CN110638834A - 一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用。本发明所提供的干细胞外泌体复合制剂由人子宫内膜干细胞外泌体与人脐带间充质干细胞复合组成，选用人子宫内膜干细胞作为干细胞外泌体来源，经培养后收集外泌体，并与一定量的、高活性的人脐带间充质干细胞混合使用，将外泌体和干细胞的功能发挥至最大化，能有效的改善卵巢生理机能，延缓卵巢衰退。本发明还提供了上述干细胞外泌体复合制剂在治疗卵巢早衰、改善激素分泌中的应用。

Description

一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用。

背景技术

卵巢早衰顾名思义指的是女性卵巢功能提前衰退，具体表现为卵巢功能下降的一些症状，如月经周期紊乱、月经量异常、生殖道炎症，还会伴随一系列的更年期症状，如皮肤松弛、易失眠、情绪焦躁等，严重影响妇女的正常生活。目前临床上多见的多囊卵巢综合征，是育龄妇女不孕不育的常见病因，其主要原因就是卵巢功能减弱导致卵泡发育异常，激素代谢紊乱引起的。对于这种疾病，常常采用的是口服或注射激素帮助卵巢短期内恢复排卵功能，但这种方法治标不治本，达不到彻底治愈的效果，病情始终反反复复，给患者带来心理和生理上的困扰。

干细胞是一类具有自我复制能力的多分化潜能的细胞，在一定条件下，可分化为多种功能细胞，且能分泌多种细胞因子，修复组织损伤，调节机体生理功能。已有研究显示，脐带间充质干细胞本身具有归巢属性，一方面可迁移至特定部位，如卵巢和子宫，并在其内存活生长，调控卵巢生理机能，另一方面通过分泌的多种细胞因子，抑制卵巢细胞凋亡，修复受损组织，补偿或替代部分卵巢细胞功能。目前南京鼓楼医院通过注射脐带间充质干细胞修复卵巢早衰，已有成功生产宝宝的案例。

外泌体是近年来备受关注的胞外囊泡，由多种活细胞产生，直径约为30-100nm，可以通过转运蛋白质、RNA、miRNA等介导细胞间物质交换和信息交流，调节细胞微环境、影响细胞生长。已有研究显示，子宫内膜干细胞分泌的外泌体主要通过改善卵巢组织微环境、免疫调节、促进卵泡发育或分化为颗粒细胞，恢复卵巢早衰患者的卵巢功能及生育能力。

发明内容

本发明的目的在于，提供了一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用，其将子宫内膜干细胞扩大化培养后收集条件培养液，经低温高速离心后获得外泌体，并与一定浓度的人脐带间充质干细胞混合制成复合制剂使用，改善女性卵巢早衰。脐带间充质干细胞通过抑制卵巢细胞凋亡，补偿部分卵巢细胞，改善卵巢机能，并协同外泌体共同作用，改善卵巢内部微环境，从整体上解决卵巢早衰的问题。

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用，包括以下步骤：

1)人子宫内膜干细胞培养：选用P2-P8代之间的人子宫内膜干细胞，以1-2×10⁵/cm²密度接种于细胞培养瓶内，加入子宫内膜干细胞培养基培养，待生长至密度为80％-85％时，弃掉原有培养基，磷酸盐缓冲液清洗，换无血清培养基继续培养。

优选的，子宫内膜干细胞培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12；

优选的，弃掉原有培养基后，选用PBS缓冲液清洗细胞表面2-3遍，去除细胞碎片和血清残留；

优选的，无血清培养基为不含任何血清的DMEM/F12培养液；

2)细胞培养液收集：待无血清培养基培养子宫内膜干细胞约48-72h后，无菌收集细胞培养液，过滤除菌后，-20℃保存。

优选的，收集的细胞培养液需经过0.22μm孔径的滤器过滤，收取滤液保存。

3)外泌体的提取及浓度测定：将步骤2)中得到的细胞培养液经过低温高速离心后，取沉淀，用3-5mL盐水悬浮，留少量液体做浓度检测，其余液体冷藏备用。

优选的，步骤2)得到的细胞培养液需经过低温高速离心，离心时温度设置为4℃，离心速率为12000-20000×g，离心时间为1-2h；

优选的，离心后弃掉上清，留沉淀，悬浮沉淀用0.9％的氯化钠注射液；

优选的，外泌体浓度检测可使用市售的BCA蛋白检测试剂盒进行蛋白含量检测，当提取的外泌体蛋白浓度大于0.3mg/mL时判定为合格外泌体，合格外泌体才可进行后续操作；

优选的，获得的合格的外泌体液体需在2℃-8℃冷藏保存；

4)人脐带间充质干细胞悬液制备：选用健康人脐带来源的P2-P6代细胞，以0.5-1×10⁵个/cm²密度接种于细胞培养瓶内，加入适量的脐带间充质干细胞培养基常规培养；待细胞生长密度达到85％-90％时，进行细胞常规消化，消化后离心，之后生理盐水清洗沉淀，制成单细胞悬液后进行细胞计数。

优选的，人脐带间充质干细胞培养基为10％FBS+90％α-MEM培养基，常规培养条件为37℃，5％CO₂培养箱中培养；

优选的，细胞消化选用不含EDTA的0.25％的胰蛋白酶，37℃消化3-5min；

优选的，消化后收集消化悬液进行离心，离心速率为800rpm/min，离心时间5min，离心后弃上清，留沉淀；

优选的，离心后沉淀中加入8-10mL 0.9％氯化钠注射液清洗2-3遍，清洗后再次离心，800rpm/min离心5min，弃上清，沉淀中加入0.9％氯化钠注射液悬浮细胞。

5)人脐带间充质干细胞质量检验：在制备干细胞悬液前三天，吸取少量细胞培养上清，分别进行细菌检测、真菌检测、肺炎支原体检测和革兰氏阴性菌脂多糖检测，所有项目检测结果均为阴性时，判定此批次人脐带间充质干细胞合格，步骤4)获得的细胞悬液方可使用。

优选的，细菌和真菌检测均选用的是涂片法，选用血平板，37℃生化培养箱中培养时间3d后观察结果；

优选的，肺炎支原体检测选用荧光定量PCR法；

优选的，革兰氏阴性菌脂多糖检测选用内毒素快速检测试剂盒(凝胶法)进行检测。

6)外泌体与人脐带间充质干细胞混合：将步骤3)得到的合格外泌体以15-30ug/mL浓度加入至步骤4)得到的合格的人脐带间充质干细胞单细胞悬液中，细胞悬液浓度为0.5-1×10⁶个/mL，轻轻混匀后，可直接注射使用或转入一次性凝胶助推器中使用。

本发明的有益效果：

1、本发明提供的一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用，是将人子宫内膜干细胞中提取得到的外泌体与人脐带间充质干细胞混合使用，得到干细胞外泌体复合制剂，用于预防及治疗女性卵巢早衰。

2、本发明提供的一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用，将干细胞与外泌体相结合使用，协同发挥两者的作用，从微小的卵巢细胞修复到卵巢微环境改善，从整体上改善卵巢机能，缓解卵巢衰退。

3、本发明提供的一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂及其应用，其用于减缓女性卵巢早衰，疗效好。

附图说明

图1是子宫内膜干细胞提取的外泌体示意图；

图2是卵巢早衰大鼠应用干细胞外泌体复合制剂治疗后卵巢组织中Bax和Bcl2蛋白表达示意图

具体实施方式

下面结合具体的实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1：人子宫内膜干细胞中外泌体的提取

1.人子宫内膜干细胞培养：选用P5代人子宫内膜干细胞，以2×10⁵/cm²密度接种于75cm²细胞培养瓶内，并加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃，5％CO₂培养箱中培养2-3d，待生长至密度为80％-85％时，弃掉原有培养基，用PBS磷酸盐缓冲液轻轻清洗细胞表面2次，去除细胞表面碎片和残留血清；弃掉PBS液，每瓶加入15mL无血清的DMEM/F12培养基继续培养72h。

2.细胞培养液收集：待无血清培养基培养子宫内膜干细胞约48-72h后，无菌收集细胞培养液，用0.22μm一次性滤器过滤除菌后，-20℃分装保存。

3.人子宫内膜干细胞培养上清中外泌体的提取：将步骤2中得到的细胞培养液分装至离心管中，离心管在4℃离心机中15000×g高速离心90min。离心结束后，轻轻弃掉上清，用3-5mL 0.9％氯化钠注射液悬浮沉淀，留50uL悬浮液做蛋白浓度检测，其余液体4℃保存。

4.外泌体中蛋白含量检测：将获得的外泌体按照BCA检测试剂盒的操作说明进行蛋白含量检测，具体操作见说明书。

结果：培养的P5代子宫内膜干细胞生长状态良好，收集培养上清后，提取获得的外泌体经过0.9％氯化钠注射液重悬，为无色透明液体状(图1)，经检测蛋白含量为0.321mg/mL，符合干细胞外泌体复合制剂所需的外泌体蛋白含量的要求，判定为合格外泌体。

实施例2：干细胞外泌体复合制剂改善大鼠卵巢早衰

1.实验动物准备：筛选具有正常动情周期的2月龄的wistar雌性大鼠40只，体重为180±20g，在适应性饲养7d后，再次称量体重，随机分配10只作为造模对照组，其余30只造模。

2.大鼠卵巢早衰模型建立：每日给予大鼠雷公藤多苷片悬浮液50mg/kg，连续灌胃14d，每日8:00用棉签轻取阴道分泌物涂片，巴氏染色后，观察阴道脱落细胞变化。灌胃结束后，大鼠尾静脉采血，检测血液中雌二醇和卵泡刺激素水平，并与造模对照组作对比。当连续10d观测到持续动情间期，且血清中雌二醇水平较对照组显著降低，卵泡刺激素水平增高，证明卵巢早衰建模成功。

3.干细胞外泌体复合制剂的制备：在注射当日，将人脐带间充质干细胞消化、洗涤并制成单细胞悬液，与预先制备好的合格外泌体混匀，保存在4℃冰箱中备用。

4.干细胞制剂治疗大鼠卵巢早衰：造模成功的大鼠随机分为两组，即模型对照组和实验组。实验组大鼠在阴道内灌注步骤4的干细胞外泌体复合制剂，每周一次，持续两周，模型对照组灌注生理盐水，每周一次，持续两周。

5.治疗效果验证：Bax和Bcl2对鼠类卵巢颗粒细胞凋亡起决定性作用，Bax主导凋亡，Bcl2抗凋亡，因此可通过验证Bax和Bcl2蛋白的表达评价卵巢机能。具体操作方法为：

1)取样：实验结束后，每组取10只大鼠脱颈处死，打开大鼠腹腔，轻轻摘取双侧卵巢。剪碎后，加入1mL裂解液，冰上匀浆40min，之后在4℃条件下12000rpm离心25min。取上清，BCA试剂盒进行蛋白定量，计算样品蛋白浓度。

2)制样：按照5:1的比例，样品中加入5倍的上样缓冲液loading buffer，混匀后，水浴锅中煮沸5min，冰上冷却，使用前短暂离心取上清即可。

3)SDS蛋白电泳：将准备好的样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，初始120V作用15min，之后转80V作用，直至溴酚蓝接近凝胶底部。

4)转膜：湿法转膜，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，转膜调键位60V转膜2h；

5)封闭：TBST配制5％脱脂奶粉，室温封闭1h；

6)一抗孵育：分别加入适量Bax(1:150)、Bcl2(1:200)和内参GAPDH(1:300)一抗，4℃冰箱孵育过夜；

7)二抗孵育：TBST洗膜三次，每次5min，之后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1:5000)，室温下孵育1h；

8)成像：TBST洗膜三次，每次5min，之后将PVDF膜转移至自动凝胶成像系统中进行图像扫描和分析。

结果：与模型对照组相比，实验组Bax显著降低，Bcl2蛋白升高(图2)，两者表达均有显著性差异，p﹤0.05，表明制备的干细胞外泌体复合制剂可显著改善大鼠卵巢早衰。

Claims (10)

1.一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂，包括人子宫内膜干细胞中外泌体的提取和外泌体与人脐带间充质干细胞混合制备干细胞外泌体复合制剂两个步骤，其特征是：

步骤一：所述人子宫内膜干细胞中外泌体的提取分为以下步骤：

1)选取P2-P8代的人子宫内膜干细胞进行培养，收集培养后的条件培养液。

2)将培养液过滤除菌后进行低温高速离心，得到人子宫内膜干细胞的外泌体，测定浓度后低温保存备用。

步骤二：外泌体与人脐带间充质干细胞混合制备干细胞外泌体复合制剂，包括以下步骤：

1)选用P2-P6代以内的人脐带间充质干细胞常规培养，经过质量检验合格后进行消化，制成单细胞悬液。

2)将一定量的人脐带间充质干细胞与步骤一得到的外泌体均匀混合，制成干细胞外泌体复合制剂。

2.如权利要求1所述的一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂，其特征在于，步骤一中所述的人子宫内膜干细胞在生长密度达到80％-85％左右，更换无血清培养基培养，无血清培养48-72h后无菌收集条件培养液。

3.如权利要求1所述的一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂，其特征在于，步骤一中所述的收集到的人子宫内膜干细胞培养液需经过0.22μm过滤除菌后方可进行低温高速离心。

4.如权利要求1所述的一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂，其特征在于，步骤一中所述的外泌体经过12000-20000×g离心1-2h后收集沉淀所得。

5.如权利要求1所述的一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂，其特征在于，步骤一中所述的外泌体需要经过蛋白含量检测，蛋白含量至少达到0.3mg/mL方可在步骤二使用。

6.如权利要求1所述的一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂，其特征在于，步骤二中所述的人脐带间充质干细胞常规培养条件为：10％FBS+90％的α-MEM培养基，37℃，5％CO₂培养箱中培养。

7.如权利要求1所述的一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂，其特征在于，步骤二中所述的质量检验包括细菌检验、肺炎支原体检验、真菌检验、革兰氏阴性菌脂多糖检验，所有检测项目合格后方可进行后续操作。

8.如权利要求1所述的一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂，其特征在于，步骤二中所述的外泌体与人脐带间充质干细胞悬液混合，其混合比例为：每毫升细胞悬液中含细胞数为0.5-1×10⁶个，外泌体浓度为15-30μg/mL。

9.一种用于改善卵巢早衰的干细胞外泌体复合制剂的应用，其特征在于，混合后可用于治疗及预防卵巢早衰，恢复卵巢自体机能，调节激素分泌，帮助女性恢复青春。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的干细胞外泌体复合制剂需要直接注射使用或转移至8mL一次性凝胶助推器中使用。

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