CN114517177A - 用于增强间充质干细胞效能的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于增强间充质干细胞效能的组合物，包括NAMPT激动剂，通过该组合物培养可增强间充质干细胞效能，得到的间充质干细胞可用于制备以异常炎症反应为特征的免疫性疾病的治疗药物。本发明的组合物可增强MSCs胞内NAD⁺代谢，提高免疫抑制因子的表达，发挥干细胞免疫调控功能，从而实现对以异常炎症反应为主要特征的免疫性疾病治疗的增益效应。

Description

用于增强间充质干细胞效能的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及免疫治疗技术领域，尤其涉及一种用于增强间充质干细胞效能的组合物及其应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是广泛存在于机体大部分组织中的多能干细胞，与个体生长发育、组织稳态维持和器官损伤修复密切相关。除具备自我更新和多向分化潜能外，MSCs还拥有重要的免疫调控特性。机体损伤发生时，无论是外源性输注的MSCs还是内源性组织的MSCs均可被趋化至损伤部位，通过自身分化能力、免疫调节特性、协调原位基质细胞和组织特异性干细胞功能等，促进损伤修复和组织再生。因此，MSCs已然成为生命医学领域中重要的研究对象，为多种难治性和顽疾性疾病的治疗带来了希望。

目前，已有很多对于MSCs在炎症治疗中的作用研究，如袁福临等(间充质干细胞治疗炎性疾病的研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志,2021,35(3):161-168.DOI:10.3867/j.issn.1000-3002.2021.03.001.)指出，MSCs通过调控辅助性T细胞1(Th1)、Th17和调节性T细胞亚群的分化及相关炎症因子的分泌，降低移植物抗宿主病和类风湿性关节炎的炎症反应，并进一步指出以MSCs为主的细胞治疗有望成为替代传统治疗的新方式；余永林等(淫羊藿甙干预脂肪间充质干细胞修复膝骨性关节炎的作用及相关机制研究[J].中国免疫学杂志,2021,37(3):301-306.DOI:10.3969/j.issn.1000-484X.2021.03.008.)通过对比淫羊藿甙干预脂肪间充质干细胞(AMSCs)与同种异体AMSCs进行移植治疗兔骨性关节炎的效果，发现淫羊藿甙干预可降低关节腔内NO、IL-1与TNF-α等炎症因子水平，改善骨性关节炎的微环境，抑制关节软骨细胞凋亡，从而达到保护关节软骨的作用。总之，MSCs对多种免疫细胞的调控作用及机制已被广泛研究。其主要通过表达不同的趋化因子和免疫抑制因子发挥强大的免疫调控功能。然而，MSCs的免疫调控功能并不是固有存在的，而是依赖于炎症因子的激活或“授权”。根据组织损伤微环境(炎症细胞和因子、氧浓度、pH值或细胞外基质组分等)的动态变化，MSCs可以表现出可塑性的免疫调控特性。例如，炎症因子IL-17A能够加强IFN-γ和TNF-α激活的MSCs的免疫抑制功能，提升干细胞对急性肝损伤的治疗效应；暴露于低氧环境下的MSCs则可表现出更强的干性特征，且能分泌更多的细胞因子和趋化因子，增强疾病的治疗效应。因此，未来MSCs精准治疗的发力方向将是基于其高度可塑性的免疫调控功能优化当前的干细胞疾病治疗模式并开发新颖的MSCs疗效增益策略。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于增强间充质干细胞效能的组合物以及增强间充质干细胞效能的方法，并将根据以上方法得到的间充质干细胞制剂用于制备治疗以异常炎症反应为主要特征的免疫性疾病的药物，该药物用于结肠炎等疾病时效果显著。

本发明的第一个目的是提供一种用于增强间充质干细胞效能的组合物，该组合物包括NAMPT(烟酰胺磷酸核糖转移酶)激动剂。

进一步地，NAMPT激动剂在组合物中的浓度为1-50μM，优选为5-10μM。

进一步地，NAMPT激动剂可为P7C3、SBI-797812等。

进一步地，间充质干细胞为人源、鼠源、猪源或兔源间充质干细胞，从其骨髓中经极限稀释法处理得到。

所述的间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一类起源于中胚层的成体干细胞，也具有自我更新及多向分化潜能，可分化为多种间质组织，如骨骼、软骨、脂肪、骨髓造血组织等。为排除伦理问题，本发明使用的是经伦理审查批准的人骨髓间充质干细胞，包括商业化的人骨髓间充质干细胞(如Prochymal，Temcell HS Inj，Neuronata-R，Stemirac，Stempeucel和Cellgram-AMI等)。

特别指出，本发明所使用的人多能干细胞均不能够发育成完整个体，且都是已通过伦理审查而建立的多能干细胞。

本发明的第二个目的是提供一种增强间充质干细胞效能的方法，包括采用上述组合物培养间充质干细胞的步骤。

进一步地，间充质干细胞在含有NAMPT激动剂的组合物中培养18-96h，优选为24-36h。

本发明的第三个目的是提供一种用于治疗以异常炎症反应为主要特征的免疫性疾病的药物，该药物中包含经上述增强间充质干细胞效能的方法制备得到的间充质干细胞。

进一步地，以异常炎症反应为主要特征的免疫性疾病包括结肠炎、急性肝炎、类风湿性关节炎、急性肺炎、移植物抗宿主病等。

进一步地，上述药物为注射剂。

进一步地，通过静脉注射进行给药。

进一步地，上述药物通过增强MSCs胞内NAD⁺代谢，提高免疫抑制因子的表达，发挥干细胞免疫调控功能。

进一步地，免疫抑制因子包括HO1、COX2和iNOS。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明通过使用NAMPT激动剂体外预处理间充质干细胞，能够实现对以异常炎症反应为主要特征的免疫性疾病治疗的增益效应，经NAMPT激动剂体外预处理的间充质干细胞相比于同等数量未经预处理的间充质干细胞可表现出更有效的效果，经体内实验发现其能够减轻体重丢失、腹泻、便血、肠组织增厚水肿、结构破损以及免疫细胞浸润等疾病症状。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为MSCs表型和分化功能鉴定结果；

图2为MSCs经IFN-γ和TNF-α刺激联合FK866处理24h后趋化因子和免疫抑制因子的富集情况；

图3为MSCs经IFN-γ和TNF-α刺激联合FK866处理24h后趋化因子和免疫抑制因子的基因和蛋白表达情况以及培养上清中NO的含量；

图4为MSCs经IFN-γ和TNF-α刺激联合P7C3处理24h后胞内免疫抑制因子的基因表达情况；

图5为敲低MSCs中NAMPT后趋化因子和免疫抑制因子的表达情况以及NO的产出情况；

图6-7为敲低MSCs中NAMPT后失去对结肠炎治疗效果的表征；

图8为MSCs经P7C3预处理24h后增强对结肠炎治疗效果的表征。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明涉及的具体实验操作如下：

1、MSCs体外培养与功能鉴定

1.1MSCs分离提取与体外扩增

(一)间充质干细胞的分离提取

(1)C57BL/6J品系小鼠经水合氯醛麻醉后，颈椎脱位处死小鼠，将其全身浸泡于75％酒精约10min，而后去除股骨和胫骨的全部肌肉组织。

(2)眼科剪减去股骨和胫骨的两端股垢后，使用含无菌PBS的注射器反复冲洗骨内骨髓组织，待骨色由红色变为白色后，将收集的全部骨髓细胞经70μm细胞筛网过滤后，400×g离心5min。

(3)离心完成后，使用MSCs生长培养基(DMEM低糖培养基+10％胎牛血清+10ng/mLbFGF)进行重悬，而后将细胞种植于多个培养皿中进行培养。

(4)根据不同类型细胞差异化的胰酶消化时间，预分离出MSCs群体。在胰蛋白酶加入至细胞后不久，吸取出脱落快速的细胞，进而离心富集。400×g离心5min。

(5)依据上一步方法培养细胞一段时间就进行多次的胰酶消化和离心富集，可大体去除混杂其中的免疫细胞。

(6)通过极限稀释法，将预提纯的细胞群体种植于96孔板中，确保每孔只存有一个细胞。培养数天，观察并筛选出能够长出细胞克隆的板孔，此孔中的细胞即为MSCs。

(二)间充质干细胞的扩增培养

(1)使用胰蛋白酶对孔板中的MSCs克隆进行消化传代，使用间充质干细胞生长培养基进行离心后的细胞重悬，而后将细胞种植于T75培养瓶中进行扩增培养。

(2)每两天更换一次新鲜培养基直至细胞融合度达到80～90％。

(3)使用胰蛋白酶对间充质干细胞进行传代，而后将子代细胞种植于新的T75培养瓶中继续培养扩增。其中，只选取20代之内的MSCs细胞群体用于本实验。

1.2 MSCs分化能力鉴定

成骨分化：待MSCs生长至完全融合状态，用无血清DMEM培养基洗涤细胞三次，而后换成间充质干细胞成骨分化培养基(DMEM低糖培养基+5％胎牛血清+10nM地塞米松+100μM抗坏血酸+10mM磷酸甘油)继续培养。分化培养结束后，使用Alizarin red染色观察MSCs成骨分化情况。

成脂分化：待MSCs生长至完全融合状态，用无血清DMEM培养基洗涤细胞三次，而后换成间充质干细胞成脂分化培养基(DMEM低糖培养基+5％胎牛血清+0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+60μM吲哚美辛+100nM地塞米松+10ug/mL胰岛素)继续培养。分化培养结束后，使用Oil red染色观察MSCs成脂分化情况。

间充质干细胞的成骨分化和成脂分化结果见图1，其中，A为流式细胞术检测MSCs表面CD45、CD11b、CD11c、CD31、CD29、CD44、Sca1和CD140a的表达情况；B为Oil red染色和Alizarin red染色分别检测MSCs经不同分化培养基诱导分化多天后干细胞成脂和成骨分化的情况。比例尺：50μm。

2、结肠炎动物模型建立

2.1实验动物

实验所用的8～10周龄雄性C57BL/6J品系小鼠均购自于北京维通利华实验动物技术有限公司，并严格遵循SPF级屏障系统标准进行饲养。本发明中所涉及的动物实验操作均经过苏州大学动物实验伦理委员会批准。

2.2结肠炎模型建立

实验开始当天，不同的C57BL/6J品系小鼠被随机分组并分别进行正常水饮食和含4％葡聚糖硫酸钠(DSS，分子量：36,000-50,000)水饮食，每两天更换小鼠饮水，共计喂养7天。根据不同的实验目的给予疾病小鼠不同的治疗处理方式，每天记录结肠炎小鼠的体重，并同时观察各小鼠便血情况、粪便形态以及小鼠活动状态等。

2.3结肠炎模型治疗

在小鼠结肠炎模型诱导第2天，给予小鼠尾静脉注射不同慢病毒转染的1×10⁶个MSCs或NAMPT激动剂P7C3预处理的1×10⁵个MSCs进行疾病的治疗，模型对照小鼠给予尾静脉PBS注射。

2.4结肠炎疾病活动指数

A.体重丢失(0～4分)

0分：未发生体重丢失；

1分：丢失初始体重的10％以下；

2分：丢失初始体重的10％～15％；

3分：丢失初始体重的15％～20％；

4分：丢失初始体重的20％以上。

B.腹泻程度(0～2分)

0分：没有腹泻；

1分：轻度腹泻；

2分：中度至重度腹泻。

C.直肠出血程度(0～2分)

0分：无出血；

1分：轻度出血；

2分：中度至重度出血。

D.机体活动(0～2分)

0分：正常

1分：轻度抑郁；

2分：中度至重度抑郁。

2.5结肠炎组织学评分

A.肠壁增厚程度(0～3分)

0分：无增厚；

1分：粘膜增厚；

2分：粘膜与粘膜下层增厚；

3分：穿透肠壁。

B.隐窝损伤程度(0～3分)

0分：无损伤；

1分：杯状细胞丢失；

2分：只有表面上皮细胞完整；

3分：整个隐窝和上皮细胞丢失。

C.炎症细胞浸润情况(0～2分)

0分：无炎症细胞浸润；

1分：轻度至中度浸润；

2分：重度浸润。

3.RNA抽提与基因表达检测

3.1细胞总RNA抽提

(1)PBS洗涤孔板中的细胞2遍后，加入l mL预冷的Trizol试剂，反复吹打至细胞完全裂解。而后将液体转移至1.5mL EP管中。

(2)按照1:5的氯仿：Trizol比例加入200μL氯仿，涡旋器上充分混匀后，室温静置5min。4℃，12,000×g离心15min。

(3)离心完毕后，液体混合液出现分层。小心吸出最上层液体至新的1.5mL EP管，加入1mL异丙醇，涡旋器上充分混匀后室温静置10min。4℃，12,000×g离心10min，弃上清。

(4)此时可见管底出现白色沉淀，加入1mL经DEPC水配制的75％乙醇溶液，上下颠倒混匀，以使沉淀脱落漂浮于乙醇溶液中。4℃，12,000×g离心5min。重复洗涤离心一次。

(5)弃上清，吸水纸吸取回流液体，而后放置于通风橱中，室温干燥至无液体残留于EP管内。

(6)加入20μL DEPC水至RNA完全溶解，使用分光光度计检测所得RNA的浓度和纯度。

3.2总RNA反转录成cDNA

吸取1ng总RNA，使用PrimeScript^TMRT Master Mix试剂盒将总mRNA反转录成cDNA。

具体反应体系如下：

反应条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃保持。

3.3实时荧光定量PCR

以cDNA为模板，按照SYBR^TMSelect Master Mix说明书要求进行实时荧光定量PCR反应。以β-actin为内参，检测各基因在细胞内的相对表达水平。

具体反应体系如下：

反应条件：

表1特异性实时荧光定量PCR引物序列表

4、免疫蛋白印迹

4.1蛋白样本制备

(1)吸除6孔板细胞培养上清，PBS洗涤细胞两次，每孔加入100μL RIPA裂解液(内含1mM PMSF)。而后将提取液转移至1.5mL EP管中，4℃冰上静置20min，以保证细胞裂解充分。

(2)超声处理蛋白样本15s，以降低样品的粘度。4℃，12,000×g离心15min。

(3)吸取上清并转移至新的1.5mL EP管中，100℃加热10min，以充分变性蛋白样品。而后放于冰上冷却，备用。

4.2SDS-PAGE凝胶电泳

(1)胶板制备

a)流水清洗所需的玻璃板，去除残余胶体或杂质后，使用无水乙醇自上而下流经玻璃板表面以去酯。吹风机吹干表面液体后，将玻璃板对靠装于制胶架上。

b)按照不同目的蛋白的分子量大小配制8％、10％或12％密度的分离胶，注入到装好的玻璃板间隙中。使用无水乙醇封顶，而后待胶体凝结。

c)倒出分离胶上层无水乙醇，而后用滤纸吸净残留的无水乙醇。

d)配制不同密度相对应的浓缩胶后，迅速注入分离胶的上层。按照所需泳道的多少将不同的孔梳插入浓缩胶中，而后待胶体凝结，备用。

(2)电泳

取出胶板对靠装于电泳架上，缓慢将电泳缓冲液倒入中间的电泳槽中，待蛋白样品加入相应的泳道后，按照黑对黑、红对红原则，盖上电泳槽盖。设置电压为80V，开始电泳分离，待蓝色Running buffer跑至浓缩胶与分离胶交界处，调节电压至120V，加快电泳速度，直至蓝色Running buffer跑至接近分离胶底部，停止电泳过程。

(3)转膜

a)将预先裁剪好大小的PVDF膜在无水甲醇中浸泡15s，以使PVDF膜附满电荷离子。

b)按照由负极向正极的方向或“黑胶白膜”原则，依次在转膜板上放置海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸和海棉垫。

c)将转膜板装入电极槽中，倒入预冷的转膜缓冲液，电压设置为100V，转膜时间设置为90min，开始转膜。

d)转膜结束后，观察彩色蛋白marker是否已经印至PVDF膜上。而后使用5％脱脂牛奶室温封闭2h，以减少抗体非特异性结合，降低背景。

(4)免疫结合和显影

a)按照相应目的蛋白分子量大小和蛋白marker裁剪PVDF膜。

b)将分割好的PVDF膜浸泡在抗体稀释液(按照各抗体说明书所指示的稀释比例，使用专用抗体稀释液稀释相应抗体)中，4℃孵育过夜，确保抗体与样品蛋白充分结合。

c)一抗孵育结束后，回收抗体，使用TBST溶液脱色摇床上洗膜5次，每次5min。

d)加入对标不同一抗种属来源的HRP标记的二抗，室温孵育2h。

e)二抗孵育结束后，使用TBST溶液脱色摇床上洗膜5次，每次5min。利用ECL化学发光液将PVDF膜上的条带于蛋白成像系统中曝光显示。

5、病理组织学

5.1结肠炎小鼠肠组织样本制备

实验处理结束后，收集各组结肠炎小鼠大肠组织并量取长度。剖开肠腔，去除其内的粪便和黏液。PBS涮洗两遍后，浸泡于4％多聚甲醛溶液固定48小时，而后进行相应的病理学技术处理与检测。

5.2肠组织石蜡切片制备

将经过4％多聚甲醛溶液固定处理后的肠组织进行脱水、透明、浸蜡和包埋等流程后，制作成组织蜡块，为下步H&E染色做好准备。

表1石蜡包埋组织制作流程表

5.3 H&E染色

(1)二甲苯脱蜡10min，重复3次。

(2)无水乙醇4min。

(3)95％乙醇1min。

(4)85％乙醇1min。

(5)75％乙醇1min。

(6)自来水冲洗1min。

(7)苏木素染色5min。

(8)自来水冲洗复蓝。

(9)伊红染色2min。

(10)75％乙醇脱水10s。

(11)85％乙醇脱水10s。

(12)95％乙醇脱水1min。

(13)无水乙醇脱水4min。

(14)二甲苯透明3min。

(15)中心树胶封固。

6、酶联免疫吸附实验

(1)麻醉实验小鼠，摘取一侧眼球后，收集小鼠全血。待血液完全凝结，2400r.p.m.离心30min后，小心吸取上层血清，注意避免吸到红色血细胞。

(2)将50μL血清样本或细胞上清样本和50μL试剂盒中样品分析缓冲液依次加入样品孔中混匀，用封板膜(透明)封住反应孔，而后将ELISA板放置于水平摇床上混匀，室温孵育120min。其中将只加有TMB溶液和终止液的实验孔设定为空白孔。

(3)孵育结束后，甩出ELISA板中的液体，使用洗涤液洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。

(4)加入生物素化抗体100μL/孔(空白孔除外)，用封板膜(透明)封住反应孔，而后将ELISA板放置于水平摇床上混匀，室温孵育60min。

(5)孵育结束后，甩出ELISA板中的液体，使用洗涤液洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。

(6)加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin 100μL/孔(空白孔除外)。用封板膜(白色)封住反应孔，而后将ELISA板放置于水平摇床上混匀，室温避光孵育20min。

(7)孵育结束后，甩出ELISA板中的液体，使用洗涤液洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。

(8)加入显色剂TMB溶液100μL/孔(包括空白孔)，用封板膜(白色)封住反应孔，而后将ELISA板放置于水平摇床上混匀，室温避光孵育20min。

(9)加入终止液50μL/孔(包括空白孔)，混匀后立即使用酶标仪测量A450处的样品吸光度值。

7.统计学分析

使用Graphpad Prism 8软件进行数据结果处理和作图。所有数据均表示为均数±标准差。对于两组比较使用非配对双尾t检验来检测两组数据间的统计学差异；对于多组比较使用one-way ANOVA 检验来检测多组数据间的统计学差异。其中P小于0.05表示为具有统计学差异。

实施例1 NAD⁺代谢调控炎症激活的MSCs趋化因子和免疫抑制因子的表达

使用炎症因子组合IFN-γ和TNF-α作为赋能MSCs免疫调控功能的手段，并通过RNA-seq技术检测在使用FK866(哺乳动物细胞中主要负责NAD⁺分子生成的补救合成途径中关键限速酶NAMPT的小分子抑制剂)处理激活后的MSCs中全局基因的表达改变。结果如图2-4所示。

图2中，(A)为GSEA分析经IFN-γ(10ng/mL)和TNF-α(10ng/mL)刺激联合NAMPT抑制剂FK866(50nM)处理24h后趋化轴和免疫反应基因的富集情况。NES代表归一化富集分数；P_adj代表使用Benjamini-Hochberg方法进行多重比较所校正后的P值。(B)为差异性表达的趋化因子和免疫抑制因子的基因火山图。炎症激活后的细胞表达不同的趋化因子和免疫抑制因子是MSCs发挥免疫调控功能的主要机制。然而通过对GSEA中趋化轴和免疫响应基因集的富集分析得出，在使用FK866干扰胞内NAD⁺稳态后，MSCs的免疫调控功能得到了极大的抑制(图2A)，具体表现在多种趋化因子和免疫抑制因子的表达下降(图2B)。

图3中，(A-F)为检测MSCs经IFN-γ(10ng/mL)和TNF-α(10ng/mL)刺激联合NAMPT抑制剂FK866(50nM)处理24h后胞内趋化因子和免疫抑制因子的基因和蛋白表达情况以及培养上清中NO的含量。从图3中可知，使用实时荧光定量PCR检测技术验证了炎症因子IFN-γ和TNF-α处理能够诱导MSCs中关键趋化因子(CCL5、CXCL9和CXCL11)和免疫抑制因子(HO-1、COX2和iNOS)的大幅表达。然而，当联合使用NAMPT抑制剂FK866耗竭胞内NAD⁺分子后，以上趋化因子和免疫抑制因子的表达受到强烈地抑制(图3A-E)，作为MSCs特异性抑制活化T细胞增殖的效应分子NO也在NAMPT失能后产出大量降低(图3F)。

图4中，(A-C)为检测MSCs经IFN-γ(10ng/mL)和TNF-α(10ng/mL)刺激联合NAMPT激动剂P7C3(5μM)处理24h后胞内免疫抑制因子的基因表达情况。可见，使用NAMPT激动剂P7C3增强炎症激活后的MSCs胞内NAD⁺代谢会进一步提升免疫抑制因子的表达。

另外，使用慢病毒干扰技术敲低MSCs中NAMPT表达后，MSCs中趋化因子和免疫抑制因子的表达情况如图5所示。

图5中，(A)为使用慢病毒干扰技术敲低MSCs中NAMPT的效率。(B-F)为使用慢病毒敲低NAMPT后的MSCs经IFN-γ(10ng/mL)和TNF-α(10ng/mL)联合刺激24h后胞内趋化因子和免疫抑制因子的基因和蛋白表达。(G)为使用慢病毒敲低NAMPT后的MSCs经IFN-γ(10ng/mL)和TNF-α(10ng/mL)联合刺激24h后培养上清中NO的含量。可见，使用慢病毒干扰技术敲低MSCs中NAMPT表达致使其失能也同样废除了炎症激活的MSCs中关键趋化因子(CCL5、CXCL9和CXCL11)和免疫抑制因子(HO-1、COX2和iNOS)的表达(图5A-F)。此外，活化T细胞增殖抑制分子NO也在NAMPT敲低后的MSCs中产出大量降低(图5G)。综合以上结果，表明了NAD⁺代谢是驱动MSCs趋化因子和免疫抑制因子表达，发挥干细胞免疫调控功能的关键因素。

实施例2 NAD⁺代谢调控MSCs的疾病治疗效能

在DSS诱导的结肠炎模型第2天将不同慢病毒转染的MSCs通过尾静脉输注至小鼠体内，每日监测各组小鼠体重变化、腹泻情况、直肠出血情况以及机体活动状态，NAMPT失能的MSCs对结肠炎的治疗效果如图6-7所示。图6中，(A)为在DSS诱导的结肠炎的第2天通过尾静脉给予小鼠不同慢病毒转染的MSCs，其中，只接受PBS处理的小鼠作为疾病治疗的同型对照。(B)为疾病期各组小鼠的体重变化曲线。(C)为根据结肠炎小鼠体重丢失情况、腹泻程度、直肠出血程度以及机体活动状况综合评算出机体的疾病活动指数。(D)为安乐死小鼠后解剖分离出各组小鼠的结肠组织并比较其长度。图7中，(A)为根据肠壁增厚情况、隐窝损伤情况和炎症细胞浸润情况综合评算出各组结肠组织的组织学评分。比例尺：250μm。(B)使用酶联免疫吸附测定法分析各结肠炎小鼠血清IL-6水平。(C-D)为利用流式细胞术统计结肠炎小鼠肠系膜淋巴结和肠组织浸润的免疫细胞总数。

结果显示，单次静脉输注对照序列转染的Ctrl-shRNA MSCs可显著缓解结肠炎所引发的体重减轻(图6B)，同时也可缓解结肠炎小鼠的腹泻和便血症状，提高它们的活跃程度，降低疾病活动指数，改善结肠缩短情况(图6C-D)。在Ctrl-shRNA MSCs处理的结肠炎小鼠中，其肠壁增厚情况、隐窝损伤情况和炎症细胞浸润都得到了改善，大大降低了结肠炎小鼠的组织学评分(图7A)。另外，指示结肠炎是否发生恶性转归的重要免疫学指标血清IL-6也在Ctrl-shRNA MSCs治疗后显著降低，同时还伴有流式计数的肠系膜淋巴结(mesentericlymph nodes，MLN)和肠组织浸润的免疫细胞数量的降低(图7B-7D)。然而，转染NAMPT-shRNA慢病毒的MSCs却未能缓解结肠炎小鼠以上的疾病指征(图6-7)。

为研究提升胞内NAD⁺代谢是否可以进一步提升MSCs的疾病治疗效应，本发明在DSS诱导的结肠炎模型第2天将不同预处理的MSCs通过尾静脉输注至小鼠体内，其中只接受PBS处理的小鼠作为疾病治疗的同型对照。每日监测各组小鼠体重变化、腹泻情况、直肠出血情况以及机体活动状态，具体实验流程如图8A所示。图8中，(B)为每日记录小鼠体重，绘制疾病期各组小鼠的体重变化曲线。(C)为根据结肠炎小鼠体重丢失情况、腹泻程度、直肠出血程度以及机体活动状况综合评算出机体的疾病活动指数。(D)为安乐死小鼠后解剖分离出各组小鼠的结肠组织并比较其长度。(E)为根据肠壁增厚情况、隐窝损伤情况和炎症细胞浸润情况综合评算出各组结肠组织的组织学评分。比例尺：100μm。(F)为使用酶联免疫吸附测定法分析各结肠炎小鼠血清IL-6水平。(G)为利用流式细胞术统计结肠炎小鼠肠组织浸润的免疫细胞总数。

结果显示，单次静脉输注较少数量的MSCs(使用DMSO预处理)未能缓解结肠炎所引发的体重减轻、腹泻和便血症状，也未能提高它们的活跃程度、降低疾病活动指数和改善结肠缩短情况(图8B-8D)。在输注DMSO预处理(24h)的MSCs的结肠炎小鼠中，其肠壁增厚情况、隐窝损伤情况和炎症细胞浸润也都未得到改善，结肠炎小鼠的组织学评分未出现下降(图8E)。另外，指示结肠炎是否发生恶性转归的重要血清标志物IL-6和肠组织浸润的免疫细胞数量都未降低(图8F-8G)。然而，输注同等数量NAMPT激动剂P7C3预处理(24h)的MSCs却可以显著缓解结肠炎小鼠以上的疾病指征。综合以上动物实验结果，表明了NAD⁺代谢是驱动MSCs发挥炎症性疾病治疗效应的关键因素。使用NAMPT激动剂P7C3增强炎症激活后的MSCs胞内NAD⁺代谢可以提升干细胞的疾病治疗效能。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种用于增强间充质干细胞效能的组合物，其特征在于：所述组合物包括NAMPT激动剂。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述NAMPT激动剂为P7C3和/或SBI-797812。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物中NAMPT激动剂的浓度为1-50μM。

4.一种增强间充质干细胞效能的方法，其特征在于：采用权利要求1-3任一项所述的组合物培养间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述间充质干细胞在所述组合物中培养18-96h。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述间充质干细胞为人源、鼠源、猪源或兔源间充质干细胞。

7.权利要求4-6任一项所述的方法制备得到的间充质干细胞。

8.一种用于治疗以异常炎症反应为特征的免疫性疾病的药物，其特征在于：所述药物包含权利要求7所述的间充质干细胞制备的制剂。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述以异常炎症反应为特征的免疫性疾病为结肠炎、急性肝炎、类风湿性关节炎、急性肺炎或移植物抗宿主病。

10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述药物增强间充质干细胞胞内免疫抑制因子的表达。

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