CN113151164B - 一种msc的培养基添加剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物技术的领域,尤其涉及一种MSC的培养基添加剂及其应用。本申请第一方面提供一种MSC的培养基添加剂,包括全反式维甲酸和γ‑干扰素。本申请第二方面公开所述培养基添加剂在提高MSC的免疫调控功能中的应用。本申请第三方面公开所述培养基添加剂在提高所述MSC的RIG‑I的表达中的应用。本申请第四方面提供了一种MSC,包括:将从体内取出组织或器官分离处理得到的MSC进行原代培养;待所述MSC贴壁后,在所述MSC的培养基中添加所述培养基添加剂继续培养,制得MSC;其中,所述的培养基添加剂包括全反式维甲酸和γ干扰素。本申请能有效解决现有技术在扩增MSC过程中存在的其免疫调控功能下降的技术问题。
Description
技术领域
本申请属于生物技术的领域,尤其涉及一种MSC的培养基添加剂及其应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)因具有多向分化潜能,免疫调控以及促进组织修复再生等功能,为现代医学提供了一种崭新的生物疗法。目前,与MSC相关的临床试验已经超过900项,占半数以上都是依据MSC的免疫调控的特性来治疗移植物抗宿主疾病(Graft-versus-host disease,GVHD)、膝骨关节炎、克罗恩病等自身免疫性疾病。
为了治疗临床试验中患者的疾病,往往需要使用大量的MSC。那就需要大规模体外培养扩增MSC。目前MSC的体外培养体系主要由培养基和培养条件组成。培养基为基础培养基加入5~10%胎牛血清(FBS)或人AB血清(HABS)。培养条件为根据MSC具有黏附的特性将MSC置于具有黏附性的培养皿中,并在37℃,5%氧气的低氧环境下进行培养。待光镜下看细胞聚合度达80%左右的密度可进行传代。大规模体外培养扩增功能强的MSC是目前临床试验中亟待解决的问题。
然而,在现有的体外培养条件下,MSC会随着体外培养时间的延长而功能下降,尤其是免疫调控的功能。体外扩增的MSC功能低下,成为了目前很多与MSC相关的临床试验结果和预期相距甚远的原因之一。
发明内容
有鉴于此,本申请提供了一种MSC及其制备方法和应用,能有效解决现有技术在扩增MSC过程中存在的其免疫调控功能下降的技术问题。
本申请第一方面提供了一种MSC的培养基添加剂,包括全反式维甲酸和γ-干扰素。
其中,本申请发现全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)和γ-干扰素(γinterferon,IFN-γ)具有能够稳定并且提高MSC免疫调节的治疗功能,为能制备具有更好免疫调控功能的间充质干细胞的一种新产品。
作为优选,所述全反式维甲酸和所述γ-干扰素的质量比为(0.3~30):1。
本申请第二方面公开了所述培养基添加剂在提高MSC的免疫调控功能中的应用。
作为优选,所述提高MSC的免疫调控功能具体为提高所述MSC的CXCL9免疫调控分子、CCL2免疫调控分子、Nos2免疫调控分子和PD-L1免疫调控分子的表达。
本申请第三方面公开了所述培养基添加剂在提高所述MSC的RIG-I的表达中的应用。
具体的,本申请所述培养基添加剂通过作用所述MSC的RIG-I以提高所述MSC免疫调控治疗功能。
本申请第四方面提供了一种MSC,经以下步骤培养得到;
将从体内取出组织或器官分离处理得到的MSC进行原代培养;
待所述MSC贴壁后,在所述MSC的培养基中添加所述培养基添加剂继续培养,制得MSC;
其中,所述的培养基添加剂包括全反式维甲酸和γ干扰素。
作为优选,所述全反式维甲酸和所述γ-干扰素的质量比为(0.3~30):1。
其中,所述全反式维甲酸在原代培养基中的浓度范围为10nM~1μM;所述γ-干扰素在原代培养基中的浓度为0.01ng/μl。
其中,采用本申请的提供的培养基添加剂培养得到的MSC的细胞量与现有方法培养得到的MSC的细胞量相当。
本申请第五方面公开了所述的MSC在抑制T细胞增殖中的应用。
具体的,本申请提供的具有更高免疫调控功能的MSC可体外抑制T细胞的活化/增值。
本申请第六方面公开了所述MSC在制备植物抗宿主疾病(Graft-versus-hostdisease,GVHD)的治疗药物中的应用。
具体的,本申请提供的具有更高免疫调控功能的MSC可治疗小鼠骨髓移植后GVHD的发病情况,更好地促进其体重恢复、改善皮肤损伤以及提高生存率。
本申请第七方面公开了所述MSC在制备急性炎症肝损伤疾病的治疗药物中的应用。
其中,所述急性炎症肝损伤疾病为刀豆素(ConA)诱导发生。
具体的,本申请提供的具有更高免疫调控功能的MSC可治疗小鼠炎症刺激的急性肝损伤,更好地改善肝脏坏死情况。
本申请第八方面提供了一种MSC的培养基,包括所述培养基添加剂。
具体的,本申请提供的MSC的培养基包括所述培养基添加剂以及MSC培养必需的物质,例如现有常规的MSC培养需要基础培养基、完全培养基等。
本申请第九方面提供了一种MSC的培养方法,包括以下步骤:
将从体内取出组织或器官分离处理得到的MSC进行原代培养;
待所述MSC贴壁后,在所述MSC的培养基中添加所述培养基添加剂继续培养,制得MSC;
其中,所述的培养基添加剂包括全反式维甲酸和γ干扰素。
作为优选,所述全反式维甲酸和所述γ-干扰素的质量比为(0.3~30):1。
其中,所述全反式维甲酸在原代培养基中的浓度范围为10nM~1μM;所述γ-干扰素在原代培养基中的浓度为0.01ng/μl。
其中,采用本申请的提供的培养基添加剂培养得到的MSC的细胞量与现有方法培养得到的MSC的细胞量相当。
具体的,所述MSC的培养方法包括:
取从体内取出组织或器官分离处理得到的2×105/孔MSC进行原代培养,待细胞聚合度达到70%-80%时,在所述MSC的培养基中添加所述培养基添加剂后继续培养,得到MSC。
作为优选,所述添加所述培养基添加剂后继续培养的时间为3~6h。
更为优选,所述添加所述培养基添加剂后继续培养的时间为6h。
现有的体外培养条件下,MSC会随着体外培养时间的延长其免疫治疗功能下降,无法满足临床试验的要求的技术缺陷。
本申请发现全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)和γ-干扰素(γinterferon,IFN-γ)协同作用起到稳定并且提高MSC的免疫调节治疗功能,从本申请实验数据可知,ATRA和IFN-γ协同促进MSC免疫调控功能,表现为显著提高CXCL9、CCL2、Nos2、PD-L1等免疫调控分子的表达,ATRA和IFN-γ是通过作用MSC的RIG-I靶点从而提高MSC免疫调控治疗功能;ATRA和IFN-γ协同培养获得的MSC可抑制T细胞的增殖,还能具有GVHD和炎症刺激肝损伤的治疗作用。可见,通过本申请提供的培养基添加剂培养MSC的方法中,在不影响MSC的数量下能有效提高MSC的质量(提高其免疫调节治疗功能)。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例中ATRA和IFNγ不同作用时间下CXCL9、CCL2、Nos2、PD-L1的mRNA相对表达量检测结果;
图2为本申请实施例中ATRA和IFNγ不同浓度作用下CXCL9、CCL2、Nos2、PD-L1的mRNA相对表达量检测结果;
图3为本申请实施例中小鼠MSC与CD4+T细胞共培养后的T细胞数量统计结果;
图4为本申请实施例中经ATRA和IFNγ作用的MSC治疗小鼠GVHD后的小鼠皮损结果;
图5为本申请实施例中经ATRA和IFNγ作用的MSC治疗小鼠GVHD后的小鼠生存情况;
图6为本申请实施例中经ATRA和IFNγ作用的MSC治疗小鼠GVHD后的小鼠体重变化结果;
图7为本申请实施例中经ATRA和IFNγ作用的MSC治疗小鼠ConA诱导的炎症肝损伤的血清ALT测量结果;
图8为本申请实施例中经ATRA和IFNγ作用的MSC治疗小鼠ConA诱导的炎症肝损伤的肝脏H&E染色结果;
图9为本申请实施例中经ATRA和IFNγ作用的MSC治疗小鼠ConA诱导的炎症肝损伤的肝脏坏死区域统计结果;
图10为本申请实施例中ATRA和IFNγ协同作用下诱导RIG-I的qpcr和westernblot结果;
图11为本申请实施例中ATRA和IFNγ分别作用于RIG-IWT和RIG-I KO的小鼠MSC的CXCL9、CCL2、Nos2、PD-L1的mRNA相对表达量检测结果;
图12为本申请实施例中RIG-I WT和RIG-I KO的小鼠MSC与CD4+T细胞共培养后的T细胞数量统计结果。
具体实施方式
本申请提供了一种MSC及其制备方法和应用,用于解决现有技术在扩增MSC过程中存在的免疫调控功能下降的技术缺陷。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
其中,以下实施例所用试剂或原料均为市售或自制;本申请中的nM为nmol/L、μM为μmol/L。
实施例1
本申请实施例提供了不同时间点的免疫调控因子表达水平的检测试验,具体步骤如下:
本实施例采用从骨髓中分离C57小鼠骨髓原代MSC的方法,按照2×105个/孔的细胞量接种于12孔板中进行体外培养,待细胞聚合度达到70%-80%左右时,便可进行下一步实验。本例设计了7个组,分别为在培养液中加入等体积的PBS、ATRA、IFNγ、ATRA+IFNγ,分别培养3小时和6小时,其中ATRA终浓度为100nM,IFNγ终浓度为0.01ng/μl。然后,采用Trizol及氯仿抽提细胞总RNA并利用实时荧光定量PCR检测免疫调控因子CXCL9,Nos2,PD-L1,CCL2等基因的表达水平。
其中,本实施例的荧光定量PCR步骤包括:
1、分别针对免疫调控因子CXCL9,CCL2,Nos2,PD-L1,设计并合成了特异性检测引物,引物序列如表1所示。
表1免疫调控分子特异性检测引物
引物名称 | 序列(5’→3’) | SeqIDNo. |
CXCL9 F | CCGAGGCACGATCCACTACA | 1 |
CXCL9 R | CGAGTCCGGATCTAGGCAGGT | 2 |
CCL2 F | TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA | 3 |
CCL2 R | GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT | 4 |
Nos2 F | TCCTACACCACACCAAAC | 5 |
Nos2 R | CTCCAATCTCTGCCTATCC | 6 |
PD-L1 F | TGGCATTTGCTGAACGCATTT | 7 |
PD-L1 R | TGCAGCCAGGTCTAATTGTTTT | 8 |
表1中,“F”表示上游引物,“R”表示下游引物,“CXCL9 F”和“CXCL9 R”分别表示CXCL9基因的上游引物和下游引物,其余类似。
2、抽提细胞RNA:用500μL的Trizol充分裂解细胞后,加入100μL氯仿剧烈震荡,充分分层后,于冷离心机中最大转速离心15分钟,取上清,向上清中并加入等量的异丙醇,颠倒混匀,室温静置10分钟,然后最大转速离心10分钟,弃上清,用DEPC水稀释的70%乙醇洗涤,充分晾干,用DEPC水溶解RNA。
3、逆转录:用TAKARA(RR036A)逆转录试剂盒进行反转录,反转录250ng RNA,并用双蒸水稀释至100μL进行后续定量PCR。
4、荧光定量PCR:采用翊圣2×SYBR及BioRad CFX96 Touch荧光定量PCR仪进行定量PCR实验。PCR反应体系:4.8μL逆转录模板、0.2μL上下游引物混合物、5μL 2×SYBRmix;其中,上下游引物混合物中上游引物和下游引物的浓度均为10nmol/L。
5、PCR反应程序:95℃预变性1min,然后进入40个循环:95℃5s、60℃30s,并于60℃收集荧光,循环结束后,95℃15s、60℃15s、95℃15s。3.流式检测干细胞因子重组蛋白(缩写SCF蛋白)水平的变化。
本实施例用ATRA、IFNγ、ATRA+IFNγ,分别处理MSC 3小时和6小时,其中ATRA终浓度为100nM,IFNγ终浓度为0.01ng/μl。然后通过定量PCR的方法检测免疫调控因子CXCL9、CCL2、Nos2、PD-L1的mRNA表达水平的变化。
实验结果如图1所示。各图由左至右为CXCL9、CCL2、Nos2和PD-L1的mRNA相对表达量分析结果;各图由左至右的7个柱依序表示PBS处理的对照实验(即“Ctrl”)、ATRA处理3h实验组(即“ATRA 3h”)、IFNγ处理3h实验组(即“IFNγ3h”)、ATRA+IFNγ处理3h实验组(即“ATRA+IFNγ3h”)、ATRA处理6h实验组(即“ATRA 6h”)、IFNγ处理6h实验组(即“IFNγ6h”)、ATRA+IFNγ处理6h实验组(即“ATRA+IFNγ6h”)。
图1结果显示,ATRA+IFNγ处理6小时后,可以显著的诱导CXCL9、CCL2、Nos2和PD-L1的表达,而ATRA+IFNγ处理3小时的诱导效果较弱,说明ATRA和IFNγ协同诱导这些免疫调控因子的表达需要刺激较长的时间,才能获得较好的诱导效果。
实施例2
本申请实施例提供了不同质量比的免疫调控因子表达水平的检测试验,具体步骤如下:
本实施例采用从骨髓中分离C57小鼠骨髓原代的MSC的方法,按照2×105个/孔的细胞量接种于12孔板中进行体外培养,待细胞聚合度达到70%-80%左右时,便可进行下一步实验。本例设计了7个组,分别为在培养液中加入PBS、10nMATRA、100nMATRA、1μMATRA、0.01ng/μl IFNγ、10nMATRA+0.01ng/μl IFNγ、100nMATRA+0.01ng/μl IFNγ、1μMATRA+0.01ng/μl IFNγ培养6小时。对于ATRA和IFNγ协同作用的组别中,ATRA和IFNγ的质量比例为(0.3:1,3:1,30:1)。然后,采用Trizol及氯仿抽提细胞总RNA并利用实时荧光定量PCR检测免疫调控因子CXCL9,Nos2,PD-L1,CCL2等基因的表达水平。
本实施例采用的培养基为含有20%胎牛血清的低糖的DMEM培养基,培养条件为37℃恒温,低氧5%O2培养箱培养。本例的RNA提取采用TAKARA公司的RNA提取试剂盒,具体的提取方法参考试剂盒使用说明书,在此不累述。实时荧光定量PCR检测也采用TAKARA公司的造血干细胞支持因子检测试剂盒,具体反应体系、反应条件参考试剂盒使用说明书,在此不累述。
其中,本实施例的荧光定量PCR步骤包括:
1、分别针对免疫调控因子CXCL9,CCL2,Nos2,PD-L1,设计并合成了特异性检测引物,引物序列如表1所示。
表1免疫调控分子特异性检测引物
引物名称 | 序列(5’→3’) | SeqIDNo. |
CXCL9 F | CCGAGGCACGATCCACTACA | 1 |
CXCL9 R | CGAGTCCGGATCTAGGCAGGT | 2 |
CCL2 F | TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA | 3 |
CCL2 R | GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT | 4 |
Nos2 F | TCCTACACCACACCAAAC | 5 |
Nos2 R | CTCCAATCTCTGCCTATCC | 6 |
PD-L1 F | TGGCATTTGCTGAACGCATTT | 7 |
PD-L1 R | TGCAGCCAGGTCTAATTGTTTT | 8 |
表1中,“F”表示上游引物,“R”表示下游引物,“CXCL9 F”和“CXCL9 R”分别表示CXCL9基因的上游引物和下游引物,其余类似。
2、抽提细胞RNA:用500μL的Trizol充分裂解细胞后,加入100μL氯仿剧烈震荡,充分分层后,于冷离心机中最大转速离心15分钟,取上清,向上清中并加入等量的异丙醇,颠倒混匀,室温静置10分钟,然后最大转速离心10分钟,弃上清,用DEPC水稀释的70%乙醇洗涤,充分晾干,用DEPC水溶解RNA。
3、逆转录:用TAKARA(RR036A)逆转录试剂盒进行反转录,反转录250ng RNA,并用双蒸水稀释至100μL进行后续定量PCR。
4、荧光定量PCR:采用翊圣2×SYBR及BioRad CFX96 Touch荧光定量PCR仪进行定量PCR实验。PCR反应体系:4.8μL逆转录模板、0.2μL上下游引物混合物、5μL 2×SYBRmix;其中,上下游引物混合物中上游引物和下游引物的浓度均为10nmol/L。
5、PCR反应程序:95℃预变性1min,然后进入40个循环:95℃5s、60℃30s,并于60℃收集荧光,循环结束后,95℃15s、60℃15s、95℃15s。
流式检测干细胞因子重组蛋白(缩写SCF蛋白)水平的变化。
本实施例分别用10nMATRA、100nMATRA、1μMATRA、0.01ng/μl IFNγ、质量比为0.3:1的ATRA与IFNγ、质量比为3:1的ATRA与IFNγ、以及质量比为30:1的ATRA与IFNγ处理MSC6小时;其中,质量比为0.3:1的ATRA与IFNγ采用10nMATRA和0.01ng/μl IFNγ配制;质量比为3:1的ATRA与IFNγ采用100nM ATRA和0.01ng/μl IFNγ配制;质量比为30:1的ATRA与IFNγ采用1μMATRA和0.01ng/μl IFNγ配制。然后通过定量PCR的方法检测免疫调控因子CXCL9、CCL2、Nos2、PD-L1的mRNA表达水平的变化。
实验结果如图2所示。各图由左至右为CXCL9、CCL2、Nos2、PD-L1的mRNA相对表达量分析结果;各图由左至右的7个柱依序表示PBS处理的对照实验(即“Ctrl”)、10nMATRA处理实验组(即“ATRA 10nM”)、100nMATRA处理实验组(即“ATRA 100nM”)、1μM ATRA处理实验组(即“ATRA 1μM”)、0.01ng/μl IFNγ处理实验组(即“IFNγ”)、质量比为0.3:1的ATRA与IFNγ处理实验组(即“IFNγ+ATRA 10μM”)、质量比为3:1的ATRA与IFNγ处理实验组(即“IFNγ+ATRA 100nM”)、质量比为30:1的ATRA与IFNγ处理实验组(即“IFNγ+ATRA 1μM”)。
结果显示,10nM、100nM、1μM浓度的ATRA协同IFNγ均有增强诱导CXCL9、CCL2、Nos2、PD-L1这些免疫调控分子表达作用,并且在质量比为3:1的ATRA与IFNγ处理6小时后诱导效果更为显著稳定。Nos2和PD-L1在高浓度的ATRA(1μM)协同IFNγ的作用下诱导水平降低,说明ATRA和IFNγ的质量比为3:1时,效果最好。
实施例3
本申请实施例提供了MSC与T细胞的共培养的试验,具体步骤如下:
体外培养的原代MSC,培养到细胞聚合度达到90%左右时,用胰酶把MSC消化下来,按照8×105个/孔的细胞量接种于24孔板中,继续培养待细胞重新贴壁,将利用isolationcocktail kit分离的小鼠CD4+T细胞按照1:50的比例(MSC:T细胞)接种于含有MSC的24孔板中,同时加入neomycin刺激T细胞增殖,共培养3天。第四天用流式细胞仪计算T细胞的数量。本实施例对比了MSC与T细胞比例为1:20和1:50时,分别用ATRA,IFNγ,ATRA+IFNγ处理的MSC与没有经过任何处理的MSC与T细胞共培养的效果。
本实施例用ATRA、IFNγ、ATRA+IFNγ预处理MSC 12小时,其中ATRA终浓度为100nM,IFNγ终浓度为0.01ng/μl,ATRA与IFNγ的质量比为3:1。取野生型小鼠的CD4+的T细胞与预处理过的野生型小鼠MSC共培养3天,然后检测T细胞的增殖数量。
结果如图3所示。左边为MSC与T细胞比例为1:50的共培养结果,右边为MSC与T细胞比例为1:50的共培养结果。从左到右5个柱子分别为仅有T细胞的对照组(即“T”),T细胞与未经预处理的MSC的共培养的结果(即“T+MSC”),T细胞与经过ATRA预处理的MSC的共培养结果(即“T+ATRA-MSC”),T细胞与经过IFNγ预处理的MSC的共培养结果(即“T+IFNγ-MSC”),T细胞与经过ATRA和IFNγ预处理的MSC的共培养结果(即“T+ATRA+IFNγ-MSC”)。
图3结果显示,MSC具有抑制T细胞增殖的作用,并且经过ATRA和IFNγ预处理的野生型小鼠的MSC对T细胞的抑制作用更为显著。并且当MSC与T细胞比例为1:20,抑制作用更为明显。
实施例4
本申请实施例提供了MSC治疗小鼠GVHD试验,具体步骤如下:
取野生型Balb/c小鼠的全骨髓细胞以及脾脏细胞,经过裂解红细胞并计数后,将5×106全骨髓细胞以及5×106脾脏细胞混匀后通过尾静脉注射至致死剂量辐照的野生型C57BL/6受体小鼠中,完成异源造血干细胞移植。每3天检测一次小鼠体重以及观察小鼠存活情况。待小鼠造血重构两周之后,收集分别经过ATRA,IFNγ,ATRA+IFNγ处理12小时的体外培养的MSC,以5×105的数量通过尾静脉注射至小鼠体内进行治疗,每隔3天治疗一次,一共治疗4次。
本实施例用ATRA、IFNγ、ATRA+IFNγ预处理MSC 12小时,其中ATRA终浓度为100nM,IFNγ终浓度为0.01ng/μl,ATRA与IFNγ的质量比为3:1。用于治疗异源造血干细胞移植后重构两周的小鼠,观察其GVHD的发病情况。实验结果如图4-6所示。
图4为小鼠皮肤损伤脱落的情况。从左到右分别为未进行异源造血干细胞移植的小鼠皮损情况(即“Ctrl”)、进行了异源造血干细胞移植未经MSC治疗的小鼠皮损情况(即“GVHD”)、进行了异源造血干细胞移植且经用ATRA预处理的MSC治疗的小鼠皮损情况(即“GVHD+ATRA-MSC”)、进行了异源造血干细胞移植且经用IFNγ预处理的MSC治疗的小鼠皮损情况(即“GVHD+IFNγ-MSC”)、进行了异源造血干细胞移植且经用ATRA和IFNγ预处理的MSC治疗的小鼠皮损情况(即“GVHD+ATRA+IFNγ-MSC”)。结果显示,未经MSC治疗的小鼠的GVHD发病严重,有大面积的皮损,而经过MSC治疗的小鼠的GVHD发病有所减缓,皮损面积减少,并且经过ATRA+IFNγ预处理的MSC治疗的小鼠的GVHD发病最轻,几乎无皮损。
图5为小鼠观察48天的生存情况。分组与图4所示一致。结果显示,未经MSC治疗的小鼠的GVHD的生存率最差,只有50%,经过MSC治疗后小鼠的生存率有所改善,并且经过用ATRA+IFNγ预处理的MSC治疗的小鼠的生存率最好,在48天内无一死亡。
图6为各组小鼠观察36天内的体重变化情况。分组与图4所示一致。结果显示,未经MSC治疗的小鼠的GVHD导致的体重下降最为严重,其他用MSC治疗的组别的体重下降情况也与未经MSC治疗的组别体重下降的严重情况相仿,只有经过用ATRA和IFNγ预处理的MSC治疗的小鼠的GVHD导致的体重下降最少,小鼠后期体重恢复的情况也更好。
图4-6结果说明,ATRA和IFNγ预处理过的MSC,可以增强MSC的免疫调控因子的表达,体外移植T细胞的增殖,同时也可以治疗小鼠骨髓移植后GVHD的发病情况,更好地促进其体重恢复、改善皮肤损伤以及提高生存率。
实施例5
本申请实施例提供了MSC治疗小鼠刀豆素(ConA)诱导的急性炎症肝损伤的试验,具体步骤如下:
野生型C57小鼠通过尾静脉以15mg/kg的量注射ConA生理盐水溶液。30分钟后通过尾静脉以5×105的数量注射经过ATRA,IFNγ,ATRA+IFNγ处理12小时的体外培养的MSC。7.5小时后处死小鼠取血清和肝脏,做血清ALT分析和肝脏H&E切片染色。
本实施例用ATRA、IFNγ、ATRA+IFNγ预处理MSC 12小时,其中ATRA终浓度为100nM,IFNγ终浓度为0.01ng/μl,ATRA与IFNγ的质量比为3:1。用于治疗刀豆素(ConA)诱导的急性炎症肝损伤的小鼠,观察其肝脏损伤的情况。实验结果如图7-9所示。
图7为小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)的测量结果。从左到右分别为未进行ConA诱导急性肝损伤的小鼠ALT情况(即“Untreated”)、进行了ConA诱导急性肝损伤未经MSC治疗的小鼠ALT情况(即“ConA”)、进行了ConA诱导急性肝损伤且经用ATRA预处理的MSC治疗的小鼠ALT情况(即“ConA+ATRA-MSC”)、进行了ConA诱导急性肝损伤且经用IFNγ预处理的MSC治疗的小鼠ALT情况(即“ConA+IFNγ-MSC”)、进行了ConA诱导急性肝损伤且经用ATRA和IFNγ预处理的MSC治疗的小鼠ALT情况(即“ConA+ATRA+IFNγ-MSC”)。结果显示,未经MSC治疗的小鼠的肝损伤最为严重,血清ALT含量最高。而经过MSC治疗的小鼠的肝损伤严重程度有所减缓,血清ALT含量降低,并且经过ATRA+IFNγ预处理的MSC治疗的小鼠的肝损伤程度最轻,血清ALT含量最低。
图8为各组小鼠肝脏H&E染色结果,图中标记为N为肝损伤坏死区域。分组与图7所示一致。结果显示,未经MSC治疗的小鼠的肝损伤最为严重,坏死区域最多。而经过MSC治疗的小鼠的肝损伤严重程度有所减缓,坏死区域无明显减少,并且经过ATRA+IFNγ预处理的MSC治疗的小鼠的肝损伤程度最轻,坏死区域N的数量和面积都最小。
图9为各组小鼠肝脏坏死区域面积统计结果。分组与图7所示一致。结果显示,未经MSC治疗的小鼠的肝脏坏死情况最为严重,坏死面积最多,其他用MSC治疗的组别的肝脏坏死面积也与未经MSC治疗的组别肝脏损伤严重情况相仿,只有经过用ATRA和IFNγ预处理的MSC治疗的小鼠肝脏坏死面积最小。
实施例6
本申请实施例提供了ATRA和IFNγ协同刺激MSC诱导RIG-I的表达试验,具体步骤如下:
本例用100nMATRA、0.01ng/μl IFNγ、100nMATRA+0.01ng/μl IFNγ处理野生型小鼠MSC 1、2、6小时,其中ATRA与IFNγ的质量比为3:1,然后通过现有常规的定量PCR的方法检测RIG-I的mRNA表达水平的变化。
实验结果如图10所示。左图为QPCR结果,右图为western blot结果。左图由左至右为刺激1小时、2小时、6小时的RIG-I mRNA相对表达量分析结果。QPCR图中1小时结果由左至右的4个柱依序表示PBS处理的对照实验(即“Ctrl”)、100nMATRA处理实验组(即“ATRA”)、0.01ng/μl IFNγ处理实验组(即“IFNγ”)、0.01ng/μl IFNγ+100nMATRA处理实验组(即“IFNγ+ATRA”),QPCR图的2小时结果和6小时结果与1小时的4个柱一致。western blot结果图由左至右为刺激2小时、4小时、12小时的RIG-I蛋白表达量分析结果。western blot结果图由左至右的4个分组依序表示PBS处理的对照实验(即“Mock”)、100nMATRA处理实验组(即“ATRA”)、0.01ng/μl IFNγ处理实验组(即“IFNγ”)、0.01ng/μl IFNγ+100nMATRA处理实验组(即“IFNγ+ATRA”)。“S.E.”表示短时间曝光,“L.E.”长时间曝光。
结果显示,ATRA协同IFNγ能在短时间迅速诱导RIG-I的mRNA和蛋白水平的表达。RIG-I为公认的MSC免疫治疗功能的筛查标记物,可见,ATRA和IFN-γ是通过作用MSC的RIG-I靶点从而提高MSC免疫调控治疗功能。
实施例7
本申请实施例提供了ATRA和IFNγ协同刺激RIG-I WT和RIG-I KO MSC诱导免疫调控因子的表达试验,具体步骤如下:
本实施例分别用100nMATRA、0.01ng/μl IFNγ、100nMATRA+0.01ng/μlIFNγ处理RIG-I WT(野生型RIG-I)和RIG-I KO(敲除RIG-I)MSC 6小时,ATRA与IFNγ的质量比为3:1。然后通过定量PCR的方法检测免疫调控因子CXCL9、CCL2、Nos2、PD-L1的mRNA表达水平的变化。
实验结果如图11所示。各图由左至右为CXCL9、CCL2、Nos2、PD-L1的mRNA相对表达量分析结果;每个蛋白的mRNA相对表达量结果图由左至右的4个柱依序表示PBS处理的对照实验(即“Ctrl”)、100nMATRA处理实验组(即“ATRA”)、0.01ng/μl IFNγ处理实验组(即“IFNγ”)、0.01ng/μl IFNγ+100Nm ATRA处理实验组(即“IFNγ+ATRA”)。白色柱子表示“RIG-IWT MSC”,灰色柱子表示“RIG-I KO MSC”。
图11结果显示,对于RIG-I WT的MSC,ATRA和IFNγ可以协同显著诱导免疫调控分子的表达。但是当RIG-I敲除之后,ATRA和IFNγ协同增加MSC免疫调控分子的作用消失。说明ATRA和IFNγ的协同作用的靶点是RIG-I,ATRA和IFNγ通过在短时间内诱导RIG-I的表达(图10),依赖于RIG-I来实现免疫调控分子的显著诱导。
实施例8
本申请实施例提供了RIG-I敲除后的MSC与T细胞共培养试验,具体步骤如下:
本实施例用ATRA、IFNγ、ATRA+IFNγ预处理MSC 12小时,其中ATRA终浓度为100nM,IFNγ终浓度为0.01ng/μl,ATRA与IFNγ的质量比为3:1。取野生型小鼠的CD4+的T细胞与预处理过的RIG-I WT和RIG-I KO MSC共培养3天,然后检测T细胞的增殖数量。
结果如图12所示。左边白色柱子为RIG-I WT MSC与T细胞的共培养结果,右边灰色柱子为RIG-I KO MSC与T细胞的共培养结果。从左边白色柱子左到右5个柱子分别为仅有T细胞的对照组(即“T cell only”),T细胞与未经预处理的RIG-I WT MSC的共培养的结果(即“T cell+MSC”),T细胞与经过ATRA预处理的RIG-I WT MSC的共培养结果(即“T cell+ATRA-MSC”),T细胞与经过IFNγ预处理的RIG-I WT MSC的共培养结果(即“T cell+IFNγ-MSC”),T细胞与经过ATRA和IFNγ预处理的RIG-I WT MSC的共培养结果(即“Tcell+ATRA-IFNγ-MSC”);从左边灰色柱子左到右5个柱子分别为仅有T细胞的对照组(即“T cellonly”),T细胞与未经预处理的RIG-I KO MSC的共培养的结果(即“T cell+MSC”),T细胞与经过ATRA预处理的RIG-I KO MSC的共培养结果(即“T cell+ATRA-MSC”),T细胞与经过IFNγ预处理的RIG-I KO MSC的共培养结果(即“T cell+IFNγ-MSC”),T细胞与经过ATRA和IFNγ预处理的RIG-I KO MSC的共培养结果(即“T cell+ATRA-IFNγ-MSC”)。
结果显示,MSC具有抑制T细胞增殖的作用,并且经过ATRA和IFNγ预处理的野生型小鼠的MSC(RIG-I WT MSC)对T细胞的抑制作用更为显著。但是敲除RIG-I之后ATRA和IFNγ预处理并不能增强MSC(RIG-I KO MSC)对T细胞的抑制作用。进一步说明ATRA和IFNγ协同提高MSC的免疫调控功能是依赖于RIG-I的。
以上结果说明,在MSC的培养体系中加入ATRA和IFNγ,可以增强MSC的免疫调控因子的表达,体外抑制T细胞的增殖,同时可以治疗小鼠骨髓移植后GVHD的发病情况,更好地促进其体重恢复、改善皮肤损伤以及提高生存率。也可以治疗小鼠炎症刺激的急性肝损伤,更好地改善肝脏坏死情况。并且,可说明了ATRA和IFNγ的协同作用靶点为RIG-I,RIG-I是提高MSC免疫调控治疗功能的分子机制靶点;当ATRA和IFNγ的质量比例范围在(0.3~30:1)时,均有协同增强MSC功能的作用,并且ATRA与IFNγ的质量比为3:1时,增强MSC的功能最为显著,表现为免疫调控分子诱导倍数更高。
以上所述仅是本申请的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
Claims (3)
1.一种MSC的培养基添加剂在制备提高MSC的免疫调控功能药物中的应用,其特征在于,所述培养基添加剂包括全反式维甲酸和γ-干扰素;
所述全反式维甲酸和所述γ-干扰素的质量比为(0.3~30):1;
所述提高MSC的免疫调控功能具体为提高所述MSC的CXCL9免疫调控分子、CCL2免疫调控分子、Nos2免疫调控分子和PD-L1免疫调控分子的表达。
2.一种MSC在制备抑制T细胞增殖药物中的应用,其特征在于,所述MSC经以下步骤培养得到;
将从体内取出组织或器官分离处理得到的MSC进行原代培养;
待所述MSC贴壁后,在所述MSC的培养基中添加培养基添加剂继续培养,制得MSC;
其中,所述培养基添加剂包括全反式维甲酸和γ干扰素。
3.一种MSC在制备植物抗宿主疾病或/和急性炎症肝损伤疾病的治疗药物中的应用,其特征在于,所述MSC经以下步骤培养得到;
将从体内取出组织或器官分离处理得到的MSC进行原代培养;
待所述MSC贴壁后,在所述MSC的培养基中添加培养基添加剂继续培养,制得MSC;
其中,所述培养基添加剂包括全反式维甲酸和γ干扰素。
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