ES2292245T3 - Celulas madre mesenquimaticas cd45+ y/o fibroblasto+humanas. - Google Patents
Celulas madre mesenquimaticas cd45+ y/o fibroblasto+humanas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2292245T3 ES2292245T3 ES99926044T ES99926044T ES2292245T3 ES 2292245 T3 ES2292245 T3 ES 2292245T3 ES 99926044 T ES99926044 T ES 99926044T ES 99926044 T ES99926044 T ES 99926044T ES 2292245 T3 ES2292245 T3 ES 2292245T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- cell
- population
- stem cells
- mesenchymal stem
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
Una población aislada de células madre mesenquimáticas humanas que comprende células madre mesenquimáticas humanas, que se ha enriquecido para CD45+, de modo que la población celular contiene menos del 5% de células que no son células CD45+.
Description
Células madre mesenquimáticas CD45+ y/o
fibroblasto+humanas.
Esta solicitud se basa en la solicitud
provisional de Estados Unidos Nº de serie 60/087.123 presentada el
29 de mayo de 1998.
Las células madre mesenquimáticas (MSC) son los
blastocitos pluripotenciales de formación encontrados entre otros
en médula ósea, sangre, dermis y periostio que son capaces de
diferenciarse en más de un tipo específico de tejido mesenquimático
o conectivo (es decir, los tejidos del cuerpo que soportan los
elementos especializados; por ejemplo, los tejidos adiposo, óseo,
estroma, cartilaginoso, conectivos elástico y fibroso) dependiendo
de diversas influencias de factores bioactivos, tales como
citoquinas. El potencial de diferenciarse en células tales como
osteoblastos y condrocitos se retiene después del aislamiento y
expansión en cultivo; la diferenciación sucede cuando las células
se inducen in vitro en condiciones específicas o se colocan
in vivo en el sitio de tejido dañado.
Los epítopos de la superficie de las células
madre mesenquimáticas humanas (hMSC) son reactivos con ciertos
anticuerpos monoclonales conocidos como SH2, SH3 y SH4 descritos en
la Patente de Estados Unidos Nº 5.486.359. Estos anticuerpos pueden
usarse como reactivos para explorar y capturar la población de
células madre mesenquimáticas a partir de una población celular
heterogénea, tal como existe, por ejemplo, en la médula ósea.
Las células madre hematopoyéticas (HSC) son los
blastocitos pluripotenciales de formación encontrados entre otros
en médula ósea y sangre periférica que son capaces de diferenciarse
en cualquiera de los tipos específicos de células hematopoyéticas o
sanguíneas, tales como eritrocitos, linfocitos, macrófagos y
megacariocitos. La expresión de un antígeno o antígenos
particulares en la superficie celular o en el citoplasma y la
intensidad de expresión indican la fase de maduración y compromiso
de linaje de la célula madre hematopoyética. Las células madre
hematopoyéticas humanas (hHSC) son reactivas con ciertos anticuerpos
monoclonales, tales como CD34, reconocidos como específicos para
células hematopoyéticas.
Por tanto, las células madre hematopoyéticas
humanas y las células madre mesenquimáticas humanas han sido
fácilmente distinguibles por sus perfiles inmunoespecíficos.
La presente invención proporciona una población
de células madre mesenquimáticas humanas potenciada en células que
son positivas para los marcadores de anticuerpos CD45. Como se ha
indicado anteriormente en este documento, una célula madre
mesenquimática es una que es capaz de diferenciarse en más de un
tipo específico de célula de tejido mesenquimático. Los
solicitantes han proporcionado una población de células madre
mesenquimáticas precursoras ("pre-MSC") que es
positiva para CD45. Estas células madre mesenquimáticas precursoras
pueden diferenciarse en los diversos linajes mesenquimáticos, por
ejemplo, los linajes de condrocitos, adipocitos y osteoblastos.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una población de células madre mesenquimáticas humanas
que son CD45 positivas y positivas para al menos uno de los
marcadores SH2, SH3 o SH4. Las células madre mesenquimáticas de la
presente invención son preferiblemente positivas para al menos el
marcador SH3. En otro aspecto, las células madre mesenquimáticas
precursoras son positivas para el marcador SH2.
Estas células madre mesenquimáticas precursoras
pueden obtenerse usando anticuerpos contra marcadores de células
mesenquimáticas y hematopoyéticas. Inesperadamente, se descubrió que
una cantidad significativa de células positivas para marcadores
seleccionados de células madre mesenquimáticas estaban
adicionalmente caracterizadas como CD45 positivas. CD45 es un
marcador habitualmente encontrado en leucocitos y células
hematopoyéticas y no en células madre mesenquimáticas cultivadas.
Aunque no se pretender limitarse por ninguna teoría, se cree que la
población de células de la presente invención comprende de células
precursoras a células madre mesenquimáticas más maduras, aunque no
comprometidas.
La invención proporciona adicionalmente un
método para recuperar una población aislada de células madre
mesenquimáticas humanas CD45+ de médula ósea u otra fuente de
células madre mesenquimáticas de un individuo (i) obteniendo tejido
de médula ósea u otra fuente de tejido de células madre
mesenquimáticas de un donante; (ii) aislando una población de
células enriquecida en células madre mesenquimáticas de la misma; y
(iii) seleccionando adicionalmente células CD45+ de la población de
células madre mesenquimáticas humanas para obtener una población de
células madre mesenquimáticas que esté enriquecida en células madre
mesenquimáticas CD45+.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona un método para recuperar una población aislada de
células madre mesenquimáticas humanas CD45+ que también son
positivas para al menos un marcador SH2, SH3 o SH4 de médula ósea u
otra fuente de células madre mesenquimáticas de un individuo (i)
obteniendo tejido de médula ósea u otra fuente de células madre
mesenquimáticas de un donante, (ii) aislando una población de
células enriquecida en células madre mesenquimáticas de la misma;
(iii) seleccionando de la población celular una población de
células madre mesenquimáticas que sea positiva para al menos un
marcador SH2, SH3 o SH4; y (iv) seleccionado adicionalmente células
CD45+ de la población de células madre mesenquimáticas humanas de la
etapa (iii) para obtener una población de células madre
mesenquimáticas que sea positiva para al menos un marcador SH2, SH3
o SH4 y CD45+. En una realización preferida, la población celular
CD45 es al menos SH3 positiva.
La Figura 1 muestra histogramas FACScan para la
expresión de antígenos de superficie celular CD45 en las tres
fracciones de células madre mesenquimáticas humanas: Fig. 1A
pre-fraccionamiento; Fig. 1B fracción negativa a
selección SH3; Fig. 1C fracción positiva a selección SH3.
La Figura 2 muestra los resultados del ensayo de
deposición de calcio descrito en el Ejemplo 5.
La presente invención implica el aislamiento y
potenciación de una subpoblación de células madre mesenquimáticas
humanas. En una realización, la presente invención proporciona una
población de células que tienen un fenotipo SH3+/CD45+ y que se
cree que son células madre mesenquimáticas precursoras. La población
de células madre mesenquimáticas humanas de la presente invención
es capaz de diferenciarse en los linajes celulares de condrocitos,
adipocitos y osteoblastos.
Las células madre mesenquimáticas de la presente
invención pueden aislarse de sangre periférica o médula ósea.
"Aisladas" como se usa en este documento significa que las
células se ponen en condiciones diferentes a su entorno natural. El
término "aisladas" no excluye el uso posterior de estas células
después de ello en combinaciones o mezclas con otras células. Se ha
descrito un método para preparar cultivos de células madre
mesenquimáticas de médula humana en la Patente de Estados Unidos Nº
5.486.359. Los especialistas en la técnica conocen varias técnicas
para el aislamiento rápido de células madre mesenquimáticas. Los
enfoques para el aislamiento de células madre mesenquimáticas
incluyen leucoféresis, fraccionamiento en gradiente de densidad,
inmunoselección y separación por adhesión diferencial.
Las células de la presente invención se
mantienen en medios de cultivo que pueden ser medios sin suero
definidos químicamente o pueden ser un "medio completo", tal
como el Medio de Eagle Modificado por Dulbecco Suplementado con
suero al 10% (DMEM). Se describen medios sin suero definidos
químicamente adecuados en la Patente de Estados Unidos Nº de Serie
08/464.599 y WO96/39487, y se describen "medios completos" en
la Patente de Estados Unidos Nº 5.486.359. El Medio Definido
Químicamente comprende un medio esencial mínimo tal como el Medio de
Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) (Gibco), suplementado con
albúmina de suero humano, lipoproteína Ex Cyte humana,
transferrina, insulina, vitaminas, aminoácidos esenciales y no
esenciales, piruvato sódico, glutamina y un mitógeno. Estos medios
estimulan el crecimiento de células madre mesenquimáticas sin
diferenciación.
Las células madre mesenquimáticas de la presente
invención aisladas de sangre periférica o médula ósea pueden
adicionalmente expandirse en cultivo. Las células pueden expandirse,
antes o después de su congelación. Los medios descritos en este
documento también son adecuados para la expansión en cultivo de las
células madre mesenquimáticas.
Las células madre mesenquimáticas aisladas de la
presente invención pueden purificarse adicionalmente. En una
realización preferida, "purificada" indica que la población
celular contiene menos del 5% de impurezas, siendo las impurezas,
por ejemplo, células que no son CD45+. La población celular
purificada después puede usarse en combinaciones o mezclas según sea
apropiado.
La presente invención contempla cualquier medio
adecuado para emplear anticuerpos monoclonales para separar células
madre mesenquimáticas de otras células, por ejemplo, las recuperadas
de médula ósea. Por consiguiente, se incluye en la presente
invención un método para producir una población de células madre
mesenquimáticas que comprende las etapas de proporcionar una
suspensión celular de tejido que contiene células madre
mesenquimáticas; poner en contacto la suspensión celular con uno o
una combinación de anticuerpos monoclonales que reconocen un
epítopo en las células madre mesenquimáticas; y separar y recuperar
de la suspensión celular las células unidas por los anticuerpos
monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden unirse a una fase
sólida y utilizarse para capturar células madre mesenquimáticas de
muestras tisulares. Las células unidas después pueden separarse de
la fase sólida por métodos conocidos dependiendo de la naturaleza
del anticuerpo y la fase sólida.
Los sistemas basados en anticuerpos monoclonales
apropiados para preparar la población celular deseada incluyen
columna de perlas magnéticas/partículas paramagnéticas utilizando
anticuerpos para selección positiva o negativa; separación basada
en afinidad a biotina o estreptavidina; y clasificación por
citometría de flujo de elevada velocidad de células madre
mesenquimáticas teñidas por inmunofluorescencia mezcladas en una
suspensión de otras células. Por tanto, el método de la presente
invención incluye el aislamiento de una población de hMSC y su
potenciación usando anticuerpos monoclonales producidos contra
antígenos superficiales expresados por hMSC derivadas de médula, es
decir SH2, SH3 o SH4. Los depósitos de los cultivos de línea celular
identificados como SH2, SH3 y SH4 están en el depósito de la
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
MD 20852, y están asignados a los números de acceso de la ATCC HB
10743, BH 10744 y HB 10745, respectivamente. Estos anticuerpos
monoclonales proporcionan sondas eficaces que pueden utilizarse para
identificar, cuantificar, y purificar células madre
mesenquimáticas, independientemente de su fuente en el cuerpo.
En una realización, el aislamiento de la
población celular de la presente invención puede comprender utilizar
una combinación de uno o más anticuerpos que reconocen un marcador
conocido en las células madre mesenquimáticas así como un
anticuerpo que reconoce CD45. Un método para dicha preparación de
las células precursoras de la presente invención es seleccionar
primero una población de células que expresan un marcador que
identifica células madre mesenquimáticas, por ejemplo, SH3 o SH2
por selección inmunomagnética de una muestra celular de médula ósea
humana de baja densidad. Como alternativa, se contempla que la
selección celular inicial puede basarse en el marcador CD45 y la
población celular puede caracterizarse adicionalmente usando los
anticuerpos monoclonales hMSC.
En otra realización, se contempla que una
población celular puede seleccionarse en base al marcador CD14.
CD14 es una proteína de membrana que funciona como un receptor para
endotoxinas (lipopolisacárido, LPS) y se expresa en gran medida en
la superficie de monocitos, pero no se expresa por progenitores
mieloides.
Por tanto, en un aspecto, en ciertas
realizaciones descritas en este documento, la población de células
madre mesenquimáticas Población 1 (Pob. 1) se identifica por FACS
por el brillo relativo de los anticuerpos teñidos con
inmunofluorescencia unidos a la misma como SH2 y SH3 brillante/CD45
débil/CD14 débil. En comparación, SH2 y SH3 están presentes en MSC
expandidas en cultivo; CD45 está ausente en MSC expandidas en
cultivo; y CD14 está ausente en MSC expandidas en cultivo.
En un aspecto adicional más de la invención,
puede seleccionarse una población celular en base a un marcador
superficial de fibroblastos, por ejemplo el anticuerpo
anti-fibroblastos encontrado en microperlas
anti-fibroblastos Miltenyi (Miltenyi Nº catalog.
506-01).
Se contempla adicionalmente que los métodos
descritos anteriormente en este documento pueden aplicarse a una
población de células madre mesenquimáticas expandidas en cultivo de
modo que las células que tienen un fenotipo Pob. 1 puedan aislarse
de la población de células madre mesenquimáticas expandidas en
cultivo.
La presente invención se refiere a diversos
métodos para utilizar las células madre mesenquimáticas humanas
CD45+ de la presente invención para propósitos terapéuticos y/o de
diagnóstico. Estos usos incluyen regenerar tejidos mesenquimáticos
que se han dañado a través de una lesión aguda, expresión genética
anormal o enfermedad adquirida; tratar a un hospedador que tiene
tejido mesenquimático dañado por la retirada de pequeñas alícuotas
de médula ósea, aislamiento de sus células madre mesenquimáticas y
el tratamiento del tejido dañado con las hMSC CD45+ combinadas con
un material vehículo biocompatible adecuado para suministrar las MSC
a los sitios de tejido dañado; producir diversos tejidos
mesenquimáticos; detectar y evaluar factores de crecimiento o
factores inhibidores pertinentes para la
auto-regeneración de las MSC y la diferenciación en
linajes mesenquimáticos comprometidos; y desarrollar linajes
celulares mesenquimáticos y ensayar factores con desarrollo de
tejido mesenquimático.
Las hMSC de la presente invención pueden usarse
en una diversidad de modos. Por ejemplo, las hMSC pueden emplearse
como parte de una terapia de reemplazo celular. Específicamente, las
hMSC pueden infundirse solas o añadidas a células de médula ósea
para procedimientos de transplante de médula ósea. Otras
aplicaciones también contempladas particularmente son ortopédicas,
tales como aumento de la formación ósea. Otras aplicaciones
incluyen, por ejemplo, el tratamiento de osteoartritis,
osteoporosis, afecciones traumáticas o patológicas que implican
cualquiera de los tejidos conectivos, tales como defectos óseos,
defectos del tejido conectivo, defectos esqueléticos o defectos del
cartílago. También se contempla que puede introducirse material
genético exógeno en las células mientras están ex vivo, y
que las células pueden readministrarse para la producción de
proteínas exógenas in vivo. La modificación genética de las
células madre mesenquimáticas se analiza más completamente en la
Patente de Estados Unidos Nº 5.591.625.
La presente invención no se limita a un método
específico para recuperar las células. Por ejemplo, dichas células
pueden aislarse por procedimientos que no usen anticuerpos, con la
condición de que las células sean positivas para CD45 y son
positivas para al menos uno de SH2, SH3 o SH4, preferiblemente al
menos SH3, y sean capaces de diferenciarse en uno o más de un
linaje de células mesenquimáticas, y preferiblemente en la mayoría,
sino todos, los linajes de células mesenquimáticas. En una
realización particularmente preferida, las células también son
capaces de auto-renovación. Por tanto, una célula
madre mesenquimática humana que sea SH3+ y CD45+ de acuerdo con la
invención puede recuperarse por técnicas diferentes al uso de
anticuerpos SH3+ y CD45+. Por tanto, la expresión "célula madre
mesenquimática humana que es SH3+ y CD45+" significa una célula
madre que tiene ambos marcadores y que es capaz de diferenciarse en
más de un linaje de células madre mesenquimáticas.
A continuación se proporcionan ejemplos para
ilustrar adicionalmente y describir la presente invención; sin
embargo, no se pretende que el alcance de la presente invención se
limite por ellos.
Se obtuvieron aspirados de médula ósea de tres
voluntarios, donantes 271, 281 y 332. Se realizó una centrifugación
por densidad de los aspirados de médula ósea usando solución de
Densidad de Flotación de Terapia Celular Activada (ACT) (1,0720
g/ml) en tubos cónicos (Dendreon, Mountain View CA) y se aislaron
las células de la fracción de baja densidad. Las células se lavaron
y se resuspendieron en PBS de Dulbecco a una concentración de 2 x
10^{7} células/ml. Las células se incubaron con anticuerpo de
bloqueo (1 mg IgG humana/ml en PBS sin azida) durante 10 minutos a
4ºC con rotación seguido de una incubación de 30 minutos a 4ºC con 1
\mug de anticuerpos SH3/1 x 10^{7} células. Las células de los
donantes 1 y 2 se lavaron dos veces con PBS/BSA al 0,5% y se
resuspendieron en PBS a 2 x 10^{7} células/ml. Se añadieron perlas
Dynal (lavadas 3 veces con PBS) y la suspensión se mezcló durante
30 minutos a 4ºC. Las células unidas se separaron magnéticamente de
las células no unidas. Las células del donante 332 se lavaron 2x
con tampón de Miltenyi y se incubaron durante 20 minutos a 4ºC con
mezcla con perlas de anticuerpo de rata anti-lgG2 de
ratón (1 ml de microperlas por 5 x 10^{8} células) (50 nm Miltenyi
Biotec, Auburn, CA) y se seleccionaron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Se analizaron tres poblaciones celulares de cada
donante: la fracción de inicio (células sin separar de baja
densidad), células SH3 seleccionadas (células unidas a las perlas
magnéticas derivatizadas) y células SH3 no seleccionadas (células
que no se unieron a las perlas derivatizadas). Los contenidos de
células madre hematopoyéticas y mesenquimática de las tres muestras
se ensayaron como se describe a continuación.
Cantidades de Células. Las cantidades de
células contenidas en las fracciones se muestran en la Tabla 1. Las
fracciones SH3 seleccionadas contenían un 4,2, 4,8, y 6,2% de las
células de inicio. Las fracciones SH3 no seleccionadas produjeron un
88, 70, y 87% de las células de inicio.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo F de Unidades Formadores de
Colonias. El ensayo CFU-F mide colonias que han
crecido en medios de cultivo completos. Se suspendieron células
nucleadas en medio hMSC a una concentración de 2 x 10^{6} células
en 40 ml, y se sembraron en placas de cultivo tisular de 100 mm a 5
x 10^{5} células por placa. Después de 14 días se fijaron las
células con glutaraldehído y se tiñeron con violeta de cristal. Los
resultados se muestran en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción SH3 seleccionada mostró
enriquecimiento para las colonias en comparación con la muestra
celular de inicio; de hecho, la fracción seleccionada en Miltenyi
(donante 332) tuvo demasiadas colonias para contarlas. En la
fracción SH3 no seleccionada uno de los 3 ensayos
CFU-F tuvo solamente 0,7 colonias por 50.000 células
sembradas, mientras que los otros 2 cultivos no tuvieron
crecimiento de colonias.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Cultivo de células madre mesenquimáticas.
Se añadieron 3,2 x 10^{6} células de los Donantes 271 y 281 en 2
pocillos de una placa de 6 pocillos. Las células se recogieron
después de 13 días en cultivo. Los resultados se muestran en la
Tabla 4.
Para la muestra del donante 332 cada pocillo se
sembró con 0,8 x 10^{6} células. En el Día 11, en base al examen
microscópico, se recogieron dos de los cuatro pocillos de células
SH3 seleccionadas. Todos los demás pocillos se recogieron después
de 14 días en cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
Los resultados de los cultivos de MSC mostraron
que las células SH3 seleccionadas se expandieron con la misma o
mayor eficacia que la fracción celular de inicio y las células
recogidas tenían la morfología y fenotipo distintivos de MSC. En
medio de cultivo completo de MSC después del cultivo primario el
rendimiento celular de esta fracción SH3 no seleccionada fue bajo
(1,3, 3,8, y 1,6%) en comparación con las fracciones celulares de
inicio (17,5, 19,4, y 44,5%, respectivamente).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las células de los donantes 271 y 281
continuaron en cultivo y las células del Pase 1 se recogieron y se
examinaron por citometría de flujo; las células eran MSC por
morfología y fenotipo. La observación visual de estos cultivos
durante P0 mostró que las colonias tipo MSC también contenían
células con perlas magnéticas unidas. Las células se volvieron a
sembrar en matraces o pocillos dependiendo de las células totales
disponibles. Las células se recogieron después de 8 días en
cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron las células cultivadas de la
recogida SH3 seleccionada del Día 11. Las células eran SH2+, SH3+,
SH4+ y CD45-, correspondientes a un fenotipo de célula madre
mesenquimática cultivada madura.
Análisis de Citometría de Flujo. Las
fracciones celulares del Donante 332 se analizaron usando marcadores
antigénicos SH3 y CD45. La Figura 1 muestra el histograma FACS del
análisis CD45.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de las Tablas 7a y b del análisis
de flujo de la muestra del donante 332 demostraron una pureza de
SH3 del 98,8% con siendo más del 99,5% de estas células CD45+. La
cantidad total de células CD45- en la muestra fue del 0,42%.
Los resultados indicaron que el precursor para
la célula madre mesenquimática observado en cultivo era SH3 positivo
y CD45 positivo y esta célula puede aislarse usando anticuerpos
contra SH3 junto con perlas inmunomagnéticas u otros métodos de
inmunoselección.
Se usaron anticuerpos anti-SH2
conjugados con biotina y microperlas magnéticas de anticuerpos de
rata anti-IgG1 de ratón para aislar dos fracciones
de células de las células de médula ósea de baja densidad: SH2
unidas y SH2 no unidas. Estas fracciones celulares se pusieron en
condiciones de cultivo de MSC convencionales para determinar el
potencial proliferativo MSC de la población celular contenida en
estas fracciones.
Las microperlas anti-IgG1 eran
de Miltenyi Lote Nº NE7200. La Columna VS era de Miltenyi Lote Nº
0231. Los filtros de pre-separación eran de 30
\mum de Miltenyi Lote Nº 55. Tampón de Miltenyi: solución salina
tamponada con fosfato pH 7,2 suplementada con BSA al 0,5% y EDTA 2
mM. Se realizó tinción de flujo usando las instrucciones sugeridas
por el fabricante. El análisis de flujo se realizó usando el FACS
Calibur o el FACS Vantage. La viabilidad celular y la cantidad de
células se determinaron usando azul tripán.
Se aislaron células de baja densidad de un
aspirado de médula ósea humana (donante Nº 426) usando solución
BDS72 de Dendreon (Seattle, WA) siguiendo una centrifugación por
densidad de los aspirados de médula ósea. Se retiraron alícuotas
como controles para el análisis de flujo y cultivo celular. Las
células restantes se diluyeron a un recuento celular de 2 x
10^{7} células/ml usando tampón de Miltenyi. Las células se
incubaron con IgG a 40 \mul por ml de suspensión celular durante
10 minutos a 4ºC con mezcla. La células se centrifugaron durante 10
minutos a 1000 RPM. El sedimento celular se incubó con el anticuerpo
anti-SH2 a 10 \mug por 1 x 10^{7} células
durante 30 minutos a 4ºC con mezcla. Las células se lavaron dos
veces con tampón frío. El sedimento celular se resuspendió en
tampón de Miltenyi (80 \mul de tampón por 10^{7} células). Se
añadieron microperlas anti-lgG1 (20 \mul de
perlas por 10^{7} células). La mezcla se incubó a 4ºC durante 15
minutos con mezcla. Se añadió tampón de Miltenyi para diluir la
mezcla y lavar las células. Las células se centrifugaron durante 10
minutos a 1000 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de
Miltenyi (0,5 ml de tampón por 10^{8} células). La columna VS se
preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. El
pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones
del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al
pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la
columna. El efluente se recogió como la fracción "SH2 no
unida". La columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de
Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "SH2 no
unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo
etiquetado "SH2 unida". Se añadieron cinco ml de tampón de
Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las
células en el tubo. Se preparó una columna nueva y se añadieron las
células del tubo "SH2 unida" a la segunda columna. La
suspensión de células/microperlas se añadió al
pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la
columna. El efluente se recogió como la fracción "SH2 no
unida". La columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de
Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "SH2 no
unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo
etiquetado "SH2 unida". Se añadieron cinco ml de tampón de
Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar
las células en el tubo. Se realizaron recuentos celulares y ensayos
de viabilidad. Las células de las fracciones unida y no unida se
tiñeron para el análisis de flujo. Las células no unidas y unidas
se pusieron en cultivo. Las células se recogieron después de 14
días. Las células de la fracción de células de baja densidad y la
fracción SH2 unida se tiñeron para el análisis de flujo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La selección de células SH2 de células de médula
ósea de baja densidad usando el sistema de microperlas Miltenyi
produjo menos del 2% de las células de baja densidad en la fracción
SH2 unida. El aislamiento produjo una fracción celular que contenía
células que eran un 98,3% SH2+. Las células SH2 unidas eran un 90%
confluyentes con células ahusadas después de 14 días en cultivo en
condiciones de cultivo de MSC convencionales. El cultivo de las
células SH2 unidas produjo una población de células adherentes que
tenían un fenotipo MSC por análisis de flujo y morfología. Se
aislaron muy pocas células adherentes de la fracción de células SH2
no unidas. Estos resultados muestran que SH2 es un antígeno
presente en el precursor MSC así como en las MSC expandidas en
cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha informado de que cultivos MSC P0 contienen
una media del 9% de células CD45+ (intervalo, del 0,5 al 50%),
mientras que el fenotipo expandido en cultivo de MSC es CD45
negativo. Se realizó una selección CD45 de células P0 en tres
donantes para determinar si las MSC podrían cultivarse a partir de
la fracción de células CD45 unidas.
Las microperlas anti-CD45 eran
de Miltenyi (Lote Nº NE5848). La Columna de Separación de Células
Grandes era de Miltenyi (Nº Cat. 422-02). Tampón de
Miltenyi: solución salina tamponada con fosfato pH 7,2 suplementada
con BSA al 0,5% y EDTA 2 mM. La tinción de flujo se realizó usando
las instrucciones sugeridas por el fabricante. El análisis de flujo
se realizó usando el FACS Calibur o el FACS Vantage. Se determinaron
la viabilidad celular y la cantidad de células usando azul
tripán.
\newpage
Las MSC P0 se obtuvieron de las células de
médula ósea humana de baja densidad (donantes Nº 394 (0), Nº 386
(0) y Nº 381 (0)). Se retiraron muestras de 0,5 - 5,0 x 10^{6}
células como controles para el análisis de flujo. Las células
restantes se diluyeron a un recuento celular de 2 x 10^{7}
células/ml usando Tampón de Miltenyi; si el recuento era < 2 x
10^{7} células/ml se saltaba esta etapa. Las células se incubaron
con IgG a 40 \mul por ml de suspensión celular durante 10 minutos
a 4ºC con mezcla. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a
1100 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi
(80 \mul de tampón por 10^{7} células). Se añadieron
microperlas anti-CD45 (20 \mul de perlas por
10^{7} células). La mezcla se incubó a 4ºC durante 15 minutos con
mezcla. Se añadió tampón de Miltenyi para diluir la mezcla y lavar
las células. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1100
RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (0,5
ml de tampón por 10^{8} células). La Columna de Separación de
Células Grandes se preparó siguiendo las instrucciones del
fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió a la
columna y la suspensión se drenó a través de la columna. El efluente
se recogió como la fracción "CD45 no unida". La columna se
aclaró tres veces con 0,5 ml de tampón de Miltenyi y este efluente
se añadió a la fracción "CD45 no unida". La columna se retiró
del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado "CD45 unida". Se
añadió un ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo
de jeringa para empujar las células en el tubo. Se preparó una
columna de células grandes nueva siguiendo las instrucciones del
fabricante y las células del tubo "CD45 unida" se añadieron a
la segunda columna. La suspensión de células/microperlas se añadió a
la columna y la suspensión se drenó a través de la columna. El
efluente se recogió como la fracción "CD45 no unida". La
columna se aclaró tres veces con 0,5 ml de tampón de Miltenyi y este
efluente se añadió a la fracción "CD45 no unida". La columna
se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado "CD45
unida". Se añadió un ml de tampón de Miltenyi a la columna y se
usó un émbolo de jeringa para empujar las células en el tubo. Se
realizaron recuentos celulares y ensayos de viabilidad. Las células
de las fracciones unida y no unida (Nº 394) y la fracción no unida
(Nº 386 y Nº 381) se tiñeron para el análisis de flujo. Las células
se pusieron en cultivo. Las células se recogieron y se pasaron
hasta que estuvo disponible una cantidad adecuada de células para el
análisis de flujo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La selección CD45 de MSC P0 produjo una
población celular que era < 2% de la población P0 de inicio. Las
células CD45 unidas cultivadas aisladas a partir de las MSC P0
produjeron MSC definidas por citometría de flujo y morfología. La
fracción celular CD45 no unida aislada de MSC P0 también produjo MSC
definidas por citometría de flujo y morfología. El fenotipo del
precursor MSC parecía ser CD45 débil.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionaron células de baja densidad
aisladas de médula ósea usando directamente microperlas Miltenyi
anti-CD45 conjugadas (Miltenyi Lote Nº NE5848)
siguiendo las instrucciones del fabricante. La Columna VS era de
Miltenyi (Lote Nº 0231). Los filtros de
pre-separación de 30 \mum eran de Miltenyi (Lote
55). Tampón de Miltenyi: solución salina tamponada con fosfato pH
7,2 suplementada con BSA al 0,5% y EDTA 2 mM. La tinción de flujo
se realizó usando las instrucciones sugeridas por el fabricante. El
análisis de flujo se realizó usando el FACS Calibur o el FACS
Vantage. Se determinaron la viabilidad celular y la cantidad de
células usando azul tripán.
Se aislaron células de baja densidad de aspirado
de médula ósea humana (donante Nº 358) usando solución BDS72 de
Dendreon siguiendo una centrifugación por densidad de los aspirados
de médula ósea. Se retiraron alícuotas como controles para el
análisis de flujo y cultivo celular. Las células restantes se
diluyeron a un recuento celular de 2 x 10^{7} células/ml usando
tampón de Miltenyi. Las células se incubaron con IgG a 40 \mul
por ml de suspensión celular durante 10 minutos a 4ºC con mezcla.
Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. El
sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (80 \mul de
tampón por 10^{7} células). Se añadieron microperlas
anti-CD45 (20 \mul de perlas por 10^{7}
células). La mezcla se incubó a 4ºC durante 20 minutos con mezcla.
Se añadió tampón de Miltenyi para diluir la mezcla y lavar las
células. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1000
RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (0,5
ml de tampón por 10^{8} células). La columna VS se preparó
siguiendo las instrucciones del fabricante. El
pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones
del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al
pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la
columna. El efluente se recogió como la fracción "CD45 no
unida". La columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de
Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "CD45 no
unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo
etiquetado "CD45 unida". Se añadieron cinco ml de tampón de
Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las
células en el tubo. Se preparó una columna nueva y las células del
tubo "CD45 unida" se añadieron a la segunda columna. El
pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones
del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al
pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la
columna. El efluente se recogió como la fracción "CD45 no
unida". La columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de
Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "CD45 no
unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo
etiquetado "CD45 unido". Se añadieron cinco ml de tampón de
Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las
células en el tubo. Se realizaron recuentos celulares y ensayos de
viabilidad. Las células de las fracciones unida y no unida se
tiñeron para el análisis de flujo. Las células se pusieron en
cultivo. Se recogieron y se contaron las células.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estaba presente el cuarenta y siete por ciento
de las células en la fracción CD45 unida. Esta población celular
CD45 unida era el 99% CD45 positiva por análisis de flujo y era
capaz de producir MSC en P0 definido por la morfología. La fracción
celular CD45 no unida era el 35% de las células totales
seleccionadas y era el 51,5% CD45 positiva. La intensidad de
fluorescencia de las células CD45 no unidas era muy inferior a la de
las células CD45 unidas. Esta fracción celular también era capaz de
producir MSC en cultivo P0 definido por la morfología. Este
experimento proporciona evidencias adicionales de que el precursor
MSC es CD45 positivo con una intensidad de tinción débil.
Se desarrollaron microperlas
anti-fibroblastos para la separación de células
basada en la expresión de un antígeno específico de fibroblastos.
Como las MSC cultivadas tienen una morfología de fibroblastos, se
usaron microperlas anti-fibroblastos para
seleccionar una fracción de células a partir de células de médula
ósea de baja densidad. Las células que se unieron y las que no se
unieron se pusieron en condiciones de cultivo de MSC convencionales
y se observaron.
Las microperlas
anti-fibroblastos eran de Miltenyi (Lote Nº NE630).
La Columna VS era de Miltenyi (Lote Nº 0231). Los filtros de
pre-separación de 30 \mum eran de Miltenyi (Lote
Nº 55). Tampón de Miltenyi: solución salina tamponada con fosfato
pH 7,2 suplementada con BSA al 0,5% y EDTA 2 mM. La tinción de flujo
se realizó siguiendo las instrucciones sugeridas por el fabricante.
El análisis de flujo se realizó usando el FACS Calibur o el FACS
Vantage. Se determinaron la viabilidad celular y la cantidad de
células usando azul tripán.
Los ensayos se realizaron del siguiente modo
para medir el potencial osteogénico y adipogénico de las
células.
Ensayo de adipogénesis. Se sembraron las
células en una placa de 6 pocillos (2 x 10^{5} células/pocillo)
en medios hMSC. Las MSC confluyentes se indujeron por pulsos con
medios de elevado contenido de glucosa que contenían dexametasona,
insulina,
3-isobutil-1-metil-xantina
e indometacina. Al final del periodo de cultivo, las placas se
fijaron con formalina al 10%, se tiñeron con Aceite Rojo "O" y
se contratiñeron con hematoxilina. Se observó la formación de
vacuolas lipídicas que se tiñeron de rojo y se
semi-cuantificaron por porcentaje de área
superficial de pocillo.
Ensayo de deposición de calcio
osteogénico. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (3
x 10^{4} células/pocillo). A los pocillos marcados como "OS"
se les suministró medios hMSC que contenían suplementos de ácido
ascórbico-2-fosfato, dexametasona y
\beta-glicerofosfato. A los pocillos marcados como
"Control" se les suministró medios hMSC convencionales. Se
realizaron cambios de los medios dos veces a la semana durante 14 a
16 días La deposición aumentada de calcio se midió a través de
ensayos colorimétricos semi-cuantitativos.
Se aislaron células de baja densidad de
aspirados de médula ósea humana (donantes Nº 373, Nº 386 y Nº 421)
usando solución BDS72 de Dendreon siguiendo una centrifugación por
densidad de los aspirados de médula ósea. Se retiraron alícuotas
como controles para cultivo celular. Las células restantes se
diluyeron a un recuento celular de 2 x 10^{7} células/ml usando
tampón de Miltenyi. Las células se incubaron con IgG a 40 \mul
por ml de suspensión celular durante 10 minutos a 4ºC con mezcla.
Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. El
sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (80 \mul de
tampón por 10^{7} células). Se añadieron microperlas
anti-fibroblastos (20 \mul de perlas por 10^{7}
células). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30
minutos con mezcla. Se añadió tampón de Miltenyi para diluir la
mezcla y lavar las células. Las células se centrifugaron durante 10
minutos a 1000 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón
de Miltenyi (1 ml de tampón por 10^{8} células). La columna VS se
preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. El
pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones
del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al
pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la
columna. El efluente se recogió como la fracción
"fibroblasto-no unida". La columna se aclaró
dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió
a la fracción "fibroblasto-no unida". La
columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado
"fibroblasto-unida". Se añadieron cinco ml de
tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para
empujar las células en el tubo. Se preparó una columna nueva y las
células del tubo "fibroblasto-unida" se
añadieron a la segunda columna. El pre-filtro se
preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. La suspensión
de células/microperlas se añadió al pre-filtro y la
suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió
como la fracción "fibroblasto-no unida". La
columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este
efluente se añadió a la fracción "fibroblasto-no
unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo
etiquetado "fibroblasto-unida". Se añadieron
cinco ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de
jeringa para empujar las células en el tubo. Se realizaron
recuentos celulares y ensayos de viabilidad. Las células de los
donantes 373 y 386 se pusieron en cultivo. Las células se
recogieron y se pasaron. Las células P0 del control de baja densidad
y los cultivos de células fibroblasto-unidas del
donante 373 se tiñeron para el análisis de flujo. Las células P0 del
donante 386 se pusieron en el ensayo de diferenciación osteogénica
in vitro y el ensayo adipogénico in vitro. Los
cultivos de los ensayos adipogénicos mostraron adipogénesis
significativa de las MSC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados del ensayo de calcio para las
fracciones celulares de baja densidad y
fibroblasto-unida del Donante 386(1) se
muestran en la Tabla 39 y la Figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción celular
fibroblasto-unida de células de médula ósea de baja
densidad representaba el 3-9% de la población
celular nucleada de inicio y se adherían a poliestireno. En
condiciones de cultivo de MSC convencionales, la fracción celular
fibroblasto-unida produjo una población de MSC
definida por citometría de flujo, ensayos biológicos y
morfología.
\vskip1.000000\baselineskip
Las microperlas
anti-fibroblastos eran de Miltenyi (Lote Nº NE6836).
La Columna VS era de Miltenyi (Lote Nº 0231). Los filtros de
pre-separación de 30 \mum eran de Miltenyi (Lote
Nº 55). Tampón de Miltenyi: solución salina tamponada con fosfato
pH 7,2 suplementada con BSA al 0,5% y EDTA 2 mM. Las perlas
magnéticas anti-CD14 eran de Dynal (Lote Nº
A93900). La tinción de flujo se realizó siguiendo las instrucciones
sugeridas por el fabricante. El análisis de flujo se realizó usando
el FACS Calibur o el FACS Vantage. Se determinaron la viabilidad
celular y la cantidad de células usando azul tripán.
Se aislaron células de baja densidad a partir de
un aspirado de médula ósea humana (donante Nº 391) usando solución
BDS72 de Dendreon siguiendo una centrifugación por densidad de los
aspirados de médula ósea. Se retiraron alícuotas como controles
para cultivo celular. Las células restantes se diluyeron a un
recuento celular de 2 x 10^{7} células/ml usando tampón de
Miltenyi. Las células se incubaron con IgG a 40 \mul por ml de
suspensión celular durante 10 minutos a 4ºC con mezcla. Las células
se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. El sedimento
celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (80 \mul de tampón
por 10^{7} células). Se añadieron microperlas
anti-fibroblastos (20 \mul de perlas por 10^{7}
células). La mezcla se incubó a 4ºC durante 15 minutos con mezcla.
Se añadió tampón de Miltenyi para diluir la mezcla y lavar las
células. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1000
RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (1
ml de tampón por 10^{8} células). La columna VS se preparó
siguiendo las instrucciones del fabricante. El
pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones
del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al
pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la
columna. El efluente se recogió como la fracción
"fibroblasto-no unida". La columna se aclaró
dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió
a la fracción "fibroblasto-no unida". La
columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado
"fibroblasto-unida". Se añadieron cinco ml de
tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para
empujar las células en el tubo. Se preparó una columna nueva y las
células del tubo "fibroblasto-unida" se
añadieron a la segunda columna. El pre-filtro se
preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. La suspensión de
células/microperlas se añadió al pre-filtro y la
suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió
como la fracción "fibroblasto-no unida". La
columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este
efluente se añadió a la fracción "fibroblasto-no
unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo
etiquetado "fibroblasto-unida". Se añadieron
cinco ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de
jeringa para empujar las células en el tubo. Se realizaron
recuentos celulares y ensayos de viabilidad. Las células no unidas
se pusieron en cultivo. Las células unidas se incubaron con perlas
magnéticas anti-CD14 Dynal a una concentración
celular de 2 x 10^{7} células por ml y una concentración de
perlas de 2 x 10^{7} perlas por ml durante 1 hora a 4ºC con
mezcla. La suspensión de células/perlas se puso cerca del imán
manual Dynal durante 2 minutos. Después de 2 minutos, las células
no unidas se decantaron en un tubo etiquetado "CD14 no unida".
El tubo de células/perlas se retiró del imán y se añadieron 5 ml de
tampón para resuspender las células. La suspensión de células/perlas
se puso cerca del imán manual Dynal durante 2 minutos. Después de 2
minutos, las células no unidas se decantaron en un tubo etiquetado
"CD14 no unida". El tubo de células/perlas se retiró del imán y
se añadieron 5 ml de tampón para resuspender las células. La
suspensión de células/perlas se puso cerca del imán manual Dynal
durante 2 minutos. Después de 2 minutos, las células no unidas se
decantaron en un tubo etiquetado "CD14 no unida". El tubo de
células/perlas se retiró del imán y se añadieron 5 ml de tampón para
resuspender las células. Las células que permanecieron unidas a las
perlas se contaron y se pusieron en cultivo en dos pocillos de 10
cm^{2}. Las células del tubo sin unión se colocaron cerca del
imán manual durante 2 minutos. Las células no unidas se decantaron,
se contaron y se sembraron en un pocillo de 10 cm^{2}. Las células
se recogieron después de 14 días. Las células cultivadas a partir
de las fracciones celulares de baja densidad y
fibroblasto-unida/CD14 unida se tiñeron para el
análisis de flujo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para definir adicionalmente el fenotipo del
precursor MSC, se realizó una selección celular secuencial usando
microperlas Miltenyi para seleccionar células
fibroblasto-unidas, seguida del uso de perlas
magnéticas Dynal para aislar células CD14 unidas a partir de la
fracción fibroblasto-unida. Esto es posible ya que
el tamaño de las microperlas es demasiado pequeño para impedir la
selección con Dynal.
Usando esta técnica, la fracción celular
fibroblasto-unida/CD14 unida era aproximadamente el
1,3% de la población celular de baja densidad de inicio. Las
células fibroblasto-unidas/CD14 unidas, cuando se
colocan en condiciones de MSC convencionales, se adherían a
matraces de poliestireno y después de 14 días de cultivo, producían
una población de MSC definida por análisis de flujo y
morfología.
En base a esta única selección, parecería que el
precursor MSC es una célula fibroblasto+, CD14+. Esto es inesperado
ya que la MSC expandida en cultivo es una célula fibroblasto+, CD14
negativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las microperlas
anti-fibroblastos eran de Miltenyi (Lote Nº NE7105).
La Columna VS era de Miltenyi (Lote Nº 0231). Los filtros de
pre-separación de 30 \mum eran de Miltenyi (Lote
Nº 55). Tampón de Miltenyi: solución salina tamponada con fosfato
pH 7,2 suplementada con BSA al 0,5% y EDTA 2 mM. La tinción de flujo
se realizó siguiendo las instrucciones sugeridas por el fabricante.
El análisis de flujo se realizó usando el FACS Calibur o el FACS
Vantage. La clasificación por flujo se realizó en el FACS Vantage.
La determinación de viabilidad celular y cantidad de células se
hizo usando azul tripán. El potencial osteogénico se midió usando el
método descrito en el Ejemplo 5 y con un ensayo de cubo osteogénico
in vivo descrito, por ejemplo, en la Patente de Estados
Unidos Nº 5.486.359. Se realizaron ensayos adipogénicos de acuerdo
con métodos descritos en el Ejemplo 5.
Los ensayos de condrogénesis se realizaron del
siguiente modo. Las células se sedimentaron en un tubo cónico de 15
ml (2,5 x 10^{5} células/gránulo) en medios condrogénicos,
compuestos por elevado contenido de glucosa, dexametasona y
TGF-\beta3. Los gránulos se sometieron a
histología para embeberlos, seccionarlos de forma delgada y
teñirlos histoquímicamente. La presencia de condrocitos se detectó
usando Azul de Toluidina, que tiñe proteoglicanos y con un
anticuerpo específico para colágeno de tipo II.
Se aislaron células de baja densidad de
aspirados de médula ósea humana (donantes Nº 401 y Nº 438) usando
solución BDS72 de Dendreon siguiendo una centrifugación por densidad
de los aspirados de médula ósea. Se retiraron alícuotas como
controles para el análisis de flujo y cultivo celular. Las células
restantes se diluyeron a un recuento celular de 2 x 10^{7}
células/ml usando tampón de Miltenyi. Las células se incubaron con
IgG a 40 \mul por ml de suspensión celular durante 10 minutos a
4ºC con mezcla. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a
1000 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi
(80 \mul de tampón por 10^{7} células). Se añadieron
microperlas anti-fibroblastos (20 \mul de perlas
por 10^{7} células). La mezcla se incubó a temperatura ambiente
durante 30 minutos con mezcla. Se añadió tampón de Miltenyi para
diluir la mezcla y lavar las células. Las células se centrifugaron
durante 10 minutos a 1000 RPM. El sedimento celular se resuspendió
en tampón de Miltenyi (1 ml de tampón por 10^{8} células). La
columna VS se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante.
El pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones
del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al
pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la
columna. El efluente se recogió como la fracción
"fibroblasto-no unida". La columna se aclaró
dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió
a la fracción "fibroblasto-no unida". La
columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado
"fibroblasto-unida". Se añadieron cinco ml de
tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para
empujar las células en el tubo. Se preparó una columna nueva y las
células del tubo "fibroblasto-unida" se
añadieron a la segunda columna. El pre-filtro se
preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. La suspensión
de células/microperlas se añadió al pre-filtro y la
suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió
como la fracción "fibroblasto-no unida". La
columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este
efluente se añadió a la fracción "fibroblasto-no
unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo
etiquetado "fibroblasto-unida". Se añadieron
cinco ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de
jeringa para empujar las células en el tubo. Se realizaron recuentos
celulares y ensayos de viabilidad.
Las células de la fracción
fibroblasto-no unida se tiñeron para el análisis de
flujo. Las células de la fracción fibroblasto-unida
se incubaron con anticuerpos anti-SH3,
anti-CD45 y anti-CD14. Se
clasificaron las células: el Donante 401 se clasificó en dos
grupos: población 1 y población 2. El Donante 438 se clasificó en
tres grupos: población 1, población 1a y población 2. Las células
de la fracción fibroblasto-no unida (solamente
Donante 401) y las poblaciones clasificadas se pusieron en cultivo.
Las células P0 se recogieron y se pasaron. Las células P1 de los
cultivos de baja densidad y población 1 del donante Nº 401 se
tiñeron para citometría de flujo y se pusieron en el ensayo de cubo
in vivo. Las células P1 para el donante Nº 438 se pasaron.
Las células P2 de los cultivos de baja densidad, población 1 y
población 1a del donante Nº 438 se tiñeron para citometría de flujo
y se pusieron en los ensayos biológicos in vitro
(osteogénico, adipogénico y condrogénico).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las muestras medidas positivas se
evaluaron por criterios de aceptación establecidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las muestras medidas positivas se
evaluaron por criterios de aceptación establecidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Todas las muestras medidas positivas se
evaluaron por criterios de aceptación establecidos.
Para definir adicionalmente el fenotipo del
precursor MSC, las células de médula ósea de baja densidad
fibroblasto-unidas se tiñeron con anticuerpos
anti-SH3 y anti-CD14 y se
clasificaron usando citometría de flujo.
Esto provocó la clasificación de la población 1,
población 1a y población 2. Estas tres poblaciones eran SH3+
brillante. La Población 1 era CD14+ con una intensidad de tinción
débil. La Población 1a era CD45+ con una intensidad de tinción
débil. La Población 2 era CD14+ con una intensidad de tinción
brillante. Se cultivaron MSC de las fracciones celulares de la
Población 1 y la Población 1a, confirmado por análisis de flujo y
ensayos biológicos in vitro e in vivo. Se estimó que
está presente una célula de la Población 1/1a en 10^{5} células de
médula ósea de baja
densidad.
densidad.
Claims (19)
1. Una población aislada de células madre
mesenquimáticas humanas que comprende células madre mesenquimáticas
humanas, que se ha enriquecido para CD45+, de modo que la población
celular contiene menos del 5% de células que no son células
CD45+.
2. La población aislada de células madre
mesenquimáticas humanas de la reivindicación 1, en la que las
células madre mesenquimáticas humanas que son CD45+ son
adicionalmente reactivas con al menos un anticuerpo monoclonal
seleccionado entre el grupo compuesto por anticuerpo SH2, anticuerpo
SH3 y anticuerpo SH4.
3. La población celular aislada de la
reivindicación 2, en la que las células madre mesenquimáticas
humanas son SH3+ y CD45+.
4. La población celular aislada de la
reivindicación 2, en la que las células madre mesenquimáticas
humanas son SH2+ y CD45+.
5. Una composición que comprende una población
aislada de células madre mesenquimáticas humanas de la
reivindicación 1 que alberga un marcador superficial de
fibroblastos.
6. La composición de la reivindicación 5 que
comprende adicionalmente células CD14+.
7. Un proceso para aislar una población de
células madre mesenquimáticas humanas de la reivindicación 1, que
comprende
(a) obtener una población enriquecida de células
madre mesenquimáticas humanas; caracterizado por
(b) seleccionar de la población celular de (a)
células que son CD45+, utilizando un anticuerpo que reconoce
CD45.
8. Un proceso para aislar una población de
células madre mesenquimáticas humanas de la reivindicación 1 que son
SH3+ y CD45+, que comprende
(a) obtener una población enriquecida de células
madre mesenquimáticas humanas que son SH3+; caracterizado
por:
(b) seleccionar de la población celular de (a)
células que son CD45+, utilizando un anticuerpo que reconoce
CD45.
9. Un proceso para aislar una población de
células madre mesenquimáticas humanas de la reivindicación 1 que son
SH2+ y CD45+, que comprende
(a) obtener una población enriquecida de células
madre mesenquimáticas humanas que son SH2+; caracterizado
por
(b) seleccionar de la población celular de (a)
células que son CD45+, utilizando un anticuerpo que reconoce
CD45.
10. Un proceso para aislar una población de
células madre mesenquimáticas humanas de la reivindicación 1 que son
fibroblastos SH3+ y CD45+, que comprende
(a) obtener una población enriquecida de células
madre mesenquimáticas humanas; caracterizado por
(b) seleccionar de la población celular de (a)
células que son fibroblastos SH3+ y CD45+, utilizando un anticuerpo
que reconoce CD45.
11. Uso de células madre mesenquimáticas humanas
de la reivindicación 1 para fabricar preparaciones farmacéuticas
para tratar a un paciente.
12. El uso de la reivindicación 11, en el que
las células madre mesenquimáticas humanas son SH3+ y CD45+.
13. El uso de la reivindicación 11, en el que
las células madre mesenquimáticas humanas son SH2+ y CD45+.
14. El uso de la reivindicación 11, en el que la
preparación farmacéutica tiene que administrarse para generar
formación ósea.
15. El uso de la reivindicación 11, en el que la
preparación farmacéutica tiene que administrarse para tratar o
reparar un defecto del tejido conectivo en el paciente.
16. El uso de la reivindicación 15, en el que el
defecto es un defecto óseo.
17. El uso de la reivindicación 15, en el que el
defecto es un defecto de cartílago.
18. El uso de la reivindicación 11, en el que la
preparación farmacéutica tiene que administrarse para potenciar el
injerto de células madre hematopoyéticas o progenitoras en un
individuo que lo necesite.
19. Células madre mesenquimáticas humanas CD45+
aisladas de la reivindicación 1 transfectadas con material genético
exógeno que codifica una proteína a expresar.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8712398P | 1998-05-29 | 1998-05-29 | |
| US87123P | 1998-05-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2292245T3 true ES2292245T3 (es) | 2008-03-01 |
Family
ID=22203248
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99926044T Expired - Lifetime ES2292245T3 (es) | 1998-05-29 | 1999-05-28 | Celulas madre mesenquimaticas cd45+ y/o fibroblasto+humanas. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6387367B1 (es) |
| EP (1) | EP1082410B1 (es) |
| AT (1) | ATE368731T1 (es) |
| AU (1) | AU4221399A (es) |
| CA (1) | CA2328524A1 (es) |
| CY (1) | CY1107778T1 (es) |
| DE (1) | DE69936720T2 (es) |
| DK (1) | DK1082410T3 (es) |
| ES (1) | ES2292245T3 (es) |
| PT (1) | PT1082410E (es) |
| WO (1) | WO1999061587A1 (es) |
Families Citing this family (152)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7001746B1 (en) | 1999-01-29 | 2006-02-21 | Artecel Sciences, Inc. | Methods and compositions for the differentiation of human preadipocytes into adipocytes |
| AU2998300A (en) * | 1999-02-17 | 2000-09-04 | United States Surgical Corporation | Genetically altered mesenchymal stem cells and methods of use thereof |
| AUPQ147799A0 (en) | 1999-07-07 | 1999-07-29 | Medvet Science Pty. Ltd. | Mesenchymal precursor cell |
| US20050158289A1 (en) * | 1999-07-07 | 2005-07-21 | Simmons Paul J. | Mesenchymal precursor cell and use thereof in the repair of bone defects and fractures in mammals |
| US8062675B2 (en) * | 1999-07-07 | 2011-11-22 | Angioblast Systems, Inc. | Mesenchymal precursor cell |
| US7670628B2 (en) * | 1999-07-07 | 2010-03-02 | Angioblast Systems, Inc. | Mesenchymal precursor cell |
| AU2003901668A0 (en) * | 2003-03-28 | 2003-05-01 | Medvet Science Pty. Ltd. | Non-haemopoietic precursor cells |
| US6555374B1 (en) | 1999-08-19 | 2003-04-29 | Artecel Sciences, Inc. | Multiple mesodermal lineage differentiation potentials for adipose tissue-derived stromal cells and uses thereof |
| DE60132429T2 (de) | 2000-02-26 | 2009-01-08 | Artecel, Inc. | Pluripotente aus von fettgewebe stammenden stromazellen erzeugte stammzellen und deren verwendung |
| US7582292B2 (en) | 2000-02-26 | 2009-09-01 | Artecel, Inc. | Adipose tissue derived stromal cells for the treatment of neurological disorders |
| EP1918366A1 (en) | 2000-02-26 | 2008-05-07 | Artecel, Inc. | Pleuripotent stem cells generated from adipose tissue-derived stromal cells and uses thereof |
| AU2001274931B2 (en) * | 2000-05-23 | 2006-03-30 | Nexell Therapeutics, Inc. | Reagents for cell selection and methods of use |
| US20030219445A1 (en) * | 2000-05-23 | 2003-11-27 | Nexell Therapeutics, Inc. | Reagents for cell selection and methods of use |
| US6632620B1 (en) | 2000-06-22 | 2003-10-14 | Andrew N. Makarovskiy | Compositions for identification and isolation of stem cells |
| US7311905B2 (en) | 2002-02-13 | 2007-12-25 | Anthrogenesis Corporation | Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells |
| JP4294316B2 (ja) | 2000-12-06 | 2009-07-08 | ハリリ，ロバート，ジェイ． | 胎盤幹細胞の回収方法 |
| EP2316918B1 (en) * | 2001-02-14 | 2015-07-01 | Anthrogenesis Corporation | Post-partum mammalian placenta, its use and placental stem cells therefrom |
| IL157392A0 (en) * | 2001-02-14 | 2004-02-19 | Robert J Hariri | Renovation and repopulation of decellularized tissues and cadaveric organs by stem cells |
| CA2445523A1 (en) * | 2001-04-30 | 2002-11-07 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Composite scaffolds and methods using same for generating complex tissue grafts |
| US20050064587A1 (en) * | 2001-09-07 | 2005-03-24 | Lawrence Rosenberg | Pancreatic small cells and uses thereof |
| IL162648A0 (en) * | 2001-12-21 | 2005-11-20 | Mount Sinai Hospital Corp | Cellular compositions and methods of making and using them |
| US7682803B2 (en) | 2005-10-13 | 2010-03-23 | Anthrogenesis Corporation | Immunomodulation using placental stem cells |
| CN1281739C (zh) * | 2002-02-19 | 2006-10-25 | 美迪宝斯特有限公司 | 从脐带血中分离并扩大培养间充质干细胞/祖细胞及将脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞分化成各种间充质组织的方法 |
| CA2493871A1 (en) * | 2002-07-16 | 2004-01-22 | Hadi Aslan | Methods of implanting mesenchymal stem cells for tissue repair and formation |
| US7470538B2 (en) * | 2002-12-05 | 2008-12-30 | Case Western Reserve University | Cell-based therapies for ischemia |
| JP4672370B2 (ja) * | 2002-12-05 | 2011-04-20 | ケース ウエスタン リザーブ ユニバーシティ | 虚血の細胞ベースの治療 |
| WO2004069172A2 (en) | 2003-01-30 | 2004-08-19 | The Government of the United States of America as represented by the Department of Veterans Affairs | Multilineage-inducible cells and uses thereof |
| CA2521217C (en) * | 2003-04-01 | 2013-05-14 | United States Of America Department Of Veteran's Affairs | Stem-cell, precursor cell, or target cell-based treatment of multi-organ failure and renal dysfunction |
| WO2004097720A1 (en) * | 2003-04-24 | 2004-11-11 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Non-invasive left ventricular volume determination |
| JP2007525193A (ja) * | 2003-05-29 | 2007-09-06 | ボード オブ リージェンツ ザ ユニヴァーシティ オブ テキサス システム | 臨床用及び商用幹細胞 |
| US20050014255A1 (en) * | 2003-05-29 | 2005-01-20 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Stem cells for clinical and commercial uses |
| US9592258B2 (en) | 2003-06-27 | 2017-03-14 | DePuy Synthes Products, Inc. | Treatment of neurological injury by administration of human umbilical cord tissue-derived cells |
| US7875272B2 (en) | 2003-06-27 | 2011-01-25 | Ethicon, Incorporated | Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells |
| US9572840B2 (en) | 2003-06-27 | 2017-02-21 | DePuy Synthes Products, Inc. | Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells |
| US20190105351A9 (en) * | 2003-06-27 | 2019-04-11 | Ethicon, Incorporated | Systemically and locally administered cells for neuropathic pain |
| US8790637B2 (en) * | 2003-06-27 | 2014-07-29 | DePuy Synthes Products, LLC | Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells |
| US8518390B2 (en) | 2003-06-27 | 2013-08-27 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders via intranasal administration of umbilical cord-derived cells |
| US7510873B2 (en) * | 2003-06-27 | 2009-03-31 | Ethicon, Incorporated | Postpartum cells isolated from umbilical cord tissue, and methods of making and using the same |
| US8491883B2 (en) * | 2003-06-27 | 2013-07-23 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using umbilical derived cells |
| US7744869B2 (en) * | 2003-08-20 | 2010-06-29 | Ebi, Llc | Methods of treatment using electromagnetic field stimulated mesenchymal stem cells |
| US8043614B2 (en) * | 2004-03-09 | 2011-10-25 | Ahlfors Jan-Eric W | Autogenic living scaffolds and living tissue matrices: methods and uses thereof |
| SG146691A1 (en) | 2003-10-08 | 2008-10-30 | Vet Stem Inc | Methods of preparing and using stem cell compositions and kits comprising the same |
| EP1689377A4 (en) | 2003-11-04 | 2008-10-22 | Univ Maryland | STEM CELL CULTURE MEDIUM AND METHOD FOR THE USE OF THIS MEDIUM AND CELLS |
| EP1576957A1 (en) | 2004-03-18 | 2005-09-21 | Universiteit Twente | Tissue repair using pluripotent cells |
| AU2005241008C1 (en) * | 2004-04-23 | 2010-11-04 | Bioe, Inc. | Multi-Lineage Progenitor Cells |
| US7622108B2 (en) * | 2004-04-23 | 2009-11-24 | Bioe, Inc. | Multi-lineage progenitor cells |
| KR20070085288A (ko) | 2004-09-24 | 2007-08-27 | 안지오블라스트 시스템스 인코퍼레이티드 | 간엽 전구세포의 증식 및/또는 생존성 증강 방법 |
| US20060165667A1 (en) * | 2004-12-03 | 2006-07-27 | Case Western Reserve University | Novel methods, compositions and devices for inducing neovascularization |
| CA2596957C (en) * | 2004-12-03 | 2015-04-14 | New Jersey Institute Of Technology | Substrate recognition by differentiable human mesenchymal stem cells |
| US20060153815A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-07-13 | Agnieszka Seyda | Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue |
| US20060166361A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-07-27 | Agnieszka Seyda | Postpartum cells derived from placental tissue, and methods of making, culturing, and using the same |
| WO2006101548A2 (en) * | 2004-12-21 | 2006-09-28 | Ethicon, Inc. | Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making, culturing, and using the same |
| ES2621847T3 (es) | 2004-12-23 | 2017-07-05 | DePuy Synthes Products, Inc. | Células posparto derivadas de tejido de cordón umbilical, y métodos de elaboración y uso de las mismas |
| DK1835924T3 (da) | 2004-12-23 | 2013-11-04 | Ethicon Inc | Behandling af parkinsons sygdom og beslægtede sygdomme under anvendelse af postpartum opnåede celler |
| CA2512667A1 (en) * | 2005-01-07 | 2006-07-07 | Takahiro Ochiya | Human hepatocyte-like cells and uses thereof |
| BRPI0520280A2 (pt) * | 2005-05-10 | 2009-04-28 | Us Of America Dept Of Veteran | terapia de disfunÇÕes renais e falÊncia méltipla de àrgços com cÉlulas-tronco mesenquimais e meio condicionado por exposiÇço a cÉlulas-tronco mesenquimais |
| AU2006265601A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-01-11 | Anthrogenesis Corporation | Repair of tympanic membrane using placenta derived collagen biofabric |
| US7928280B2 (en) * | 2005-07-13 | 2011-04-19 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of leg ulcers using placenta derived collagen biofabric |
| EP1940423B1 (en) | 2005-09-09 | 2014-04-16 | Duke University | Tissue engineering methods and compositions |
| WO2008048671A1 (en) * | 2006-10-18 | 2008-04-24 | University Of Illinois | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use |
| SI1948259T1 (sl) | 2005-10-26 | 2017-07-31 | Genesis Technologies Limited | Acelularni bioabsorbljivi tkivni regeneracijski matriksi, proizvedeni z inkubiranjem acelularnih proizvodov krvi |
| US7713232B2 (en) | 2005-11-04 | 2010-05-11 | Medrad, Inc. | System for washing and processing of cells for delivery thereof to tissue |
| US8182444B2 (en) * | 2005-11-04 | 2012-05-22 | Medrad, Inc. | Delivery of agents such as cells to tissue |
| US20070105769A1 (en) * | 2005-11-07 | 2007-05-10 | Ebi, L.P. | Methods of treating tissue defects |
| US7521221B2 (en) * | 2005-11-21 | 2009-04-21 | Board Of Trustees Of The University Of Arknasas | Staphylococcus aureus strain CYL1892 |
| KR100697326B1 (ko) * | 2005-12-02 | 2007-03-20 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | Ｏｃｔ４ 발현능을 가지는 제대혈 유래 다분화능 성체줄기세포 및 그의 제조방법 |
| PL1971681T3 (pl) * | 2005-12-16 | 2018-01-31 | Depuy Synthes Products Inc | Kompozycje oraz sposoby do hamowania niepożądanej odpowiedzi immunologicznej w przypadku transplantacji z brakiem zgodności tkankowej |
| EP1976975B1 (en) * | 2005-12-19 | 2012-08-01 | Ethicon, Inc. | In vitro expansion of postpartum derived cells in roller bottles |
| US9125906B2 (en) | 2005-12-28 | 2015-09-08 | DePuy Synthes Products, Inc. | Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells |
| ES2628129T3 (es) * | 2005-12-28 | 2017-08-01 | DePuy Synthes Products, Inc. | Tratamiento de la enfermedad vascular periférica utilizando células derivadas del posparto |
| WO2007079184A2 (en) | 2005-12-29 | 2007-07-12 | Anthrogenesis Corporation | Co-culture of placental stem cells and stem cells from a second source |
| ES2706726T3 (es) | 2005-12-29 | 2019-04-01 | Celularity Inc | Poblaciones de células madre placentarias |
| JP5649786B2 (ja) | 2006-03-07 | 2015-01-07 | ギータ シュロフ | ヒト胚性幹細胞およびそれらの誘導体を含む組成物、使用方法、ならびに調製方法 |
| US7727763B2 (en) * | 2006-04-17 | 2010-06-01 | Bioe, Llc | Differentiation of multi-lineage progenitor cells to respiratory epithelial cells |
| US8455245B2 (en) * | 2006-05-31 | 2013-06-04 | Children's Medical Center Corporation | ABCB5 positive mesenchymal stem cells as immunomodulators |
| CN101501185A (zh) * | 2006-06-09 | 2009-08-05 | 人类起源公司 | 胎盘巢(placental niche)及其培养干细胞的用途 |
| US7993918B2 (en) * | 2006-08-04 | 2011-08-09 | Anthrogenesis Corporation | Tumor suppression using placental stem cells |
| WO2008021391A1 (en) * | 2006-08-15 | 2008-02-21 | Anthrogenesis Corporation | Umbilical cord biomaterial for medical use |
| WO2008042441A1 (en) * | 2006-10-03 | 2008-04-10 | Anthrogenesis Corporation | Use of umbilical cord biomaterial for ocular surgery |
| WO2008060377A2 (en) | 2006-10-04 | 2008-05-22 | Anthrogenesis Corporation | Placental or umbilical cord tissue compositions |
| KR20210018526A (ko) | 2006-10-06 | 2021-02-17 | 안트로제네시스 코포레이션 | 천연(텔로펩티드) 태반 콜라겐 조성물 |
| US8562972B2 (en) | 2006-10-23 | 2013-10-22 | Anthrogenesis Corporation | Methods and compositions for treatment of bone defects with placental cell populations |
| JP5537153B2 (ja) * | 2006-11-03 | 2014-07-02 | アストロム バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド | 組織修復のための混合細胞集団および細胞処理のための単離技術 |
| US20080299097A1 (en) * | 2006-11-08 | 2008-12-04 | Tulane University Health Sciences Center | Isolated population of rapidly proliferating marrow stromal cells for enhanced in vivo engraftment |
| WO2008085229A2 (en) * | 2006-11-15 | 2008-07-17 | Arteriocyte Inc. | Cell-based therapies for treating liver disease |
| US8920305B2 (en) | 2007-01-19 | 2014-12-30 | Advanced Bariatric Technology, Llc | Vertically oriented band for stomach |
| US8084023B2 (en) | 2007-01-22 | 2011-12-27 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Maintenance and propagation of mesenchymal stem cells |
| JP5979811B2 (ja) | 2007-02-12 | 2016-08-31 | アンスロジェネシス コーポレーション | 胎盤幹細胞を使用した炎症性疾患の治療 |
| CA2679178A1 (en) * | 2007-02-26 | 2008-09-04 | Mount Sinai Hospital | Compositions and methods for treating peripheral vascular diseases |
| US8034014B2 (en) | 2007-03-06 | 2011-10-11 | Biomet Biologics, Llc | Angiogenesis initation and growth |
| US20090028921A1 (en) | 2007-06-18 | 2009-01-29 | New Jersey Institute Of Technology | Electrospun Ceramic-Polymer Composite As A Scaffold For Tissue Repair |
| CN101835479A (zh) * | 2007-07-25 | 2010-09-15 | 佰欧益有限公司 | 多系祖细胞分化为软骨细胞 |
| EP2203176B1 (en) | 2007-09-28 | 2014-11-26 | Anthrogenesis Corporation | Tumor suppression using human placental perfusate and human placenta-derived intermediate natural killer cells |
| ES2525718T3 (es) * | 2007-10-05 | 2014-12-29 | DePuy Synthes Products, LLC | Reparación y regeneración de tejido renal mediante células derivadas de tejido de cordón umbilical humano |
| EP2222234B1 (en) * | 2007-12-04 | 2018-01-24 | Ingeneron, Inc. | Apparatus and methods for cell isolation |
| US8236538B2 (en) | 2007-12-20 | 2012-08-07 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Methods for sterilizing materials containing biologically active agents |
| US20110052533A1 (en) | 2008-03-14 | 2011-03-03 | Regenerative Sciences, Llc | Compositions and Methods for Cartilage Repair |
| US20090325296A1 (en) | 2008-03-25 | 2009-12-31 | New Jersey Institute Of Technology | Electrospun electroactive polymers for regenerative medicine applications |
| WO2009134429A2 (en) * | 2008-05-02 | 2009-11-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for modulating immunological tolerance |
| CA2724839A1 (en) * | 2008-05-21 | 2009-11-26 | Bioe Llc | Differentiation of multi-lineage progenitor cells to pancreatic cells |
| PE20110399A1 (es) | 2008-08-20 | 2011-06-22 | Anthrogenesis Corp | Tratamiento de la apoplejia utilizando celulas placentarias aisladas |
| WO2010021714A2 (en) | 2008-08-20 | 2010-02-25 | Anthrogenesis Corporation | Improved cell composition and methods of making the same |
| JP2012500792A (ja) | 2008-08-22 | 2012-01-12 | アンスロジェネシス コーポレーション | 胎盤細胞集団による骨欠損の治療のための方法および組成物 |
| US8865199B2 (en) * | 2008-11-17 | 2014-10-21 | Ingeneron, Inc. | Biomatrix composition and methods of biomatrix seeding |
| KR20110086176A (ko) | 2008-11-19 | 2011-07-27 | 안트로제네시스 코포레이션 | 양막 유래 부착성 세포 |
| US9192695B2 (en) | 2008-11-20 | 2015-11-24 | Allosource | Allografts combined with tissue derived stem cells for bone healing |
| US10179900B2 (en) * | 2008-12-19 | 2019-01-15 | DePuy Synthes Products, Inc. | Conditioned media and methods of making a conditioned media |
| BRPI0923070A2 (pt) * | 2008-12-19 | 2016-06-14 | Atrm Llc | "usos de composições para regeneração e reparo de tecido neural após lesão, as referidas composições, e kit" |
| CN107028983A (zh) | 2008-12-19 | 2017-08-11 | 德普伊新特斯产品有限责任公司 | 肺部疾病和病症的治疗 |
| US20100310527A1 (en) * | 2009-01-09 | 2010-12-09 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Liposome mediated delivery of lineage determining factors |
| US9334476B2 (en) | 2009-03-12 | 2016-05-10 | New Jersey Institute Of Technology | Method for nerve growth and repair using a piezoelectric scaffold |
| US9192655B2 (en) | 2009-03-12 | 2015-11-24 | New Jersey Institute Of Technology | System and method for a hydrogel and hydrogel composite for cartilage repair applications |
| US9771557B2 (en) | 2009-03-12 | 2017-09-26 | New Jersey Institute Of Technology | Piezoelectric scaffold for nerve growth and repair |
| US9476026B2 (en) | 2009-03-12 | 2016-10-25 | New Jersey Institute Of Technology | Method of tissue repair using a piezoelectric scaffold |
| US8722034B2 (en) * | 2009-03-26 | 2014-05-13 | Depuy Synthes Products Llc | hUTC as therapy for Alzheimer's disease |
| US9301975B2 (en) | 2009-05-01 | 2016-04-05 | Biocardia, Inc. | Method of preparing autologous cells and method of use for therapy |
| EP2529007B1 (en) | 2010-01-26 | 2017-07-12 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of bone-related cancers using placental stem cells |
| US9180166B2 (en) | 2010-03-12 | 2015-11-10 | New Jersey Institute Of Technology | Cartilage repair systems and applications utilizing a glycosaminoglycan mimic |
| MX347451B (es) | 2010-04-07 | 2017-04-27 | Anthrogenesis Corp | Angiogenesis utilizando celulas madre placentarias. |
| JP2013523823A (ja) | 2010-04-08 | 2013-06-17 | アントフロゲネシス コーポレーション | 胎盤幹細胞を用いるサルコイドーシスの治療 |
| AU2011242576B2 (en) | 2010-04-23 | 2016-03-31 | Cold Spring Harbor Laboratory | Novel structurally designed shRNAs |
| PT2576768T (pt) | 2010-06-01 | 2017-08-11 | Auxocell Laboratories Inc | Células estaminais da geleia nativa de wharton e a sua purificação |
| KR20180099915A (ko) | 2010-07-13 | 2018-09-05 | 안트로제네시스 코포레이션 | 천연 킬러 세포의 생성 방법 |
| PT2613776T (pt) | 2010-09-01 | 2020-10-21 | Univ Jefferson | Composição e método para reparação e regeneração muscular |
| WO2012033763A2 (en) | 2010-09-07 | 2012-03-15 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Tissue-specific differentiation matrices and uses thereof |
| US9677042B2 (en) | 2010-10-08 | 2017-06-13 | Terumo Bct, Inc. | Customizable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system |
| WO2012060517A1 (ko) * | 2010-11-05 | 2012-05-10 | 하이스템(주) | Ｃｄ45가 발현되는 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환 예방 및 치료용 의약 조성 |
| AR093183A1 (es) | 2010-12-31 | 2015-05-27 | Anthrogenesis Corp | Aumento de la potencia de celulas madre de placenta usando moleculas de arn moduladoras |
| JP6189827B2 (ja) | 2011-04-13 | 2017-08-30 | ニュー ジャージー インスティテューツ オブ テクノロジー | 骨修復のためのエレクトロスピニングによる生分解性の足場のためのシステムと方法 |
| DK2714059T3 (en) | 2011-06-01 | 2019-01-21 | Celularity Inc | TREATMENT OF PAIN WHEN USING PLACENT STAM CELLS |
| SG10201605518XA (en) | 2011-07-06 | 2016-08-30 | Cell Therapy Ltd | Progenitor Cells Of Mesodermal Lineage |
| US9925221B2 (en) | 2011-09-09 | 2018-03-27 | Celularity, Inc. | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using placental stem cells |
| JP6301263B2 (ja) | 2011-12-23 | 2018-03-28 | デピュイ・シンセス・プロダクツ・インコーポレイテッド | ヒト臍帯組織由来細胞の検出 |
| ES2656614T3 (es) | 2011-12-30 | 2018-02-27 | Amit Patel | Métodos y composiciones para la derivación clínica de células alogénicas y sus usos terapéuticos |
| GB201202319D0 (en) | 2012-02-10 | 2012-03-28 | Orbsen Therapeutics Ltd | Stromal stem cells |
| CN109316221A (zh) | 2012-08-09 | 2019-02-12 | 高级肥胖症治疗技术公司 | 聚合物包覆成型的肥胖症治疗钳和安装方法 |
| CN115137753A (zh) | 2013-02-05 | 2022-10-04 | 细胞结构公司 | 来自胎盘的自然杀伤细胞 |
| EP2964238B1 (en) | 2013-02-19 | 2021-01-13 | Children's Medical Center Corporation | Abcb5(+) stem cells for treating ocular disease |
| EP2970882B1 (en) | 2013-03-15 | 2018-11-28 | AlloSource | Cell repopulated collagen matrix for soft tissue repair and regeneration |
| ES2892403T3 (es) | 2013-05-10 | 2022-02-04 | Childrens Medical Center | Curación de heridas e ingeniería de tejidos |
| WO2015073918A1 (en) | 2013-11-16 | 2015-05-21 | Terumo Bct, Inc. | Expanding cells in a bioreactor |
| EP3074506A1 (en) | 2014-02-12 | 2016-10-05 | National University of Ireland, Galway | Selection and use of stem cells |
| JP6783143B2 (ja) | 2014-03-25 | 2020-11-11 | テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド | 培地の受動的補充 |
| NZ763661A (en) | 2014-08-26 | 2023-01-27 | Advanced Bariatric Tech Llc | Bariatric clamp with suture portions, magnetic inserts and curvature |
| US20160090569A1 (en) | 2014-09-26 | 2016-03-31 | Terumo Bct, Inc. | Scheduled Feed |
| WO2017004592A1 (en) | 2015-07-02 | 2017-01-05 | Terumo Bct, Inc. | Cell growth with mechanical stimuli |
| JP7034949B2 (ja) | 2016-05-25 | 2022-03-14 | テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド | 細胞の増殖 |
| US11685883B2 (en) | 2016-06-07 | 2023-06-27 | Terumo Bct, Inc. | Methods and systems for coating a cell growth surface |
| US11104874B2 (en) | 2016-06-07 | 2021-08-31 | Terumo Bct, Inc. | Coating a bioreactor |
| US11624046B2 (en) | 2017-03-31 | 2023-04-11 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
| US11702634B2 (en) | 2017-03-31 | 2023-07-18 | Terumo Bct, Inc. | Expanding cells in a bioreactor |
| EP4314244A1 (en) | 2021-03-23 | 2024-02-07 | Terumo BCT, Inc. | Cell capture and expansion |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5837539A (en) * | 1990-11-16 | 1998-11-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells |
| US5486359A (en) * | 1990-11-16 | 1996-01-23 | Osiris Therapeutics, Inc. | Human mesenchymal stem cells |
| US5654186A (en) * | 1993-02-26 | 1997-08-05 | The Picower Institute For Medical Research | Blood-borne mesenchymal cells |
| US5591625A (en) * | 1993-11-24 | 1997-01-07 | Case Western Reserve University | Transduced mesenchymal stem cells |
| US5736396A (en) * | 1995-01-24 | 1998-04-07 | Case Western Reserve University | Lineage-directed induction of human mesenchymal stem cell differentiation |
-
1999
- 1999-05-28 ES ES99926044T patent/ES2292245T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-28 CA CA002328524A patent/CA2328524A1/en not_active Abandoned
- 1999-05-28 EP EP99926044A patent/EP1082410B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-28 PT PT99926044T patent/PT1082410E/pt unknown
- 1999-05-28 US US09/321,924 patent/US6387367B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-28 AU AU42213/99A patent/AU4221399A/en not_active Abandoned
- 1999-05-28 WO PCT/US1999/011975 patent/WO1999061587A1/en active IP Right Grant
- 1999-05-28 DE DE69936720T patent/DE69936720T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-28 DK DK99926044T patent/DK1082410T3/da active
- 1999-05-28 AT AT99926044T patent/ATE368731T1/de active
-
2007
- 2007-10-25 CY CY20071101380T patent/CY1107778T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69936720T2 (de) | 2008-04-30 |
| US6387367B1 (en) | 2002-05-14 |
| CA2328524A1 (en) | 1999-12-02 |
| WO1999061587A1 (en) | 1999-12-02 |
| EP1082410A1 (en) | 2001-03-14 |
| EP1082410B1 (en) | 2007-08-01 |
| CY1107778T1 (el) | 2013-06-19 |
| PT1082410E (pt) | 2007-11-09 |
| ATE368731T1 (de) | 2007-08-15 |
| DE69936720D1 (de) | 2007-09-13 |
| AU4221399A (en) | 1999-12-13 |
| DK1082410T3 (da) | 2007-11-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2292245T3 (es) | Celulas madre mesenquimaticas cd45+ y/o fibroblasto+humanas. | |
| ES2285779T3 (es) | Celulas madre mesenquimatosas humanas de sangre periferica. | |
| ES2535042T3 (es) | Identificación y aislamiento de células multipotentes de tejido mesenquimal no osteocondral | |
| US5965436A (en) | Method of isolating mesenchymal stem cells associated with isolated megakaryocytes by isolating megakaryocytes | |
| Caterson et al. | Human marrow-derived mesenchymal progenitor cells: isolation, culture expansion, and analysis of differentiation | |
| KR101704072B1 (ko) | 골 치유를 위한 조직 유래된 줄기 세포와 결합된 동종이식편 | |
| US6200606B1 (en) | Isolation of precursor cells from hematopoietic and nonhematopoietic tissues and their use in vivo bone and cartilage regeneration | |
| US20100260721A1 (en) | Enrichment of Cells | |
| Yang et al. | Comparison of phenotypic characterization between" alginate bead" and" pellet" culture systems as chondrogenic differentiation models for human mesenchymal stem cells | |
| RU2636551C2 (ru) | Стромальные стволовые клетки | |
| KR20080091832A (ko) | 중간엽 줄기 세포 응집물의 제조 및 특성화 방법, 및 이의 용도 | |
| CN110499287A (zh) | 简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法 | |
| WO1998020731A9 (en) | Msc-megakaryocyte precursor composition and method of isolating mscs associated with isolated megakaryocytes by isolating megakaryocytes | |
| EP0877795A1 (en) | Isolation of precursor cells from hematopoietic and non-hematopoietic tissues and their use | |
| CN113136362B (zh) | 一种囊泡及其应用 | |
| Tsvetkova et al. | Chondrogeneic potential of MSC from different sources in spheroid culture | |
| Kang et al. | The potential of mouse skin-derived precursors to differentiate into mesenchymal and neural lineages and their application to osteogenic induction in vivo | |
| JP2023513395A (ja) | 小胞及びその使用 | |
| Andriamanalijaona et al. | Differentiation potential of human muscle-derived cells towards chondrogenic phenotype in alginate beads culture | |
| AU2013237374B2 (en) | Novel MSC surface marker | |
| WO2008097828A2 (en) | Method for isolating mesenchymal stromal cells | |
| Murray et al. | A new ball for an old trick: paramagnetic cell sorting of human mesenchymal stem cells from adipose tissue | |
| Naung | Comparative Study of Different Dilutional and Centrifugation Protocols for a Lower Density Gradient Separation Media in Isolation of Osteoprogenitors from Human Bone Marrow Aspirate | |
| Awaya et al. | Selective Development of Myogenic Mesenchymal Cells from Human Embryonic and Induced |