CN112569261A - 一种改善卵巢功能的组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改善卵巢功能的组合物,包括脐带间充质干细胞和脐带血CGF。通过卵巢多位点注入的给药方式,将干细胞和CGF的功能发挥至最大化,使得卵巢早衰模型大鼠卵巢重量、各级卵泡数和E2水平增加,而FSH水平及卵巢颗粒细胞凋亡率下降,Bax蛋白显著降低,Bcl2蛋白升高。本发明为临床治疗卵巢早衰,改善卵巢功能提供了有力工具。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域,更具体地,涉及一种改善卵巢功能的组合物及其应用。
背景技术
卵巢早衰是一种因卵巢功能退减引发的生殖系统内分泌疾病,其特征为血清雌激素水平下降、促性腺激素水平升高,多发于女性初潮后至40岁前。近年来卵巢早衰的发病率呈逐年升高趋势,在15~29岁、30~40岁中的发病率分别为0.1%、1~3%,其不同程度地影响了患者的身心健康。具体表现为卵巢功能下降的一些症状,如月经周期紊乱、月经量异常、生殖道炎症,还会伴随一系列的更年期症状,如皮肤松弛、易失眠、情绪焦躁等,严重影响妇女的正常生活。目前临床上多见的多囊卵巢综合征,其主要原因就是卵巢功能减弱导致卵泡发育异常,激素代谢紊乱引起的。对于这种疾病,常常采用的是口服或注射激素帮助卵巢短期内恢复排卵功能,并没有从根本上解决卵巢受损的问题,达不到彻底治愈的效果,病情始终反反复复,给患者带来心理和生理上的困扰。
随着干细胞治疗的兴起,尤其是对间充质干细胞研究的深入,给多种难治性疾病的治疗带来希望。间充质干细胞本身具有归巢属性,一方面可迁移至特定部位,如卵巢和子宫,并在其内存活生长,调控卵巢生理机能,另一方面通过分泌的多种细胞因子,抑制卵巢细胞凋亡,修复受损组织,补偿或替代部分卵巢细胞功能。目前南京鼓楼医院通过注射脐带间充质干细胞修复卵巢早衰,已有成功生产宝宝的案例。
中国专利CN201911158092.5公开了本发明公开了一种干细胞制剂和生长因子组合物,包括间充质干细胞制剂和自体CGF,间充质干细胞制剂联合应用自体CGF能够明显提高间充质干细胞促进软骨新生和修复的作用;能够增强间充质干细胞在炎症状态下的增殖和迁移能力,并且高分泌干细胞促进归巢、组织修复和再生以及免疫调节的细胞因子表达。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足,提供一种改善卵巢功能的组合物。
本发明的第一个目的是提供一种改善卵巢功能的组合物。
本发明的另一个作用是提供任一所述组合物在制备改善卵巢生理机能、延缓卵巢衰退和/或治疗卵巢早衰的药物中的应用。
发明人发现双侧卵巢注射UMSCs、UMSCs+CGF后,卵巢早衰模型大鼠卵巢重量、各级卵泡数和E2水平增加,而FSH水平及卵巢颗粒细胞凋亡率下降,与阳性对照组相比UMSCs、UMSCs+CGF组Bax显著降低,Bcl2蛋白升高。综上,UMSCs、UMSCs+CGF对改善大鼠卵巢早衰有疗效,其中UMSCs+CGF较UMSCs能更有效治疗卵巢早衰。
为了实现上述目的,本发明是通过以下技术方案予以实现的:
脐带间充质干细胞来源于分娩后的脐带,相较于其他MSCs,取材方便,不会对供者造成二次伤害,不受伦理、道德及法律方面的限制;病毒和细菌污染率低;UMSCs生长的组织环境单纯,体外容易分离、培养,可多次传代大量扩增;UMSCs免疫原性较低,利于异体移植;能够自我更新及定向分化。因此得到广泛而深入的研究。
CGF(Concentrate Growth Factors)即高度浓缩生长因子血纤维蛋白。含有多种生长因子,与一定量、高活性的人脐带间充质干细胞混合使用,脐带间充质干细胞起到种子细胞的作用,在机体环境诱导作用下向组织细胞分化,血浆起到营养作用,同时,CGF中各种高浓度有活性的生长因子可促进卵巢干细胞和脐带间充质干细胞的增殖分化,增加修复细胞数量,脐带间充质干细胞通过旁分泌和自分泌形式分泌生长因子又可以作用于卵巢干细胞及周围细胞,从而构成了一个良性循环,各自联合起到协同修复的效果,能有效的改善卵巢生理机能,延缓卵巢衰退。
因此本发明要求保护一种改善卵巢功能的组合物,包括脐带间充质干细胞和脐带血CGF。
优选地,所述脐带间充质干细胞和脐带血CGF的用量按照每2×107~6×107个脐带间充质干细胞数为和5~15ml脐带血CGF的比例。
更优选地,所述脐带间充质干细胞和脐带血CGF的用量按照每4×107个脐带间充质干细胞数为和10ml脐带血CGF的比例。
所述脐带血CGF的制备方法为:使用肝素钠抗凝负压管,抽取脐带血经变速离心系统离心后得到上层的PPP,中间的液态CGF和最底层为RBC,将注射器针头插入RBC层的最顶端,抽取液态CGF,制得CGF。按照每10ml全血保留2.5ml为CGF的量制备CGF
以上任一所述组合物在制备改善卵巢生理机能、延缓卵巢衰退和/或治疗卵巢早衰的药物中的应用,也属于本发明的保护范围。
优选地,所述组合物提升卵巢肿瘤和/或抑制卵巢重量降低。
优选地,所述组合物提升各级卵泡数和/或抑制各级卵泡数降低。
优选地,所述组合物提升E2水平和/或抑制E2水平降低。
优选地,所述组合物降低FSH水平和/或抑制FSH升高。
优选地,所述组合物降低卵巢颗粒细胞凋亡率和/或抑制卵巢颗粒细胞凋亡率升高。
优选地,所述组合物降低Bax蛋白和/或抑制Bax蛋白升高。
优选地,所述组合物提升Bcl2蛋白和/或抑制Bcl2降低。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明提供了一种改善卵巢功能的组合物,所述组合物为干细胞联合脐带血CGF复合制剂,通过卵巢多位点注入的给药方式,将干细胞和CGF的功能发挥至最大化,使得卵巢早衰模型大鼠卵巢重量、各级卵泡数和E2水平增加,而FS H水平及卵巢颗粒细胞凋亡率下降,Bax蛋白显著降低,Bcl2蛋白升高。本发明为临床治疗卵巢早衰,改善卵巢功能提供了有力工具。
附图说明
图1为显微镜下的脐带间充质干细胞细胞(40×)。
图2为脐带间充质干细胞三系分化图片。
图3为脐带间充质干细胞流式细胞学分析结果。
图4为脐带血离心分层后CGF所在位置。
图5为A、B、C、D四组Bax和Bcl2蛋白水平比较
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1脐带间充质干细胞分离培养
一、实验方法
取15~20cm长的新生儿脐带,要求妇产科健康足月剖腹产胎儿,孕妇HBV抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、支原体、抗巨细胞病毒抗体等检测均阴性。
6h内处理,无菌条件下用PBS洗涤至无血迹,纵向剖开,去除血管后剪碎至1mm×1mm×1mm大小组织块,将0.5ml脐带组织悬液加入75cm2培养瓶中,同时加入10ml无血清完全培养基,放入37℃、5%CO2培养箱中培养。第3天半量换液,第7天全量换液,于倒置显微镜下观察,待细胞生长至80%融合时,以0.05%胰蛋酶消化,按1:5传代,取生长状态良好的P3~P5代细胞后续使用。
二、实验结果
细胞形态学照片见图1、三系分化图片见图2及流式细胞学分析结果见图3。
脐带间充质干细胞的分离、扩增及鉴定结果显示检测符合脐带间充质干细胞的特征。
实施例2脐带血CGF的分离
一、实验方法
使用肝素钠抗凝负压管,抽取脐带血经变速离心系统离心后得到上层的PPP(贫血小板血浆),中间的液态CGF(富血小板血浆)和最底层为RBC(红细胞),将注射器针头插入RBC层的最顶端,抽取液态CGF,制得CGF。具体方法为:
1、取内含肝素钠的10ml采血管采集脐带血10ml,上下颠倒混匀,配平后于室温下200g离心10min(调节升速1,降速1)。
2、离心结束后,将5ml注射器自带的针头从采血管管盖插入(排气用),然后将5ml注射器与长针头连在一起,将5ml注射器与长针头连在一起,然后将长针头从管盖处扎入采血管,将针头伸到CGF层的位置的蓝点处(见图4,尽量不要吸到红细胞,在不吸取到红细胞的前提下,尽量靠近红细胞层),吸取蓝点以上全部血浆到新的5ml采血管中离心,500g离心10min(调节升速1,降速1)。
3、离心结束后,5ml采血管中液体分为2层,上层为PPP(贫血小板血浆),下层为CGF(富血小板血浆)。用注射器连接长针头,吸取上层血浆弃去,再将剩余的2.5ml血浆混匀,即为脐带血CGF。
同时进行全血及CGF中血小板计数,以确保GCF中血小板浓度是全血的4倍以上。
二、实验结果
本次实验采集10ml脐带血,脐带血全血中血小板和浓缩后CGF中血小板计数结果如下:
血小板数量(全血):192×109
血小板数量(浓缩后):812×109
结果显示:浓缩后血小板浓度/全血血小板浓度即浓度倍数为4.23倍,大于4倍,属于正常值范围内。
实施例3脐带间充质干细胞和脐带血CGF的联用
一、实验方法
1、大鼠卵巢早衰模型建立
雌性Wistar大鼠60只,在动物房后适应性饲养1周后开始建模。按体质量采用数字表法随机分为4组,每组15只,分别为:正常对照组(A组)、卵巢早衰(POF)模型对照组(B组)、UMSCs组(C组)、UMSCs+CGF组(D组)。
A组分别注射等体积DMSO和0.9%(质量分数)氯化钠注射液,每日8:00棉签轻取阴道分泌物涂片,巴氏染色,观察阴道脱落细胞变化,当连续10d观测到持续动情间期,视为POI建模成功,作为B组。
2、脐带间充质干细胞和脐带血CGF的联用
造模成功1周后各组给药。除A组外,各组大鼠分别皮下注射白消安(12mg/kg,溶于DMSO)和腹腔注射环磷酰胺(120mg/kg,溶于0.9%(质量分数)氯化钠注射液)。C组双侧卵巢多点注射UMSCs单个细胞生理盐水混悬液(100μl生理盐水,含细胞数量为2×106个每鼠),D组大鼠双侧卵巢多点注射脐带血CGF联合UMSCs混悬液(100μl CGF,含细胞数量为2×106个每鼠)。
实施例4脐带间充质干细胞和脐带血CGF的联用后卵巢结果与功能的各项评估指标
实验前尾静脉采血1ml测定雌二醇(E2)、卵泡刺激激素(FSH)基础水平。实施例3注射后每日8:00~9:00行阴道脱落细胞涂片观察动情周期。注射后第15、30、45、60天尾静脉采血,-80℃储存,用于检测E2及FSH。每组处死5只大鼠,留取双侧卵巢,一侧卵巢用于卵巢重量测定,卵巢结构、卵泡数观察及颗粒细胞凋亡的检测,另一侧用于Bax和Bcl2蛋白水平检测,评价卵巢机能。
一、TUNEL法检测卵巢颗粒细胞凋亡检测
1、实验方法
TUNEL法检测卵巢颗粒细胞凋亡操作严格按说明书。每张切片随机选取8个视野,共计数100个细胞。凋亡指数(PI)=凋亡颗粒细胞数/总颗粒细胞数。
2、实验结果
表1各组大鼠在不同时间点卵巢颗粒细胞凋亡率(%)
组别 | 15d | 30d | 45d | 60d |
空白对照(A组) | 11.05±5.32 | 10.21±4.36 | 10.26±3.92 | 11.17±3.54 |
阳性对照(B组) | 39.06±2.98 | 38.96±5.21 | 40.42±4.12 | 39.54±4.18 |
UMSCs(C组) | 34.01±2.46 | 32.68±3.85 | 29.09±2.48 | 29.89±4.21 |
UMSCs+CGF(D组) | 27.98±2.98 | 22.43±5.26 | 20.93±4.32 | 19.03±3.09 |
结果显示:注射后各个时间点B组的凋亡率均高于A组、C组及D组,注射后第15、30、45、60天,UMSCs+CGF(D组)的卵巢颗粒细胞凋亡率持续下降,显著低于B组和C组,但仍高于空白对照(A组)。
二、E2及FSH检测
E2、FSH浓度分别采用放射免疫法和化学发光法进行检测。
2、实验结果
结果如表2和表3所示。
表2:各组大鼠在实验前以及注射后第15、30、45、60天E2的水平
组别 | 基础水平 | 15d | 30d | 45d | 60d |
空白对照(A组) | 56.62±13.21 | 53.26±11.21 | 57.32±10.91 | 56.03±10.45 | 57.21±10.90 |
阳性对照(B组) | 55.23±12.34 | 31.21±8.10 | 27.31±7.25 | 21.30±2.98 | 18.52±3.21 |
UMSCs(C组) | 54.28±12.78 | 39.32±6.01 | 40.12±7.45 | 41.23±9.11 | 40.23±5.68 |
UMSCs+CGF(D组) | 52.43±10.96 | 40.36±8.29 | 41.26±7.96 | 43.62±8.12 | 45.25±6.95 |
表3:各组大鼠在实验前以及注射后第15、30、45、60天FSH的水平
结果显示:各组大鼠E2和FSH基础水平无统计学差异。注射后第15、30、UMSCs(C组)和UMSCs(C组)45、60天,阳性对照(B组)E2水平持续下降,FSH水平持续上升;注射第45~60天UMSCs(C组)和UMSCs+CGF(D组)激素水平趋于稳定,其中D组的E2水平显著高于C组,D组的FSH水平显著低于C组,但仍未恢复至空白对照组的水平。
三、卵巢外观、重量及卵泡计数
1、实验方法
卵巢形态学分析、卵巢重量及卵泡计数处死大鼠,取双侧卵巢,称重,肉眼观察大体结构。其中一侧卵巢用石蜡包埋固定,5μm厚切片,取第12张进行HE染色,观察卵巢镜下结构及各级卵泡计数。
始基卵泡仅有单层梭状颗粒细胞;初级卵泡单层颗粒细胞内含有立方细胞≥3个;次级卵泡含有≥2层颗粒细胞,且颗粒细胞层中没有卵泡腔;窦卵泡≥2层颗粒细胞含有卵泡腔。
2、实验结果
表4:各组大鼠在不同时间点的卵巢重量(mg)
组别 | 15d | 30d | 45d | 60d |
空白对照(A组) | 37.23±1.64 | 37.13±1.59 | 35.95±2.23 | 37.47±1.98 |
阳性对照(B组) | 19.54±1.98 | 17.60±1.53 | 16.18±1.11 | 16.25±1.75 |
UMSCs(C组) | 18.41±1.67 | 21.84±1.32 | 22.73±0.98 | 22.86±1.23 |
UMSCs+CGF(D组) | 18.38±1.94 | 26.98±1.34 | 27.05±2.01 | 28.34±1.52 |
表5:各组大鼠各级卵泡计数
组别 | 样本数 | 初级卵泡 | 次级卵泡 | 成熟卵泡 | 闭锁卵泡 |
空白对照(A组) | 15 | 35.65±4.32 | 30.14±5.67 | 28.54±2.31 | 4.38±1.21 |
阳性对照(B组) | 15 | 12.31±3.21 | 12.09±2.12 | 12.87±3.21 | 11.00±3.18 |
UMSCs(C组) | 15 | 28.21±3.98 | 28.28±5.32 | 26.24±5.51 | 5.66±1.83 |
UMSCs+CGF(D组) | 15 | 33.31±4.21 | 29.98±5.31 | 26.98±1.79 | 4.69±0.98 |
结果显示:空白对照不同发育阶段的卵泡,颗粒细胞发育良好;阳性对照组原始卵泡和初级卵泡数目减少,闭锁卵泡增加,颗粒细胞层明显减少;治疗组卵巢组织形态完整,正常形态卵泡数目相对模型组显著增多,闭锁卵泡数目减少,差异有统计学意义;治疗组卵巢组织形态完整,正常形态卵泡数目与C组比更接近正常组,闭锁卵泡数目也明显减少,差异有统计学意义。
四、Bax和Bcl2蛋白浓度
1、实验方法
取大鼠一侧卵巢剪碎后,加入1ml裂解液,冰上均浆40min,之后在4℃条件下12000rpm离心25min。取上清,BAC试剂盒进行蛋白定量,计算样品Bax、Bcl2蛋白浓度,具体步骤:
1)制样:按照5:1的比例,样品加入5倍的上样缓冲液loading buffer,混匀后,水浴锅中煮沸5min,冰上冷却,使用前短暂离心取上清即可。
2)SDS蛋白电泳:将准备好的样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,初始120V作用15min,之后转80V作用,直至溴酚蓝接近凝胶底部。
3)转膜:湿法转膜,将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上,转膜调键位60V转膜2h;
4)封闭:TBST配制5%脱脂奶粉,室温封闭1h;
5)一抗孵育:分别加入适量Bax(1:150)、Bcl2(1:200)和内参GAPDH(1:300)一抗,4℃冰箱孵育过夜;
6)二抗孵育:TBST洗膜三次,每次5min,之后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1:5000),室温下孵育1h;
7)成像:TBST洗膜三次,每次5min,之后将PVDF膜转移至自动凝胶成像系统中进行图像扫描和分析。
2、实验结果
A组、B组、C组、D组Bax、Bcl2蛋白水平比较见图5,UMSCs+CGF(D组)凋亡Bax蛋白表达显著低于其他三组,而抗凋亡Bcl2蛋白表达显著高于其他三组。
综上,UMSCs+CGF较单一注射UMSCs能更有效地抑制卵巢早衰大鼠体内卵巢颗粒的调亡,加强卵巢结构和功能的恢复。
Claims (10)
1.一种改善卵巢功能的组合物,其特征在于,包括脐带间充质干细胞和脐带血CGF。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述脐带间充质干细胞和脐带血CGF的用量按照每2×107~6×107个脐带间充质干细胞数为和5~15ml脐带血CGF的比例。
3.权利要求1到2任一所述组合物在制备改善卵巢生理机能、延缓卵巢衰退和/或治疗卵巢早衰的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述组合物提升卵巢肿瘤和/或抑制卵巢重量降低。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述组合物提升各级卵泡数和/或抑制各级卵泡数降低。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述组合物提升E2水平和/或抑制E2水平降低。
7.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述组合物降低FSH水平和/或抑制FSH升高。
8.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述组合物降低卵巢颗粒细胞凋亡率和/或抑制卵巢颗粒细胞凋亡率升高。
9.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述组合物降低Bax蛋白和/或抑制Bax蛋白升高。
10.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述组合物提升Bcl2蛋白和/或抑制Bcl2降低。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210330 |
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