CN116004531A

CN116004531A - 一种经血干细胞培养基及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN116004531A
Application number: CN202310164829.4A
Authority: CN
Inventors: 史辛艺
Original assignee: Shenzhen New Sail Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen New Sail Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-02-26
Filing date: 2023-02-26
Publication date: 2023-04-25

Abstract

一种经血干细胞培养基及其制备方法和用途，包括：所述的培养基采用DMEM/F12作为基础培养基，向其中加入青霉素、链霉素、姜黄素、复合氨基酸、葡萄糖、红色诺卡式菌细胞壁骨架等。此培养基不仅能保证经血来源间充质干细胞的大量增殖，还可以促进外泌体的分泌及活性。此外将间充质干细胞与其分泌的外泌体组合物可应用于生殖系统、呼吸系统等方面的疾病。

Description

一种经血干细胞培养基及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，具体地，本发明提供了一种经血干细胞培养基及其制备方法和用途。

背景技术

经血来源干细胞是从女性月经血中提取的，具有多向分化潜能的间充质干细胞。其具有很强的增殖能力，在体外倍增时间为数小时，在多次传代下仍能保证细胞核型和染色体稳定，有定向趋化能力，也可分化为多种功能性细胞，可调节免疫反应并以旁分泌途径分泌各种生物活性成分，促进组织和细胞再生。

经血来源干细胞外泌体是经血来源干细胞发挥旁分泌功能的主要物质，属于胞外囊泡的一种，粒径大小为30-150nm，其中含有脂质、RNA和蛋白质，从间充质干细胞中提取的外泌体在组织再生和损伤恢复方面具有与其来源细胞相同的功效。

经血来源间充质干细胞已被应用在很多方面，包括生殖系统、神经系统、呼吸系统中等。经血来源干细胞外泌体虽然不具有间充质干细胞所具有的的分化再生能力，但其具有其来源细胞相同的功效，并且其降低了经血来源干细胞治疗发生免疫排斥、栓塞或肿瘤形成的风险。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种经血来源间充质干细胞培养基。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种经血来源间充质干细胞培养基，包括以下成分：DMEM/F12、青霉素、链霉素、姜黄素、复合氨基酸、红色诺卡式菌细胞壁骨架、葡萄糖、维生素、pH缓冲剂。

所述的经血来源间充质干细胞培养基组成成分为，按照质量百分比：60-80％DMEM/F12、1-3％青霉素、0.5-2.3％链霉素、1.3-2.8％姜黄素、5-13％复合氨基酸、3-8％红色诺卡式菌细胞壁骨架、8-13％葡萄糖、3-7％维生素、3-5％pH缓冲剂。

优选的，所述的复合氨基酸为脯氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苏氨酸、盐酸精氨酸、天冬氨酸的等质量比混合物。

进一步优选的，所述的维生素为生物素、烟酸、叶酸，其质量比为(1-5)：(1-3)：1。

优选的，所述的pH缓冲剂为碳酸氢钠。

进一步地，本发明还提供了一种经血来源间充质干细胞培养方法，其步骤包括：(1)将原代经血来源间充质干细胞用完全培养基在37℃、5％CO₂条件下培养，当原代间充质干细胞长至密度为85-95％时，将其进行消化传代，扩大培养；(2)将传代培养的细胞以每孔300000-500000个细胞接种在含有本发明制备的干细胞培养基的8孔板中培养，培养过程中将其使用低功率MHz级声辐射进行处理30-50分钟，处理完毕后，培养4天(37℃、5％CO₂)；(3)经过离心、过滤分离外泌体及间充质干细胞，使用胎盘蓝染液测定细胞计数。

优选的，其所述的传代培养为：将培养的原代细胞重新接种在本发明制备的的培养基中，将其在37℃、5％CO₂条件下培养3天。

优选的，其所述的低功率-MHz级声辐射的功率在2-4W之间，频率为10MHz。

更进一步的，本发明提供了一种治疗宫腔粘连、肺纤维化、肺损伤的干细胞组合物，其组成成分包括经血来源间充质干细胞及其外泌体。

宫腔粘连是造成妇女不孕的主要原因之一，目前主要依靠手术治疗，但中重度宫腔粘连的术后复发率很高。目前已在临床试验中证实移植自体经血来源干细胞可改善薄型子宫内膜症状，使患者能够利用辅助生殖技术受孕，且经血来源干细胞与富血小板血浆联合应用可提升治疗效果。也有研究发现经血来源干细胞是通过激活Hippo/TAZ通路来改善宫腔粘连症状的。此外，经血来源干细胞的胞外囊泡(经血来源干细胞-细胞外囊泡)也能安全有效地促进子宫内膜的修复。

宫腔粘连也继发于宫腔内炎症，促炎因子白细胞介素6和干扰素γ增加负反馈地使基质金属蛋白酶活性下降，促进了子宫内膜纤维化的产生，经血来源干细胞具有比脐血间充质干细胞更强的促进基质金属蛋白酶表达的能力，可能是治疗宫腔粘连的原因之一。

而姜黄素和红色诺卡式菌细胞壁骨架能够与经血来源的间充质干细胞上的T钙粘蛋白结合，刺激了外泌体的产生和分泌。本研究团队发现，经过姜黄素和红色诺卡式菌细胞壁骨架刺激的经血来源间充质干细胞的外泌体的分泌量相比于未刺激的间充质干细胞的外泌体分泌量，产量增加了三倍之多。

本发明与现有技术相比，有以下优点及益处：

(1)常见的培养基中大部分培养基中含有动物胚胎血清，动物血清中含有病毒，会造成传播病毒的风险。本发明制备的培养基将动物血清替换为复合氨基酸，能够为细胞繁殖提供营养物质，并且降低了传播病毒的风险。

(2)本发明中含有的姜黄素和红色诺卡式菌细胞壁骨架，姜黄素和红色诺卡式菌细胞壁骨架能够与经血来源的间充质干细胞上的T钙粘蛋白结合，刺激了外泌体的产生和分泌，还出乎预料地增强了外泌体的活性。

(3)本发明制备的培养基配合本发明提供的培养方法，二者存在协同作用，能够刺激间充质干细胞大量的分泌外泌体。

附图说明

图1为样品3制备的培养基培养的原代间充质干细胞细胞样貌图。

图2为样品3制备的培养基培养的P5代间充质干细胞细胞样貌图。

图3为样品3制备的培养基制备的外泌体的TEM图。

图4为外泌体数量与粒径的关系图。

图5为不同培养基的粒径峰值下的粒径的数量图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1培养基的制备

样品1：本样品提供了一种经血干细胞培养基，包括以下质量分数的组分：74％DMEM/F12、1％青霉素、1％链霉素、2％姜黄素、5％复合氨基酸、3％红色诺卡式菌细胞壁骨架、8％葡萄糖、3％维生素、3％pH缓冲剂。

其中，复合氨基酸为脯氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苏氨酸、盐酸精氨酸、天冬氨酸；维生素为生物素、烟酸、叶酸，其质量比为2.5：3：1；pH缓冲剂为碳酸氢钠。

样品2：本样品提供了一种经血干细胞培养基，包括以下质量分数的组分：67％DMEM/F12、1％青霉素、1％链霉素、2.5％姜黄素、7.5％复合氨基酸、5％红色诺卡式菌细胞壁骨架、10％葡萄糖、3％维生素、3％pH缓冲剂。

样品3：本样品提供了一种经血干细胞培养基，包括以下质量分数的组分：68％DMEM/F12、1％青霉素、1％链霉素、1.5％姜黄素、7.5％复合氨基酸、5％红色诺卡式菌细胞壁骨架、8％葡萄糖、5％维生素、3％pH缓冲剂。

样品4：本样品提供了一种经血干细胞培养基，包括以下质量分数的组分：69.5％DMEM/F12、1％青霉素、1％链霉素、7.5％复合氨基酸、5％红色诺卡式菌细胞壁骨架、8％葡萄糖、5％维生素、3％pH缓冲剂。

样品5：本样品提供了一种经血干细胞培养基，包括以下质量分数的组分：73％DMEM/F12、1％青霉素、1％链霉素、1.5％姜黄素、7.5％复合氨基酸、8％葡萄糖、5％维生素、3％pH缓冲剂。

样品6：本样品提供了一种经血干细胞培养基，包括以下质量分数的组分：74.5％DMEM/F12、1％青霉素、1％链霉素、7.5％复合氨基酸、8％葡萄糖、5％维生素、3％pH缓冲剂。

实施例2细胞的培养

将经血来源的间充质干细本实施例所用来自南昌大学第二附属医院赠送。将经血来源的间充质干细胞以5000个细胞/cm²接种于黏附细胞用T25烧瓶，所用培养基为完全培养基，培养3天(37℃、5％CO₂)后进行传代，传代所使用的培养基分别为实施例1中样品1-6制备的培养基、含10％FBS DMEM/F12培养基、SF培养基(味之素公司、StemFit ForMesenchymal Stem Cell)，进一步传代培养4天(37℃、5％CO₂)后回收上清液。采用活细胞成像系统测定至细胞静止为止的时间。

具体传代方法为：1、吸出原培养液；2、加入2ml左右PBS，轻轻晃动培养瓶润洗细胞，吸出PBS丢弃；3、加入1ml左右胰酶，轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞，放入培养箱消化；4、消化时间跟据细胞特性有所不同，显微镜下看到细胞块中间的细胞明显分离变圆，侧立培养瓶细胞可以滑落时可终止消化，全程不要拍打培养瓶；5、加入3ml含血清的培养基终止消化，吹打细胞使之脱落并在液体里反复吹打使细胞，使之尽量呈单颗细胞的悬浮液，这时可以在显微镜看下；6、收集细胞悬液离心，1200rpm(约250g)3分钟，离心完吸出上清丢弃。7、加入实验所需的培养基，吹打几下混匀细胞即可，按需接种到新培养瓶，补足培养基，拧松瓶盖或使用透气瓶盖进行培养。8、检查培养箱二氧化碳，温度和水盘。

此外，将传代培养后的细胞采用0.4％的胎盘蓝溶液和细胞计数器测定细胞数目，以测定细胞的活性。

测得的结果见表1。

表1细胞活性检测

如表1所示，可知用样品1-3制备的培养基培养的间充质干细胞相对于用DMEM/F12培养基、SF培养基培养基的间充质粘附于培养容器为止的短。与此同时，其他样品制备的培养基粘附于培养容器为止的时间要长于样品1-3制备的培养基。另外，从各培养基样品的吸光度可看出，样品1-3制备的培养基的吸光度要大于其它培养基的吸光度，这说明样品1-3的培养基中细胞增殖的数量多。尤其值得注意的是，样品3的效果尤其好，其增殖速度快，细胞密度高。

由以上结果可明确，样品1-3制备的培养间充质干细胞粘附所需的时间更多，增殖的细胞数目更多，这说明，样品1-3制备的培养基培养的间充质干细胞的增殖活性高。

实施例3外泌体含量的测定

(1)将原代经血来源间充质干细胞用完全培养基在37℃、5％CO₂条件下培养，当原代间充质干细胞长至密度为85％时，将其进行消化传代；传代培养步骤为：将培养的原代细胞重新接种在实施例1制备的培养基中，将其在37℃、5％CO₂条件下培养。(2)将传代培养的细胞以每孔300000个细胞接种在8孔板中培养，培养过程中将其使用低功率(4W)MHz级声辐射(谐振频率f＝10MHz)进行处理30分钟，处理完毕后，培养4天(37℃、5％CO₂)；(3)经过离心，上清液通过0.22μm过滤器过滤分离外泌体及间充质干细胞，使用胎盘蓝染液测定细胞计数。

其中本发明采用超速离心的方法分离外泌体。超离程序设为(1)10000g 1h，(2)100000g 4h，温度条件设定为4℃。

对照组：培养基为样品3，在培养过程中不进行任何处理。

将本实施例收集的外泌体进行固定，铜网置于疏水膜上，吸取固定完毕的外泌体悬液加在通往表面多余液体用试纸小心吸去。用1％醋酸氧铀溶液室温条件下复染5min，蒸馏水清洗染液，吸干多余液体后灯下烤干，在TEM下观察外泌体形态。

使用ZetaView仪器测量MenSCs-Exos的颗粒直径和浓度。仪器使用110nm的聚苯乙烯颗粒对仪器进行校准。将MenSCs-Exos用PBS适当稀释后注射到样品室中，检测获得测量值，对直径数据进行作图分析。

图1、图2分别为实施例3中在样品3制备的培养基中培养的原代经血来源间充质干细胞和P5间充质干细胞在显微镜下观察到的图像。从图中可以看出，原代和P5的间充质干细胞呈现纺锤形或梭形，这说明培养的细胞还具有较高的分化潜能，干细胞的干性保持良好。

图3为样品3制备的培养基制备的外泌体的TEM图。从图中可以看出，分泌的外泌体主要为颗粒状，直径在200nm左右。

图4为外泌体数量与粒径的关系图。从图中可以看出，经血来源间充质干细胞的粒径大小介于30-150nm之间，粒径峰值为127nm。

图5为不同培养基的粒径峰值下的粒径的数量图。从图5中可以看出，样品3组的在粒径峰值下，粒径数量在1700000左右，而不经过低功率(4W)MHz级声辐射处理的的对照组的粒径数量在985000左右，DMEM/F12培养基的外泌体的粒径数量在1200000左右。从数据可以看出，样品3制备的培养基结合低功率(4W)MHz级声辐射处理，能够刺激间充质干细胞大量分泌外泌体。但是不经过低功率(4W)MHz级声辐射处理的对照组并没有这样的效果。同时经过低功率(4W)MHz级声辐射处理的DMEM/F12培养基中的外泌体的数量也不能达到样品3。这说明本发明制备的样品3能与低功率(4W)MHz级声辐射发生协同作用，可能原因之一是在低功率(4W)MHz级声辐射下，样品3中的特定比例的姜黄素与红色诺卡式菌细胞壁骨架能够与经血来源的间充质干细胞上的T钙粘蛋白结合，刺激了外泌体的产生和分泌。

实施例4外泌体活性检测

(1)大鼠模型的建立

大鼠选择SPF级别的10周龄雌性大鼠，均购自北京华阜康生物科技股份有限公司(SCXK(京)2014-0004)。SD大鼠全程饲养在SP级房，分笼合理，饲养环境湿度、温度和光照适宜。

手术全程在无菌房内进行，并且保证全程遵守无菌原则，每次手术前将所用到的手术器械在75％的酒精浸泡30分钟。采用阴道涂片检查大鼠动情期，称量大鼠的体重，按照3mL/kg的剂量采用10％水合氯醛进行麻醉，麻醉后用剃毛器剃净大鼠下腹部的毛，再用酒精对大鼠下腹部进行消毒，最后将大鼠仰卧，置于恒温手术台。

在大鼠腹部做一个长度约为1.5cm的切口，此切口能够使大鼠的子宫中段显露出来。再于子宫中段远离血管一侧做一约2mm切口，将改良的16G注射器针头探入宫腔，刮除大鼠的子宫内膜。

刮除干净后，缝合子宫切口，用1mL无菌注射器抽取适量生理盐水，从子宫的卵巢端进针冲洗宫腔，可见大鼠阴道口有生理盐水流出，确认缝合处无渗漏后，用无菌生理盐水冲洗腹腔，逐层关腹。待大鼠显露出苏醒迹象后，将其放回鼠笼单独饲养。

(2)大鼠模型的治疗

选取80只造型成功的大鼠，将其随机分为4组，分别为对照组、样品组、DMEM/F12组、经血干细胞组，每组20只。

在造型手术成功七天后，将各组的大鼠腹部切开暴露子宫，用32G注射器延子宫长轴远离血管的一侧进行多点注射。样品组每只大鼠注射50μL外泌体悬液(作为示例，采用实施例1中的样品3，按照实施例3的方法制备，外泌体含量为400μg/ml)，DMEM/F12组每只大鼠注射50μL外泌体悬液(采用DMEM/F12培养基，按照实施例3的方法制备，外泌体含量为400μg/ml)，经血干细胞组每只大鼠注射50μL经血干细胞悬液(约500000个细胞)，对照组每只大鼠注射相同体积的无菌磷酸盐缓冲液。

冲洗大鼠腹腔后关腹，等到大鼠麻醉效果消失，大鼠苏醒后，将其分笼饲养，在饲养达到5天、10天后麻醉处死，取材。

(3)采用HE染色方法检测子宫内膜的腺体数量/

HE染色方法：

1.将子宫组织置于包埋盒中，按照浓度梯度由低到高进行脱水处理，75％、85％、95％乙醇处理1h、100％乙醇处理30min、100％乙醇处理20min。

2.将脱水处理后的子宫组织进行透明处理，采用二甲苯处理两次，分别处理10min、5min。

3.将石蜡置于包埋机中，预先打开包埋机，等待其中的石蜡融化后包埋子宫组织，置于冷台上凝固。

4.将得到的蜡块采用手术刀修正后固定在标本台上，用切片机制备成5μm的石蜡切片，将切片于65℃烤箱中过夜。

5.将切片浸泡在二甲苯中三次，每次10min，处理完毕后进行脱水处理。将切片按照浓度梯度由高到低进行脱水处理，100％乙醇处理两次，每次5min、95％、85％、75％乙醇处理5min，最后水洗5min。

6.将苏木素滴加至组织上染色10min，利用流动自来水返蓝30min，伊红染液对组织切片进行染色45s，水洗1min，显微镜下观察染色情况，颜色过深时可在75％酒精中浸泡洗脱部分染料。

7.再将切片脱水处理，依次浸于75％、85％、95％乙醇内30s，100％乙醇两次，每次2min，二甲苯两次，每次3min，用棉棒木棍蘸取中性树脂，轻轻滴加在玻片上，用盖玻片封片。

8.镜下观察子宫内膜腺体，并对其数量进行统计。

(4)实验结果

表2子宫内膜腺体数量(条)

	5天	10天
			对照组	11.1±1.4	13.6±1.1
样品3组	23.2±1.7	28.8±0.9
			DMEM/F12组	18.6±1.1	22.7±1.2
经血干细胞组	17.3±0.9	24.6±1.8
			健康小鼠	34.3±1.1	33.5±1.3

从腺体的数量结果可以看出，样品组第5天、10天的腺体数量与对照组、DMEM/F12组、经血干细胞组相比显著增加。腺体数据的结果显示，经过本发明制备的培养基培养的经血干细胞分泌的外泌体的活性要好于DMEM/F12组。此外在第五天至第十天的过程中，经血干细胞组的腺体增长的速率开始增加，这说明随着时间的推移，经血干细胞经移植后，能够稳定促进内膜再生，增加腺体的数量，而样品组即同等细胞数量分泌的外泌体能够在短时间内即具有更好的效果，长期效果表现也不俗。

Claims

1.一种经血干细胞培养基，其特征在于，所述的干细胞培养基成分包括：DMEM/F12、青霉素、链霉素、姜黄素、复合氨基酸、红色诺卡式菌细胞壁骨架、葡萄糖、维生素、pH缓冲剂。

2.如权利要求1所述的一种经血干细胞培养基，其特征在于，所述的干细胞培养基组成成分为：60-80％DMEM/F12、1-3％青霉素、0.5-2.3％链霉素、1.3-2.8％姜黄素、5-13％复合氨基酸、3-8％红色诺卡式菌细胞壁骨架、8-13％葡萄糖、3-7％维生素、3-5％pH缓冲剂。

3.如权利要求1或2所述的一种经血干细胞培养基，其特征在于，所述的复合氨基酸为脯氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苏氨酸、盐酸精氨酸、天冬氨酸中的一种或几种。

4.如权利要求1或2所述的一种经血干细胞培养基，其特征在于，所述的维生素为生物素、烟酸、叶酸中的一种或几种。

5.如权利要求1或2所述的一种经血干细胞培养基，其特征在于，所述的pH缓冲剂为碳酸氢钠、磷酸钠或者磷酸钾缓冲液。

6.一种经血来源间充质干细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将原代经血来源间充质干细胞用完全培养基在37℃、5％CO₂条件下培养，当原代间充质干细胞长至密度为85-95％时，将其进行消化，使用权利要求1-5任一项所述培养基进行传代扩大培养；(2)将传代培养的细胞以每孔300000-500000个细胞接种在8孔板中培养，培养过程中将其使用低功率-MHz级声辐射进行处理30-50分钟；(3)经过离心、过滤分离外泌体及间充质干细胞。

7.如权利要求6所述的一种经血来源间充质干细胞培养方法，其特征在于，其所述的传代扩大培养为：将培养的原代细胞重新接种在权利要求1所述的培养基中，将其在37℃、5％CO₂条件下培养。

8.如权利要求6所述的一种经血来源间充质干细胞培养方法，其特征在于，其所述的低功率-MHz级声辐射的功率在2-4W之间。

9.根据权利要求1-5任一项所述的一种经血干细胞培养基或权利要求6-8所述的一种经血来源间充质干细胞培养方法制备的间充质干细胞及其外泌体的组合物在医用产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述医用产品包括治疗宫腔粘连、肺纤维化、肺损伤等药物或注射剂中。