DE69936720T2

DE69936720T2 - Menschliche cd45+ und/oder fibroblasten+ mesenchymale stammzellen

Info

Publication number: DE69936720T2
Application number: DE69936720T
Authority: DE
Inventors: Janice M. Towson DAVIS-SPROUL; Mark Aaron Baltimore MOORMAN; Renee Marie Baltimore MCNEIL; Donald William Jr. 3024 Ward Ro Forest Hill SIMONETTI; Lora Catherine Bel Air HAMMILL; Stewart Issaquah CRAIG
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1998-05-29
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2019-05-29
Also published as: DK1082410T3; US6387367B1; DE69936720D1; CA2328524A1; ES2292245T3; EP1082410A1; CY1107778T1; ATE368731T1; WO1999061587A1; PT1082410E; EP1082410B1; AU4221399A

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Anmeldung geht auf die US-Provisional Application SN 60/087,123 (Anmeldetag 29. Mai 1998) zurück.
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) stellen die formativen, pluripotenten Blastzellen dar, die unter anderem im Knochenmark, Blut, Dermis und Periosteum auftreten und zur Differenzierung zu mehr als einem spezifischen Typ von Mesenchym- oder Bindegewebe (d. h. Geweben des Körpers, die spezialisierte Elemente, z. B. Adipose-, Knochen-, Stroma-, Knorpel-, elastische und fibröse Bindegewebe) unterstützen, und zwar in Abhängigkeit von verschiedenen Einflüssen bioaktiver Faktoren, wie von Cytokinen. Das Potential zur Differenzierung zu Zellen, wie Osteoblasten und Chondrozyten bleibt nach Isolierung und Expansion in Kultur erhalten. Eine Differenzierung erfolgt, wenn die Zellen in vitro unter spezifischen Bedingungen induziert werden oder wenn sie in vivo an den Ort von geschädigtem Gewebe gebracht werden.
Epitope auf der Oberfläche der humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) reagieren mit bestimmten monoklonalen Antikörpern, die als SH2, SH3 und SH4 bekannt sind und im US-Patent 5 486 359 beschrieben sind. Diese Antikörper können als Reagenzien zum Screening und zum Abfangen der mesenchymalen Stammzellpopulation aus einer heterogenen Zellpopulation, wie sie beispielsweise im Knochenmark vorliegt, verwendet werden.
Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) stellen die formativen, pluripotenten Blastzellen dar, die unter anderem im Knochenmark und im peripheren Blut auftreten und zur Differenzierung zu beliebigen spezifischen Typen von hämatopoetischen oder Blutzellen, wie Erythrozyten, Lymphozyten, Makrophagen und Megakaryozyten, befähigt sind. Die Expression eines speziellen Antigens oder von Antigenen auf der Zelloberfläche oder im Zytoplasma und die Intensität der Expression stellen ein Anzeichen für die Reifungsstufe und die Linienfestlegung der hämatopoetischen Stammzelle dar. Humane hämatopoetische Stammzellen (hHSCs) reagieren mit bestimmten monoklonalen Antikörpern, wie CD34, die als spezifisch für hämatopoetische Zellen erkannt werden.
Somit sind humane hämatopoetische Stammzellen und humane mesenchymale Stammzellen leicht durch ihre immunospezifischen Profile unterscheidbar.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Population von humanen mesenchymalen Stammzellen bereit, die in Bezug auf Zellen, die positiv auf CD45-Antikörpermarker sind, verstärkt sind. Wie nachstehend angegeben, handelt es sich bei einer mesenchymalen Stammzelle um eine Zelle, die zur Differenzierung zu mehr als einem spezifischen Typ von mesenchymalen Gewebezellen befähigt ist. Die Anmelderin hat eine Population von mesenchymalen Vorläuferstammzellen ("pre-MSCs") bereitgestellt, die positiv in Bezug auf CD45 ist. Die mesenchymalen Vorläuferstammzellen können zu verschiedenen mesenchymalen Linien differenzieren, z. B. zu Chondrozyten-, Adipozyten- und Osteoblasten-Linien.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Population von humanen mesenchymalen Stammzellen bereit, die in Bezug auf CD45 positiv und in Bezug auf mindestens einen der SH2-, SH3- oder SH4-Marker positiv sind. Die erfindungsgemäßen mesenchymalen Stammzellen sind vorzugsweise positiv in Bezug auf mindestens einen der SH3-Marker. Gemäß einem weiteren Aspekt sind die mesenchymalen Vorläuferstammzellen positiv in Bezug auf den SH2-Marker.
Die mesenchymalen Vorläuferstammzellen lassen sich unter Verwendung von Antikörpern gegen Marker von mesenchymalen und hämatopoetischen Zellen erhalten. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass eine signifikante Anzahl von Zellen, die positiv für die Selektion von Markern von mesenchymalen Stammzellen sind, ferner als CD45-positiv charakterisiert wurden. CD45 ist ein Marker, der üblicherweise an Leukozyten und hämatopoetischen Zellen auftritt und nicht an gezüchteten mesenchymalen Stammzellen. Obgleich damit keine Festlegung auf eine Theorie verbunden sein soll, wird angenommen, dass die Population von erfindungsgemäßen Zellen eine Vorläuferzelle für reifere, jedoch nicht festgelegte mesenchymale Stammzellen umfasst.
Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur Gewinnung einer isolierten Population von humanen mesenchymalen Stammzellen, die CD45+ sind, aus Knochenmark oder einer anderen mesenchymalen Stammzellquelle eines Individuums bereitgestellt, indem man (i) Knochenmarkgewebe oder eine andere Gewebequelle von mesenchymalen Stammzellen von einem Spender gewinnt; (ii) eine Population von Zellen, die in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereichert ist, daraus isoliert; und (iii) ferner aus der Population von humanen mesenchymalen Stammzellen Zellen auswählt, die CD45+ sind, um eine Population von mesenchymalen Stammzellen zu erhalten, die in Bezug auf mesenchymale Stammzellen, die CD45+ sind, angereichert sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung einer isolierten Population von humanen mesenchymalen Stammzellen, die CD45+ sind und auch positiv in Bezug auf mindestens einen der SH2-, SH3- oder SH4-Marker sind, aus Knochenmark oder einer anderen Quelle für mesenchymale Stammzellen eines Individuums bereit, indem man (i) Knochenmarkgewebe oder eine andere Quelle für mesenchymale Stammzellen von einem Spender gewinnt; (ii) eine Population von Zellen, die in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereichert ist, daraus isoliert; (iii) aus der Zellpopulation eine Population von mesenchymalen Stammzellen auswählt, die in Bezug auf mindestens einen der SH2-, SH3- oder SH4-Marker positiv ist; und (iv) ferner aus der Population von humanen mesenchymalen Stammzellen von Stufe (iii) Zellen, die CD45+ sind, auswählt, um eine Population von mesenchymalen Stammzellen zu erhalten, die in Bezug auf mindestens einen der SH2-, SH3- oder SH4-Marker und in Bezug auf CD45+ positiv sind. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die CD45-Zellpopulation mindestens SH3-positiv.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt FACScan-Histogramme für die Expression von CD45-Zelloberflächenantigenen an den drei Fraktionen von humanen mesenchymalen Stammzellen: 1A: Präfraktionierung; 1B: Selektion der SH3-negativen Fraktion; 1C: Selektion der SH3-positiven Fraktion.
2 zeigt die Ergebnisse des in Beispiel 5 beschriebenen Calciumabscheidungstests.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Isolierung und Verstärkung einer Untergruppenpopulation von humanen mesenchymalen Stammzellen. Gemäß einer Ausführungsform wird erfindungsgemäß eine Population von Zellen mit einem SH3+/CD45+-Phänotyp bereitgestellt, von denen angenommen wird, dass es sich um Vorläufer für mesenchymale Stammzellen handelt. Die erfindungsgemäße Population von humanen mesenchymalen Stammzellen ist zur Differenzierung zu chondrozytischen, adipozytischen und osteoblastischen Zelllinien befähigt.
Die erfindungsgemäßen mesenchymalen Stammzellen lassen sich aus peripherem Blut oder Knochenmark isolieren. Der hier verwendete Ausdruck "isoliert" bedeutet, dass die Zellen unter Bedingungen gebracht werden, die sich von ihrer natürlichen Umgebung unterscheiden. Der Ausdruck "isoliert" schließt nicht die spätere Verwendung dieser Zellen in Kombinationen oder Gemischen mit anderen Zellen aus. Ein Verfahren zur Herstellung von humanen mesenchymalen Knochenmark-Stammzellkulturen wird im US-Patent 5 486 359 beschrieben. Dem Fachmann sind mehrere Techniken für die rasche Isolierung von mesenchymalen Stammzellen bekannt. Zu Möglichkeiten für die Isolierung von mesenchymalen Stammzellen gehören die Leukopherese, die Dichtegradientenfraktionierung, die Immunoselektion und die differenzielle Adhäsionstrennung.
Die erfindungsgemäßen Zellen werden in einem Kulturmedium gehalten, das ein chemisch definiertes serumfreies Medium oder ein "Komplettmedium", z. B. ein gemäß Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium, das mit 10 % Serum ergänzt ist (DMEN), sein kann. Geeignete, chemisch definierte, serumfreie Medien sind in US-SN 08/464,599 und WO-96/39487 beschrieben und "Komplettmedien" sind im US-Patent 5 486 359 beschrieben. Ein chemisch definiertes Medium umfasst ein essentielles Minimalmedium, wie gemäß Iscove modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM, Gibco), das mit Humanserumalbumin, humanem Ex Cyte-Lipoprotein, Transferrin, Insulin, Vitaminen, essentiellen und nicht-essentiellen Aminosäuren, Natriumpyruvat, Glutamin und einem Mitogen ergänzt ist. Diese Medien stimulieren das Wachstum von mesenchymalen Stammzellen ohne Differenzierung.
Die aus peripherem Blut oder Knochenmark isolierten erfindungsgemäßen mesenchymalen Stammzellen können ferner in Kultur expandiert werden. Die Zellen können vor oder nach Einfrieren expandiert werden. Die hier beschriebenen Medien eignen sich auch zur Kulturexpansion der mesenchymalen Stammzellen.
Die erfindungsgemäßen isolierten mesenchymalen Stammzellen können ferner gereinigt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Ausdruck "gereinigt", dass die Zellpopulation weniger als 5 % Verunreinigungen enthält, wobei es sich bei den Verunreinigungen beispielsweise um Zellen handelt, die nicht CD45+ sind. Die gereinigte Zellpopulation kann später je nach Zweckmäßigkeit in Kombinationen oder Gemischen eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung zieht ein beliebiges geeignetes Verfahren zur Anwendung von monoklonalen Antikörpern in Betracht, um mesenchymalen Stammzellen von anderen Zellen, die beispielsweise aus Knochenmark gewonnen worden sind, zu trennen. Demzufolge umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Population von mesenchymalen Stammzellen, das die folgenden Stufen umfasst:
Bereitstellen einer Zellsuspension von Gewebe mit einem Gehalt an mesenchymalen Stammzellen; Kontaktieren der Zellsuspension mit einem monoklonalen Antikörper oder einer Kombination von monoklonalen Antikörpern, die ein Epitop an den mesenchymalen Stammzellen erkennen; und Trennen und Gewinnen der durch die monoklonalen Antikörper gebundenen Zellen aus der Zellsuspension. Die monoklonalen Antikörper können mit einer Festphase verknüpft sein und zum Abfangen von mesenchymalen Stammzellen aus Gewebeproben verwendet werden. Die gebundenen Zellen können sodann von der festen Phase nach bekannten Verfahren abgetrennt werden, und zwar in Abhängigkeit von der Natur des Antikörpers und der festen Phase.
Zu Systemen auf monoklonaler Basis, die sich zur Herstellung der angestrebten Zellpopulation eignen, gehören Säulen mit magnetischen Perlen/paramagnetischen Teilchen unter Verwendung von Antikörpern für eine positive oder negative Selektion; eine Trennung auf der Basis der Biotin- oder Streptavidin-Affinität; und eine fließzytometrische Hochgeschwindigkeitssortierung von immunofluoreszierend gefärbten mesenchymalen Stammzellen, die in einer Suspension von anderen Zellen im Gemisch vorliegen. Somit umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Isolierung einer Population von hMSCs und die Anreicherung unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen Oberflächenantigene, die durch von Knochenmark abgeleitete hMSCs, d. h. SH2, SH3 oder SH4, exprimiert werden. Als SH2, SH3 und SH4 identifizierte Zelllinienkulturen wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklaven Drive, Rockville, MD 20852, hinterlegt und erhielten die ATCC-Hinterlegungsnummern HB 10743, HB 10744 bzw. HB 10745. Diese monoklonalen Antikörper ergeben wirksame Sonden, die zur Identifizierung, Quantifizierung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen verwendet werden können, unabhängig von deren Quelle im Körper.
Gemäß einer Ausführungsform kann die Isolierung der erfindungsgemäßen Zellpopulation die Verwendung einer Kombination von einem oder mehreren Antikörpern umfassen, die einen bekannten Marker an mesenchymalen Stammzellen erkennen, sowie einen Antikörper, der CD45 erkennt. Ein Verfahren für eine derartige Herstellung der Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung besteht darin, zunächst eine Population von Zellen, die einen Marker zur Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen, z. B. SH3 oder SH2, exprimieren, durch immunomagnetische Selektion einer humanen Knochenmark-Zellprobe von geringer Dichte auszuwählen. Alternativ kommt es in Betracht, dass die anfängliche Zellselektion auf dem CD45-Marker basiert und die Zellpopulation unter Verwendung der monoklonalen hMSC-Antikörper weiter charakterisiert wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kommt es in Betracht, dass eine Zellpopulation auf der Basis des CD14-Markers ausgewählt werden kann. CD14 ist ein Membranprotein, das als ein Rezeptor für Endotoxin (Lipopolysaccharid, LPS) wirkt und intensiv auf der Oberfläche von Monozyten, jedoch nicht durch myeloide Vorläufer exprimiert wird.
Somit wird gemäß einem Aspekt bei bestimmten, hier beschriebenen Ausführungsformen die mesenchymale Stammzellpopulation, Population 1 (Pop 1), durch FACS aufgrund der relativen Helligkeit von immunofluoreszierend gefärbten Antikörpern, die daran gebunden sind, als SH2- und SH3-hell/CD45-matt/CD14-matt identifiziert. Im Vergleich dazu sind SH2 und SH3 an in Kultur expandierten MSCs vorhanden; CD45 fehlt an in Kultur expandierten MSCs; und CD14 fehlt an in Kultur expandierten MSCs.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung kann eine Zellpopulation auf der Grundlage eines Fibroblasten-Zelloberflächenmarkers ausgewählt werden, z. B. des Antifibroblasten-Antikörpers, der an Miltenyi-Antifibroblasten-Mikroperlen (Miltenyi-Katalog # 506-01) vorhanden ist.
Ferner kommt es in Betracht, dass die vorstehend beschriebenen Verfahren auf eine Population von in Kultur expandierten mesenchymalen Stammzellen angewandt werden, so dass Zellen mit einem Pop 1-Phänotyp aus der Population von in Kultur expandierten mesenchymalen Stammzellen isoliert werden können.
Die vorliegende Erfindung ist auf verschiedene Verfahren zur Verwendung der humanen mesenchymalen CD45+-Stammzellen für therapeutische und/oder diagnostische Zwecke abgestellt. Zu diesen Anwendungsmöglichkeiten gehören die Regeneration von mesenchymalen Geweben, die durch eine akute Verletzung, eine abnormale genetische Expression oder durch eine erworbene Krankheit geschädigt worden sind; die Behandlung eines Wirts mit geschädigtem mesenchymalen Gewebe durch Entfernen geringer Aliquotmengen von Knochenmark, Isolieren von mesenchymalen Stammzellen und Behandeln des geschädigten Gewebes mit CD45+-hMSCs, die mit einem geeigneten, biologisch verträglichen Trägermaterial zur Abgabe der MSCs an die geschädigten Gewebestellen kombiniert sind; das Erzeugen von verschiedenen mesenchymalen Geweben; das Nachweisen und Bewerten von Wachstumsfaktoren oder Hemmfaktoren, die von Bedeutung für die MSC-Selbstregenerierung und -Differenzierung zu festgelegten mesenchymalen Linien von Bedeutung sind; und die Entwicklung von mesenchymalen Zelllinien und das Testen auf Faktoren mit mesenchymaler Gewebeentwicklung.
Die erfindungsgemäßen hMSCs können auf verschiedenen Wegen eingesetzt werden. Beispielsweise können die hMSCs als Bestandteil einer Zellersatztherapie verwendet werden. Speziell können die hMSCs für Knochenmark-Transplantationsvorgänge allein infundiert oder Knochenmarkzellen zugesetzt werden. Weitere Anwendungsmöglichkeiten, die ebenfalls speziell in Betracht kommen, sind orthopädische Anwendungen, z. B. eine verstärkte Knochenbildung. Zu weiteren Anwendungsmöglichkeiten gehören beispielsweise die Behandlung von Osteoarthritis, Osteoporose, traumatischen oder pathologischen Zuständen unter Beteiligung von beliebigen Bindegeweben, wie Knochendefekten, Bindegewebedefekten, Skelettdefekten oder Knorpeldefekten. Ferner kommt es in Betracht, exogenes genetisches Material in die Zellen in einem ex vivo-Zustand einzuführen und die Zellen wieder zu verabreichen, um eine in vivo-Erzeugung von exogenen Proteinen zu bewirken. Eine genetische Modifikation von mesenchymalen Stammzellen wird im US-Patent 5 591 625 ausführlich erörtert.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein spezielles Verfahren zur Gewinnung von Zellen beschränkt. Beispielsweise können derartige Zellen durch Verfahren isoliert werden, die sich keiner Antikörper bedienen, vorausgesetzt, dass die Zellen in Bezug auf CD45 positiv sind und auf mindestens einen der Bestandteile SH2, SH3 oder SH4 und insbesondere SH3 positiv sind und zur Differenzierung in eine oder mehrere mesenchymale Zelllinien befähigt sind, und zwar vorzugsweise zur Differenzierung zu den meisten, wenn nicht zu sämtlichen mesenchymalen Zelllinien. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Zellen auch zur Selbsterneuerung befähigt. Somit kann eine erfindungsgemäße humane mesenchymale Stammzelle, die SH3+ und CD45+ ist, durch Techniken gewonnen werden, die sich von Techniken unter Verwendung von SH3+- und CD45+-Antikörpern unterscheiden. Somit bedeutet der Ausdruck "humane mesenchymale Stammzelle, die SH3+ und CD45+ ist" eine Stammzelle, die beide Marker aufweist und zur Differenzierung zu mehr als einer mesenchymalen Stammzelllinie befähigt ist.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung und Beschreibung der vorliegenden Erfindung, sollen jedoch nicht als eine Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung angesehen werden.
Beispiel 1
Isolierung von hMSCs aus humanem Knochenmark
Abgesaugte Knochenmarkproben wurden von drei freiwilligen Versuchspersonen, den Spendern 271, 281 und 332, erhalten. Eine Dichtezentrifugation der Knochenmarkaspirate wurde unter Verwendung einer Activated Cell Therapy (ACT)-Schwebedichte-Lösung (1,0720 g/ml) in konischen Röhrchen (Dendreon, Mountain View, CA) durchgeführt und Zellen wurden aus der leichten Fraktion isoliert. Die Zellen wurden gewaschen und in Dulbecco-PBS in einer Konzentration von 2 × 10⁷ Zellen/ml resuspendiert. Sodann wurden die Zellen mit Blockierantikörper (humanes IgG, 1 mg/ml in azidfreiem PBS) 10 Minuten bei 4 °C unter Rotieren inkubiert, wonach sich eine 30-minütige Inkubation bei 4 °C mit 1 μg/1 × 10⁷ Zellen SH3-Antikörper anschloss. Die Zellen der Spender 1 und 2 wurden 2-mal mit PBS/0,5 % BSA gewaschen und in PBS in einer Konzentration von 2 × 10⁷ Zellen/ml resuspendiert. Dynal-Perlen (3-mal mit PBS gewaschen) wurden zugegeben und die Suspension wurde 30 Minuten bei 4 °C vermischt. Gebundene Zellen wurden magnetisch von ungebundenen Zellen abgetrennt. Die Zellen des Spenders 332 wurden 2-mal mit Miltenyi-Puffer gewaschen und 20 Minuten bei 4 °C unter Vermischen mit Rattenanti-Mäuse-IgG2-Perlen (1 ml Mikroperlen pro 5 × 10⁸ Zellen) (50 nm Miltenyi Biotec, Auburn, CA) inkubiert und ausgewählt, wobei die Anweisungen des Herstellers eingehalten wurden.
Drei Zellpopulationen eines jeden Spenders wurden analysiert: die Ausgangsfraktion (ungetrennte Zellen von geringer Dichte), SH3-selektierte Zellen (Zellen, die an derivatisierten magnetischen Perlen hafteten) und SH3-unselektierte Zellen (Zellen, die nicht an den derivatisierten Perlen hafteten). Der Gehalt an hämatopoetischen und mesenchymalen Stammzellen der drei Proben wurde auf die nachstehend beschriebene Weise bestimmt.
Zellzahlen.

Die in den Fraktionen enthaltene Anzahl an Zellen ist in Tabelle 1 angegeben. Die SH3-selektierten Fraktionen enthielten 4,2, 4,8 und 6,2 % der Ausgangszellen. Die SH3-unselektierten Fraktionen ergaben 88, 70 und 87 % der Ausgangszellen. Tabelle 1 Zellzahlen (Ausbeuten)

Fraktion	Gesamte Zellen (× 10⁶)	% Zellausbeute	% Lebensfähigkeit
Spender 271
Beginn	262
SH3-selektiert	11	4,2	94,2
SH3-unselektiert	231	88,1	92,8
Spender 281
Beginn	217
SH3-selektiert	10,5	4,8	90,0
SH3-unselektiert	150	70,0	99,5
Spender 332
Beginn	207
SH3-selektiert	12,8	6,2
SH3-unselektiert	181	87,4

F-Test auf kolonienbildende Einheiten.

Der CFU-F-Test misst die in Komplettkulturmedien gewachsenen Kolonien. Nukleisierte Zellen wurden in hMSC-Medium bis zu einer Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen in 40 ml suspendiert und auf 100 mm-Gewebekulturplatten in einer Menge von 5 × 10⁵ pro Platte ausgestrichen. Nach 14 Tagen wurden die Zellen mit Glutaraldehyd fixiert und mit Kristallviolett gefärbt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 CFU-F-Test

Fraktion	# CFU-F-Kolonien/5 × 10⁴ Zellen	Gesamte CFU-F (% der Gesamtmenge)
Spender 271
Beginn	nicht durchgeführt
SH3-selektiert	15	3,3 × 10³
SH3-unselektiert	0	0
Spender 281
Beginn	1,3	5,77 × 10³
SH3-selektiert	16,7	3,50 × 10³ (61 %)
SH3-unselektiert	0,7	2,01 × 10³ (35 %)
Spender 332
Beginn	5,7	2,36 × 10⁴
SH3-selektiert	TNTC
SH3-unselektiert	0	0

TNTC = für eine Zählung zu zahlreich

Die SH3-selektierte Fraktion zeigte eine Anreicherung an Kolonien, verglichen mit der Ausgangszellprobe. Tatsächlich wies die Miltenyiselektierte Fraktion (Spender 332) so zahlreiche Kolonien auf, dass diese nicht gezählt werden konnten. In der SH3-unselektierten Fraktion ergaben sich bei einem der 3 CFU-F-Tests nur 0,7 Kolonien pro 50 000 ausgestrichenen Zellen, während die restlichen 2 Kulturen kein Kolonienwachstum zeigten. Tabelle 3 Hämatopoetische Vorläuferzellen, gesamte Kolonien (% Ausbeute)

Fraktion	CFU-E	CFU-GM	CFU-GEMM
Spender 271
Beginn	5,61 × 10⁵	5,30 × 10⁵	0
SH3-selektiert	0	2,45 × 10² (0,05 %)	0
SH3-unselektiert	3,82 × 10⁵ (68 %)	4,72 × 10⁵ (89 %)	0
Spender 281
Beginn	4,63 × 10⁵	2,62 × 10⁵	0
SH3-selektiert	1,16 × 10² (0,02 %)	1,16 × 10² (0,04 %)	0
SH3-unselektiert	3,08 × 10⁵ (67 %)	2,56 × 10⁵ (98 %)	0
Spender 332
Beginn	6,07 × 10⁵	4,28 × 10⁵	8,28 × 10⁴
SH3-selektiert	0	1,28 × 10³ (0,3 %)	0
SH3-unselektiert	5,61 × 10⁵ (92 %)	4,40 × 10⁵ (103 %)	6,03 × 10⁴ (73 %)

Die SH3-unselektierten Fraktionen enthielten 89, 98 und 103 % der hämatopoetischen CFU-GM-Ausgangskolonien (Tabelle 3). Nur 0,04, 0,05 und 0,3 % der Ausgangs-CFU-GMs wurden in der SH3-selektierten Zellfraktion gefunden (Tabelle 3).
Mesenchymale Stammzellenkultur.
3,2 × 10⁶ Zellen der Spender 271 und 281 wurden in 2 Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen gegeben. Die Zellen wurden nach 13-tägiger Kultur geerntet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Bei der Probe des Spenders 332 wurde jede Vertiefung mit 0,8 × 10⁶ Zellen beimpft. Nach 11 Tagen wurden auf der Grundlage einer mikroskopischen Überprüfung 2 von 4 Vertiefungen mit SH3-selektierten Zellen geerntet. Sämtliche übrigen Vertiefungen wurden nach 14-tägiger Kultur abgeerntet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Die Ergebnisse der MSC-Kulturen zeigten, dass die SH3-selektierten Zellen sich mit dem gleichen oder einem höheren Wirkungsgrad als die Ausgangszellfraktion vermehrt hatten und die geernteten Zellen deutlich eine MSC-Morphologie und einen MSC-Phänotyp aufwiesen. In MSC-Komplettkulturmedium war nach Primärkultur die Zellausbeute aus dieser SH3-unselektierten Fraktion gering (1,3, 3,8 und 1,6 %), verglichen mit den Ausgangszellfraktionen (17,5, 19,4 bzw. 44,5 %). Tabelle 4 Zellzahlen der PO-Kultur & Ernte

Fraktion	Gesamte geerntete Zellen	% Ausbeute
Spender 271
Beginn	5,6 × 10⁵	17,5 %
SH3-selektiert	5,7 × 10⁵	17,8 %
SH3-unselektiert	0,42 × 10⁵	1,3 %
Spender 281
Beginn	6,2 × 10⁵	19,4 %
SH3-selektiert	6,3 × 10⁵	19,7 %
SH3-unselektiert	1,2 × 10⁵	3,8 %

Tabelle 5 Spender 332

Fraktion	Anzahl der pro Vertiefung geernteten Zellen	Ausbeute (% der überimpften Zellen)	Erscheinungsbild
Beginn	3,56 × 10⁵	44,5	85 % Konfluenz
SH3-selektiert (Tag 11)	3,00 × 10⁵	37,0	85 % Konfluenz
SH3-selektiert (Tag 14)	5,50 × 10⁵	68,8	100 % Konfluenz
SH3-unselektiert	1,30 × 10⁴	1,6	keine spindelförmigen Zellen; zigarrenförmige oder runde Zellen

Die Zellen der Spender 271 und 281 wurden weiter in Kultur gehalten und Zellen der Passage 1 wurden gewonnen und durch Fließzytometrie geprüft. Bei den Zellen handelte es sich gemäß Morphologie und Phänotyp um MSCs. Eine visuelle Betrachtung dieser Kulturen während P0 zeigte, dass MSC-artige Kolonien ebenfalls mit anhaftenden magnetischen Perlen enthielten. Die Zellen wurden je nach der Anzahl der verfügbaren gesamten Zellen in Kolben oder Vertiefungen ausgestrichen. Die Zellen wurden nach 8-tägiger Kultur geerntet. Tabelle 6 Zellzahlen der P1-Kultur & Ernte

Fraktion	Anzahl der ausgestrichenen Zellen	Anzahl der geernteten Zellen	Faktor der Zunahme
Spender 271
Beginn	4,3 × 10⁵	2,6 × 10⁶	6,0
SH3-selektiert	4,3 × 10⁵	1,8 × 10⁶	4,2
SH3-unselektiert	4,2 × 10⁴	0,13 × 10⁶	3,1
Spender 281
Beginn	4,3 × 10⁵	2,3 × 10⁶	5,3
SH3-selektiert	4,3 × 10⁵	2,0 × 10⁶	4,5
SH3-unselektiert	1,2 × 10⁵	0,26 × 10⁶	2,3

Die nach 11 Tagen geernteten gezüchteten Zellen der SH3-Selektion wurden analysiert. Die Zellen waren SH2+, SH3+, SH4+ und CD45-, was einem reifen, gezüchteten mesenchymalen Stammzell-Phänotyp entsprach.
Fließzytometrische Analyse.

Die Zellfraktionen des Spenders 332 wurden unter Verwendung von SH3- und CD45-Antigenmarkern analysiert. 1 zeigt das FACS-Histogramm der CD45-Analyse. Tabelle 7a Fließanalyse, Spender 332

Fraktion	Gesamte Zellen	% SH3⁺	Gesamte SH3⁺-Zellen	Ausbeute (%)
Beginn	207 × 10⁶	20,8	43,0 × 10⁶
SH3-selektiert	12,8 × 10⁶	98,8	12,6 × 10⁶	29,4
SH3-unselektiert	181 × 10⁶	13,6	24,6 × 10⁶	57,2

Tabelle 7b

Fraktion	Gesamte Zellen	% SH3⁺/CD45⁺	Gesamte SH3⁺/CD45+-Zellen	Ausbeute (%)
Beginn	207 × 10⁶	20,4	42,2 × 10⁶
SH3-selektiert	12,8 × 10⁶	98,4	12,6 × 10⁶	29,8
SH3-unselektiert	181 × 10⁶	12,3	22,3 × 10⁶	52,8

Die Ergebnisse in den Tabellen 7a und b über die Fließanalyse der Probe des Spenders 332 zeigten eine SH3-Reinheit von 98,8 %, wobei mehr als 99,5 % dieser Zellen CD45⁺ waren. Die Gesamtzahl der CD45^--Zellen in der Probe betrug 0,42 %.
Die Ergebnisse zeigten, dass der in Kultur festgestellte Vorläufer für die mesenchymale Stammzelle SH3-positiv und CD45-positiv war und dass diese Zelle unter Verwendung von SH3-Antikörper in Verbindung mit immunomagnetischen Perlen oder anderen Immunoselektionsverfahren isoliert werden kann.
Beispiel 2
MSC-Isolierung unter Anwendung von SH2-Zellselektion
Biotin-anti-SH2-Antikörper und Ratten-anti-Maus-IgG1-Magnetmikroperlen wurden zur Isolierung von zwei Fraktionen von Zellen aus Knochenmarkzellen geringer Dichte verwendet: SH2-gebunden und SH2-ungebunden. Diese Zellfraktionen wurden unter übliche MSC-Kulturbedingungen gebracht, um das proliferative MSC-Potential der in diesen Fraktionen enthaltenen Zellpopulation zu bestimmen.
Anti-IgGI-Mikroperlen der Fa. Miltenyi, Charge # NE7200, wurden verwendet. Eine VS-Säule stammte von der Fa. Miltenyi, Charge # 0231. Als Präseparationsfilter wurden 30 μm-Filter der Fa. Miltenyi, Charge # 55 verwendet. Miltenyi-Puffer: phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, ergänzt mit 0,5 % BSA und 2 mM EDTA. Eine Fließfärbung wurde unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Fließanalyse wurde unter Anwendung entweder von FACS-Calibur oder FACS-Vantage durchgeführt. Die Lebensfähigkeit der Zellen und die Zellzahlen wurden unter Verwendung von Trypanblau bestimmt.

Zellen geringer Dichte wurden aus einem humanen Knochenmarkaspirat (Spender # 426) unter Verwendung der Dendreon-Lösung BDS72 (Seattle, WA) nach Dichtezentrifugation von Knochenmarkaspiraten isoliert. Aliquotanteile wurden als Kontrollen für die Fließanalyse und die Zellkultur entnommen. Die restlichen Zellen wurden unter Verwendung von Miltenyi-Puffer auf eine Zellzahl von 2 × 10⁷ Zellen/ml verdünnt. Die Zellen wurden 10 Minuten bei 4 °C unter Vermischen mit IgG in einer Menge von 40 μl pro ml Zellsuspension inkubiert. Sodann wurden die Zellen 10 Minuten mit 1 000 U/min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit anti-SH2-Antikörper 30 Minuten bei 4 °C unter Vermischen in einer Menge von 10 μg pro 1 × 10⁷ Zellen inkubiert. Sodann wurden die Zellen 2-mal mit kaltem Puffer gewaschen. Das Zellpellet wurde in Miltenyi-Puffer (80 μl Puffer pro 10⁷ Zellen) resuspendiert. Anti-Igel-Mikroperlen wurden zugesetzt (20 μl Perlen pro 10⁷ Zellen). Das Gemisch wurde 15 Minuten unter Vermischen bei 4 °C inkubiert. Miltenyi-Puffer wurde zur Verdünnung des Gemisches und zum Waschen der Zellen zugesetzt. Die Zellen wurden 10 Minuten mit 1 000 U/min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde im Miltenyi-Puffer resuspendiert (0,5 ml Puffer pro 10⁸ Zellen). Die VS-Säule wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Der Vorfilter wurde ebenfalls gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Die Zellen/Mikroperlen-Suspension wurde auf den Vorfilter aufgesetzt und die Suspension wurde durch die Säule geleitet. Das ausströmende Produkt wurde als die "SH2-ungebundene" Fraktion gesammelt. Die Säule wurde 2-mal mit 3 ml Miltenyi-Puffer gespült und dieses ausströmende Produkt wurde zur "SH2-ungebundenen" Fraktion gegeben. Die Säule wurde vom Magneten entfernt und über ein Röhrchen mit der Bezeichnung "SH2-gebunden" angeordnet. 5 ml Miltenyi-Puffer wurden auf die Säule aufgesetzt und ein Spritzenkolben wurde dazu verwendet, die Zellen in das Röhrchen zu drücken. Eine frische Säule wurde vorbereitet und die Zellen im "SH2-gebundenen" Röhrchen wurden auf die zweite Säule aufgesetzt. Die Zellen/Mikroperlen-Suspension wurde zum Vorfilter gegeben und die Suspension wurde durch die Säule geleitet. Das ausströmende Produkt wurde als die "SH2-ungebundene" Fraktion gesammelt. Die Säule wurde 2-mal mit 3 ml Miltenyi-Puffer gespült und dieses ausströmende Produkt wurde zur "SH2-ungebundenen" Fraktion gegeben. Die Säule wurde vom Magneten entfernt und über ein Röhrchen mit der Bezeichnung "SH2-gebunden" gebracht. 5 ml Miltenyi-Puffer wurden zu der Säule gegeben und ein Spritzenkolben wurde dazu verwendet, die Zellen in das Röhrchen zu drücken. Tests zur Bestimmung der Zellzahlen und der Lebensfähigkeit wurden durchgeführt. Zellen der gebundenen und ungebundenen Fraktionen wurden für die Fließanalyse gefärbt. Ungebundene und gebundene Zellen wurden einer Kultur unterworfen. Die Zellen wurden nach 14 Tagen geerntet. Zellen von den Zellen mit geringer Dichte und der SH2-gebundenen Fraktion wurden für die Fließanalyse gefärbt. Tabelle 8 SH2-Zellselektionsausbeuten

Fraktion	Anzahl der Zellen	% Ausbeute
Zellen geringer Dichte	2,0 × 10⁸	100
SH2-gebunden	3,6 × 10⁶	1,8
SH2-ungebunden	2,3 × 10⁸	113

Tabelle 9 Fließanalyse der Ausgangszellfraktionen

Fraktion	% SH2+-Anzahl Zellen
Zellen geringer Dichte	23,9
SH2-gebunden	98,3
SH2-ungebunden	14,6

Tabelle 10 Mikroskopische Prüfung von P0-Kulturen am Tag 14

Fraktion	Erscheinungsbild
Zellen geringer Dichte	75 % Konfluenz, eine Phase mit hellen Zellen ist sichtbar
SH2-gebunden	90 % Konfluenz, eine Phase mit hellen Zellen ist sichtbar
SH2-ungebunden	Sehr kleine Kolonien sind sichtbar

Tabelle 11 P0-Zellernten

Fraktion	Überimpfte Zellen/cm²	Geerntete Zellen/cm²	% Ausbeute
Zellen geringer Dichte	8,0 × 10⁴	1,4 × 10⁴	17
SH2-gebunden	8,0 × 10⁴	1,2 × 10⁴	15
SH2-ungebunden	8,0 × 10⁴	3,2 × 10²	0,4

Tabelle 12 Fließanalyse von P0-Kulturen

Fraktion	% MSC-Phänotyp	% CD45+-Zellen
Zellen geringer Dichte	99,5	0,3
SH2-gebunden	98,7	0,2

Die SH2-Zellselektion von Knochenmarkzellen geringer Dichte unter Verwendung des Miltenyi-Mikroperlensystems ergab weniger als 2 % Zellen geringer Dichte in der SH2-gebundenen Fraktion. Die Isolierung ergab eine Zellfraktion mit einem Gehalt an Zellen, die zu 98,3 % SH2+ waren. Die SH2-gebundenen Zellen zeigten 90 % Konfluenz unter Bildung von spindelförmigen Zellen nach 14-tägiger Kultur unter MSC-Standardkulturbedingungen. Die Kultur der SH2-gebundenen Zellen ergab eine Population von adhärenten Zellen, die bei Fließanalyse und Morphologie einen MSC-Phänotyp aufwiesen. Sehr wenige adhärente Zellen wurde aus der SH2-ungebundenen Zellfraktion isoliert. Diese Ergebnisse zeigen, dass SH2 ein Antigen darstellt, das sowohl an MSC-Vorläufer als auch an den in Kultur expandierten MSCs vorliegt.
Beispiel 3
MSC-Isolierung von P0-MSC-Kulturen unter Anwendung der CD45-Zellselektion
Es wird berichtet, dass P0-MSC-Kulturen einen Median von 9 % CD45+-Zellen (Bereich 0,5 bis 50 %) aufweisen, während der in Kultur expandierte Phänotyp von MSCs CD45-negativ ist. Eine CD45-Selektion von P0-Zellen wurde an drei Spendern durchgeführt, um festzustellen, ob MSCs aus der CD45-gebundenen Zellfraktion gezüchtet werden können.
Anti-CD45-Mikroperlen stammten von der Fa. Miltenyi (Charge # NE5848). Eine große Zellseparationssäule stammte von der Fa. Miltenyi (Katalog # 422-02). Miltenyi-Puffer: phosphatgepufferte Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2, ergänzt mit 0,5 % BSA und 2 mM EDTA. Die Fließfärbung wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die Fließanalyse wurde durchgeführt, indem entweder FACS-Calibur oder FACS-Vantage verwendet wurde. Die Zelllebensfähigkeit und die Zellzahl wurden unter Verwendung von Trypanblau bestimmt.
P0-MSCs wurden von humanen Knochenmarkzellen geringer Dichte (Spender # 394 (0), # 386 (0) und # 381 (0) abgeleitet. Proben von 0,5-5,0 × 10⁶ Zellen wurden als Kontrollen für die Fließanalyse entnommen. Die restlichen Zellen wurden unter Verwendung von Miltenyi-Puffer auf eine Zellzahl von 2 × 10⁷ Zellen/ml verdünnt. Wenn die Zahl <2 × 10⁷ Zellen/ml betrug, wurde dieser Schritt weggelassen. Die Zellen wurden mit IgG in einer Menge von 40 μl pro ml Zellsuspension 10 Minuten bei 4 °C unter Vermischen inkubiert. Sodann wurden die Zellen 5 Minuten mit 1 100 U/min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Miltenyi-Puffer (80 μl Puffer pro 10⁷ Zellen) resuspendiert. Anti-CD45-Mikroperlen wurden zugegeben (20 μl Perlen pro 10⁷ Zellen). Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 4 °C unter Vermischen inkubiert. Miltenyi-Puffer wurde zugesetzt, um das Gemisch zu verdünnen und die Zellen zu waschen. Sodann wurden die Zellen 10 Minuten mit 1 100 U/min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Miltenyi-Puffer resuspendiert (0,5 ml pro 10⁸ Zellen). Die große Zellseparationssäule wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Die Zellen/Mikroperlen-Suspension wurde auf die Säule aufgesetzt und die Suspension wurde durch die Säule geleitet. Das ausströmende Produkt wurde als die "CD45-ungebundene" Fraktion gewonnen. Die Säule wurde 3-mal mit 0,5 ml Miltenyi-Puffer gespült und dieses ausströmende Produkt wurde zu der "CD45-ungebundenen" Fraktion gegeben. Die Säule wurde vom Magneten entfernt und über ein Röhrchen mit der Bezeichnung "CD45-gebunden" gebracht. 1 ml Miltenyi-Puffer wurde auf die Säule aufgesetzt und ein Spritzenkolben wurde dazu verwendet, die Zellen in das Röhrchen zu drücken. Eine frische große Zellsäule wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet und die Zellen im "CD45-gebundenen" Röhrchen wurden auf die zweite Säule aufgesetzt. Die Zellen/Mikroperlen-Suspension wurde auf die Säule aufgesetzt und die Suspension wurde durch die Säule geleitet. Das ausströmende Produkt wurde als die "CD45-ungebundene" Fraktion gesammelt. Die Säule wurde 3-mal mit 0,5 ml Miltenyi-Puffer gespült und dieses ausströmende Produkt wurde zu der "CD45-ungebundenen" Fraktion gegeben. Die Säule wurde vom Magneten entfernt und über ein Röhrchen mit der Bezeichnung "CD45-gebunden" gebracht. 1 ml Miltenyi-Puffer wurde auf die Säule aufgesetzt und ein Spritzenkolben wurde dazu verwendet, die Zellen in das Röhrchen zu drücken. Tests zur Bestimmung der Zellzahlen und der Lebensfähigkeit wurden durchgeführt. Zellen von der gebundenen und der ungebundenen Fraktion (# 394) und der ungebundenen Fraktion (# 386 & # 381) wurden für die Fließanalyse gefärbt. Eine Zellkultur wurde durchgeführt. Zellen wurden geerntet und passagiert, bis eine angemessene Anzahl an Zellen für die Fließanalyse verfügbar war. Tabelle 13 Spender # 381: P0-CD45-Zellselektionsausbeuten

Fraktion Anzahl der Zellen % Ausbeute

P0-Zellen 381 8,7 × 10⁶ 100

CD45-gebunden 1,4 × 10⁵ 1,6

CD45-ungebunden 4,8 × 10⁶ 55

Tabelle 14 Spender # 386: P0-CD45-Zellselektionsausbeuten

Fraktion Anzahl der Zellen % Ausbeute

P0-Zellen 386 1,2 × 10⁷ 100

CD45-gebunden 2,2 × 10⁵ 1,9

CD45-ungebunden 8,4 × 10⁶ 70

Tabelle 15 Spender # 394: P0-CD45-Zellselektionsausbeuten

Fraktion Anzahl der Zellen % Ausbeute

P0-Zellen 394 1,2 × 10⁸ 100

CD45-gebunden 1,8 × 10⁶ 1,5

CD45-ungebunden 1,1 × 10⁸ 92

Tabelle 16 Fließanalyse der Ausgangszellfraktionen

Fraktion % CD45+-Zellen

P0-Zellen 381 4,7

CD45-ungebunden 381 1,5

P0-Zellen 386 1,9

CD45-ungebunden 386 3,5

P0-Zellen 394 2,0

CD45-ungebunden 394 1,4

Tabelle 17 Spender 381(1), Zellernten

Fraktion Zellen/cm² überimpft Zellen/cm² geerntet Tage in der Kultur Expansionsfaktor

CD45-gebunden 3,4 × 10⁴ 5,8 × 10⁴ 12 1,7

CD45-ungebunden 5,4 × 10⁴ 8,3 × 10³ 7 1,5

Tabelle 18 Spender 381(2), Ernten der CD45-gebundenen Zellen

Fraktion Zellen/cm² überimpft Zellen/cm² geerntet Tage in der Kultur Expansionsfaktor

CD45-gebunden 2,9 × 10³ 3,7 × 10⁴ 3 12,8

Tabelle 19 Spender 386(1), Zellernten

Fraktion Zellen/cm² überimpft Zellen/cm² geerntet Tage in der Kultur Expansionsfaktor

CD45-gebunden 4,4 × 10⁴ 7,5 × 10⁴ 12 1,7

CD45-ungebunden 5,4 × 10³ 1,6 × 10⁴ 7 3,0

Tabelle 20 Spender 394(1), Zellernten

Fraktion Zellen/cm² überimpft Zellen/cm² geerntet Tage in der Kultur Expansionsfaktor

CD45-gebunden 5,3 × 10³ 1,3 × 10⁴ 11 2,5

CD45-ungebunden 5,3 × 10³ 3,1 × 10⁴ 11 5,0

Tabelle 21 Fließanalyse von gezüchteten Zellen aus CD45-selektierten P0-MSCs

Fraktion % MSC-Phänotyp % CD45+

381(2) aus CD45-gebunden 99,2 0,7

386(1) aus CD45-gebunden 99,0 0,8

394(1) aus CD45-gebunden 98,5 1,4
Die CD45-Selektion von P0-MSCs ergab eine Zellpopulation, die <2 % der Ausgangs-P0-Population ausmachte. Gezüchtete CD45-gebundene Zellen, die aus den P0-MSCs isoliert worden waren, ergaben MSCs gemäß Bestimmung durch Fließzytometrie und Morphologie. Die CD45-ungebundene Zellfraktion, die aus den P0-MSCs isoliert worden war, ergab ebenfalls MSCs gemäß Bestimmung durch Fließzytometrie und Morphologie. Der Phänotyp des MSC-Vorläufers war offensichtlich CD45-matt.
Beispiel 4
MSC-Isolierung unter Anwendung der CD45-Selektion
Aus Knochenmark isolierte Zellen geringer Dichte wurden unter Verwendung von direkt konjugierten anti-CD45-Miltenyi-Mikroperlen (Miltenyi Charge # NE5848) gemäß den Anweisungen des Herstellers selektiert. Die VS-Säule stammte von der Fa. Miltenyi (Charge # 0231). 30 μm-Präseparationsfilter stammten von der Fa. Miltenyi (Charge 55). Miltenyi-Puffer: phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, ergänzt mit 0,5 % BSA und 2 mM EDTA. Die Fließfärbung wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die Fließanalyse wurde unter Anwendung von FACS-Calibur oder FACS-Vantage durchgeführt. Die Zelllebensfähigkeit und die Zellzahl wurden unter Verwendung von Trypanblau bestimmt.
Zellen geringer Dichte wurden aus humanem Knochenmarkaspirat (Spender # 358) unter Verwendung der Dendreon-Lösung BDS72 nach Dichtezentrifugation der Knochenmarkaspirate isoliert. Aliquotanteile wurden als Kontrollen für die Fließanalyse und die Zellkultur entfernt.
Die restlichen Zellen wurden unter Verwendung von Miltenyi-Puffer auf eine Zellzahl von 2 × 10⁷ Zellen/ml verdünnt. Die Zellen wurden mit IgG in einer Menge von 40 μl pro ml Zellsuspension 10 Minuten bei 4 °C unter Vermischen inkubiert. Die Zellen wurden 10 Minuten mit 1 000 U/min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Miltenyi-Puffer resuspendiert (80 μl Puffer pro 10⁷ Zellen). Anti-CD45-Mikroperlen wurden zugegeben (20 μl Perlen pro 10⁷ Zellen). Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 4 °C unter Vermischen inkubiert. Miltenyi-Puffer wurde zur Verdünnung des Gemisches und zum Waschen der Zellen zugesetzt. Die Zellen wurden 10 Minuten mit 1 000 U/min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Miltenyi-Puffer resuspendiert (0,5 ml Puffer pro 10⁸ Zellen). Die VS-Säule wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Der Vorfilter wurde ebenfalls gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Die Zellen/Mikroperlen-Suspension wurde auf den Vorfilter aufgesetzt und die Suspension wurde durch die Säule geleitet. Das ausströmende Produkt wurde als die "CD45-ungebundene" Fraktion gesammelt. Die Säule wurde 3-mal mit 3 ml Miltenyi-Puffer gespült und dieses ausströmende Produkt wurde zur "CD45-ungebundenen" Fraktion gegeben. Die Säule wurde vom Magneten entfernt und über ein Röhrchen mit der Bezeichnung "CD45-gebunden" gebracht. 5 ml Miltenyi-Puffer wurden zu der Säule gegeben und ein Spritzenkolben wurde dazu verwendet, die Zellen in das Röhrchen zu drücken. Eine frische Säule wurde vorbereitet und die Zellen im "CD45-gebundenen" Röhrchen wurden zur zweiten Säule gegeben. Der Vorfilter wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Die Zellen/Mikroperlen-Suspension wurde auf den Vorfilter aufgesetzt und die Suspension wurde durch die Säule geleitet. Das ausströmende Produkt wurde als die "CD45-ungebundene" Fraktion gesammelt. Die Säule wurde 2-mal mit 3 ml Miltenyi-Puffer gespült und dieses ausströmende Produkt wurde zur "CD45-ungebundenen" Fraktion gegeben. Die Säule wurde vom Magneten entfernt und über ein Röhrchen mit der Bezeichnung "CD45-gebunden" gebracht. 5 ml Miltenyi-Puffer wurden auf die Säule aufgesetzt und ein Spritzenkolben wurde dazu verwendet, die Zellen in das Röhrchen zu drücken. Tests zur Bestimmung der Zellzahlen und der Lebensfähigkeit wurden durchgeführt. Zellen der gebundenen und ungebundenen Fraktionen wurden für die Fließanalyse gefärbt. Eine Zellkultur wurde durchgeführt. Zellen wurden geerntet und gezählt. Tabelle 22 CD45-Zellselektionsausbeuten

Fraktion Anzahl der Zellen % Ausbeute

Zellen geringer Dichte 3,93 × 10⁸ 100

CD45-gebunden 1,84 × 10⁸ 47

CD45-ungebunden 1,37 × 10⁸ 35

Tabelle 23 Fließanalyse der Ausgangszellfraktionen

Fraktion % CD45+-Zellen

Zellen geringer Dichte 78,3

CD45-gebunden 99,0*

CD45-ungebunden 51,5

* Die Färbungsintensität ist in der CD45-gebundenen Zellfraktion signifikant erhöht.

Fraktion	Erscheinungsbild
Zellen geringer Dichte	100 % Konfluenz, zahlreiche Zellen mit heller Phase
CD45-gebunden	80 % Konfluenz, einige Zellen mit heller Phase
CD45-ungebunden	95 % Konfluenz, einige Zellen mit heller Phase

Fraktion	Zellen/cm² überimpft	Zellen/cm² geerntet	% Ausbeute
Zellen geringer Dichte	1,6 × 10⁵	5,4 × 10⁴	33
CD45-gebunden	1,6 × 10⁵	1,9 × 10⁴	12
CD45-ungebunden	1,6 × 10⁵	4,6 × 10⁴	29

47 % der Zellen waren in der CD45-gebundenen Fraktion vorhanden. Diese CD45-gebundene Zellpopulation war zu 99 % CD45-positiv gemäß Fließanalyse und war zur Bildung von MSCs bei P0 gemäß Bestimmung durch Morphologie befähigt. Die CD45-ungebundene Zellfraktion machte 35 % der gesamten selektierten Zellen aus und war zu 51,5 % CD45-positiv. Die Fluoreszenzintensität der CD45-ungebundenen Zellen war wesentlich geringer als die der CD45-gebundenen Zellen. Diese Zellfraktion war ebenfalls zur Bildung von MSCs in P0-Kultur gemäß Bestimmung durch Morphologie befähigt. Dieses Experiment liefert einen weiteren Beweis, dass der MSC-Vorläufer CD45-positiv bei einer matten Färbungsintensität ist.
Beispiel 5
MSC-Isolierung unter Anwendung von Fibroblastenzellselektion
Anti-Fibroblasten-Mikroperlen wurden für die Trennung von Zellen auf der Grundlage der Expression eines Fibroblasten-spezifischen Antigens entwickelt. Da gezüchtete MSCs eine Fibroblasten-Morphologie aufweisen, wurden die anti-Fibroblasten-Mikroperlen zur Selektion einer Fraktion von Zellen aus Knochenmarkzellen geringer Dichte verwendet. Zellen, die gebunden waren und solche die nicht gebunden waren, wurden unter übliche MSC-Kulturbedingungen gebracht und beobachtet.
Anti-Fibroblasten-Mikroperlen stammten von der Fa. Miltenyi (Charge # NE630). Die VS-Säule stammte ebenfalls von der Fa. Miltenyi (Charge # 0231). 30 μm-Präseparationsfilter stammten ebenfalls von der Fa. Miltenyi (Charge # 55). Miltenyi-Puffer: phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, ergänzt mit 0,5 % BSA und 2 mM EDTA. Eine Fließfärbung wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die Fließanalyse wurde entweder unter Verwendung von FACS-Calibur oder FACS-Vantage durchgeführt. Die Zelllebensfähigkeit und die Zellzahlen wurden unter Verwendung von Trypanblau bestimmt.
Tests wurden auf folgende Weise durchgeführt, um das osteogene und adipogene Potential der Zellen zu messen.
Adipogenese-Test.
Zellen wurden in einer Schale mit 6 Vertiefungen (2 × 10⁵ Zellen/Vertiefung) in hMSC-Medium ausgestrichen. Konfluente MSCs wurden einer Impulsinduktion mit stark glucosehaltigem Medium mit einem Gehalt an Dexamethason, Insulin, 3-Isobutyl-1-methylxanthin und Indomethacin unterworfen. Am Ende der Züchtungsperiode wurden die Platten mit 10 % Formalin fixiert, mit Oil Red "O" gefärbt und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Bildung von Lipidvakuolen mit Rotfärbung wurde beobachtet und halbquantitativ durch Bestimmung der prozentualen Oberfläche der Vertiefung bestimmt.
Test auf osteogene Calciumabscheidung.
Zellen wurden in Schalen mit 6 Vertiefungen (3 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) ausgestrichen. Vertiefungen mit der Bezeichnung "OS" wurden mit hMSC-Medium, das mit Ascorbinsäure-2-phosphat, Dexamethason und β-Glycerophosphat ergänzt war, versorgt. Vertiefungen mit der Bezeichnung "Kontrolle" wurden mit üblichem hMSC- Medium versorgt. Das Medium wurde 14 bis 16 Tage lang 2-mal wöchentlich ausgetauscht. Die erhöhte Calciumabscheidung wurde durch halbquantitative kolorimetrische Tests bestimmt.

Zellen geringer Dichte wurden aus humanen Knochenmarkaspiraten (Spender # 373, # 386 & # 421) unter Verwendung der Dendreon-Lösung BDS72 nach Dichtezentrifugation der Knochenmarkaspirate isoliert. Aliquotanteile wurden als Kontrollen für die Zellkultur entnommen. Die restlichen Zellen wurden auf eine Zellzahl von 2 × 10⁷ Zellen/ml unter Verwendung von Miltenyi-Puffer verdünnt. Die Zellen wurden mit IgG in einer Menge von 40 μl pro ml Zellsuspension 10 Minuten bei 4 °C unter Vermischen inkubiert. Sodann wurden die Zellen 10 Minuten mit 1 000 U/min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Miltenyi-Puffer (80 μl pro 10⁷ Zellen) resuspendiert. Anti-Fibroblasten-Mikroperlen wurden zugesetzt (20 μl Perlen pro 10⁷ Zellen). Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Vermischen inkubiert. Miltenyi-Puffer wurde zugesetzt, um das Gemisch zu verdünnen und die Zellen zu waschen. Sodann wurden die Zellen 10 Minuten mit 1 000 U/min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Miltenyi-Puffer (1 ml Puffer pro 10⁸ Zellen) resuspendiert. Die VS-Säule wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Der Vorfilter wurde ebenfalls gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Die Zellen/Mikroperlen-Suspension wurde auf den Vorfilter aufgesetzt und die Suspension wurde durch die Säule geleitet. Das ausströmende Produkt wurde als "Fibroblasten-ungebundene" Fraktion gesammelt. Die Säule wurde 3-mal mit Miltenyi-Puffer gespült und dieses ausströmende Produkt wurde zur "Fibroblasten-ungebundenen" Fraktion gegeben. Die Säule wurde vom Magneten entfernt und über ein Röhrchen mit der Bezeichnung "Fibroblasten-gebunden" gebracht. 5 ml Miltenyi-Puffer wurden auf die Säule aufgesetzt und ein Spritzenkolben wurde dazu verwendet, die Zellen in das Röhrchen zu drücken. Eine frische Säule wurde vorbereitet und die Zellen im "Fibroblasten-gebundenen" Röhrchen wurden auf die zweite Säule aufgesetzt. Der Vorfilter wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Die Zellen/Mikroperlen-Suspension wurde auf den Vorfilter aufgesetzt und die Suspension wurde durch die Säule geleitet. Das ausströmende Produkt wurde als "Fibroblasten-ungebundene" Fraktion gesammelt. Die Säule wurde 2-mal mit 3 ml Miltenyi-Puffer gespült und dieses ausströmende Produkt wurde zur "Fibroblasten-ungebundenen" Fraktion gegeben. Die Säule wurde vom Magneten entfernt und über ein Röhrchen mit der Bezeichnung "Fibroblasten-gebunden" gebracht. 5 ml Miltenyi-Puffer wurden auf die Säule aufgesetzt und ein Spritzenkolben wurde dazu verwendet, die Zellen in das Röhrchen zu drücken. Tests zur Bestimmung der Zellzahlen und der Lebensfähigkeit wurden durchgeführt. Die Zellen der Spender 373 und 386 wurden einer Kultur unterworfen. Die Zellen wurden geerntet und passagiert. P0-Zellen der Kontrolle niedriger Dichte und die Fibroblasten-gebundenen Kulturen des Spenders 373 wurden für die Fließanalyse gefärbt. P0-Zellen des Spenders 386 wurden dem in vitro-Test auf osteogene Differenzierung und dem in vitro-Adipogenese-Test unterworfen. Kulturen von den Adipogenese-Tests zeigten eine signifikante Adipogenese der MSCs. Tabelle 26 Spender 373, Zellselektionsausbeuten

Fraktion	Anzahl der Zellen	% Ausbeute
Zellen geringer Dichte	6,0 × 10⁷	100
Fibroblasten-gebunden	5,6 × 10⁶	9
Fibroblasten-ungebunden	4,2 × 10⁷	70

Tabelle 27 Spender 386, Zellselektionsausbeuten

Fraktion	Anzahl der Zellen	% Ausbeute
Zellen geringer Dichte	6,0 × 10⁸	100
Fibroblasten-gebunden	2,1 × 10⁷	3,5
Fibroblasten-ungebunden	4,3 × 10⁸	72

Tabelle 28 Spender 421, Zellselektionsausbeuten

Fraktion	Anzahl der Zellen	% Ausbeute
Zellen geringer Dichte	4,4 × 10⁸	100
Fibroblasten-gebunden	2,6 × 10⁷	5,8
Fibroblasten-ungebunden	4,2 × 10⁸	94

Tabelle 29 Spender 373, Mikroskopische Prüfung von P0-Kulturen am Tag 14

Fraktion	Erscheinungsbild
Zellen geringer Dichte	80 % Konfluenz, Zellen mit heller Phase sind sichtbar
Fibroblasten-gebunden	50 % Konfluenz, Zellen mit heller Phase sind sichtbar
Fibroblasten-ungebunden	Runde Zellen, Bruchstücke

Tabelle 30 Spender 386, Mikroskopische Prüfung von P0-Kulturen am Tag 14

Fraktion	Erscheinungsbild
Zellen geringer Dichte	100 % Konfluenz, Zellen mit heller Phase sind sichtbar
Fibroblasten-gebunden	100 % Konfluenz, Zellen mit heller Phase sind sichtbar
Fibroblasten-ungebunden	Runde schwimmende Zellen, Bruchstücke

Tabelle 31 Spender 373, P0-Zellernten

Fraktion	Zellen/cm² überimpft	Zellen/cm² geerntet	% Ausbeute
Zellen geringer Dichte	8,1 × 10⁴	1,2 × 10⁴	15
Fibroblasten-gebunden	8,0 × 10⁴	5,0 × 10³	10
Fibroblasten-ungebunden	8,1 × 10⁴	3,2 × 10¹	0,04

Tabelle 32 Spender 386, P0-Zellernten

Fraktion	Zellen/cm² überimpft	Zellen/cm² geerntet	% Ausbeute
Zellen geringer Dichte	1,6 × 10⁵	1,6 × 10⁴	10
Fibroblasten-gebunden	1,6 × 10⁵	1,8 × 10⁴	11
Fibroblasten-ungebunden	1,6 × 10⁵	3,9 × 10¹	0,02

Tabelle 33 Spender 373, Fließanalyse von P0-Kulturen

Spender/Fraktion	% MSC-Phänotyp	% CD45+-Zellen
373(0) Zellen geringer Dichte	89,3	10,3
373(0) Fibroblasten-gebundene Zellen	85,9	13,8

Die Ergebnisse des Calciumtests für den Spender 386(1), Zellen geringer Dichte und Fibroblasten-gebundene Zellfraktionen, sind in Tabelle 39 und 2 aufgeführt. Tabelle 34

Proben-ID	Bedingungen	Verdünnungsfaktor	Spektrophotometer-OD-Ablesungen bei 575 nm			Calcium (μg/Vertiefung)			Mittelwert	S.D.
Proben-ID	Bedingungen	Verdünnungsfaktor	1	2	3	1	2	3	Mittelwert	S.D.
Geringe Dichte	Kontrolle	20	0,0000	0,0000	0,0000	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Geringe Dichte	OS	50	0,1490	0,1625	0,1903	60,4	62,3	66,4	63,0	3,1
Fibro Pos	Kontrolle	20	0,0000	0,0000	0,0000	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Fibro Pos	OS	50	0,1370	0,1554	0,1225	58,6	61,3	56,5	58,8	2,4

Die Fibroblasten-gebundene Zellfraktion von Knochenmarkzellen geringer Dichte repräsentierte 3-9 % der nukleisierten Ausgangszellpopulation und haftete an Polystyrol. Unter üblichen MSC-Kulturbedingungen ergab die Fibroblasten-gebundene Zellfraktion eine MSC-Population gemäß Bestimmung durch Fließzytometrie, biologische Tests und Morphologie.
Beispiel 6
MSC-Isolierung unter Anwendung von Fibroblasten- und CD14-Zellselektion
Anti-Fibroblasten-Mikroperlen stammten von der Fa. Miltenyi (Charge # N56836). Die VS-Säule stammte ebenfalls von der Fa. Miltenyi (Charge # 0231). 30 μm-Präseparationsfilter stammten ebenfalls von der Fa. Miltenyi (Charge # 55). Miltenyi-Puffer: phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, ergänzt mit 0,5 % BSA und 2 mM EDTA. Anti-CD14-Magnetperlen stammte von Dynal (Charge # A93900). Eine Fließfärbung wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die Fließanalyse wurde unter Verwendung von FACS-Calibur oder FACS-Vantage durchgeführt. Die Zelllebensfähigkeit und die Zellzahl wurden unter Verwendung von Trypanblau bestimmt.

Zellen niedriger Dichte wurde aus humanem Knochenmarkaspirat (Spender # 391) unter Verwendung der Dendreon-Lösung BDS72 nach Dichtezentrifugation der Knochenmarkaspirate isosliert. Aliquotanteile wurden als Kontrolle für die Zellkultur entnommen. Die restlichen Zellen wurden auf eine Zellzahl von 2 × 10⁷ Zellen/ml unter Verwendung von Miltenyi-Puffer verdünnt. Die Zellen wurden mit IgG in einer Menge von 40 μl pro ml Zellsuspension 10 Minuten bei 4 °C unter Vermischen inkubiert. Sodann wurden die Zellen 10 Minuten mit 1 000 U/min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Miltenyi-Puffer (80 μl Puffer pro 10⁷ Zellen) resuspendiert. Anti-Fibroblasten-Mikroperlen wurden zugegeben (20 μl Perlen pro 10⁷ Zellen). Das Gemisch wurde bei 4 °C 15 Minuten unter Vermischen inkubiert. Miltenyi-Puffer wurde zugesetzt, um das Gemisch zu verdünnen und die Zellen zu waschen. Die Zellen wurden 10 Minuten mit 1 000 U/min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Miltenyi-Puffer (1 ml Puffer pro 10⁸ Zellen) resuspendiert. Die VS-Säule wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Der Vorfilter wurde ebenfalls gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Die Zellen/Mikroperlen-Suspension wurde auf den Vorfilter aufgesetzt und die Suspension wurde durch die Säule geleitet. Das ausströmende Produkt wurde als die "Fibroblasten-ungebundene" Fraktion gesammelt. Die Säule wurde 2-mal mit 3 ml Miltenyi-Puffer gespült und dieses ausströmende Produkt wurde zu der "Fibroblasten-ungebundenen" Fraktion gegeben. Die Säule wurde vom Magnet entfernt und über ein Röhrchen mit der Bezeichnung "Fibroblasten-gebunden" gebracht. 5 ml Miltenyi-Puffer wurden auf die Säule aufgesetzt und ein Spritzenkolben wurde dazu verwendet, die Zellen in das Röhrchen zu drücken. Eine frische Säule wurde vorbereitet und die Zellen im "Fibroblasten-gebundenen" Röhrchen wurden auf die zweite Säule aufgesetzt. Der Vorfilter wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Die Zellen/Mikroperlen-Suspension wurde auf den Vorfilter aufgesetzt und die Suspension wurde durch die Säule geleitet. Das ausströmende Produkt wurde als "Fibroblasten-ungebundene" Fraktion gesammelt. Die Säule wurde 2-mal mit 3 ml Miltenyi-Puffer gespült und dieses ausströmende Produkt wurde zur "Fibroblasten-ungebundenen" Fraktion gegeben. Die Säule wurde vom Magnet entfernt und über ein Röhrchen mit der Bezeichnung "Fibroblasten-gebunden" gebracht. 5 ml Miltenyi-Puffer wurden auf die Säule aufgesetzt und ein Spritzenkolben wurde dazu verwendet, die Zellen in das Röhrchen zu drücken. Tests auf Zellzahl und Lebensfähigkeit wurden durchgeführt. Ungebundene Zellen wurden einer Kultur unterworfen. Gebundene Zellen wurden mit Dynal-anti-CD14-Magnetperlen in einer Zellkonzentration von 2 × 10⁷ Zellen pro ml und einer Perlenkonzentration von 2 × 10⁷ Perlen pro ml 1 Stunde bei 4 °C unter Vermischen inkubiert. Die Zellen/Perlen-Suspension wurde 2 Minuten in die Nähe des Dynal-Handmagneten gebracht. Nach 2 Minuten wurden nicht-haftende Zellen in ein Röhrchen mit der Bezeichnung "CD14-ungebunden" dekantiert. Das Zellen/Perlen-Röhrchen wurde vom Magnet entfernt und 5 ml Puffer wurden zugegeben, um die Zellen zu resuspendieren. Die Zellen/Perlen-Suspension wurde 2 Minuten in die Nähe des Dynal-Handmagneten gebracht. Nach 2 Minuten wurden nicht-haftende Zellen in ein Röhrchen mit der Bezeichnung "CD14-ungebunden" dekantiert. Das Zellen/Perlen-Röhrchen wurde vom Magnet entfernt und 5 ml Puffer wurden zugegeben, um die Zellen zu resuspendieren. Die Zellen/Perlen-Suspension wurde 2 Minuten in die Nähe des Dynal-Handmagneten gebracht. Nach 2 Minuten wurden die nicht-haftenden Zellen in ein Röhrchen mit der Bezeichnung "CD14-ungebunden" dekantiert. Das Zellen/Perlen-Röhrchen wurde vom Magnet entfernt und 5 ml Puffer wurden zugegeben, um die Zellen zu resuspendieren. Die Zellen, die an den Perlen haften blieben, wurden gezählt und einer Kultur in 2 10 cm²-Vertiefungen unterworfen. Die Zellen im ungebundenen Röhrchen wurden 2 Minuten in die Nähe des Handmagneten gebracht. Nicht-haftende Zellen wurden dekantiert, ausgezählt und in eine 10 cm²-Vertiefung ausgestrichen. Die Zellen wurden nach 14 Tagen geerntet. Gezüchtete Zellen von den Zellen geringer Dichte und die Fibroblasten gebundenen/CD14-gebundenen Fraktionen wurden für die Fließanalyse gefärbt. Tabelle 35 Fibroblastenzellen-Selektionsausbeuten

Fraktion	Anzahl der Zellen	% Ausbeute
Zellen geringer Dichte	3,35 × 10⁸	100
Fibroblasten-gebunden	1,2 × 10⁷	3,4
Fibroblasten-ungebunden	3,51 × 10⁸	105

Tabelle 36 CD14-Zellselektionsausbeuten

Fraktion	Anzahl der Zellen	% Ausbeute
Fibroblasten-gebunden	9 × 10⁶	100
CD14-gebunden	3,4 × 10⁶	38
CD14-ungebunden	1,9 × 10⁶	21

Tabelle 37 Mikroskopische Prüfung von P0-Kulturen am Tag 14

Fraktion	Erscheinungsbild
Zellen geringer Dichte	100 % Konfluenz, eine Phase mit hellen Zellen ist sichtbar
Fibroblasten-ungebunden	Runde Zellen als Einzelzellen und Klümpchen
Fibroblasten-gebunden/CD14-gebunden	100 % Konfluenz, wobei Perlen an einigen spindelförmigen Zellen haften
Fibroblasten-gebunden/CD14-ungebunden	Runde Zellen als Einzelzellen und Klümpchen

Tabelle 38 P0-Zellernten

Fraktion	Zellen/cm² überimpft	Zellen/cm² geerntet	% Ausbeute
Zellen geringer Dichte	1,6 × 10⁵	7,6 × 10⁴	47
Fibroblasten-ungebunden	1,6 × 10⁵	1,6 × 10²	0,1
Fibroblasten-gebunden/CD14-gebunden	1,7 × 10⁵	4,0 × 10⁴	23
Fibroblasten-gebunden/CD14-ungebunden	1,9 × 10⁵	1,0 × 10³	0,5

Tabelle 39 Fließanalyse von P0-Kulturen

Fraktion	% MSC-Phänotyp	% CD45+-Zellen
Zellen geringer Dichte	98,1	1,0
Fibroblasten-gebunden/CD14-gebunden	98,3	0,3

Um den Phänotyp des MSC-Vorläufers weiter zu definieren, wurde eine sequentielle Zellselektion unter Verwendung von Miltenyi-Mikroperlen durchgeführt, um Fibroblasten-gebundene Zellen zu selektieren, wonach sich die Verwendung von Dynal-Magnetperlen zur Isolierung von CD14-gebundenen Zellen aus der Fibroblasten-gebundenen Fraktion anschloss. Dies ist möglich, da die Größe der Mikroperlen zu klein ist, um eine Störung der Dynal-Selektion vorzunehmen.
Bei Anwendung dieser Technik machte die Fibroblasten-gebundene/CD14-gebundene Zellfraktion etwa 1,3 % der Ausgangspopulation von Zellen geringer Dichte aus. Die Fibroblasten-gebundenen/CD14-gebundenen Zellen hafteten unter üblichen MSC-Kulturbedingungen an Polystyrol-Kolben und nach 14-tägiger Züchtung ergab sich eine MSC-Population gemäß Bestimmung durch Fließanalyse und Morphologie.
Auf der Grundlage dieser einzigen Selektion ergibt sich, dass es sich beim MSC-Vorläufer um eine Fibroblasten+, CD14+-Zelle handelt. Dies ist überraschend, da es sich bei der in Kultur expandierten MSC um eine Fibroblasten+, CD14-negative Zelle handelt.
Beispiel 7
MSC-Isolierung unter Anwendung von Fibroblastenzellselektion und Fließsortierung
Anti-Fibroblasten-Mikroperlen stammten von der Fa. Miltenyi (Charge # NE7105). Die VS-Säule stammte ebenfalls von der Fa. Miltenyi (Charge # 0231). 30 μm-Präseparationsfilter stammten ebenfalls von der Fa. Miltenyi (Charge # 55). Miltenyi-Puffer: phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, ergänzt mit 0,5 % BSA und 2 mM EDTA. Eine Fließfärbung wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die Fließanalyse wurde unter Verwendung von FACS-Calibur oder FACS-Vantage durchgeführt. Die Fließsortierung wurde an FACS-Vantage durchgeführt. Die Bestimmung der Zelllebensfähigkeit und der Zellzahl wurden unter Verwendung von Trypanblau vorgenommen. Das osteogene Potential wurde unter Anwendung des in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens und mit einem in vivo-Osteogenese-Würfeltest, wie er beispielsweise im US-Patent 5 486 359 beschrieben ist, gemessen. Adipogenese-Tests wurden gemäß den in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Chondrogenese-Tests wurden folgendermaßen durchgeführt: Zellen wurden in einem 15 ml fassenden konischen Röhrchen (2,5 × 10⁵ Zellen/Pellet) in chondrogenem Medium, das aus Glucose in hohen Mengen, Dexamethason und TGF-β3 bestand, pelletisiert. Die Pellets wurden für die histologische Untersuchung eingebettet, in dünne Schnitte aufgeteilt und histochemisch gefärbt. Die Anwesenheit von Chondrozyten wurde unter Verwendung von Toluidinblau, das Proteoglycane färbt, und mit einem für Kollagen-Typ II spezifischen Antikörper nachgewiesen.
Zellen geringer Dichte wurden aus humanem Knochenmarkaspirat (Spender # 401 und # 438) unter Verwendung der Dendreon-Lösung BDS72 unter anschließender Dichtezentrifugation der Knochenmarkaspirate isoliert. Aliquotanteile wurden als Kontrollen für die Fließanalyse und die Zellkultur entnommen. Die restlichen Zellen wurden auf eine Zellzahl von 2 × 10⁷ Zellen/ml unter Verwendung von Miltenyi-Puffer verdünnt. Die Zellen wurden sodann mit IgG in einer Menge von 40 μl pro ml Zellsuspension 10 Minuten bei 4 °C unter Vermischen inkubiert. Sodann wurden die Zellen 10 Minuten mit 1 000 U/min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Miltenyi-Puffer (80 μl Puffer pro 10⁷ Zellen) resuspendiert. Anti-Fibroblasten-Mikroperlen wurden zugegeben (20 μl Perlen pro 10⁷ Zellen). Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Vermischen inkubiert. Miltenyi-Puffer wurde zugesetzt, um das Gemisch zu verdünnen und die Zellen zu waschen. Sodann wurden die Zellen 10 Minuten mit 1 000 U/min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Miltenyi-Puffer (1 ml Puffer pro 10⁸ Zellen) resuspendiert. Die VS-Säule wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Der Vorfilter wurde ebenfalls gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Die Zellen/Mikroperlen-Suspension wurde auf den Vorfilter aufgesetzt und die Suspension wurde durch die Säule geleitet. Das ausströmende Produkt wurde als "Fibroblasten-ungebundene" Fraktion gesammelt. Die Säule wurde 2-mal mit 3 ml Miltenyi-Puffer gespült und dieses ausströmende Produkt wurde der "Fibroblasten-ungebundenen" Fraktion zugesetzt. Die Säule wurde vom Magnet entfernt und über ein Röhrchen mit der Bezeichnung "Fibroblasten-gebunden" gebracht. 5 ml Miltenyi-Puffer wurden auf die Säule aufgesetzt und ein Spritzenkolben wurde dazu verwendet, die Zellen in das Röhrchen zu drücken. Eine frische Säule wurde vorbereitet und die Zellen im "Fibroblasten-gebundenen" Röhrchen wurden auf die zweite Säule aufgesetzt. Der Vorfilter wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Die Zellen/Mikroperlen-Suspension wurde auf den Vorfilter aufgesetzt und die Suspension wurde durch die Säule geleitet. Das ausströmende Produkt wurde als "Fibroblasten-ungebundene" Fraktion gesammelt. Die Säule wurde 2-mal mit 3 ml Miltenyi-Puffer gespült und dieses ausströmende Produkt wurde zur "Fibroblasten-ungebundenen" Fraktion gegeben. Die Säule wurde vom Magnet entfernt und über ein Röhrchen mit der Bezeichnung "Fibroblasten-gebunden" gebracht. 5 ml Miltenyi-Puffer wurden auf die Säule aufgesetzt und ein Spritzenkolben wurde dazu verwendet, die Zellen in das Röhrchen zu drücken. Tests auf Zellzahl und Lebensfähigkeit wurden durchgeführt.

Zellen aus der Fibroblasten-ungebundenen Fraktion wurden für die Fließanalyse gefärbt. Zellen aus der Fibroblasten-gebundenen Fraktion wurden mit anti-SH3, anti-CD45 und anti-CD14 inkubiert. Die Zellen wurden sortiert: die Zellen des Spenders 401 wurden in zwei Gruppen sortiert: Population 1 und Population 2. Die Zellen des Spenders 438 wurden in drei Gruppen sortiert: Population 1, Population 1a und Population 2. Die Zellen aus der Fibroblasten-ungebundenen Fraktion (nur Spender 401) und die sortierten Populationen wurden einer Kultur unterzogen. P0-Zellen wurden geerntet und passagiert. P1-Zellen aus der Kultur geringer Dichte und der Kultur von Population 1 von Spender # 401 wurden für die Fließzytometrie gefärbt und dem in vivo-Würfeltest unterworfen. P1-Zellen des Spenders # 438 wurden passagiert. P1-Zellen des Spenders 438 wurden passagiert. P2-Zellen von Kulturen geringer Dichte, von Population 1 und von Population 1a von Spender # 438 wurden für die Fließzytometrie gefärbt und biologischen in vitro-Tests unterworfen (Osteogenese, Adipogenese und Chondrogenese). Tabelle 40 Spender 401, Zellselektionsausbeuten

Fraktion	Anzahl der Zellen	% Ausbeute
Zellen geringer Dichte	6,6 × 10⁸	100
Fibroblasten-gebunden	2,9 × 10⁷	4,4
Fibroblasten-ungebunden	5,4 × 10⁸	82

Tabelle 41 Spender 438, Zellselektionsausbeuten

Fraktion	Anzahl der Zellen	% Ausbeute
Zellen geringer Dichte	8,5 × 10⁸	100
Fibroblasten-gebunden	2,0 × 10⁷	2,4
Fibroblasten-ungebunden	7,9 × 10⁸	93

Tabelle 42 Fibroblasten-gebundene Zellen nach Fließsortierung

Fraktion	Oberflächenphänotyp-Fließprofil	Anzahl der Zellen
Spender 401, Population 1	SH3+ hell; CD14 matt	1,1 × 10⁴
Spender 401, Population 2	SH3+ hell; CD14 hell	2,0 × 10⁴
Spender 438, Population 1	SH3+ hell; CD14 matt	1,5 × 10⁴
Spender 438, Population 1a	SH3+ hell; CD14 matt	1,5 × 10⁴
Spender 438, Population 2	SH3+ hell; CD14 hell	4,8 × 10⁵

Tabelle 43 Spender 401: Mikroskopische Prüfung von P0-Kulturen am Tag 12

Fraktion	Erscheinungsbild
Zellen geringer Dichte	60 % Konfluenz, eine Phase von hellen Zellen ist sichtbar
Fibroblasten-ungebunden	Runde Zellen mit seltenen spindelförmigen Zellen sind sichtbar
Fibroblasten-gebundene Population 1	100 % Konfluenz, eine Phase von hellen Zellen sind sichtbar
Fibroblasten-gebundene Population 2	Runde Zellen mit seltenen spindelförmigen Zellen ist sichtbar

Tabelle 44 Spender 438: Mikroskopische Prüfung von P0-Kulturen am Tag 14

Fraktion	Erscheinungsbild
Zellen geringer Dichte	90 % Konfluenz, eine Phase von hellen Zellen ist sichtbar
Fibroblasten-gebundene Population 1	100 % Konfluenz, eine Phase von hellen Zellen ist sichtbar
Fibroblasten-gebundene Population 1a	100 % Konfluenz, eine Phase von hellen Zellen ist sichtbar
Fibroblasten-gebundene Population 2	Bruchstücke

Tabelle 45 Spender 401: P0-Zellernten (Kulturen nach 12 Tagen)

Fraktion	Zellen/cm² überimpft	Zellen/cm² geerntet	% Ausbeute
Zellen geringer Dichte	8,0 × 10⁴	1,7 × 10⁴	21
Fibroblasten-ungebunden	8,0 × 10⁴	6,7 × 10²	0,08
Population 1	8,9 × 10²	1,7 × 10³	196
Population 2	1,7 × 10³	7,1 × 10²	42

Tabelle 46 Spender 438: P0-Zellernten (Kulturen nach 14 Tagen)

Fraktion	Zellen/cm² überimpft	Zellen/cm² geerntet	Expansionsfaktor
Zellen geringer Dichte	8,0 × 10⁴	4,5 × 10⁴	0,6
Population 1	6,0 × 10²	4,2 × 10⁴	70
Population 1a	6,0 × 10²	4,6 × 10⁴	77
Population 2	9,6 × 10³	0	0

Tabelle 47 P1-Zellen (Kulturen nach 7 Tagen)

Fraktion	Zellen/cm² überimpft	Zellen/cm² geerntet	Expansionsfaktor
401, Zellen geringer Dichte	6,7 × 10³	3,6x × 10⁴	5
401, Population 1	0,3 × 10³	2,5 × 10⁴	90,0
438, Zellen geringer Dichte	6,1 × 10³	2,3 × 10⁴	4
438, Population 1	5,7 × 10³	2,1 × 10⁴	4
438, Population 1a	6,2 × 10³	2,6 × 10⁴	5

Tabelle 48 Fließanalyse von P1-Kulturen, Spender 401(1)

Fraktion	% MSC-Phänotyp	% CD45+
Zellen geringer Dichte	99,2	0,2
Population 1	99,8	<0,1

Tabelle 49 Ergebnisse des in vivo-Würfeltests, Spender 401(1)

Fraktion	Durchschnittliche Bewertung für 3 Würfel
Zellen geringer Dichte	0,3
Population 1	0,5
Negative Kontrolle	0

Tabelle 50 Spender 438: P2-Zellernte (Kulturen nach 7 Tagen)

Fraktion	Zellen/cm² überimpft	Zellen/cm² geerntet	Expansionsfaktor
Zellen geringer Dichte	5,4 × 10³	2,1 × 10⁴	3,8
Population 1	5,3 × 10³	2,4 × 10⁴	4,5
Population 1a	5,3 × 10³	2,2 × 10⁴	4,2

Tabelle 51 Fließanalyse von P2-Kulturen, Spender 438(2)

Spender/Fraktion	% MSC-Phänotyp	% CD45+
Zellen geringer Dichte	99,9	<0,1
Population 1	99,9	<0,1
Population 1a	99,9	<0,1

Tabelle 52 Spender 438(2): Adipogenese-Ergebnisse

	% Fläche mit Vakuolen
Fraktion	Adipogenese-Medium	Adipogenese-Erhaltungsmedium	Humanes MSC-Medium
Zellen geringer Dichte	40	0	0
Population 1	40	0	0
Population 1a	40	0	0

Alle Proben ergaben positive Messergebnisse gemäß Bewertung nach eingeführten Kriterien. Tabelle 53 Spender 438(2): Osteogenese-Ergebnisse

	Calcium, μg/Schale		Calcium, μg/Million Zellen
Fraktion	Kontrolle	OS	Kontrolle	OS
Zellen geringer Dichte	1,0	16,2	5,1	12,9
Population 1	1,1	18,0	7,2	15,1
Population 1a	1,1	14,4	5,8	12,8

Alle Proben ergaben positive Messergebnisse gemäß Bewertung nach angeführten Kriterien. Tabelle 54a Spender 438(2): Chondrogenese-Ergebnisse; Toluidinblau-Ergebnisse

Toluidinblau (%)

Fraktion Tag 7 Tag 14 Tag 21 Tag 28

Zellen geringer Dichte 60 40 70 100

Population 1 70 100 90 100

Population 1a 90 100 100 100

Tabelle 54b Spender 438(2): Chondrogenese-Ergebnisse; Kollagen-Typ II-Ergebnisse

Anti-Kollagen-Typ II (%)

Fraktion Tag 7 Tag 14 Tag 21 Tag 28

Zellen geringer Dichte 0 0 30 50

Population 1 0 100 70 80

Population 1a 0 90 100 80

Tabelle 54c Spender 438(2): Chondrogenese-Ergebnisse; Pelletgröße

Durchmesser (mm)

Fraktion Tag 7 Tag 14 Tag 21 Tag 28

Zellen geringer Dichte 1,0 0,8 0,9 1,0

Population 1 0,8 1,2 1,5 1,5

Population 1a 1,0 1,4 1,6 1,5
Alle Proben ergaben positive Messergebnisse gemäß Bewertung nach eingeführten Kriterien.
Um den Phänotyp des MSC-Vorläufers zu definieren, wurden Fibroblasten-gebundene Knochenmarkzellen geringer Dichte mit anti-SH3 und anti-CD14 gefärbt und unter Anwendung von Fließzytometrie sortiert.
Dies führte zur Sortierung von Population 1, Population 1a und Population 2. Alle diese drei Populationen waren SH3+-hell. Die Population 1 war CD14+ mit einer matten Färbungsintensität. Die Population 1a war CD45+ mit einer matten Färbungsintensität. Die Population 2 war CD14+ mit einer hellen Färbungsintensität. MSCs wurden aus Population 1- und Population 1a-Zellfraktionen gezüchtet, was durch Fließanalyse und biologische in vitro- und in vivo-Tests bestätigt wurde. Es wurde festgestellt, dass eine Population 1/1a-Zelle in 10⁵ Knochenmarkzellen geringer Dichte vorhanden ist.

Claims

Isolierte Population von humanen mesenchymalen Stammzellen, umfassend humane mesenchymale Stammzellen, die in bezug auf CD45+ so angereichert sind, dass die Zellpopulation weniger als 5 % Zellen enthält, bei denen es sich nicht um CD45+-Zellen handelt.
Isolierte Population von humanen mesenchymalen Stammzellen nach Anspruch 1, wobei die humanen mesenchymalen Stammzellen, die CD45+ sind, ferner mit mindestens einem monoklonalen Antikörper reaktiv sind, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SH2-Antikörper, SH3-Antikörper und SH4-Antikörper besteht.
Isolierte Zellpopulation nach Anspruch 2, wobei die humanen mesenchymalen Stammzellen SH3+ und CD45+ sind.
Isolierte Zellpopulation nach Anspruch 2, wobei die humanen mesenchymalen Stammzellen SH2+ und CD45+ sind.
Zusammensetzung, umfassend eine isolierte Population von humanen mesenchymalen Stammzellen nach Anspruch 1, die einen Fibroplasten-Oberflächenmarker tragen.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, ferner umfassend CD14+-Zellen.
Verfahren zum Isolieren einer Population von humanen mesenchymalen Stammzellen nach Anspruch 1, umfassend (a) das Erhalten einer angereicherten Population von humanen mesenchymalen Stammzellen; gekennzeichnet durch (b) Auswählen von Zellen, die CD45+ sind, aus der Zellpopulation von (a) unter Verwendung eines Antikörpers, der CD45 erkennt.
Verfahren zum Isolieren einer Population von humanen mesenchymalen Stammzellen nach Anspruch 1, die SH3+ und CD45+ sind, umfassend (a) das Erhalten einer angereicherten Population von humanen mesenchymalen Stammzellen, die SH3+ sind; gekennzeichnet durch (b) Auswählen von Zellen, die CD45+ sind, aus der Zellpopulation von (a) unter Verwendung eines Antikörpers, der CD45 erkennt.
Verfahren zum Isolieren einer Population von humanen mesenchymalen Stammzellen nach Anspruch 1, die SH2+ und CD45+ sind, umfassend: (a) das Erhalten einer angereicherten Population von humanen mesenchymalen Stammzellen, die SH2+ sind; gekennzeichet durch (b) Auswählen von Zellen, die CD45+ sind, aus der Zellpopulation von (a) unter Verwendung eines Antikörpers, der CD45 erkennt.
Verfahren zum Isolieren einer Population von humanen mesenchymalen Stammzellen nach Anspruch 1, die Fibroblasten+, SH3+ und CD45+ sind, umfassend (a) das Erhalten einer angereicherten Population von humanen mesenchymalen Stammzellen; gekennzeichet durch (b) Auswählen von Zellen, die Fibroblasten+, SH3+ und CD45+ sind, aus der Zellpopulation von (a) unter Verwendung eines Antikörpers, der CD45 erkennt.
Verwendung von humanen mesenchymalen Stammzellen nach Anspruch 1 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung eines Patienten.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die humanen mesenchymalen Stammzellen SH3+ und CD45+ sind.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die humanen mesenchymalen Stammzellen SH2+ und CD45+ sind.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das pharmazeutische Präparat zur Erzielung von Knochenbildung zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das pharmazeutische Präparat zur Behandlung oder Reparatur eines Bindegewebedefekts beim Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem Defekt um einen Knochendefekt handelt.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem Defekt um einen Knorpeldefekt handelt.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das pharmazeutische Präparat zu verabreichen ist, um das Engraftment von hämatopoetischen Stammzellen oder Progenitorzellen bei einem behandlungsbedürftigen Patienten zu verstärken.
Isolierte humane mesenchymale CD45+-Stammzellen nach Anspruch 1, die mit einem exogenen genetischen Material, das für ein zu exprimierendes Protein kodiert, transfiziert sind.