CN102641296B - 一种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病（gvhd）制剂及其制备方法 - Google Patents
一种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病（gvhd）制剂及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102641296B CN102641296B CN201110041925.7A CN201110041925A CN102641296B CN 102641296 B CN102641296 B CN 102641296B CN 201110041925 A CN201110041925 A CN 201110041925A CN 102641296 B CN102641296 B CN 102641296B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- msc
- preparation
- days
- substratum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 title claims abstract description 100
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 title claims abstract description 30
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 44
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 21
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 19
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 19
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims description 16
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 16
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims description 16
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 16
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 15
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 14
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 13
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 13
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 12
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 9
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims description 8
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims description 8
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims description 8
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 7
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 6
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 claims description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 3
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 claims description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims description 2
- 238000009583 bone marrow aspiration Methods 0.000 claims description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 claims 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract 1
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 7
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 7
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 7
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 7
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 7
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 7
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 7
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 7
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 7
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 3
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 3
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 3
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 3
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 2
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000012560 cell impurity Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 102100034594 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010048154 Angiopoietin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034608 Angiopoietin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010048036 Angiopoietin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 1
- 102100023702 C-C motif chemokine 13 Human genes 0.000 description 1
- 101710112613 C-C motif chemokine 13 Proteins 0.000 description 1
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 description 1
- 101710155833 C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150001151 CD86 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100027995 Collagenase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108050005238 Collagenase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000868152 Homo sapiens Son of sevenless homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710175243 Major antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- -1 PDGF Proteins 0.000 description 1
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 230000020385 T cell costimulation Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108010031374 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102100030742 Transforming growth factor beta-1 proprotein Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 108010073919 Vascular Endothelial Growth Factor D Proteins 0.000 description 1
- 102100038234 Vascular endothelial growth factor D Human genes 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 108010086652 phytohemagglutinin-P Proteins 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)的制剂及其制备方法，该制剂的制备方法是通过诱导单核细胞获得间充质干细胞(Mesenchymal？stem？cells，MSC)，进而在低血清条件培养上述MSC细胞，最后分离MSC细胞获得无细胞培养基，并对该无细胞培养基进行相应后处理，即可获得所述制剂。体外和体内实验表明，本发明所述的抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)的制剂能够显著的抑制受体的免疫反应从而有效的改善GVHD症状。
Description
技术领域
本发明涉及一种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)的制剂及其制备方法。
背景技术
早在19世纪，在创伤愈合的研究领域，就有观点第一次提出了骨髓中可能存在着非造血功能的干细胞。但直到1976年，间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSC)才首次被报导，并由此开始逐渐被人们重视。MSC是一种存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞，将同种异体甚至异种异体的间充质干细胞移植入宿主体内，在一定的诱导条件下可分化成具有中胚层、外胚层或内胚层特点的细胞，并参与宿主的构成。这使得人们一直以来对于异体移植的理解产生了巨大的冲击，甚至在一些研究中间充质干细胞还可以用来治疗由于器官移植造成的移植物抗宿主病，可见间充质干细胞有着独特的免疫调节功能使其在人和动物体内可以避免异种移植排斥反应的发生，逐渐成为移植治疗中的研究热点。
近年来，MSC的免疫调节作用愈发引起了新的重视，MSC具有独特的免疫学特性。首先，MSC没有免疫原性，MSC仅低水平表达人类主要组织相容性I类分子，而不表达人类主要组织相容性II类分子，由于人类主要组织相容性II类分子是诱发异体免疫排斥的主要抗原，因而导致了间充质干细胞的低免疫原性，不会刺激机体产生免疫反应，这就可以使其逃避细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞(NK)的杀伤作用；另一个方面，MSC又显示出一定的免疫调节作用，可以降低机体的免疫反应，具有复杂的调节T细胞和B细胞功能的作用。MSC表面不表达T细胞共刺激分子B7-1、B7-2，也不表达刺激细胞凋亡的分子如CD40、CD80、CD86。有报道表明，用CD80、CD86基因转染MSC，从而为T细胞增殖提供CD28介导的共刺激信号，或是用γ-干扰素预处理MSC以上调人类主要组织相容性II类分子的表达，这些经处理的MSC仍不能有效提呈抗原和刺激T细胞的增殖，进一步证实了间充质干细胞的低免疫原性。
正因为MSC具有重要的体内外免疫调节作用，同时其取材方便，数量丰富，扩增效率高，具有多向分化潜能，因而，MSC正成为最具临床应用潜能的干细胞，也展现了在器官移植后的免疫排斥抑制方面的广泛应用前景。
移植物抗宿主病(GVHD)是由于供受体间次要组织相容性抗原的差异，即便在MHC配型极大的提高了骨髓移植的成功性的今天，GVHD仍然是骨髓移植患者所面临的重要问题，是导致骨髓移植患者死亡的重要因素，而MSC的免疫调节功能，为临床上治疗GVHD提供了一种全新的思路。
目前，对MSC的临床应用尝试主要集中与直接进行自体或异体的细胞移植，有报道显示MSC对免疫细胞的调节作用具有剂量依赖性，尤其是对T细胞增殖的抑制作用，随着MSC剂量增加，抑制作用加强。尽管在细胞移植的角度，MSC应用取得了一定程度的进展，但细胞移植本身的局限性，例如活细胞的保存困难、移植的操作难度等极大的限制了MSC的更为广泛的应用，针对这一问题，本发明人通过相关研究，证实移植的MSC在参与免疫调节抑制的过程中所分泌出的生长因子和细胞活素，可借由MSC在体外特定环境中所分泌的条件培养基中获得，并完全可能将其应用于临床上的器官移植或组织工程后的免疫抑制方面的应用，从而提升器官移植或者组织工程(例如人工骨移植)后的愈后效果。因此，MSC在体外人工环境中分泌的促血管及周边组织修复或再生的生长因子和细胞活素在临床上有巨大的潜力，可以作为干细胞疗法的有效替代品或辅助药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂，应用于抑制临床由于器官移植、骨组织工程手术等因素引起的自体免疫排斥反应。
本发明的目的还在于提供一种制备免疫抑制及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的方法，该方法步骤为：
1)从健康人血液中通过白细胞置换(leukapheresis)获取外周血单核细胞，或从骨髓中(通过密度梯度离心的方法，可选步骤)获取骨髓单核细胞，或从人脂肪吸取物(lipoaspirate)中直接提取MSC；
2)筛选及培养外周血或骨髓单核细胞以获得MSC细胞；
3)在特定条件下培养MSC细胞使其分泌促组织修复和再生的生长因子和细胞活素，分离MSC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；
4)对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括：过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂。
本发明所述制备免疫抑制及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的方法中，步骤1)所述的健康人血液或骨髓的来源可以是自体来源或异体来源，获得途径可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。可选步骤中所述的梯度离心以获取单核细胞的步骤为：将所获得的骨髓或外周血液在密度梯度剂中梯度离心，所用的梯度剂可为Ficoll-Paque(GEhealthcare)、Histopaque-1077(Sigma)，或其他公司同类产品，优选为Histopaque-1077；适用温度范围为15到25℃，优选为25℃。具体操作为：将含有骨髓或外周血及梯度剂的容器在200g-500g下离心20-40分钟，分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液，经鉴定，此单核细胞群体来源于骨髓髓系干细胞其内所含多种细胞亚群，呈多形性。
本发明所述制备抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞时，所用的培养基可为M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的一种，并可添加有heparin(0-100U/ml)。培养基中另可含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。在预设条件为培养温度37℃，二氧化碳浓度为5-7％的细胞培养箱中培养。
本发明所述制备抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞的步骤为以下所述方法①至④中的一种：
方法①：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养1-2天，去除悬浮细胞，将贴壁的细胞继续培养7-21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。
方法②：将单核细胞与fibrin微球(直径50-250微米，可由商业途径获得，如ForticellBioscience)共同培养1-2天，每100-1000mgfibrin微球可吸附1×106至1×108个细胞的密度，去除悬浮细胞，将附着于fibrin微球的细胞继续培养7-21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。
方法③：将单核细胞通过CD14，或CD45特异性抗体进行磁珠分选(由德国MiltenyiBiotec公司生产)，筛选出不含CD14或CD45的单核细胞亚群，将此CD14-或CD45-单核细胞亚群以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，去除悬浮细胞，将贴壁(或附着于fibrin微球)的细胞继续培养7-21天。所获II型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。
方法④：将人脂肪吸取物(lipoaspirate，约50-100ml)在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)或0.9％的医用生理盐水中洗净，用I型和II型胶原酶(collagenasetypeI，II，Sigma-Aldrich)消化(酶的浓度范围0.05％-0.1％)，消化步骤为置于37℃条件下震荡30-60分钟。将消化分散后的单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，将贴壁(或附着于fibrin微球)细胞继续培养7-21天。所获III型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。
本发明所述制备抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的方法中，步骤3)中所述的在特定条件下培养MSC细胞的方法为以下所述方法①或②中的一种：
方法①：将步骤2)所获得的I、II、III型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％，温度为37℃的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)或0.9％的医用生理盐水，并可添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。
方法②：将步骤2)所获得的I、II、III型MSC先置于促血管内皮细胞生长的培养基中培养1-2天，此培养基可为M119、DMEM、F12、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的一种，并可添加有0.5-1％的生长因子添加剂EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的一种(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)；或添加有内皮细胞生长因子ECGF(10-100μg/ml)；并可添加有heparin(0-100U/ml)；培养基中另可含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。1-2天后将MSC转入不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％，温度为37℃的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)或0.9％的医用生理盐水，并可添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。
在按照上述方法①或②培养完成后，收集富含细胞生长因子的条件培养基，弃去MSC细胞。
本发明所述制备抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的方法中，步骤4)所述的后处理步骤包括：
①对步骤3)中所收集的无细胞培养基进行过滤，可通过高速离心或过滤器将细胞杂质及碎片去除。
②对过滤后的无细胞培养基进行成分鉴定，并对其中所含的代表性促血管及周边组织生长因子及细胞活素如MCP-1，EGF，MMP-9，MMP-2，PDGF，SDF-1，FGF，VEGF的含量进行鉴定，鉴定方法可为蛋白组学(proteomics)，细胞活素阵列(cytokinearray)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，或Bio-PlexTM细胞因子测试。
③对过滤后的无细胞培养基进行冻干或分装冷冻保存，以便长期保存其中的生长因子及细胞活素成分的活性。
附图说明
图1：本发明所述抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂对对外周血单核细胞(PBMC)中淋巴细胞群增殖活性的抑制作用。
图2：动物实验检测抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂对GVHD模型小鼠的存活率影响。
具体实施方式
以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。
实施例1.单核细胞的制备。
将抽取出的骨髓或者由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液加入密度梯度剂Histopaque-1077(Sigma)，每15mLHistopaque中加入30mL骨髓提取液或者外周血白细胞悬液。将骨髓提取液或外周血白细胞悬液在梯度剂的存在下于400G的速度下常温离心30分钟。分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含骨髓系单核细胞的悬浮液。
实施例2.MSC细胞的获取。
针对I类MSC细胞的获取方法：将骨髓或外周血单核细胞在添加有10％人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米1×106个细胞的密度培养2天，去除悬浮细胞，将贴壁细胞继续培养21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。
针对II类MSC细胞的获取方法：将骨髓或外周血单核细胞在添加有10％人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米1×106个细胞的密度培养2天，通过CD14，或CD45特异性抗体进行磁珠分选(由德国MiltenyiBiotec公司生产)，筛选出不含CD14或CD45的单核细胞亚群，将此CD14-或CD45-单核细胞亚群在添加有10％人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米1×106个细胞的密度培养2天，去除悬浮细胞，将贴壁细胞继续培养21天。所获II型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。
针对III类MSC细胞的获取方法：将人脂肪吸取物(lipoaspirate，约50-100ml)在pH＝7.4，0.9％的医用生理盐水中洗净，用II型胶原酶(collagenasetypeII)消化(质量浓度0.075％)，消化条件为于37℃下震荡30分钟。将消化并过滤出的单核细胞在添加有10％人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米1×106个细胞的密度培养2天，将贴壁细胞继续培养21天。所获III型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。
实施例3.抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的获取。
将实施例2所获得的各型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％的环境中在0.9％的医用生理盐水中培养2天(每平方厘米2×105个细胞)，并可添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。培养完成后收集富含细胞生长因子的无细胞培养基，弃去贴壁的MSC细胞。将收集的无细胞培养基通过孔径为0.2微米的过滤器将细胞杂质及碎片去除并分装于-80℃冷库冷藏备用。视具体情况，每1x106个MSC细胞可以制备2-5ml所述抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂。
实施例4.抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂中的生长因子及细胞活素的鉴定。
实施例3所制得的抗移植排斥制剂中含有的生长因子及细胞活素成分通过细胞活素阵列(cytokinearray)鉴定(由R&DSystems购买)，此抗移植排斥制剂的有效成分包含并不局限于以下生长因子：MCP-1、EGF、IL-6、IL-8、MMP-9、SDF-1、HGF、VEGF以及PDGF。通过酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)，其中有效成分的含量为，MCP-1：5-50ng/ml；IL-8：1-5μg/ml；SDF-1：0.5-5ng/ml；IL-6：5-20ng/ml；PDGF-BB：0.1-10ng/ml；VEGF：1-20ng/ml。其他成分组成见表1。
表1.本发明所述抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂中的成分列表(包含并不局限于以下成分)
| ANG-1 | IGF-II | MCP-4 | SDF-1 |
| ANG-2 | IL-1 | M-CSF | Sfrp |
| bFGF | IL-11 | MMP-13 | TB4 |
| b-NGF | IL-12 | MMP-2 | TGFbeta |
| EGF | IL-6 | MMP-9 | TIMP-1 |
| FGF-7 | IL-7 | PA | TNFalpha |
| G-CSF | IL-8 | PDGF | TSP-1 |
| GM-CSF | LIF | PIGF | TSP-2 |
| HGF | MCP-1 | RANTES | VEGF |
| IGF-I | MCP-2 | SCF | VEGF-D |
实施例5.体外检测抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂对外周血单核细胞(PBMC)中淋巴细胞群增殖活性的抑制作用。
将血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液加入密度梯度剂Histopaque-1077(Sigma)，每15mLHistopaque中加入30mL白细胞悬液。将含有白细胞悬液及梯度剂的试管在400G的速度下常温离心30分钟。分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含外周血单核细胞群(PBMC)的悬浮液。
将分离所得的PBMC以每孔1×103个细胞的密度接种于96孔板中，置于200μl本发明所述的抗移植排斥制剂或阴性对照培养基(即只含有1％人血清白蛋白的PBS，pH＝7.4)中，同时向每孔内添加500ng植物血凝素Phytohemagglutinin(PHA，可从RocheAppliedScience等公司获得)，其中PHA为一种促有丝分裂因子(Mitogen)，可激发PBMC中大量淋巴细胞(如T细胞，B细胞)活化及增殖。将上述96孔板中的PBMC于37℃，5％二氧化碳浓度的细胞培养箱中培养48小时后，添加[3H]-thymidine(可由Sigm-Aldrich公司获得)，含量为0.5μCi/每孔([3H]-thymidine参与DNA的合成，其在DNA中的含量反映细胞的增殖量)。继续培养20小时收集细胞并在液闪仪(liquidscintillationcounter)中检测其中[3H]含量，即为增殖淋巴细胞量。结果显示，在发明所述的抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂中培养的PBMC中，其所含的T，B淋巴细胞群对PHA的非特异性抗原刺激的活化及增殖反应相对于阴性对照组减少了58.5％，仅为对照组的41.5±3.1％(P＜0.05，见图1)。
实施例6.动物实验检测抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂对GVHD模型小鼠的存活率影响。
将BALB/c小鼠进行6.0Gyγ射线一次性全身照射，制出放射性造血损伤模型。二至四小时后向此BALB/c小鼠的尾静脉进行异源造血干细胞(HematopoieticStemCell，HSC)移植，其中对照组(20只)接受注射1x107个异源造血干细胞，制剂组(20只)注射接受注射1x107个异源造血干细胞并同时接受注射100μl此抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂。观察并记录两实验组在接受异源HSC移植后的存活时间。试验结果表明，在往对照组的造血损伤小鼠体内注射入异源造血干细胞后，所有小鼠均产生严重的GVHD，表现为超过三分之一以上的体重损失以及因为严重GVHD而死亡。如图2所示，对照组的存活率在8天内下降到了50％，并且所有小鼠在14天内皆因严重GVHD死亡。反之在制剂组中的老鼠由于接受了100μl此抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的注射，其GVHD症状显著减轻，其存活率在8天内提高到了80％，并且在14天有超过50％以上的小鼠存活。可见本发明所述抑制免疫及治疗移植物抗宿主病GVHD制剂可极大抑制GVHD进而提高GVHD模型小鼠的存活率。
Claims (7)
1.一种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)的制剂的制备方法，其特征在于，该制剂的制备方法包括如下步骤：
1)从健康人血液中通过白细胞置换获取外周血单核细胞，或从骨髓中通过密度梯度离心的方法获取骨髓单核细胞，或从人脂肪吸取物中直接提取MSC；
2)筛选及培养外周血或骨髓单核细胞以获得MSC细胞；
3)在特定条件下培养MSC细胞使其分泌促组织修复和再生的生长因子和细胞活素，分离MSC细胞和培养基，获得富含促组织修复和再生的生长因子和细胞活素的无细胞培养基；
4)对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括：过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)的制剂；
其中，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞时，所用的培养基为M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的一种，并添加有0-100U/ml的heparin，培养基中另含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清，在预设条件为培养温度37℃，二氧化碳浓度为5-7％的细胞培养箱中培养；
步骤2)所述的培养单核细胞以获得MSC细胞的方法为以下所述方法①、②、③或④中的一种：
方法①：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养1-2天，去除悬浮细胞，将贴壁的细胞继续培养7-21天，获I型MSC；
方法②：将单核细胞与fibrin微球共同培养1-2天，每100-1000mgfibrin微球能吸附1×106至1×108个细胞的密度，去除悬浮细胞，将附着于fibrin微球的细胞继续培养7-21天，获I型MSC；
方法③：将单核细胞通过CD14，或CD45特异性抗体进行磁珠分选，筛选出不含CD14或CD45的单核细胞亚群，将此CD14-或CD45-单核细胞亚群以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养1-2天或用方法②培养，去除悬浮细胞，将贴壁或附着于fibrin微球的细胞继续培养7-21天，获II型MSC；
方法④：将人脂肪吸取物50-100ml在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液PBS或0.9％的医用生理盐水中洗净，用I型和II型胶原酶消化，酶的浓度范围0.05％-0.1％，消化步骤为置于37℃条件下震荡30-60分钟。将消化分散后的单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养1-2天，或用方法②培养，将贴壁或附着于fibrin微球细胞继续培养7-21天，获III型MSC；
步骤3)中所述的在特定条件下培养MSC细胞的方法为以下所述方法①或②中的一种:
方法①：将步骤2)所获得的I、II、III型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％，温度为37℃的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液或0.9％的医用生理盐水，并添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清；
方法②：将步骤2)所获得的I、II、III型MSC先置于促血管内皮细胞生长的培养基中培养1-2天，此培养基为M119、DMEM、F12、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的一种，并添加有0.5-1％的生长因子添加剂EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的一种；或添加有10-100μg/ml的内皮细胞生长因子ECGF；并添加有0-100U/ml的heparin；培养基中另含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。1-2天后将MSC转入不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％，温度为37℃的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液或0.9％的医用生理盐水，并添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的健康人血液或骨髓的来源是自体来源或异体来源，获得途径是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。
3.根据权利要求1-2任一所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的从血液中或骨髓中通过密度梯度离心获取外周血单细胞的方法为：使用梯度剂为Ficoll-Paque、Histopaque-1077或其他同类产品，温度为15～25℃，离心力为200g-500g，时间20-40分钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液。
4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，不添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。
5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，所述MSC细胞为I型MSC细胞。
6.一种由权利要求1-5任一所述的方法制备获得的制剂。
7.权利要求6所述的制剂在制备抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110041925.7A CN102641296B (zh) | 2011-02-21 | 2011-02-21 | 一种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病（gvhd）制剂及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110041925.7A CN102641296B (zh) | 2011-02-21 | 2011-02-21 | 一种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病（gvhd）制剂及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102641296A CN102641296A (zh) | 2012-08-22 |
| CN102641296B true CN102641296B (zh) | 2015-11-25 |
Family
ID=46654542
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110041925.7A Active CN102641296B (zh) | 2011-02-21 | 2011-02-21 | 一种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病（gvhd）制剂及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102641296B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106511975A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-03-22 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种干细胞制剂及其制备方法和应用 |
| CN115105530A (zh) * | 2021-03-08 | 2022-09-27 | 上海赛立维生物科技有限公司 | 免疫细胞的增殖抑制剂及其制备方法和应用 |
| CN113151164B (zh) * | 2021-05-08 | 2023-08-18 | 中山大学 | 一种msc的培养基添加剂及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101505796A (zh) * | 2006-06-20 | 2009-08-12 | 伊西康公司 | 使用干细胞产物进行软组织修复和再生 |
| CN101940590A (zh) * | 2010-08-27 | 2011-01-12 | 上海士腾生物技术有限公司 | 促进创伤愈合的制剂及其制备方法 |
-
2011
- 2011-02-21 CN CN201110041925.7A patent/CN102641296B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101505796A (zh) * | 2006-06-20 | 2009-08-12 | 伊西康公司 | 使用干细胞产物进行软组织修复和再生 |
| CN101940590A (zh) * | 2010-08-27 | 2011-01-12 | 上海士腾生物技术有限公司 | 促进创伤愈合的制剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Novel Cell-Free Strategy for Therapeutic Angiogenesis: In Vitro Generated onditioned Medium Can Replace Progenitor Cell Transplantation;stefano Di Santo，et al.;《PLoS ONE》;20090531;第4卷(第5期);1-9 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102641296A (zh) | 2012-08-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220088084A1 (en) | Uses of mesenchymal stem cells | |
| CN104136034B (zh) | 间充质基质细胞及其相关用途 | |
| US8440177B2 (en) | Method of treating graft versus host disease using adipose derived mesenchymal stem cells | |
| US9931445B2 (en) | System and methods for preparation of adipose-derived stem cells | |
| US11447748B2 (en) | Encapsulated adipose-derived stem cells, methods for preparation and theraputic use | |
| US8828375B2 (en) | Expansion of haemopoietic precursors | |
| CN102539736B (zh) | 一种cd106阳性细胞、其鉴定、制备方法及应用 | |
| US20110044958A1 (en) | Activated mesenchymal stem cells for the prevention and repair of inflammatory states | |
| Li et al. | Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on hematopoietic recovery and acute graft-versus-host disease in murine allogeneic umbilical cord blood transplantation model | |
| WO2015004609A2 (en) | Adherent cells from placenta and use thereof in treatment of injured tendons | |
| CN106038598A (zh) | 人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备方法 | |
| CN101940590A (zh) | 促进创伤愈合的制剂及其制备方法 | |
| CN102643784A (zh) | 一种造血干/祖细胞的体外扩增体系 | |
| CN102641296B (zh) | 一种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病（gvhd）制剂及其制备方法 | |
| US9650604B2 (en) | Equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells | |
| CN106659560B (zh) | 生殖腺来源的侧群干细胞 | |
| CN102641293B (zh) | 用于治疗缺血性脑血管疾病的制剂及其制备方法 | |
| Chen et al. | Co-transplantation of hematopoietic stem cells and cxcr4 gene-transduced mesenchymal stem cells promotes hematopoiesis | |
| CN102641292B (zh) | 促血管及周边组织修复或再生的制剂及其制备方法 | |
| CN102119936B (zh) | 制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液 | |
| CN101940594B (zh) | 用于治疗缺血性心血管疾病的制剂及其制备方法 | |
| CN102641295B (zh) | 促进创伤愈合的制剂及其制备方法 | |
| CN102641294B (zh) | 一种制剂在制备治疗缺血性心血管疾病的药物中的应用 | |
| CN102641297B (zh) | 治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂及其制备方法 | |
| KR102376432B1 (ko) | 말초 혈액으로부터 중간엽 줄기 세포 집단을 생성하는 방법 및 그의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20181204 Address after: 314100 C7 building 201, Chuang Road, Dayun Town, Jiashan, Jiaxing, Zhejiang, 201 Patentee after: Jiaxing Lai Pu Sheng Medical Technology Co., Ltd. Address before: 201712 419 Daying Road, Qingpu District, Shanghai Patentee before: Yang Zijiang |