KR20080106332A - 인간 배아 줄기 세포 및 그의 유도체를 포함하는 조성물, 그의 사용 방법 및 제조 방법 - Google Patents

인간 배아 줄기 세포 및 그의 유도체를 포함하는 조성물, 그의 사용 방법 및 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 배아 줄기 (hES) 세포 및 그의 유도체의 제제를 포함하는 제약 조성물, 및 인체로의 그의 이식 방법에 관한 것이며, 여기서 이식은 광범위한 현재 불치의 및 말기의 의학적 상태, 질환 및 장애의 증상의 임상적 반전, 치유, 안정화 또는 퇴행의 정지를 야기한다. 본 발명은 추가로 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 신규 줄기 세포주의 신규 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 줄기 세포의 단리, 배양, 유지, 증식, 분화, 저장 및 보존에 관한 것이다.
인간 배아 줄기 세포, hES 세포, 태아 줄기 세포

Description

인간 배아 줄기 세포 및 그의 유도체를 포함하는 조성물, 그의 사용 방법 및 제조 방법 {COMPOSITIONS COMPRISING HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS AND THEIR DERIVATIVES, METHODS OF USE, AND METHODS OF PREPARATION}
본 발명은 현재 불치의, 말기의 및 의학적 질환, 상태 또는 장애의 치료에서 사용하기 위한, 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 인간 배아 줄기 (hES) 세포 또는 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 이식 프로토콜을 통해 hES 세포를 사용하는, 임상적 장애 및 말기의 또는 현재 불치의 상태의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 신규 줄기 세포주의 신규 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 줄기 세포의 단리, 배양, 유지, 증식, 분화, 저장 및 보존에 관한 것이다.
많은 인간 의학적 장애, 상태 및 질환은 현존하는 약물요법, 수술 또는 이식 방법을 통해서는 현재 불치이거나, 또는 말기이다.
줄기 세포는 분열하여 줄기 세포의 특성을 보유하는 "딸" 세포를 생성하거나, 또는 보다 미세분화된 세포 유형으로의 분화를 개시하는 딸을 생성하거나, 또는 각 유형의 하나의 딸 세포를 생성하는 능력을 갖는다. 따라서, 줄기 세포는 정상적인 인간 성장 및 발달에 중추적이며, 그의 고유 특징에 의해 또한 질환에 걸린 조직 또는 손상된 조직의 재생을 위한 새로운 세포의 잠재적 공급원이다. 줄기 세포는 모든 발달 단계에 존재하며, 성인의 많은 조직 (가능하게는 대부분의 조직)에 존재한다. 상이한 조직으로부터의 줄기 세포 및 상이한 발달 단계로부터의 줄기 세포는 정상적으로 발생하는 세포의 수 및 유형의 측면에서 다양하다. 이 분류에 따른 줄기 세포의 주요 부류는 배아 줄기 세포, 체세포 줄기 세포 및 배아 배 세포이다.
수정 후 가장 초기 단계에서 (8개 세포 단계까지), 모든 배아 세포는 전능하다 (즉, 이들은 배아외 조직, 예컨대 태반 및 제대을 비롯하여 전체 발달에 필요한 모든 세포 유형으로 발달하는 능력을 가짐). 약 2일 내지 5일 후에 포배 단계에 도달된다. 50 내지 100개의 이러한 세포 공 내에 내부 세포 군체가 놓이고, 이는 적합한 배아로 발달할 것이다. 내부 세포 군체는 이 발달 단계에서의 모든 세포 및 고유한 부류의 줄기 세포; 배아 줄기 세포의 약 1/4을 포함한다. 배아 줄기 세포는 신체의 200개 정도의 세포 유형 각각으로 분화하는 선천성 능력 또는 잠재성을 가지며, 다능성이라고 기재되어 있다. 발달에서 모든 조직 유형에 기여하는 hES 세포의 능력은 아직 완전히 정립되지 않았지만, 배양에서 장기간에 걸쳐 성장 되고, 그의 세포 유전자형 또는 표현형의 변화 없이 수적으로 증식되고, 이들 조건하에 그의 다능성 상태를 유지할 수 있다.
포배 단계를 넘어서, 줄기 세포는 배아, 태아 및 성체에서 감소하는 비율의 세포를 포함한다. 태아 및 성체에서 많은 조직, 아니면 대부분의 조직은 줄기 세포를 함유하며, 이는 이들이 정상적으로 존재하는 조직을 재생하기 위해 그의 정상적인 위치에서 제한된 수의 특정 세포 유형으로 분화하는 잠재성을 갖는다. 이들 줄기 세포 (체세포 줄기 세포)는 다잠재성이며, 정상적으로 인체의 모든 세포 유형이 아닌 일부 세포 유형으로 발생하는, 배아 줄기 세포보다 더 제한된 잠재성을 가질 수 있다. 체세포 줄기 세포의 주요 공급원은 태아 및 성인 골수 및 제대혈이다.
배아 줄기 세포는 세포 분화 사건의 연구, 약물 스크리닝을 위한 우수한 시험관내 시스템으로서, 및 미래 재생 치료 적용을 위한 특정 미세분화된 세포의 주요한 공급원으로서 사용된다.
다능성인 배아 줄기 세포는 임의의 분화된 세포 유형으로 발생하는 발생 잠재성을 갖는다. 따라서, 특정 세포 유형의 유전적 또는 후천적 기능부전 또는 탈조절로부터 야기되는 질환은 결손 세포의 대체 및 영향받은 기관 또는 조직의 재생에 의한 hES 세포 또는 그의 유도체의 이식에 의해, 및 또한 휴면상태 조직 및 죽어가는 조직의 자극에 의해 잠재적으로 치료가능하다.
hES 세포 또는 그의 유도체의 인체로의 이식은 미충족 의학적 필요성을 처리하기 위한 수단으로서 잠재성을 갖는 것으로 제안되었다.
hES 세포의 이식은 광범위한 질환, 상태 및 장애의 치료에 혁명을 일으킬 것이라고 광범위하게 고려되었으나, 최근 연구는 마우스 및 영장류에서의 전임상 연구로 제한되었다. 동물 모델에서 관찰되는 결과가 이러한 세포의 인간으로의 이식시 발생하는 진정 대표적인 사건인가가 의문이다. 더욱이, 개념의 임상적 사용 없이, 줄기 세포의 제약 조성물, 프로토콜, 투여 경로 및 투여량은 불확정 및 미시험된 상태로 남아있다. 또한, 배아, 또는 다른 종으로부터의 세포, 조직 및 기관의 이종이식 이외의 공급원으로부터 유래된 인간 줄기 세포가 임상에서 사용되었음에도 불구하고, 이들 시도는 크게 성공적이지 않았거나, 또는 여러 쇠약화 부작용을 제공하였다.
본 발명은 각종 현재 불치의 또는 말기의 상태, 질환 또는 장애를 앓고 있는 인간으로의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 제약 조성물의 이식을 제공한다.
미국 특허 제5,453,457호에는 원시 배 세포로부터 유래된 비-뮤린 포유동물 다능성 세포를 포함하고 염기성 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 백혈병 억제 인자를 포함하는 조성물이 개시되어 있다.
미국 특허 제6,800,480호는 세포외 매트릭스 상에서 증식하는 미분화된 hES 세포를 포함하는 조성물을 청구한다.
미국 특허 출원 제2003/0017587호에는 공급자 세포를 필요로 하지 않는 배양 배지를 사용하는, 낙태된 태아 또는 신선한 또는 동결된 절단 단계 포배로부터 얻은 미분화된 배아 줄기 세포의 시험관내 증식이 개시되어 있다. 단리하면, 환자로 이식시 잠재적 부작용의 측면에서 바람직하지 않은, 성장 인자, 태아 소 혈청, 뉴 런 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 또는 조건화 배지가 보충된 세포 배양 배지로 배아 줄기 세포를 도입한다. 또한, 상기 특허 출원에는 환자가 각 유형의 세포의 한 용량을 요구한다는 것을 제외하고는 유전적 또는 임상적 장애의 치료를 위해 사용되는 프로토콜에 대한 언급이 없다.
미국 특허 출원 제2004/0071665호는 심장병리의 치료를 위해 포유동물 줄기 세포를 사용하는 치료 방법을 제공한다. 상기 예는 심근원성 클러스터를 형성하도록 분화되고, 공급자 세포 상에서 배양된 후, 심근 경색이 있는 마우스의 심장의 3개의 부위에 주사된 배아 줄기 세포를 제공한다.
미국 특허 출원 제2004/0107453호에는 성인 줄기 세포의 수득, 유지 및 분화 방법, 및 치유적 치료에서의 그의 용도가 개시되어 있다.
미국 특허 출원 제2005/0124003호에는 태아 줄기 세포의 수득, 유지 및 분화 방법, 및 치유적 치료에서의 그의 용도가 개시되어 있다.
특히, 및 본 발명과 특히 관련하여, 척수 상해 (SCI)의 마우스 모델에서의 배아 줄기 세포의 이식은 급성 SCI의 치료의 일차 선택으로서 그의 미래 잠재성을 명백하게 나타내었다 (문헌 [McDonald et al., (1999) Nature Med. 5:1410]; [Kerr et al., (2003) J. Neurosci. 23:5131]; [Roy et al., (2004) Nature Biotechnology, 22:297]; [Hori et al., (2003) Stem Cells, 21:405]; [Harper, (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101:7123]). 동물 모델에서 나타난 효능에도 불구하고, 이식편대숙주 거부 문제점과 관련된 회의주의, 면역억제제의 일생 투여에 대 한 잠재적 필요성, 및 종양 및 기형종 형성은 실험적 인간 시험에서 전임상 안전성 및 효능의 재현을 위한 인가를 지연시켰다. 임상적 연구의 설계 및 본 발명에 대한 특정 관련성에 직면한 추가 문제점은 아직까지 정립된 투여 프로토콜 또는 스케쥴이 없고, 치료 유효량 또는 활성 제약 조성물이 무엇인가에 대한 연구, 또는 어떠한 세포 유형 또는 세포 조합이 사용되어야 하는가에 대한 연구가 없었다는 것이다.
그러므로, 본 발명의 목적은 생체적합성 용액, 담체 또는 매트릭스에 현탁되어 인간 사용에 적합한, 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물을 개발하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 현재 불치의 또는 말기의 장애의 치료용 프로토콜을 개발하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 SCI (척수 상해)의 치료용 프로토콜을 개발하는 것이다.
본 발명의 조성물은 제조하기 간편하고, 안전하고, 비용 효과적이고, 효율적이고, 용이하게 휴대가능하고, 측정가능하고, 양호한 저장수명을 가지며, 부작용, 예컨대 항체-항원 반응, 이상 신경지배, 종양형성, 기형종 형성 또는 이식편 숙주 거부가 없다. 또한, 본 발명은 오직 하나의 배아만을 필요로 하므로, 인간 배아의 연속적 공급은 필요치 않다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 프로토콜은 면역억제제 의 사용을 필요로 하지 않고, HLA 형결정에 의존적이지 않으며, 질환, 상태 또는 장애의 효과적인 치료를 위해 치료되는 대상체의 인종, 성별 또는 연령에 의존적이지 않고, 퇴행이 없으며, 투여 분야에서 이전 숙련에 대한 필요가 없다. 그러므로, 본 발명의 실시에 따른 제약 조성물에 의한 대상체의 치료는 세계적으로 임의의 적합하게 갖춘 임상 실험실에서 가능하다.
치료 목적으로 인간으로 인간 배아 줄기 세포를 이식하기 위해, 상기 세포는 오염, 예컨대 박테리아, 바이러스, 프리온 또는 바이로이드가 없다는 것이 중요하다. 표준 조작 실험실 실시, 예컨대 양호한 제조 및 양호한 임상 실시의 채택은 이러한 오염의 위험을 허용되는 수준으로 감소시킨다.
그러나, 환자에 대한 위험은 현존하는 세포 배양 방법을 통해 존재한다.
주요 위험은 인간 대상체로의 투여용 제약 제품에 보유된 세포 배양 배지의 성분이 투여되고, 그러므로 동물 시험에서 "안전성" 연구를 통해 예상될 수 없었던 예상치 못한 부작용을 통해 환자에게 위험을 나타낸다는 것이다.
그러므로, 이러한 위험의 제거가 바람직하다.
인간 대상체로의 투여용 배아 줄기 세포 배양 공급원의 특징은 하기 설계를 갖는 바와 같이 확인되었다: 이는 분화 없이 연장된 기간 동안 증식할 수 있고, 공여자의 모든 특징이 배양 중에 충실히 보유되는 핵형을 유지하고, 배양에 걸쳐 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 유도체로 분화하는 잠재성을 유지하고, 외인성 인자의 부재하에 배양시 분화하지 않을 것이며, 기형종을 발생시키지 않을 것이며, 면역원성이 아닐 것이며, 이상 연결 및 이소성 조직을 형성하지 않을 것이며, 손상된 조 직에 작용할 것이며, 생체내에서 연속적으로 분열하지는 않으나 천연 생장 주기에서 행하도록 프로그래밍된 바와 같이 분열할 것이다. 본 발명에 개시된 배양 방법 및 세포주에 존재하는 오염물질이 없어야 한다.
지금까지 연구의 주요 요점은 이들 요구사항을 충족시키는 배양 조건을 개발하는 것이었으나, 최근 이러한 조건은 준비되어 있지 않거나 또는 임상 시험을 통해 입증되지 않았다. 특히, 최근 연구는 인간 배아 줄기 세포 배양의 성장 및 탈분화를 위한 매트릭스로서 마우스 공급자 세포에 대한 요구사항의 제거에 집중되었다. 공급자 세포의 제거 및 "조건화 배지"의 보충을 통한 비공지된 성장 인자의 제공의 부분적 치료약은 또한 이상적인 배양 배지에서 허용되지 않는 위험을 나타내었다. 공급자 조건화 배지의 존재하에 배양된 인간 배아 줄기 세포는 오염의 고유 위험을 여전히 보유하므로, 인간으로의 이식 중에 허용되지 않는 위험을 보유한다.
인간에게 투여하기 위해 예정된 인간 배아 줄기 세포의 배양 조건의 설계에서의 추가 인자는 투여되는 제약 조성물에 존재할 수 있으나 세포 증식기 중에 필수적인 배지에서의 잔류 외인성 보충제에 대한 의문이다.
이들로는 염기성 섬유모세포 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자, 혈청, 알부민 또는 알부민 보충제, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 트랜스페린 또는 트랜스페린 보충제, 항산화제, 인슐린 또는 인슐린 치환물, 콜라겐 전구체 또는 콜라겐 전구체 치환물, 미량 원소, "조건화 배지"의 잔류물, 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충 제, 및 비타민 보충제가 포함된다.
이러한 추가 보충제의 잔류물은 인간 배아 줄기 세포의 이러한 대상체로의 이식 중에 환자의 안전성에 대한 불필요한 위험으로서 검토된다. 또한, 배양 배지로의 이러한 인자의 보충은 환경으로부터의 오염의 위험에 추가하고, 줄기 세포 치료요법의 미래 비용에 추가하고, 그러므로 광범위한 의학적 질환, 상태 또는 장애에서의 그의 적용성을 제한한다.
미국 특허 및 출원 제5,843,780호; 제5,690,926호; 제6,642,048호; 제6,800,480호; 제5,166,065호; 제6,200,806호; 제5,453,357호; 제6,090,622호; 제6,562,619호; 제6,921,632호, 제2006/0073587호 및 제2002/076747호를 비롯한 많은 접근법이 이들 위험을 감소시키기 위해 채택되었다.
그러나, 이들 접근법 중 어떠한 것도 인간에게 투여시 인간 배아 줄기 세포 및 그의 유도체의 효능 및 안전성에 영향을 줄 수 있는 잠재적 오염 인자가 없는, 인간 배아 줄기 세포 및 그의 유도체를 함유하는 제약 제품의 제조용 시스템을 제공하지 않는다.
그러므로, 본 발명의 다른 목적은 광범위한 의학적 장애에 바로 사용가능한 제약 제품의 제조를 위해 실질적으로 미분화된 상태의 hES 세포 및 그의 유도체의 증식을 위한 단순화된 세포 배양 시스템을 개발하는 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 목적은 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 줄 기 세포주를 제조하는 배양 기술을 제공하는 것이다.
<발명의 요약>
본 발명은 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물, 및 광범위한 상태, 질환 및 장애의 치료에서의 hES 세포 및 그의 유도체의 용도를 제공하며, 여기서 줄기 세포는 여러 투여 경로, 국부 적용 또는 병변내 삽입에 의해 인체로 도입된다.
본 발명은 추가로 근육내, 정맥내, 미측, 유리체내, 선조체내, 실질내, 경막내, 경막외, 안구후, 피하, 심장내, 낭내, 관절내 또는 경막내 주사, 경막외 카테터 주입, 지주막하 차단 카테터 주입, 정맥내 주입을 통한, 연무기를 통한, 스프레이를 통한, 질내 경로를 통한, 국부 눈 및 귀 점적을 통한, 치료 유효량의 hES 세포 또는 그의 유도체의 투여 스케쥴, 및 hES 세포 및 그의 유도체의 국부적 또는 병변내 투여 스케쥴을 포함하는, 말기의 또는 현재 불치의 질환, 장애 또는 상태를 앓고 있는 대상체의 치료 방법을 제공한다.
오염의 임의의 가망 및 부정적 부작용의 가능성을 회피하기 위해, 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 비타민 보충제, 아미노산 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 hES 세포 또는 그의 유도체를 사용하는 것이 바람직하다. hES 세포 및 그의 유도체는 임의의 공지되고 승인된 세포 배양 방법을 통해 얻을 수 있으며, 이는 공급자 세포가 없고, 임의의 공급원으로부터의 오염물이 없고, 인간 이식에 안전하다. hES 유도체는 인체로부터의 분화된 세포를 추가로 포 함한다.
본 발명은 제약상 허용되는 생체적합성 용액 또는 임의의 다른 담체 비히클에 현탁된, 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 포함하는, 말기의 또는 현재 불치의 질환, 장애 또는 상태의 치료용 제약 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 생체적합성 물질 또는 매트릭스에 봉입된, 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 포함한다. 생체적합성 물질 또는 매트릭스는 피브로넥틴, 여러 유형의 콜라겐, 라미닌, 케라틴, 피브린, 피브리노겐, 히알루론산, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 아가로스 또는 젤라틴을 비롯한 다당류, 폴리펩티드 또는 단백질을 비롯한 생체중합체에서 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 줄기 세포가 적절한 생존율을 갖는, 즉 줄기 세포가 하나 이상의 본 발명의 방법에 유용하기에 충분히 높은 생존율을 갖는 바로 사용가능한 약물 형태일 수 있다. 한 실시양태에서, 줄기 세포는 약 40% 초과, 예를 들어 약 50%, 60%, 70% 또는 80% 초과의 생존율을 갖는다. 조성물은 항미생물제, 항박테리아제, 호르몬 제품 또는 다른 약제를 추가로 포함할 수 있다.
조성물의 제조를 위해, 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 하나 이상의 그의 유도체, 예컨대 조혈 줄기 세포 선조, 뉴런 줄기 세포 선조, 간엽 줄기 세포 선조, 인슐린-생성 줄기 세포 선조, 간세포 줄기 세포 선조, 심장 줄기 세포 선조, 상피 줄기 세포 선조 또는 이들의 혼합물을 담체 비히클 약 0.25 ml 내지 약 100 ml에 현탁한다. 한 실시양태에서, 약 750,000 내지 약 8천만개의 hES 세포를 담체 비히클 약 0.25 ml 내지 약 10 ml에 현탁한다. 미분화된 줄기 세포의 일부가 조성물에 남아있을 것이나, 집단 중 특정 분화된 줄기 세포 선조 유형에 대한 풍부는 우선적이다. 한 실시양태에서, 미분화된 줄기 세포의 부분은 세포의 총 집단의 약 80% 이하일 것이다. 다른 실시양태에서, 미분화된 줄기 세포의 부분은 세포의 총 집단의 약 40% 이하일 것이다.
본 발명에 따라 치료되거나 또는 완화될 수 있는 말기의 질환 및 다른 장애 또는 상태로는 암, 간 및 신장 장애, 신경계 장애, 피부 장애, 자가면역 장애, 유전적 장애, 눈 장애, 근골격 장애, 수정능 및 생식 장애 및 심혈관 장애가 포함되나 이에 제한되지 않으며, 급성 골수성 백혈병, 선암종, 관절염, 성상세포종, 청신경 위축, 자폐증, 자가면역 장애, 알츠하이머병, 강직 척추염, 베커 근이영양증, 뇌 손상, 화상, 뇌혈관 발작, 뇌성 마비, 혼수, 각막 궤양, 각막 이식편 거부, 신경계의 피질기저 변성, 관상 동맥 질환, 당뇨병, 치매, 다운 증후군, 뒤시엔느 근이영양증, 말기 신장 질환, 에르브 마비, 안면 견갑 근이영양증, 수정능 장애, 프리이드라이히 운동실조, 심부전, 간세포 암종, 유전성 척수 운동 뉴런 질환, 헌팅톤 무도병, 크라베 질환, 지대형 이영양증, 간 경화증, 황반 변성, 정신 지체, 다 발성 경화증, 운동 뉴런 질환, 심근 경색, 신증후군, 니만 픽 질환, 피부의 악성 궤양, 올리브교 소뇌 위축, 시신경 위축, 파킨슨병, 전격 쇼크 후 뇌병증, 광견병 백신 후 뇌병증, 압박성 궤양, 진행성 핵상 마비, 건선, 안구로, 제한성 심근병증, 색소성 망막염, 우각 차단, 사르코이드증, 동 서맥, 척수 근이영양증, 척수 소뇌 운동실조, 스티븐 존슨 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 저혈소판증, 지중해빈혈, 궤양성 대장염, 식물 상태, 낭성 섬유증, 간질성 폐 질환, 무정자증, 원발성 난소 기능상실, 아프타 궤양 (Aphthous Ulcer), 호르몬 불균형, 골관절염, 호너 증후군 및 불완전 골형성증, 및 채널병증 및 저감마글로불린혈증이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 본 발명은
a) 피하 주사를 통해 약 750,000 내지 약 8천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 투여하는 단계;
b) 예정된 기간 후 단계 (a)를 반복하고, 그 후 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 근육내 주사를 통해 투여하는 단계;
c) 뉴런 줄기 세포 선조 및 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 정맥내 주사 또는 주입을 통해 투여하는 단계;
d) 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 경막외 주사를 통해 투여하고, 임상 시험 및/또는 신경 시험에 의해 분석된 대상체의 상태에 의존적으로 예정된 기간 후 상기 용량을 반복하는 단계;
e) 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 미측 주사를 통해 투여하는 단계;
f) 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 경막내 주사 또는 지주막하 차단 카테터를 통해 투여하는 단계;
g) 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 경막외 주사 또는 경막외 카테터를 통해 투여하는 단계;
h) 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 척추 측부 상으로 심부 척수 주사를 통해 투여하는 단계; 및
i) 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 정맥내 주입을 통해 투여하는 단계
를 포함하며, 여기서 단계 (a) 및 (b)는 먼저 수행되고 나머지 단계는 임의의 순서로 수행될 수 있는 대상체의 SCI의 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 단계 (g) 전의 단계 (f)는 대상체가 상기 SCI로부터의 회복의 임상 징후를 나타낼 때까지 1회 이상 반복된다.
본 발명은 또한 동물 생성물, 공급자 세포, 조건화 배지, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자 또는 가용성 스틸 인자가 없는 배지에서 배양된 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를, 근육내 주사 또는 정맥내 주사 또는 경막외 주사 또는 경막외 카테터 또는 안구후 주사 또는 피하 주사 또는 심장내 주사 또는 낭내 주사 또는 경막내 주사를 통해 또는 국부 적용 또는 병변내 적용에 의해 투여하는 것을 포함하는, 질환, 장애 또는 상태가 있는 대상체의 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 질환, 장애 또는 상태는 말 기의 또는 현재 불치의 질환, 장애 또는 상태이다.
본 발명은 또한 뉴런 줄기 세포 선조 및 조혈 줄기 세포 선조를 단독으로 또는 조합으로 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 경막내 주사, 경막외 카테터 주입 및 지주막하 차단 카테터 주입을 통해 투여하는 것을 포함하는, 발달성, 퇴행성, 가족성 및 외상성 신경계 장애 및 뇌혈관 발작의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 피하 또는 정맥내 주사를 통해 투여하는 것을 포함하는, 피부 장애의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 국소 또는 국부 적용을 통해 및 근육내 주사를 통해 투여하는 것을 포함하는, 와창의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 근육내 주사 또는 정맥내 주사 또는 피하 주사 또는 관절내 주사 또는 정맥내 주입, 또는 이들의 조합을 통해 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 장애의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 뉴런 줄기 세포 선조 및 조혈 줄기 세포 선조를 단독으로 또는 조합으로 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 경막내 주사, 경막외 카테터 주입 또는 지주막하 차단 카테터 주입, 또는 이들의 조합을 통해 투여하는 것을 포함하 는, 유전적 장애의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 정맥내 주사, 근육내 주사, 또는 생존가능한 조직 및 죽은 조직 또는 이들의 조합의 접합점에서의 국소 적용을 통해 투여하는 것을 포함하는, 괴저의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 또는 국소 적용을 통해 현탁액으로 또는 겔, 연고, 매트릭스, 페이스트 또는 에어로졸 스프레이와 같은 생체적합성 담체에 혼합되어 투여하는 것을 포함하는, 노화와 관련된 상태의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 인슐린-생성 선조 세포를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 정맥내 또는 근육내 주사 또는 이들의 조합을 통해 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 심장내 주사, 혈관조영 또는 수술 도중 직접 주사를 통해 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 장애의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 조혈 줄기 세포 선조, 알부민-생성 줄기 세포 선조 및 빌리루빈-생성 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 정맥내 주입 또는 국소 주사를 통해 투여하는 것을 포함하는, 간 및 신장 장애의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 국소 근육내 주사, 고환내 주사를 통해 또는 부고환 근처 피하 피부 주사를 통해 투여하는 것을 포함하는, 수정능 및 생식 장애의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 뉴런 줄기 세포 선조 및 조혈 줄기 세포 선조를 단독으로 또는 조합으로 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사 또는 정맥내 카테터 주입을 통해 투여하는 것을 포함하는, 근골격 장애의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 뉴런 줄기 세포 선조, 조혈 줄기 세포 선조 및 간엽 줄기 세포 선조를 단독으로 또는 조합으로 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 국소 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 안구후 주사, 유리체내 주사 또는 국부 적용을 통해 투여하는 것을 포함하는, 눈 장애의 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체는 안구후 주사를 통해 투여된다. 다른 실시양태에서, 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체는 유리체내 주사를 통해 투여된다. 다른 실시양태에서, 간엽 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체는 각막 찰과상의 치료를 위해 눈 위에 배 치되는 콘택트 렌즈에 적용된다 (예를 들어, 콘택트 렌즈를 세포로 코팅하기 위해 콘택트 렌즈는 hES 세포 및/또는 그의 유도체와 배양된 후, 렌즈는 약 24시간 동안 눈 위에 위치됨).
본 발명은 또한 조혈 줄기 세포 선조를 단독으로 또는 조합으로 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 근육내 주사, 정맥내 주사, 스프레이 또는 연무기를 통해 투여하는 것을 포함하는, 폐 장애의 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 750,000 내지 1억6천만개의 조혈 줄기 세포 선조는 생리식염수 2 ml가 첨가된 연무기를 통해 투여된다. 다른 실시양태에서, 750,000 내지 1억6천만개의 조혈 줄기 세포 선조는 스프레이 (퍼프)를 통해 투여된다.
본 발명은 또한 조혈 및 뉴런 줄기 세포를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 근육내 및 정맥내 경로를 통해 투여하는 것을 포함하는, 호르몬 장애의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 조혈 및 뉴런 줄기 세포를 조합으로 또는 단독으로 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 근육내 및 정맥내 경로를 통해 투여하는 것을 포함하는, 아프타 궤양 및 다른 궤양의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 근육내, 정맥내 또는 관절내 주사를 통해 투여하는 것을 포함하는, 무릎관절 및 고관절의 골관절염의 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 750,000 내 지 1억6천만개의 조혈 줄기 세포 선조는 관절내로 투여된다.
본 발명은 임의의 부작용, 예컨대 기형종 형성, 종양 형성, 항원성 문제점 또는 이식편대숙주 거부 없이 인간에서 이식을 위해 사용될 수 있는 hES 세포 및 그의 유도체의 배양에 적용될 수 있는 세포 배양 방법을 제공한다.
배양 방법의 설계는 구체적으로 인간에서 이식 후 치료적으로 최적의 활성에 충분한 생존율 및 적절한 특징의 hES 세포 및 그의 유도체의 제조를 위한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 세포 배양 방법은 hES 세포의 성장, 증식, 분화 및 저장을 위해 사용된다. 또한, 본 발명은 해동시 직접 이식에 적합한 저장 조건에서 저장된 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 포함하는 바로 주사가능한 조성물에 관한 것이다.
실질적으로 미분화된 상태의 hES 세포의 유지를 위한 현존하는 세포 배양 방법과는 대조적으로, 배양 배지는 보충제, 예컨대 염기성 섬유모세포 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자, 혈청, 알부민 또는 알부민 보충제, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 트랜스페린 또는 트랜스페린 보충제, 항산화제, 인슐린 또는 인슐린 치환물, 콜라겐 전구체 또는 콜라겐 전구체 치환물, 미량 원소, "조건화 배지"의 잔류물, 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 및 비타민 보충제를 함유하지 않는다.
hES 세포의 증식용 다른 세포 배양 방법과는 추가로 대조적으로, 본 발명의 실시는 배아유사 체의 형성을 유발하지 않으며, 이에 의해 수술적 절개에 대한 필요성을 회피한다. 본 발명의 생성물이 전체 인간 생성물이라는 이 점에서 이종이 식 (예를 들어, 동물 시험)이 필수적일 수 없다는 것에 주목할 가치가 있다. 제1 시험관내 수정 (IVF) 임신의 예는 결과적 예이다.
다른 세포 배양 방법과는 달리, 본 발명의 세포 배양 기술은 유의한 분화 없이 hES 세포의 거의 무제한적 증식을 허용한다. 본 발명의 주요 장점은 단일 배아가 많은 환자의 치료를 위해 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 제공하기에 충분하다는 것이다. 따라서, 인간 배아의 반복된 획득이 필요 없으며, 인간 배아의 사용과 관련된 많은 윤리적 문제점이 회피될 수 있다.
본 발명의 방법의 추가 장점은 hES 세포 및 그의 유도체가 면역학적 측면에서 보편적으로 허용되는 생성물이며, 환자와 세포의 교차-매칭이 요구되지 않으며, 면역억제가 필요하지 않다는 점이다.
본 발명의 한 측면은
(a) 최소 필수 배지에서 2 내지 7일이 경과된 배아를 수집하는 단계,
(b) 기계적 수단에 의해 배아로부터 hES 세포를 단리하는 단계
를 포함하는, hES 세포의 단리 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면은
(a) 최소 필수 배지, 프로게스틴 및 β-인간 융모 성선자극호르몬 (βhCG) 효능제(agonist)로 구성된 세포 배지에 hES 세포를 도입하는 단계; 및
(b) 줄기 세포를 약 34℃ 내지 약 38℃의 온도에서 약 3.5% 내지 약 6% 이산화탄소의 환경하에 약 12시간 내지 약 48시간 동안 인큐베이션하는 단계
를 포함하는, 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보 충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 인간 배아 줄기 세포의 증식 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은
(a) 최소 필수 배지로 구성된 세포 배양 배지에 hES 세포를 도입하는 단계; 및
(b) 줄기 세포를 약 34℃ 내지 약 38℃의 온도에서 약 3.5% 내지 약 6% 이산화탄소의 환경하에 약 12시간 내지 약 48시간 동안 인큐베이션하는 단계
를 포함하는, 부분적으로 분화된 단계 전의 단계에 있고, 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 hES 세포의 성장 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은
(a) 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보조 미네랄 조합, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 인간 배아 줄기 세포를 얻는 단계,
(b) 상기 줄기 세포를 원심분리하여 펠렛을 얻는 단계, 및
(c) 펠렛을 생체적합성 용액에 현탁하는 단계
를 포함하는, 인간 이식용의 바로 사용가능한 인간 배아 줄기 세포 제제의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은
(a) 본 발명의 방법에 의해 제조된 줄기 세포를 취하는 단계,
(b) 동결보존제를 첨가하는 단계, 및
(c) 세포를 -4 내지 -80℃에서 동결하는 단계
를 포함하는, 생존가능한 상태의 인간 배아 줄기 세포의 저장 방법에 관한 것이다.
이러한 보충제의 부재하에 본 발명의 실시에 따라 hES 세포를 성장시키는 목적은 배양물로의 박테리아, 진균, 바이러스 또는 다른 오염물의 도입의 위험을 감소시키는 것이다. 이는 감염의 위험 및 세포의 특징의 변동성을 감소시킨다.
본 발명의 추가 목적은 임의의 오염 잔류물이 없고 인간에서 사용하기에 안전한 형태의 hES 세포 및 그의-유도체의 제조 및 증식을 위한 간단하고 비용 효과적이며 측정가능한 방법을 제공하는 것이다.
그러므로, 본 발명의 목적은 모든 공동오염물의 투여의 위험이 감소되고 보조 인자의 잔류 오염이 제거된 제약 제품을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 염색체 이상 또는 유전자 불안정성의 위험을 감소시키는 세포 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 배양물이 이식된 환자에서 기형종 형성의 위험을 감소시키는 세포 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 배양물이 이식된 환자에서 종양 형성의 위험을 감소시키는 세포 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 배양물이 이식된 환자에서 항원성 문제점 또는 이식편대숙주 거부 문제점의 위험을 감소시키는 세포 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 구체적으로 안전성 및 품질의 국제 조절 표준에 순응하는 형태이고, 그러므로 치료 목적을 위해 인간 환자에게 바로 주사가능한 형태인, hES 세포 및 그의 유도체, 및 생체적합성 배지를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 생체적합성 용액에 현탁되고, 저장, 수송 또는 인간으로의 직접적 이식을 위한 용기에 함유된, hES 세포 및/또는 그의 유도체의 현탁액을 포함하는 제조 제품을 제공한다.
본 발명은 또한 hES 세포 및 그의 유도체의 증식 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 hES 세포 및 그의 유도체의 증식 방법, 및 그의 분화의 억제 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 질환, 상태 또는 장애를 앓고 있는 인간으로의 이식시 치료 효과를 제공하는 hES 세포 및 그의 유도체의 성장 방법을 제공한다.
정의
하기 발명의 상세한 설명 및 실시예에서 많은 용어가 사용된다. 본 명세서 및 청구의 범위의 명백하고 일치된 이해를 제공하기 위해, 주어진 이러한 용어의 범위를 비롯하여 하기 정의를 제공한다.
본 발명을 일반적으로 기재하는데 사용된 용어가 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 그의 통상적인 의미를 유지하는 방식으로 사용된다는 것을 주목할 수 있다.
"배아 줄기 세포"는 인간의 다능성 세포 (즉, hES 세포)를 지칭한다. 한 실시양태에서, hES 세포는 포배전 단계 배아로부터 단리된다. 다른 실시양태에서, hES 세포는 적어도 부분적으로 분화된 세포 (예를 들어, 다능성 세포)의 탈분화에 의해 제조되며, 실시로 전능성이다. hES 세포의 제조 방법은 익히 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제5,843,780호, 제6,200,806호, 제7,029,913호, 제5,453,357호, 제5,690,926호, 제6,642,048호, 제6,800,480호, 제5,166,065호, 제6,090,622호, 제6,562,619호, 제6,921,632호 및 제5,914,268호, 미국 공개 출원 제2005/0176707호 및 국제 출원 제WO2001085917호에 교시되어 있다.
"태아 줄기 세포"는 태아 조직, 즉 자궁에서 배아의 착상 후 발달하는 인간의 조직으로부터 유래된 줄기 세포를 지칭한다.
"다잠재성(multipotent)"은 세포의 밀접하게 관련된 족의 세포만을 생성할 수 있는 줄기 세포를 지칭한다.
"다능성(pluripotent)"은 전능성 세포의 자손이며, 전능성 줄기 세포를 제외하고 임의의 세포 유형으로 성장할 수 있는 줄기 세포를 지칭한다.
"전능성"은 난자 및 정자 세포의 융합으로부터 생성된 줄기 세포를 지칭한다. 수정된 난자의 제1 몇몇 분열에 의해 생성된 세포는 또한 전능성이다. 이들 세포는 예외 없이 임의의 유형의 세포로 성장할 수 있다.
"치료 유효량"은 본 발명의 하나 이상의 측면의 실시의 문맥 내에 의도된 결과를 생성하는데 효과적인 성분, 예컨대 배아 줄기 세포, 신경 선조 세포, 뉴런 세포, 조혈 줄기 세포 선조, 심장 줄기 세포 선조, 또는 줄기 세포의 임의의 다른 유도체, 또는 다른 작용제 및 이들의 혼합물의 농도 또는 양을 기재하는데 본 명세서에서 사용된다.
용어 "이식하는" 및 "이식"은 본 명세서에 걸쳐 대상체의 중추 신경계에 대한 손상의 복구, 신경퇴행성 질환의 치료, 또는 뇌졸중에 의해 유발된 신경 손상의 효과, 심혈관 질환, 심장 발작, 또는 뇌 및/또는 척수 또는 다른 기관에 대한 물리적 상해 또는 외상 또는 유전적 손상 또는 환경적 발작 (예를 들어, 사고 또는 다른 활동에 의해 유발됨), 간 손상, 자가면역 장애, 성 기능장애 또는 생식 기능장애, 눈의 여러 부분의 변성, 신장 손상 등의 치료를 포함하나 이에 제한되지 않는, 세포가 본원에 기재된 질환, 장애 또는 상태의 치료 또는 완화와 관련하여 유리한 효과를 나타내도록 의도된 인체 내의 부위로 본 발명에 따른 배아 줄기 세포 및/또는 그의 유도체를 전달하는 방법을 기재하는데 동의어로 사용된다.
"생체적합성 용액"은 본 명세서에서 hES 세포 및/또는 그의 유도체가 이식을 위한 프로토콜에서의 사용을 위해 또는 임의의 다른 후속적 사용을 위해 현탁된 용액을 지칭하는데 사용된다. 이러한 생체적합성 용액은 염수를 포함하며, 다른 성분, 예컨대 보존제, 항미생물제 등 및 다른 약제를 추가로 포함할 수 있다.
"생체적합성 담체"는 본 명세서에서 hES 세포 및/또는 그의 유도체가 국부 치료, 이식을 위한 프로토콜에서의 사용을 위해 또는 임의의 다른 후속적 사용을 위해 현탁된 고체 담체, 용액 및 혼합물을 지칭하는데 사용된다. 이러한 생체적합성 담체로는 겔, 연고, 페이스트 및 에어로졸 스프레이가 포함된다.
"생체적합성 용기"는 본 명세서에서 hES 세포 및/또는 그의 유도체가 위치하고, 세포가 이식에서 사용되는 것을 방지하지 않는, 즉 대상체에게 투여될 수 없는 화합물로 세포를 오염시키지 않는 용기 (예를 들어, 세포 배양 또는 저장 용기)을 지칭하는데 사용된다. 생체적합성 용기 재료의 예로는 비제한적으로 유리, 스테인레스 스틸 및 폴리스티렌을 들 수 있다.
"프로게스틴"은 프로게스테론-유사 활성을 갖는, 즉 생물학적 활성에 대한 임의의 공지된 검정법 중 하나에서 프로게스테론의 활성의 25% 이상을 갖는 임의의 천연 또는 합성 호르몬이다. 예로는 비제한적으로 프로게스테론, 디드로게스테론, 메드록시프로게스테론, 노르에티스테론, 레보노르게스트렐, 노르게스테렐, 게스토덴 및 드로스피레논을 들 수 있다. 기타 프로게스틴의 예는 미국 특허 제7,091,234호, 제7,084,151호, 제7,081,457호, 제7,071,205호, 제6,562,857호, 제6,319,911호, 제6,245,757호, 제6,043,235호 및 제6,028,064호에 개시되어 있다.
"β-인간 융모 성선자극호르몬 (βhCG) 효능제"는 생물학적 활성에 대한 임의의 공지된 검정법 중 하나에서 천연 βhCG의 활성의 25% 이상을 갖는 임의의 천연 또는 합성 βhCG 또는 그의 단편 또는 유도체로서 정의된다. βhCG 효능제의 예로는 비제한적으로 βhCG 및 미국 특허 제6,635,445호, 제6,585,982호, 제6,583,109호, 제6,469,139호 및 제5,997,871호에 개시된 것을 들 수 있다.
"최소 필수 배지"는 본 명세서에서 아미노산, 염, 글루코스 및 비타민을 포함하는 세포 배양 배지를 지칭하는데 사용된다. 예로는 RPMI, DMEM, EMEM 및 GMEM을 들 수 있다.
"연무(nebulization)"는 연무기를 통한 폐로의 약물 또는 물질의 투여를 의미한다.
관절내는 관절내 공간으로의 투여를 의미한다.
안구후는 안구후 공간으로의 투여를 의미한다.
정맥내 주입은 생성물 또는 약물을 포함하는 iv 액의 사용에 의한 정맥으로의 투여를 의미한다.
"경막외" 주사 또는 카테터 주입은 수막의 경막 외부의 영역으로의 투여를 의미한다.
"경막내" 주사 또는 카테터 주입은 수막의 최내 층, 즉 뇌의 연속체 내에 있는 뇌척수액로의 거미막으로의 투여를 의미한다.
"미측" 주사는 경막외 공간이 있는 연속체 내에 있는 미골의 팁 위로 대략 3 센티미터에 있는 천골막을 통한 투여를 의미한다.
"심부 척수 주사"는 척추의 측부 상의 척주세움근으로의 주사를 의미한다.
"근육내" 주사는 근육 시트 사이로의 투여를 의미한다.
"정맥내" 주사는 정맥 내로의 투여를 의미한다.
"급성 SCI"는 SCI의 발생일 후 3개월까지를 의미한다.
"아급성 SCI"는 SCI의 발생일 후 3개월로부터 상해의 발생일 후 9개월까지를 의미한다.
"만성 SCI"는 SCI의 발생일 후 9개월 초과를 의미한다.
hES 세포의 "유도체"는 다잠재성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 성인 줄기 세포 및 조직 특이적 줄기 세포를 포함하며, 완전히 분화된 세포를 포함하지 않는다. 조직 특이적 줄기 세포의 예는 하기 표에서 찾을 수 있다.
세포 유형 특허 번호
지방-유래 줄기 세포 6,777,231
유방 상피 줄기 세포 5,814,511
내피 줄기 세포 6,852,533
후근절 선조 세포 6,835,567
조혈 선조 세포 CD34-, CD7+, Lin-, Lin-, CD45RA+ 6,537,807
조혈 줄기 세포 Thy-1+ 5,061,620
조혈 줄기 세포 Thy-1+, CD34+ 5,750,397
조혈 선조 세포 CD34+, CD38-, HLA-DR+ 5,840,580
조혈 림프양 및 수상돌기 세포 CD34+, CD45RA+, CD10+; 조혈 수상돌기 세포 CD34+, CD45RA+, CD10+ 5,972,627
조혈 줄기 세포 c-kit-, Thy-1- 5,876,956
조혈 줄기 세포 CD34+ 5,681,559
조혈 줄기 세포 HCC-1+ 5,677,136
조혈 선조 세포 CD34+, 갈락토스-특이적 렉틴+ 5,858,782
조혈 줄기 세포 (휴지) CD34+ 5,807,686
각질세포 줄기 세포 6,485,971
간 줄기 세포 OC2를 발현하지 않음 6,129,911 6,872,389
림프조혈 선조 줄기 세포 My10- 5,256,560
림프양 선조 세포 6,908,763
중뇌 신경 선조 세포 6,913,925
간엽 줄기 세포 CD45+ 6,387,367
간엽 줄기 세포 5,486,359
간엽 줄기 세포 5,827,735
간엽 줄기 세포 5,908,782
간엽 줄기 세포 6,936,281
간엽 줄기 세포 6,908,764
뮬러관-유래 다능성 상피 세포 6,416,999
골수성 선조 세포 c-kithi, IL-7Rα- 6,465,247
골수성 선조 세포 Thy-1-, IL-7Rα- 6,761,883
신경 선조 세포 5,753,505
신경 줄기 세포 5,851,832
뉴런 선조 세포 6,251,669
뉴런 줄기 세포 6,969,608
Hu 단백질을 발현하지 않는 뉴런 선조 세포 6,852,532
직계성-제한 뉴런 전구 세포 E-NCAM+ 6,734,015
신경상피 줄기 세포 7,037,702
중추 신경계 신경 줄기 세포 5,968,829
뉴런 선조 세포 6,812,027
신경 선조 세포 6,913,925
중추 신경계 뉴런-제한 전구 세포 6,787,353
배측 중뇌 뉴런 선조 세포 5,411,883
신경 능선 줄기 세포 5,589,376
RET 단백질을 함유하는 신경 능선 다잠재성 세포 6,890,724
중성구 전구 세포 5,955,357
췌장 선조 세포 6,436,704
췌장 섬 선조 세포 ErbB2 발현 6,753,153
다능성 세포 5,914,268
HOX11 유전자로 형질전환된 다능성 세포 5,874,301
말초 혈액 선조 세포 5,541,103
신장 줄기 세포 6,410,320
신장 줄기 세포 6,458,588
망막 줄기 세포 6,117,675
골격 선조 세포 6,517,872
줄기 세포 FGFR+, ES 세포 아님 6,767,737
혈액 세포를 발생시키는 줄기 세포 CD34-, MHC-I-, MHC-II- 5,744,347
T 직계성 선조 세포 CD8int, CD4int, c-kithi, 높은 bcl-2; CD8lo, CD4lo, c-kithi, 높은 bcl-2 5,821,108
T 림프구 전구 세포 CD34+, CD7+, Leu 8+ 5,622,853
본 발명은 현재 불치의 또는 말기의 질환, 상태 또는 장애의 임상적 치료에서 사용하기 위한, 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 이식 프로토콜을 통해 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 사용하는, 현재 불치의 또는 말기의 상태의 치료 방법에 관한 것이다.
어구 "동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는"은 본 발명의 배양 방법의 결과로서 제약 조성물에 존재할 수 있는 미량의 프로게스틴 및 βhCG 효능제를 배제하지 않는다. 용어 "동물 생성물"은 임의의 비인간 생성물을 지칭한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 바로 사용가능한 형태이고, 공급자 세포 및 임의의 다른 오염물이 없는, hES 세포 및/또는 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물의 간단하고 안전하고 광범위하게 적용가능하고 재현가능하고 효율적인 이식 방법을 제공한다. 이들 세포는 임의의 배양 방법으로부터 유도될 수 있으며, 환자의 유전자 배경, 연령, 인종 및 성별에 관계없이, 항체-항원 반응 또는 이식편-숙주 거부 없이, 기형종 또는 종양의 형성, 또는 다른 쇠약화 부작용 없이, 이상 신경지배의 결과 없이, 및 여러 질환, 상태 및 장애의 치료용 면역억제제의 투여에 대한 필요 없이 인체로 이식될 수 있다.
다른 공지된 방법과는 대조적으로, 본 발명의 제약 조성물의 제조에 사용된 hES 세포는 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 배양 배지에서 성장되며, 그러므로 의도된 임상적 용도의 안전성 또는 효능을 방해할 수 있는 임의의 종류의 오염물을 갖지 않는다.
본 발명의 실시에 따라, hES 세포 및/또는 그의 유도체는 근육내, 정맥내, 미측, 유리체내, 선조체내, 실질내, 경막내, 경막외, 안구후, 피하, 경구, 심장내, 낭내, 관절내 또는 경막내 주사 또는 경막외 카테터, 지주막하 차단 카테터, 정맥내 주입에 의해, 연무기를 통해, 스프레이를 통해, 질내 경로를 통해, 및/또는 국부 눈 및 귀 점적을 통해 인체로 도입된다. 다른 실시양태에서, hES 세포 및/또는 그의 유도체는 국부적으로 또는 병변내로 투여된다.
투여 경로 각각은 특정 주사 부피를 사용하므로, 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 스톡 용액으로부터 특정 범위의 세포를 사용한다. 세포 유형이 (예를 들어, 하기 주사 스케쥴 표에) 지시된 경우, 지시된 세포 유형은 세포 집단에 우세하게 존재하는 유형이다.
투여 경로 부피 세포수
근육내 0.25 ml 750,000 내지 150만
정맥내 0.25 ml 750,000 내지 150만
피하 0.25 ml 750,000 내지 150만
미측 2 ml 6백만 내지 1천6백만
경막외 2 ml 6백만 내지 1천6백만
경막내 2 ml 6백만 내지 1천6백만
관절내 2 ml 6백만 내지 1천6백만
안구후 2 ml 6백만 내지 1천6백만
경막외 카테터 4 내지 5 ml 1천2백만 내지 4천만
정맥내 주입 0.75 ml 225만 내지 450만
연무기 2 ml 6백만 내지 1천6백만
질내 2 ml 6백만 내지 1천6백만
임상인가 아닌가 실험실과 사용의 궁극적 지점 사이에서, 제약 조성물은 냉각 저장에서 유지되어야 한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 +4 내지 약 -160℃에서 저장된다. 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 -15 내지 약 -72℃, 예를 들어, 약 -20 내지 약 -40℃에서 저장된다.
한 실시양태에서, 본 발명에서 사용된 hES 세포는 여분 배아로부터 단리되고, 천연 시험관내 수정 주기로부터 버리고, 정보에 근거한 동의를 통해 공여된다. 대안의 실시양태에서, 융모막 융모, 양수 및/또는 태반으로부터 단리된 다능성 태아 줄기 세포, 예컨대 미국 공개 출원 제2005/0124003호에 기재된 것은 본 발명에서 사용된다.
본 발명은 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 사용하는, 암, 뇌졸중, 유전적 장애, 간 장애, 신경계 장애, 혈관 장애, 피부 질환 및 장애, 자가면역 장애, 눈 장애, 신장 장애, 심장 장애, 근골격 장애, 생식 및 수정능 장애, 및 관절염을 포함하나 이에 제한되지 않는, 여러 질환, 상태 및 장애의 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 암의 비제한적 예로는 척수 종양, 유방암, 전립선암, 림프종, 피부암, 췌장암, 대장암, 흑색종, 악성 흑색종, 난소암, 뇌암, 원발성 뇌 암종, 두경부암, 신경교종, 교모세포종, 간암, 방광암, 비소세포 폐암, 두경부 암종, 유방 암종, 난소 암종, 자궁경부 암, 전이성 병변, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 윌름 종양, 자궁경부 암종, 전립선 암종, 방광 암종, 췌장 암종, 위 암종, 대장 암종, 전립선 암종, 비뇨생식 암종, 갑상선 암종, 식도 암종, 골수종, 다발성 골수종, 부신 암종, 신장 세포 암종, 자궁내막 암종, 부신피질 암종, 악성 췌장 인슐린종, 악성 카르시노이드 암종, 융모막암종, 악성 고칼슘혈증, 자궁경부 과형성, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 모발상 세포 백혈병, 신경모세포종, 횡문근육종, 카포시 육종, 진성 적혈구증가증, 필수 혈소판증가증, 호지킨 질환, 비호지킨 림프종, 연조직 육종, 골원성 육종, 원발성 거대글로불린혈증 및 망막모세포종을 들 수 있다.
한 실시양태에서, hES 세포는 배아인 세포가 프로그래밍되고 대상체로 투여되면, 세포가 병변의 부위로 이동하기 때문에 분화제에 의해 처리되지 않는다. 상기 부위에서, 세포는 생체내 분화 신호에 반응하여 분화한다. 병변 부위에서, hES 세포 및 그의 유도체는 불명확하게 증식하지 않으며, 이에 의해 반복된 주사 스케쥴을 필요로 하지 않는다. hES 세포 및 그의 유도체가 불명확하게 증식하지 않는다는 사실은 종양형성성 및 기형종 형성의 가능성을 제거한다.
본 발명의 실시에 따른 hES 세포 및/또는 그의 유도체에 의한 치료 후, 환자는 휴식을 취해야 하며, 세포 기능을 손상시키고 병변 부위로의 hES 세포 및 그의 유도체의 이동에 의해 촉발된 재생 프로세스를 방해할 수 있는 임의의 물질, 예컨대 알콜 또는 담배의 섭취를 절제하는 엄격한 요법을 채택해야 한다. 또한, 환자는 임신 중에 유해하다고 공지된 임의의 약제 투약을 피해야 하며, 이는 상기 약제가 이식된 세포에 대한 유해 효과를 가질 수 있기 때문이다.
SCI 의 치료에서의 hES 세포 및 그의 유도체의 사용
종종 대마비, 사지마비 (tetraplegia, quadriplegia)를 유발하는, 급성 척수 손상, 아급성 척수 손상 또는 만성 척수 손상을 비롯한 SCI의 치료에 효과적인 치유법이 현재 없다. SCI의 치료를 위한 hES 세포의 이식은 미충족 의학적 요구를 다루고 SCI의 결과를 앓고 있는 세계의 수백만의 사람들의 삶을 극적으로 개선하는 고유한 기회를 제공한다. 실질적으로 선조 상태의 hES 세포 및 그의 유도체의 이식을 통한 중추 신경계 및 자율 신경계의 상실된 기능의 회복은 상실된 세포 기능의 대체, 상실된 신경 세포의 재생, 물리적 장벽, 예컨대 반흔 조직의 제거, 억제 신호전달 경로 및 이식된 hES 세포 선조로부터의 향신경성 인자의 방출의 차단을 통한, 부교감, 교감, 운동, 자율 및 감각 경로의 회복을 허용할 것이다.
본 발명의 실시에 따른 hES 세포의 이식을 통한 신경학적 기능의 복구의 이점 중에서, 운동 및 감각 기능, 일반적인 삶의 질의 개선, 일반적으로 인척에 의해 제공되는 지지 시스템의 감소, 다른 제약 조성물 및 다른 의학적 장치 및 보충제에 대한 의존성의 감소, 정신 및 심리적 상태의 개선, 및 또한 경제적 독립성의 개선이 있다. 부교감, 교감, 감각 및 운동 기능의 회복을 통한 의료 설비 및 무능력 보조 및 약물처치 의존성의 비용의 감소가 있다. 자족의 향상, 사회적 상태, 결혼 상태 및 생식권을 발휘하는 능력의 개선, 치료를 위한 1년당 병원 방문의 제한된 횟수가 있다. 본 발명에 따른 hES 세포 및 그의 유도체의 투여에 의한 치료는 항원성, 종양 형성, 기형종 형성 또는 이상 신경 연결의 문제점을 유발하지 않는다.
또한, hES 세포 및 그의 유도체의 투여, 특히 SCI 대상체를 위한 hES 세포 및 그의 유도체의 투여는 와창의 치유, 고혈압제 또는 항우울제에 대한 필요성의 감소, 방광 감각 및 조절의 복구, 장 감각 및 통증 감각 및 촉각의 복구; 상실된 반사의 복구; 감기 발한의 증상의 감소; 현기증의 감각의 감소; 혈액 압력의 정상화, 및 전체 횡격막성 침범이 있는 호흡의 정상화를 유발한다.
아급성 척수 손상 또는 만성 척수 손상을 앓고 있는 환자 및 천연 회복 메카니즘이 나타나지 않는 환자에게 hES 세포를 투여하는 절차는 하기 상세히 제공된다. 본 발명의 실시에 따라 상해의 3개월 내의 치료의 제1 선택으로서 급성 SCI의 상이한 치료 절차는 또한 하기 상세히 제공된다.
투여되는 hES 세포의 치료 유효량, 투여 스케쥴 및 투여 경로는 주로 세가지 인자, 즉 장애의 유형, 환자의 임상적 상태 및 존재하는 증상의 중증도에 의존한다. 본 발명의 실시 중에, 치료 유효량 및 스케쥴이 연령, 성별, 체중 또는 인종에 의존적이지 않다는 것이 밝혀졌다. 환자 각각에 대한 프로토콜은 환자의 진행중인 평가 방법을 기초로 개별적으로 정립된다.
본 발명의 실시의 한 실시양태에서, hES 세포 및/또는 그의 유도체를 함유하는 제약 조성물은 현재 불치의 장애 또는 말기의 상태 또는 상기 언급된 바와 같은 다른 임상적 장애를 앓고 있는 대상체에게 상기 장애를 치료하기 위해 일련의 주사를 통해 투여된다.
본 발명에 따른 임상적 장애 및 말기의 상태의 치료에 대한 여러 실시양태는 하기 실시예와 관련하여 이제 기재될 것이다.
SCI 를 앓고 있는 환자의 치료, 투여량, 스케쥴 , 투여 경로, 평가 및 추적 조사
한 실시양태에서, hES 세포 및/또는 그의 유도체는 3개월 초과 동안 SCI를 앓은 대상체 (아급성 및 만성 SCI)에게 장애를 치료하기 위해 일련의 주사를 통해 투여된다. 다른 실시양태에서, hES 유도체는 조혈 선조 줄기 세포이다. 다른 실시양태에서, hES 유도체는 뉴런 선조 줄기 세포이다.
시험 용량
한 실시양태에서, 약 0.25 내지 약 1.0 ml의 최종 부피로 멸균 생리식염수에 희석된, 조혈 선조 줄기 세포 및 뉴런 선조 줄기 세포를 포함하는 약 750,000 내지 약 8천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체는 오염 및 생존율에 대해 시험하고, 표준 프로토콜을 사용하여 개수에 대해 시험한 후, 시험 용량으로서 전완에서 피하 주사에 의해 투여한다. 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간 및 24시간 후 아나필락시성 쇼크, 주사 부위에서의 통증 또는 염증, 전신 소양증, 홍조 또는 열의 체크를 위해 관찰한다. 한 실시양태에서, hES 세포 대 조혈 선조 줄기 세포 및 뉴런 선조 줄기 세포의 비율은 약 4:1 내지 약 1:4의 범위이다. 다른 실시양태에서, 비율은 약 1:1이다.
시동 용량
프로토콜은 멸균 생리식염수 약 0.25 ml 내지 약 1.0 ml 부피에 재현탁된, 조혈 선조 줄기 세포 및 뉴런 선조 줄기 세포를 포함하는 약 750,000 내지 약 8천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 함유하는 제약 조성물의 피하, 근육내 및/또는 정맥내 시동 주사의 투여를 수반한다. 시동 주사는 1주일 내지 10일 동안 1일마다 동일한 수의 hES 세포 및 그의 유도체를 함유하는 제약 조성물의 주사를 통해 투여된다.
경막외 주사 및 경막외 카테터
멸균 생리식염수 2 ml의 부피에 현탁되고 추가로 멸균 생리식염수 5 ml 내지 40 ml로 희석된, 뉴런 선조 줄기 세포를 포함하는 약 750,000 내지 8천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체는 제1 시동 주사 후 연속적인 3일, 7 내지 10일의 기간에 걸쳐 1일마다 2회 병변 부위 위 또는 아래에 경막외 주사 또는 경막외 카테터에 의해 투여된다. 경막외 주사/경막외 카테터에 의한 투여는 환자에 의해 나타나는 증상의 개선 및 의사의 의견에서 임상 진행에 따라 병변 부위 위 또는 아래에서 반복된다. 또한, 환자가 경막외 주사 후 그/그녀가 등을 위로하여 누워있는 경우 감각 개선이 실질적인가, 그/그녀가 안면-하향 위치로 누워있는 경우 운동 개선이 실질적인가를 관찰한다. 둘 모두의 경우, 환자는 다리를 상승된 위치에서 유지시켜야 한다.
경막내
멸균 생리식염수 2 ml에 현탁되고 멸균 생리식염수 2 ml에 의해 총 부피 4 ml로 희석된, 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 1천1백만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체는 시동 주사의 개시 후 2, 5, 8, 12, 17 및 22개월의 기간에서 병변 부위 위 또는 아래에서 경막내 주사에 의해 투여된다.
한 실시양태에서, SCI 치료는 병변 부위 위 또는 아래에서, 예를 들어 상해 후 15일에 카테터를 통한 경막외 주사에 의해 세포를 투여함으로써 계속된다. 한 실시양태에서, 멸균 생리식염수 2 ml의 부피에 현탁된 후 멸균 생리식염수 15 ml 내지 40 ml로 추가로 희석된, 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 8천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 현탁액은 주사된다. 이 치료는 1.5개월 후에 반복될 수 있다.
심부 척수 주사
증상 반전에서 관찰된 진행에 따라, 멸균 생리식염수 0.25 ml 내지 1.0 ml의 부피에 현탁된, 조혈 줄기 세포 및 뉴런 선조 줄기 세포 둘 모두를 포함하는 약 750,000 내지 약 8천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물의 추가 추가접종 주사가 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 1주마다 또는 격주마다 척추의 배측에서 심부 척수 주사에 의해 투여된다. 이 치료는 환자가 이동성을 회복한 경우 배측 근육을 강화시키고 물리적 재활을 향상시킬 것이다.
미측 주사
본 발명의 실시에 따라, 염수 2 ml에 재현탁되고 10 ml로 단독으로 또는 데포메드롤 (메틸프레드니솔론 아세테이트) 20 ml 이하와 조합으로 희석된, 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 8천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 제약 조성물은 미측 주사에 의해 투여된다. 이 치료는 요추 영역의 근육을 강화시키고, 요추 및 천골 구역에서 감각 및 운동력을 회복하게 할 것이다.
hES 세포의 진행중인 이식 이외에, 환자의 회복은 세포 기능 및 세포 재생 프로세스를 촉진하는 건강 생활방식의 유지에 대한 지시사항 및 상실된 운동 기능의 사용에서 매일 물리치료 및 재교육에 의해 보조된다.
국소 투여
본 발명의 실시에 따라 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 사용하는 SCI의 직접 치료 이외에, 환자의 장기간 부동화의 결과로 유발되는 와창은 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 함유하는 제약 조성물의 국부 적용을 통해 빠르고 효과적으로 치료될 수 있다.
와창의 치료는 조혈 선조 세포를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 함유하는 제약 조성물의 국부 적용에 의해 성취될 수 있다. 부하 용량 또는 시동 용량은 내부 치유 뿐만 아니라 신생혈관화를 촉진하기 위해 정맥내 및 근육내 주사에 의해 제공된다. 대안으로, hES 세포 및 그의 유도체는 염수 2 ml에 재현탁되고, 염수 2 내지 4 ml로 희석되고, 병변내로 적용된다.
정맥내 주입
본 발명의 실시에 따라, 조혈 및 뉴런 선조 세포를 포함하는 750,000 내지 8천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물은 생리식염수 100 ml에 재현탁되고, 정맥내 경로에 의해 투여된다. 이 치료는 신체로의 줄기 세포의 연속적 유동을 안전하게 하고, 임의의 이유, 예를 들어 부위에서의 와창, 너무 쇠약한 환자로 인해 다른 직접 경로가 접근가능하지 않은 경우 특히 유용할 수 있다.
급성 SCI 치료를 위한 프로토콜
급성 SCI의 치료에서 급속 중재는 환자의 생존 기회를 크게 향상시킨다. 더욱이, 본 발명의 실시를 통한 임의의 불치의 질환, 상태 또는 장애의 치료에서 급속 중재는 회복 기회를 증가시킨다. 본 발명의 추가 실시양태에서, 척수 상해 후 3개월 미만 동안 급성 SCI를 앓고 있는 환자는 또한 하기 상세히 기재된 바와 같이 성공적으로 치료될 수 있다. 본 발명의 실시에 따른 효과적인 물리치료, 재활 및 재교육 프로그램과 함께 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 제약 조성물은 급성 SCI의 치료의 효과적인 제1 선택이다.
급성 SCI의 치료는 아급성 및 만성 SCI의 치료를 위해 사용된 모든 단계 + 2개의 추가 단계를 포함한다. 상해가 생긴 직후 (예를 들어, 수술) SCI를 위한 초기 중재 동안 hES 세포 및/또는 그의 유도체는 상해의 부위로 직접 투여된다. 추적 조사 치료는 상해의 3개월 내에 2개의 경막내 주사 및 1개의 경막외 주사를 포함한다.
임상적 평가 및 관찰
본 발명에 따라 치료되는 동안 연장된 기간 동안 다리의 운동 기능이 상실된 환자에 대해서는, 보행 재교육 및 다른 물리적 치료요법에 대한 프로그램이 다리에 대한 운동 기능 복귀로서 실행되어야 한다. 이러한 프로그램의 제1 단계로서, 보행 보조기 및 캘리퍼스 부목의 사용은 재교육에서 효과적인 것으로 증명되었다. 팔 및 상체의 근육화의 추가 프로그램은 환자가 보행에서 보조없이 그의 체중을 지탱할 수 있도록 실행되어야 한다. 재교육 프로그램은 치료가 계속되고 환자 상태가 개선됨에 따라 감소될 수 있다.
의학적 장치 지지물 및 물리적 치료요법에 대한 필요성의 감소 이외에, 본 발명의 실시에 따른 치료를 통한 환자의 교감 및 부교감 증상의 개선 때문에, 혈액 압력 기복 약물처치, 우울증 약물처치, 와창 약물처치, 장 및 방광 합병증을 위한 약물처치 및 의학적 장치, 항-경련 약물처치 및 펌프를 비롯한 약물처치에 대한 요구사항의 감소가 있다.
SCI와 직접 또는 간접적으로 관련된 증상의 치료용 약물처치에 대한 필요성의 감소 이외에, SCI와 함께 본 발명에 따라 치료된 당뇨병이 항-당뇨병 약물처치에 대한 필요성의 감소를 나타낸다는 것이 관찰된다.
SCI를 앓고 있고 본 발명에 따라 치료된 환자에 의해 나타난 증상의 개선의 진행의 임상적 평가는 치료 과정 중 및 완화 후 규칙적으로 모니터링한다. 많은 생리적, 교감, 부교감, 운동, 자율 및 심리적 파라미터는 SCI의 증상의 역전 기술의 효능을 평가하기 위해 분석하며, 이들은 하기 상세히 기재되어 있다.
증상 기재, 병변 부위 카테고리화, 증상 진행, 임상적 중재, 상해의 치료 및 전반적 병력을 비롯한 참고용 임상의 기록을 시험한다. 이 시험을 기초로 하고, 자기 공명 영상 (MRI), 근전도검사 (EMG), 신경 전도 속도 (NCV) 스캔, 및 손상의 정도를 분석하고 치료 전 병변의 기록을 얻기 위한 신경학적 시험을 비롯한 다른 신경학적 시험 및 연구를 비롯하여, 환자의 시험을 통해, 본 발명의 실시에 따른 이식 후 개선의 반정량적 기재 방법을 행하고, 이는 하기 상세히 기재되어 있다.
환자의 정신 상태, 우울증 또는 다른 경우, 행동 특징, 뇌신경 기능 및 일반적인 태도를 심리적 평가의 일부로서 포함하는 교감 파라미터 및 신경학적 안녕을 주목한다.
병변 부위에서의 신경학적 손상 및 자율 신경계의 기능과 관련된 징후 및 증상을 평가한다. 이는 신경학적 시험, 심부 압력을 감지하는 능력, 촉각, 감각, 균형, 통증을 감지하는 능력, 온도 변화를 감지하는 능력, 강제 이동, 냉한의 존재, 현기증, 혈액 압력, 호흡 곤란, 누울 때 비정상적인 자세, 및 도움없이 앉는 능력의 시험을 포함한다.
방광 및 장 기능을 평가한다. 이는 방광 조절, 방광 흐름 및 방광에서의 충만 감각, 장 조절, 장의 배설 시간, 및 장에서의 감각을 포함한다.
중추 신경계의 손상 정도를 평가하기 위해 상체의 운동 기능을 평가한다. 이는 어깨 이동, 손목 및 손가락 이동, 힘줄 반사, 및 사지 이동의 강도, 근육 위축 및 손 움켜잡기를 포함한다.
중추 신경계에 대한 손상의 정도를 평가하기 위해 하체의 운동 기능을 평가한다. 이는 엉덩이 이동, 무릎 이동, 발가락 이동, 힘줄 반사, 및 사지의 강도, 근육 위축 및 발바닥 반응을 포함한다. 사지 신경지배의 진행을 모니터링하기 위해 치료 중에 규칙적인 간격으로 상세한 신경학적 시험을 또한 수행한다.
병원 방문의 과정 중에 환자의 회복을 돕기 위해, 운동 기능이 복귀할 때 환자를 정상으로 돌리기 위해, 표준 물리적 치료요법 기술을 사용하여, 그의 사지 및 관절의 사용을 회복할 수 있으며, 보다 움직이기 쉬워질 수 있다.
신경 재생의 증거는 신경학적 기능의 복구 및 신경학적 평가에 의해 입증된다. SCI에 대한 치료 프로토콜의 예는 본 출원에서 환자 연구로서 제공되었다.
신경계의 발달성 장애의 치료
본 발명의 실시에 따른 hES 세포 및/또는 그의 유도체는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포의 양으로 발달 장애, 예컨대 자폐증 및 정신 지체의 치료를 위해 투여된다. 다른 실시양태에서, 약 750,000 내지 약 8천만개의 세포가 시험 용량 후 근육내 또는 정맥내 경로를 통해 투여된다. 경막내 경로가 또한 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 두개내 이식이 또한 사용될 수 있다. hES 세포 및/또는 그의 유도체는 주로 뉴런 선조 세포이다. 다른 실시양태에서, 조혈 및 뉴런 선조 세포는 근육내 또는 정맥내 경로를 통해 투여된다. 이 치료는 3개월의 기간 동안 근육내 또는 정맥내 경로를 통해 1일마다 주사와 함께 개시하는 1년의 기간에 걸쳐 계속된다. 그 후, 동일한 주사가 다음 3 내지 6개월 동안 1주마다 1회, 및 그 후 다음 3개월 동안 2주마다 1회, 및 그 후 의사의 관찰에 따라 1개월마다 1회 계속된다. 경막내 주사는 치료 개시 후 6 내지 8개월에만 및 그 후 또한 환자가 근육내 및 정맥내 주사에 반응을 나타내지 않는 경우에만 프로토콜에 포함된다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 750,000 내지 8천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체는 생리식염수 100 ml에 재현탁되고, 정맥내 주입을 통해 투여된다.
실시예 l:
퍼덕이기 진전, 과다활동 상태, 사회 기술 없음, 눈 접촉 없음, 환약조제양운동, 지시사항을 따르는 것에 대한 무능력, 학습 의욕 없음을 갖는 자폐증으로 진단된 환자는 뉴런 줄기 세포 선조 및 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물의 투여 후 개선을 나타내었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 2에 나타낸다. 이 표 및 주사 스케쥴에 관한 하기 표의 모두에 대해, 세포 유형 표시자 "뉴런"은 신경 선조 줄기 세포로의 분화를 촉진하는 배지 (예를 들어, DMEM)에서 부분적으로 분화된 hES 세포의 세포 집단을 지칭한다. 상기 세포 집단은 우세하게 뉴런 선조 줄기 세포인 줄기 세포 및 hES 세포를 포함한다. 표시자 "비-뉴런"은 뉴런 선조 줄기 세포 이외에 선조 줄기 세포로의 분화를 촉진하는 배지 (예를 들어, RPMI)에서 부분적으로 분화된 hES 세포의 세포 집단을 지칭한다. 상기 세포 집단은 우세하게 뉴런 선조 줄기 세포가 아닌 여러 줄기 세포 및 hES 세포를 포함한다.
Figure 112008069743056-PCT00001
Figure 112008069743056-PCT00002
퇴행성 신경계 장애의 치료
본 발명의 실시에 따른 뉴런 줄기 세포 선조 및 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 hES 세포 및/또는 그의 유도체는 피질기저 변성, 올리브교 소뇌 위축, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 치매, 청신경 위축 및 운동 뉴런 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 퇴행성 신경계 장애의 치료를 위해 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포의 양으로 투여된다. 다른 실시양태에서, 약 750,000 내지 약 8천만개의 세포가 투여된다.
투여 프로토콜은 특정 환자에 맞추기 위해 다양할 수 있으나, 어린이의 퇴행성 신경계 장애의 치료를 위한 전형적 프로토콜은 첫번째 달에 1일마다 근육내 및 정맥내 주사, 두번째 내지 네번째 달 동안 1주마다 3회 주사, 다섯번째 및 여섯번째 달에 1주마다 주사, 및 아홉번째 내지 열두번째 달에 1주마다 추가접종 주사를 포함한다. 성인의 경우, 전형적 프로토콜은 경막외 카테터, 요추 천자, 경막내 또는 미측 경로에 의한 투여와 함께 1일마다 근육내 및 정맥내 주사를 포함한다. 그 후, 7일 이상의 최소 간격으로 두번 정맥내 주입한다. 마지막으로, 추가접종 주사가 6개월 동안 1개월마다 1회 및 이어서 6개월 이상 동안 2개월마다 1회 투여된다. 치료는 더 긴 기간 동안 계속될 수 있으며, 심지어 질환이 진행되는 만큼 길게 평생 동안 계속될 수 있다.
진행성 및 퇴행성 장애의 경우, 본 발명의 실시에 따라 급속 중재를 통해 질환 진행을 저지하거나 또는 안정화시키는 것은 환자의 증가된 자가 의존성을 허용한다. 안정화 효과 후에만 몇몇 개선이 나타날 수 있다.
실시예 2:
솔루메드롤 (메틸프레드니솔론)을 1일마다 투약하는, 반복 진행성 다발성 경화증의 2년 병력이 있는 환자는 보행할 수 없었으며, 방광 또는 장 조절을 할 수 없었고, 호흡 장애를 종종 앓았다.
본 발명에 따른 치료에 따라, 대상체의 상태가 개선되었으며, 환자는 보행할 수 있고, 방광 및 장 조절의 복구가 있었으며, 솔루메드롤의 사용을 줄였다. MRI는 50% 개선을 나타내었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 3에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00003
Figure 112008069743056-PCT00004
실시예 3:
60세 노인은 그의 팔 및 손에 급속한 황폐로 2년 전에 ALS (운동 뉴런 질환)를 나타내었다. 그의 팔, 손 및 혀에 연속적 연축 및 속상수축이 있었다. 그는 그의 왼쪽 팔을 회외하고 회내할 수 없거나, 또는 머리 위로 팔을 들어올릴 수 없었다. 그의 오른쪽 팔은 단수축으로 위로 들어올릴 수 없었으며, 그는 골격 손을 가졌었다.
치료 후 1½년에, 그의 손은 양손의 소지 및 무지 근육의 재생으로 골격 프레임으로부터 회복되었다. 양팔의 회외 및 회내가 가능하였다. 연하에 동일한 곤란함을 발견하였으나, 악화되지는 않았다. 그의 다리, 호흡 및 언어에는 황폐가 없었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 4에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00005
Figure 112008069743056-PCT00006
Figure 112008069743056-PCT00007
Figure 112008069743056-PCT00008
Figure 112008069743056-PCT00009
Figure 112008069743056-PCT00010
Figure 112008069743056-PCT00011
실시예 4:
환자는 파킨슨병을 앓는 것으로 진단되었다. 환자는 표준 치료에 반응하지 않았으며, 그의 상태는 시간이 지남에 따라 악화되었다. 그는 전형적 셔플링 보행을 하였다. 오른쪽 팔에 편측성 진전이 존재하였으며, 생리적으로 매우 우울하였다. 그는 눈을 뜨지 못했다. 치료를 시작한 이래로, 환자는 점차 개선을 나타내었으며, hES 세포 치료의 1년 후, 환자는 현저하게 개선되었다. 보행은 정상적이었고, 손의 진전은 최소였으며, 심리적으로 낙관적이었다. 그는 눈을 완전히 뜰 수 있었다. 치료를 시작할 때는 사인하고 글을 쓸 수 없었으나 이제는 가능하게 되었다. 그는 이제 다른 사람에게 덜 의존적이 되었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 5에 나타낸다.
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뇌성 마비의 치료
뇌성 마비의 치료를 위해 본 발명의 실시에 따른 뉴런 줄기 세포 선조 및 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포의 양으로 투여하였다. 프로토콜 및 투여량은 신경퇴행성 장애의 치료를 위한 투여량과 동일하였다.
실시예 5:
출생시 CP로서 AIIMS에서 진단된 48세 남성은 불명료한 언어, 셔플링 보행, 연하의 곤란함 및 좌측 편측부전마비를 가졌다. 근육 긴장, 반사 및 힘의 챠트를 이를 확신하기 위해 행하였다.
치료 후 6개월에 그는 더 명료한 언어를 갖고, 연하의 곤란함이 없었으며, 신체의 좌측을 사용할 수 있었으며, 보행이 개선되었다. 그는 왼손으로 쉐이빙을 할 수 있었으며 또한 왼손을 사용하여 컵 등을 잡을 수 있었다. 그의 균형은 우수하였고, 그는 긴 거리를 걸을 수 있었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 6에 나타낸다.
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실시예 6:
3세 유아 소녀를 CP로 병원에 데려와서 관찰하였는데, 소녀는 목을 조절하지 못하고 약하게 울고, 병을 통해 빨 수 없었으며, 무반응으로 1개월된 아기처럼 행동하였다. 소녀는 완전히 긴장저하유아였다.
치료의 1년 반 후, 소녀는 성장하였으며 2세 유아처럼 보였다. 소녀는 목을 조절할 수 있었고, 그녀의 부모를 인식하고, 침대 위에서 기어다니고, 정상식을 먹고, 인식하며 웃고, 지지를 받아 앉고, 그녀의 엄마가 그녀를 붙들어주면 몇걸음을 걸었다. 소녀의 보행은 가위 보행이었으며, 또한 그녀는 그녀의 부모를 부르기 시작하였다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 7에 나타낸다.
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실시예 8:
8세 어린이가 뇌성 마비 및 중증의 정신 지체로 진단되었으며, 그녀 스스로 걸을 수 없었다. 그녀는 사물을 인식할 수 없었으며, 주의집중 기간이 매우 짧았다. 침을 많이 흘렸으며, 입을 계속 벌리고 있었다.
치료 후 그녀는 침을 흘리지 않았으며, 주의집중 기간이 개선되었고, 더 민첩하게 보였다. 그녀는 최소 지지를 받아 보행하였다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 8에 나타낸다.
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Figure 112008069743056-PCT00027
신경계 외상의 치료
뇌 손상, 혼수 및 식물 상태를 포함하나 이에 제한되지 않는 신경계 외상의 치료를 위해 본 발명의 실시에 따른 뉴런 줄기 세포 선조 및 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포의 양으로 투여하였다. 다른 실시양태에서, 약 750,000 내지 약 8천만개의 세포를 투여하였다.
투여 프로토콜은 특정 환자에 맞추기 위해 다양할 수 있으나, 신경계 외상의 치료를 위한 전형적 프로토콜은 경막내 및 경막외 주사와 함께 첫번째 2개월 동안 1일마다 근육내 및 정맥내 주사를 포함한다.
뇌혈관 사고 또는 뇌졸중의 치료
뇌혈관 사고 또는 뇌졸중의 치료를 위해 본 발명의 실시에 따른 뉴런 줄기 세포 선조 및 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포의 양으로 투여하였다. 다른 실시양태에서, 약 750,000 내지 약 8천만개의 세포를 투여하였다.
투여 프로토콜은 특정 환자에 맞추기 위해 다양할 수 있으나, 뇌혈관 사고의 치료를 위한 전형적 프로토콜은 2주 동안 1일마다 근육내 및 정맥내 주사 및 그 후 첫번째 달에 3일 동안 정맥내 주입, 두번째 및 세번째 달 동안 15일마다 2일 동안의 정맥내 주입, 다섯번째 달에 2일 동안의 정맥내 주입 및 경막내 주사, 및 여덟번째, 열번째 및 열두번째 달 동안 4일 동안의 정맥내 주입 후 4일 동안의 근육내 주사를 포함한다.
실시예 9:
뇌혈관 사고 또는 뇌졸중으로 진단된 환자가 침흘림, 연하의 곤란함, 및 말하거나 또는 걷는 것에 대한 무능력을 갖는 우측 편측부전마비를 앓았다. 또한, 상기 환자는 대장암을 가졌다. 본 발명에 따른 치료 후, 환자는 언어 및 운동 활동이 개선되고 척추를 똑바르게 하고, 편측부전마비가 개선되는 개선의 징후를 나타내었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 9에 나타낸다.
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실시예 9:
82세 남성이 5년전에 뇌졸중을 앓았으며, 안면 비대칭 및 불명료 언어를 갖는 우측 편측부전마비를 나타내었다. 그는 지팡이를 잡고 걸었으며, 다리를 몹시 절었고, 조정의 곤람함으로 인해 오른손으로 식사할 수 없었다. 그 스스로 앉거나 또는 일어설 수 없었으며, 보행시 다리를 끌었다. 침을 흘렸으며 또한 잘 연하할 수 없었다.
치료 후 2개월에, 그는 지지 없이 걸을 수 있었으며, 스스로 앉고 일어설 수 있었고, 오른손으로 식사하고, 불명료한 언어는 없었으며 안면 비대칭도 없었다. 그는 의자로부터 일어설 수 있었다. 균형을 유지하면서 보행시 병에 걸린 무릎을 구부렸다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 10에 나타낸다.
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가족성 신경계 장애의 치료
올리브교 대뇌 위축 및 헌팅톤 무도병을 포함하나 이에 제한되지 않는 가족성 신경계 장애의 치료를 위해 본 발명의 실시에 따른 뉴런 줄기 세포 선조 및 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포의 양으로 대상체에게 투여하였다. 다른 실시양태에서, 약 750,000 내지 약 8천만개의 세포를 투여하였다. 투여 경로는 경막내, 경막외 카테터 및 정맥내 주입과 함께 근육내 및 정맥내이었다. 이는 개인의 수명을 가장 쉽게 연장할 것이나, 첫번째 연도는 하기와 같은 집중 프로그램일 것이다 - 경막내, 경막외 카테터 및 정맥내 주입이 또한 투여되는 시간 동안 3개월 이상 동안 1일마다 근육내 및 정맥내 주사. 21일의 기간에 걸쳐 한달반의 간격 후 동일한 세트의 주사를 투여하였다. 1일마다 근육내 및 정맥내 주사를 계속한 후, 1주마다 3회, 1주마다 2회, 1주마다 1회, 2주마다 1회로 감소시킨 후, 환자 상태에 따라 1개월마다 1회로 감소시켰다. 경막외 카테터와 마찬가지로 4 내지 6개월 간격으로 경막내 주사를 반복할 수 있었다. 정맥내 주입을 2주마다, 1개월마다 또는 2개월마다 제공할 수 있었다.
실시예 10:
침대에 앉거나 걷거나 또는 앉아있는 동안 그의 위치를 이동하는 능력이 없는 산발성 척수 소뇌 운동실조로 진단된 환자는 언어의 곤란함 및 진전이 있었으며, 그의 목을 일으켜 세울 수 없었다.
본 발명의 실시에 따른 줄기 세포 치료 후, 모든 증상의 개선이 인식되었으며, 환자는 그 자신의 몸을 균형잡을 수 있고, 몇 걸음을 걸을 수 있었다. 언어는 일관성이 있게 되었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 11에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00032
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실시예 1l:
가족성 올리브교 대뇌 위축이 있는 환자가 존 홉킨스 대학교에서 진단되었다. 그녀의 아버지, 쌍둥이 여자형제 및 남자형제는 동일한 질환을 앓았다. 그녀는 숨을 내쉴 때에만 말을 할 수 있었으며, 소변의 연속적 적하가 있어 휠체어 신세였고, 대변의 수동 배설을 행해야 했다. 그녀는 빈약한 신체 전반에 진전이 있었으며, 앉아 있는 동안 조차도 몸의 균형을 잡을 수 없었다. 중증의 체위 저혈압이 있었다.
치료의 2년 후, 환자는 그녀의 신체 기능을 위해 화장실에 가고, 잘 말하고, 진전이 없었으며, 지지 받아 걸을 수 있었다. 그녀의 쌍둥이 여자형제는 동일한 질환으로 병상에 있었으나 황폐는 없었다. 체위 저혈압은 없었으며, 그녀는 명확히 쇠약하지 않았다.
피부 장애의 치료
악성 궤양, 건선, 압박성 궤양 및 사르코이드증을 포함하나 이에 제한되지 않는 피부 장애의 치료를 위해 본 발명의 실시에 따른 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포의 양으로 피하 또는 정맥내 주사를 통해 또는 국소 또는 국부 적용을 통해 투여하였다. 피부 장애의 경우, 피부 장애 또는 손상의 치료를 위해 hES 세포를 또한 국부적으로 사용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 약 750,000 내지 약 8천만개의 세포를 투여하였다.
한 실시양태에서, hES 세포 또는 분화된 피부 세포 및 배아 추출물을 생체적합성 담체, 예컨대 겔, 연고 또는 페이스트와 혼합하고, 치유에 저항성인 창상, 예컨대 당뇨병 또는 욕창 궤양의 치유 뿐만 아니라 치유를 가속하기 위해 손상된 피부 또는 점막 조직에 적용할 수 있었다. 대안으로, 세포를 현탁액 또는 에멀젼으로 제공할 수 있었다. 한 실시양태에서, 담체는 또한 항미생물제, 진통제 또는 다른 약제를 함유하였다.
대안으로, 상이한 실시양태에서, hES 세포를 모슬린과 같은 멸균 인공 다공성 기재 상에서 성장시키고, 창상에 직접 적용하였다. 12 내지 24시간 후, 모슬린을 제거하고, 줄기 세포를 계속 성장시키고, 창상을 치유하였다. 병변내로 적용된 hES 세포는 분화하였으며, 마침내 손상된 세포를 대체하였다.
실시예 12:
70세 여성이 통상적인 치료요법에도 불구하고 치유되지 않은 왼쪽 관절 상의 화상 상해를 앓았다. 화상 부위 상에 hES 세포를 적용한 후, 그녀의 창상은 치유되기 시작하였으며, 3년 후 피부는 완전히 좋아졌다.
자가면역 장애의 치료
전신성 홍반성 루푸스, 강직 척추염, 심근병증, 사르코이드증, 관절염 및 궤양성 대장염을 포함하나 이에 제한되지 않는 자가면역 장애의 치료를 위해 본 발명의 실시에 따른 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포의 양으로 근육내 주사, 정맥내 주사, 피하 주사, 관절내 주사 또는 정맥내 주입 또는 이들의 조합을 통해 투여하였다. 다른 실시양태에서, 약 750,000 내지 약 8천만개의 세포를 투여하였다. hES 세포의 투여는 자가면역 장애의 치료에서만이 아니라 억제된 면역계의 복구에서도 또한 매우 효과적이었다. 면역억제제에 의한 치료에 대한 대안으로서, 또는 기관 이식 또는 다른 의학적 중재를 위해 환자를 "시동"하는 방법으로서, 숙주-이식편 거부 프로세스의 감소를 통한 기관의 허용을 위해 hES 세포 및 그의 유도체를 사용할 수 있었다.
투여 프로토콜은 특정 환자에 맞추기 위해 다양할 수 있으나, 자가면역 장애의 치료를 위한 전형적 프로토콜은 첫번째 2개월 동안 1일마다 주사, 세번째 달 동안 정맥내 주입와 함께 격일 주사, 다섯번째 내지 일곱번째 및 열번째 내지 열두번째 달 동안 15일마다 2일 연속적 정맥내 주입과 함께 1주마다 주사, 및 1년 동안 3개월마다 및 그 후 1년 동안 6개월 마다 추가접종 주사를 포함한다.
실시예 13:
고혈압과 함께 지난 26년 동안 건선을 앓은 환자는 피부 이식이 순응하지 않고 치유되지 않는 그녀의 다리위의 거대한 궤양과 건선성 관절염, 고혈압 및 당뇨병이 있어서 휠체어 신세였다.
6개월 동안 치료요법을 받은 후, 그녀는 궤양도 없고 관절염도 없었다. 당뇨병 및 고혈압은 조절하에 있었다. 그녀는 그녀 스스로 보행하기 시작하였으며, 모든 활동을 시작하였고, 지난 1년 동안 추가접종 주사를 투여받았다. 그녀는 지난 26년이래로 처음으로 걸었으며 그녀의 모든 집안일을 그녀 스스로 할 수 있다고 주장하였다.
줄기 세포 치료는 궤양에 국소적으로 이루어졌으며, 궤양이 치유되었다. 또한, 치료 후 추가 궤양은 검출되지 않았다. 피부의 비늘모양 및 가려움, 및 다리의 종창이 감소되었다. 혈압 조절과 함께 당뇨병 상태가 또한 치유되어, 약물처치를 감소하였다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 12에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00034
Figure 112008069743056-PCT00035
혈액 장애의 치료
본 발명의 실시에 따른 방법의 또다른 실시양태는 조혈 줄기 세포 선조 세포를 포함하는 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 정맥내 주사에 의한 혈액 장애, 예컨대 저혈소판증, 지중해빈혈, 급성 골수성 백혈병의 치료이다. 세포를 10일 내지 14일 동안 투여한 후, 양성 상태의 경우 1주마다 주사를 반복하였다. 악성 상태의 경우, 주사를 40일 동안 1일마다 제공한 후, 재발이 있으면 이를 반복하였다.
유전적 장애의 치료
본 발명의 실시에 따른 hES 세포 이식 방법의 다른 실시양태는 다운 증후군, 프리이드라이히 운동실조, 헌팅톤 무도병, 아스퍼거 증후군 및 척수근육 위축을 포함하나 이에 제한되지 않는 유전적 장애의 치료이다.
유전적 장애의 증상은 정신 지체, 근골격 기능장애 및 기관 기능부전에 의해 조합으로 또는 단독으로 나타나며, 심각한 불치의 쇠약 및 감소된 남은 수명을 유발한다. 유전적 장애를 앓는 환자의 경우, hES 세포를 본 발명의 실시에 따라 환자에게 투여하고, 투여하면 분화하여, 세포내 항상성의 뒤이은 복구와 함께 상실된 또는 저하된 유전자 생성물을 발현하는 세포의 집단을 환자에게 제공하였다.
투여 프로토콜은 특정 환자에 맞추기 위해 다양할 수 있으나, 유전적 장애의 치료를 위한 전형적 프로토콜은 첫번째 달 동안 1일마다 근육내 및 정맥내 주사, 두번째 달 동안 격일 주사, 세번째 달 동안 1주마다 2회 주사, 다섯번째, 일곱번째, 아홉번째, 열한번째 및 열두번째 달 동안 1주마다 1회 주사, 및 1년 동안 3개월마다 추가접종 주사를 포함한다. 또한, 정맥내 주입을 15일마다 제공하였다.
실시예 14:
다운 증후군이 있는 환자는 구두 명령에 반응을 나타내지 않았으며, 계단을 오르고 내리지 못하였고, 식사 곤란함의 결과로 저체중이었다. 상기 환자는 식사를 할 수 없었으며, 전형적 넓은 입각을 나타내고, 잦은 기침 및 감기를 앓았다. 눈은 몽골인종의 눈이었다.
본 발명에 따른 치료에 의해, 상기 환자는 구두 명령을 이해하고 수행할 수 있었으며, 말하기 시작하고, 계단을 걸어서 오르고 내리기 시작하였다. DQ 시험은 정신 연령이 1년 미만의 기간내에 2년 6개월이 뒤쳐진만큼 그녀의 생활나이보다 뒤쳐진 1년인 것으로 나타내었다. 사회적으로, 그녀는 학교에 다니고 다른 어린이들과 놀았다. 또한, 그녀는 스스로 식사하였다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 13에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00036
Figure 112008069743056-PCT00037
Figure 112008069743056-PCT00038
실시예 15:
3세 소녀가 다운 증후군으로 진단되었다. 그녀는 말하거나, 이해하거나 또는 계단을 걸어서 오르고 내리지 못하였다. 그녀는 스스로 식사하지 못하였고, 한단어 언어로 제한된 말하기는 매우 불명료하였다.
치료의 8개월 후, 그녀는 모든 것을 이해하고, 3단어의 문장을 말하고, 색상, 형상 및 크기를 인식하였다. 그녀는 스스로 계단을 오르고 내릴 수 있게 되었으며, 스스로 먹기 시작하였다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 14에 나타낸다.
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실시예 16:
13세 소년이 집중 결핍, 잦은 발작 및 시력 손상이 있는 유전적 결함을 앓았다. 그는 전체 터널 시야를 가졌다. 그는 교실에 앉아있기 곤란하였으며, 맨앞줄에 앉아있는 동안조차 칠판을 보기 곤란하였다. 그는 이정표의 지연을 가졌으며, 그가 어떤 것을 읽는 경우 읽고 있는 것을 기억하기 위해서는 그것을 세번 읽어야만 했다. 그는 또한 방에 사물을 위치시키는데 곤란함이 있었다.
hES 세포의 개시 이래로, 그의 시력이 개선되었으며, 교실에서 뒤에서 두번째 줄에 앉았고, 칠판을 훨씬 잘 볼 수 있었다. 그는 더 많은 것을 기억할 수 있었으며, 구두 명령에 대한 반응 시간이 개선되었다. 그는 전만큼 많이 경련하지 않았으며, 그의 약물처치가 감소되었다. 안과의사로부터의 보고는 말초의 사멸된 구역이 복구되었음을 나타내었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 15에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00043
Figure 112008069743056-PCT00044
Figure 112008069743056-PCT00045
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실시예 17:
환자는 프레드릭 운동실조를 앓는 32세 남성이었으며, 그의 여자형제는 상기 질환으로 사망하였다. 그는 서있을 수 없었고, 희미한 언어, 연하의 곤란함을 가졌으며, 휠체어 신세였고, 화장실에 가는데 도움을 필요로 하였다. 그는 독일 및 미국에서 이미 치료받았으나 결과가 없었다. 그의 심장은 확장되었고, 15 내지 20%로 기능하였다.
hES 세포의 개시 이래로, 그는 개선을 나타내었다. 그는 더 명료하게 말할 수 있게 되었으며, 연하의 곤란함이 없었다. 그의 심장은 개선되어 모든 치수가 정상치로 돌아왔으며, 기능 능력은 58 내지 60%까지였다. 황폐는 없었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 16에 나타낸다.
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Figure 112008069743056-PCT00048
Figure 112008069743056-PCT00049
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눈 장애의 치료
본 발명의 실시에 따른 hES 세포 이식의 다른 용도는 본 발명의 실시에 따른 뉴런 선조 및 hES 세포의 눈의 안구후 부분, 눈의 표재 구역 및 눈의 내부 챔버로의 직접 주사를 통한 시신경 위축, 황반 변성, 눈 손상, 각막 이식편 거부 및 색소성 망막염을 포함하나 이에 제한되지 않는 눈 장애의 치료이다.
투여 프로토콜은 특정 환자에 맞추기 위해 다양할 수 있으나, 눈 장애의 치료를 위한 전형적 프로토콜은 10일의 근육내 및 정맥내 주사, 이어서 안구후 또는 유리체내 주사, 15일의 근육내 및 정맥내 주사, 이어서 안구후 주사, 2번의 정맥내 주입, 및 2개월 후 안구후 주사를 포함한다. 4번의 안구후 주사 전체는 몇몇의 경우에는 결과가 조기에 나타났으나 결과가 나타나기 전에 8개월 내지 1년의 기간에 걸쳐 제공하였다. 유리체내 경로를 사용할 수 있었다. 또한, 각막은 줄기 세포가 성장했을 때 콘택트 렌즈의 사용을 통해 복구할 수 있었다. 또한, 줄기 세포를 포함하는 점안액을 사용하였다.
실시예 18:
시신경 위축으로 진단된 환자는 작은 글자를 읽는데 곤람함이 있었으며 멀리 위치한 사물을 볼 수 없는 상태였다. 또한, 검푸른색 및 보라색이 보이지 않았다. 시야는 빛을 지각하는 정도로 0이었으며, 지금은 6/24이다.
본 발명에 따른 줄기 세포 치료요법에 의해, 즉 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 hES 세포 및 그의 유도체를 안구후 주사에 의해 투여하고, 본 발명의 실시에 따른 뉴런 줄기 세포 선조 및 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 hES 세포 및 그의 유도체를 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포의 양으로 국소 정맥내 주사, 또는 피하 주사 또는 근육내 주사, 유리체내 주사 또는 국부 적용을 통해 투여하였으며, 환자는 유의한 개선을 나타내었다. 그는 타임지를 읽을 수 있었으며, 빌보드를 볼 수 있을 뿐만 아니라 먼거리의 텔레비전 시청도 가능하게 되었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 17에 나타낸다.
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간 및 신장 장애의 치료
본 발명의 실시에 따른 hES 세포 이식의 또다른 용도는 본 발명의 실시에 따른 이식을 통한 말기 신장 신장증 및 신증후군을 포함하나 이에 제한되지 않는 간 장애 및 신장 장애의 치료이다. 투여 경로는 정맥내, 근육내 및 정맥내 주입을 통하였다.
실시예 19:
신증후군으로 진단된 환자는 상승된 우레아, 크레아틴 및 P 단백질 수준을 나타내었다. 피질수질 분화는 유지되지 않았고, 신체는 팽윤하였다. 본 발명의 실시에 따른 조혈 줄기 세포 선조, 알부민-생성 줄기 세포 선조 및 빌리루빈-생성 줄기 세포 선조를 포함하는 hES 세포 및 그의 유도체를 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포의 양으로 정맥내 주사, 또는 피하 주사, 또는 근육내 주사, 또는 정맥내 주입을 통해 투여하였다. 줄기 세포에 의한 치료 후, 신체는 덜 팽윤하였으며, 피질수질 분화는 복구되었다. 우레아, 크레아틴 및 P 단백질 수준도 정상화되었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 18에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00052
근골격 장애의 치료
본 발명의 실시에 따른 hES 세포 이식의 다른 용도는 관절염, 뒤시엔느 근이영양증, 지대형 이영양증, 척수 근육 위축 및 베커 근육 위축을 포함하나 이에 제한되지 않는 근골격 장애의 치료이다.
투여 프로토콜은 특정 환자에 맞추기 위해 다양할 수 있으나, 근골격 장애의 치료를 위한 전형적 프로토콜은 첫번째 달 동안 1일마다 근육내 또는 정맥내 주사, 세번째, 다섯번째, 여섯번째 및 일곱번째 달 동안 1주마다 2회 주사, 아홉번째 내지 열두번째 달 동안 1주마다 주사 및 3개월마다 추가접종 주사를 포함한다. 정맥내 주입은 10일 내지 15일마다 제공하였으며, 심부 척수 근육 주사는 15일 내지 30일마다 제공하였다.
실시예 20:
뒤시엔느 근이영양증으로 진단된 환자의 병력은 10,000 단위의 크레아틴 포스포키나제 (CPK)의 고수준과 함께, 생기없음, 팽윤된 넙적다리 및 얼굴, 및 양성 가워 (Gower's) 징후와 같은 증상을 나타내었다.
뉴런 줄기 세포 선조 및 조혈 줄기 세포 선조를 단독으로 또는 조합으로 포함하는 hES 세포 및 그의 유도체를 예정된 기간 동안 정맥내 주사, 또는 피하 주사, 또는 근육내 주사, 또는 정맥내 카테터 주입, 또는 경막외 카테터 주입 또는 지주막하 차단 카테터 주입을 통해 환자를 치료한 후, CPK 수준은 1198 단위로 극적으로 감소하였고, 가워 징후는 음성이었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 19에 나타낸다.
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실시예 21:
DMD 사례로 진단된 14세 소년은 근육 위축이 있고, 양손 및 양다리에 힘이 없어서 병상에 있었다. 그는 또한 척주측만증이 있었다.
치료요법의 8개월 후, 이두근, 삼두근 및 상완요골의 근육이 발달하였으며, 팔을 팔꿈치 수준까지 들어올릴 수 있었다. 그는 체중이 증가했으며, 임의의 관련된 척수 척주측만증 없이 키가 성장하였다. 근육 파괴의 속도를 나타내는 CPK 수준이 감소되었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 20에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00057
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실시예 22:
DMD로 인해 휠체어 신세인 8세 소년은 걷거나 서있을 수 없었다. 치료의 6개월 후, CPK 수준이 감소되었다. 그는 쇠약하지 않았으며 팔을 움직일 수 있었다. 그는 최소 지지를 받아 보행을 시작하였다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 21에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00064
Figure 112008069743056-PCT00065
Figure 112008069743056-PCT00066
실시예 23:
지지를 받아 몇 걸음을 걸을 수 있었던 DMD로 진단된 10세 소년이 치료요법을 받았다. 그는 침대 위에서 스스로 뒤집거나 또는 스스로 앉을 수 없었다. 그는 팔꿈치 수준까지 30°까지 팔을 올릴 수 있었다. 치료의 수개월 후, CPK 수준이 강하하기 시작하였으며, 스스로 뒤집고, 목욕하기 위해 머리위로 물잔을 들어올릴 수 있었다. 체중 손실은 없었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 22에 나타낸다.
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Figure 112008069743056-PCT00068
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심장 질환 및 장애의 치료
본 발명의 실시에 따른 hES 세포 이식의 다른 용도는 제한성 심근병증, 심부전, 동 서맥 및 관상 동맥 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 심장 질환 및 장애의 치료이다. 분화된 세포의 몇몇 부분은 환자의 심장 조직으로 혼입되어, 손상된 근육을 재생하고 복구하였다.
투여 프로토콜은 특정 환자에 맞추기 위해 다양할 수 있으나, 심장 질환 및 장애의 치료를 위한 전형적 프로토콜은 2주 동안 격일로 및 그 후 다음 2주 동안 3일마다 근육내 및 정맥내 주사, 및 세번째, 여섯번째, 열번째 및 열두번째 달 동안 정맥내 주입와 함께 1개월마다 1회 근육내 주사를 포함한다. 손상된 구역 주변의 심장내 주사는 우회로 수술 도중에 제공할 수 있었다.
실시예 23:
동 서맥이 있는 동성 코르다 증후군으로 진단된 환자가 박동조율기 이식을 추천받았다. 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 hES 세포 및 그의 유도체를 정맥내 주사, 또는 피하 주사, 또는 근육내 주사 또는 심장내 주사를 통해 또는 혈관조영 중에 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포의 양으로 투여하는, 본 발명의 실시에 따라 환자를 치료하였다. 환자는 hES 세포에 의한 치료 후 개선의 징후를 나타내었으며, 박동조율기에 대한 필요성이 없어졌다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 22에 나타낸다.
<표 22>
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암성 세포 및 종양발생 조직의 치료
대안으로, 암 환자의 통상적인 화학요법 치료를 보충하기 위해 본 발명의 실시에 따라 hES 세포를 투여할 수 있다. 통상적인 화학요법에서, 암 세포를 파괴하기 위해 세포독성제를 투여한다. 그러나, 세포독성제는 정상적인 세포와 암 세포를 구별하지 않아서, 환자의 면역계 세포를 비롯해 환자의 비-암 세포를 파괴할 수 있다. 그 결과, 화학요법을 받는 동안 및 화학요법 중지 후 수 기간 동안 암 환자는 그의 저하된 면역계로 인해 감염에 민감하다. 화학요법을 받는 환자에게 조혈 줄기 세포, 뉴런 줄기 세포 및 hES 세포를 투여함으로써, 주사된 세포의 몇몇 부분은 화학요법에 의해 파괴된 백혈구, 적혈구, 혈소판 및 다른 세포를 대체하여 새로운 면역계로 분화할 것이다. 또한, 체세포분열의 역학의 조절을 통한 방사선요법 및 화학요법의 결과로 무형성 골수의 재생, 및 정상적인 세포 교통 경로의 복구는 면역계를 부양하고, 추가로 탈조절된 체세포분열을 정지시킨다. hES 세포 및/또는 그의 유도체는 정맥내 또는 근육내 주사를 통해 투여되거나 또는 성장물에 직접 투여될 수 있다. 이들 세포는 또한 이상 고슴도치 경로에 작용하고 이를 제어하여 과잉 증식이 중지되도록 하였다.
실시예 24:
등급 III 선암종으로 보고된 환자가 화학요법 치료 및 수술을 받았으나 성공하지 못하였다. 결절성 외관 및 복강 림프절 및 역췌장 림프절이 있는 다발성 간 전이의 발병때문에 환자는 지지요법을 필요로 하였다.
본 발명의 실시에 따른 hES 세포 및 그의 유도체를 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포의 양으로 환자에게 투여하여, 이전에 결절성이었던 균일한 이종 간의 복구 및 림프절의 증가된 에코발생 구역을 비롯하여 현저한 개선을 가져왔다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 23에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00072
Figure 112008069743056-PCT00073
아프타 궤양/편평태선의 치료
hES 세포 및/또는 그의 유도체의 또다른 용도는 입의 아프타 궤양과 같은 신체 점막 구역의 임의의 궤양의 치료이다. 세포를 정맥내, 근육내 및 국소적으로 투여한다. 첫번째 4개월 동안 1일마다 주사를 근육내 또는 정맥내로 제공하고, 15일 내지 30일마다 정맥내 주입을 제공한다. 또한, 직접 또는 겔과의 혼합을 통해 국소로 적용한다.
실시예 25:
65세 할머니가 통증이 있는 괴사 조직이 가득한 혀 및 아프타 궤양이 있었다. 그녀는 식사 및 연하, 및 말하는데 곤란함이 있었다. hES 세포를 투여받고 그녀는 더 좋아졌으며, 연하 및 말하기가 더 용이해지고, 입을 벌리는 것도 더 나아졌다. 또한, 그녀는 궤양 및 괴사 조직의 회복을 나타냈다.
골관절염, 관절염, 강직 관절의 치료
hES 세포 및/또는 그의 유도체의 또다른 용도는 골관절염, 관절염 및 강직 관절의 치료이다. 시동을 위해 10일 동안 1일마다 근육내 주사를 제공하였다. 살루메드롤과 혼합된 750,000 내지 8천만개의 hES 세포의 관절내 주사를 제공하고 1½ 내지 3개월 후 반복하였다.
완신경총 상해의 치료
hES 세포 및/또는 그의 유도체의 또다른 용도는 영향받은 팔이 마비된 완신경총 상해의 치료이다. 세포를 근육내, 정맥내 및 완신경총으로 투여하고, 1년 동안 또는 팔이 더 좋아질 때까지 1½개월마다 반복하였다. 또한, 정맥내 주입을 사용하였다.
실시예 26:
환자는 완신경총 상해 (좌측) 손을 앓고 지난 7 내지 8년 동안 왼손의 기능이 상실된 26세 남성이었다. 줄기 세포 치료에 의해 그의 왼손은 팔꿈치 및 손목까지 더 큰 운동력과 함께 훨씬 더 좋아졌다. 그는 손목을 움직일 수 있었으며, 손은 예전처럼 이완되지 않았다. 또한, 그는 팔을 위를 향해 움직일 수 있었다.
생식 장애의 치료
본 발명의 실시에 따른 hES 세포 이식의 다른 용도는 전립선 위축, 난소 기능부전 및 무정자증을 앓는 환자의 수정능 복구를 통한 생식 장애의 치료이다.
실시예 27:
본 발명의 실시에 따른 국소 근육내 주사를 통한 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 hES 세포 및 그의 유도체에 의한 무정자증 환자의 치료는 정자의 생성을 야기하였다. 또한, 고환으로의 직접 주사 뿐만 아니라 정맥내 및 근육내 주사를 사용하였으며, 또한 부고환에 인접한 피하 주사를 사용하였다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 24에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00074
조직 재생
근육 재생, 간 경화증의 치료, 및 퇴행성 질환의 치료에 효과적인 새로운 혈관의 형성 (신생혈관화), 및 악성 궤양의 치료를 포함하나 이에 제한되지 않는 조직 재생의 유도를 위해 본 발명의 실시에 따라 hES 세포를 투여할 수 있다.
당뇨병의 치료
본 발명의 다른 실시양태는 당뇨병의 치료에서의 인슐린-생성 선조 세포를 포함하는 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 사용이다.
당뇨병 환자는 심장 발작 또는 뇌졸중을 앓을 위험이 4배로 높고, 또한 신장, 눈, 신경계 및 전신 면역계를 비롯한 다기관 변성 및 기능부전의 위험이 증가된다. 인슐린-생성 hES 세포의 이식 및 신체에서 인슐린 생성의 복구를 통한 당뇨병의 치료에 의해 인슐린에 대한 필요성이 감소되고, 쇠약화 부작용이 감소된다.
투여 프로토콜은 특정 환자에 맞추기 위해 다양할 수 있으나, 당뇨병의 치료를 위한 전형적 프로토콜은 첫번째 달 동안 1주마다 2회 근육내 및 정맥내 주사, 세번째, 여섯번째, 열한번째 및 열두번째 달 동안 1주마다 1회 주사를 포함한다. 또한 여섯번째 달 동안 정맥내 주입을 제공할 수 있다.
실시예 28:
환자는 과케토산증을 앓았었고 당뇨병이 있는 70세 남성이었으며, 인슐린 52 단위 및 경구 혈당강하제를 투여받고 있었다. 치료요법의 6개월 내에, 그는 모든 약물처치 및 인슐린의 투여를 중지하였으며, 이제 지난 1½년 동안 정상 식이로 혈당을 유지할 수 있었다. 그는 추가접종 주사를 받았다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 25에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00075
실시예 29:
54세 남성은 지난 3년 동안 비조절된 당뇨병을 나타내었으며, 경구 혈당강하제와 함께 인슐린 42 단위를 투여받았다. 모든 약물처치에 의해 공복 혈당은 200 mg/dl이었으며, 식후 혈당은 280 mg/dl이었다.
3주 동안 hES 세포를 투여받은 후, 그는 인슐린 투여를 중지하고 감소된 용량의 혈당강하 약물을 투여받았다. 그는 훨씬 좋아진 느낌이며, 보다 민첩해졌다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 26에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00076
실시예 30:
45세 남성이 협심증 및 당뇨병이었다. 그는 인슐린 및 경구 혈당강하제를 투여받고, 혈관성형술을 받았다.
hES 세포 치료를 받은 후 3개월에 인슐린 투여를 중단하였고, 감소된 용량의 경구 혈당강하제를 투여받았다. 혈당 및 약물처치의 기록은 혈당 수준이 잘 조절되고 있음을 나타내었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 27에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00077
Figure 112008069743056-PCT00078
Figure 112008069743056-PCT00079
간질성 폐 질환의 치료
실시예 31:
중년의 여성이 ILD (간질성 폐 질환)으로 병원에 왔다. 그녀는 휴식시 SPO2 69%로 말기의 단계에 있었다. hES 세포 치료에 의해 그녀의 질환은 진행을 멈추었다. 환자는 전반적으로 더 나아진 느낌이었고, 심지어 호흡도 개선되었다. 치료를 계속하였다. 청진시 들리는 호흡음이 있었으며, 전반적인 폐 기능 시험은 소정의 개선을 나타내었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 28에 나타낸다.
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새로운 약물 개발
hES 세포의 또다른 용도는 새로운 약물의 개발 및 시험이다. 예를 들어, hES 세포를 본 발명의 실시에 따라 배양하고, 제약 연구 및 개발 중에 새로운 화학적 실체, 약물 후보 및 새로운 약제의 표적, 작용 방식, 섭취, 대사, 배설, 독성 및 안전성의 시험을 위한 기질로서 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 화합물의 존재하에 본 발명의 방법에 의해 얻은 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 배양하는 단계, 및 상기 세포에 대한 상기 화합물의 효과를 결정하는 단계를 포함하는, hES 세포 및/또는 그의 유도체에 대한 화합물의 효과의 시험 방법에 관한 것이다.
실시예 32:
배양된 hES 세포에 대한 항생제 테트라사이클린 및 세프트리악손의 효과를 환자의 혈청과 함께 분석하였다. 이들 약물을 상이한 농도로 함께 뿐만 아니라 별도로 도입하고, 줄기 세포에 대한 효과를 연구하였다. 마지막으로, 약물처치의 용량 및 약물의 효능을 결정하였다.
약물 전달
hES 세포 및/또는 그의 유도체의 다른 용도는 상해 또는 질환의 부위로의 약물의 국소 전달을 위한 약물을 담지하는 것이다. 세포가 약물을 수용하도록 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 약물의 존재하에 인큐베이션할 수 있다. 그 후, 로딩된 세포를 약물이 세포로 확산될 치료 부위에 국소적으로 전달할 수 있으며, 상해 또는 질환의 치료가 계속될 것이다. 다른 실시양태에서, 손상된 또는 질환에 걸린 구역이 약물의 직접 적용에 부적합한 경우 (예를 들어, 상기 구역이 약물을 직접 주사하기에 너무 손상된 경우), 로딩된 세포를 손상된 또는 질환에 걸린 구역 이외의 부위로 전달할 수 있다. 이러한 약물 전달 방법은 대상체에게 전신 투여하는 경우 독성인 약물의 사용을 허용한다. 또한, 상기 방법은 다른 투여 경로에 의해 가능한 농도보다 부위로 투여되는 약물의 더 높은 농도를 허용한다. 추가 실시양태에서, hES 세포 및/또는 그의 유도체를, 세포 자체의 이식에 의해 생성되는 치료를 향상시키는 하나 이상의 약물과 함께 로딩할 수 있다. 비제한적 예로는 심장 질환의 치료를 위한 항고혈압제와 세포의 로딩, 암 환자의 치료를 위한 화학요법제와 세포의 로딩, SCI의 치료를 위한 향신경성 인자와 세포의 로딩을 들 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 약물의 존재하에 본 발명의 방법에 의해 얻은, 약물을 수용하는 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 배양하는 단계, 및 대상체의 부위로 세포를 투여하는 단계 (여기서, 약물이 전달됨)를 포함하는, 대상체로의 약물의 전달 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 배양 방법은 약물 또는 활성제를 환자에 직접 투여하는 것과 비교하여, 이식 전에 시험관내 약물 및 다른 활성제로의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 노출을 허용한다. 세포의 시험관내 노출은 이롭게는 약물의 전신 투여의 독성을 회피하는 반면 약물의 양성 효과 (예를 들어, 발프로산의 향신경성 효과)를 제공한다.
척수 상해 치료: 증례 연구
SCI를 위한 hES 세포 및 그의 유도체를 사용하는 임상적 치료는 현저한 결과를 나타내었다. 본 발명의 실시의 성질, 및 환자가 불치의 지원자이고, 상태가 천연 신경 재생 프로세스가 가능한 단계를 넘어서 ASIA A 만성 SCI이라면, 의사의 확신의 측면에서 이중 맹검 또는 플라시보 대조군 시험을 수행하지 않았다. 프로토콜의 결과는 하기 증례 연구에 제공된 상세한 실시예를 통해 입증된다.
증례 연구 1
본 발명의 실시는 본원에 기재된 프로토콜에 따른 hES 세포의 이식에 의해 SCI를 앓는 대상체에서 SCI의 증상의 반전을 가져왔다.
ReRo 1.3.4./000/220905/α, C6-C7 골절 및 탈구가 있는 29세 대상체는 상이한 의료 진료에 의해 치료가 불가능한 것으로 선언되었다. 대상체는 유방간 구역 하향으로부터 감각이 없었고, 스스로 앉아있을 수 없었으며, 방광 또는 장 조절이 안되고, 팔 및 손가락을 움직일 수 없었고, 다리에 힘 또는 긴장이 없었다. 대상체는 3년의 기간 동안 악성 양측 와창이 발병하였다. 본 발명의 실시에 따른 hES 세포 및 그의 유도체의 투여는 아래와 같이 이들 조건하에 개시하였다.
조혈 줄기 세포 선조 및 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 대략 750,000 내지 약 8천만개의 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물을 멸균 생리식염수에 0.25 내지 1.0 ml의 최종 부피로 희석하고, 핵형분석하고, 표준 프로토콜을 사용하여 오염, 생존율 및 개수에 대해 시험한 후, 피하 주사에 의해 전완에 투여하였다. 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간 및 24시간 후 대상체를 아나필락시성 쇼크, 주사 부위에서의 통증 또는 염증, 전신성 소양증, 홍조 또는 열에 대해 관찰하였다.
멸균 생리식염수 0.25 ml 내지 1.0 ml의 부피에 재현탁된, 조혈 줄기 세포 선조 및 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 750,000 내지 8천만개의 hES 세포 및 그의 유도체를 함유하는 제약 조성물의 피하 시동 주사의 투여에 의해 대상체를 치료하였다. 멸균 생리식염수 0.25 ml 내지 1.0 ml에 재현탁된 동일한 개수의 조혈 줄기 세포 및 뉴런 줄기 세포를 담지하는 추가 시동 주사를 근육내 주사에 의해 투여하였다. 멸균 생리식염수 0.25 ml 내지 1.0 ml의 부피에 재현탁된 750,000 내지 8천만개의 뉴런 줄기 세포 선조의 최종 시동 주사를 정맥내 주사에 의해 투여하였다.
멸균 생리식염수 2 ml의 부피에 재현탁되고 추가로 멸균 생리식염수 15 ml 내지 40 ml로 희석된, 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 750,000 내지 8천만개의 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물의 재현탁액에 의해 본 발명의 실시에 따른 SCI의 직접 치료를 수행하고, 제1 시동 주사 후 7일에 병변 부위, 병변 부위 아래, 및 병변 부위 위에 경막외 주사에 의해 투여하였다. 시동의 한달반 후, 시동후 4개월, 및 시동후 6개월에 경막외 주사의 투여에 의한 치료를 반복하였다.
경막외 투여 이외에, 멸균 생리식염수 2 ml에 재현탁된, 조혈 줄기 세포 선조 및 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 750,000 내지 1천1백만개의 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물의 경막내 주사에 의해 대상체를 치료의 개시 후 2 및 5개월에 치료하였다.
또한, 멸균 생리식염수 2 ml에 재현탁되고 추가로 4 ml의 최종 부피로 희석된, 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 750,000 내지 8천만개의 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물의 연속적인 3일 동안 1일마다 2회 경막외 주사에 의해 대상체를 치료하였다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 29에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00086
Figure 112008069743056-PCT00087
대상체의 신경학적 안녕을 치료의 개시 후 규칙적인 간격으로 평가하고, 하기 표 30에 나타낸 바와 같이 2주 후 대상체의 정신 상태 및 전신 위생의 현저한 개선을 관찰하였다.
기간 정신 상태 위생 행동 뇌신경
0일 우울함 불량 공손함 정상
3일 우울함 불량 공손함 정상
15일 희망적임 평균 공손함 정상
2개월 행복함 평균 공손함 정상
3개월 희망적임 평균 공손함 정상
10개월 매우 행복하고 삶을 기대함 평균 공손함 정상
치료 과정 중에 C6-C7 골절의 결과로서 자율 신경계에 대한 손상의 전형적 징후 및 증상을 평가하였다. 심부 압력을 감지하는 능력, 촉각, 감각, 균형, 통증을 감지하는 능력, 온도 변화를 감지하는 능력, 강제 이동, 냉한의 존재, 현기증, 혈액 압력, 호흡 곤란, 누워있는 동안의 비정상적인 자세, 및 도움없이 앉을 수 있는 능력을 비롯한, 시험된 모든 파라미터의 현저하고 진행적인 개선을 하기 표 31에 나타낸 바와 같이 관찰하였다.
기간 심부 압력 촉각 감각 균형 통증 온도
0일 유방간 쇄골의 하부 가장자리 쇄골의 하부 가장자리 앉지 않음 쇄골의 상부 가장자리 쇄골의 상부 가장자리
3일 배꼽 유방간 팔 유방간 팔 전완 앉지 않음 유방간 유방간
15일 배꼽 아래 검상흉골 검상흉골 및 내부 팔 앉음 검상흉골 및 내부 팔 검상흉골 및 내부 팔
2개월 좌골극 좌골극 검상흉골 및 내부 팔 매우 잘 앉음 좌골극 좌골극
3개월 넙적다리의 상부 가장자리 좌골극 검상흉골 및 내부 팔 앉음 좌골극 좌골극
10개월 " 회음 배꼽 잘 앉음 회음 회음
05.06 회음 넙적다리 아래 중간 배꼽 잘 앉음 회음 회음
기간 냉한 현기증 BP 호흡 누워있는 동안의 비정상적인 자세
0일 ++++ ++++ 오르내림 횡격막 호흡 앉을 수 없음
3일 +++ +++ 오르내림 횡격막 호흡 앉을 수 없음
15일 ++ + 안정 정상 안정하게 앉음
2개월 없음 앉아있을 때 + 안정 정상 매우 잘 앉음
3개월 없음 앉아있을 때 + 안정 정상 매우 잘 앉음
10개월 없음 앉아있을 때 + 안정 정상 캘리퍼스 부목 및 보행 보조기에 의해 서있음
05.06 없음 없음 안정 정상 캘리퍼스 부목 및 보행 보조기에 의해 서있고, 앞으로 걸음
방광 및 장 기능장애는 SCI의 결과로서 신경학적 손상과 통상적으로 관련된다. 이 손상은 손상된 방광 조절, 방광 흐름 및 방광에서의 충만 감각, 장 조절, 장의 배설 시간 및 장의 감각을 야기한다. 치료의 과정 중에, 시험된 모든 파라미터의 현저하고 진행적인 개선을 하기 표 32에 나타낸 바와 같은 치료 결과로서 관찰하였다.
기간 불수의 운동 방광 조절 방광 흐름 감각(방광) 장 조절 평가 시간 감각(장)
0일 없음 없음 없음 없음 없음 3시간 없음
3일 없음 없음 없음 없음 없음 3시간 없음
15일 없음 없음 없음 없음 없음 2.5시간 없음
2개월 없음 없음 없음 없음 없음 2시간 +
3개월 없음 없음 없음 개시 + 0.5시간 ++
C6-C7 병변의 부위에서 신경 재생에 대한 증거로서, 상체의 운동 기능의 변화를 치료의 과정 중에 평가하였다. 어깨 이동, 손목 및 손가락 이동, 손가락의 힘, 힘줄 반사, 사지 이동, 근육 위축 및 손 움켜잡기의 강도의 현저하고 진행적인 개선을 하기 표 33에 나타낸 바와 같이 관찰하였다.
기간 어깨 L R 손목 손가락 L R 힘줄 반사 L R 힘 S FA W F 위축 S FA W F 손 움켜잡기
0일 으쓱임 + 수근하수 쇠약한 손가락 이동 없음 이두근 활기참 양측 4 2 3 0 0 3+ 4+ 4+ 없음 B/L
3일 으쓱임 + 수근하수 쇠약한 손가락 이동 없음 이두근 활기참 양측 4 2 3 0 0 3+ 4+ 4+ 없음 B/L
15일 으쓱임 + 수근하수 우수 움켜쥘 수 있음 손목을 이동할 수 있음 활기참 4 3 4 3 0 3 4 4+ 존재함 유리잔을 잡을 수 있음
2개월 + " 모호함 4 4 4 4 0 2+ 3+ 3+ 입으로 음식을 집을 수 있음
3개월 + 훨씬 잘 이동함 모호함 4 4 4 4 0 2+ 3+ 3+
S = 어깨; FA = 전완; W = 손목; F = 손가락; L = 왼쪽; R = 오른쪽
힘: 0은 불량하고, 4는 양호함
위축: 0은 양호하고, 4는 불량함
C6-C7 병변의 부위에서 신경 재생에 대한 증거로서, 엉덩이 이동, 무릎 이동, 발가락 이동, 힘줄 반사, 사지의 강도, 근육 위축 및 발바닥 반응을 비롯한 하체의 운동 기능의 변화를 치료의 과정 중에 평가하였다. 연구 과정 중에 시험된 파라미터 중 임의의 파라미터의 개선은 없었으나, 치료의 3개월 후 대상체는 하기 표 34에 나타낸 바와 같이 보행 보조기의 도움으로 설 수 있었다.
기간 엉덩이 L R 무릎 L R 발가락 L R 반사 L R 힘 L R 위축 L R 발바닥 L R
0일 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4+ 4+ 모호함
3일 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4+ 4+ 모호함
15일 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4+ 4+ 모호함
2개월 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4+ 4+ 모호함
3개월 10분 동안 보행 보조기에 의해 서있음 모호함
증례 연구 2
ReRo 1.3.4./001/051004/α001, 2층 지붕 꼭대기에서 떨어진 후 D6-D7 골절의 결과로서 외상후 대마비 SCI를 앓은 22세 대상체. 대상체는 떨어진 후 2일 동안 혼수에 있다가 희식을 회복하였으나, 유방간 영역으로부터 발까지의 신체의 하반신의 전체 감각 및 운동 상실이 있는 양측 마비가 발병하였고, 발 또는 다리를 올릴 수 없었으며, 도움없이 앉거나, 또는 앉아있는 위치에서 일어날 수 없었다. 대상체는 영구적으로 병상 신세였으며, 방광 및 장 조절능이 상실되었고, 상부 사지는 영향받지 않았지만, 가족의 도움에 완전히 의존하고 있었다.
상해의 5개월 후, 본 발명의 실시에 따른 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물의 투여를 개시하였다. 5개월의 시간에, 대상체는 방광 및 장 조절능을 회복하였고, 도움없이 앉을 수 있게 되었으며, 엉덩이를 들어올려 미끄러져 위아래로 움직일 수 있게 되었다. 감각 지각이 회음 수준까지 복구되었다. 대상체는 보행 보조기 도움없이 스스로 일어날 수 있었으며, 무릎 지지에 대한 필요성 없이 보행 보조기에서 쉽게 설 수 있었다. 치료에 의해, 대상체는 무릎 고정기의 지지로 보행 보조기를 사용하여 걸을 수 있게 되었으며, 일에 복귀하였다, 즉 규칙적인 생활방식으로 회복하였다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 35에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00088
Figure 112008069743056-PCT00089
증례 연구 3
ReRo 1.3.4./002/040205/α, C5-C6 상해의 결과로서 사지마비 SCI 및 목의 경직 및 통증을 앓은 40세 대상체. 대상체는 6개월 후 수술을 받았으며, 그 후로 사지마비였다. 대상체는 지지에 의해 앉아야 한다는 쇠약감 및 현기증을 앓았으며, 수술 직후 모든 사지의 힘의 전체 상실, 및 장 및 방광 기능의 상실과 함께 상부 견갑골의 상부 가장자리로부터 감각을 가졌다.
본 발명의 실시에 따른 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물의 투여는 수술 후 9개월에 개시하였다. hES 세포 치료의 결과로서, 대상체는 지지에 대한 필요성 없이 편안하게 앉을 수 있었고, 편안하게 다리를 늘어뜨린 상태로 의자에 앉아 있는 동안 옆으로 이동하고 구부릴 수 있었다. 대상체는 회복하여 상체의 조절의 현저한 개선을 나타내었다. 대상체는 증가된 이동성 및 독립성 및 활동을 통해 일반적인 심리적 안녕의 실질적 개선을 받았다. 그는 하부 사지의 힘으로 지지받아 서있을 수 있었고, 발가락 이동을 조절할 수 있었으며, 수근하수는 없었다. 치료는 대상체의 상태의 개선에 따라 진행하였다.
증례 연구 4
ReRo 1.3.4./003/260902/β, 17년 전에 도로 교통 사고 후 뇌 손상과 함께 척수 상해를 입었으며, 휠체어 신세인 37세 대상체. 또한, 대상체는 우측 편측마비, 대화 무능력, 안면 마비, 전체 기억 상실 및 방광 비조절을 앓았다.
1년 2개월 동안 본 발명의 실시에 따른 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물을 대상체에게 투여하였으며, 이에 의해 보행 보조기의 도움 없이 걸을 수 있고, 몇단어를 말하고, 목을 펼 수 있게 되었으며, 안면 마비가 제거되고, 기억이 개선되었다.
증례 연구 5
ReRo 1.3.4./004/030505/α, 척수좌상 및 관련된 전경막외 출혈을 일으키는 골절된 척추의 후방돌출과 함께 C5-C8의 외상후 골절을 앓았으며, 양측마비였던 56세 대상체. 대상체는 양쪽 하부 사지를 움직일 수 없었으며, 목에 급성 통증을 앓았다.
본 발명의 실시에 따른 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물의 투여를 1년의 기간 동안 수행하였으며, 이에 의해 양쪽 다리의 소정의 강도, 다리의 감각 지각, 예컨대 진동, 요통 없이 보행 보조기의 도움으로 설 수 있는 능력을 회복하였다. 대상체는 보행 보조기의 도움으로 걸을 수 있었으며, 방광 조절 및 감각을 회복하였고, 냉한 및 현기증의 발작을 극복하였다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 36에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00090
Figure 112008069743056-PCT00091
Figure 112008069743056-PCT00092
증례 연구 6
ReRo 1.3.4./005/130705/β, 척수의 전감압술에 의해 3회 수술을 받은, 하부 사지 대마비가 있는 D6 수준에서의 포트 척추 장애로 진단된 25세 대상체. 대상체는 휠체어 신세였고, 지지없이 앉을 수 없었고, 다리의 이완 마비가 있었고, 장 조절을 하지 못하고, 누워있는 동안 배설하였으며, 방광 감각이 없었다.
본 발명의 실시에 따른 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물을 대상체에게 상해 후 11년 6개월에 투여하였다. 첫번째 1년 동안 이어진 치료 프로토콜에 의해 등이 강화되고, 지지없이 앉을 수 있고, 다리에 무게 감각을 느낄 수 있었다. 또한, 대상체는 월경중 요통 및 월경통이 회복되었다. 넓적다리, 다리의 감각, 및 방광 감각 및 조절의 회복이 관찰되었다. 대상체는 양쪽 다리의 이동의 양호한 복구에 의해 보행 보조기의 도움으로 걸을 수 있었다. 치료는 진행중이다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 37에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00093
Figure 112008069743056-PCT00094
Figure 112008069743056-PCT00095
증례 연구 7
ReRo 1.3.4./0O6/220805/α, C6-C7 양측마비 SCI를 앓는 30세 대상체는 하부 사지를 움직일 수 없었고, 장 조절 또는 장 감각이 없었다. 대상체는 상부 유방간 영역으로부터만 미세한 심부 압력 감각이 있을 뿐이었다. 따라서, 대상체는 앉아 있기 힘들었다. 대상체의 손은 매우 약한 강도를 갖고 있었고, 손가락 이동이 매우 약하였으며, 대상체는 호흡에 곤란함이 있었다.
상해 후 약 3개월에 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물의 투여에 의해 본 발명의 실시에 따라 대상체를 치료하였다. 대상체는 지지없이 앉을 수 있는 능력을 회복하였으며, 현기증이 없어졌고, 서혜부의 압력을 감지할 수 있고, 팔꿈치의 내측의 감각이 있었고, 환자가 움질이려고 하면 다리에 통증을 느꼈다. 대상체는 용이하게 숨쉬고, 방광 및 장에 감각이 있었으며, 다리에 감각이 있었고, 지지받아 수분 동안 서있을 수 있었다. 또한, 대상체는 손가락의 강도가 증가되고 움직일 수 있게 되었다. 치료는 진행중이다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 38에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00096
증례 연구 8
ReRo 1.3.4./007/221005/β, D6의 SCI의 결과로서 양측마비인 26세 대상체는 지지 없이 앉아있을 수 있었으나 양쪽 하부 사지를 움직일 수 없었다. 대상체는 방광 또는 장 조절을 할 수 없었으며, 상부 유방간 구역로부터만 감각이 있었다.
상해 후 약 10개월에 본 발명의 실시에 따른 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물을 대상체에게 투여하였다. 대상체는 신체의 가측, 및 겨드랑이 구역으로부터 무명골까지 양측 배꼽 영역까지의 감각을 회복하였다. 대상체는 다리의 운동력과 함께 보행 보조기 및 캘리퍼스 부목의 도움으로 걸을 수 있었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 39에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00097
증례 연구 9
ReRo 1.3.4./008/151005/β, 27세 대상체는 외상성 사지마비를 앓았고, 경직된 목으로 말하고 호흡하는데 매우 곤란함을 겪었다. 대상체의 다리는 마비되고, 대상체는 손가락을 움직일 수 없었고, 신체의 나머지에 감각이 없었다.
본 발명의 실시에 따른 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물의 투여를 통한 치료를 상해 후 약 2년에 개시하였다. 대상체는 목 움직임이 개선되었고, 말하기가 용이해지고, 목소리 음성의 조절이 개선되었다. 대상체는 호흡이 덜 방해받고, 소정의 손가락 움직임으로 운동 기능이 복귀하였음을 알았다. 다리는 덜 경직되었으며, 대상체는 도움없이 앉아있을 수 있었다. 또한, 발가락을 다시 움직일 수 있고, 대상체는 어깨를 움직일 수 있었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 40에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00098
증례 연구 10
ReRo 1.3.4./009/300106/α, 25세 대상체는 도로 사고를 당했으며, 지지없이 앉을 수 있는 능력을 상실하였다. 척추는 좌굴요절하기 쉬웠으며, 대상체는 방광 및 장 조절능을 상실하였고, 대상체는 다리의 전체 힘을 상실하였다.
상해 후 약 2년에 본 발명의 실시에 따른 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물의 투여에 의해 대상체를 치료하였다. 대상체는 급속한 개선을 나타내었으며, 지지없이 앉아있을 수 있었다. 대상체는 현기증이 없어지고, 양발을 모두 움직였고, 손가락 끝의 감각을 회복하였고, 척추를 통해 오한 흐름을 경험할 수 있었다.
증례 연구 11
ReRo 1.3.4./010/0202067β, 도로 교통 사고의 결과로서 D12-L1의 SCI가 있는 26세 대상체는 무릎이 수축된 상태로 서 있을 수 없었다. 대상체는 지지없이 앉아있을 수 있었고, 사지에 정상적인 감각이 있었다. 대상체는 방광 또는 장 조절을 할 수 없었으며, 경련이 증가되었다.
본 발명의 실시에 따른 hES 세포 및 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물의 투여에 의해 상해 후 약 12년에 대상체를 치료하였다. 대상체는 경련의 감소와 함께 다리 운동 기능의 현저한 회복을 경험하였으며, 오른쪽 다리를 완전히 펼 수 있었고, 왼쪽 다리의 강도가 복귀되었다. 대상체는 서 있는 능력을 회복하였으며, 캘리퍼스 부목 및 보행 보조기의 도움으로 걸을 수 있었다. 또한, 대상체에서 방광 및 장 감각이 복귀하였다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 41에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00099
증례 연구 12
환자는 D6 내지 D8 사이의 상해 후 대마비가 있는 26세 남성이었다. 그는 2004년 9월에 외상성 도로 사고를 당했다. 그는 흉부 아래로 감각이 없었으며 완전히 병상 신세였으며, 방광 또는 장 조절을 할 수 없었고, 흉부 아래로부터 감각 또는 운동력이 없었다. 그는 천골이 보일 수 있는 하부 등에 매우 깊은 와창이 있었다.
환자는 2006년 4월 27일에 hES 세포를 개시하였다. 와창때문에 임의의 O/T 절차를 받을 수 없었으며, 정맥내 및 근육내로 세포의 1일 투여량을 제공하였고, 마침내 hES 세포를 직접 그의 와창에 적용하였다. 또한, 그는 정맥내 주입을 제공받았다.
치료의 열한번째 날에 그는 전체 캘리퍼스 부목 (손목부터 관절까지) 및 보행 보조기에 의해 서있을 수 있었고, 두 걸음을 걸었다. 시간이 지남에 따라 그의 근육의 힘이 증가되었으며, 4개월 후 그는 100 걸음을 걸을 수 있었고, 20분 이하 동안 서있을 수 있었다. 그는 다리 감각을 느낄 수 있었고, 또한 다리를 움직일 수 있었다. 또한, 그는 방광 및 장 충만을 느낄 수 있었고, 지지를 위해 무릎 고정기 및 보행 보조기에 의해 걸을 수 있었다. 그의 와창은 치유되었으며, 그는 연구를 다시 시작하였다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 42에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00100
Figure 112008069743056-PCT00101
Figure 112008069743056-PCT00102
Figure 112008069743056-PCT00103
Figure 112008069743056-PCT00104
Figure 112008069743056-PCT00105
증례 연구 13
환자는 2006년 6월에 낙마 사고를 겪은 22세 남성이었고, T-12, L-1에 양측마비이었다. 그는 손목 아래 힘이 없었으며, 장 또는 방광 조절을 할 수 없었으며, 손목 아래 감각이 없었다.
환자는 2006년 9월에 6주 동안 허용된 치료를 시작하였다. 그는 hES 세포에 반응하였으며, 1주 내에 서있을 수 있었고 전체 캘리퍼스 부목 (손목부터 관절까지) 및 보행 보조기에 의해 몇걸음을 걸을 수 있었다. 그는 진척되었으며, 무릎 고정기를 착용하였으며, 보행 보조기에 의해 30분 이하 동안 서있을 수 있었다. 그는 이제 전체 감각이 있었고, 장 및 방광 조절을 할 수 있었다. 또한, 그는 지팡이 및 또한 목발에 의해 양호하게 균형잡았다. 그는 캘리퍼스 부목 및 목발에 의해 계단을 오르고 내릴 수 있었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 43에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00106
Figure 112008069743056-PCT00107
Figure 112008069743056-PCT00108
증례 연구 14
환자는 2004년 9월에 도로 교통 사고를 당한, T-12, L-1에 외상성 양측마비가 있는 26세 여성이었다. 그녀는 흉부 아래로 감각이 없었으며, 장 또는 방광 조절을 하지 못하였다. 다리에 운동력이 없었으며, 휠체어 신세였다.
환자는 2006년 3월에 hES 세포를 개시하였다. 그녀는 9일 후 전체 캘리퍼스 부목 (손목부터 관절까지) 및 보행 보조기에 의해 서있을 수 있고 몇걸음 걸을 수 있었으며, 계속 진행되었다. 그녀는 현재 캘리퍼스 부목 및 보행 보조기에 의해 연속적으로 걸을 수 있으며, 또한 무릎 고정기를 사용하여 서있을 수 있다. 장 및 방광 감각이 조절과 함께 복구되었으며, 임의의 카테터 또는 좌약을 사용하지 않게 되었다. 감각이 관절 수준까지 개선되었다.
이 환자에 대한 주사 스케쥴은 하기 표 44에 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00109
Figure 112008069743056-PCT00110
Figure 112008069743056-PCT00111
인간 배아 줄기 세포 배양 방법
본 발명하에 개발된 세포주를 위한 출발 물질로서 사용된 hES 세포는 자궁으로의 착상 전에 2 내지 7일이 경과된 배아, 예를 들어 2 내지 4 일이 경과된 배아, 예를 들어 3일이 경과된 배아로부터 유래된 것이다.
배아 단리를 위해, 규칙적인 IVF 주기를 갖는 인간 공여자로부터 동의에 의해 난자를 수집하였다. 난자를 정자에 의해 수정시키고, 통상적인 방법에 의해 배양하여, 배아를 얻었다. 외배아를 세포주의 발생을 위해 다양한 기간 동안 인큐베이션하였다.
배아를 소량의 최소 필수 배지 (예를 들어, RPMI, 예를 들어 2.2 g/L 중탄산나트륨을 갖는 RPMI 1640)에 현탁하고, hES 세포를 기계적 수단 (예를 들어, 진탕)에 의해 배아로부터 단리하였다. 추가 배지를 프로게스틴 및 βhCG 효능제와 함께 단리된 세포에 첨가하였다. 한 실시양태에서, 프로게스테론 (250 mg/ml 16 내지 64 ㎕) 및 βhCG (5000 iu/ml 16 내지 64 ㎕)를 첨가하였다. 단리된 세포를 12 내지 48시간 동안, 예를 들어 24시간 동안 34 내지 38℃의 온도에서 3.5 내지 6% 이산화탄소의 환경하에 배양하였다.
한 실시양태에서, hES 세포를 분화를 방지하면서 세포의 증식을 위해 혐기성 조건 또는 실질적으로 혐기성 조건하에 배양하였다. "실질적으로 혐기성"이란 약 10% 미만의 O2, 예를 들어, 8%, 6%, 4%, 2% 또는 1% 미만의 O2로서 정의된다. 저산소 상태는 주변 공기를 질소 기체에 의해 대체함으로써 산소 수준이 0% 내지 20%로 고정될 수 있는 다중 기체 (CO2, O2, N2) 세포 인큐베이터를 사용하여 형성될 수 있다. 다중-기체 인큐베이터의 예로는 피셔(Fisher) 11-730 시리즈, 나프코(Napco) 7000 시리즈, 산요(Sanyo) MCO 시리즈, 주안(Jouan) IG750 및 헤라어스 헤라셀(Heraeus Heracell) 150을 들 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포를 CO2 인큐베이터에서 배양하고, 산소 수준을 세포가 함유된 플라스크의 형상 및 위치에 의해 조절하였다. 예를 들어, 세포 배양 플라스크를 수직 위치에서 유지하는 경우 플라스크 중 많은 배양 배지는 실질적으로 혐기성이다. 대조적으로, 세포 배양 플라스크를 수평 위치에서 유지하는 경우 배양 배지는 실질적으로 호기성이다. 배양 배지 중 산소 수준은 인큐베이터 내의 세포 배양 플라스크의 형상 및/또는 위치, 또는 플라스크 내의 배지의 양 (예를 들어, 상부 공간의 양)을 변형함으로써 실질적으로 혐기성으로부터 실질적으로 호기성까지 다양할 수 있다.
증식 단계 동안, 플라스크를 수평 위치보다는 수직 위치에서 유지할 수 있다. 한 실시양태에서, 부피가 배지에 의해 거의 완전히 점유된 배양 용기에서 인큐베이션을 수행하고, 용기를 수직 위치에서 유지하였다. 그 결과로서, 실질적 비율의 세포는 배양 플라스크의 벽에 부착하지 않았으며, 배양 배지는 실질적으로 혐기성이었다.
이러한 성장 조건하에, 세포-배가 또는 복제 주기는 최대에 있었으며, 세포 분화 프로세스는 실질적으로 억제되었다. 증식 중에 세포 복제 주기는 12 내지 48시간, 예를 들어 24시간 동안 진행하였다.
hES 세포의 통과 또는 재배양을 위해, 세포 현탁액을 원심분리하고, 세포 펠렛을 프로게스테론 및 βhCG를 포함하는 소량의 신선한 배양 배지에 재현탁하고, 세포를 분취하고, 프로게스테론 및 βhCG가 없는 추가 신선한 배지를 첨가하였다. 한 실시양태에서, 인큐베이션된 줄기 세포의 분취액 대 신선한 세포 배지의 비율은 약 1:3.5 내지 약 1:35 부피/부피이었다. 실질적으로 혐기성 조건하에 12 내지 48시간 동안, 예를 들어 24시간 동안 3.5 내지 6% 이산화탄소의 분위기로 보충된, 수재킷 인큐베이터에서 34 내지 38℃에서 세포를 재인큐베이션하였다. 이 시점에서, 세포를 연속된 증식을 위해 통과시키거나, 또는 미래 사용을 위해 저장할 수 있다.
이러한 조건하에 배양된 hES 세포는 알칼리 포스파타제 활성, 및 세포 미세분화 또는 분화의 임의의 마커 특징의 부재에 의해 결정된 바와 같이 크게 미분화된 형태로 남아있었다. 그러나, 완전히 분화되거나 또는 완전히 미분화된 세포 집단이 얻어지지 않는다는 것을 주목할 수 있다. 세포 집단은 미분화된 세포 대 분화된 세포 약 4:1 내지 약 10:1 범위의 비율의 분화된 세포주 및 미분화된 세포주의 혼합물이다.
예를 들어 깊은 동결실 또는 액체 질소에서 증식된 hES 세포의 저장을 위해, 0.2 내지 2% (w/v) 디메틸 술폭시드 (DMSO)를 포함하나 이에 제한되지 않는 동결보존제를 배양 배지에 첨가할 수 있다. 사용된 DMSO의 수준은 분화의 유도 또는 세포에 대한 손상을 회피하기 위해 동결보존 (예를 들어, 2 내지 84 ㎕/0.5 ml 튜브)에서 전형적으로 사용되는 수준 미만이다. 동결보존제의 양 대 줄기 세포를 함유하는 배양 배지의 양의 비율은 약 1:500 내지 약 16:1000으로 다양할 수 있다. 다른 동결보존제로는 비제한적으로 글리세롤, 프로판디올, 부탄디올, 에탄올, 글루코스, D-글루코스, 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 파파라빈, 포름아미드, 프로부콜, 쿠르쿠민, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 콘드로이틴 술페이트, 글리코스아미노글리칸 디메틸 술폭시드, 글루타민 및 피루브산나트륨을 들 수 있다. 세포 현탁액을 위한 동결 온도는 약 -15 내지 약 -80℃, 예를 들어, 약 -15 내지 약 -40℃로 다양할 수 있다. 인간 배아 줄기 세포 및 그의 유도체의 저장을 위한 다른 기술과는 대조적으로, 급속 동결 또는 "스트로"에서의 저장에 대한 필요성이 없다. 저장 후, 세포를 수집하고, 원심분리하고, 세포 펠렛을 신선한 배지에서 재현탁함으로써, 연속적 증식 또는 분화를 위한 세포를 제조할 수 있다.
세포 현탁액을 원심분리 (예를 들어, 700 내지 1400 rpm에서 5 내지 12분 동안)에서 침강시키고, 상등액을 제거하고 버리고, 세포를 프로게스틴 및 βhCG 효능제를 함유하는 소량의 신선한 배지 (예를 들어, RPMI)에서 재현탁함으로써, 증식된 hES 세포 (예를 들어, 신선하게 단리된 hES 세포의 증식 또는 이전에 증식된 세포의 저장 후)의 부분적 분화를 수행한다. 그 후, 세포를 분취하고, 프로게스틴 또는 βhCG가 없는 추가 배양 배지 (예를 들어, 최소 필수 배지, 예컨대 RPMI 또는 DMEM, 예를 들어, 4.5 g/L 글루코스 및 3.7 g/L 중탄산나트륨을 함유하는 IX 글루탐산 비함유 DMEM 또는 DMEM)를 첨가한다. 세포를 실질적으로 호기성 조건하에 (예를 들어, 플라스크에서 수평 위치에서) 12 내지 48시간, 예를 들어 24시간 동안 배양한다. "실질적으로 호기성"이란 약 15% 이상의 O2, 예를 들어 약 18% 또는 20% 이상의 O2로서 정의된다. 실질적으로 호기성 조건하에 hES 세포는 분화하기 시작할 것이다. hES 세포를 위한 분화 경로는 분화 단계 중에 사용된 배양 배지에 의존적이다. 뉴런 선조 세포를 제조하기 위해, hES 세포를 DMEM 또는 그의 균등물에서 배양한다. 뉴런 선조 이외에 선조 세포를 제조하기 위해, hES 세포를 RPMI 또는 그의 균등물에서 배양한다. 뉴런 선조 이외에 선조 세포를 제조하기 위해, 12 내지 48 시간의 복제 주기 후, 세포를 수집하고, 계속 분화시키기 위해 신선한 배지에 재현탁한다. 일반적으로 분화 단계는 48 내지 72시간 초과로 지속되지 않아야 하는데, 이는 이 시간을 넘은 추가 분화는 본 발명의 방법을 사용하는 이식에 적합하지 않은 세포를 생성하기 때문이다.
세포가 부분적으로 분화되면, 상기 기재된 바와 같이 동결보존제를 첨가하고 세포를 -15 내지 약 -80℃에서 저장함으로써, 또는 본 발명의 방법에서 사용을 위한 세포를 제조함으로써 세포를 미래 사용을 위해 저장할 수 있다. 사용을 위한 세포를 제조하기 위해, 세포를 분취하고, 신선한 배지를 첨가하고 (예를 들어, 적절하게 DMEM 또는 RPMI), 12 내지 48시간, 예를 들어 24시간 동안 추가 분화를 방지하기 위해 실질적으로 혐기성 조건하에 세포를 배양한다. 그 후, 연속적 증식을 위해 세포를 신선한 배지내로 분취하거나, 또는 원심분리에 의해 수집하고, 이식을 위한 제제 중의 생체적합성 용액 (예를 들어, 염수)에 재현탁한다. 이 시점에서, 세포를 환자로 이식하거나, 미래 이식을 위해 +4℃ 내지 -80℃에서 저장할 수 있다. 수송 또는 임상적 사용을 용이하게 할 수 있는, 시험 튜브, 바이알, 시린지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 용기에 저장할 수 있다. 한 실시양태에서, 생체적합성 용액에 재현탁된 세포를 바로 사용가능한 형태 (예를 들어, 예비충전된 시린지)로 저장한다. 필요하다면, 수조 또는 인큐베이터에 대한 필요성 없이 세포의 분취액을 자연적으로 해동한다.
생체적합성 용액에서 기재된 저장 조건 하에, 검출가능한 유전자형 (유전적 불안정성) 또는 표현형 변형, 예컨대 이수배수체 또는 이상배수체와 함께 저장의 6개월 후에 조차 재해동 후 > 40%의 세포 생존율이 관찰되었다.
증식, 분화 및 저장의 각 단계에서, 트립판 블루 배제 및 현미경 검사 시험을 통해 생존율에 대해 세포의 분취액을 시험한다. 세포 배양의 분취액을 또한 미생물학적 오염에 대해 시험한다. 세포 현탁액의 추가 분취액을 또한 혈구계 상에 놓고, 세포 밀도를 결정하기 위해 현미경검사로 시험한다. 또한, 세포 배양의 분화 상태에 대한 마커로서 알칼리 포스파타제 활성을 시험하기 위해 추가 분취액을 취한다.
저장 중에, 배양 방법의 결과로서 발생하는 유전자 불안정성에 대해 시험하기 위해, 세포를 그의 핵형에 대해 1개월에 1회 시험할 수 있다.
< 실시예 >
실시예 1
배아 단리를 위해, 8개의 난포를 생성하는 규칙적인 IVF 주기를 경험한 인간 공여자의 동의에 의해 난자를 수집하였다. 난자를 정자에 의해 수정하고, 통상적인 방법에 의해 배양하여, 배아를 얻었다. 배아 중 3개를 공여자에게 이식하였다. hES 세포주의 발달을 위해 다양한 기간 동안 외배아를 인큐베이션하였다.
무손상 상태 또는 깨진 상태의 배아를 배양 배지에 현탁하였다. 추가로, 프로게스테론 (250 mg/ml) 84 ㎕ 및 βhCG (5000 iu/ml) 84 ㎕를 첨가하였다. 배아 세포를 함유하는 배지를 임의의 오염에 대해 시험하고, 임의의 감염된 배아를 버렸다. 이 형태의 배아의 세포를 증식 및 저장을 위해 사용하였다.
인큐베이션 하루 후에, 배아 세포 함유 배지 1 ml를 프로게스테론 및 βhCG와 함께 50 ml 용기 중의 40 ml 세포 배양 배지 (DMEM 또는 RPMI)에 도입하였다. 줄기 세포와 함께 배양 배지를 수평 위치에서 주변 온도에서 이산화탄소를 함유하는 환경하에 인큐베이션하였다. 하기 표 45는 이 방법을 위한 몇몇의 실험 조건을 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00112
Figure 112008069743056-PCT00113
인큐베이션의 24시간 후, 동등한 수의 유핵 (부분적으로 분화된) 세포 및 공백 (미분화된) 세포를 관찰하였다. 약 0.5 ml의 분취액을 이 단계에서 저장을 위해 취하였다. 인큐베이션의 48시간 후, 수가닥의 타원 형상 세포를 DMEM 배지에서 관찰하였다. 그러나, RPMI 배지를 사용한 경우, 다양한 형상의 많은 유핵 세포를 관찰하였다. 용기의 부피는 인큐베이션 48시간 후 37 ml 표지까지 충전된 것으로 밝혀졌다. 0.5 ml의 분취액을 이 단계에서 저장을 위해 취하였다. DMEM에서 인큐베이션의 72시간 후, 신경 조직과 같은 교차된 세포의 긴 가닥이 관찰되었다. RPMI 배지 인큐베이션은 몇몇의 소세포, 및 중추 세포 주변에 축적된 몇몇의 세포를 생성하였다. 0.5 ml의 분취액을 이 단계에서 저장을 위해 취하였다.
배양물 함유 배지에서 성장된 배아 세포의 분취액을 멸균 용기 (타르슨스 스테리플라스크)에서 다른 시험 성분과 함께 다른 세포 배지 (RPMI 또는 DMEM)에 도입하였다. 18시간 내지 5일의 범위의 여러 기간 동안 수평 위치에서 이산화탄소의 환경하에 주변 온도에서 줄기 세포를 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 24시간 후, 약 0.5 ml의 분취액을 다시 다른 배양 배지에 도입하고, 재인큐베이션하였다. 상이한 인큐베이션 단계 후 저장을 위해 뿐만 아니라 바로 사용가능한 조성물의 제조를 위해 분취액을 취하였다. 표 46은 hES 세포의 증식을 위한 몇몇 실험 조건을 나타낸다.
실시예 2
무손상 또는 깨진 상태의 배아를 배양 배지에 현탁하였다. 추가로, 프로게스테론 84 ㎕ 및 βhCG 84 ㎕를 첨가하였다. 배아 세포를 함유하는 배지를 임의의 오염에 대해 시험하고, 임의의 감염된 배아를 버렸다. 이 형태의 배아의 세포를 증식 및 저장을 위해 사용하였다.
인큐베이션의 1일 후, 배아 세포를 함유하는 배지 1 ml를 50 ml 용기에서 프로게스테론 및 βhCG와 함께 46 ml 세포 배양 배지 (DMEM 또는 RPMI)에 도입하였다. 줄기 세포를 이산화탄소의 환경하에 주변 온도에서 수직 위치에서 인큐베이션하였다. 하기 표 47은 이 실험에서 사용된 몇몇 실시예 변수를 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00114
Figure 112008069743056-PCT00115
인큐베이션의 24시간 후, 유핵 세포 (부분적으로 분화된) 및 공백 세포 (미분화된)를 약 1:4의 비율로 관찰하였다. 인큐베이션의 48시간 후, 유핵 세포 및 공백 세포를 1:2의 비율로 관찰하였다. 0.5 ml의 분취액을 24시간 및 48시간 단계에서 저장을 위해 취하였다.
배양에서 성장된 배아 세포를 함유하는 배지 0.5 ml를 50 ml 멸균 용기 (타르슨스 스테리플라스크)에서 다른 시험 성분과 함께 46 ml 세포 배지 (RPMI 또는 DMEM)에 도입하였다. 이산화탄소를 함유하는 환경하에 주변 온도에서 수평 위치에서 줄기 세포를 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 24시간 후, 0.5 ml의 분취액을 다시 46 ml 배양 배지에 도입하고, 재인큐베이션하였다. 표 48은 hES 세포의 증식을 위한 몇몇 실험 조건을 나타낸다.
24 시간 인큐베이션 단계 후 저장을 위해 뿐만 아니라 바로 사용가능한 조성물의 제조를 위해 분취액을 취하였다.
실시예 3: 저장
저장을 위해, hES 세포를 0.5 ml 저장 튜브에 취하고, 16 ㎕의 양으로 동결보존제, 예컨대 0.2% DMSO를 첨가하고, 완만한 진탕 후 -20℃에서 저장하였다. 바로 사용가능한 조성물의 제조를 위해 또는 추가 증식을 위해 세포를 자연적으로 해동하였다. 해동된 세포의 생존율을 시험하고, 세포의 64% 내지 84%가 생존가능한 것으로 밝혀졌다. 저장된 세포를 규칙적인 간격 후 생존율 뿐만 아니라 오염에 대해 시험하였다. 하기 표 49는 해동 후 세포의 생존율 뿐만 아니라 5개의 상이한 실험에서 저장에 대한 실제 파라미터를 나타낸다.
Figure 112008069743056-PCT00116
실시예 4
각 배양에 존재하는 hES 유도체의 확인 및 증식 단계 및 저장 단계의 여러 간격에서 배아 세포에서 임의의 오염 또는 감염 또는 비정상성을 체크하기 위해 여러 시험을 수행하였다. 상이한 시험으로는 HTV, HbSAg (간염에 대함), 코호 시험을 위한 통상적인 PCR (결핵에 대함), 김자 띠염색의 CG 방법에 의한 염색체 분석, 젠드라시익(Jendrasiik) 및 그로프(Grof) 방법에 의한 빌리루빈, 및 BCG 염료 결합 방법을 사용하는 알부민 (간 선조 세포에 대함), CLIA 방법을 통한 인슐린 (췌장 선조 세포에 대함), 면역조직화학적 방법에 의한 신경미세섬유 (뉴런 선조 세포에 대함), 면역조직화학적 방법에 의한 CD34 시험 (조혈 선조 세포에 대함), PNPP 방법을 통한 알칼리 포스파타제 (미분화된 세포에 대함), 조직병리학 시험 (형태학에 의한 세포 확인) 등을 들 수 있다. 수동 배양 플레이트 방법에 의해 배양 조건을 시험하고, versatrek/AP1에 의한 수동 민감성 및 확인을 진균 감염에 대해 수행하였다. 모든 시험을 수행하고, 세포 개수 및 세포의 생존율을 각 단계에서 체크하였다. 하기 표 50은 몇몇 시험의 결과를 제공한다.
실시예 5: 이식을 위한 hES 세포의 제조
줄기 세포 현탁액 15 ml를 취하고, 7분 동안 1000 r.p.m.에서 원심분리하였다. 상등액을 버렸다. 염수 2 내지 15 ml를 펠렛에 첨가하여, 줄기 세포를 현탁하였다. 현탁액을 미생물 오염에 대해 체크하였다. 또한, 생존율 시험을 수행하였다.
실시예 6: 바로 사용가능한 형태의 hES 세포의 저장
이식가능한 hES 세포 현탁액으로 충전된 용기 (시린지, 시험 튜브, 플라스크, 바이알)를 표지하고, -20℃에서 저장하였다. 냉각 쇄를 이식 단계까지 유지하였다. 현탁액을 이식 직전에 자연적으로 해동하였다.
Figure 112008069743056-PCT00117
세포주
본 발명의 hES 세포를 정립하기 위해 계대배양을 100회 초과 반복하였다. 추가로, 추가 증식 또는 저장의 각 단계에서 임의의 오염/감염에 대해 계대배양을 시험하였다. hES 세포주는 계대배양 주기의 5년 초과 동안 임의의 비정상성 없이 안정한 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 본 발명의 많은 측면의 예시로서 의도된 특정 실시양태 및 실시예에 의해 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 균등한 임의의 실시양태는 본 발명의 범위 내에 있다. 당업자는 통상적인 실험을 사용하지 않고도 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 균등물을 알거나 또는 확신할 수 있을 것이다. 이들 및 모든 다른 균등물은 하기 청구의 범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다. 본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공개물은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

Claims (117)

  1. 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자 또는 가용성 스틸 인자 또는 조건화 배지가 없고, 제약상 허용되는 생체적합성 용액에 현탁된, 치료 유효량의 인간 배아 줄기 (hES) 세포 및/또는 그의 유도체를 포함하는, 질환, 장애 또는 상태의 치료용 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 바로 사용가능한 형태인 제약 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 바로 사용가능한 형태가 예비충전된 시린지인 제약 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 줄기 세포가 치료적으로 효과적이기에 충분한 생존율을 갖는 것인 제약 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 줄기 세포의 생존율이 40% 초과인 제약 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 용액이 염수인 제약 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 용액이 항미생물제, 항박테리아제 또는 다 른 약제를 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 치료 유효량의 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 제약 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 치료 유효량의 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 제약 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 치료 유효량의 조혈 줄기 세포 선조 및 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 제약 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 치료 유효량의 간엽 줄기 세포 선조를 포함하는 제약 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 치료 유효량의 인슐린-생성 줄기 세포 선조를 포함하는 제약 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 치료 유효량의 간세포 줄기 세포 선조를 포함하는 제약 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 치료 유효량의 심장 줄기 세포 선조를 포함하는 제약 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 치료 유효량의 상피 줄기 세포 선조를 포함하는 제약 조성물.
  16. 제8항에 있어서, 조성물 중 치료 유효량의 조혈 줄기 세포 선조가 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포인 제약 조성물.
  17. 제9항에 있어서, 조성물 중 치료 유효량의 뉴런 줄기 세포가 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포인 제약 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체가 생체적합성 용액 약 0.25 ml 내지 약 100 ml 중 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포인 제약 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체가 생체적합성 용액 약 0.25 ml 내지 약 10 ml 중 750,000 내지 약 8천만개의 세포인 제약 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 질환, 장애 또는 상태가 암, 뇌졸중, 유전적 장애, 간 장애, 신경계의 발달성 장애, 퇴행성 장애, 가족성 장애 또는 외상성 장애, 혈관 장애, 피부 질환 및 장애, 자가면역 장애, 눈 장애, 신장 장애, 심장 장애, 근골격 장애, 생식 및 수정능 장애, 및 관절염 및 혈액 장애로 구성된 군에서 선택된 것인 제약 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 질환, 장애 또는 상태가 급성 골수성 백혈병, 선암종, 관절염, 성상세포종, 청신경 위축, 자폐증, 자가면역 장애, 알츠하이머병, 강직 척추염, 베커 근이영양증, 뇌 손상, 화상, 뇌혈관 사고, 뇌성 마비, 혼수, 각막 궤양, 각막 이식편 거부, 신경계의 피질기저 변성, 관상 동맥 질환, 당뇨병, 치매, 다운 증후군, 뒤시엔느 근이영양증, 말기 신장 질환, 에르브 마비, 안면 견갑 근이영양증, 수정능 장애, 프리이드라이히 운동실조, 심부전, 간세포 암종, 유전성 척수 운동 뉴런 질환, 헌팅톤 무도병, 크라베 질환, 지대형 이영양증, 간 경화증, 황반 변성, 정신 지체, 다발성 경화증, 운동 뉴런 질환, 심근 경색, 신증후군, 니만 픽 질환, 피부의 악성 궤양, 올리브교 소뇌 위축, 시신경 위축, 파킨슨병, 전격 쇼크 후 뇌병증, 광견병 백신 후 뇌병증, 압박성 궤양, 진행성 핵상 마비, 건선, 안구로, 제한성 심근병증, 색소성 망막염, 우각 차단, 사르코이드증, 동 서맥, 척수 종양, 척수 근이영양증, 척수 소뇌 운동실조, 스티븐 존슨 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 저혈소판증, 지중해빈혈, 궤양성 대장염, 식물 상태, 낭성 섬유증, 간질성 폐 질환, 무정자증, 원발성 난소 기능상실, 아프타 궤양, 호르몬 불균형, 골관절염, 호너 증후군 및 불완전 골형성증, 채널병증, 및 저감마글로불린혈증으로 구성된 군에서 선택된 것인 제약 조성물.
  22. 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자 및/또는 가용성 스틸 인자 또는 조건화 배지가 없는 hES 세포 및/또는 그의 유도체를, 생체적합성, 선택적 투과성 구조 또는 매트릭스에 봉입함으로써 얻어진, hES 세포 및/또는 그의 유도체를 포함하는 물질의 조성물.
  23. 제22항에 있어서, hES 세포 및/또는 그의 유도체가 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 것인 물질의 조성물.
  24. 제22항에 있어서, hES 세포 및/또는 그의 유도체가 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 것인 물질의 조성물.
  25. 제22항에 있어서, hES 세포 및/또는 그의 유도체가 조혈 줄기 세포 및 뉴런 줄기 세포 선조의 조합을 포함하는 것인 물질의 조성물.
  26. 제22항에 있어서, 생체적합성, 선택적 투과성 구조 또는 매트릭스가 생체중합체, 폴리펩티드, 단백질, 다당류, 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 케라틴, 피브린, 피브리노겐, 히알루론산, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 아가로스 및 젤 라틴으로 구성된 군에서 선택된 것인 물질의 조성물.
  27. 제22항에 있어서, hES 세포 및/또는 그의 유도체가 아가로스 및 콜라겐의 혼합물, 또는 아가로스 및 젤라틴의 혼합물에 봉입된 것인 물질의 조성물.
  28. (a) 최소 필수 배지로 구성된 배지에서 2 내지 7일이 경과된 배아를 수집하는 단계,
    (b) 기계적 수단에 의해 배아로부터 hES 세포를 단리하는 단계
    를 포함하는, hES 세포의 단리 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 배아가 2일이 경과된 배아인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 기계적 수단이 진탕인 방법.
  31. (a) 최소 필수 배지, 프로게스틴 및 β-인간 융모 성선자극호르몬 (βhCG) 효능제(agonist)로 구성된 세포 배양 배지에 hES 세포를 도입하는 단계; 및
    (b) 줄기 세포를 약 34℃ 내지 약 38℃의 온도에서 약 3.5% 내지 약 6% 이산화탄소의 환경하에 약 12시간 내지 약 48시간 동안 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는, 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관 련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 hES 세포의 증식 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 RPMI인 hES 세포의 증식 방법.
  33. 제31항에 있어서,
    (c) 하나 이상의 줄기 세포를 함유하는, 단계 (b)의 인큐베이션된 줄기 세포의 분취액을 취하는 단계,
    (d) 프로게스테론 및 βhCG와 함께 세포 배양 배지 중 세포를 분취액으로 재현탁하는 단계,
    (e) 프로게스틴 및 βhCG 효능제가 없는 세포 배양 배지에 세포를 희석하는 단계, 및
    (f) 세포를 약 34℃ 내지 약 38℃의 온도에서 약 3.5% 내지 약 6% 이산화탄소의 환경하에 약 12시간 내지 약 48시간 동안 인큐베이션하는 단계
    를 추가로 포함하는, hES 세포의 증식 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 인큐베이션이 수재킷 세포 배양 인큐베이터에서 수행되는 것인 hES 세포의 증식 방법.
  35. 제31항에 있어서, 배양 배지 중 상기 줄기 세포가 생체적합성 용기에서 실질적으로 혐기성 조건하에 인큐베이션되는 것인 hES 세포의 증식 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 줄기 세포가 증식시 분화하지 않는 것인 hES 세포의 증식 방법.
  37. 제31항에 있어서, 사용된 hES 세포가 기계적 수단을 통해 3일이 경과된 배아로부터 단리되는 것인 hES 세포의 증식 방법.
  38. 제31항에 있어서, 증식된 줄기 세포를 임의의 오염에 대해 시험하는 단계를 추가로 포함하는, hES 세포의 증식 방법.
  39. 제31항에 있어서, 상기 배양 공정이 생체적합성 용기에서 수행되는 것인 hES 세포의 증식 방법.
  40. 제31항에 있어서, 인큐베이션된 줄기 세포의 분취액 대 세포 배지의 비율이 약 1:3.5 내지 약 1:35인 hES 세포의 증식 방법.
  41. 제31항에 있어서, 상기 인큐베이션이 실질적으로 혐기성 환경에서 수행되는 것인 hES 세포의 증식 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 인큐베이션이 부피가 배지에 의해 거의 완전히 점유 된 생체적합성 용기에서 수행되며, 상기 용기가 수직 위치에서 유지되는 것인 hES 세포의 증식 방법.
  43. (a) 최소 필수 배지로 구성된 세포 배양 배지에 hES 세포를 도입하는 단계; 및
    (b) 줄기 세포를 약 34℃ 내지 약 38℃의 온도에서 약 3.5% 내지 약 6% 이산화탄소의 환경하에 약 12시간 내지 약 48시간 동안 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는, 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 hES 세포의 부분적 분화 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 RPMI 또는 DMEM인 hES 세포의 부분적 분화 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 인큐베이션이 수재킷 세포 배양 인큐베이터에서 수행되는 것인 hES 세포의 부분적 분화 방법.
  46. 제43항에 있어서, 배양 배지 중 상기 줄기 세포가 생체적합성 용기에서 실질적으로 호기성 조건하에 인큐베이션되는 것인 hES 세포의 부분적 분화 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 줄기 세포가 증식시 분화하는 것인 hES 세포의 부분적 분화 방법.
  48. 제43항에 있어서, 증식된 줄기 세포를 임의의 오염에 대해 시험하는 단계를 추가로 포함하는, hES 세포의 부분적 분화 방법.
  49. 제43항에 있어서, 상기 배양 공정이 생체적합성 용기에서 수행되는 것인 hES 세포의 부분적 분화 방법.
  50. 제43항에 있어서, 인큐베이션된 줄기 세포의 분취액 대 세포 배지의 비율이 약 1:3.5 내지 약 1:35인 hES 세포의 부분적 분화 방법.
  51. 제43항에 있어서, 상기 인큐베이션이 실질적으로 호기성 환경에서 수행되는 것인 hES 세포의 부분적 분화 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 인큐베이션이 생체적합성 용기에서 수행되고, 상기 용기가 수평 위치에서 유지되는 것인 hES 세포의 부분적 분화 방법.
  53. (a) 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 보충 미네랄 조합물, 아미노산 보충제, 비타민 보충제, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자, 가용성 스틸 인자 및 조건화 배지가 없는 hES 세포를 얻는 단계,
    (b) 상기 줄기 세포를 원심분리하여 펠렛을 얻는 단계, 및
    (c) 펠렛을 생체적합성 용액에 현탁하는 단계
    를 포함하는, 인간 이식용 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 바로 사용가능한 제제의 제조 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    (d) 제제를 약 -15℃ 내지 약 -72℃에서 저장하는 단계, 및
    (e) 저장된 제제를 이식 전에 자연적으로 해동하는 단계
    를 추가로 포함하며, 여기서 세포의 생존율은 해동시 40% 이상인, 인간 이식용 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 바로 사용가능한 제제의 제조 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 제제를 이식 전에 임의의 오염에 대해 시험하는 단계를 추가로 포함하는, 인간 이식용 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 바로 사용가능한 제제의 제조 방법.
  56. 제53항에 있어서, 단계 (a)에서 얻은 hES 세포 및/또는 그의 유도체가 제31항 또는 제45항의 방법에 의해 제조된 것인 인간 이식용 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 바로 사용가능한 제제의 제조 방법.
  57. (a) 제31항 또는 제45항의 방법에 의해 제조된 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 제제를 취하는 단계,
    (b) 동결보존제를 첨가하는 단계, 및
    (c) 세포를 약 -15 내지 약 -72℃에서 동결하는 단계
    를 포함하는, 생존가능한 상태의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 제제의 저장 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 동결보존제의 양 대 배양 배지의 양의 비율이 약 1:500 내지 약 16:1000인 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 제제의 저장 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 저장이 생체적합성 용기에서의 저장인 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 제제의 저장 방법.
  60. 제57항에 있어서, 세포가 약 -18 내지 약 -20℃에서 동결된 것인 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 제제의 저장 방법.
  61. 대상체의 질환, 장애 또는 상태의 치료용 의약의 제조를 위한, 동물 생성물, 공급자 세포, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 섬유모세포 성장 인자 또는 조건화 배지가 없는, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  62. 제61항에 있어서, hES 세포 및/또는 그의 유도체가 제31항 또는 제45항의 방법에 의해 제조된 것인 용도.
  63. 제61항에 있어서, 질환, 장애 또는 상태가 암, 뇌졸중, 유전적 장애, 간 장애, 신경계의 발달성 장애, 퇴행성 장애, 가족성 장애 또는 외상성 장애, 혈관 장애, 피부 질환 및 장애, 자가면역 장애, 눈 장애, 신장 장애, 심장 장애, 근골격 장애, 생식 및 수정능 장애, 관절염 및 혈액 장애로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  64. 제63항에 있어서, 신경계 장애가 자폐증, 뇌성 마비, 에르브 마비, 정신 지체 및 진행성 핵상 마비로 구성된 군에서 선택된 발달성 신경계 장애인 용도.
  65. 제63항에 있어서, 신경계 장애가 알츠하이머병, 피질기저 변성, 난청 (청신경 위축), 치매, 프리이드라이히 운동실조, 운동 뉴런 질환, 다발성 경화증, 올리브교 소뇌 위축, 파킨슨병 및 척수 소뇌 운동실조로 구성된 군에서 선택된 퇴행성 신경계 장애인 용도.
  66. 제63항에 있어서, 신경계 장애가 뇌 손상, 혼수, 전격 쇼크 후 뇌병증, 광견병 백신 후 뇌병증, 척수 손상 또는 상해 및 식물 상태로 구성된 군에서 선택된 신 경계의 외상인 용도.
  67. 제63항에 있어서, 신경계 장애가 뇌혈관 사고 또는 뇌졸중인 용도.
  68. 제63항에 있어서, 신경계 장애가 유전성 척수 운동 뉴런 질환 및 헌팅톤 무도병으로 구성된 군에서 선택된 가족성 상태인 용도.
  69. 제63항에 있어서, 간 및 신장 장애가 간 경화증, 말기 신장 질환, 신증후군 및 니만 픽 질환으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  70. 제63항에 있어서, 피부 장애가 관절염, 죽상경화증, 화상, 악성 궤양, 압박성 궤양, 건선, 전신성 홍반성 루푸스 및 사르코이드증으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  71. 제63항에 있어서, 자가면역 장애가 저혈소판증, 전신성 홍반성 루푸스, 사르코이드증 및 궤양성 대장염으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  72. 제63항에 있어서, 유전적 장애가 다운 증후군, 강직 척추염, 지중해빈혈 및 헌팅톤 무도병으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  73. 제63항에 있어서, 눈 장애가 시신경 위축, 안구로, 황반 변성, 색소성 망막염, 각막 찰과상, 각막 이식편 거부 및 각막 궤양으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  74. 제63항에 있어서, 근골격 장애가 뒤시엔느 근이영양증, 안면 견갑 근이영양증, 지대형 이영양증, 척수 근위축 및 베커 근이영양증으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  75. 제63항에 있어서, 심장 장애가 심근 경색, 우각 차단, 제한성 심근병증, 심부전, 동 서맥 및 관상 동맥 질환으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  76. 제63항에 있어서, 종양학적 상태가 급성 골수성 백혈병, 부신의 선암종, 성상세포종, 간세포 암종 및 척수 종양으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  77. 제63항에 있어서, 질환이 당뇨병인 용도.
  78. 근육내 주사 또는 정맥내 주사 또는 경막외 주사 또는 경막외 카테터 또는 안구후 주사 또는 피하 주사 또는 심장내 주사 또는 낭내 주사 또는 경막내 주사를 통해, 또는 국부 적용 또는 병변내 적용 또는 정맥내 주입에 의해, 또는 연무기를 통해, 또는 스프레이를 통해, 또는 질내 경로를 통해, 또는 국부 눈 및 귀 점적을 통해 투여하기 위한 의약의 제조를 위한, 동물 생성물, 공급자 세포, 조건화 배지, 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 섬유모세포 성장 인자, 막 관련 스틸 인자 또는 가용성 스틸 인자가 없는 배지에서 배양된 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  79. 제78항에 있어서, hES 세포 및/또는 그의 유도체가 제31항 또는 제45항의 방법에 의해 제조된 것인 용도.
  80. 제78항에 있어서, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체가 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 세포인 용도.
  81. 제78항에 있어서, hES 세포 및/또는 그의 유도체가 조혈 줄기 세포 선조, 뉴런 줄기 세포 선조, 간엽 줄기 세포 선조, 상피 줄기 세포 선조, 신장 줄기 세포 선조, 심장 줄기 세포 선조, 또는 간 줄기 세포 선조, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 용도.
  82. 제78항에 있어서, 질환이 암, 뇌졸중, 유전적 장애, 간 장애, 신경계의 발달성 장애, 퇴행성 장애, 가족성 장애 또는 외상성 장애, 혈관 장애, 피부 질환 및 장애, 자가면역 장애, 눈 장애, 신장 장애, 심장 장애, 근골격 장애, 생식 및 수정능 장애, 관절염 및 혈액 장애로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  83. 제78항에 있어서, 질환, 장애 또는 상태가 급성 골수성 백혈병, 선암종, 관절염, 성상세포종, 청신경 위축, 자폐증, 자가면역 장애, 알츠하이머병, 강직 척추염, 베커 근이영양증, 뇌 손상, 화상, 뇌혈관 사고, 뇌성 마비, 혼수, 각막 궤양, 각막 이식편 거부, 신경계의 피질기저 변성, 관상 동맥 질환, 당뇨병, 치매, 다운 증후군, 뒤시엔느 근이영양증, 말기 신장 질환, 에르브 마비, 안면 견갑 근이영양증, 수정능 장애, 프리이드라이히 운동실조, 심부전, 간세포 암종, 유전성 척수 운동 뉴런 질환, 헌팅톤 무도병, 크라베 질환, 지대형 이영양증, 간 경화증, 황반 변성, 정신 지체, 다발성 경화증, 운동 뉴런 질환, 심근 경색, 신증후군, 니만 픽 질환, 피부의 악성 궤양, 올리브교 소뇌 위축, 시신경 위축, 파킨슨병, 전격 쇼크 후 뇌병증, 광견병 백신 후 뇌병증, 압박성 궤양, 진행성 핵상 마비, 건선, 안구로, 제한성 심근병증, 색소성 망막염, 우각 차단, 사르코이드증, 동 서맥, 척수 종양, 척수 근이영양증, 척수 소뇌 운동실조, 스티븐 존슨 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 저혈소판증, 지중해빈혈, 궤양성 대장염, 식물 상태, 낭성 섬유증, 간질성 폐 질환, 무정자증, 원발성 난소 기능상실, 아프타 궤양, 호르몬 불균형, 골관절염, 호너 증후군 및 불완전 골형성증, 채널병증, 및 저감마글로불린혈증으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  84. 제78항에 있어서, hES 세포 및/또는 그의 유도체의 투여가 종양, 기형종 또는 염색체 변화를 유발하지 않는 것인 용도.
  85. a) 피하 주사를 통해 약 750,000 내지 약 8천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 투여하는 단계;
    b) 예정된 기간 후 단계 (a)를 반복하고, 그 후 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 근육내 주사를 통해 투여하는 단계;
    c) 뉴런 줄기 세포 선조 및 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 정맥내 주사 또는 주입을 통해 투여하는 단계;
    d) 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 경막외 주사를 통해 투여하고, 임상 시험 및/또는 신경 시험에 의해 분석된 대상체의 상태에 의존적으로 예정된 기간 후 상기 용량을 반복하는 단계;
    e) 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 미측 주사를 통해 투여하는 단계;
    f) 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 경막내 주사 또는 지주막하 차단 카테터를 통해 투여하는 단계;
    g) 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는, 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 경막외 주사 또는 경막외 카테터를 통해 투여하는 단계;
    h) 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 척추 측부 상으로 심부 척수 주사를 통해 투여하는 단계; 및
    i) 치료 유효량의 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 정맥내 주입을 통해 투여하는 단계
    를 포함하며, 여기서 단계 (a) 및 (b)는 먼저 수행되고 나머지 단계는 임의의 순서로 수행될 수 있는 것인 방법에 의한 대상체의 척수 상해 (SCI)의 치료용 의약의 제조를 위한, hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  86. 제85항에 있어서, 방법이 대상체가 상기 SCI로부터의 회복의 임상 징후를 나타낼 때까지 단계 (g) 전의 단계 (f)를 반복하는 것을 추가로 포함하는 것인 용도.
  87. 제85항에 있어서, hES 세포 및/또는 그의 유도체가 제31항 또는 제45항의 방법에 의해 제조된 것인 용도.
  88. 제85항에 있어서, 조혈 줄기 세포 선조 및 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 8천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체가 단계 (a) 및 단계 (b)에서 생체적합성 용액 0.25 내지 1.0 ml에 현탁된 것인 용도.
  89. 제85항에 있어서, 조혈 줄기 세포 선조 및 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1천1백만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체가 단계 (f)에서 생체적합성 용액 2.0 내지 4.0 ml에 현탁된 것인 용도.
  90. 제85항에 있어서, 조혈 줄기 세포 선조 및 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 8천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체가 단계 (g)에서 생체 적합성 용액 15 내지 40 ml에 현탁된 것인 용도.
  91. 제85항에 있어서, SCI가 있는 대상체의 상기 치료가 와창의 완화를 유발하는 것인 용도.
  92. 발달성, 퇴행성, 가족성 및 외상성 신경계 장애 및 뇌혈관 발작의 치료를 위한, 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 경막내 주사, 경막외 카테터 주입 또는 지주막하 차단 카테터 주입을 통한 투여용 의약의 제조를 위한, 뉴런 줄기 세포 선조 및/또는 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  93. 피하 또는 정맥내 주사를 통한 피부 장애의 치료용 의약의 제조를 위한, 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  94. 제93항에 있어서, 상기 hES 세포 및/또는 선조가 손상된 피부에 적용되기 위해 생체적합성 담체에 혼합된 것인 용도.
  95. 제94항에 있어서, 상기 생체적합성 담체가 겔, 연고, 페이스트 또는 에어로졸 스프레이인 용도.
  96. 국소 또는 국부 적용을 통한 및 근육내 주사를 통한 와창의 치료용 의약의 제조를 위한, 약 750,000 내지 약 8천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  97. 근육내 주사, 정맥내 주사, 피하 주사, 관절내 주사 또는 정맥내 주입 또는 이들의 조합을 통한 자가면역 장애의 치료용 의약의 제조를 위한, 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  98. 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 경막내 주사, 경막외 카테터 주입 또는 지주막하 차단 카테터 주입 또는 이들의 조합을 통한 유전적 장애의 치료용 의약의 제조를 위한, 뉴런 줄기 세포 선조 및/또는 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  99. 정맥내 주사, 근육내 주사, 또는 생존가능한 조직 및 죽은 조직 또는 이들의 조합의 접합점에서의 국소 적용을 통한 괴저의 치료용 의약의 제조를 위한, 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  100. 현탁액으로 또는 생체적합성 담체에 혼합되어 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 국소 적용을 통한 노화와 관련된 상태의 치료용 의약의 제조를 위한, 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  101. 제100항에 있어서, 상기 생체적합성 담체가 겔, 연고, 페이스트 또는 에어로졸 스프레이인 용도.
  102. 정맥내 또는 근육내 주사 또는 이들 둘 모두를 통한 당뇨병의 치료용 의약의 제조를 위한, 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 인간 배아 인슐린-생성 선조 세포의 용도.
  103. 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 심장내 주사, 혈관조영 또는 직접 주사, 또는 이들의 조합을 통한 심혈관 장애의 치료용 의약의 제조를 위한, 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  104. 제102항에 있어서, 상기 투여가 혈관조영 도중에 이루어지는 것인 용도.
  105. 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 정맥내 주입 또는 국소 주사, 또는 이들의 조합을 통한 간 및 신장 장애의 치료용 의약의 제조를 위한, 조혈 줄기 세포 선조, 알부민-생성 줄기 세포 선조 및 빌리루빈-생성 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  106. 국소 근육내 주사, 고환내 주사 또는 부고환 근처 피하 피부 주사, 또는 이들의 조합을 통한 수정능 및 생식 장애의 치료용 의약의 제조를 위한, 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  107. 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사 또는 정맥내 카테터 주입, 또는 이들의 조합을 통한 근골격 장애의 치료용 의약의 제조를 위한, 뉴런 줄기 세포 선조 및/또는 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  108. 국소 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 안구후 주사, 유리체내 주사 또는 국부 적용, 또는 이들의 조합을 통한 눈 장애의 치료용 의약의 제조를 위한, 뉴런 줄기 세포 선조, 조혈 줄기 세포 선조 및/또는 간엽 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  109. 제108항에 있어서, 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체가 안구후 주사를 통해 투여되는 것인 용도.
  110. 제108항에 있어서, 뉴런 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체가 유리체내 주사를 통해 투여되는 것인 용도.
  111. 제108항에 있어서, 간엽 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체가 각막 찰과상의 치료를 위해 콘택트 렌즈에 적용되는 것인 용도.
  112. 근육내 주사, 정맥내 주사, 스프레이, 또는 연무기, 또는 이들의 조합을 통한 폐 장애의 치료용 의약의 제조를 위한, 뉴런 줄기 세포 선조 및/또는 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  113. 근육내 주사 또는 정맥내 주사, 또는 이들의 조합을 통한 호르몬 장애의 치료용 의약의 제조를 위한, 뉴런 줄기 세포 선조 및/또는 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  114. 근육내 주사 또는 정맥내 주사, 또는 이들의 조합을 통한 아프타 궤양의 치료용 의약의 제조를 위한, 뉴런 줄기 세포 선조 및/또는 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  115. 근육내 주사, 정맥내 주사 또는 관절내 주사, 또는 이들의 조합을 통한 무릎관절 및 고관절의 골관절염의 치료용 의약의 제조를 위한, 뉴런 줄기 세포 선조 및/또는 조혈 줄기 세포 선조를 포함하는 약 750,000 내지 약 1억6천만개의 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
  116. 제31항 또는 제45항의 방법에 의해 얻은 hES 세포 및/또는 그의 유도체를 화합물의 존재하에 배양하는 단계, 및 상기 세포에 대한 상기 화합물의 효과를 결정하는 단계를 포함하는, hES 세포 및/또는 그의 유도체에 대한 화합물의 효과의 시험 방법.
  117. 세포가 약물의 존재하에 약물을 수용하고, 약물이 전달되는 대상체의 부위로 세포가 투여되는 것인, 대상체로의 약물 전달용 의약의 제조에서의, 제31항 또는 제45항의 방법에 의해 얻은 hES 세포 및/또는 그의 유도체의 용도.
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