CN115300612A - 一种修复子宫内膜的干细胞制剂及其应用 - Google Patents

一种修复子宫内膜的干细胞制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种修复子宫内膜的干细胞制剂及其应用，该干细胞制剂包括间充质干细胞、间充质干细胞分泌物和细胞因子等成分。研究结果显示，本发明所提供的干细胞制剂通过添加二甲基乙二酰氨基乙酸和低氧高氮条件联合刺激培养间充质干细胞后所得的分泌物，以及添加间充质干细胞和细胞因子，可以达到对子宫内膜的显著修复效果，可以将子宫内膜厚度及相关蛋白恢复至正常水平。

Description

一种修复子宫内膜的干细胞制剂及其应用
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，特别涉及一种修复子宫内膜的干细胞制剂及其应用。
背景技术
子宫内膜是附着在子宫腔内的黏膜组织，子宫内膜分为功能层和基底层这2个亚层，基底层与子宫肌层相连，一般不受体内雌、孕激素变化影响。功能层面向子宫腔，受体内雌、孕激素影响发生周期变化而脱落。子宫内膜损伤是因各种宫腔操作、宫腔内感染和一些不明因素的子宫内膜发育不良状态等导致子宫内膜变薄、纤维化及宫腔粘连，造成月经过少、闭经、不孕等，因此子宫内膜再生及修复至关重要。
目前用于治疗子宫内膜损伤的药物包括激素、中药、干细胞等，激素副作用很大，治疗范围局限，中药治疗周期较长，见效慢。干细胞治疗是近年来的研究热门，有文献报道应用经血来源间充质干细胞(MenSCs)、骨髓间充质干细胞(BMSC)、脐带间充质干细胞(UC-MSCs)、子宫内膜间充质干细胞(EnMSC)等干细胞制剂成功修复受损子宫内膜并改善其功能，但是修复效果有限，仅使用间充质干细胞无法将子宫内膜厚度及相关蛋白的表达完全恢复至子宫内膜受损前的水平。例如，王红燕等(经血来源间充质干细胞对大鼠薄型子宫内膜的治疗效果[J].中国医学前沿杂志，2019,11(11):41-45.)探究经血来源间充质干细胞对大鼠薄型子宫内膜的治疗效果。结果显示模型组、MenSCs组、雌激素组大鼠子宫内膜厚度均显著小于对照组，模型组、MenSCs组、雌激素组大鼠子宫内膜组织角蛋白、波形蛋白、整合素β3表达水平均显著低于对照组，MenSCs组大鼠上述蛋白表达水平均显著高于模型组和雌激素组。李瑞娇等(子宫内膜间充质干细胞对小鼠模型薄型子宫内膜的修复作用[J].生殖医学杂志，2021,30(01):68-75.)观察小鼠子宫内膜间充质干细胞对小鼠模型薄型子宫内膜的修复作用。结果显示干细胞移植组小鼠子宫内膜厚度在各时间点均显著厚于模型对照组，但与空白对照组仍有一定距离。干细胞移植组角蛋白、波形蛋白、VEGF、ERα各项指标均有显著上升，与模型对照组有显著性差异，干细胞移植组各检测指标与同时间点空白对照组相比，具有显著差异。
发明内容
鉴于目前用于修复子宫内膜的干细胞制剂治疗效果有限，还不能完全满足人们的需求，我们对相关产品进行进一步的探究，初步得到一种对受损子宫内膜具有明显修复效果，可以使得子宫内膜恢复至受损前水平的新型干细胞制剂。
本发明方案的技术关键在于：
一种修复子宫内膜的干细胞制剂，包括间充质干细胞、间充质干细胞分泌物和细胞因子。
所述间充质干细胞分泌物为经过二甲基乙二酰氨基乙酸和/或低氧高氮条件联合刺激培养间充质干细胞后所得的分泌物。
干细胞具有多向分化潜能，在对干细胞筛选的过程当中，我们发现某些间充质干细胞的分泌物与人脐带间充质干细胞组合用于子宫内膜修复时具有显著的效果。
所述间充质干细胞分泌物富含miRNA、蛋白质等多种生物活性物质。
优选的，所述低氧高氮条件为氧气体积浓度为1％～3％，氮气体积浓度为92～94％N2。
优选的，二甲基乙二酰氨基乙酸的浓度为500～1000μmol/L。
优选的，所述间充质干细胞分泌物为脂肪间充质干细胞分泌物。
优选的，所述间充质干细胞分泌物为：将脂肪间充质干细胞接种至含有500～1000μmol/L二甲基乙二酰氨基乙酸的培养液中，于氧气体积浓度为1％～3％和氮气体积浓度为92～94％的条件下培养24～48h，得细胞上清液A；取细胞上清液A，通过差速离心获得分泌物。
优选的，所述细胞因子为血管内皮生长因子和白细胞介素8。
优选的，所述干细胞制剂包括脐带间充质干细胞1010～109cells/L、20～60mg/L间充质干细胞分泌物、0.5～0.8μg/L血管内皮生长因子和5.8～7.0μg/L白细胞介素8。
优选的，所述干细胞制剂包括脐带间充质干细胞109cells/L、40mg/L间充质干细胞分泌物、0.6μg/L血管内皮生长因子和5.8μg/L白细胞介素8。
优选的，所述差速离心为：取细胞上清液A，在2000×g条件下离心10～15min得细胞上清液B；细胞上清液B继续在12000×g条件下离心30～45min，得细胞上清液C；细胞上清液C再经过100000×g离心1～1.5h，所得沉淀物为分泌物。
另一方面，本发明涉及所述干细胞制剂在制备用于修复子宫内膜的药品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明建立与人体子宫内膜受损情况接近的动物模型，验证了本发明干细胞制剂的使用效果。结果显示，本发明所提供的干细胞制剂通过添加二甲基乙二酰氨基乙酸和低氧高氮条件联合刺激培养间充质干细胞后所得的分泌物，以及添加间充质干细胞和细胞因子，可以达到对子宫内膜的显著修复效果，可以将子宫内膜厚度及相关蛋白恢复至正常水平。
本发明干细胞制剂见效快，在小鼠的第二个动情期，各项指标就可以达到正常水平。
附图说明
图1：实验1子宫内膜厚度结果统计图。*代表与空白组相比差异显著，误差条：+/-1SD
图2：实验1CK18表达水平AOD值结果统计图。*代表与空白组相比差异显著，误差条：+/-1SD。
图3：实验1Vimentin表达水平AOD值结果统计图。*代表与空白组相比差异显著，误差条：+/-1SD。
图4：实验2子宫内膜厚度结果统计图。组间相比均具有显著性差异，误差条：+/-1SD。
具体实施方式
为对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下结合实施例进行说明，但以下实施例所描述的仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
若未特别说明，以下实施例所述间充质干细胞为经DMEM/F12(Gibco)培养液培养的第3代间充质干细胞。但本发明所适用的间充质干细胞并不限于此，本领域技术人员可以选择市售产品或其他常规方法自行分离培养。
以下实施例所述PBS缓冲液的配方：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4，去离子水定容。
实验1：
1.1主要材料
干细胞分泌物的提取：利用超速离心法提取分泌物，具体步骤为：取第3代人脂肪间充质干细胞，按1×107个/L接种至含有600μmol/L二甲基乙二酰氨基乙酸的DMEM/F12培养液中，于37℃，5％CO2+2％O2+93％N2条件下培养24h，得细胞上清液A。取细胞上清液A，在4℃，2000×g条件下离心10min得细胞上清液B；细胞上清液B继续在4℃，12000×g条件下离心30min，得细胞上清液C；细胞上清液C再经过4℃，100000×g离心1h，得沉淀物。
干细胞制剂配方：人脐带间充质干细胞109cells/L、40mg/L干细胞分泌物、0.6μg/L血管内皮生长因子和5.8μg/L白细胞介素8，余量是PBS缓冲液。
1.2实验方法
1.2.1建立子宫内膜损伤动物模型
选取健康性成熟、未交配的C57BL/6J雌性小鼠，鼠龄8～10周，体重22～25g。通过阴道涂片判断小鼠动情周期，在动情期当天宫腔灌注95％乙醇建立子宫内膜损伤模型(薄型子宫内膜小鼠模型)。子宫内膜变薄，腺体减少，排列紊乱，视为造模成功。
1.2.2实验分组及处理
实验动物随机分为3组：实验组、模型组和空白组，每组6只。实验组为建模小鼠宫腔灌注干细胞制剂(0.1mL/只)，模型组为建模小鼠宫腔灌注等量PBS，空白组为正常小鼠未经任何处理。
1.2.3检测
在第二个动情期处死小鼠。取小鼠子宫组织行HE染色，显微镜下观察子宫内膜细胞形态、拍片并使用Image J软件测定子宫内膜厚度(子宫内膜肌层交接处至宫腔的垂直距离)，每张片子取3个部位，取平均值作为该切片子宫内膜厚度。通过免疫组化测定平均光密度值，获得子宫内膜中细胞角蛋白18(CK18)、波形蛋白(Vimentin)的水平。平均光密度值AOD值越大，说明表达水平越高。
1.2.4统计学分析
采用SPSS统计软件进行数据分析，多组数据组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
1.2.5结果
模型组子宫内膜变薄，腺体减少，排列紊乱。空白组和实验组小鼠子宫内膜结构完整，子宫内膜腔上皮细胞和腺上皮细胞完整，排列紧密，腺体丰富。空白组和实验组子宫内膜厚度无显著差异，与模型组相比差异非常显著。实验组CK18蛋白、Vimentin蛋白表达水平与空白组相比同样无显著差异，与模型组相比差异非常显著。整体说明实验组小鼠子宫内膜恢复至正常水平。
表1子宫内膜厚度检测结果(μm)
Figure BDA0003771402410000041
表2CK18表达的AOD值
Figure BDA0003771402410000042
表3Vimentin表达的AOD值
Figure BDA0003771402410000043
实验2：
实验分组及处理：
实验动物随机分为6组：实验组①、实验组②、实验组③、实验组④、模型组和空白组，每组6只。实验组①为建模小鼠宫腔灌注干细胞制剂①，实验组②为建模小鼠宫腔灌注干细胞制剂②、实验组③为建模小鼠宫腔灌注干细胞制剂③、实验组④为建模小鼠宫腔灌注干细胞制剂④、模型组为建模小鼠宫腔灌注等量PBS，空白组为正常小鼠未经任何处理。
干细胞制剂①：人脐带间充质干细胞109cells/L、40mg/L干细胞分泌物，余量是PBS缓冲液。分泌物为未添加二甲基乙二酰氨基乙酸刺激且低氧高氮培养条件(5％CO2+2％O2+93％N2)换成常氧条件5％CO2+20％O2+75％N2后所得的分泌物，其他提取步骤同实验1。
干细胞制剂②：人脐带间充质干细胞109cells/L、40mg/L干细胞分泌物，余量是PBS缓冲液。分泌物为将低氧高氮培养条件(5％CO2+2％O2+93％N2)换成常氧条件5％CO2+20％O2+75％N2后所得的分泌物，其他提取步骤同实验1。
干细胞制剂③：人脐带间充质干细胞109cells/L、40mg/L干细胞分泌物，余量是PBS缓冲液。分泌物为未添加二甲基乙二酰氨基乙酸刺激所得的分泌物，其他提取步骤同实验1。
干细胞制剂④：人脐带间充质干细胞109cells/L、40mg/L干细胞分泌物，余量是PBS缓冲液。干细胞分泌物为采用实验1方法所得，其他提取步骤同实验1。
其他实验过程参照实验1。
实验结果：
各组之间的子宫内膜厚度均存在显著性差异，其中实验组④采用二甲基乙二酰氨基乙酸和低氧高氮条件联合刺激培养间充质干细胞后所得的分泌物，对子宫内膜的修复效果最为显著。将本实验的效果与实验1的效果进行对比可知，模型组之间、空白组之间无显著差异，但是实施例1实验组与本实验实验组④的子宫内膜厚度相比，达到显著水平。说明实验1的干细胞制剂中所添加的细胞因子对子宫内膜修复有促进作用。
表4子宫内膜厚度(μm)
Figure BDA0003771402410000051
以下提供优选实施例，采用以下实施例中的方法均可达到与上述实验1相当的效果。
实施例1：修复子宫内膜的干细胞制剂
干细胞分泌物的提取：利用超速离心法提取分泌物，具体步骤为：取第3代人脂肪间充质干细胞，按1×107个/L接种至含有1000μmol/L二甲基乙二酰氨基乙酸的DMEM/F12培养液中，于37℃，5％CO2+2％O2+93％N2条件下培养48h，得细胞上清液A。取细胞上清液A，在4℃，2000×g条件下离心10min得细胞上清液B；细胞上清液B继续在4℃，12000×g条件下离心30min，得细胞上清液C；细胞上清液C再经过4℃，100000×g离心1h，得沉淀物。
干细胞制剂：人脐带间充质干细胞109cells/L、40mg/L干细胞分泌物、0.6μg/L血管内皮生长因子和5.8μg/L白细胞介素8，余量是PBS缓冲液。
实施例2：修复子宫内膜的干细胞制剂
干细胞分泌物的提取：利用超速离心法提取分泌物，具体步骤为：取第3代人脂肪间充质干细胞，按1×107个/L接种至含有500μmol/L二甲基乙二酰氨基乙酸的DMEM/F12培养液中，于37℃，5％CO2+2％O2+93％N2条件下培养48h，得细胞上清液A。取细胞上清液A，在4℃，2000×g条件下离心10min得细胞上清液B；细胞上清液B继续在4℃，12000×g条件下离心30min，得细胞上清液C；细胞上清液C再经过4℃，100000×g离心1h，得沉淀物。
干细胞制剂：人脐带间充质干细胞109cells/L、40mg/L干细胞分泌物、0.6μg/L血管内皮生长因子和7.0μg/L白细胞介素8，余量是PBS缓冲液。
实施例3：修复子宫内膜的干细胞制剂
干细胞分泌物的提取：利用超速离心法提取分泌物，具体步骤为：取第3代人脂肪间充质干细胞，按1×107个/L接种至含有1000μmol/L二甲基乙二酰氨基乙酸的DMEM/F12培养液中，于37℃，5％CO2+2％O2+93％N2条件下培养48h，得细胞上清液A。取细胞上清液A，在4℃，2000×g条件下离心15min得细胞上清液B；细胞上清液B继续在4℃，12000×g条件下离心45min，得细胞上清液C；细胞上清液C再经过4℃，100000×g离心1.5h，得沉淀物。
干细胞制剂：人脐带间充质干细胞109cells/L、40mg/L干细胞分泌物、0.6μg/L血管内皮生长因子和5.8μg/L白细胞介素8，余量是PBS缓冲液。
实施例4：修复子宫内膜的干细胞制剂
干细胞分泌物的提取：利用超速离心法提取分泌物，具体步骤为：取第3代人脂肪间充质干细胞，按1×107个/L接种至含有1000μmol/L二甲基乙二酰氨基乙酸的DMEM/F12培养液中，于37℃，5％CO2+2％O2+93％N2条件下培养24h，得细胞上清液A。取细胞上清液A，在4℃，2000×g条件下离心10min得细胞上清液B；细胞上清液B继续在4℃，12000×g条件下离心45min，得细胞上清液C；细胞上清液C再经过4℃，100000×g离心1h，得沉淀物。
干细胞制剂：人脐带间充质干细胞1010cells/L、40mg/L干细胞分泌物、0.8μg/L血管内皮生长因子和7.0μg/L白细胞介素8，余量是PBS缓冲液。
实施例5：修复子宫内膜的干细胞制剂
干细胞分泌物的提取：利用超速离心法提取分泌物，具体步骤为：取第3代人脂肪间充质干细胞，按1×107个/L接种至含有1000μmol/L二甲基乙二酰氨基乙酸的DMEM/F12培养液中，于37℃，5％CO2+2％O2+93％N2条件下培养48h，得细胞上清液A。取细胞上清液A，在4℃，2000×g条件下离心10min得细胞上清液B；细胞上清液B继续在4℃，12000×g条件下离心45min，得细胞上清液C；细胞上清液C再经过4℃，100000×g离心1h，得沉淀物。
干细胞制剂：人脐带间充质干细胞1010cells/L、60mg/L干细胞分泌物、0.5μg/L血管内皮生长因子和7.0μg/L白细胞介素8，余量是PBS缓冲液。
实施例6：修复子宫内膜的干细胞制剂
干细胞分泌物的提取：利用超速离心法提取分泌物，具体步骤为：取第3代人脂肪间充质干细胞，按1×107个/L接种至含有1000μmol/L二甲基乙二酰氨基乙酸的DMEM/F12培养液中，于37℃，5％CO2+2％O2+93％N2条件下培养48h，得细胞上清液A。取细胞上清液A，在4℃，2000×g条件下离心10min得细胞上清液B；细胞上清液B继续在4℃，12000×g条件下离心30min，得细胞上清液C；细胞上清液C再经过4℃，100000×g离心1h，得沉淀物。
干细胞制剂：人脐带间充质干细胞109cells/L、60mg/L干细胞分泌物、0.5μg/L血管内皮生长因子和7.0μg/L白细胞介素8，余量是PBS缓冲液。
实施例7：修复子宫内膜的干细胞制剂
干细胞分泌物的提取：利用超速离心法提取分泌物，具体步骤为：取第3代人脂肪间充质干细胞，按1×107个/L接种至含有1000μmol/L二甲基乙二酰氨基乙酸的DMEM/F12培养液中，于37℃，5％CO2+3％O2+92％N2条件下培养48h，得细胞上清液A。取细胞上清液A，在4℃，2000×g条件下离心10min得细胞上清液B；细胞上清液B继续在4℃，12000×g条件下离心30min，得细胞上清液C；细胞上清液C再经过4℃，100000×g离心1h，得沉淀物。
干细胞制剂：人脐带间充质干细胞109cells/L、60mg/L干细胞分泌物、0.5μg/L血管内皮生长因子和7.0μg/L白细胞介素8，余量是PBS缓冲液。
实施例8修复子宫内膜的干细胞制剂
干细胞分泌物的提取：利用超速离心法提取分泌物，具体步骤为：取第3代人脂肪间充质干细胞，按1×107个/L接种至含有1000μmol/L二甲基乙二酰氨基乙酸的DMEM/F12培养液中，于37℃，5％CO2+1％O2+94％N2条件下培养48h，得细胞上清液A。取细胞上清液A，在4℃，2000×g条件下离心10min得细胞上清液B；细胞上清液B继续在4℃，12000×g条件下离心30min，得细胞上清液C；细胞上清液C再经过4℃，100000×g离心1h，得沉淀物。
干细胞制剂：人脐带间充质干细胞109cells/L、60mg/L分泌物、0.5μg/L血管内皮生长因子和7.0μg/L白细胞介素8，余量是PBS缓冲液。
本发明干细胞制剂在人体中也具有良好的效果。使用方法：宫腔灌注干细胞10mL并抬高臀部保留双腔管半小时，细胞液直接接触子宫内膜。受损或菲薄的子宫内膜在干细胞的作用下被修复。内膜可以达到中期＞8毫米，利于胚胎着床并维持妊娠至足月分娩，同时可以改善月经量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种修复子宫内膜的干细胞制剂，其特征在于，包括间充质干细胞、间充质干细胞分泌物和细胞因子。
所述间充质干细胞分泌物为经过二甲基乙二酰氨基乙酸和低氧高氮条件联合刺激培养间充质干细胞后所得的分泌物。
2.根据权利要求1所述修复子宫内膜的干细胞制剂，其特征在于，所述低氧高氮条件为氧气体积浓度为1％～3％，氮气体积浓度为92～94％N2。
3.根据权利要求1所述修复子宫内膜的干细胞制剂，其特征在于，二甲基乙二酰氨基乙酸的浓度为500～1000μmol/L。
4.根据权利要求1所述修复子宫内膜的干细胞制剂，其特征在于，所述间充质干细胞分泌物为脂肪间充质干细胞分泌物。
5.根据权利要求1所述修复子宫内膜的干细胞制剂，其特征在于，所述间充质干细胞分泌物为：将脂肪间充质干细胞接种至含有500～1000μmol/L二甲基乙二酰氨基乙酸的培养液中，于氧气体积浓度为1％～3％和氮气体积浓度为92～94％的条件下培养24～48h，得细胞上清液A；取细胞上清液A，通过差速离心获得分泌物。
6.根据权利要求1所述修复子宫内膜的干细胞制剂，其特征在于，所述细胞因子为血管内皮生长因子和白细胞介素8。
7.根据权利要求1所述修复子宫内膜的干细胞制剂，其特征在于，包括脐带间充质干细胞1010～109cells/L、20～60mg/L间充质干细胞分泌物、0.5～0.8μg/L血管内皮生长因子和5.8～7.0μg/L白细胞介素8。
8.根据权利要求7所述修复子宫内膜的干细胞制剂，其特征在于，包括脐带间充质干细胞109cells/L、40mg/L间充质干细胞分泌物、0.6μg/L血管内皮生长因子和5.8μg/L白细胞介素8。
9.根据权利要求5所述修复子宫内膜的干细胞制剂，其特征在于，所述差速离心为：取细胞上清液A，在2000×g条件下离心10～15min得细胞上清液B；细胞上清液B继续在12000×g条件下离心30～45min，得细胞上清液C；细胞上清液C再经过100000×g离心1～1.5h，所得沉淀物为分泌物。
10.权利要求1所述干细胞制剂在制备用于修复子宫内膜的药品中的应用。
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