的损伤或创伤、手术、休克和低血压。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述肾脏损伤为肾脏缺血再灌注损伤。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述HSC在损伤后至少约20小时且在损伤后约7天之前施用。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述HSC在损伤后至少22小时且在损伤后约4天之前施用。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述HSC在损伤后约24小时施用。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括第二次施用HSC。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述HSC的第二次施用是在所述第一次施用之后至少约12小时施用。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述HSC的第二次施用是在所述第一次施用后至少约24小时施用。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HSC为其中至少30％的细胞为CD34⁺HSC的细胞群的一部分。

15.根据权利要求14所述的方法，其中至少50％的细胞为CD34⁺HSC。

16.根据权利要求15所述的方法，其中至少75％的细胞为CD34⁺HSC。

17.根据权利要求16所述的方法，其中75％以上的细胞为CD34⁺HSC。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HSC为分离自供体外周血的经动员的骨髓细胞。

19.根据权利要求18的所述方法，其中所述供体为所述患者，并且所述HSC对于所述患者为自体同源的。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中将至少2.5×10⁶个HSC施用至所述患者。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HSC为肠胃外施用。

22.一种药物组合物，其包含HSC群和药物载体。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，其配制用于肠胃外施用。

24.根据权利要求22或23所述的药物组合物，其中将所述HSC与用于肾脏缺血再灌注损伤的治疗剂缀合。

25.根据权利要求22-24中任一项所述的药物组合物，还包含用于治疗肾脏疾病或肾脏医学状况的治疗剂。

26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述治疗剂选自：TLR2抑制剂、ATF3基因或基因产物、盐皮质激素受体阻断剂、溶血磷脂酸、2-甲基氨基色满、21-氨基类固醇、三甲氧苄嗪，和苏拉明。

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