CN115386539A

CN115386539A - 胸腺细胞在培养肌肉干细胞中的用途

Info

Publication number: CN115386539A
Application number: CN202110538518.0A
Authority: CN
Inventors: 朱敏生
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2021-05-18
Filing date: 2021-05-18
Publication date: 2022-11-25

Abstract

本发明涉及胸腺细胞在培养肌肉干细胞中的用途。本发明提供胸腺细胞、其培养物、分泌物和/或其提取物在促进肌肉再生和/或修复、增加肌肉纤维的数量、增加肌肉干细胞的数量、抑制骨骼肌衰老等中的用途。本发明发现，由胸腺细胞制备的条件培养基可高效扩增肌肉纤维和肌肉干细胞，从而抑制骨骼肌衰老。

Description

胸腺细胞在培养肌肉干细胞中的用途

技术领域

本发明属于干细胞培养领域，具体涉及胸腺细胞在培养肌肉干细胞中的用途。

背景技术

成年肌肉一直处于生长/衰竭的动态平衡之中，随着年龄的增加，肌肉生长速度明显大于衰竭速度，但在40岁后，肌肉每年以0.5％－2.0％的速度减少。成体干细胞更新是肌肉生长/衰竭动态平衡的关键调节环节，同时也是肌肉再生的保障。因此，保障机体肌肉干细胞池或扩增干细胞是防治衰老、肌肉损伤、肌肉遗传性疾病的关键技术，具有高度的实用价值。

肌肉成体干细胞主要为肌卫星细胞(Satellite cells)，其具有异质性，是目前研究核心细胞。肌卫星细胞群在机体发育的早期即已存在，其关键细胞标志是表达Pax7(Paired box transcription factor 7)转录因子；在胚胎期和出生后早期，肌卫星细胞参与新肌纤维发育，促进肌肉的形成；在出生后3周，当肌肉发育分化完成后，肌卫星细胞则停留于肌肉纤维周边，始终处于静止状态。研究发现，成体肌肉在生理状态下，肌卫星细胞存在于肌肉纤维基底膜下(Basal lamina)。该细胞体积小，处于G0期，表现为细胞分裂静息状态，此时细胞代谢也处于静止状态，称之为静息卫星细胞(Quiescent Satellite Cells，QSC)。当肌肉受损时，肌卫星细胞激活、增殖、分化，最后融合到肌纤维，形成再生纤维。在此过程中，肌卫星细胞由静息状态转变为激活状态(Active Satellite Cells，ASC)，其主要标记由Pax7⁺/MyoD^-转变成Pax7⁺/MyoD⁺。为了维持干细胞池的平衡，ASC可通过非对称分裂(Asymmetric division)的方式产生不同命运的子代，即部分子代细胞失去Pax7表达(Pax7^-/MyoD⁺)继而分化修复受损纤维，而另一些子代细胞下调MyoD表达(Pax7⁺/MyoD^-)逐渐退出细胞周期，回复到静息状态，再回到肌膜上的干细胞巢的位置成为新的QSC。以上动态过程循环往复，直至肌肉修复完成。这种更新机制是维持再生所必需的卫星细胞池的基础。但这种更新过程是如何被老龄化调控的尚不清楚。

数十年前，人们希望通过大量培养和回输肌肉干细胞来治疗肌肉疾病和退化，但均不成功。其主要原因是所培养的细胞以肌母细胞(Myoblast)为主，无法在体内持续增殖产生新的肌肉纤维。为避免这一问题，人们直接从肌肉纤维分离新鲜的QSC并回输机体，结果证实这种方法获得的干细胞可高效定植在干细胞巢中，并进入肌肉再生纤维。但这种方法最大的缺点在于获得新鲜QSC的效率很低，1克组织最多可得到10^4个干细胞，难以满足临床应用和基础研究的需要。

现有的肌卫星细胞培养方法获得的肌卫星细胞群中的非激活肌卫星细胞(NonActive Satellite Cells,NA-SC)比例仍较少，限制了该细胞的广泛应用。本领域仍需能高效扩增肌卫星细胞的培养方法。

发明内容

发明人发现，胸腺细胞、其培养物、分泌物和/或其提取物可以促进肌肉再生。

因此，本发明第一方面提供胸腺细胞、其培养物、分泌物和/或其提取物在选自以下一项或多项中的用途或在制备用于选自以下一项或多项的试剂盒中的用途：促进肌肉再生和/或修复、增加肌肉纤维的单位横截面积、增加肌肉纤维的数量、上调肌肉组织或细胞中的成肌调节因子、上调肌肉组织或细胞中的肌球蛋白重链MHC、增加肌肉干细胞的数量、提高肌肉干细胞的增殖、维持肌肉干细胞池、促进肌肉干细胞的再生相关基因的表达、抑制肌肉干细胞的激活和/或分化、维持肌肉干细胞的干性、促进骨骼肌前体细胞在体外的扩增、抑制骨骼肌衰老。

在一个或多个实施方案中，所述胸腺细胞是哺乳动物胸腺细胞，例如人、小鼠、大鼠的胸腺细胞。

在一个或多个实施方案中，胸腺细胞是胸腺非淋巴细胞或胸腺淋巴细胞。

在一个或多个实施方案中，胸腺细胞包括胸腺未成熟淋巴细胞，优选胸腺未成熟T细胞。

在一个或多个实施方案中，胸腺细胞选自以下的一种或多种：CD45⁺CD3⁺细胞、CD45⁺CD3^-细胞、CD45^-CD3^-细胞、CD45⁺CD3⁺CD4⁺CD8⁺细胞、CD45⁺CD3⁺CD4⁺细胞、CD45⁺CD3⁺CD8⁺细胞、CD45⁺CD3⁺CD4⁺CD127^-CD25⁺细胞(Treg细胞)。

在一个或多个实施方案中，肌肉干细胞是肌卫星细胞或成肌细胞。

在一个或多个实施方案中，肌肉干细胞是Pax7阳性细胞。

在一个或多个实施方案中，肌肉干细胞是Pax7阳性且Myod阴性细胞。

在一个或多个实施方案中，再生相关基因包括Myh3、MyoD或MyoG。

在一个或多个实施方案中，成肌调节因子包括Myod和myogenin。

在一个或多个实施方案中，肌肉再生修复包括肌肉二次损伤的再生修复。

在一个或多个实施方案中，肌肉纤维是再生肌肉纤维。

在一个或多个实施方案中，所述胸腺细胞培养物是培养胸腺细胞的含细胞或无细胞培养基。

在一个或多个实施方案中，所述胸腺细胞分泌物和提取物是经培养的胸腺细胞的分泌物和提取物。

在一个或多个实施方案中，培养胸腺细胞的培养基包含基础培养基，例如F10培养基，DMEM培养基，F12培养基，RPMI 1640培养基。在一个或多个实施方案中，培养胸腺细胞的培养基还包含选自以下的一种或多种组分：FBS、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、β-巯基乙醇、刀豆球蛋白A。优选地，各组分浓度分别为：1-20％FBS、0.5-2％L-谷氨酰胺、0.5-2％青霉素、0.5-2％链霉素、20-80μMβ-巯基乙醇或1-5μg/ml刀豆球蛋白A。更优选地，各组分浓度分别为：10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素、链霉素以及50μMβ-巯基乙醇或2.5μg/ml刀豆球蛋白A。

在一个或多个实施方案中，培养胸腺细胞的条件具有选自以下的一个或多个：温度37℃；5％CO2；pH7.4；培养时间2小时-5天，优选1-3天，更优选2天。

在一个或多个实施方案中，所述胸腺细胞分泌物通过以下步骤获取：(1)对经培养的胸腺细胞的混合物进行固液分离，和任选(2)阴离子柱层析分离、高效液相层析和/或质谱。

在一个或多个实施方案中，所述胸腺细胞提取物通过以下步骤获取：(1)对经培养的胸腺细胞进行细胞破碎，(2)固液分离，和任选(3)DEAE纤维素阴离子柱层析分离、高效液相层析、质谱。

本发明第二方面提供条件培养基，包含胸腺细胞、其培养物、分泌物和/或其提取物，和任选的基础培养基。

在一个或多个实施方案中，所述条件培养基用于培养肌肉细胞、肌肉干细胞。

在一个或多个实施方案中，所述基础培养基包含F10培养基、DMEM培养基、F12培养基或RPMI 1640培养基。

在一个或多个实施方案中，所述条件培养基还包含FBS和/或碱性成纤维细胞生长因子。优选地，FBS为5-20％，更优选10％-15％；碱性成纤维细胞生长因子为1-5ng/ml，更优选2-3ng/ml。

在一个或多个实施方案中，所述胸腺细胞是哺乳动物胸腺细胞，例如人、小鼠、大鼠胸腺细胞。

在一个或多个实施方案中，胸腺细胞包括选自以下的一种或多种：CD45⁺CD3⁺细胞,CD45⁺CD3^-细胞、CD45^-CD3^-细胞、CD45⁺CD3⁺CD4⁺CD8⁺细胞、CD45⁺CD3⁺CD4⁺细胞、CD45⁺CD3⁺CD8⁺细胞、CD45⁺CD3⁺CD4⁺CD127^-CD25⁺细胞(Treg细胞)。在一个或多个实施方案中，肌肉干细胞是肌卫星细胞或成肌细胞。

在一个或多个实施方案中，所述条件培养基包含培养胸腺细胞的培养物和任选的基础培养基。

在一个或多个实施方案中，所述条件培养基中胸腺细胞培养物占1-100％(体积)，优选占30-70％，更优选50％。

本发明第三方面提供一种培养肌肉干细胞的方法，包括使用本文第二方面任一实施方案所述的条件培养基培养肌肉干细胞。

在一个或多个实施方案中，培养肌肉干细胞的温度30-40℃，优选37℃。

在一个或多个实施方案中，在约5％CO₂的条件下培养肌肉干细胞。

在一个或多个实施方案中，所述肌肉干细胞的成肌调节因子上调。

在一个或多个实施方案中，所述肌肉干细胞的肌球蛋白重链MHC上调。

在一个或多个实施方案中，所述肌肉干细胞的数量增加。

在一个或多个实施方案中，所述肌肉干细胞的增殖提高。

在一个或多个实施方案中，所述肌肉干细胞的再生相关基因的表达提高。

在一个或多个实施方案中，所述肌肉干细胞的激活和/或分化受到抑制。

在一个或多个实施方案中，所述肌肉干细胞的干性得到维持。

本发明还提供一种上调肌肉干细胞的成肌调节因子、上调肌肉干细胞的肌球蛋白重链MHC、上调肌肉干细胞的再生相关基因的表达、增加肌肉干细胞的数量、提高肌肉干细胞的增殖、抑制肌肉干细胞的激活和/或分化、维持肌肉干细胞干性的方法，包括使用本文第二方面任一实施方案所述的条件培养基培养肌肉干细胞。

在一个或多个实施方案中，在约5％CO2的条件下培养肌肉干细胞。

在一个或多个实施方案中，本方面所述方法的其他特征如本发明第二方面中任一实施方案所述。

本发明还提供包含本文所述方法培养的肌肉干细胞和药学上可接受的辅料的药物组合物。

在一个或多个实施方案中，肌肉干细胞是Pax7阳性细胞。

在一个或多个实施方案中，所述肌肉干细胞的数量增加。

在一个或多个实施方案中，所述肌肉干细胞的增殖提高。

本发明还提供胸腺细胞、其培养物、分泌物或提取物、和/或本文所述方法培养的肌肉干细胞在制备药物中的用途，所述药物用于增加肌肉纤维的数量或单位横截面积、抑制骨骼肌衰老、细胞移植、肌肉训练、美体、治疗或预防肌肉疾病、治疗或预防肌肉损伤、治疗或预防肌肉流失、基因编辑等。

在一个或多个实施方案中，所述肌肉疾病是遗传性肌肉疾病，例如杜氏肌营养不良(DMD)、贝克肌营养不良(BMD)、面肩肱型肌营养不良症(facioscapulohumeral musculardystrophy)、肢带型肌营养不良症2A和2B型(limb-girdle muscular dystrophies types2A and 2B)、Miyoshi肌病、杆状体肌病(nemaline myopathy)、皮肌炎(dermatomyositis)、多发性肌炎(polymyositis)、包涵体肌炎(inclusion body myositis)、中央核肌病(centronuclear myopathy)等。

附图说明

图1显示胸腺是骨骼肌再生所必需的，但不是骨骼肌生长所必需的。术后4个月(A)、7个月(B)和8个月(C)，成年对照组和胸腺切除组小鼠的绝对体重、瘦质量和脂肪质量。(D)H&E染色切片的代表性显微照片，说明胸腺切除小鼠和对照小鼠TA肌肉是一样正常的。比例尺代表50um。(E)成年对照组和胸腺切除组小鼠胫前(TA)肌注射1.2％BaCl₂溶液100ul，第5天分离分析TA肌相对重量、再生肌纤维的平均横截面积(CSA)以及含有两个及以上中央核的肌纤维数量。(F)H&E染色切片的代表性图像显示在BaCl₂介导的损伤后第5天，胸腺切除(THY)小鼠与对照小鼠的损伤TA肌肉的病理性切片。比例尺代表20um。数据为平均值±标准误。*p<0.05，与对照组相应损伤的TA肌有显著性差异。

图2展示切除胸腺抑制小鼠损伤后肌原纤维的形成和肌源性调节因子的表达。(A)对照组和胸腺切除(THY)小鼠的TA损伤5天后，eMHC(绿色)和层粘连蛋白(红色)免疫染色肌肉切片,对每单位面积中eMHC的多少(B)和每单位面积中eMHC阳性纤维数目(C)进行统计。(D-F)用qRT-PCR法检测未损伤和损伤5天后，对照组和胸腺切除组小鼠TA肌Myh3、Myod1和Myogenin的相对mRNA水平。(G)免疫印迹显示对照组(Ctrl)和胸腺切除小鼠未损伤和损伤的TA肌肉中eMyHC、MyoD、myogenin的水平，并对其进行蛋白定量(H)。数据表示为平均值±标准误。*p<0.05，**p<0.01非配对t检验，与对照组小鼠相应损伤的TA肌有显著性差异。

图3显示去除胸腺导致小鼠肌损伤后肌卫星细胞池衰竭。对照组和胸腺切除(THY)小鼠的TA肌分别注射1.2％BaCl₂或生理盐水，5天后分离肌肉进行分析。(A)Pax7染色切片的代表性图像。用DAPI共染色鉴定细胞核。比例尺代表50um。(B)对照组和胸腺切除组小鼠未损伤和损伤肌肉中每根肌纤维Pax7⁺细胞频率的量化。(C)qRT-PCR检测未损伤和损伤TA肌Pax7的水平。(D)BrdU标记对照组和切除胸腺小鼠的TA肌肉中的增殖细胞。(E)伤后第3天注射Brdu的对照组和切除胸腺小鼠中每根肌纤维中Brdu阳性核的定量。比例尺代表50um。每组N＝4，用于Brdu掺入分析和定量。数据为平均值±标准误。*p<0.05，与对照组相应损伤的TA肌有显著性差异。#P<0.05，配对t检验与相应损伤的TA肌有显著性差异。

图4显示胸腺培养基促进肌卫星干细胞体外增殖。(A)用不同培养基培养5天后的肌卫星干细胞形态。(B)CCK8实验检测肌卫星干细胞在不同培养基中的增殖情况。(C)原代肌卫星细胞传至第二代后，在不同培养基中的形态。(D)肌卫星细胞在不同培养基中生长，细胞传代后的数目(E-F)在不同培养基中，用Pax7和MyoD免疫荧光共染监测肌卫星细胞活化状态。TCM：不含conA的胸腺细胞培养基；TCM-conA：含conA的胸腺细胞培养基；数据为平均值±标准误。*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。B和E：两因素方差分析(有交互作用)。

图5显示含有不同胸腺细胞亚群的培养基(TCM)在体外肌卫星干细胞扩增中的作用。(A)用流式细胞仪(FACS)将胸腺细胞亚群分为3组：CD45⁺CD3⁺、CD45⁺CD3^-和CD45^-CD3^-。(B)观察卫星细胞在不同培养基(CD45⁺CD3⁺、CD45⁺CD3^-和CD45^-CD3^-)中的生长速度。(C)采用流式细胞仪(FACS)分析，将胸腺细胞CD45⁺CD3⁺亚群分为4组：CD4⁺CD8^-、CD4^-CD8⁺、CD4⁺CD8⁺和Treg(CD4⁺CD8^-CD127^-CD25⁺)并收集细胞作为条件培养基。(D)观察卫星细胞在不同培养基(CD4⁺CD8^-、CD4^-CD8⁺、CD4⁺CD8⁺和Treg(CD4⁺CD8^-CD127^-CD25⁺))中的生长速度。

图6显示肌卫星细胞在不同体外培养基中的扩增状况。(A)肌卫星细胞在相应培养基中培养5天后，免疫荧光标记Pax7、Edu、MyoD和DAPI。(B)对图A中细胞根据标记结果进行分类统计。

图7显示扩增后的肌肉干细胞能够有效参与肌肉再生纤维的修复进程。用F10和TCM培养基(条件培养基)分别体外扩增EGFP转基因鼠的肌肉干细胞，之后植入肌肉损伤小鼠TA中，观测相应指标(第一次损伤)，然后再次诱导损伤后，监控修复情况(第二次损伤)。(A)第一、二次损伤后肌肉再生肌纤维状态。绿色表示植入的EGFP⁺细胞。红色表示层粘连蛋白免疫荧光染色。蓝色表示细胞核DAPI染色。比例尺代表20um。(B)第一次损伤后计TA肌中EGFP阳性纤维数。三个独立重复实验。(C)第二次损伤后TA肌中EGFP阳性纤维数。5个独立重复实验。数据为平均值±标准误。**p<0.01。

图8表明卫星细胞介导的骨骼肌再生不需要脾脏。(A)脾脏来源细胞培养基培养原代小鼠肌卫星细胞。(B)CCK8法测定细胞增殖率。(C)第5天培养的SCM和SCM-conA的卫星细胞形态以及培养的卫星细胞抗MyoG抗体(绿色)和DAPI(蓝色)的免疫染色。(D)对照组和脾切除术组小鼠肌肉注射1.2％BaCl₂溶液，损伤5d后取材，切片用H&E染色。H&E染色切片的代表性图像表明Ctr和脾切除术(SP)小鼠之间的肌肉再生无明显差异。(E-F)在损伤后第5天，每个视野中含有两个或更多中心核的肌纤维百分比和平均横截面积(CSA)的量化。比例尺代表50um。数据为平均值±标准误。*p<0.05，***p<0.001。B：两因素方差分析；D&E，斯氏t检验(双侧)。SCM：不含conA的脾细胞培养基；SCM-conA：含conA的脾细胞培养基。

图9胸腺条件培养基中促进肌肉卫星细胞扩增的活性物质分析。(A)胸腺条件性培养基的液相色谱-质谱分析。(B)利用琼脂糖凝胶FF对胸腺条件性培养基进行高效液相色谱进行组分分析以及各个组分培养肌肉卫星细胞的形态。(C)组分6的液相色谱-质谱分析。(D)来自于胸腺条件性培养基的外泌体对肌肉卫星细胞进行培养，细胞增值使用CCK8进行吸光度检测。培养在基础培养基的肌肉卫星细胞CCK8的吸光值作为对照。

图10细胞亚群占胸腺细胞的百分比。(A)通过流式分选将胸腺细胞分为3个亚群，每个亚群所占胸腺细胞的百分比。(B)CD45+CD3+各个亚群所占细胞百分比。

具体实施方式

本发明发现，胸腺组织可对肌肉再生进行远程调控，可扩增体内肌卫星细胞池。还发现，由胸腺细胞制备的条件培养基可高效扩增肌卫星细胞，且非激活细胞的比例比其他培养基明显增高。由此扩增的细胞可用于临床肌肉干细胞移植、基因编辑等用途。

本文中，“胸腺细胞”是胸腺中存在的造血祖细胞。胸腺细胞成熟是胸腺中胸腺细胞分化成成熟T淋巴细胞的过程。本文中，胸腺细胞主要指哺乳动物胸腺细胞，例如人、大鼠、小鼠的胸腺细胞。胸腺细胞包括胸腺非淋巴细胞或胸腺淋巴细胞，其中胸腺淋巴细胞包括成熟淋巴细胞和未成熟淋巴细胞，优选胸腺未成熟T细胞。具体地，胸腺淋巴细胞包括CD45⁺CD3⁺细胞、CD45⁺CD3^-细胞、CD45^-CD3^-细胞、CD45⁺CD3⁺CD4⁺CD8⁺细胞、CD45⁺CD3⁺CD4⁺细胞、CD45⁺CD3⁺CD8⁺细胞、CD45⁺CD3⁺CD4⁺CD127^-CD25⁺细胞(Treg细胞)。

本文中“肌肉干细胞”包括肌卫星细胞或成肌细胞。肌卫星细胞是Pax7阳性细胞。静息肌卫星细胞是Pax7阳性且Myod阴性细胞。

本文中“二次损伤”指相隔至少7天、至少15天、至少30天、至少60天的第二次损伤，用于观察肌纤维再生。损伤产生的方式以及具体部位不受限。例如，可以是小鼠胫骨前肌注射氯化钡造成损伤。两次损伤的形式可以相同也可以不同。

本文所述“胸腺细胞培养物”指胸腺细胞培养一定时间后的含细胞的培养物。本文所述“培养上清”指胸腺细胞培养一定时间后的不含细胞的上清液，培养物和/或上清液可用于与任选的基础培养基一起制备条件培养基用于培养肌肉干细胞。条件培养基中的所述培养物或培养上清占比可为1-100％，优选占30-70％，更优选50％。

本文中，培养胸腺细胞的培养基可以是本领域已知任何可用于培养动物细胞的培养基，例如RPMI 1640、F10、F20、DMEM等培养基。任选地，培养胸腺细胞的培养基还可包含选自以下的一种或多种组分：FBS、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、β-巯基乙醇、刀豆球蛋白A。优选地，各组分浓度分别为：1-20％FBS、0.5-2％L-谷氨酰胺、0.5-2％青霉素、0.5-2％链霉素、20-80μMβ-巯基乙醇或1-5μg/ml刀豆球蛋白A。此外，培养胸腺细胞的合适条件和时间本领域周知。

本文中，“提取物”是指由本文所述胸腺细胞中分离的物质，包括小分子化合物、氨基酸、多肽、蛋白质、核酸等。该物质可用于培养肌肉干细胞。可使用本领域已知的任何可用于从动物细胞中提取物质的方法获取本文所述提取物。

本文中，“分泌物”是指由本文所述胸腺细胞合成、分泌的物质，包括小分子化合物、氨基酸、多肽、蛋白质、核酸等。该物质可用于培养肌肉干细胞。可使用本领域已知的任何可用于分离动物细胞分泌物的方法获取本文所述分泌物，例如HPLC。

本发明提供胸腺细胞、其分泌物和/或其提取物在选自以下一项或多项中的用途或在制备用于选自以下一项或多项的试剂盒中的用途：促进肌肉再生和/或修复、增加肌肉纤维的单位横截面积、增加肌肉纤维的数量、上调肌肉组织或细胞中的成肌调节因子、上调肌肉组织或细胞中的胚胎型肌球蛋白重链MHC、增加肌肉干细胞的数量、提高肌肉干细胞的增殖、维持肌肉干细胞池、促进肌肉干细胞的再生相关基因的表达、抑制肌肉干细胞的激活和/或分化、维持肌肉干细胞的干性、促进骨骼肌前体细胞在体外的扩增、抑制骨骼肌衰老。

本发明还提供用于培养肌肉干细胞的条件培养基，包含胸腺细胞、其分泌物和/或其提取物，和任选的基础培养基。所述基础培养基可以是本领域已知任何可用于培养动物细胞的培养基，例如F10、RPMI 1640、F20、DMEM等培养基。条件培养基还可包含FBS和/或碱性成纤维细胞生长因子。优选地，FBS为5-20％，更优选10％-15％；碱性成纤维细胞生长因子为1-5ng/ml，更优选2-3ng/ml。相应地，本发明还包括胸腺细胞、其分泌物和/或其提取物在制备用于培养肌肉干细胞的条件培养基中的用途。

一方面，所述条件培养基包含培养胸腺细胞的培养物或上清液和任选的基础培养基，其中培养物或培养上清占1-100％、5-95％、10-90％、15-85％、20-80％、25-75％、30-70％、35-65％、40-60％、45-55％。培养胸腺细胞的培养基、培养条件、时间等如本文他处所述。另一方面，所述条件培养基包含本文所述的胸腺细胞分泌物和任选的基础培养基。再一方面，所述条件培养基包含本文所述的胸腺细胞提取物和任选的基础培养基。

使用本文所述的条件培养基可培养肌肉干细胞，高效获得静息或激活的肌肉干细胞。如上所述，肌肉干细胞包括肌卫星细胞或成肌细胞。使用本文所述的条件培养基培养的肌肉干细胞具有如下特征：成肌调节因子上调、胚胎型肌球蛋白重链MHC上调、再生相关基因的表达提高、肌肉干细胞的数量增加、肌肉干细胞的增殖提高、肌肉干细胞的激活和/或分化受到抑制、肌肉干细胞的干性得到维持。可使用本领域已知的任何用于培养肌肉干细胞(特别是肌卫星细胞)的条件进行本文所述的肌肉干细胞培养。在一个或多个实施方案中，所述肌肉干细胞是Pax7阳性细胞，包括Pax7阳性且Myod阴性细胞和Pax7阳性且Myod阳性细胞。

由于发明人发现的胸腺细胞对肌肉干细胞的调控作用，本文所述的胸腺细胞、其分泌物和/或其提取物以及本文方法获得的肌肉干细胞可用于制备药物组合物，该药物组合物可用于预防或治疗肌肉相关疾病或肌肉训练、美体，例如用于增加肌肉纤维的数量或单位横截面积、抑制骨骼肌衰老、细胞移植、肌肉训练、美体、治疗或预防肌肉疾病、治疗或预防肌肉损伤、治疗或预防肌肉流失、基因编辑等。肌肉疾病包括遗传性肌肉疾病，例如杜氏肌营养不良(DMD)、贝克肌营养不良(BMD)、面肩肱型肌营养不良症(facioscapulohumeral muscular dystrophy)、肢带型肌营养不良症2A和2B型(limb-girdle muscular dystrophies types 2A and 2B)、Miyoshi肌病、杆状体肌病(nemalinemyopathy)、皮肌炎(dermatomyositis)、多发性肌炎(polymyositis)、包涵体肌炎(inclusion body myositis)、中央核肌病(centronuclear myopathy)等。

因此，本发明还提供药物组合物，其包含本文所述的胸腺细胞、其分泌物和/或其提取物，或本文所述方法培养的肌肉干细胞，和药学上可接受的辅料。本文中，药学上可接受的辅料是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体、稀释剂和/或赋形剂，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂和防腐剂。更具体而言，合适的药学上可接受的辅料可以是本领域常用于肌肉干细胞给药的辅料。

通常，药物组合物中含有治疗有效量的胸腺细胞、其分泌物和/或其提取物或肌肉干细胞。治疗有效量是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。可根据患者年龄、性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。

此外，本发明还揭示了存储计算机程序的计算机可读存储介质，存储介质上所存储的计算机程序运行后执行本文所述的检测、诊断或治疗方法。结合本文中公开的实施方案描述的方法或算法的步骤可直接在硬件中、在由处理器执行的软件模块中、或在这两者的组合中体现。如果在软件中实现为计算机程序产品，则各功能可以作为一条或更多条指令或代码存储在计算机可读介质上或藉其进行传送。计算机可读介质包括计算机存储介质和通信介质两者，其包括促成计算机程序从一地向另一地转移的任何介质。存储介质可以是能被计算机访问的任何可用介质。作为示例而非限定，这样的计算机可读介质可包括RAM、ROM、EEPROM、CD-ROM或其它光盘存储、磁盘存储或其它磁存储设备、或能被用来携带或存储指令或数据结构形式的合意程序代码且能被计算机访问的任何其它介质。示例性存储介质耦合到处理器以使得该处理器能从/向该存储介质读取和写入信息。在替换方案中，存储介质可以被整合到处理器。处理器和存储介质可驻留在ASIC中。ASIC可驻留在用户终端中。在替换方案中，处理器和存储介质可作为分立组件驻留在用户终端中。

发明人经深入研究发现，胸腺不但是一个免疫器官，还是肌肉调节器官，是肌肉卫星细胞池的生理性调控者。发明人通过氯化钡诱导损伤和胸腺切除模型评价了胸腺在肌肉生长、再生中的作用，然后通过体外胸腺培养的方法研究胸腺细胞在肌卫星细胞干性维持中的作用。

发明人首先观察了成年小鼠胸腺对肌肉损伤的反应性。当肌肉损伤小鼠胫骨前肌后三天，胸腺的重量比未损伤组显著降低，且胸腺中CD45+CD3+CD4+和、CD45+CD3+CD8+细胞比例显著升高，而CD45+CD3+CD4+CD8+阳性细胞比例显著降低。表明胸腺未成熟T细胞被动员参与肌肉再生修复。当切除成年小鼠胸腺后，小鼠肌肉再生能力明显下降。损伤5天后，组织学切片显示，胸腺切除组与对照组相比，再生肌肉纤维的单位横截面积显著减少，再生肌肉纤维的数量显著降低；并且伴有大量的炎性细胞浸润，造成损伤肌肉与体重比显著升高。RNA检测和免疫印迹结果显示，胸腺切除组与对照组相比，成肌调节因子Myod和myogenin显著降低，胚胎型肌球蛋白重链MHC显著降低。以上结果表明：胸腺能应答肌肉损伤，对肌肉损伤的再生和修复具有重要的调控作用。

其次，发明人还观察研究了胸腺对肌卫星细胞池的影响。在胸腺切除小鼠，当肌肉损伤后5天，肌肉卫星细胞的生物标志物Pax7显著降低，而未损伤肌肉Pax7表达并没有显著性变化。通过给小鼠注射Brdu进一步观察干细胞增殖情况，发现胸腺切除组与对照组相比，再生细胞比例显著降低。以上结果证实：在损伤过程中，胸腺具有调控肌肉卫星细胞池的作用，是其调节肌肉再生的细胞学基础。

为研究胸腺是如何调控肌卫星细胞池的，发明人通过体外培养胸腺细胞制备条件性培养基，然后观察该培养基对小鼠肌肉卫星细胞增殖的影响。结果发现，来自于胸腺的条件性培养基可以显著提高肌肉卫星细胞的增殖能力，与对照培养基相比，条件性培养基中肌肉卫星细胞的数量明显增高，以Pax7阳性为标志的肌肉干细胞比例显著增高。有意思的是，培养后肌卫星细胞的PAX7^hi/MyoD^low亚群的比例明显升高，提示该培养基可以抑制肌卫星细胞的激活和分化，这对肌卫星细胞的体外扩增和临床应用具有重要价值。通过流式细胞仪分选，我们检测了胸腺细胞不同细胞群对小鼠肌肉卫星细胞增殖的影响。结果表明，各个组群条件性培养基对小鼠增殖都有不同程度的促进作用，以CD45+CD3+CD4+CD8+效应最强。

为研究培养于条件性培养基中的肌肉卫星细胞在体内的修复能力，发明人将体外培养的带有EGFP标记的肌肉卫星细胞注射到受损的小鼠胫骨前肌中，发现这些细胞可以形成带有荧光标记的肌肉纤维。并且当肌肉进行二次损伤后7天，也会形成新的带有荧光标记的肌肉纤维。结果证实，这些细胞可以整合到体内肌肉卫星细胞库中。此外，条件性培养基促进人骨骼肌前体细胞在体外的扩增。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明上述发现。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不意图限制本发明的范围。实施例中未具体描述的材料、试剂和方法，均未本领域常规的材料、试剂和方法。

实施例

材料和方法

动物与手术

C57BL/6(B6)和EGFP转基因小鼠(C57BL/6背景)购自Gempharmatech公司(中国南京)。对于胸腺切除术，在麻醉小鼠(8-10周龄，C7BL/6)的胸部顶部开胸进行切除(Yada等，2015)，切除胸腺的两个叶。胸腔缝合闭合，皮肤固定。对照组小鼠也采用同样的程序，但胸腺保持完整(Chen等人，2009年)。对于脾切除术，小鼠腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉。小鼠腹壁经左肋下切口切开。脾动脉和脾静脉被结扎并分开。切除脾脏，关闭腹部切口。在对照手术中，同样打开腹壁，然后关闭，脾脏保持完整(Yada等人，2015)。在下一次实验之前，让小鼠恢复7天。动物的护理和使用符合南京大学模型动物研究中心的伦理要求。

损伤诱导：8周左右雄鼠，移植前1天，麻醉后，胫骨前肌注射氯化钡造成损伤，肌肉移植细胞；损伤两个月后，处死小鼠检测肌肉切片；另一组注射氯化钡造成二次损伤，七天后检测肌纤维再生情况。

RT-PCR

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(Invitrogen)从组织中提取总RNA。用分光光度计在260nm和280nm处测定总RNA的浓度和纯度。吸收比(260/280nm)在1.8～2.0之间。用RT-SuperMix(Vazyme)反转录每个样本的500ng RNA。采用SYBR-Green-Master-Mix(Vazyme)和ABI-Prism-Step-One系统进行实时PCR。以2^-ΔΔCT法分析基因表达的变化，结果用内标GAPDH rRNA进行标准化。引物如下所示。

组织学分析

分离指定肌肉，并立即在预先在液氮中冷却的异戊烷中冷冻。将冷冻肌肉样品切成10μm切片，并用苏木精和伊红染色(Gao等人，2015)。用Image-Pro Plus软件对肌纤维面积进行测量和分析。横截面积(CSA)由每组3-5只小鼠计算得出，每只小鼠超过200根纤维。

Western bolt分析

在指定的时间采集肌肉，并在含有蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液(2％SDS、10mM二硫苏糖醇、10％甘油、微量溴酚蓝和50mM Tris-HCl，pH 7.4)(罗氏)中混匀。样品均化在85℃下培养5分钟，并在室温下储存60分钟。然后，细胞裂解物在12000rpm下离心10分钟以去除碎片。蛋白浓度用bicinchinic acid(BSA)蛋白检测试剂盒(Pierce)测定。用样品缓冲液将蛋白质在95℃下煮沸5分钟。5X样品缓冲液含有10％SDS、20％甘油、0.05％溴酚蓝、10mMβ-巯基乙醇、200mM三氯化氢和8M尿素。将骨骼肌总蛋白装入一个样品孔中进行SDS/PAGE分析。将分离的蛋白质转移到PVDF膜(BioRad)上，然后在室温(RT)下用5％的脱脂牛奶在TBST中封闭印迹1小时。然后在4℃下用相应的一抗将膜印迹过夜。洗涤后，在RT下用相应的辣根过氧化物酶(HRP)结合的二抗(Thermo Fisher，31460和31430)培养膜2小时。最后，在TBST中洗涤后，使用ECL Western试剂盒观察免疫反应性印迹检测系统。采用SuperBright Subpico ECL Substrate和Prolong ECL(SUDGEN)Substrate。抗体来源和稀释度如下：Myog(Santa Cruz Biotechnology,sc-576)，1:1000；eMHC(DevelopmentalStudies Hybridoma Bank)，1:500；Pax7(Developmental Studies Hybridoma Bank)，1:200；GAPDH(Santa Cruz Biotechnology,sc-32233)，1:2000；MyoD(Santa CruzBiotechnology,sc-377460)，1:500。

免疫荧光分析

免疫荧光染色：培养细胞、肌纤维和肌肉切片用4％PFA固定15min，RT时用0.25％Triton X-100透化15min，用1％BSA或5％非免疫山羊血清阻断一抗的非特异性结合1h。然后在4℃的加湿条件下培养一抗过夜。冷冻TA肌肉切片上Pax7染色的方案参考先前方法(Fu等人，2015)。简单地说，肌肉切片用4％多聚甲醛固定15分钟，然后用冷甲醇进行渗透处理。在用枸橼酸盐抗原回收液(E673001，Sangon Biotech)阻断前需要进行抗原回收步骤。用PBS冲洗后，用PBST中1％BSA封闭切片。然后将抗Pax7(发育研究杂交瘤库)在4℃下培养过夜。将Alexa Fluor 488或594结合的二抗在RT下培养1小时，然后用PBS洗涤3次10分钟。细胞核用DAPI和二抗染色。对于其他免疫荧光染色，分别使用抗eMHC(DevelopmentalStudies Hybridoma Bank)和抗层粘连蛋白(Sigma)抗体作为主要抗体。载玻片由蔡司LSM880在室温下装载和显示。

肌肉再生

肌肉再生按照先前方案进行(Ge等人，2011；Ogura等人，2015)。为了诱导急性肌肉损伤，用异氟醚麻醉小鼠，并向TA肌肉注射BaCl₂(100μl 1.2％wt/vol盐水，Sigma)。另一个TA注射生理盐水(100μl)作为对照。然后在注射后指定的时间点采集肌肉，以评估再生和修复过程。在一个实验中，给老鼠喂食。在一个实验中，小鼠在第3天腹腔注射BrdU(每只小鼠100毫克)，肌肉注射1.2％BaCl₂(Ogura等人，2015年)。在指定的时间点，从安乐死小鼠身上采集TA肌肉进行生化和组织学研究。

卫星细胞的分离

如前所述制备卫星细胞(Gromova等人，2015)。分离6～8周龄小鼠后肢肌肉，切碎，制成肌肉悬液。首先在37℃水平摇床上用含5％马血清的DMEM中的II型胶原酶(700单位，Life Technologies，

目录号：17101-015)消化组织90分钟。然后用II型胶原酶(100单位/ml最终浓度)和分散酶II(2U/ml；Roche)在第二次消化中培养消化的肌肉持续30分钟，用力摇晃，直到大部分方块消失。完全消化的肌肉通过40μm尼龙细胞过滤器(Thermo-Fisher)过滤，并洗涤得到单核细胞悬浮液。分离的细胞在培养基(添加10％胎牛血清的DMEM，GlutaMAXTM补充剂，1％青霉素-链霉素)中培养，37℃，2小时，去除成纤维细胞。然后收集上清液并在室温下以300g离心5min。收集肌肉卫星细胞并在F10基础培养基(含15％FBS和2.5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(PeproTech)的F10培养基)和胸腺细胞条件培养基(含10％FBS的F10培养基：胸腺细胞培养基＝1:1)中的胶原涂层培养皿上培养。每隔一天更换一次培养基。

条件培养基

从SD雌性大鼠(200-250g，南京医科大学动物核心实验室)中分离胸腺和脾脏细胞。简单地说，分离的脾脏和胸腺通过一个70微米的细胞过滤器压缩，并用红细胞溶解缓冲液去除红细胞。细胞在RPMI 1640培养基(RPMI 1640(Invitrogen)中以1×10⁷个细胞/ml的速度培养，并添加10％FBS、1％l-谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素以及50μMβ-巯基乙醇)和2.5μg/ml刀豆球蛋白A(Concanavalin A，ConA；Sigma)激活2天。为了收集条件培养基，通过离心丢弃细胞。上清液经0.22μm滤膜压滤去除细胞碎片。有ConA的条件培养基称为TCM-con，无ConA的条件培养基称为TCM。

细胞增殖试验

按照制造商的说明(C10229，Thermo Scientific)进行EdU分析。将生长在盖玻片上的卫星细胞在含10uM EdU的培养基中培养一定时间。然后用PBS洗涤细胞并用4％多聚甲醛固定15分钟。使用细胞计数试剂盒-8(20118，SUDGEN)进行细胞计数测定。简言之，将细胞接种在96孔板中并培养指定时间，然后将试剂盒处理4小时(Chen等人，2019)。在450nm处用吸光度法测定增殖，在650nm处用背景减法测定增殖。对于抗BrdU染色，冷冻肌肉样品用1MHCl冰上处理10分钟。接下来，在室温下用2M HCl处理样品10分钟，然后在37℃下处理20分钟，然后在0.1M pH 8.5的Na₂B₄O₇缓冲液中洗涤(Wang等人，2012)。然后在阻断后在4℃湿化条件下将一抗培养过夜。

细胞移植

为了诱导肌肉损伤，在移植前24小时将BaCl₂(Sigma-Aldrich)注射到C57BL/6小鼠的TA肌肉中。将用基础培养基或条件培养基培养的独立C57BL/6-EGFP转基因小鼠来源的卫星细胞直接注射到TA肌肉中(Ishii等人，2018)。

实施例1，胸腺是骨骼肌再生所必需的为了研究胸腺在肌肉生长中的作用，我们从成年小鼠体内取出胸腺(Novoseletskaya et al.，2015；Vianna et al.，2016；Wainwrightet al.，2011)。术后4个月，与假手术对照组相比，小鼠体重减轻，但其瘦体重是相同的(p>0.05)(图1，A)。术后7个月和8个月，手术小鼠的体重和瘦体重均恢复到对照水平(图1，B和C)。各组肌肉的组织结构也具有可比性(图1，D)。这一结果表明，去除胸腺并不影响骨骼肌的生长。

然后我们用同样的动物模型研究胸腺在骨骼肌再生中的潜在作用。手术小鼠(胸腺切除术后7天)胫骨前肌注射100ul氯化钡(BaCl₂)，然后进行肌肉检查。注射后5天，切除胸腺导致受伤TA肌肉重量显著增加(图1，E)。TA肌肉组织学HE染色显示，这些肌肉浸润大量的炎性细胞和成肌细胞，而观察到较少的再生纤维和中心核(图1，F)。这一结果表明胸腺切除后肌肉再生能力受到抑制。

为了进一步验证抑制再生，我们测量了损伤肌肉中含有eMHC的纤维的比率。未损伤的肌肉eMHC阳性纤维数目在胸腺切除组和对照组中没有差别(图2，A)。然而，BaCl₂损伤后，胸腺切除组肌肉内的eMHC+纤维数量明显少于对照组，且纤维面积较小(图2，B和C)。我们还检测了Myh3、MyoD和MyoG等再生相关基因，并观察到mRNA和蛋白质水平的显著降低(图2，D-H)。综上所述，我们得出结论，胸腺切除导致肌肉再生能力下降。

实施例2，胸腺调节骨骼肌再生过程中的卫星细胞池

Pax7是一种在静止或激活的卫星细胞中表达的特异性转录因子，通常用作特异性标记物。我们通过测量Pax7蛋白或mRNA来评估受损肌肉中的卫星细胞池。在没有BaCl₂处理的情况下，对照组和切除胸腺的小鼠的肌肉都有一些类似于假手术组的卫星细胞(Pax7+)(图3，A和B)。然而，在损伤后，对照组小鼠损伤肌肉中的卫星细胞数量显著增加，而切除胸腺的小鼠的卫星细胞数量略有增加(图3，B)。对再生肌肉中Pax7 mRNA的测量显示了一致的结果(图3，C)。同时，我们用Brdu标记BaCl₂损伤后的增殖细胞，发现再生骨骼肌中Brdu阳性细胞核显著减少(图3，D和E)。这也支持胸腺的去除显著减少了骨骼肌再生所需的卫星细胞池。

实施例3，胸腺细胞培养直接促进卫星细胞体外扩增

胸腺切除小鼠的卫星细胞池的改变促使我们推测某些从胸腺释放的因子有助于卫星细胞的增殖。因此，我们在体外培养大鼠胸腺细胞48小时，加入或不加刀豆球蛋白(ConA)刺激。收集所得培养基作为胸腺条件培养基(TCM和TCM-ConA)培养卫星细胞。与TCM共培养3d后，卫星细胞开始在小球中快速生长。然而，当与TCM-ConA一起培养时，细胞生长相对缓慢，出现更多的贴壁细胞(图4)。这一观察结果表明，无刺激的胸腺细胞具有更强的促进卫星细胞增殖的能力。由于脾淋巴细胞也调节卫星细胞增殖，我们将脾细胞条件培养基(SCM)与TCM进行了比较。SCM和SCM-ConA对卫星细胞增殖的促进作用均弱于TCM(图8，A-C)。从脾脏切除的动物身上观察到，脾脏缺乏并不影响肌肉再生，这也支持了这一观点(图8，D-F)。

为了鉴定TCM中的有效成分，我们使用DEAE-sepharose FF柱将无血清TCM应用于HPLC色谱(图9)。在洗脱组分中，有几个组分的活性较弱，其中组分6(组分6为4.89％-10.58％mM Nacl/pH8.0 Tris-Hcl洗脱组分)的活性相对较高。LC-MASS分析表明该组分由丰富的酶、骨架蛋白和一些细胞因子组成(图9)。我们用超速离心法从无血清TCM中制备了外泌体，并测定了其对卫星细胞生长的活性，但没有发现活性。因此，胸腺细胞产生的活性成分可能是由包括外泌体的混合物组成的。

实施例4，胸腺细胞调控卫星细胞增殖的特性研究

胸腺是一个中枢免疫器官，包含非淋巴细胞和处于不同发育阶段的淋巴细胞。为了确定哪种类型的细胞调控卫星细胞增殖，我们用流式细胞仪将胸腺细胞分为3个亚组：CD45+CD3+、CD45+CD3-和CD45-CD3-(图10)。胸腺细胞中CD45+CD3-细胞占84.91％，CD45+CD3+细胞占10.30％，CD45-CD3-细胞占4.786％(图10)。我们调节淋巴细胞(CD45+CD3+)和非淋巴细胞(CD45+CD3-或CD45-CD3-)胸腺细胞的浓度与原始胸腺细胞混合物中的浓度相同，制备淋巴细胞TCM(TCM-L)和非淋巴细胞TCM(TCM-NL)。结果表明，TCM-L和TCM-NL均能促进卫星细胞的生长，但前者的促进作用更为明显(图6，B)。结果表明，淋巴细胞和非淋巴细胞胸腺细胞均能促进卫星细胞增殖。在淋巴细胞胸腺细胞中，CD4+CD8+细胞占10.55％，CD4-CD8+细胞占18.78％，CD4+CD8-细胞占67.37％，Treg细胞占18.37％(图5，C)。为了比较各亚群对卫星细胞增殖的贡献，我们采用等体积的TCM(TCM-LCD4+8+、TCM-LCD4+、TCM-L8+和TCM-Treg+)进行卫星细胞培养。TCM-LCD4+8+、TCM-LCD4+和TCM-LCD8+对细胞生长的作用相当，而TCM-Treg的作用较弱(图5，D)。这一结果表明，0.2％CD4+CD8+与5.3％CD4+CD8-和1.8％CD4-CD8+具有相当的扩增效果，并且比0.2％Treg具有更大的扩增效果。因此，CD4+CD8+胸腺细胞对卫星细胞扩增表现出较高的活性。

实施例5，经TCM扩增的卫星细胞能够整合到再生肌肉中

由于Pax7和MyoD的动态表达主要反映卫星细胞的分化状态(Kuang和Rudnicki，2008；Sambasivan和Tajbakhsh，2007；Tedesco等人，2010)，我们测量了不同条件培养基培养的卫星细胞中的Pax7/MyoD。当与TCM(不含conA)培养5天时，约40％的卫星细胞为Pax7^hiMyoD^low(表达高水平的Pax7和低水平的MyoD)，约10％为Pax7^hiMyoD^hi，50％为Pax7^lowMyoD^low+Pax7^lowMyoD^hi(图4，E和F)。相反，用TCM-conA培养5天后，几乎没有检测到Pax7^hiMyoD^low卫星细胞。这一观察结果表明，TCM主要扩增Pax7^hiMyoD^low群体。也就是说，TCM具有促进Pax7+细胞增殖的作用。由于PAX7^hiMyoD^low细胞代表未激活或静止的卫星细胞，我们随后通过掺入5-乙炔基-20-脱氧尿苷(EdU)来测试其分裂能力。令我们惊讶的是，大约15％的细胞是Pax7^hiMyoD^lowEdU+，而40％的细胞是Pax7^hiMyoD^hi EdU+(图6)。我们还分离了新鲜的EDL肌纤维外植体，培养2天，让卫星细胞在原位纤维上生长。同样，在TCM培养基中培养的Pax7^hiMyoD^hiEdu+细胞数也高于对照组。这一结果表明，经TCM扩增的PAX7^hiMyoD^low细胞具有较强的分裂能力。

为了评价TCM扩增卫星细胞的功能，我们将这些细胞移植到损伤的肌肉中，并测量它们在肌纤维中的掺入。将C57BL6-EGFP小鼠培养的10⁴-10⁵个细胞注入TA肌，第3代(P3，约1周)取TCM培养细胞。由于对照培养基不能将卫星细胞传至P3，培养后48小时，在P0处收获对照培养基细胞。移植前一天，首先给受体肌肉注射BaCl₂启动再生过程。移植后2个月，检测再生纤维中EGFP细胞的掺入情况。移植TCM扩增细胞后，与对照组相比，再生肌纤维具有更多EGFP阳性纤维(图7，A和B)。在第二次肌肉损伤的情况下也得到了类似的结果(图7，A和C)。这一观察结果表明，在TCM中培养的卫星细胞具有很强的整合肌纤维的能力。

讨论

胸腺是人体的中枢免疫器官，其基本作用与淋巴细胞发育有关(Gordon andManley，2011；Shanley et al.，2009)。在本报告中，我们观察到胸腺切除的动物对骨骼肌损伤的再生反应有显著的抑制作用，并且卫星细胞池也减少了。这一观察清楚地揭示了胸腺在骨骼肌再生中的新作用。鉴于再生减少和卫星细胞池是骨骼肌衰老的主要致病因素，胸腺可能是骨骼肌衰老过程中必不可少的抑制剂。由于淋巴细胞(CD45-CD3+)和非淋巴细胞(CD45+CD3-)胸腺细胞都能通过释放因子刺激卫星细胞增殖，因此胸腺在肌肉再生中的作用可能是通过一种远程机制实现的。我们在这里观察到，胸腺切除不影响受损肌肉中淋巴细胞浸润的证据可能进一步支持这一观点。此外，由于去除胸腺对肌肉生长没有明显影响，胸腺似乎主要影响卫星细胞和再生，但对肥大过程没有影响。结合目前的知识，我们推测了骨骼肌中胸腺功能调节的方案。在胚胎和出生后发育阶段，胸腺促进卫星细胞增殖，以满足肌肉快速发育的需要。成年后，胸腺开始退化，维持卫星细胞池，以应对肌肉老化和损伤。在老年阶段，胸腺严重退化，骨骼肌由于卫星细胞的丢失而开始逐渐萎缩。上调胸腺功能可能是抑制骨骼肌衰老的新策略。

序列表

<110> 南京大学

<120> 胸腺细胞在培养肌肉干细胞中的用途

<130> 209970

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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gccgcctgag caaagtgaat g 21

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Claims

1.胸腺细胞、其培养物、分泌物和/或其提取物在选自以下一项或多项中的用途或在制备用于选自以下一项或多项的试剂盒中的用途：促进肌肉再生和/或修复、增加肌肉纤维的单位横截面积、增加肌肉纤维的数量、上调肌肉组织或细胞中的成肌调节因子、上调肌肉组织或细胞中的肌球蛋白重链MHC、增加肌肉干细胞的数量、提高肌肉干细胞的增殖、维持肌肉干细胞池、促进肌肉干细胞的再生相关基因的表达、抑制肌肉干细胞的激活和/或分化、维持肌肉干细胞的干性、促进骨骼肌前体细胞在体外的扩增、抑制骨骼肌衰老，

优选地，

所述胸腺细胞培养物是培养胸腺细胞的含细胞或无细胞培养基，和/或

所述胸腺细胞分泌物和提取物是经培养的胸腺细胞的分泌物和提取物，和/或

所述再生相关基因包括Myh3、MyoD和/或MyoG，和/或

所述成肌调节因子包括Myod和/或myogenin。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胸腺细胞是胸腺未成熟淋巴细胞，和/或所述肌肉干细胞是肌卫星细胞或成肌细胞，

优选地，所述胸腺细胞是胸腺未成熟T细胞，和/或所述肌肉干细胞肌肉干细胞是Pax7阳性细胞。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，

培养胸腺细胞的培养基包含基础培养基，并且任选包含选自以下的一种或多种组分：FBS、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、β-巯基乙醇、刀豆球蛋白A，和/或

所述胸腺细胞分泌物通过如下步骤获取：(1)对经培养的胸腺细胞的混合物进行固液分离，和任选的(2)阴离子柱层析分离、高效液相层析和/或质谱，和/或

所述胸腺细胞提取物通过以下步骤获取：(1)对经培养的胸腺细胞进行细胞破碎，(2)固液分离，和任选的(3)DEAE纤维素阴离子柱层析分离、高效液相层析、质谱。

4.一种条件培养基，包含胸腺细胞、其培养物、分泌物和/或其提取物，和任选的基础培养基，

优选地，

所述基础培养基包含F10培养基、DMEM培养基、F12培养基或RPMI 1640培养基，和/或

所述条件培养基中胸腺细胞培养物占1-100体积％，和/或

所述条件培养基还包含FBS和/或碱性成纤维细胞生长因子，和/或

所述胸腺细胞分泌物和提取物是经培养的胸腺细胞的分泌物和提取物。

5.如权利要求4所述的条件培养基，其特征在于，所述胸腺细胞是胸腺未成熟淋巴细胞，

优选地，所述胸腺细胞是胸腺未成熟T细胞。

6.如权利要求4或5所述的条件培养基，其特征在于，

7.一种培养肌肉干细胞的方法，包括使用权利要求4-6中任一项所述的条件培养基培养肌肉干细胞，

优选地，

所述肌肉干细胞是肌卫星细胞或成肌细胞，和/或

培养肌肉干细胞的温度为30-40℃，和/或

在5％CO₂的条件下培养肌肉干细胞，和/或

培养的肌肉干细胞具有选自以下的一个或多个特征：成肌调节因子上调、肌球蛋白重链MHC上调、数量增加、增殖提高、再生相关基因的表达提高、激活和/或分化受到抑制、干性得到维持。

8.一种上调肌肉干细胞的成肌调节因子、上调肌肉干细胞的肌球蛋白重链MHC、上调肌肉干细胞的再生相关基因的表达、增加肌肉干细胞的数量、提高肌肉干细胞的增殖、抑制肌肉干细胞的激活和/或分化、维持肌肉干细胞干性的方法，包括使用权利要求4-6中任一项所述的条件培养基培养肌肉干细胞，

优选地，

培养肌肉干细胞的温度为30-40℃，和/或

在5％CO₂的条件下培养肌肉干细胞。

9.一种药物组合物，包含由权利要求7所述方法获得的肌肉干细胞和药学上可接受的辅料。

10.胸腺细胞、其培养物、分泌物或提取物、和/或由权利要求7所述方法获得的肌肉干细胞在制备药物中的用途，所述药物用于增加肌肉纤维的数量或单位横截面积、抑制骨骼肌衰老、细胞移植、肌肉训练、美体、治疗或预防肌肉疾病、治疗或预防肌肉损伤、治疗或预防肌肉流失、基因编辑，

优选地，所述肌肉疾病是遗传性肌肉疾病，例如杜氏肌营养不良、贝克肌营养不良、面肩肱型肌营养不良症、肢带型肌营养不良症2A和2B型、Miyoshi肌病、杆状体肌病、皮肌炎、多发性肌炎、包涵体肌炎或中央核肌病。