ES2285779T3

ES2285779T3 - Celulas madre mesenquimatosas humanas de sangre periferica.

Info

Publication number: ES2285779T3
Application number: ES98935544T
Authority: ES
Inventors: Mireya Fernandez; Jose J. Minguell
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1997-07-03
Filing date: 1998-07-01
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2018-07-01
Also published as: DE69837491T2; PT1028737E; ATE358493T1; DK1028737T3; CA2294944A1; WO1999001145A1; EP1028737A4; EP1028737B1; US6261549B1; EP1028737A1; DE69837491D1; CY1106798T1; AU8476698A

Abstract

Uso de células madre mesenquimatosas que son SH2+, SH3+ y/o SH4+ para la fabricación de una composición farmacéutica para terapia de sustitución celular, terapia génica, trasplante de médula ósea, aplicaciones ortopédicas, tratamiento de osteoartritis, osteoporosis y estados traumáticos o patológicos de tejido conjuntivo, en el que dichas células madre mesenquimatosas se obtienen a partir de sangre periférica tras la administración de una cantidad eficaz de un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en G-CSF y GM-CSF.

Description

Células madre mesenquimatosas humanas de sangre periférica.

Antecedentes de la invención

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud estadounidense provisional con número de serie 60/051.651, presentada el 3 de julio de 1997. Este trabajo fue respaldado por las subvenciones FONDECYT-Chile (Nº 1950-238) y Fundacao Vitae-Brasil (Nº B-11487/4B001). Estas pueden haber creado ciertos derechos en la invención.

Las células madre mesenquimatosas (MSC) son los blastocitos pluripotenciales formativos que se encuentran entre otros en la médula ósea, sangre, dermis y periostio, que pueden diferenciarse en más de un tipo específico de tejidos mesenquimatoso o conjuntivo (es decir los tejidos del cuerpo que soportan los elementos especializados; por ejemplo tejidos adiposo, óseo, del estroma, cartilaginoso, elástico y conjuntivo fibroso) dependiendo de diversas influencias de factores bioactivos, tales como citocinas. Las células madre mesenquimatosas humanas (hMSC) reaccionan con ciertos anticuerpos monoclonales, conocidos como SH2, SH3 y SH4 (véase la patente estadounidense número 5.486.359).

Las células madre hematopoyéticas (HSC) son los blastocitos pluripotenciales formativos que se encuentran entre otros en la médula ósea y sangre periférica, que pueden diferenciarse en cualquiera de los tipos específicos de células hematopoyéticas o sanguíneas, tales como eritrocitos, linfocitos, macrófagos y megacariocitos. Tras la movilización de las HSC desde la médula ósea mediante la administración de ciertos factores tales como G-CSF y GM-CSF y posterior recuperación a partir de sangre periférica, las HSC también se han llegado a denominar células progenitoras de sangre periférica (PBPC). Las células madre hematopoyéticas humanas (hHSC) y las PBPC reaccionan con anticuerpos monoclonales que ahora se reconocen como que son específicas para células hematopoyéticas, por ejemplo, CD34.

Por tanto, las hMSC y hHSC son fácilmente distinguibles por sus perfiles inmunoespecíficos y, a modo aclaratorio en el presente documento, se denominarán, por ejemplo, en el presente documento como hMSC SH2^{+}-CD14^{-} o hHSC SH2^{-}-CD14^{+} según se necesite.

El trasplante de células madre hematopoyéticas humanas (hHSC), o de células progenitoras de sangre periférica (PBPC) se ha convertido en un método aceptado para la intensificación de la dosis en el tratamiento de varias enfermedades neoplásicas^{1,2}. Se han usado diversos procedimientos para la movilización de hHSC y la eliminación de la circulación mediante aféresis. En la actualidad, la mayoría de los métodos se aprovechan del rebote en los progenitores circulantes que se produce tras quimioterapia citotóxica.^{3} Juntos, la administración a corto plazo de o bien GM-CSF o bien G-CSF, aumenta el rendimiento de hHSC, tal como se mide mediante el número de células CD34^{+4,5,6} que, cuando se usan para el autoinjerto a 2,5 x 10^{6} hHSC CD34^{+}/kg de receptor, aseguran una rápida recuperación hematopoyética^{4,5,6}.

Parece que diversos mecanismos están implicados en la liberación mediada por el factor de crecimiento de células progenitoras de la médula.^{7} Entre ellos, parece que tras la exposición a G-CSF o GM-CSF, se liberan moléculas de adhesión desde la superficie de células de linaje múltiple primitivas residentes de la médula, permitiendo así que entren en la circulación^{5}. Este concepto se ha reforzado por diversas observaciones que muestran que los factores de crecimiento (como G-CSF, GM-CSF, IL-3 y SCF) modulan la expresión o función de diversas moléculas citoadhesivas en la superficie de células progenitoras hematopoyéticas.^{8,9} Además, los informes citan que las citocinas producen cambios inmunohistoquímicos y morfológicos profundos en el estroma medular y en la matriz extracelular contigua.^{10,11}

El documento US 5 486 359 describe un método para aislar, purificar y expandir en cultivo células madre mesenquimatosas humanas no diferenciadas que tienen la capacidad de diferenciarse en más de un tipo de tejido. El documento US 5 486 359 describe además los anticuerpos monoclonales SH2, SH3 y SH4, que reconocen células madre mesenquimatosas que son SH2^{+}, SH3^{+} y SH4+.

El documento US 5 199 942 se refiere a un método para el trasplante de células hematopoyéticas autólogas en un paciente que recibe terapia citorreductora. El método implica expandir las células progenitoras hematopoyéticas ex vivo con un factor de crecimiento.

Sumario de la invención

La invención se refiere al uso de un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en G-CSF y GM-CSF para la fabricación de una composición farmacéutica para aumentar la cantidad de células madre mesenquimatosas en sangre periférica, en la que las células madre mesenquimatosas son SH2+, SH3+ y/o SH4+.

Según una realización preferida de la invención, las células madre mesenquimatosas son además CD14- y CD34-.

Puede usarse dicho factor de crecimiento en un método para obtener células madre mesenquimatosas humanas en el que las células madre mesenquimatosas humanas se recuperan a partir de sangre periférica obtenida de un individuo. Más particularmente, puede usarse dicho factor de crecimiento en un método para recuperar sangre periférica que contiene una población de células con aumento de las células madre mesenquimatosas humanas de un individuo, método que comprende (i) administrar a dicho individuo al menos un factor de crecimiento y, después de esto, (ii) recuperar las hMSC de la sangre periférica de dicho individuo. Los factores de crecimiento que se usan según la invención son G-CSF, GM-CSF y combinaciones de los mismos.

Puede usarse dicho factor de crecimiento en un método para recuperar una población expandida en cultivo, aislada de células madre mesenquimatosas humanas a partir de la sangre periférica enriquecida en células madre mesenquimatosas de un individuo mediante (i) administrar a dicho individuo de al menos un factor de crecimiento; (ii) recuperar la sangre periférica enriquecida en células madre mesenquimatosas de dicho individuo; (iii) cultivar la sangre periférica enriquecida en células madre mesenquimatosas o una fracción de la misma; y (iv) aislar una población expandida en cultivo de células madre mesenquimatosas humanas a partir de otras células en dicha sangre periférica enriquecida en células madre mesenquimatosas. Las etapas de cultivar y aislar también pueden ser en orden inverso. Es decir, pueden aislarse las células madre mesenquimatosas de la sangre periférica y después expandirse en cultivo. Los enfoques para tal aislamiento incluyen leucoféresis, fraccionamiento en gradiente de densidad, inmunoselección y separación por adhesión diferencial. Los medios de cultivo pueden ser medios libres de suero definidos químicamente o bien puede ser un "medio completo", tal como DMEM o DMEM-1g que contiene suero. Los medios libres de suero definidos químicamente adecuados se describen en el documento U.S. con número de serie 08/464.599, presentado el 5 de junio de 1995, y los "medios completos" se describen en la patente estadounidense número 5.486.359, expedida el 23 de enero de 1996.

Dicho factor de crecimiento puede usarse además en un método para conservar ex vivo una población expandida en cultivo, aislada de células madre mesenquimatosas humanas de la sangre periférica enriquecida en células madre mesenquimatosas de un individuo mediante (i) administrar a dicho individuo al menos un factor de crecimiento; (ii) recuperar la sangre periférica enriquecida en células madre mesenquimatosas de dicho individuo; (iii) cultivar la sangre periférica enriquecida en células madre mesenquimatosas; (iv) aislar una población expandida en cultivo de células madre mesenquimatosas humanas a partir de otras células en dicha sangre periférica enriquecida en células madre mesenquimatosas; y (v) conservar la población expandida en cultivo, aislada de células madre mesenquimatosas humanas. Preferiblemente, la conservación es mediante crioconservación.

Dicho factor de crecimiento puede usarse además en un método para tratar un individuo que necesita tratamiento con una población expandida en cultivo, aislada de células madre mesenquimatosas humanas mediante (i) administrar a dicho individuo al menos un factor de crecimiento; (ii) recuperar la sangre periférica enriquecida en células madre mesenquimatosas de dicho individuo; (iii) cultivar la sangre periférica enriquecida en células madre mesenquimatosas; (iv) aislar una población expandida en cultivo de células madre mesenquimatosas humanas a partir de otras células en dicha sangre periférica enriquecida en células madre mesenquimatosas; y (v) administrar dicha población expandida en cultivo, aislada de células madre mesenquimatosas a dicho individuo. Las células pueden administrarse mediante, por ejemplo, infusión sistémica o implantación local en un sitio en el que se desea la generación de tejido de novo, tal como mediante un procedimiento abierto o artroscópico. Pueden conservarse las células antes de la nueva adminis-
tración.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1

Fotomicrografías de contraste de fase de células del estroma en cultivo a partir de fracciones recogidas de PBPC movilizadas

Figura 1A. Tras el cultivo (10 días) de PBPC de baja densidad en medio complementado con FCS al 20%, se generó una capa adherente que contiene células similares a fibroblastos, colonias y células redondas pequeñas (a). (x 10).

Figura 1B. Se formaron colonias por células similares a fibroblastos, células redondas planas grandes y células redondas pequeñas dispersas o colocadas encima de las células redondas planas grandes (x 100).

Figura 1C. Después de 20 días en cultivo, se visualiza una monocapa adherente casi confluente de células similares a fibroblastos (x10).

Figura 2

Inmunotinción para fibronectina, colágeno I, ICAM-1, VCAM-1 y antígeno mesenquimatoso SH2 en cultivos de células del estroma derivadas de fracciones recogidas de PBPC movilizadas

Las micrografías muestran la tinción por inmunofluorescencia in situ para fibronectina (figura 2A), colágeno I (figura 2B), ICAM-1 (figura 2C), VCAM-1 (figura 2D) y antígeno mesenquimatoso SH2 (figura 2E). Aumento original x40.

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Figura 3

Histogramas de FACScan representativos para la expresión de antígenos de superficie de células madre mesenquimatosas

Se liberaron en EDTA células adherentes de cultivos de 10 días de células progenitoras de sangre periférica (PBPC) y médula ósea, y se analizaron para determinar la expresión de antígenos de superficie asociados a células madre mesenquimatosas reconocidos por los anticuerpos monoclonales SH-2 y SH-3. Se muestra el diagrama de dispersión de FSC frente a SSC para MSC de sangre periférica (figura 3A) y MSC de médula ósea (figura 3D) para permitir el control de SH-2^{+}/CD14^{-}. El perfil de fluorescencia en cada una de las figuras 3B, 3C, 3E y 3F muestra el control negativo sin tinción (pico izquierdo de cada uno) y el control positivo para las células teñidas (pico derecho de cada uno).

Figura 4

Correlación entre el número de células CD34^{+} y SH-2^{+} en productos de aféresis movilizados por factor de crecimiento

Se analizaron los datos de los productos de aféresis de 14 pacientes con cáncer de mama. Se normalizaron las cifras de CD34^{+} y SH-2^{+} a 10^{4} células mononucleares por ml de cada fracción recogida. La línea representa la tendencia (coeficiente de correlación 0,92).

Descripción detallada de realizaciones preferidas

Los siguientes son ejemplos representativos de citocinas que pueden emplearse: puede emplearse IL-1 en una cantidad eficaz para enriquecer la población de hMSC en sangre periférica, generalmente, tal cantidad es de al menos 20 pg/ml y no necesita superar 1 ng/ml, preferiblemente 1 ng/ml; puede emplearse IL-6 en una cantidad eficaz para enriquecer la población de hMSC en sangre periférica, generalmente, tal cantidad es de al menos 1 pg/ml y no necesita superar los 50 ng/ml, preferiblemente 10 ng/ml; puede emplearse IL-3 en una cantidad eficaz para enriquecer la población de hMSC en sangre periférica, generalmente, tal cantidad es de al menos 500 pg/ml y no necesita superar los 50 ng/ml, preferiblemente 500 pg/ml; puede emplearse G-CSF en la presente invención en una cantidad eficaz para enriquecer la población de hMSC en sangre periférica, y generalmente, tal cantidad es de al menos 100 pg/ml y no necesita superar 1 ng/ml, preferiblemente 200 pg/ml. Puede emplearse GM-CSF en la presente invención en una cantidad eficaz para enriquecer la población de hMSC en sangre periférica, y generalmente, tal cantidad es de al menos 100 pg/ml y no necesita superar 1 ng/ml, preferiblemente 200 pg/ml; puede emplearse el ligando de kit c en una cantidad eficaz para enriquecer la población de hMSC en sangre periférica, generalmente, tal cantidad es de al menos 1,0 ng/ml y no necesita superar los 500 ng/ml, preferiblemente 100 ng/ml. Pueden emplearse tales citocinas solas o en combinación las unas con las otras. También pueden emplearse otras citocinas, tales como LIF y SCF, y combinaciones de las mismas para movilizar las hMSC en la sangre periférica.

Las hMSC recuperadas de sangre periférica pueden usarse en una variedad de maneras. Por ejemplo, tales hMSC pueden emplearse como parte de terapia de sustitución celular. Específicamente, las hMSC expandidas y cultivadas pueden infundirse solas o añadidas a células de médula ósea para procedimientos de trasplante de médula ósea. También se contemplan otras aplicaciones, particularmente ortopédicas. Tales incluyen, por ejemplo, el tratamiento de osteoartritis, osteoporosis, estados traumáticos o patológicos que implican cualquiera de los tejidos conjuntivos. También se contempla que puede introducirse material genético exógeno en las células mientras ex vivo y que las células se vuelvan a administrar como parte de un régimen de terapia génica. La modificación mediante ingeniería genética de células madre mesenquimatosas se trata de manera más completa en la patente estadounidense número 5.591.625, expedida el 7 de enero de 1997.

Las células pueden expandirse, tal como mediante el procedimiento enseñado en Caplan et al., patente estadounidense número 5.486.359 (expedida el 23 de enero de 1996), antes o después de la congelación de las mismas. Tras la quimioterapia, se vuelven a infundir las células expandidas en un paciente mediante procedimientos conocidos en la técnica.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar y describir adicionalmente la presente invención; sin embargo, no se pretende que el alcance de la presente invención esté limitado por los mismos.

Ejemplo 1 Aislamiento de hMSC de sangre humana periférica

En el presente estudio, se detectó la presencia de hMSC en fracciones recogidas de hHSC movilizadas por factor de crecimiento de pacientes con cáncer de mama. Con este fin, se usó un procedimiento que incluía cultivar hMSC y su cuantificación mediante citometría de flujo usando anticuerpos monoclonales generados contra antígenos de superficie expresados por hMSC derivadas de médula, es decir, SH2 y SH3. Ya se ha seguido un enfoque similar para demostrar que las células medulares incluyen las células madre mesenquimatosas primitivas.

Procedimiento para la fracción recogida de hHSC y población de pacientes

Se trataron catorce pacientes femeninas con cáncer de mama en estadio II, establecido histológicamente con 10 o más ganglios linfáticos axilares implicados con (i) quimioterapia^{6}, y, después, (ii) con G-CSF humano recombinante (Neupogen®, F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basilea, Suiza) o GM-CSF (LeucomaxR, Schering Plough- Sandoz Pharma Ltd., Basilea, Suiza) a 5 \mug/kg/d por vía subcutánea, un día después del final de la quimioterapia. Después de esto se recogió una fracción de hHSC durante la recuperación medular tan pronto como fue detectable una población diferenciada de CD34^{+} (\geq10/1) en la sangre periférica, usando un separador de sangre Haemonetics V50 (Braintree, MA). Se contó una alícuota de la fracción recogida de hHSC y se procesó para realizar un examen morfológico, ensayo de CFU-GM^{16} y contenido de CD34 mediante inmunofluorescencia directa (véase más adelante). Se apartó otra alícuota para cultivar y realizar análisis fenotípico de hMSC SH2^{+}. Las fracciones recogidas de hHSC se redujeron en volumen mediante centrifugación, se diluyeron con una mezcla de plasma autólogo y DMSO al 10%, se congelaron en un congelador de velocidad controlada (Cryomed; Forma Scientific, Marietta, OH, EE.UU.) y se crioconservaron en la fase de vapor de nitrógeno líquido hasta su nueva infusión.

Recogida de médula ósea

Se obtuvo el material sobrante de células de médula ósea (MO) heparinizadas tomadas de individuos normales que estaban sometiéndose a fracciones recogidas de MO para el trasplante alogénico. Se lavaron dos veces las células en medio 199 que contenía heparina 20 U/ml, se resuspendieron en medio solo y se usaron para el cultivo de hMSC derivadas de médula.

Se realizaron todos los procedimientos según las directrices del comité ético de la Clínica Las Condes. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes.

Cultivo de hHSC de sangre periférica y hMSC derivadas de médula

Se cultivaron las hMSC usando los métodos notificados previamente^{11,13}. En resumen, se separaron por densidad células mononucleares de productos de aféresis y de fracciones recogidas de MO mediante centrifugación en Ficoll-Hypaque de 1,077 g/cm^{3} (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). Se suspendieron las células de baja densidad en \alpha-MEM que contenía suero de ternero fetal al 20% (FCS, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) y se cultivaron en placas Petri de 35 mm a una concentración de 10^{6} células/placa a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 5%. Después de 10 días en cultivo, con un cambio de medio el día 4, se usaron las células en la capa adherente para análisis fenotípico o bien in situ o tras el desprendimiento de las células con EDTA al 0,02% en solución salina tamponada con fostato.

Análisis fenotípico

Se realizó un examen por microscopia óptica en células teñidas con Wright-Giemsa o bien en la placa de cultivo o bien en preparaciones de citospina de células desprendidas con EDTA. Se realizó tinción histoquímica mediante protocolos habituales usando kits de diagnóstico (Sigma) para negro Sudán, ácido peryódico de Schiff (PAS), \alpha-naftil butirato esterasa, fosfatasa ácida y fosfatasa alcalina.

Para estudios de inmunofluorescencia, se procesaron las células con un reactivo de fijación/permeabilización (Cytoperm®, Serotech Ltd., Oxford, Inglaterra) y se marcaron con anticuerpos monoclonales conjugados con FITC o libres apropiados (véase más adelante) y se leyeron bajo iluminación ultravioleta a 50 nm con una lámpara de gas de mercurio en un microscopio Nikon. Para el análisis de citometría de flujo, se tiñeron las células liberadas con EDTA o las células en los productos de aféresis con anticuerpos monoclonales o bien puros o bien conjugados con FITC o PE. Se usaron anticuerpos con isotipo coincidente no específicos para determinar la fluorescencia de fondo. Se analizaron las células en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, BD) y se realizó la adquisición de datos con un software de investigación FACScan Lysis II (BD). Cada medición incluyó al menos 30.000 células.

Se usaron los siguientes anticuerpos monoclonales: anti-CD-45-FITC, anti-CD14_{-}PE, anti-CD34-PE, se adquirieron a Becton Dickinson; anti-colágeno I, anti-colágeno III y anti-fibronectina eran de Sigma; anti-colágeno VI era de Gibco BRL (Grand Island, NY, EE.UU.); anti-ICAM-1 (CD54) y anti-VCAM-1 (CD106) eran de R&D Systems (Minneapolis, MN, EE.UU.). Se adquirieron IgG_{1}-PE, IgG_{1}-FITC, IgG_{2a}-PE y F(ab')_{2}-PE de ratón control a Becton Dickinson. Los anticuerpos monoclonales SH-2 (IgG_{1}) y SH-3 (IgG_{2b}) fueron proporcionados amablemente por el Dr. A.I. Caplan (Case Western Reserve University, Cleveland, OH, EE.UU.) y por Osiris Therapeutics, Inc. (Baltimore, MD, EE.UU.). Estos anticuerpos reconocen antígenos en la superficie celular de las células progenitoras mesenquimatosas derivadas de médula, pero no reaccionan con células hematopoyéticas derivadas de médula así como con la superficie celular de osteoblastos u osteocitos^{12,14,15}.

Resultados Generación ex vivo de hMSC a partir de fracciones recogidas de hHSC movilizadas

Se hicieron crecer células mononucleares de baja densidad a partir de fracciones recogidas de hHSC en cultivo en presencia de FCS pero en ausencia de glucocorticoides o factores de crecimiento que favorecen la replicación/diferenciación de precursores hematopoyéticos y del estroma, respectivamente^{15,17}. Tras eliminar las células no adherentes cambiando el medio (día 4 de cultivo), se visualizó una pequeña parte de células nucleadas unidas en la placa de cultivo, que para el día 10 de cultivo se desarrollaron para dar una capa adherente que contenía abundantes células similares a fibroblastos dispersas y varias colonias grandes (figura 1A).

Cuando se examinaron mediante microscopía de contraste de fase, el núcleo de cada colonia estaba formado predominantemente por varias células similares a fibroblastos y por algunas células redondas planas grandes. También se observaron células redondas pequeñas, o bien dispersas en las colonias o bien encima de las células redondas planas grandes (figura 1B). Todos los tipos de célula que formaban una colonia eran débilmente positivas para negro Sudán y negativas para fosfatasa alcalina. En el día 20 de cultivo, las células han proliferado y tienden a formar una capa casi continua que comprende principalmente células similares a fibroblastos. En este momento se dispersan las células planas grandes y representan sólo una población minoritaria (figura 1C).

Tal como se reveló mediante análisis histoquímico (no mostrado), las células del estroma fueron positivas para \alpha-naftil butirato esterasa, ácido peryódico de Schiff (PAS) y fostatasa ácida; débilmente positivas para negro Sudán y negativas para fosfatasa alcalina de membrana. No se observaron diferencias histoquímicas significativas entre las células similares a fibroblastos y las redondas planas grandes.

Se realizó la caracterización inmunológica de células del estroma derivadas de PBPC mediante inmunofluorescencia indirecta, utilizando un panel de anticuerpos monoclonales usados en la actualidad para detectar células del estroma de médula ósea. Los resultados de estos estudios se resumen en la tabla 1.

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TABLA 1

1

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De manera similar, en la figura 2 se muestran micrografías que muestran tinciones por inmunofluorescencia seleccionadas (es decir, fibronectina, colágeno I, ICAM-1, VCAM-1 y antígeno mesenquimatoso SH-2). En general, el patrón de tinción reveló la producción de moléculas de la matriz extracelular y la expresión de ligandos de adhesión. Juntas, las células del estroma que son CD14^{-} y CD34- expresan antígenos mesenquimatosos reconocidos por los anticuerpos monoclonales SH2 y SH3. Sin excepción, no se observaron diferencias inmunofenotípicas entre las células similares a fibroblastos y las redondas planas grandes.

Las células redondas pequeñas, observadas en las colonias, han resultado ser CD45^{+} y CD34^{-} y no se analizaron adicionalmente.

El análisis por citometría de flujo de células del estroma de 10 días liberadas con EDTA indicó que más del 85% de las células expresan proteínas de la superficie de células madre mesenquimatosas humanas únicas, que se detectaron por los anticuerpos monoclonales SH-2 y SH-3. (figura 3A). Juntos, los análisis por citometría de flujo de células del estroma liberadas con EDTA no revelaron expresión de antígenos asociados a células hematopoyéticas maduras o progenitoras como, CD34, CD45 y CD14. La figura 3B muestra el patrón de tinción de células del estroma de médula ósea liberadas con EDTA tras marcarlas con los anticuerpos SH2 y SH3.

Por tanto, basándose en la morfología y fenotipo de membrana de superficie, las hMSC generadas ex vivo a partir de fracciones recogidas de hHSC movilizadas son indistinguibles de las células madre mesenquimatosas humanas derivadas de médula ósea.

Cuantificación de hMSC en fracciones recogidas de hHSC movilizadas por factores de crecimiento

Se midió el contenido de hMSC en fracciones recogidas de hHSC movilizadas por factor de crecimiento mediante citometría de flujo usando el anticuerpo monoclonal SH2. Se localizaron las hMSC SH2^{+} en la parte superior de linfocitos y en la inferior del agrupamiento celular de monocitos en un diagrama de puntos de dispersión directa y lateral. Para evitar el solapamiento escaso entre las células SH2^{+} y CD14^{+} y la unión no específica del anticuerpo secundario (IgG_{1}) a monocitos, se fijó una compuerta alrededor de la zona superior, para excluir las células CD14* y para enumerar las células SH-2^{+}/CD14^{-}.

Se detectaron las hMSC SH2^{+} en 11/14 fracciones recogidas de hHSC. El porcentaje medio de células SH2^{+} en productos de aféresis fue del 0,63% (intervalo de 0,02-2,32). No se halló correlación entre el porcentaje de células SH2^{+} o la cantidad total de células SH2^{+} por fracción recogida y el tipo de factor de crecimiento (GM-CSF o G-CSF) usado para movilizar las fracciones recogidas de hHSC.

Para establecer si la eficacia de la movilización de hHSC (medida como la cantidad de células CD34^{+} recogidas), se correlaciona con la cantidad de células SH2^{+} por aféresis, se analizó el tipo de relación entre ambas variables. Tal como se observa en la figura 4, considerando el grupo completo de 14 pacientes estudiadas, se halló una correlación muy fuerte (r= 0,92, P<0,001) entre el número absoluto de células CD34^{+} y el de células SH2^{+}, en cada producto de aféresis. Estos resultados sugieren que podría predecirse el número de SH2^{+} a partir del número de células CD34^{+} con un alto nivel de confianza.

Las células mononucleares preparadas a partir de la sangre de tres donantes normales fueron negativas para las células SH2^{+}, mientras que las células mononucleares preparadas a partir de una muestra de sangre extraída a una paciente sin cáncer de mama tras 5 días de estimulación con G-CSF, contenía el 0,11% de hMSC SH2^{+}.

Discusión

Aunque en los productos de aféresis movilizados por factor de crecimiento la presencia de células progenitoras hematopoyéticas así como la de células tumorales e inmunitarias accesorias está bien documentada.^{5,6,18,19,29} No existe información previa, que se sepa, sobre la presencia de hMSC en fracciones recogidas de hHSC.

En el presente documento se ha usado un enfoque dual, que incluye la generación ex vivo de hMSC y su caracterización fenotípica, para investigar para determinar la presencia de hMSC en fracciones recogidas de hHSC movilizadas por factor de crecimiento de pacientes con cáncer de mama.

Las células mononucleares de baja densidad procedentes de fracciones recogidas de hHSC, cuando se cultivan en presencia de FCS dan lugar a una población de células fuertemente adherentes que comprenden tanto células similares a fibroblastos aisladas como que forman colonias, que en el último caso crecen junto con células redondas planas grandes. Los marcadores de diferenciación del estroma medular típicos, tales como positividad para negro Sudán y fosfatasa alcalina^{23}, están o bien expresados débilmente o bien ausentes en células adherentes derivadas de una fracción recogida de PBPC. Los antígenos progenitores de mieloide tempranos o tardíos, como CD34, CD45, CD14, no se expresan por estas células. Por otro lado, las hMSC derivadas de una fracción recogida de hHSC se reconocen por los anticuerpos SH2 y SH3 que reaccionan con antígenos en la superficie de células madre mesenquimatosas humanas derivadas de médula, pero no reaccionan con células hematopoyéticas derivadas de médula^{13}. Además, los estudios demuestran que las características fenotípicas de hMSC derivadas de una fracción recogida de hHSC son similares a las de hMSC derivadas de médula ósea.

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Claims

1. Uso de células madre mesenquimatosas que son SH2^{+}, SH3^{+} y/o SH4^{+} para la fabricación de una composición farmacéutica para terapia de sustitución celular, terapia génica, trasplante de médula ósea, aplicaciones ortopédicas, tratamiento de osteoartritis, osteoporosis y estados traumáticos o patológicos de tejido conjuntivo, en el que dichas células madre mesenquimatosas se obtienen a partir de sangre periférica tras la administración de una cantidad eficaz de un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en G-CSF y GM-CSF.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que las células madre mesenquimatosas son además CD14- y CD34-.