ES2285779T3 - Celulas madre mesenquimatosas humanas de sangre periferica. - Google Patents
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Abstract
Uso de células madre mesenquimatosas que son SH2+, SH3+ y/o SH4+ para la fabricación de una composición farmacéutica para terapia de sustitución celular, terapia génica, trasplante de médula ósea, aplicaciones ortopédicas, tratamiento de osteoartritis, osteoporosis y estados traumáticos o patológicos de tejido conjuntivo, en el que dichas células madre mesenquimatosas se obtienen a partir de sangre periférica tras la administración de una cantidad eficaz de un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en G-CSF y GM-CSF.
Description
Células madre mesenquimatosas humanas de sangre
periférica.
Esta solicitud reivindica la prioridad de la
solicitud estadounidense provisional con número de serie 60/051.651,
presentada el 3 de julio de 1997. Este trabajo fue respaldado por
las subvenciones FONDECYT-Chile (Nº
1950-238) y Fundacao Vitae-Brasil
(Nº B-11487/4B001). Estas pueden haber creado
ciertos derechos en la invención.
Las células madre mesenquimatosas (MSC) son los
blastocitos pluripotenciales formativos que se encuentran entre
otros en la médula ósea, sangre, dermis y periostio, que pueden
diferenciarse en más de un tipo específico de tejidos
mesenquimatoso o conjuntivo (es decir los tejidos del cuerpo que
soportan los elementos especializados; por ejemplo tejidos adiposo,
óseo, del estroma, cartilaginoso, elástico y conjuntivo fibroso)
dependiendo de diversas influencias de factores bioactivos, tales
como citocinas. Las células madre mesenquimatosas humanas (hMSC)
reaccionan con ciertos anticuerpos monoclonales, conocidos como SH2,
SH3 y SH4 (véase la patente estadounidense número 5.486.359).
Las células madre hematopoyéticas (HSC) son los
blastocitos pluripotenciales formativos que se encuentran entre
otros en la médula ósea y sangre periférica, que pueden
diferenciarse en cualquiera de los tipos específicos de células
hematopoyéticas o sanguíneas, tales como eritrocitos, linfocitos,
macrófagos y megacariocitos. Tras la movilización de las HSC desde
la médula ósea mediante la administración de ciertos factores tales
como G-CSF y GM-CSF y posterior
recuperación a partir de sangre periférica, las HSC también se han
llegado a denominar células progenitoras de sangre periférica
(PBPC). Las células madre hematopoyéticas humanas (hHSC) y las PBPC
reaccionan con anticuerpos monoclonales que ahora se reconocen como
que son específicas para células hematopoyéticas, por ejemplo,
CD34.
Por tanto, las hMSC y hHSC son fácilmente
distinguibles por sus perfiles inmunoespecíficos y, a modo
aclaratorio en el presente documento, se denominarán, por ejemplo,
en el presente documento como hMSC
SH2^{+}-CD14^{-} o hHSC
SH2^{-}-CD14^{+} según se necesite.
El trasplante de células madre hematopoyéticas
humanas (hHSC), o de células progenitoras de sangre periférica
(PBPC) se ha convertido en un método aceptado para la
intensificación de la dosis en el tratamiento de varias
enfermedades neoplásicas^{1,2}. Se han usado diversos
procedimientos para la movilización de hHSC y la eliminación de la
circulación mediante aféresis. En la actualidad, la mayoría de los
métodos se aprovechan del rebote en los progenitores circulantes
que se produce tras quimioterapia citotóxica.^{3} Juntos, la
administración a corto plazo de o bien GM-CSF o
bien G-CSF, aumenta el rendimiento de hHSC, tal como
se mide mediante el número de células CD34^{+4,5,6} que, cuando
se usan para el autoinjerto a 2,5 x 10^{6} hHSC CD34^{+}/kg de
receptor, aseguran una rápida recuperación
hematopoyética^{4,5,6}.
Parece que diversos mecanismos están implicados
en la liberación mediada por el factor de crecimiento de células
progenitoras de la médula.^{7} Entre ellos, parece que tras la
exposición a G-CSF o GM-CSF, se
liberan moléculas de adhesión desde la superficie de células de
linaje múltiple primitivas residentes de la médula, permitiendo así
que entren en la circulación^{5}. Este concepto se ha reforzado
por diversas observaciones que muestran que los factores de
crecimiento (como G-CSF, GM-CSF,
IL-3 y SCF) modulan la expresión o función de
diversas moléculas citoadhesivas en la superficie de células
progenitoras hematopoyéticas.^{8,9} Además, los informes citan
que las citocinas producen cambios inmunohistoquímicos y
morfológicos profundos en el estroma medular y en la matriz
extracelular contigua.^{10,11}
El documento US 5 486 359 describe un método
para aislar, purificar y expandir en cultivo células madre
mesenquimatosas humanas no diferenciadas que tienen la capacidad de
diferenciarse en más de un tipo de tejido. El documento US 5 486
359 describe además los anticuerpos monoclonales SH2, SH3 y SH4, que
reconocen células madre mesenquimatosas que son SH2^{+},
SH3^{+} y SH4+.
El documento US 5 199 942 se refiere a un método
para el trasplante de células hematopoyéticas autólogas en un
paciente que recibe terapia citorreductora. El método implica
expandir las células progenitoras hematopoyéticas ex vivo
con un factor de crecimiento.
La invención se refiere al uso de un factor de
crecimiento seleccionado del grupo que consiste en
G-CSF y GM-CSF para la fabricación
de una composición farmacéutica para aumentar la cantidad de células
madre mesenquimatosas en sangre periférica, en la que las células
madre mesenquimatosas son SH2+, SH3+ y/o SH4+.
Según una realización preferida de la invención,
las células madre mesenquimatosas son además CD14- y CD34-.
Puede usarse dicho factor de crecimiento en un
método para obtener células madre mesenquimatosas humanas en el que
las células madre mesenquimatosas humanas se recuperan a partir de
sangre periférica obtenida de un individuo. Más particularmente,
puede usarse dicho factor de crecimiento en un método para recuperar
sangre periférica que contiene una población de células con aumento
de las células madre mesenquimatosas humanas de un individuo,
método que comprende (i) administrar a dicho individuo al menos un
factor de crecimiento y, después de esto, (ii) recuperar las hMSC
de la sangre periférica de dicho individuo. Los factores de
crecimiento que se usan según la invención son
G-CSF, GM-CSF y combinaciones de los
mismos.
Puede usarse dicho factor de crecimiento en un
método para recuperar una población expandida en cultivo, aislada
de células madre mesenquimatosas humanas a partir de la sangre
periférica enriquecida en células madre mesenquimatosas de un
individuo mediante (i) administrar a dicho individuo de al menos un
factor de crecimiento; (ii) recuperar la sangre periférica
enriquecida en células madre mesenquimatosas de dicho individuo;
(iii) cultivar la sangre periférica enriquecida en células madre
mesenquimatosas o una fracción de la misma; y (iv) aislar una
población expandida en cultivo de células madre mesenquimatosas
humanas a partir de otras células en dicha sangre periférica
enriquecida en células madre mesenquimatosas. Las etapas de cultivar
y aislar también pueden ser en orden inverso. Es decir, pueden
aislarse las células madre mesenquimatosas de la sangre periférica y
después expandirse en cultivo. Los enfoques para tal aislamiento
incluyen leucoféresis, fraccionamiento en gradiente de densidad,
inmunoselección y separación por adhesión diferencial. Los medios de
cultivo pueden ser medios libres de suero definidos químicamente o
bien puede ser un "medio completo", tal como DMEM o
DMEM-1g que contiene suero. Los medios libres de
suero definidos químicamente adecuados se describen en el documento
U.S. con número de serie 08/464.599, presentado el 5 de junio de
1995, y los "medios completos" se describen en la patente
estadounidense número 5.486.359, expedida el 23 de enero de
1996.
Dicho factor de crecimiento puede usarse además
en un método para conservar ex vivo una población expandida
en cultivo, aislada de células madre mesenquimatosas humanas de la
sangre periférica enriquecida en células madre mesenquimatosas de
un individuo mediante (i) administrar a dicho individuo al menos un
factor de crecimiento; (ii) recuperar la sangre periférica
enriquecida en células madre mesenquimatosas de dicho individuo;
(iii) cultivar la sangre periférica enriquecida en células madre
mesenquimatosas; (iv) aislar una población expandida en cultivo de
células madre mesenquimatosas humanas a partir de otras células en
dicha sangre periférica enriquecida en células madre
mesenquimatosas; y (v) conservar la población expandida en cultivo,
aislada de células madre mesenquimatosas humanas. Preferiblemente,
la conservación es mediante crioconservación.
Dicho factor de crecimiento puede usarse además
en un método para tratar un individuo que necesita tratamiento con
una población expandida en cultivo, aislada de células madre
mesenquimatosas humanas mediante (i) administrar a dicho individuo
al menos un factor de crecimiento; (ii) recuperar la sangre
periférica enriquecida en células madre mesenquimatosas de dicho
individuo; (iii) cultivar la sangre periférica enriquecida en
células madre mesenquimatosas; (iv) aislar una población expandida
en cultivo de células madre mesenquimatosas humanas a partir de
otras células en dicha sangre periférica enriquecida en células
madre mesenquimatosas; y (v) administrar dicha población expandida
en cultivo, aislada de células madre mesenquimatosas a dicho
individuo. Las células pueden administrarse mediante, por ejemplo,
infusión sistémica o implantación local en un sitio en el que se
desea la generación de tejido de novo, tal como mediante un
procedimiento abierto o artroscópico. Pueden conservarse las
células antes de la nueva adminis-
tración.
tración.
Figura
1
Figura 1A. Tras el cultivo (10 días) de PBPC de
baja densidad en medio complementado con FCS al 20%, se generó una
capa adherente que contiene células similares a fibroblastos,
colonias y células redondas pequeñas (a). (x 10).
Figura 1B. Se formaron colonias por células
similares a fibroblastos, células redondas planas grandes y células
redondas pequeñas dispersas o colocadas encima de las células
redondas planas grandes (x 100).
Figura 1C. Después de 20 días en cultivo, se
visualiza una monocapa adherente casi confluente de células
similares a fibroblastos (x10).
Figura
2
Las micrografías muestran la tinción por
inmunofluorescencia in situ para fibronectina (figura 2A),
colágeno I (figura 2B), ICAM-1 (figura 2C),
VCAM-1 (figura 2D) y antígeno mesenquimatoso SH2
(figura 2E). Aumento original x40.
\newpage
Figura
3
Se liberaron en EDTA células adherentes de
cultivos de 10 días de células progenitoras de sangre periférica
(PBPC) y médula ósea, y se analizaron para determinar la expresión
de antígenos de superficie asociados a células madre
mesenquimatosas reconocidos por los anticuerpos monoclonales
SH-2 y SH-3. Se muestra el diagrama
de dispersión de FSC frente a SSC para MSC de sangre periférica
(figura 3A) y MSC de médula ósea (figura 3D) para permitir el
control de SH-2^{+}/CD14^{-}. El perfil de
fluorescencia en cada una de las figuras 3B, 3C, 3E y 3F muestra el
control negativo sin tinción (pico izquierdo de cada uno) y el
control positivo para las células teñidas (pico derecho de cada
uno).
Figura
4
Se analizaron los datos de los productos de
aféresis de 14 pacientes con cáncer de mama. Se normalizaron las
cifras de CD34^{+} y SH-2^{+} a 10^{4} células
mononucleares por ml de cada fracción recogida. La línea representa
la tendencia (coeficiente de correlación 0,92).
Los siguientes son ejemplos representativos de
citocinas que pueden emplearse: puede emplearse IL-1
en una cantidad eficaz para enriquecer la población de hMSC en
sangre periférica, generalmente, tal cantidad es de al menos 20
pg/ml y no necesita superar 1 ng/ml, preferiblemente 1 ng/ml; puede
emplearse IL-6 en una cantidad eficaz para
enriquecer la población de hMSC en sangre periférica, generalmente,
tal cantidad es de al menos 1 pg/ml y no necesita superar los 50
ng/ml, preferiblemente 10 ng/ml; puede emplearse
IL-3 en una cantidad eficaz para enriquecer la
población de hMSC en sangre periférica, generalmente, tal cantidad
es de al menos 500 pg/ml y no necesita superar los 50 ng/ml,
preferiblemente 500 pg/ml; puede emplearse G-CSF en
la presente invención en una cantidad eficaz para enriquecer la
población de hMSC en sangre periférica, y generalmente, tal
cantidad es de al menos 100 pg/ml y no necesita superar 1 ng/ml,
preferiblemente 200 pg/ml. Puede emplearse GM-CSF
en la presente invención en una cantidad eficaz para enriquecer la
población de hMSC en sangre periférica, y generalmente, tal
cantidad es de al menos 100 pg/ml y no necesita superar 1 ng/ml,
preferiblemente 200 pg/ml; puede emplearse el ligando de kit c en
una cantidad eficaz para enriquecer la población de hMSC en sangre
periférica, generalmente, tal cantidad es de al menos 1,0 ng/ml y no
necesita superar los 500 ng/ml, preferiblemente 100 ng/ml. Pueden
emplearse tales citocinas solas o en combinación las unas con las
otras. También pueden emplearse otras citocinas, tales como LIF y
SCF, y combinaciones de las mismas para movilizar las hMSC en la
sangre periférica.
Las hMSC recuperadas de sangre periférica pueden
usarse en una variedad de maneras. Por ejemplo, tales hMSC pueden
emplearse como parte de terapia de sustitución celular.
Específicamente, las hMSC expandidas y cultivadas pueden infundirse
solas o añadidas a células de médula ósea para procedimientos de
trasplante de médula ósea. También se contemplan otras
aplicaciones, particularmente ortopédicas. Tales incluyen, por
ejemplo, el tratamiento de osteoartritis, osteoporosis, estados
traumáticos o patológicos que implican cualquiera de los tejidos
conjuntivos. También se contempla que puede introducirse material
genético exógeno en las células mientras ex vivo y que las
células se vuelvan a administrar como parte de un régimen de terapia
génica. La modificación mediante ingeniería genética de células
madre mesenquimatosas se trata de manera más completa en la patente
estadounidense número 5.591.625, expedida el 7 de enero de
1997.
Las células pueden expandirse, tal como mediante
el procedimiento enseñado en Caplan et al., patente
estadounidense número 5.486.359 (expedida el 23 de enero de 1996),
antes o después de la congelación de las mismas. Tras la
quimioterapia, se vuelven a infundir las células expandidas en un
paciente mediante procedimientos conocidos en la técnica.
Se proporcionan los siguientes ejemplos para
ilustrar y describir adicionalmente la presente invención; sin
embargo, no se pretende que el alcance de la presente invención esté
limitado por los mismos.
En el presente estudio, se detectó la presencia
de hMSC en fracciones recogidas de hHSC movilizadas por factor de
crecimiento de pacientes con cáncer de mama. Con este fin, se usó un
procedimiento que incluía cultivar hMSC y su cuantificación
mediante citometría de flujo usando anticuerpos monoclonales
generados contra antígenos de superficie expresados por hMSC
derivadas de médula, es decir, SH2 y SH3. Ya se ha seguido un
enfoque similar para demostrar que las células medulares incluyen
las células madre mesenquimatosas primitivas.
Se trataron catorce pacientes femeninas con
cáncer de mama en estadio II, establecido histológicamente con 10 o
más ganglios linfáticos axilares implicados con (i)
quimioterapia^{6}, y, después, (ii) con G-CSF
humano recombinante (Neupogen®, F. Hoffmann-La
Roche Ltd., Basilea, Suiza) o GM-CSF (LeucomaxR,
Schering Plough- Sandoz Pharma Ltd., Basilea, Suiza) a 5
\mug/kg/d por vía subcutánea, un día después del final de la
quimioterapia. Después de esto se recogió una fracción de hHSC
durante la recuperación medular tan pronto como fue detectable una
población diferenciada de CD34^{+} (\geq10/1) en la sangre
periférica, usando un separador de sangre Haemonetics V50
(Braintree, MA). Se contó una alícuota de la fracción recogida de
hHSC y se procesó para realizar un examen morfológico, ensayo de
CFU-GM^{16} y contenido de CD34 mediante
inmunofluorescencia directa (véase más adelante). Se apartó otra
alícuota para cultivar y realizar análisis fenotípico de hMSC
SH2^{+}. Las fracciones recogidas de hHSC se redujeron en volumen
mediante centrifugación, se diluyeron con una mezcla de plasma
autólogo y DMSO al 10%, se congelaron en un congelador de velocidad
controlada (Cryomed; Forma Scientific, Marietta, OH, EE.UU.) y se
crioconservaron en la fase de vapor de nitrógeno líquido hasta su
nueva infusión.
Se obtuvo el material sobrante de células de
médula ósea (MO) heparinizadas tomadas de individuos normales que
estaban sometiéndose a fracciones recogidas de MO para el trasplante
alogénico. Se lavaron dos veces las células en medio 199 que
contenía heparina 20 U/ml, se resuspendieron en medio solo y se
usaron para el cultivo de hMSC derivadas de médula.
Se realizaron todos los procedimientos según las
directrices del comité ético de la Clínica Las Condes. Se obtuvo el
consentimiento informado de todos los pacientes.
Se cultivaron las hMSC usando los métodos
notificados previamente^{11,13}. En resumen, se separaron por
densidad células mononucleares de productos de aféresis y de
fracciones recogidas de MO mediante centrifugación en
Ficoll-Hypaque de 1,077 g/cm^{3} (Sigma, St.
Louis, MO, EE.UU.). Se suspendieron las células de baja densidad en
\alpha-MEM que contenía suero de ternero fetal al
20% (FCS, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) y se cultivaron en placas
Petri de 35 mm a una concentración de 10^{6} células/placa a 37ºC
en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 5%. Después
de 10 días en cultivo, con un cambio de medio el día 4, se usaron
las células en la capa adherente para análisis fenotípico o bien
in situ o tras el desprendimiento de las células con EDTA al
0,02% en solución salina tamponada con fostato.
Se realizó un examen por microscopia óptica en
células teñidas con Wright-Giemsa o bien en la placa
de cultivo o bien en preparaciones de citospina de células
desprendidas con EDTA. Se realizó tinción histoquímica mediante
protocolos habituales usando kits de diagnóstico (Sigma) para negro
Sudán, ácido peryódico de Schiff (PAS),
\alpha-naftil butirato esterasa, fosfatasa ácida y
fosfatasa alcalina.
Para estudios de inmunofluorescencia, se
procesaron las células con un reactivo de fijación/permeabilización
(Cytoperm®, Serotech Ltd., Oxford, Inglaterra) y se marcaron con
anticuerpos monoclonales conjugados con FITC o libres apropiados
(véase más adelante) y se leyeron bajo iluminación ultravioleta a 50
nm con una lámpara de gas de mercurio en un microscopio Nikon. Para
el análisis de citometría de flujo, se tiñeron las células
liberadas con EDTA o las células en los productos de aféresis con
anticuerpos monoclonales o bien puros o bien conjugados con FITC o
PE. Se usaron anticuerpos con isotipo coincidente no específicos
para determinar la fluorescencia de fondo. Se analizaron las
células en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, BD) y
se realizó la adquisición de datos con un software de investigación
FACScan Lysis II (BD). Cada medición incluyó al menos 30.000
células.
Se usaron los siguientes anticuerpos
monoclonales:
anti-CD-45-FITC,
anti-CD14_{-}PE,
anti-CD34-PE, se adquirieron a
Becton Dickinson; anti-colágeno I,
anti-colágeno III y
anti-fibronectina eran de Sigma;
anti-colágeno VI era de Gibco BRL (Grand Island,
NY, EE.UU.); anti-ICAM-1 (CD54) y
anti-VCAM-1 (CD106) eran de R&D
Systems (Minneapolis, MN, EE.UU.). Se adquirieron
IgG_{1}-PE, IgG_{1}-FITC,
IgG_{2a}-PE y
F(ab')_{2}-PE de ratón control a Becton
Dickinson. Los anticuerpos monoclonales SH-2
(IgG_{1}) y SH-3 (IgG_{2b}) fueron
proporcionados amablemente por el Dr. A.I. Caplan (Case Western
Reserve University, Cleveland, OH, EE.UU.) y por Osiris
Therapeutics, Inc. (Baltimore, MD, EE.UU.). Estos anticuerpos
reconocen antígenos en la superficie celular de las células
progenitoras mesenquimatosas derivadas de médula, pero no reaccionan
con células hematopoyéticas derivadas de médula así como con la
superficie celular de osteoblastos u osteocitos^{12,14,15}.
Se hicieron crecer células mononucleares de baja
densidad a partir de fracciones recogidas de hHSC en cultivo en
presencia de FCS pero en ausencia de glucocorticoides o factores de
crecimiento que favorecen la replicación/diferenciación de
precursores hematopoyéticos y del estroma,
respectivamente^{15,17}. Tras eliminar las células no adherentes
cambiando el medio (día 4 de cultivo), se visualizó una pequeña
parte de células nucleadas unidas en la placa de cultivo, que para
el día 10 de cultivo se desarrollaron para dar una capa adherente
que contenía abundantes células similares a fibroblastos dispersas
y varias colonias grandes (figura 1A).
Cuando se examinaron mediante microscopía de
contraste de fase, el núcleo de cada colonia estaba formado
predominantemente por varias células similares a fibroblastos y por
algunas células redondas planas grandes. También se observaron
células redondas pequeñas, o bien dispersas en las colonias o bien
encima de las células redondas planas grandes (figura 1B). Todos
los tipos de célula que formaban una colonia eran débilmente
positivas para negro Sudán y negativas para fosfatasa alcalina. En
el día 20 de cultivo, las células han proliferado y tienden a formar
una capa casi continua que comprende principalmente células
similares a fibroblastos. En este momento se dispersan las células
planas grandes y representan sólo una población minoritaria (figura
1C).
Tal como se reveló mediante análisis
histoquímico (no mostrado), las células del estroma fueron positivas
para \alpha-naftil butirato esterasa, ácido
peryódico de Schiff (PAS) y fostatasa ácida; débilmente positivas
para negro Sudán y negativas para fosfatasa alcalina de membrana. No
se observaron diferencias histoquímicas significativas entre las
células similares a fibroblastos y las redondas planas grandes.
Se realizó la caracterización inmunológica de
células del estroma derivadas de PBPC mediante inmunofluorescencia
indirecta, utilizando un panel de anticuerpos monoclonales usados en
la actualidad para detectar células del estroma de médula ósea. Los
resultados de estos estudios se resumen en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
De manera similar, en la figura 2 se muestran
micrografías que muestran tinciones por inmunofluorescencia
seleccionadas (es decir, fibronectina, colágeno I,
ICAM-1, VCAM-1 y antígeno
mesenquimatoso SH-2). En general, el patrón de
tinción reveló la producción de moléculas de la matriz extracelular
y la expresión de ligandos de adhesión. Juntas, las células del
estroma que son CD14^{-} y CD34- expresan antígenos
mesenquimatosos reconocidos por los anticuerpos monoclonales SH2 y
SH3. Sin excepción, no se observaron diferencias inmunofenotípicas
entre las células similares a fibroblastos y las redondas planas
grandes.
Las células redondas pequeñas, observadas en las
colonias, han resultado ser CD45^{+} y CD34^{-} y no se
analizaron adicionalmente.
El análisis por citometría de flujo de células
del estroma de 10 días liberadas con EDTA indicó que más del 85% de
las células expresan proteínas de la superficie de células madre
mesenquimatosas humanas únicas, que se detectaron por los
anticuerpos monoclonales SH-2 y
SH-3. (figura 3A). Juntos, los análisis por
citometría de flujo de células del estroma liberadas con EDTA no
revelaron expresión de antígenos asociados a células
hematopoyéticas maduras o progenitoras como, CD34, CD45 y CD14. La
figura 3B muestra el patrón de tinción de células del estroma de
médula ósea liberadas con EDTA tras marcarlas con los anticuerpos
SH2 y SH3.
Por tanto, basándose en la morfología y fenotipo
de membrana de superficie, las hMSC generadas ex vivo a
partir de fracciones recogidas de hHSC movilizadas son
indistinguibles de las células madre mesenquimatosas humanas
derivadas de médula ósea.
Se midió el contenido de hMSC en fracciones
recogidas de hHSC movilizadas por factor de crecimiento mediante
citometría de flujo usando el anticuerpo monoclonal SH2. Se
localizaron las hMSC SH2^{+} en la parte superior de linfocitos y
en la inferior del agrupamiento celular de monocitos en un diagrama
de puntos de dispersión directa y lateral. Para evitar el
solapamiento escaso entre las células SH2^{+} y CD14^{+} y la
unión no específica del anticuerpo secundario (IgG_{1}) a
monocitos, se fijó una compuerta alrededor de la zona superior,
para excluir las células CD14* y para enumerar las células
SH-2^{+}/CD14^{-}.
Se detectaron las hMSC SH2^{+} en 11/14
fracciones recogidas de hHSC. El porcentaje medio de células
SH2^{+} en productos de aféresis fue del 0,63% (intervalo de
0,02-2,32). No se halló correlación entre el
porcentaje de células SH2^{+} o la cantidad total de células
SH2^{+} por fracción recogida y el tipo de factor de crecimiento
(GM-CSF o G-CSF) usado para
movilizar las fracciones recogidas de hHSC.
Para establecer si la eficacia de la
movilización de hHSC (medida como la cantidad de células CD34^{+}
recogidas), se correlaciona con la cantidad de células SH2^{+}
por aféresis, se analizó el tipo de relación entre ambas variables.
Tal como se observa en la figura 4, considerando el grupo completo
de 14 pacientes estudiadas, se halló una correlación muy fuerte (r=
0,92, P<0,001) entre el número absoluto de células CD34^{+} y
el de células SH2^{+}, en cada producto de aféresis. Estos
resultados sugieren que podría predecirse el número de SH2^{+} a
partir del número de células CD34^{+} con un alto nivel de
confianza.
Las células mononucleares preparadas a partir de
la sangre de tres donantes normales fueron negativas para las
células SH2^{+}, mientras que las células mononucleares preparadas
a partir de una muestra de sangre extraída a una paciente sin
cáncer de mama tras 5 días de estimulación con
G-CSF, contenía el 0,11% de hMSC SH2^{+}.
Aunque en los productos de aféresis movilizados
por factor de crecimiento la presencia de células progenitoras
hematopoyéticas así como la de células tumorales e inmunitarias
accesorias está bien documentada.^{5,6,18,19,29} No existe
información previa, que se sepa, sobre la presencia de hMSC en
fracciones recogidas de hHSC.
En el presente documento se ha usado un enfoque
dual, que incluye la generación ex vivo de hMSC y su
caracterización fenotípica, para investigar para determinar la
presencia de hMSC en fracciones recogidas de hHSC movilizadas por
factor de crecimiento de pacientes con cáncer de mama.
Las células mononucleares de baja densidad
procedentes de fracciones recogidas de hHSC, cuando se cultivan en
presencia de FCS dan lugar a una población de células fuertemente
adherentes que comprenden tanto células similares a fibroblastos
aisladas como que forman colonias, que en el último caso crecen
junto con células redondas planas grandes. Los marcadores de
diferenciación del estroma medular típicos, tales como positividad
para negro Sudán y fosfatasa alcalina^{23}, están o bien
expresados débilmente o bien ausentes en células adherentes
derivadas de una fracción recogida de PBPC. Los antígenos
progenitores de mieloide tempranos o tardíos, como CD34, CD45,
CD14, no se expresan por estas células. Por otro lado, las hMSC
derivadas de una fracción recogida de hHSC se reconocen por los
anticuerpos SH2 y SH3 que reaccionan con antígenos en la superficie
de células madre mesenquimatosas humanas derivadas de médula, pero
no reaccionan con células hematopoyéticas derivadas de
médula^{13}. Además, los estudios demuestran que las
características fenotípicas de hMSC derivadas de una fracción
recogida de hHSC son similares a las de hMSC derivadas de médula
ósea.
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1. Uso de células madre mesenquimatosas que son
SH2^{+}, SH3^{+} y/o SH4^{+} para la fabricación de una
composición farmacéutica para terapia de sustitución celular,
terapia génica, trasplante de médula ósea, aplicaciones
ortopédicas, tratamiento de osteoartritis, osteoporosis y estados
traumáticos o patológicos de tejido conjuntivo, en el que dichas
células madre mesenquimatosas se obtienen a partir de sangre
periférica tras la administración de una cantidad eficaz de un
factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en
G-CSF y GM-CSF.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que las
células madre mesenquimatosas son además CD14- y CD34-.
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