CN102641295B

CN102641295B - 促进创伤愈合的制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN102641295B
Application number: CN201110041922.3A
Authority: CN
Inventors: 顾丽娅; 杨子江; 顾茂健
Original assignee: 杨子江
Current assignee: Beikang Medical Technology Co., Ltd; Shengtaiyingnuo (Jiaxing) Medical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2011-02-21
Filing date: 2011-02-21
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2031-02-21
Also published as: CN102641295A

Abstract

本发明涉及一种促进创伤愈合的制剂及其制备方法，该制剂的制备方法是通过诱导单核细胞获得间充质干细胞(Mesenchymal？stem？cells，MSC)，进而在低血清条件培养上述MSC细胞，最后分离MSC细胞获得无细胞培养基，并对该无细胞培养基进行相应后处理，即可获得所述制剂。体外和体内实验表明，本发明所述的促进创伤愈合的制剂能够显著的促进受损皮肤及周边组织的修复和再生，从而起到促进创伤愈合的相应功能。

Description

促进创伤愈合的制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种可以促进创伤愈合的制剂及其制备方法。

背景技术

创伤愈合是医学领域中古老而重要的课题之一。皮肤作为一种特殊的器官，是人类与外界接触的第一道屏障，在创伤愈合中起着不容忽视的作用。创伤愈合包括毛细血管再生、纤维蛋白充填、细胞增殖和组织塑形3个基本过程，进而由增生的细胞和细胞间质，充填、连接或代替缺损的组织。血液中的中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞受创伤区趋化因子趋化和细胞因子、生长因子、缺氧环境等刺激，穿过血管壁到达创面，再生血运途径，促进创面愈合，而参与创面愈合的成纤维细胞则是由创面底部或边缘的间充质细胞或成纤维细胞演化而来的。

随着组织工程的拓展，应用干细胞技术可望为创伤修复提供新的手段。从理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，尤其是其具有的促进血管再生和器官功能恢复的特殊功效，在涉及血管疾病，血运重建及创伤愈合的治疗中有着巨大潜力。

间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSC)是来源于早期中胚层的一种具有多向分化潜能的成体干细胞。MSC广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，易于从骨髓中分离获得。近年来，尽管人们已成功地应用自体成熟细胞，如成纤维细胞来修复皮肤缺损，但MSC与成熟细胞相比具有更大的优势，因在体外培养过程中，MSC可以保持未分化表型不断增殖，达到所需数目，然后经诱导可分化为所需表型，这些表型包括脂肪细胞、内皮细胞、成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、成纤维细胞、肌腱、韧带等多种间充质来源的细胞。从骨髓中分离MSC，还能避免通过手术从病人自身获取自体成熟细胞所造成的二次损伤。

基于上述事实，将MSC应用于各种程度的创伤愈合治疗中，正越来越成为相关领域的关注重点，事实上，移植的MSC在参与受损皮肤组织修复中分泌出的生长因子和细胞活素，可借由MSC在体外特定环境中所分泌的条件培养基中获得，并完全可能将其应用于受损皮肤及周边组织的修复和再生，从而起到促进创伤愈合的相应功能。因此，MSC在体外人工环境中分泌的促血管及周边组织修复或再生的生长因子和细胞活素在临床上有巨大的潜力，可以作为干细胞疗法的有效替代品或辅助药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够有效的促进创伤愈合的制剂，用于克服现有药物的不足，为临床促进创伤愈合的治疗提供一种新的治疗药物。

本发明的目的还在于提供一种制备能够有效的促进创伤愈合的制剂的方法，该方法步骤为：

1)从健康人血液中通过白细胞置换(leukapheresis)获取外周血单核细胞，或从骨髓中(通过密度梯度离心的方法，可选步骤)获取骨髓单核细胞，或从人脂肪吸取物(lipoaspirate)中直接提取MSC；

2)筛选及培养外周血或骨髓单核细胞以获得MSC细胞；

3)在特定条件下培养MSC细胞使其分泌促组织修复和再生的生长因子和细胞活素，分离MSC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；

4)对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括：过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得促进创伤愈合的制剂。

本发明所述制备能够有效的促进创伤愈合的制剂的方法中，步骤1)所述的健康人血液或骨髓的来源可以是自体来源或异体来源，获得途径可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。可选步骤中所述的梯度离心以获取单核细胞的步骤为：将所获得的骨髓或外周血液在密度梯度剂中梯度离心，所用的梯度剂可为Ficoll-Paque(GEhealthcare)、Histopaque-1077(Sigma)，或其他公司同类产品，优选为Histopaque-1077；适用温度范围为15到25℃，优选为25℃。具体操作为：将含有骨髓或外周血及梯度剂的容器在200g-500g下离心20-40分钟，分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液，经鉴定，此单核细胞群体来源于骨髓髓系干细胞其内所含多种细胞亚群，呈多形性。

本发明所述制备能够有效的促进创伤愈合的制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞时，所用的培养基可为M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的一种，并可添加有heparin(0-100U/ml)。培养基中另可含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。在预设条件为培养温度37℃，二氧化碳浓度为5-7％的细胞培养箱中培养。

本发明所述制备能够有效的促进创伤愈合的制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞的步骤为以下所述方法①至④中的一种：

方法①：将单核细胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天，去除悬浮细胞，将贴壁的细胞继续培养7-21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。

方法②：将单核细胞与fibrin微球(直径50-250微米，可由商业途径获得，如ForticellBioscience)共同培养1-2天，每100-1000mgfibrin微球可吸附1×10⁶至1×10⁸个细胞的密度，去除悬浮细胞，将附着于fibrin微球的细胞继续培养7-21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。

方法③：将单核细胞通过CD14，或CD45特异性抗体进行磁珠分选(由德国MiltenyiBiotec公司生产)，筛选出不含CD14或CD45的单核细胞亚群，将此CD14^-或CD45^-单核细胞亚群以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，去除悬浮细胞，将贴壁(或附着于fibrin微球)的细胞继续培养7-21天。所获II型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。

方法④：将人脂肪吸取物(lipoaspirate，约50-100ml)在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)或0.9％的医用生理盐水中洗净，用I型和II型胶原酶(collagenasetypeI，II，Sigma-Aldrich)消化(酶的浓度范围0.05％-0.1％)，消化步骤为置于37℃条件下震荡30-60分钟。将消化分散后的单核细胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，将贴壁(或附着于fibrin微球)细胞继续培养7-21天。所获III型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。

本发明所述制备能够有效的促进创伤愈合的制剂的方法中，步骤3)中的在特定条件下培养MSC细胞的方法为以下所述方法①或②中的一种：

方法①：将步骤2)所获得的I、II、III型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)或0.9％的医用生理盐水，并可添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。

方法②：将步骤2)所获得的I、II、III型MSC先置于促血管内皮细胞生长的培养基中培养1-2天，此培养基可为M119、DMEM、F12、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的一种，并可添加有0.5-1％的生长因子添加剂EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的一种(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)；或添加有内皮细胞生长因子ECGF(10-100μg/ml)；并可添加有heparin(0-100U/ml)；培养基中另可含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。1-2天后将MSC转入不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％，温度为37℃的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)或0.9％的医用生理盐水，并可添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。

在按照上述方法①或②培养完成后，收集富含细胞生长因子的条件培养基，弃去MSC细胞。

本发明所述制备能够有效的促进创伤愈合的制剂的方法中，步骤4)所述的后处理步骤包括：

①对步骤3)中所收集的无细胞培养基进行过滤，可通过高速离心或过滤器将细胞杂质及碎片去除。

②对过滤后的无细胞培养基进行成分鉴定，并对其中所含的代表性促血管及周边组织生长因子及细胞活素如MCP-1，EGF，MMP-9，MMP-2，PDGF，SDF-1，FGF，VEGF的含量进行鉴定，鉴定方法可为蛋白组学(proteomics)，细胞活素阵列(cytokinearray)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，或Bio-Plex^TM细胞因子测试。

③对过滤后的无细胞培养基进行冻干或分装冷冻保存，以便长期保存其中的生长因子及细胞活素成分的活性。

附图说明

图1：本发明所述促进创伤愈合制剂对内皮细胞，成纤维细胞及角质形成细胞的刮伤愈合功效。

具体实施方式

以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。

实施例1.单核细胞的制备。

将抽取出的骨髓或者由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液加入密度梯度剂Histopaque-1077(Sigma)，每15mLHistopaque中加入30mL骨髓提取液或者外周血白细胞悬液。将骨髓提取液或外周血白细胞悬液在梯度剂的存在下于400G的速度下常温离心30分钟。分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含骨髓系单核细胞的悬浮液。

实施例2.MSC细胞的获取。

针对I类MSC细胞的获取方法：将骨髓单核细胞在添加有10％人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米1×10⁶个细胞的密度培养2天，去除悬浮细胞，将贴壁细胞继续培养21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。

针对II类MSC细胞的获取方法：将骨髓单核细胞在添加有10％人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米1×10⁶个细胞的密度培养2天，通过CD14，或CD45特异性抗体进行磁珠分选(由德国MiltenyiBiotec公司生产)，筛选出不含CD14或CD45的单核细胞亚群，将此CD14^-或CD45^-单核细胞亚群在添加有10％人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米1×10⁶个细胞的密度培养2天，去除悬浮细胞，将贴壁细胞继续培养21天。所获II型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。

针对III类MSC细胞的获取方法：将人脂肪吸取物(lipoaspirate，约50-100ml)在pH＝7.4，0.9％的医用生理盐水中洗净，用II型胶原酶(collagenasetypeII)消化(质量浓度0.075％)，消化条件为于37℃下震荡30分钟。将消化并过滤出的单核细胞在添加有10％人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米1×10⁶个细胞的密度培养2天，将贴壁细胞继续培养21天。所获III型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。

实施例3.促进创伤愈合制剂的获取。

将实施例2所获得的各型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％的环境中在0.9％的医用生理盐水中培养2天(每平方厘米2×10⁵个细胞)，并可添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。培养完成后收集富含细胞生长因子的无细胞培养基，弃去贴壁的MSC细胞。将收集的无细胞培养基通过孔径为0.2微米的过滤器将细胞杂质及碎片去除并分装于-80℃冷库冷藏备用。视具体情况，每1x10⁶个MSC细胞可以制备2-5ml所述促进创伤愈合制剂。

实施例4.促进创伤愈合制剂中的生长因子及细胞活素的鉴定。

实施例3所制得的促进创伤愈合制剂中含有的生长因子及细胞活素成分通过细胞活素阵列(cytokinearray)鉴定(由R&DSystems购买)，此促进创伤愈合制剂的有效成分包含并不局限于以下生长因子：MCP-1、EGF、IL-6、IL-8、MMP-9、SDF-1、HGF、VEGF以及PDGF。通过酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)，其中有效成分的含量为，MCP-1：5-50ng/ml；IL-8：1-5μg/ml；SDF-1：0.5-5ng/ml；IL-6：5-20ng/ml；PDGF-BB：0.1-10ng/ml；VEGF：1-20ng/ml。其他成分组成见表1。

表1.本发明所述促进创伤愈合制剂中的成分列表(包含并不局限于以下成分)

ANG-1	IGF-II	MCP-4	SDF-1
				ANG-2	IL-1	M-CSF	Sfrp
bFGF	IL-11	MMP-13	TB4
				b-NGF	IL-12	MMP-2	TGFbeta
EGF	IL-6	MMP-9	TIMP-1
				FGF-7	IL-7	PA	TNFalpha
G-CSF	IL-8	PDGF	TSP-1
				GM-CSF	LIF	PIGF	TSP-2
HGF	MCP-1	RANTES	VEGF
				IGF-I	MCP-2	SCF	VEGF-D

实施例5.体外检测促进创伤愈合制剂对内皮细胞，成纤维细胞及角质形成细胞的刮伤愈合(Scratchwoundhealing)功效。

将成体内皮细胞(HUVEC细胞，此细胞可通过商业途径购买，例如：PromocellGmbH)以每孔5×10⁴个细胞的密度接种于24孔板中，在含10％人血清白蛋白及1％的生长因子添加剂EGM(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)的EBM-2培养基下中培养24小时，弃去原培养基并用移液管尖在板底的细胞层上划出一道细胞空白区域，将细胞重新置于本发明所述的促伤口愈合制剂或阴性对照培养基(即只含有1％人血清白蛋白的PBS，pH＝7.4)中继续培养10小时后检测此刮伤愈合(Scratchwoundhealing)的程度(即空白区域面积比，示意图见图1A)。结果显示，本发明所述的促伤口愈合制剂能够显著的增加HUVEC细胞在低血清环境中的刮伤愈合程度，相比对照组的愈合速度(刮伤面积减少34.1±3.4％)，本发明所述的促伤口愈合制剂能够更有效的减小66.1±5.6％的刮伤面积(见图1B，*：p＜0.05)。

将成纤维细胞(Fibroblast，此细胞可通过商业途径购买，例如：PromocellGmbH)细胞以每孔1×10⁵个细胞的密度接种于24孔板中，在含10％人血清白蛋白的DMEM/F12培养基下中培养24小时，弃去原培养基并用移液管尖在板底的细胞层上划出一道细胞空白区域，将细胞重新置于本发明所述的促进创伤愈合制剂或阴性对照培养基(即只含有1％人血清白蛋白的PBS，pH＝7.4)中继续培养10小时后检测此刮伤愈合(Scratchwoundhealing)的程度(见图1C)。结果显示，本发明所述的促进创伤愈合制剂能够显著的加快fibroblast细胞在低血清环境中的刮伤愈合速度，相比对照组的愈合速度(刮伤面积减少40.4±2.8％)，本发明所述的促进创伤愈合制剂促进创伤愈合制剂能够更有效的减小83.4±3.6％的刮伤面积(*：p＜0.05)。

将角质形成细胞(Keratinocyte，此细胞可通过商业途径购买，例如：PromocellGmbH)以每孔1×10⁵个细胞的密度接种于24孔板中，在含10％人血清白蛋白的DMEM/F12培养基下中培养24小时，弃去原培养基并用移液管尖将在板底的细胞层上划出一道细胞空白区域，将细胞重新置于本发明所述的促进创伤愈合制剂或阴性对照培养基(即只含有1％人血清白蛋白的PBS，pH＝7.4)中继续培养10小时后检测此刮伤愈合(Scratchwoundhealing)的程度(见图1D)。结果显示，本发明所述的促进创伤愈合制剂能够显著的加快fibroblast细胞在低血清环境中的刮伤愈合速度，相比对照组的愈合速度(刮伤面积减少36.4±2.1％)，本发明所述的促进创伤愈合制剂促进创伤愈合制剂能够更有效的减小70.4±13.8％的刮伤面积(*：p＜0.05)。

Claims

1.一种促进创伤愈合的制剂的制备方法，其特征在于，该制剂的制备方法包括如下步骤：

1)从健康人血液中通过白细胞置换获取外周血单核细胞，或从骨髓中通过密度梯度离心获取骨髓单核细胞，或从人脂肪吸取物中直接提取MSC；

2)筛选及培养外周血或骨髓单核细胞以获得MSC细胞；

4)对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括：过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得促进创伤愈合的制剂；

其中，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞时，所用的培养基为M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的一种，并添加有0-100U/ml的heparin，培养基中另含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清，在预设条件为培养温度37℃，二氧化碳浓度为5-7％的细胞培养箱中培养；

其中，步骤3)中所述的特定条件为：将步骤2)所获得的I、II、III型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％，温度为37℃的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液或0.9％的医用生理盐水，并添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的健康人血液或骨髓的来源是自体来源或异体来源，获得途径是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。

3.根据权利要求1-2任一所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的从血液中或骨髓中通过密度梯度离心获取外周血单细胞的方法为：使用梯度剂为Ficoll-Paque、Histopaque-1077或其他同类产品，温度为15～25℃，离心力为200g-500g，时间20-40分钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液。

4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的培养单核细胞以获得MSC细胞的方法为以下所述方法①、②、③或④中的一种：

方法①：将单核细胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天，去除悬浮细胞，将贴壁的细胞继续培养7-21天，获I型MSC。

方法②：将单核细胞与fibrin微球共同培养1-2天，每100-1000mgfibrin微球能吸附1×10⁶至1×10⁸个细胞的密度，去除悬浮细胞，将附着于fibrin微球的细胞继续培养7-21天，获I型MSC。

方法③：将单核细胞通过CD14，或CD45特异性抗体进行磁珠分选，筛选出不含CD14或CD45的单核细胞亚群，将此CD14^-或CD45^-单核细胞亚群以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天，或用方法②培养，去除悬浮细胞，将贴壁或附着于fibrin微球的细胞继续培养7-21天，获II型MSC。

方法④：将人脂肪吸取物50-100ml在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液PBS或0.9％的医用生理盐水中洗净，用I型和II型胶原酶消化，酶的浓度范围0.05％-0.1％，消化步骤为置于37℃条件下震荡30-60分钟。将消化分散后的单核细胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天，或用方法②培养，将贴壁或附着于fibrin微球细胞继续培养7-21天，获III型MSC。

5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述的在特定条件下培养MSC细胞的其中的所述特定条件还可以为:

将步骤2)所获得的I、II、III型MSC先置于促血管内皮细胞生长的培养基中培养1-2天，此培养基为M119、DMEM、F12、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的一种，并添加有0.5-1％的生长因子添加剂EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的一种；或添加有10-100μg/ml的内皮细胞生长因子ECGF；并添加有0-100U/ml的heparin；培养基中另含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。1-2天后将MSC转入不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％，温度为37℃的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液或0.9％的医用生理盐水，并添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。

6.根据权利要求1-5任一所述的制备方法，其特征在于，不添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。

7.根据权利要求1-6任一所述的制备方法，其特征在于，所述MSC细胞为I型MSC细胞。

8.一种由权利要求1-7任一所述的方法制备获得的制剂。

9.权利要求8所述的制剂在制备促进创伤愈合的药物中的应用。