CN106916783A - 肌肉干细胞体外培养方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肌肉干细胞体外培养方法及其应用。本发明的肌肉干细胞体外培养方法，为采用血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细胞。本发明还进一步公开了所述肌肉干细胞体外培养方法所用培养基及其应用。采用本发明的方法，肌肉干细胞可以增殖十次以上。更重要的是，在本发明的培养基中，肌肉干细胞可以连续传代，并继续保持干性和分化潜能，并且扩增后的肌肉干细胞均保持干性和完整分化潜能，能够在体内修复肌肉损伤，这就使得利用体外培养的肌肉干细胞用于再生医学治疗的策略在临床上具有可行性。

Description

肌肉干细胞体外培养方法及其应用

本案为以下专利申请的分案申请：

申请号：201310205059X；

申请日：2013年5月29日；

发明名称：肌肉干细胞体外培养方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术与医学领域，特别涉及肌肉干细胞相关的细胞培养与细胞治疗领域。

背景技术

肌肉干细胞负责出生后肌肉组织的生长和再生，且肌肉干细胞在体内没有致癌效果，不存在应用胚胎干细胞时会碰到的伦理问题，因而在肌肉萎缩和重症肌无力等各种肌肉退行性疾病的治疗方面有广阔的应用前景。肌肉干细胞临床应用的一个重要障碍是无法在体外长期培养肌肉干细胞。和大多数成体干细胞一样，肌肉干细胞从体内分离之后，在体外培养系统中只能再分裂2－4次，几乎无法传代。

现有培养肌肉干细胞(卫星细胞)的方法几乎都来源于Bischoff博士在1986年建立的方法，后经过Beauchamp等人的改进，形成现有的在F10基础培养基中添加10ng/ml FGF进行培养的方法。在此培养条件下，肌肉干细胞可以增殖3－5次。在传代时，肌肉干细胞会经过一个严重的危机时期，在这一危机时期，绝大多数细胞都会死去，残留的细胞则分化为不具有干性的前体细胞。所以体外培养1－3代(3－12天)后，分离得到的肌肉干细胞即全部分化为不具有干性的前体细胞，肌肉干细胞的分子标记在这些前体细胞中都无法检测到。注射入小鼠体内后，这些前体细胞参与肌肉损伤修复的能力非常弱，不能在体内形成有功能的干细胞，完全不能进行移植后二次损伤的修复。(Bischoff R.A satellite cellmitogen from crushed adult muscle.Dev Biol.,1986.115(1):140-147.Beauchamp,J.R.,et al.,Expression of CD34and Myf5defines the majority of quiescent adultskeletal muscle satellite cells.J Cell Biol,2000.151(6):p.1221-34.)也就是说，采用现有的肌肉干细胞体外培养系统，培养后的肌肉干细胞传代后要经过一个危机期，危机期后得到的可以增殖的细胞绝大多数已经分化为肌肉祖细胞，丧失了肌肉损伤修复的能力。由于这一问题的存在，使得通过在肌肉干细胞中进行基因修复治疗遗传性的肌肉退行性疾病的方法难以在临床治疗中使用。

发明内容

本发明的目的就是克服现有技术的缺陷，提供一种肌肉干细胞培养基及其应用。

本发明第一方面提供了一种肌肉干细胞体外培养方法，为采用添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细胞。本发明的肌肉干细胞体外培养方法适合体外长期培养肌肉干细胞。

本发明第二方面提供了一种肌肉干细胞培养基，为添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞条件培养基。

所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基中所添加的血液细胞的细胞因子，用于制备所述血液细胞条件培养基的血液细胞，均与待培养的肌肉干细胞来源于相同的动物物种。

当添加动物血清培养细胞时，本发明所述的添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基中所添加的血液细胞的细胞因子并不包括所用动物血清中本就含有的细胞因子。

所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基可由在通用细胞培养基中添加血液细胞的细胞因子的方法制备获得。

进一步的，所述血液细胞条件培养基为淋巴细胞条件培养基。更进一步的，为B细胞条件培养基或T细胞条件培养基。

所述添加的血液细胞的细胞因子选自以下细胞因子中的多种：GM-CSF(粒细胞集落刺激因子)、sICAM-1(人可溶性细胞间粘附分子1)；IFN gamma(γ干扰素)、IL1(白介素1)、IL-1alpha receptor(白介素1α受体)、IL1alpha(白介素1α)、IL-3(白介素3)、IL2(白介素2)、IL-10(白介素10)、IL-16(白介素16)、IL13(白介素13)、IL-17(白介素17)、IP-10(干扰素诱导蛋白10)、SCYA2(小诱导型细胞因子A2)、MIG(干扰素γ诱生单核因子)、MIP-1alpha(巨噬细胞炎性蛋白1α)、TGF－beta(转化生长因子β)、IL-4(白介素4)、TRAF6(TNF受体相关因子6)、FGF(成纤维细胞生长因子)、IGF胰岛素样生长因子)、PDGF(血小板衍生生长因子)、LIF(白血病抑制因子)、mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)、LPS(细胞内毒素)、TLR1(Toll-样受体1)、IL12(白介素12)、IL23(白介素23)、NGF(神经生长因子)、TNFalpha(α干扰素)、IL1beta(白介素1β)。

所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，所述添加的血液细胞的细胞因子总浓度不低于6ng/ml，较佳地为50-4500ng/ml。

进一步的，所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，任一添加的血液细胞的细胞因子的浓度均在0.5ng/ml以上，较佳的为1ng/ml以上，再佳的为10ng/ml以上，更佳的，25ng/ml以上，更进一步的，为50ng/ml以上。

进一步的，所添加的述血液细胞的细胞因子至少包括IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma。

进一步的，所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma的浓度之和不低于6ng/ml，较佳地为50-1250ng/ml。

进一步的，所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，所述IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma中任一种的浓度均不低于0.5ng/ml，较佳的为1ng/ml以上，更佳为10ng/ml以上，一般可选择50-500ng/ml。

本发明第三方面，提供了前述血液细胞的细胞因子或血液细胞条件培养基在肌肉干细胞体外培养中的用途。

所述血液细胞的细胞因子或血液细胞条件培养基可促进肌肉干细胞在体外的增殖并使体外增殖的肌肉干细胞保持干性。

本发明第四方面，提供了一种用于治疗肌肉退行性疾病的制剂，为以采用本发明的肌肉干细胞体外培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分的制剂。

进一步的，所述制剂以来源于病人本体的肌肉干细胞采用本发明的肌肉干细胞体外培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分。

进一步的，所述制剂为注射剂、手术植入剂。

所述制剂一般包含常用的制剂辅料。

本发明第五方面，提供了一种对病人的肌肉退行性疾病细胞治疗方法，包括下列步骤：

1)收集病人的肌肉干细胞；

2)采用本发明的肌肉干细胞培养基体外扩增培养步骤1)收集的肌肉干细胞至得到足够多的肌肉干细胞；

3)将获得的肌肉干细胞给药至病人肌肉损伤部位。

其中步骤3)所述给药方式可采用注射剂的方式将肌肉干细胞肌肉注射至病人肌肉损伤部位。

肌肉干细胞的注射剂可将扩增后的肌肉干细胞经胰酶消化从培养皿中取下后，重悬在生理盐水中获得。

采用本发明的肌肉干细胞体外培养、传代方法，使得肌肉干细胞可以在体外大量扩增并保持干性，从而大大提高了可以用于再生医学治疗的干细胞的数量，使得由患者提供少量肌肉组织，分离肌肉干细胞，进行基因修复，体外扩增后将携带正确遗传信息的肌肉干细胞注射如体内实现对多种遗传性肌肉退行性疾病的细胞治疗的策略成为可能。

现有的肌肉干细胞培养方法无法在体外长期培养具有分化潜能的肌肉干细胞，无法传代，培养时间超过12天后全部细胞都分化为祖细胞，丧失在体内修复肌肉损伤的能力。在现有培养条件下，肌肉干细胞只能分裂3－5次，即最多扩增为原始细胞数的32倍，即丧失分裂能力，因而要得到足够多的肌肉干细胞用于治疗，就必须取非常大的肌肉组织用来分离纯化肌肉干细胞，在临床上基本不具有可行性。在本发明的培养基中，肌肉干细胞可以增殖十次以上，即在每一代均可以扩增为原始细胞数的1000倍以上。更重要的是，在本发明的培养基中，肌肉干细胞可以连续传代，并且继续保持干性和分化潜能。这样最终得到的肌肉干细胞数目是起始分离纯化的肌肉干细胞数目的2^mx2ⁿ倍，m为每代分裂次数，n为传代数目。采用本发明的方法得到的m值至少为12，n值至少为40，即肌肉干细胞数目至少可以扩增为原始分离纯化的肌肉干细胞数目的4.5x10¹⁵倍，并且扩增后的肌肉干细胞均保持干性和完整分化潜能，能够在体内修复肌肉损伤。注射入小鼠体内后，这些干细胞可以较高效地参与肌肉损伤的修复，也可以补充体内的干细胞储备，具有移植后二次损伤的修复能力。这就使得通过微创手术，提取少量肌肉组织(克级)，分离纯化少量肌肉干细胞，然后在体外扩增获得足够量的肌肉干细胞用于再生医学治疗的策略在临床上具有可行性。

附图说明

图1添加细胞因子的F10培养基中培养的P0代肌肉干细胞(Pax7染色)

图2添加细胞因子的F10培养基中培养的对照成纤维细胞(Pax7染色)

图3添加细胞因子的F10培养基中培养的P8代肌肉干细胞(Pax7染色)

图4添加细胞因子的F10培养基中培养的P22代肌肉干细胞(Pax7染色)

图5在添加细胞因子的F10培养基中培养的P0代细胞的分化结果

图6在添加细胞因子的F10培养基中培养的P22代细胞的分化结果

图7在添加细胞因子的F10培养基中培养的表达RFP的肌肉干细胞在体内参与肌肉损伤修复结果

图8.在添加细胞因子的F10培养基中培养的RFP标记的肌肉干细胞能够参与肌肉损伤的修复结果。

体外培养的RFP标记的肌肉干细胞注射入没有荧光标记的损伤的肌肉7天后，切片观察红色细胞的整合情况，发现在损伤部位有来源于注射的表达RFP的肌肉干细胞的红色肌纤维形成。

其中，图A为注射加入细胞因子培养的肌肉干细胞的修复情况；

图B为注射用T细胞条件培养基培养的肌肉干细胞的修复情况。

具体实施方式

本发明发现，与血细胞共培养后可以促进肌肉干细胞的增殖，且这一促进作用不依赖于血细胞与肌肉干细胞之间的细胞接触。血细胞条件培养基即可以促进肌肉干细胞的增殖。经过进一步细分，B细胞和T细胞条件培养基均可以促进肌肉干细胞的增殖。肌肉干细胞在T细胞条件培养基中培养后，每代可连续分裂10次以上，并可在体外培养系统中至少连续传代40代。经过一系列分离纯化步骤后，分离到T细胞所分泌出的细胞因子，这些细胞因子的组合可以促进肌肉干细胞在体外的增殖。经细胞因子处理过后的肌肉干细胞表达肌肉干细胞所应表达的分子标记，其增殖能力显著提高，可以连续传代40代以上。传代后的每一代细胞均表达肌肉干细胞的分子标记，具有较强的增殖能力，可以高效分化为成熟肌管。更重要的是，当这些用T细胞条件培养基或细胞因子培养的肌肉干细胞注射入诱导肌肉损伤后的小鼠时，注射的肌肉干细胞可以修复肌肉损伤，形成新的肌纤维，表明本发明得到的是真正的肌肉干细胞。

本发明的肌肉干细胞体外培养方法，为采用添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细胞。

本发明的关键在于对体外培养肌肉干细胞的培养基进行了改进，体外培养肌肉干细胞的其他方面与常规细胞培养一致。

最佳培养条件：CO₂培养箱中37℃培养。CO₂培养箱中CO₂浓度较佳为5％(v/v)。

所述肌肉干细胞的体外培养是贴壁培养。

本发明所采用的肌肉干细胞培养基，为添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞条件培养基。

所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基中所添加的血液细胞的细胞因子与所述待培养的肌肉干细胞应当来源于相同的动物物种。用于制备所述血液细胞条件培养基的血液细胞与所述待培养的肌肉干细胞也应当来源于相同的动物物种。如培养鼠肌肉干细胞，则采用添加了鼠血液细胞细胞因子的细胞培养基或鼠血液细胞条件培养基，如培养人肌肉干细胞，则采用添加人血液细胞的细胞因子的细胞培养基或人血液细胞条件培养基，其余类推。

所述物种(Species)，为生物分类学的基本单位。进一步的，所述动物物种选自哺乳动物。更进一步的，所述物种选自哺乳动物中的啮齿目、偶蹄目、奇蹄目、兔形目、灵长目等的物种，如鼠、兔、羊、猪、猴、人等。

当添加动物血清培养细胞时，本发明所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基中所添加的血液细胞的细胞因子并不包括加入培养基的动物血清中本就含有的细胞因子。亦即，当添加动物血清培养细胞时，本发明还需额外添加与所培养的肌肉干细胞同物种的血液细胞的细胞因子。

本发明所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基是指除常规细胞培养所需组分外，还额外添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基。

本发明所述肌肉干细胞培养基中除添加的血液细胞的细胞因子外的其他组分及含量均与常规细胞培养基一致。常规细胞培养基成分一般选自：平衡盐水、pH调节液、抗生素、动物血清、细胞生长必须的氨基酸、维生素、葡萄糖、pH指示剂等。所述平衡盐水成分如氯化钙、硝酸铁、硫酸镁、氯化钾、氟化钠、氯化钠、磷酸钠等；所述pH调节液如3.7％碳酸氢钠、HEPES溶液(二羟乙基哌嗪乙烷磺酸)、丙酮酸钠等；所述抗生素如青霉素、链霉素、等；常用的动物血清主要有牛血清和马血清。维生素如氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、泛酸钙、盐酸吡哆醛、维生素B6、核黄素、硫胺素等。

所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基可由在通用细胞培养基中添加血液细胞的细胞因子的方法制备获得。其中，所述通用细胞培养基可选自各种常规细胞培养基，如DMEM、RPMI 1640、MEM、DEME/F12、F10、CD293、medium 231、medium 106。本发明实施例具体列举了在F10培养基中添加各种血液细胞的细胞因子的肌肉干细胞培养基。

所述血液细胞条件培养基是指为：培养过血液细胞的细胞培养基。进一步的，所述血液细胞为淋巴细胞。最佳的，所述血液细胞为B细胞和/或T细胞。

所述血液细胞条件培养基可由在通用细胞培养基中培养血液细胞后分离获得。在通用细胞培养基中培养B细胞后分离获得B细胞条件培养基，在通用细胞培养基中培养T细胞后分离获得T细胞条件培养基。

所述添加的血液细胞的细胞因子选自以下细胞因子中的多种：GM-CSF、sICAM-1；IFN gamma、IL1、IL-1 alpha、IL-1 alpha receptor、IL-3、IL2、IL-10、IL-16、IL13、IL-17、IP-10、SCYA2、MIG、MIP-1 alpha、TGF－beta、IL-4、TRAF6、FGF、IGF、PDGF、LIF、mTOR、LPS、TLR1、IL12、IL23、NGF、TNFalpha、IL1 beta。

所有上述细胞因子可以在淋巴细胞条件培养基中检测到，尤其均存在于T细胞条件培养基中。

更佳的，所述血液细胞的细胞因子选自上述细胞因子中的至少六种；或者，所述血液细胞的细胞因子选自上述细胞因子中的至少七种；或者，所述血液细胞的细胞因子选自上述细胞因子中的至少八种；或者，所述血液细胞的细胞因子选自上述细胞因子中的至少九种；或者，所述血液细胞的细胞因子选自上述细胞因子中的至少十种。

为了维持肌肉干细胞的增殖并使其传代细胞保持干性，所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，所述血液细胞的细胞因子总浓度不能过低，一般不应低于6ng/ml，较佳地为50-4500ng/ml。

所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，任一添加的血液细胞的细胞因子的浓度均在0.5ng/ml以上，较佳的为1ng/ml以上，更佳为10ng/ml以上，一般可选在50-500ng/ml的范围内。上述描述并非指细胞因子的浓度不能高于500ng/ml，而是认为在此浓度范围内细胞因子可以较好地发挥积极效果，浓度过低效果不明显，浓度过高造成浪费。

经试验，六种血液细胞的细胞因子：IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma对肌肉干细胞的增殖与干性的保持关系密切。在本发明优选的技术方案中，这6种血液细胞的细胞因子必须添加，而其余血液细胞的细胞因子可添加也可以不添加。

进一步的，所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma的浓度之和不低于6ng/ml，较佳地为50-1250ng/ml。

进一步的，所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，所述IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma中任一种的浓度均在0.5ng/ml以上，较佳的为1ng/ml以上，更佳为10ng/ml以上，一般可选50-500ng/ml。所述细胞因子的浓度高于500ng/ml并不会对肌肉干细胞的增殖构成严重的负面影响，但考虑到成本因素，无需添加过多的细胞因子。

添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基中，上述各细胞因子的浓度均指：在添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基中，来源于与所培养的肌肉干细胞同物种的血液细胞的细胞因子的终浓度。

本发明揭示了血液细胞的细胞因子或血液细胞条件培养基可用于肌肉干细胞体外培养，可促进肌肉干细胞在体外的增殖并使体外增殖的肌肉干细胞保持干性。

本发明还提供了一种用于治疗肌肉退行性疾病的制剂，为以采用本发明的肌肉干细胞体外培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分的制剂。

所述制剂以来源于病人本体的肌肉干细胞采用本发明的肌肉干细胞体外培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分。

根据本发明的试验，用于人体，推荐的给药剂量约为3x10⁶个肌肉干细胞/次。可单次给药，也可以根据病人的肌肉恢复情况多次给药。一般的给药方式为通过肌肉注射的方式给药。但本发明并不排除其他可能的给药方式。

所述制剂一般包含常用的制剂辅料。

常用的制剂辅料包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、多元醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的制剂优选被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。其他可能的制剂形式可通过常规方法进行制备。本发明的制剂宜在无菌条件下制造。此外，本发明的制剂还可与其他治疗剂一起使用。

本发明进一步提供了一种对病人的肌肉退行性疾病细胞治疗方法，包括下列步骤：

1)收集病人的肌肉干细胞；

病人肌肉干细胞的收集可通过微创手术从病人机体中提取少量肌肉样品，而后从肌肉样品中将肌肉干细胞分离纯化获得。该技术为本领域技术人员熟知。

2)采用本发明的肌肉干细胞培养基体外扩增培养步骤1)收集的肌肉干细胞至得到足够多的肌肉干细胞；

基于本发明的肌肉干细胞培养技术，收集了病人的肌肉干细胞后，可以进一步利用已知的基因工程手段对肌肉干细胞进行基因工程改造，修复缺陷基因或进行基因优化，并进一步扩增改造后的肌肉干细胞，以达到克服一些遗传或突变相关的肌肉疾病或进一步优化肌肉组织的目的。

3)将获得的肌肉干细胞给药至病人肌肉损伤部位。

一般可采用注射剂的方式将肌肉干细胞肌肉注射至病人肌肉损伤部位。注射后应当让病人进行适度锻炼，促进肌肉干细胞的整合。4－8周后检查修复效果。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

鼠T细胞条件培养基的制备：

将野生型C57/B6小鼠处死，取出脾脏，置于70um滤网中，加入2-3毫升PBS湿润后，使用辗磨棒辗磨脾脏，加适量PBS过滤，收集细胞悬液。1000rpm离心5分钟，弃上清，使用5毫升红细胞裂解液重悬细胞，加入5毫升RPMI-1640培液，并用滤网再次过滤去除细胞碎片，1000rpm离心5分钟收集细胞。使用RPMI-1640培液洗涤细胞两次，调整细胞密度为1x10⁹cells每升，接种于细胞培养瓶，加入ConA(终浓度为5mg/L)，于37度CO₂培养箱培养48小时后补加等倍RPMI-1640培液，24小时后3000rpm离心5分钟，将细胞上清转移至新离心管中，于-80摄氏度保存。

经检测，获得的T细胞条件培养基中含有下列浓度的细胞因子：

检测方法：ELISA检测,参见R&D公司Mouse Cytokine Array,Panel A(Catalog#ARY006)

在不同的细胞培养基或者不同操作人员的情况下，T细胞条件培养基中的细胞因子含量会略有波动，但这一波动并不足以影响本发明的实施。

人T细胞条件培养基除培养用细胞为人T细胞外，其余参考鼠T细胞条件培养基的方法制备。

鼠B细胞条件培养基的制备：

将野生型C57/B6小鼠处死，取出脾脏，置于70um滤网中，加入2-3毫升PBS湿润滤网后，使用辗磨棒辗磨脾脏，并加适量PBS过滤，收集细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃上清，使用5毫升红细胞裂解液重悬细胞，加入5毫升RPMI-1640培液，并用滤网再次过滤去除细胞碎片，1000rpm离心5分钟收集细胞，使用RPMI-1640培液洗涤细胞两次，调整细胞密度为1*10⁹cells每升，接种于细胞培养瓶，加入LPS，终浓度为1mg/L，于37度CO₂培养箱培养48小时后补加等倍RPMI-1640培液，24小时后3000rpm离心5分钟，将细胞上清转移至新离心管中，于-80度保存。

人B细胞条件培养基除培养用细胞为人B细胞外，其余参考鼠B细胞条件培养基的方法制备。

添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基的配制：

各血细胞因子均可市购获得。

添加有血液细胞的细胞因子的肌肉干细胞培养基的配制方法：

将F10培养基干粉溶于超纯水，过滤除菌，按表1和表2加入无菌的各细胞因子，10％胎牛血清，100IU青霉素，100μg/ml链霉素后混匀。

也可采用1640培养基和DMEM培养基,均能培养肌肉干细胞。

按下表加入细胞因子，下表中各血液细胞的细胞因子均来源于鼠或来源于人。

表1

表2

实施例2

肌肉干细胞的培养与检测

1)肌肉干细胞的获取：

鼠肌肉干细胞：将数只3天新生小鼠处死，取四肢肌肉置于加有0.2％D型胶原酶的DMEM培养液中，37度消化1.5小时，随后用PBS洗涤肌肉三遍，每次自然沉降肌肉数分钟收集肌肉。先后使用巴斯德吸管和18G针头吹吸肌肉数次，直至肌肉团块被打碎，40um滤网过滤去除非肌肉杂质，1000rpm离心5分钟，重悬于加有F10培液并接种于10cm培养皿中，3小时后将上清转移至0.05％I型胶原包被的10cm培养皿中，同时加入5ng/mlFGF细胞因子，于37度CO₂培养箱培养过夜。次日，胰酶消化肌肉细胞，1500rpm离心5分钟，PBS洗涤细胞两次，将细胞重悬于含有1.5％BSA的PBS中，加入CD34抗体(BD Pharmingen，cat No：553733，稀释比：1:20)、integrinα7(R&D，cat No：FAB3518A，稀释比：1:10),37度孵育45分钟，5000rpm离心5分钟收集细胞，PBS洗涤细胞两次，使用Influx流式细胞分选仪分选CD34和integrinα7双阳性细胞，即为鼠肌肉干细胞。

人肌肉干细胞：获取人肌肉组织后，使用无菌手术器械去除所有皮肤、脂肪及骨骼等非肌肉组织。称重后将肌肉剪成小块，每克肌肉加入3.5毫升dispase II和D型胶原酶等比混合液，置于37度CO₂培养箱消化15分钟，使用5毫升移液管吹吸肌肉组织，重复上述过程2-3次，直至所有肌肉团块已被消化。加入2倍于总体积的完全生长培养基终止消化，100um滤网过滤后329g离心10分钟。以初始每克肌肉3.5毫升将沉淀重悬于完全生长培养基，加入7倍体积的红细胞裂解液，上下颠倒离心管数次，40um滤网过滤，329g离心10分钟收集细胞，调整细胞浓度至0.5-1x10⁶cells/10ml将细胞接种于gelatin包被的培养皿中。

2)肌肉干细胞传代培养：

分别将实施例1制备的各培养基加入分离纯化的肌肉干细胞，在37℃5％CO₂培养箱中培养。每48小时传代一次，传代后的细胞在37℃5％CO₂培养箱中培养。

传代方法：肌肉干细胞生长至密度达到70％时，用37℃预热的PBS洗一次，加入37℃预热的胰酶，消化1－2分钟，加入37℃预热的培养基终止反应。重悬细胞，室温3000rpm离心6分钟。弃上清，将沉淀的细胞重悬于37℃预热的培养基中，稀释3倍，均分入3个培养皿，在37℃5％CO2培养箱中培养48小时。

3)检测：

每一代肌肉干细胞均进行肌肉干细胞的分子标记Pax7的免疫荧光染色，检测其表达水平。

每一代肌肉干细胞均进行体外分化实验，检测其分化潜能。

每一代细胞均通过肌肉注射引入诱导肌肉损伤的小鼠肌肉检测其修复肌肉损伤的能力。

每种培养基最多检测40代细胞。

肌肉干细胞的分子标记Pax7的免疫荧光染色检测：

传代后的细胞取其中一盘，用PBS(磷酸缓冲液)洗3次。用4％甲醛固定，室温15分钟。用PBS洗3次，加入1％Tween20，室温10分钟。用PBS洗3次，加入在1％BSA(牛血清白蛋白)的PBS中稀释的Pax7抗体(购自DSHB)，室温孵育1小时。用PBS洗三次，每次5分钟。加入在1％BSA PBS溶液中1：1000稀释的荧光标记的驴抗鼠二抗，室温孵育1小时。用PBS洗一次，加入20μM DAPI,室温5分钟，用PBS洗三次，每次5分钟。加入抗猝灭剂后封片。在Zeiss荧光显微镜下观察拍照。

能够观察到位于细胞核的荧光染色判断为阳性。不能观察到位于细胞核的荧光染色判断为阴性。

体外分化实验：

取一盘培养后的肌肉干细胞，将其用预热37℃的PBS洗三次，加入含有2％马血清的DMEM培养基，在37℃5％CO₂培养箱中培养72小时后，在显微镜下观察分化情况。

能够观察到>90％的细胞分化为成熟肌管，判断为保持良好分化潜能。观察到部分细胞分化为成熟肌管，判断为部分保持分化潜能。没有肌管形成，判断为无分化潜能。

肌肉损伤修复试验：

诱导肌肉损伤的小鼠动物模型：购自Charlse River的野生型小鼠。

取一盘培养后的表达RFP(红色荧光蛋白)的肌肉干细胞，用预热37℃的PBS洗一次，用预热37℃的胰酶消化2分钟后，取1x10⁵个肌肉干细胞，重悬于200μl无菌的PBS中，转入无菌的1ml注射器，肌肉注射入诱导肌肉损伤的不表达RFP的小鼠腓肠肌中。小鼠培养1个月后，取腓肠肌冰冻切片，进行laminin染色以标记肌纤维的轮廓，DAPI染色以标记DNA，在激光共聚焦显微镜下观察RFP细胞是否存在于损伤部位。染色方法如下：冰冻切片用PBS洗3次。用4％甲醛固定，室温15分钟。用PBS洗3次，加入1％Tween20，室温10分钟。用PBS洗3次，加入在1％BSA的PBS中稀释的Laminin抗体(购自Abcam公司)，室温孵育1小时。用PBS洗三次，每次5分钟。加入在1％BSA PBS溶液中1：1000稀释的荧光标记的驴抗兔二抗，室温孵育1小时。用PBS洗一次，加入20μM DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚),室温5分钟，用PBS洗三次，每次5分钟。加入抗猝灭剂后封片。在Zeiss激光共聚焦显微镜下观察拍照。

在损伤部位可观察到较多的有红色荧光的肌纤维存在判断为肌肉修复优良。在损伤部位仅观察到少数有红色荧光的肌纤维存在判断为肌肉少量修复。无法检测到任何有红色荧光的肌纤维判断为肌肉未修复。

4)试验结果(1#-14#分别对应采用表1和表2中1#-14#的配方制备的添加有鼠血液细胞的细胞因子的F10细胞培养基)：

++：Pax7的免疫荧光染色检测阳性；+：Pax7的免疫荧光染色检测弱阳性；-：Pax7的免疫荧光染色检测阴性

aa:保持良好分化潜能；ab:部分保持分化潜能；bb：无分化潜能

cc：肌肉损伤修复良好；cd：肌肉少量修复；dd：肌肉未修复。

-：该项检测未进行

部分实验结果图片参见附图

5)结果分析：

上述结果可见，采用本发明的培养基，对40代肌肉干细胞进行Pax7染色后，发现其均为Pax7阳性，每一代细胞均表达肌肉干细胞的分子标记Pax7，均能分化为成熟的肌管细胞。第1到第30代细胞均可修复肌肉损伤。在小鼠体内，目前已经检测的18代细胞均能够参加肌肉损伤的修复。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (14)

1.一种肌肉干细胞体外培养方法，为采用血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细胞。

2.如权利要求1所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，用于制备所述血液细胞条件培养基的血液细胞，与待培养的肌肉干细胞来源于相同的动物物种。

3.如权利要求2所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述血液细胞条件培养基为淋巴细胞条件培养基。

4.如权利要求3所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述血液细胞条件培养基为B细胞条件培养基或T细胞条件培养基。

5.如权利要求4所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述血液细胞的条件培养基中，IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma中任一种的浓度均不低于0.5ng/ml，较佳的为1ng/ml以上，更佳为10ng/ml以上，一般可选择50-500ng/ml。

6.一种肌肉干细胞培养基，为血液细胞条件培养基。

7.如权利要求6所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，用于制备所述血液细胞条件培养基的血液细胞与待培养的肌肉干细胞来源于相同的动物物种。

8.如权利要求7所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，所述血液细胞条件培养基为淋巴细胞条件培养基。

9.如权利要求8所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，所述血液细胞条件培养基为B细胞条件培养基或T细胞条件培养基。

10.如权利要求9所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，所述血液细胞的条件培养基中，IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma中任一种的浓度均不低于0.5ng/ml，较佳的为1ng/ml以上，更佳为10ng/ml以上，一般可选择50-500ng/ml。

11.血液细胞条件培养基在肌肉干细胞体外培养中的用途。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述血液细胞条件培养基用于促进肌肉干细胞在体外的增殖并使体外增殖的肌肉干细胞保持干性。

13.一种用于治疗肌肉退行性疾病的制剂，是以权利要求1-5任一权利要求所述的肌肉干细胞体外培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分的制剂。

14.如权利要求13所述的制剂，其特征在于，所述制剂以来源于病人本体的肌肉干细胞经所述的肌肉干细胞体外培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分。