KR20080081088A - 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 공동배양 - Google Patents

Abstract

본 발명은 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 또는 전구세포의 조합에 관한 것이며, 이 세포 조합은 태반 줄기세포 또는 제2 세포원으로부터의 줄기세포 단독인 경우 비교하여 이식 세포의 생착 비율이 높다. 이러한 세포 조합은 통합 줄기세포군으로 일컫는다. 본 발명은 또한 통합 줄기세포군의 확인과 제조를 위한 시험관내 방법과 생체내 방법 및 이식 모델을 제공한다. 본 발명에 따라서 태반 줄기세포를, 예를 들어 제대혈 유래 줄기세포 또는 전구세포, 태아 또는 신생아 줄기세포 또는 전구세포, 성체 줄기세포 또는 전구세포, 조혈 줄기세포 또는 전구세포, 골수 유래 줄기세포 또는 전구세포와 통합할 수 있다.

태반 줄기세포, 제2 세포원, 이식,

Description

태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 공동 배양{Co-Culture of Placental Stem Cells and Stem Cells from a Second Source}

본 발명에서는 제2 세포원(細胞源 source)으로부터 얻은 줄기세포군 및/또는 전구세포군에 대한 태반 유래 줄기세포군의 비율을 최적화하는 시험관내와 생체내 방법을 제공하여,태반 줄기세포군 또는 제2 세포원으로부터의 줄기세포를 단독으로 사용하는 경우보다 더 향상된 생착 잠재력(engraftment potential)을 지니는 통합 줄기세포군을 이룩한다. 본 발명은 또한 태반 유래 줄기세포와 제2 세포원으로부터 유래한 줄기 또는 전구세포를 함유하는 통합 줄기세포군을 제공하는데, 이 통합 세포군은 태반 줄기세포 또는 제2 세포원으로부터의 줄기세포 단독인 경우 비교하여 이식 성공 비율이 높다. 본 발명에 따라서 태반 유래 줄기세포를, 예를 들어 제대혈 유래 줄기세포 또는 전구세포, 태아 또는 신생아 줄기세포 또는 전구세포, 성체 줄기세포 또는 전구세포, 조혈 줄기세포 또는 전구세포, 골수 유래 줄기세포 또는 전구세포와 통합할 수 있다. 줄기세포 이식이 필요한 개체, 예를 들어 골수 절제 치료를 받아 면역계와 조혈계를 재수립하여야 하는 개체 또는 줄기세포의 도입에 의하여 치료할 수 있는 질병, 질환 또는 상태를 가지는 개체에게 이 통합 세포군을 이식할 수 있다. 본 발명의 통합 줄기세포군은 줄기세포 투여로 혜택을 입을 수 있는 모든 상태에 쓰일 수 있는데, 여기에는 빈혈 등의 혈액 장애, 신경학적 장애, 면역 장애 등이 포함된다.

사람 줄기세포는 여러 종류의 성숙한 세포 계통을 생성할 수 있는 전능성(totipotent)이거나 다능성(pluripotent)인 전구세포(precursor cell)이다. 줄기세포는 혹 모든 조직이 아니라면 수많은 조직을 재성하고, 생체적·해부학적 기능을 되살리는데 쓰일 수 있다. 예를 들어 줄기세포를 함유하는 세포군은 절제 시술을 받은 환자들에서 조혈 기능을 부분적으로 또는 완전하게 회복하는데 쓰인 바 있다.

최근 Hariri는 포유류 태반에서 줄기세포를 분리하고 이들 세포의 특성을 파악하였다고 보고하였다. Hariri의 미국 출원 공보 제2002/0123141호 "Method of collecting Placental Stem Cells",

Hariri의 미국 특허 출원 공보 제2002/0160510호 "Renovation and Repopulation of Decellularized Tissues and Cadaveric Organs by stem cells", Hariri의 미국 출원 공보 제2003/0032179호 "Post-partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom"와 Hariri의 미국 출원 공보 제2003/0180269호 "Embryonic-like Stem Cells Derived From Post-partum Mammalian Placenta, and Uses and Methods of Treatment Using Said Cells"를 참조하라.

수많은 서로 다른 포유류 줄기세포들의 특성이 분석된 바 있다. 예를 들어 Caplan 외 미국 특허 제5,486,359호(사람 중간엽 줄기세포); Hu 외, 제WO 00/73421(사람 양막 상피 세포의 분리, 냉동보존과 치료 용도에 관한 방법); Boyse 외 미국 특허 제5,004,681호(태아와 신생아 조혈줄기세포와 전구세포); Boyse 외 미국 특허 제5,192,553호 (상동); Beltrami 외, Cell 114(6):763~766 (2003) (심근 줄기세포); Forbes 외, J. Pathol 197(4):510~518 (2002) (간 줄기세포)를 보라.

줄기세포 이식의 성공은 생착 가능한(engraftable) 세포를 얼마나 많이 투여하느냐에 현저하게 관련이 있다. 예를 들어 하나의 기증자로부터 얻을 수 있는, 한 단위의 제대혈 속 생착 가능한 세포의 수는 몇백배 차이가 날 수 있다. 예를 들어, Gluckman의 혈액학(미국 혈액학회 교육 프로그램 교재, 1~14(1998))을 보라. 따라서 제대혈 단위, 제대혈 유래 유핵세포 또는 기타 줄기세포의 생착 잠재력을 특히 이식 수술 전에 향상시킬 방법이 필요하다.

발명의 요약

본 발명에서는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대한 태반 유래 줄기세포의 비율을 결정함으로써 태반 줄기세포 단독 또는 제2 세포원의 줄기세포 단독인 경우보다 더 많은 수의 콜로니 형성 단위(colony-forming unit)를 형성하거나 생체내에서 생착이 향상된 줄기세포군을 생산한다. 본 발명은 세포 배양물 또는 줄기세포 단위, 전구세포 또는 제대혈과 같이 줄기 또는 전구세포를 함유하는 조직, 혹은 이들의 조합의 생착 잠재력(engraftment potential)을 향상 및/또는 촉진하는 방법을 제공한다. 특히 본 발명은 제2 세포군으로부터 얻은 줄기세포, 예를 들어 제대혈 또는 태반 혈액이나 이들로부터 얻은 줄기세포를 태반 줄기세포와 통합한 세포군의 생착 잠재력을 향상 및/또는 촉진하기 위한 방법과 조성물을 제공한다. 본 명세서에서는 이러한 세포군을 "통합 줄기세포군(combined stem cell population)"으로 일컫는다. 본 발명은 나아가 상기 통합 줄기세포군을 생체내에서 사용하는 방법을 제공한다. 바람직한 한 실시 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 태반 관류물(perfusate)로부터 얻은 세포군 속에 포함되는 태반 줄기세포들이다.

한 실시 태양에서, 본 발명은 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 수에 대한 태반 줄기세포의 비율을 정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 전체 세포 수 중에서, 태반 줄기세포의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대한 비율을 정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 콜로니-형성 단위의 형성을 허용하기에 충분한 시간과 조건 하에서 상기 비율에 따라 공동 배양하면, 동일한 전체 세포 수를 가지는 태반 줄기세포만의 세포군 또는 제2 세포원의 줄기세포만의 세포군보다 더 많은 콜로니-형성 단위를 형성한다. 이렇게 함으로써 통합 세포군을 형성하는 비율을 확인한다. 한 특정 실시 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 태반 줄기세포만을 줄기세포가 필요한 개체에 이식한 경우나 제2 세포원의 세포만을 이식한 경우보다, 같은 수의 세포를 동일한 개체에 이식하였을 때 더 높은 생착률을 나타낸다.

한 태양에서, 본 발명은 통합 줄기세포군을 확인하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 시험관내에서 콜로니-형성 단위를 형성하는데 충분한 시간과 조건 하에서 태반 줄기세포를 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포와 다양한 비율로 접촉시키는 단계와 상기 다양한 비율 중에서 가장 많은 수의 콜로니-형성 단위를 생산하는 비율을 확인하는 단계를 포함하고, 이때 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 이 비율로 혼합되었을 때 통합 줄기세포군으로 동정된다. 한 실시 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 줄기세포가 필요한 한 개체에 이식되었을 때 세포 생착률을 향상시킨다.

더 구체적인 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 줄기세포가 필요한 개체 내에서 이식 후 적어도 제 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일째까지 혹은 그 시점에 생착률을 향상시킨다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 줄기세포가 필요한 개체 내에서 이식 후 적어도 제21일째까지 혹은 그 시점에 생착률을 향상시킨다. 특정 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 줄기세포가 필요한 개체 내에서 이식 후 적어도 25, 30, 35, 40, 50, 55째 주 또는 1년 혹은 더 오랜 동안, 혹은 그 해당 시점에서의 생착률을 향상시킨다.

다른 특정 태양에서, 상기 접촉은 상기 태반 줄기세포와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 같은 물리적 공간 안에서 배양하는 것을 포함한다. 다른 특정 태양에서, 상기 접촉은 상기 태반 줄기세포와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 배양 배지를 고유하는 별도의 물리적 공간 속에서 배양하는 것을 포함한다.

다른 실시 태양에서, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 제대혈에서 유래한 줄기세포이다. 다른 태양에서, 태반 줄기세포는 CD34⁺ 세포, 예를 들어 CD34⁺CD38⁺ 세포 및/또는 CD34⁺CD38^- 세포를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 태반 줄기세포는 표지 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73 또는 CD105 중 적어도 하나를 발현하고, 표지 CD34, CD38, CD45, SSEA3과 SSEA4 중 하나 이상을 결여하는 세포를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 태반 줄기세포는 표지 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73 또는 CD105에 대하여 양성이고, 표지 CD34, CD38, CD45, SSEA3과 SSEA4에 대하여 음성인 세포를 포함한다. 다른 태양에서, 태반 줄기세포는 표지 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73과 CD105를 하나 이상 함유하고, 표지 CD34, CD38, CD45, SSEA3과 SSEA4 중 하나 이상을 결여하는 세포를 포함한다. 다른 태양에서, 태반 줄기세포는 표지 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73과 CD105에 대하여 양성이고, 표지 CD34, CD38, CD45, SSEA3과 SSEA4에 대하여 음성인 세포를 포함한다. 다른 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD34^- 세포를 포함한다. 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD34^-CD38^- 태반 줄기세포이다. 다른 태양에서 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺ 또는 ABC-p⁺ 세포이다. 더 구체적인 태양에서 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺ 이고 ABC-p⁺인 세포이다. 다른 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD10, CD29, CD33, CD44, CD73, CD105, CD117과 CD133에 대하여 양성이고 CD34 또는 CD45에 대하여 음성인 세포를 함유한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 HLA-ABC⁺인 세포를 함유한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 HLA-ABC^-인 세포를 함유한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 HLA-DR⁺인 세포를 함유한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 HLA-DR^-인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD200⁺이고 HLA-G⁺인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD200⁺이고 OCT-4⁺인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺인 세포를 함유하는데, 이러한 줄기세포들은 이 세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배아유사체(embryoid-like body)의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때, 상기 분리된 태반 세포군이 배아유사체를 형성하도록 촉진한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺인 세포를 함유하는데, 이러한 줄기세포들은 이 세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배아유사체(embryoid-like body)의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때, 상기 분리된 태반 세포군이 배아유사체를 형성하도록 촉진한다.

특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 하나의 태반으로부터 얻는다. 다른 특정 태양에서는 상기 태반 줄기세포를 여러 개의 태반으로부터 얻는다. 다른 특정 태양에서는, 상기 태반 줄기세포를 태반 관류물로부터 얻는다. 다른 특정 태양에서는, 관류 용액으로 상기 태반을 관류함으로써 상기 태반으로부터 상기 태반 줄기세포를 얻는다. 더 구체적인 태양에서, 상기 관류 용액은 단백질 분해 효소 또는 점액 분해 효소를 함유한다. 다른 구체 태양에서는, 태반 또는 태반의 일부를 물리적으로 파괴하여 상기 태반 줄기세포를 얻는다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 물리적 파괴는 상기 태반 줄기세포를 단백질 분해 효소 또는 점액 분해 효소에 접촉시켜 이루어진다. 더욱 더 구체적인 태양에서는 상기 단백질 분해 효소가 콜라게나아제(예를 들어 콜라게나아제 I, 콜라게나아제 IV), 트립신(예를 들어, 트립신-EDTA), 엘라스타제, 디스파제 또는 이들의 혼합물이다. 또 다른 더욱 구체적인 태양에서는, 상기 점액 분해 효소가 히알루로니다제(hyaluronidase)이다.

다른 특정 태양에서, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 제대혈 유래 줄기세포이다. 더 구체적인 태양에서, 상기 제대혈 유래 세포는 조혈 줄기세포이다. 다른 특정 태양에서는 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 현탁액 속에서 통합한다. 다른 특정 태양에서, 본 발명은 생활성 물질을 상기 통합 줄기세포군에 가하는 단계를 더 포함한다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 생활성 물질은 사이토킨 또는 성장 인자이다.

본 발명은 또한 다수의 세포가 시험관내에 포함된 통합 세포군을 제공하는데, 여기서 상기 다수의 세포는 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 포함하며, 이 때 상기 통합 줄기세포군은 콜로니-형성 단위를 형성할 수 있는 시간과 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 통합 줄기세포군의 다수의 세포와 같은 수로 태반 줄기세포만을 배양 또는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만을 배양한 경우보다 콜로니-형성 단위를 더 많이 형성한다. 본 발명은 나아가 다수의 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 시험관내에 포함하는 통합 줄기세포군을 제공하는데, 여기서 상기 통합 줄기세포군의 줄기세포를 이식하면 상기 통합 줄기세포군과 같은 수의 태반 줄기세포만을 또는 같은 수의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만을 이식하는 경우보다 생착률이 향상된다. 다른 특정 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 상기 태반 줄기세포와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 어느 한 비율로 포함하는데, 이 비율은 콜로니-형성 단위의 형성을 허용하는 조건 항에서 여러 가지 세포 비율 중 가장 많은 콜로니-형성 단위를 낳는 비율을 선택한 것이다. 한 특정 태양에서, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 제대혈 줄기세포, 골수 줄기세포, 조혈 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 조혈 줄기세포는 제대혈 조혈 줄기세포이다. 더 구체적인 태양에서, 상기 조혈 줄기세포는 CD34⁺ 세포이다. 다른 구체 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD34⁺ 세포를 포함한다. 다른 구체 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD34^- 세포를 포함한다. 다른 구체 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺ 또는 ABC-p⁺ 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 사기 태반 줄기세포는 CD34⁺ 세포와 OCT-4⁺ 또는 ABC-p⁺인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서는 실질적으로 적혈구와 세포 파편이 없는 태반 관류물 속에 상기 태반 줄기세포를 포함한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 태반 관류물에서 분리된 태반 줄기세포이거나, 이를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 이 태반 줄기세포는 태반 관류물로부터 얻은 총 유핵세포 속에 포함된다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 태반 관류물로부터 얻은 세포군 속에 포함된다. 다른 특정 태양에서, 상기 조성물은 태반 조직을 효소 소화하여 분리한 태반 세포를 포함한다. 다른 특정 태양에서는 상기 태반 줄기세포와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 같은 개체로부터 얻는다. 다른 특정 태양에서는 상기 태반 줄기세포와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 서로 다른 개체들로부터 얻는다. 다른 특정 태양에서는 상기 태반 줄기세포를 여러 개의 태반으로부터 얻는다. 다른 특정 태양에서는 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 여러 개체들로부터 얻는다.

다른 실시 태양에서, 상기 통합 줄기세포군 속의 태반 줄기세포는 CD34⁺ 세포, 예를 들어 CD34⁺CD38⁺ 세포 및/또는 CD34⁺CD38^- 세포를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 태반 줄기세포는 표지 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73 또는 CD105 중 적어도 하나를 발현하고, 표지 CD34, CD38, CD45, SSEA3과 SSEA4 중 하나 이상을 결여하는 세포를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 태반 줄기세포는 표지 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73 또는 CD105에 대하여 양성이고, 표지 CD34, CD38, CD45, SSEA3과 SSEA4에 대하여 음성인 세포를 포함한다. 다른 태양에서, 태반 줄기세포는 표지 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73과 CD105를 하나 이상 함유하고, 표지 CD34, CD38, CD45, SSEA3과 SSEA4 중 하나 이상을 결여하는 세포를 포함한다. 다른 태양에서, 태반 줄기세포는 표지 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73과 CD105에 대하여 양성이고, 표지 CD34, CD38, CD45, SSEA3과 SSEA4에 대하여 음성인 세포를 포함한다. 다른 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD34^- 세포를 포함한다. 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD34^-CD38^- 태반 줄기세포이다. 다른 태양에서 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺ 또는 ABC-p⁺이다. 더 구체적인 태양에서 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺ 이고 ABC-p⁺이다. 다른 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD10, CD29, CD33, CD44, CD73, CD105, CD117과 CD133에 대하여 양성이고, CD34 또는 CD45에 대하여 음성인 세포를 함유한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 HLA-ABC⁺인 세포를 함유한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 HLA-ABC^-인 세포를 함유한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 HLA-DR⁺인 세포를 함유한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 HLA-DR^-인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD200⁺이고 HLA-G⁺인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD200⁺이고 OCT-4⁺인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺인 세포를 함유하는데, 이러한 줄기세포들은 이 세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배아유사체(embryoid-like body)의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때, 상기 분리된 태반 세포군이 배아유사체를 형성하도록 촉진한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺인 세포를 함유하는데, 이러한 줄기세포들은 이 세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배아유사체(embryoid-like body)의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때, 상기 분리된 태반 세포군이 배아유사체를 형성하도록 촉진한다.

다른 실시 태양에서, 상기 통합 줄기세포군 속의 태반 줄기세포 또는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 알데히드 탈수소효소(ALDH) 양성이고 CD34⁺인 세포를 포함한다. 이러한 세포들은 ALDH 분석에서 측정 가능한 ALDH 농도를 나타낸다. 따라서 많은 실시 태양에서, 본 발명의 통합 줄기세포군은 CD34⁺인 세포를 포함하는데, 여기서 이 CD34⁺ 줄기세포들 중 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%가 ALDH⁺이다.

본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체에 통합 줄기세포군, 예를 들어 태반 관류물, 태반 효소 소화물 또는 이들로부터 유래한 태반 줄기세포를 제대혈 또는 제대혈 유래 줄기세포와 통합한 세포 혼합물이 함유된 약학적 조성물을 제공한다. 많은 특정 태양에서, 상기 통합 줄기세포군 속의 태반 줄기세포는 하나의 기증자 또는 여러 기증자로부터 유래할 수 있고, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포도 하나의 기증자 또는 여러 기증자들로부터 유래할 수 있다. 한편 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 모두가 하나의 기증자로부터 또는 여러 명의 기증자들로부터 유래할 수 있다. 본 발명의 방법에서 유용한 통합 줄기세포군은 수용 대상자와 전면적으로 HLA 일치하는 줄기세포군 또는 전구세포군은 물론, 전면적으로 또는 부분적으로 HLA 불일치하는 줄기세포군도 포함할 수 있다.

통합 줄기세포군, 예를 들어 태반 관류물 또는 태반 관류물에서 유래한 줄기세포 및/또는 전구세포가 최적 비율로 보강된 제대혈은 여러 가지 용도에 쓰이는데, 여기에는 예방, 치료와 진단 용도가 있다. 본 발명의 한 실시 태양에서는 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 함유하는 상기 통합 줄기세포군이 조직과 장기를 쇄신하고 세포를 채워 넣는데 쓰이는데, 이를 통하여 병든 조직, 장기 또는 그 중 일부를 대체하거나 수리하게 된다. 다른 태양에서는 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 함유하는 상기 통합 줄기세포군이 골수의 부분 또는 완전 절제 시술을 받은 개체에서 조혈 기능 수립을 촉진하는데 쓰인다. 다른 태양에서 상기 통합 줄기세포군은 치사량 또는 치사량 미만의 방사능에 노출된 개체의 조혈 기능 재수립을 촉진하는데 쓰인다.

본 발명은 또한 통합 줄기세포군을 투여하는 이식 방법과 이러한 이식이 필요한 개체의 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 개체에 다수의 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 소정의 비율로 투여하는 단계를 포함하고, 이때 상기 비율로 통합되어 투여된 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 세포군은 같은 세포 수로 태반 줄기세포만의 세포군을 투여한 경우 또는 같은 세포 수로 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만의 세포군을 투여한 경우보다 더 향상된 세포 생착을 나타낸다. 더 구체적인 태양에서, 상기 통합 줄기세포군의 이식은 같은 세포 수로 태반 줄기세포만의 세포군을 투여한 경우 또는 같은 세포 수로 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만의 세포군을 투여한 경우와 비교했을 때, 줄기세포가 필요한 개체 내에서 이식 후 적어도 제 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일째까지 혹은 그 시점에 생착률을 향상시킨다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 줄기세포가 필요한 개체 내에서 세포 생착률을 이식 후 21일보다 더 오래 동안 향상시킨다.

더 구체적인 실시 태양에서, 상기 비율은 콜로니-형성 단위 형성을 허용하는 조건 하에서, 상기 통합 줄기세포군으로 하여금 같은 총 세포 수를 가지는 태반 줄기세포만의 세포군 또는 같은 총 세포 수를 가지는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만의 세포군보다 시험관내에서 더 많은 콜로니-형성 단위를 생산하게 하는 비율이다. 다른 구체 태양에서, 상기 비율은 콜로니-형성 단위 형성을 허용하는 조건 하에서, 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 여러 비율로 시험관내에서 통합하였을 때, 그 중 가장 많은 수의 콜로니-형성 단위를 낳는 비율이다. 즉, 만약 X가 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 더한 수라면, 그러한 실시 태양에서 태반 줄기세포의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대한 세포 수가 상기 비율인 세포군은 세포 수 X 개의 태반 줄기세포만의 세포군이나, 세포 수 X 개의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만의 세포군보다 시험관내에서 더 많은 콜로니-형성 단위를 생성한다.

본 발명은 나아가 본 발명의 통합 줄기세포군을 제조하는 데에 쓰이는 HLA-특성 분석된(HLA-characterized) 태반 유래 줄기세포 은행을 수립한다. 한 실시 태양에서, 본 발명은 태반 유래 줄기세포 단위를 여러 개 포함하는 줄기세포 은행을 제공하는데, 여기서 상기 태반 유래 줄기세포는 적어도 하나의 HLA 표지에 의하여 동정할 수 있다. 한 특정 실시 태양에서, 상기 태반 유래 줄기세포는 태반 관류물로부터 분리한 것이다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 유래 줄기세포는 태반 관류물로부터 분리한 유핵세포군 속에 포함된다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 유래 줄기세포는 CD34⁺ 줄기세포이다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 유래 줄기세포는 CD73 또는 CD105에 대하여 양성이고, 항체 SH2, SH3 또는 SH4와 결합하고 있다. 다른 특정 태양에서, 상기 줄기세포 은행은 복수의 태반 혈액 단위 또는 제대혈 단위들을 더 포함한다. 다른 특정 태양에서, 적어도 한 단위의 상기 복수의 태반 혈액 또는 제대혈은 복수의 태반 유래 줄기세포 단위들 중 하나와 HLA 표지를 공유함으로써 동정할 수 있다. 다른 특정 태양에서, 상기 복수의 태반 혈액 단위 또는 제대혈 단위 중 대다수는 상기 여러 개의 태반 유래 줄기세포 단위들 중 대다수가 공유하는 HLA 표지에 의하여 동정할 수 있다.

용어의 정의

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 태반과 관련되어 사용되는 경우 “실혈된(exsanguinated)” 또는 “실혈(exsanguination)”은 태반으로부터 제대혈을 실질적으로 전부 제거 및/또는 배출하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "계대(passage)"라는 용어는, 세포 배양과 관련했을 때는, 한 배양물로부터 복수의 세포를 분획하여 별도 용기로 옮겨 새 세포 배양을 시작하는 것을 뜻한다. 전형적인 경우에, 계대는 예를 들어 한 용기 속 한 배양물로부터 10⁴~10⁵ 개의 세포를 별도 용기 속 새 배지로 분획하여 옮기는 과정을 포함한다. 배양 중인 세포가 컨플루언스(confluence)에 이를 경우, 즉 부착 세포로 된 단일층이 세포가 자랄 수 있는 표면 전부를 한 층으로 덮을 때 계대하는 것이 전형적이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “관류한다(perfuse)” 또는 “관류(perfusion)”는 복수의 태반 세포를 수집하기에 충분한 힘으로 유체를 태반 혈관계 속으로 통과시키는 것을 의미한다. 본 명세서에서 "관류물(perfusate)”은 태반을 통하여 나온 유체를 수집한 것으로서, 관류하는 동안 수집된 세포들을 포함한다.

본 명세서에서 "태반 혈액"과 "제대혈" 또는 "탯줄 혈액"는 같은 의미이다.

본 명세서에서, "태반 줄기세포"와 "태반 유래 줄기세포"는 같은 의미이다.

본 명세서에서, "태반 줄기세포"라는 용어는 형상, 세포 표면 표지 등과 무관하게 포유류 태반 혹은 그 일부(예를 들어, 양막, 융모막 등)로부터 얻거나 유래한 줄기세포로서 영양막 세포(trophoblast)를 제외한 것을 가리킨다. 이 용어는 태반으로부터 직접 얻은 줄기세포, 예를 들어 태반 관류물 또는 소화된 태반 조직 속의 태반 세포군을 포함하는 세포들과 증폭 및/또는 한 번 이상 계대한 태반 세포군을 포함하는 세포들을 망라한다. 이 용어는, 그러나, 전적으로 다른 조직, 예를 들어 태반 혈액 또는 제대혈로부터 유래한 줄기세포를 망라하지는 않는다. 태반은 예를 들어 서로 구별되는 표지를 나타내고, 이로써 구별할 수 있는 줄기세포의 군을 포함한다.

본 명세서에서, "양성"이란, 줄기세포 표지와 관련하여, 그 표지가 기준이 되는 다른 비줄기세포, 예를 들어 섬유모세포의 경우와 비교하였을 때 더 많은 양, 또는 더 높은 농도로 존재하는 것을 의미한다. 더 일반적으로, 세포는 어느 표지가 세포 내부 또는 표면에 존재하기 때문에 그 표지를 이용하여 그 세포를 하나 이상의 다른 세포 유형과 구별할 수 있으면 그 표지에 대하여 양성이 된다.

본 명세서에서, "제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포"란 포유류 태반이 아닌 모든 세포원으로부터 얻은 포유류 줄기세포(전구세포원 포함)를 뜻한다.

본 명세서에서 "줄기세포"는 줄기세포와 전구세포를 망라한다.

본 명세서에서, "단위"란, 제대혈 또는 태반 혈액과 관련하여, 한 기증자로부터 수집한 혈액이거나 그 수집한 혈액으로부터 얻을 수 있는 유핵세포 또는 줄기세포를 의미한다. 한 기증자로부터 얻은 혈액의 양은 약 50 내지 약 150 mL인 것이 전형적이다. 태반 관류물과 관련하여, "단위"란 하나의 태반으로부터 태반 줄기세포 또는 전구세포를 수집하기 위하여 쓰이는 관류액의 양을 뜻하거나, 그러한 양의 관류액으로부터 얻을 수 있는 유핵세포 또는 줄기세포를 의미한다. 한 단위의 태반 관류액의 부피는 약 100~500 mL 내지 약 1000 mL인 것이 전형적이다.

발명의 내용

본 출원은 2006년 12월 29일 출원된 미국 예비 출원 제60/754,692호의 우선권을 주장하며, 그 개시 내용은 본 명세서의 참고 문헌으로 들어 있다.

본 발명은 (1) 태반 줄기세포, 예를 들어, 사람 태반 관류물 속의 태반 줄기세포, 태반 효소 소화물 속의 태반 줄기세포, 분리된 태반 줄기세포 또는 전구세포 등과 (2) 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포로 이루어진 통합 세포군을 제공하는데, 여기서 이 통합 세포군의 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 같은 세포 수로 태반 줄기세포만을 배양 또는 같은 세포 수로 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만을 배양한 경우보다 콜로니-형성 단위를 더 많이 형성하게 하여 주는 비율로 혼합된다. 본 발명은 나아가 같은 세포 수로 태반 줄기세포만의 세포군을 이식한 경우 또는 같은 세포 수로 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만의 세포군을 이식한 경우와 비교하였을 때 더 향상된 생체내 세포 생착을 나타내는 통합 세포군을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 비율과 그에 따른 통합 세포군을 찾는 방법, 그리고 이 통합 세포군을 이용하는 방법을 제공한다.

1. 태반 줄기세포 와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 의 통합 세포군의 최적화

1.1. 시험관내 분석법

본 발명에서는 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 통합 줄기세포군으로서, 같은 세포 수의 태반 줄기세포만을 또는 같은 세포 수의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만을 단독으로 사용하는 경우보다 더 향상된 생착 잠재력(engraftment potential)을 지니는 통합 줄기세포군을 동정하는 시험관내 공동 배양 방법을 제공한다. 본 발명의 시험관내 공동 배양 분석법은 따라서 세포 수와 관련 없이 콜로니-형성 단위 수와 생착 능력을 향상시키는 태반 줄기세포의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대한 비율을 찾아낸다.

본 발명의 한 실시 태양에서는, 예를 들어, 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 수에 대한 태반 줄기세포의 비율을 정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 전체 세포 수 중에서 태반 줄기세포의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대하여 가지는 비율을 정하는 단계를 포함하며, 이러한 비율의 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 콜로니-형성 단위의 형성을 허용하기에 충분한 시간과 조건 하에서 상기 비율에 따라 공동 배양하면, 동일한 전체 세포 수를 가지는 태반 줄기세포만의 세포군 또는 제2 세포원의 줄기세포만의 세포군보다 더 많은 콜로니-형성 단위를 형성한다. 다른 실시 태양에서는 여러 가지 비율에 따른 공동 배양 결과를 비교하면서 전체 세포 수 중 태반 줄기세포가 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대하여 차지하는 비율을 정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 콜로니-형성 단위를 형성하는데 충분한 시간과 조건 하에서 태반 줄기세포를 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포와 시험관내에서 다양한 비율로 접촉시키는 단계와 상기 다양한 비율 중에서 가장 많은 수의 콜로니-형성 단위를 생산하는 비율을 확인하는 단계를 포함한다. 구체적인 한 실시 태양에서는, 상기 비율에 따라 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 수용 대상자에게 이식하면, 같은 세포 수로 태반 줄기세포만을 이식한 경우, 또는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만을 이식한 경우보다 수용 대상자 내의 세포 생착이 향상된다. 더 구체적인 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 줄기세포가 필요한 개체 내에서 이식 후 적어도 제 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 동안 그 시점에 생착률을 향상시킨다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 줄기세포가 필요한 개체 내에서 이식 후 21일보다 더 오랜 동안 생착률을 향상시킨다.

1.1.1. 태반 유래 줄기세포

본 발명의 방법과 조성물에 유용한 태반 유래 줄기세포로는 예를 들어, 배아 유사 세포, 다능성 세포, 중복성 세포, 수임 전구세포, 조혈 전구세포와 태반으로부터 얻는 중간엽 유사 줄기세포가 있다. 한 실시 태양에서, 이 태반 유래 줄기세포는 태반 관류물 속에 포함되거나 이로부터 유래한다.

본 발명의 방법에 쓰이는 태반 유래 줄기세포는 하나의 태반 또는 여러 개의 태반에서 유래하거나 어떠한 방법을 이용하여 얻어도 무방하다. 태반 유래 줄기세포는 예를 들어, 미국 특허 출원 제2002/0123141호와 2003/0032179호에 기재된 것처럼 관류를 이용하여 얻을 수 있는데, 이 기재 내용은 본 명세서의 참고 문헌이다. 이러한 관류는 팬 방법(pan method)을 사용하여 이루어질 수 있는데, 여기서느 관류액을 태반 혈관계 속으로 강제로 관통시키며, 태반, 전형적으로는 태반의 모체쪽에서 스며나오는 액체를 상기 채반을 담고 있는 팬으로 수집하게 된다. 한편 폐쇄 회로식 관류도 가능한데, 여기서는 관류액의 통과와 수집이 오로지 태아쪽 태반 혈관계 속에서 이루어진다. 한 구체 태양에서, 이러한 관류는 연속 방식, 즉 태반을 이미 관통하여 다수의 태반 세포를 함유하는 관류액을 태반 세포의 분리 전에 한 차례 더, 혹은 여러 차례 더 태반 관통시키는 방식을 취한다.

한편 태반을 물리적 또는 효소 소화로 파괴하여, 이를 테면 단백질 분해 효소 및/또는 다른 조직 파괴 효소를 이용하여 태반의 다세포 구조를 파괴하여 태반 유래 줄기세포를 얻을 수도 있다. 이러한 단백질 분해 효소로는 중성 단백 분해 효소 또는 금속단백 분해 효소, 예를 들어 콜라게나아제, 디스파제, 트립신, 엘라스타제 등을 들 수 있다. 한편 점액 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제를 이용한 태반의 물리적 파괴에 의해서도 태반 줄기세포를 얻을 수 있다.

본 발명에서 분리되고 관류된 태반은 대량의 줄기세포의 공급원 역할을 하는데, 이 세포들은 예를 들어 CD34⁺CD38^- 세포, 예를 들어, CD34⁺, CD38^-, lin^- 세포와 같이 CD34⁺ 줄기세포로 농축된 세포들이거나, 예를 들어 CD34^-CD38⁺ 세포와 같이 CD34^- 줄기세포로 농축된 세포들이다. 태반에서 첫번째 수집한 혈액을 제대혈이라 하며, 대부분 CD34⁺CD38⁺ 조혈 전구세포를 포함한다. 산후 관류 후 첫 24 시간내에 고농도(예를 들어 1×10⁵ 내지 약 2×10⁷)의 CD34⁺CD38^- 조혈 전구세포를 높은 농도의 CD34^-CD38⁺ 세포와 함께 태반으로부터 분리할 수 있다. 관류 약 24시간 후에 고농도(예를 들어 1~10×10⁶)의 CD34^-CD38^- 세포들을 상기 언급한 세포와 함께 태반으로부터 분리할 수 있다. 24 시간 또는 그 이상 관류된 분리된 태반은 CD34^-CD38^- 세포가 농축된 줄기세포들의 대량 공급원이 된다.

다른 실시 태양에서, 본 발명의 통합 세포군은 알데히드 탈수소효소(ALDH)에 대하여 양성인 CD34⁺ 태반 줄기세포를 포함한다. 이러한 세포는 ALDH 분석에서 측정 가능한 ALDH 농도를 나타낸다. 이러한 분석법은 종래 기술(예를 들어 Bostian과 Betts의 Biochem . J., 173, 787, (1978)을 보라)로 잘 알려져 있다. 특정 태양에서, 상기 ALDH 분석법은 ALDEFLUOR(미국 오레곤 주 Ashland의 Aldagen Inc.사)를 알데히드 탈수소효소 활성의 지표로 사용한다. 따라서 다양한 실시 태양에서 본 발명의 통합 줄기세포군은 CD34⁺ 줄기세포로서 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 세포가 ALDH⁺인 세포를 함유한다.

사람 태반 줄기세포 중 적어도 한 세포 유형은 배아 줄기세포 또는 생식 세포의 특징을 가진다. 예를 들어, 이 유형의 줄기세포는 SSEA3^-(stage-specific embryonic antigen 3), SSEA4^-, OCT-4⁺(줄기세포 전사 인자의 일종)이고 ABC-p⁺ (ATP-결합성 카세트(ABC) 운반 단백질)인데, 이는 분화를 아직 거치지 않은 다능성 줄기세포가 나타내는 표지 특성이다. 따라서 본 발명의 방법과 조성물은 비배아성 태반 줄기세포로서 예를 들어, SSEA3^- SSEA^- OCT-4⁺ 또는 ABC-p⁺인 세포들을 포함하거나 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 태반 줄기세포가 OCT-4⁺ABC-p⁺이며, 더욱 바람직하게는 SSEA3^-SEA4^-OCT-4⁺ABC-p⁺이다. 다른 태양에서 본 발명은 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73 또는 CD105 중 적어도 하나에 대하여 양성인 태반 줄기세포 또는 CD34, CD38 혹은 CD45 중 적어도 하나에 대하여 음성인 태반 줄기세포를 사용하는 것을 포함한다. 다른 실시 태양에서, 본 발명의 조성물과 방법은 태반 줄기세포로서 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73 또는 CD105를 가지고 있거나 양성이고 또한 CD34, CD38 또는 CD45에 대하여 음성이거나 결여하고 있는 세포를 사용하거나 포함한다. 다른 태양에서 본 발명의 조성물과 방법은 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73 또는 CD105 중 적어도 하나에 대하여 양성이거나 CD34, CD38 또는 CD45 중 적어도 하나에 대하여 음성인 태반 줄기세포를 이용하거나 포함한다. 다른 태양에서 본 발명은 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73 또는 CD105를 가지고 있거나 양성이고 또한 CD34, CD38 또는 CD45에 대하여 음성이거나 결여하고 있는 세포를 사용하는 것을 포함한다.

한 실시 태양에서, 본 발명의 조성물과 방법에 쓰이는 태반 줄기세포는 표지 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD105(SH2), CD73(SH3, SH4), OCT-4 및/또는 ABC-p의 존재 및/또는 표지 CD34, CD38, CD45, SSEA3 혹은 SSEA4의 부존재에 의하여 확인할 수 있다. 한 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD73⁺, CD90⁺, CD105⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, OCT-4⁺, ABC-p⁺이다. 다른 특정 태양에서, 이 태반 줄기세포는 CD200⁺이고 HLA-G⁺이다. 여기서, "SH2⁺", "SH3⁺", "SH4⁺"는 그 줄기세포가 각각 항체 SH2, SH3, SH4와 결합하고 있음을 의미한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺이다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD200⁺이고 OCT-4⁺ 이다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺이고, 이 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배아유사체(embryoid-like body)의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때, 상기 분리된 태반 세포군이 배아유사체를 형성하도록 촉진한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺이다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺인데, 이러한 줄기세포들은 이 세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배아유사체(embryoid-like body)의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때, 상기 분리된 태반 세포군이 배아유사체를 형성하도록 촉진한다. 본 명세서에서, "배아유사체"란 부착 줄기세포층으로부터 출현하는 분화 과정 중인 세포와 분화 완료한 세포의 3차원적 덩어리를 가리킨다.

다른 실시 태양에서, 상기 사람 태반 줄기세포는 MHC 클래스 2 항원을 발현하지 않는다.

한 실시 태양에서, 태반 관류물 유래 줄기세포군은 영양막 세포를 포함한다.

세포 표지, 예를 들어 줄기세포 표지와 세포 표면 표지는 이 분야의 공지 기술, 예를 들어 흐름 세포측정법 또는 형광 표지 세포 분리법(FACS)을 이용하여 분석할 수 있는데, 적절한 형광 발색단으로 표지된 항세포표지로 염색하고 세척함으로써 분석할 수 있다. 예를 들어, CD34 또는 CD38의 존재를 결정하기 위하여 세포들을 PBS로 세척하고 항-CD34 피코에리드린과 항-CD38 이소티오시안산플루오레사인(Becton Dickinson, Mountain View, CA)로 이중염색할 수 있다. 이 세포를 표준적인 흐름 세포 측정장치로 분석한다. 혹은 한편으로 세포내 표지를 표준적인 방법으로 분석할 수도 있다. 세포 표지에 특이적인 항체/형광 발색단 조합으로는 HLA-G에 대한 이소티오시안산플루오레사인(FITC) 결합 모노클론 항체(미국 노스캐롤라이나주 Raleigh의 Serotec으로부터 입수 가능), CD1O(미국 캘리포니아주 산호세의 BD Immunocytometry Systems), CD44(미국 캘리포니아주 산호세의 BD Biosciences Pharmingen)와 CD105(미국 미네소타주 미니아폴리스의 R&D Systems Inc.)에 대한 항체; 피코에리드린(PE) 결합 단일클론 항체로서 CD44, CD200, CD117 및 CD13에 대한 항체(BD Biosciences Pharmingen); 피코에리드린-Cy7(PE Cy 7) 결합 단일클론 항체로서 CD33과 CD1O 에 대한 항체(BD Biosciences); 알로피코시아닌(APC) 결합 스트렙아비딘과 단일클론 항체로서 CD38에 대한 것(BD Biosciences Pharmingen); 그리고 바이오틴화 CD90 (BD Biosciences Pharmingen)을 들 수 있지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 다른 항체/표지 조합으로 쓰일 수 있는 것에는 CD133-APC(Miltenyi), KDR-Biotin (CD309, Abcam), CytokeratinK-Fitc(Sigma사 또는 Dako사), HLA ABC-Fitc(BD), HLA DRDQDP-PE (BD), β-2-마이크로글로불린-PE(BD), CD80-PE(BD)과 CD86-APC(BD), CD45-PerCP(퍼리딘 엽록소 단백질(peridin chlorophyll protein)); CD44-PE; CD19-PE; CD10-F(플루오레사인); HLA-G-F와 7-아미노-악티노마이신-D (7-AAD); HLA-ABC-F 등이 있지만, 여기에 한정되지는 않는다.

태반 줄기세포, 예를 들어 태반 관류물에 포함된 태반 줄기세포는 수집 후 바로 쓰이거나 분석 단계 또는 통합 줄기세포군의 형태로 개체에 투여되기 전에 일정 기간 동안 배양될 수 있다. 예를 들어 한 실시 태양에서는 상기 줄기세포들을 노치(Notch) 작용제, 예를 들어 실질적으로 노치 단백질의 세포내 도메인만으로 이루어진 노치 단백질의 결실 형태나 델타 단백질을 함유하는 배지 속에서 배양할 수 있다. 미국 출원 2004/0067583호를 보라.

1.1.2. 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포

본 명세서에서 기술하는 방법과 조성물은 태반 줄기세포를 제2 세포원, 즉 포유류 태반이 아닌 모든 세포원으로부터 얻은 줄기세포와 통합하여 사용한다. 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 하나 이상 유형의 줄기세포를 포함할 수 있는데, 예를 들어 배야 줄기세포, 배아 생식 세포, 성체 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 비조혈 줄기세포, 골수 유래 줄기세포, 신경 줄기세포, 심근 줄기세포, 눈 줄기세포, 상피 줄기세포, 내피 줄기세포, 간 줄기세포, 폐 줄기세포, 근육 줄기세포, 창자 줄기세포 등이 있다. 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 제2의 비태반 세포원으로부터 분리한 줄기세포이거나, 상기 줄기세포를 함유하는 조직일 수 있다. 태반에 관해서는, 줄기세포를 함유하는 상기 장기의 관류 또는 상기 줄기세포를 함유하는 상기 장기의 조직 파괴 및/또는 효소 소화에 의하여 줄기세포를 분리할 수 있다. 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 예를 들어, 오로지 탯줄 또는 오로지 양수에서 유래한 줄기세포일 수 있다.

관련 조직 시료를 마련하고, 하나 이상의 세포 표면 표지를 이용하여 이 조직으로부터 줄기세포를 분리함으로써 제2 세포원부터 줄기세포를 얻을 수도 있다. 예를 들어, 조혈 줄기세포는 혈액(예를 들어, 말초 혈액, 태반 혈액, 제대혈)시료 또는 골수 시료를 마련하고, 상기 혈액 또는 골수로부터 단핵세포를 부리한 다음 이 분리된 단핵세포로부터 CD34⁺ 세포를 분리함으로써 혈액 또는 골수로부터 얻을 수 있다. 이러한 분리는 잘 알려진 공지 기술을 이용할 수 있는데, 예를 들어 성분 채집(apherisis)에 이어서 자기 비드나 CD34 또는 CD200 등의 해당 세포 표면 표지에 대한 하나 이상의 항체를 포함하는 컬럼을 이용하여 분리하는 방법, 혹은 FACS를 통한 방법이 있다. 혈액을 이용하는 경우, 혈액으로부터 얻은 총 유핵세포(TNC), 예를 들어 말초 혈액, 태반 혈액, 제대혈 등등으로부터 얻은 총 유핵세포 속에 상기 줄기세포가 포함된다.

다른 조직으로부터 비슷한 방법으로 줄기세포를 얻을 수 있다. 중간엽 줄기세포는 예를 들어, CD73, CD105 및/또는 CD45에 대하여 양성인 세포를 골수로부터 분리(예를 들어 미국 특허 제6,387,367호를 보라)할 수 있다. 눈(사지) 줄기세포는 각막 세포를 마련하고 SSEA-4⁺ 세포를 분리함으로써 각막으로부터 얻을 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 제2005/0186672호를 보라). 간 줄기세포는 CD14, CD34, CD38, ICAM, CD45, CD117, 글리코포린 A, 커넥신 32(connexin 32), 오스테오폰틴(osteopontin), 뼈 시알로단백질(bone sialoprotein), 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 또는 이들의 조합을 발현하는 세포를 선별함으로써 간, 특히 태아 간 시료로부터 얻을 수 있다(예를 들어, 미국 출원공보 제 2005/0148072호를 보라). 근육 줄기세포는 조혈 세포 표지를 발현하지 않는 CD34⁺ CD45^- 세포를 선별함으로써 근육 조직으로부터 분리할 수 있다(예를 들어, 미국 출원 공보 제 2005/0079606 호를 보라). 심근 줄기세포는 c-kit^- CD31⁺CD38⁺ 세포를 선별함으로써 심근 조직으로부터 분리할 수 있다(예를 들어, 미국 출원 공보 제 2004/0126879호를 보라). 줄기세포의 분리는 다른 공지 특성 또는 표지를 이용하여서도 이루어질 수 있다.

한 실시 태양에서, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 제대혈 줄기세포이다. 특정 태양에서, 이 제대혈 줄기세포들은 CD34⁺ 줄기세포인데, 예를 들어 CD34⁺CD38⁺ 줄기세포, CD34⁺CD38^- 줄기세포, CD34⁺, CD38^-, lin^- 줄기세포 등이다. 한 특정 태양에서 제2 세포원에서 CD34⁺ 줄기세포는 ALDH⁺이다. 제대혈 그 자체 또는 제대혈로부터 얻은 줄기세포 및/또는 전구세포는 본 발명의 방법에 쓰일 수 있다. 특정 태양에서, 상기 제대혈 유래 세포는 조혈 줄기세포를 포함하는데, 여기서는 통합 줄기세포군을 조혈 이식에 쓰게 된다. 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 한 기증자로부터 얻거나, 동등한 양 혹은 서로 다른 양으로 다수의 기증자로부터 얻을 수 있다. 복수의 제2 세포원(즉 태반이 아닌 세포원)으로부터 얻은 줄기세포는 태반 줄기세포와 통합하여, 본 발명의 방법과 조성물에 쓰일 수 있다.

제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포, 예를 들어 제2 세포원으로부터 얻은 조혈 줄기세포는 수집 후 바로 쓰이거나 분석 단계 또는 통합 줄기세포군의 형태로 개체에 투여되기 전에 일정 기간 동안 배양될 수 있다. 예를 들어 한 실시 태양에서는 상기 줄기세포들을 노치(Notch) 작용제, 예를 들어 실질적으로 노치 단백질의 세포내 도메인만으로 이루어진 노치 단백질의 결실 형태나 델타 단백질을 함유하는 배지 속에서 배양할 수 있다. 미국 출원 2004/0067583호를 보라.

1.1.3. 분석의 파라미터

태반 줄기세포군과 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포군을 얻고 나면, 이 세포들을 시험관내 공동 배양 또는 콜로니-형성 분석법을 통하여 이러한 특정 비율로 통합된 줄기세포들이 같은 세포 수로 태반 줄기세포만을 배양 또는 같은 세포 수로 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만을 배양한 경우보다 콜로니-형성 단위를 더 많이 형성하는지를 분석할 수 있다. 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 모든 통합 비율 중에서 같은 세포 수로 태반 줄기세포만을 배양 또는 같은 세포 수로 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만을 배양한 경우보다 콜로니-형성 단위를 더 많이 형성하는 통합 비율은 본 발명에 따른 통합 줄기세포군의 비율로 정하게 된다.

통합 줄기세포군을 동정하는 분석법으로는 그 분석 방법이 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 증식과 분화를 허용하는 한, 공지 기술에서 흔히 쓰이는 모든 콜로니-형성 단위 분석을 쓸 수 있는데, 예를 들어 Stem Cell Technologies, Inc.사가 제공하는 콜로니 형성 분석법을 쓸 수 있다. 이러한 분석법은 예를 들어, MesenCult^TM 배지(캐나다 브리티시 콜럼비아 주 Stem Cell Technologies, Inc.사)를 이용할 수 있다. 통합 줄기세포군의 동정에는 새로 마련한 세포 또는 냉동 보존 세포로부터 해동한 세포 모두를 쓸 수 있다. 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포은 공동 배양을 위하여 결합할 때, 현탁 상태인 것이 바람직하다. 태반 줄기세포, 그리고 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 생존능, 증식 잠재성과 수명은 이 분야에 알려진 표준적인 기법을 이용하여 평가할 수 있는데, 이들 기법의 예는 다음과 같다: 트리판블루 배제 분석, 디아세트산플루오레사인 흡수 분석, (생존능 평가를 위한)요오드화프로피듐 흡수 분석, 티미딘 흡수 분석, (증식을 평가하는) MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 세포 증식 분석. 수명도 장기 배양시 세포군 배증의 최대값을 측정하는 등의 이 분야에 잘 알려진 방법으로 알아낼 수 있다.

시험관내 방법의 한 태양에서는, 다음과 같이 태반 줄기세포와 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 콜로니-형성 단위 분석을 수행할 수 있다. HLA/기증자 일치하는 새로운 혹은 해동된 태반 관류물과 제대혈 단위를 마련한 다음, 각각 총 유핵세포수를 혈구계로 측정한다. 해동된 단위를 사용할 때는 제대혈 시료를 헤타녹말(hetastarch)로 분리할 수 있으며, 태반 관류물 단위는 피콜(ficoll) 분리하는 것이 바람직하다. 각 세포원으로부터 얻은 유핵세포의 소규모 시료를 현탁액 형태로 접종 하여 두 개 이상의 비율로 공동 배양하고, 증폭한다. 이 공동 배양물을 예를 들어, 적절한 배양 배지(예를 들어, RPMI 1640 배양 배지에 2~10% 소 태아 혈청과 선택적으로 1% Stemspan 사이토킨 칵테일이 보충된 것, Methocult GF⁺ H4435 배지 등)가 담긴 35 mm 배양 접시 속에서 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대한 태반 줄기세포의 비율을 하나 이상으로 변화시켜 가며 3회 반복 실험할 수 있다. 조혈 줄기세포는 GM-CSF, IL-3, IL-6, SCF와 FLT-3 리간드를 포함하는 배양 배지 속에서 증폭할 수 있다.

공동 배양 분석에 쓰이는 용기는 줄기세포의 조직 배양에 적합한 것이 바람직하다. 예를 들어, 유리 또는 플라스틱 페트리 접시, 16-웰 플레이트, 32-웰 플레이트, 96-웰 플레이트, 128-웰 플레이트 등 속에서 공동 배양할 수 있다. 각 공동 배양물 속의 각 세포원으로부터 얻은 유핵세포의 총 수는 1×10⁴ 내지 1×10⁶으로 변화하는 것이 전형적인 경우이다. 세포는 또한 마이크로패턴이 있는 형태(micropatterned configuration) 속에서 공동 배양할 수도 있다. 미국 특허 제6,221,663호를 보라.

다수의 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 함유하는 세포군 내에서 태반 줄기세포가 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대하여 가지는 비율을 정하는 데 있어서, 바람직한 비율이란 같은 조건하에서 같은 세포 수의 태반 줄기세포만을 배양한 경우나, 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만을 배양한 경우보다 더 많은 콜로니-형성 단위를 낳는 모든 비율이다. 더 바람직하게는, 이 비율은 시험한 다른 모든 비율보다 더 많은 콜로니-형성 단위를 생성하는 비율이다. 시험한 비율 사이에 통계적인 유의미성을 따지는 것은 바람직하지만, 필수적이지는 않다. 더 많은 수의 콜로니-형성 단위는 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 함께 가지는 배양물, 거의 대부분 혹은 전부 태반 줄기세포로 이루어진 배양물 또는 거의 대부분 혹은 전부 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포로 이루어진 배양물이 생성하거나 혹은 이로부터 유래할 수 있다.

통합 줄기세포군은 콜로니-형성 단위가 생성되기 충분한 시간, 전형적으로는 10~20일 동안 배양한다. 증폭 도중의 세포 배양은 줄기세포 또는 전구세포 배양 분야에서 잘 알려진 표준 절차를 따르며, 예를 들어,매일 배지를 교체하고, 가습 배양기 속에서 약 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양하는 등의 조건을 포함한다. 10~20일 후, 공동 배양물 속의 콜로니-형성 단위의 수와 형태를 결정한다(예를 들어, 조혈 줄기세포에 대해서는 CFU-GM, CFU-L, CFU-M, CFU-G, CFU-DC, CFU-GEMM, CFU-E의 수).

공동 배양의 특정 사례에서, 태반 관류물로부터 얻은 유핵세포와 제대혈로부터 얻은 유핵세포는 1:1, 1:3과 3:1의 비율(여기서 1은 예를 들어 1×10⁵ 세포이다)로 Methocult GF⁺ H4435 배지 속에서 배양할 수 있다. 이 공동 배양물을 이어서 14일 동안 조직 배양하여 증폭한다. 공동 배양된 세포의 형태, 콜로니-형성 단위의 수를 결정한다. 상기 두 세포원으로부터 얻은 유핵세포 시료의 비율 중 가장 콜로니-형성 단위를 많이 낳는 것이 최적 비율로 정하여지고, 이 두 세포 단위 또는 한 단위 혹은 양쪽 단위의 줄기세포 및/또는 전구세포들은 줄기세포 이식이 필요한 수용자에게 투여를 위하여 상기 최적 비율로 혼합된다. 이러한 최적 비율은 같은 세포 수로 어느 한쪽 단위 또는 어느 한 쪽 단위만의 줄기세포 및/또는 전구세포를 투여한 경우보다 생체 내에서 더 높은 생착률을 얻게 하여 준다.

상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 공동 배양 도중 직접적으로 또는 간접적으로 서로 접촉하게 된다. 이러한 접촉은 최소한도로는 줄기세포 중 한 종류를 다른 종류의 줄기세포를 얼마간 배양한 배양 배지에 접촉하는 것, 예를 들어 한 종류의 줄기세포를 다른 종류의 줄기세포가 배양 과정에서 조건화한(conditioned) 배지에 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 콜로니-형성 단위 생성을 위한 배양 도중 같은 물리적 공간 안에서 배양, 예를 들어 같은 배양 접시 또는 멀티웰 플레이트 속 같은 웰 속에서 배양할 수 있다. 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 같은 배양 배지 속이지만 서로 다른 물리적 공간 속(예를 들어 막에 의하여 분리되었거나 멀티웰 플레이트의 서로 다른 웰 속에 있지만 배양 배지는 두 웰 사이를 수동적 또는 능동적으로 이동할 수 있고, 세포는 섞이지 못하는 경우)에서 배양하면서 서로 접촉할 수도 있다. 다른 태양에서, 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 공통의 배양 배지를 갖지 않는 서로 다른 물리적 공간에서 배양하면서 한 줄기세포의 배양 배지 전부 또는 일부를 다른 쪽 줄기세포 배양 배지와 교환함으로써 양 줄기세포를 접촉하게 할 수도 있다. 다른 실시 태양에서는, 상기 공동 배양 세포들을 생분자는 자유로이 두 배양물 사이를 확산하되, 세포들은 서로 물리적으로 분리되어 있는 방식으로 배양한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,665,596호 "Device for Cell Co-culture and Method for Its Use in Cuturing Cells"를 보라. 줄기세포 배양물들끼리 별도로 있는 경우는, 별도로 있는 배양물과 합쳐진 배양물의 콜로니-형성 단위 수를 해당 통합 비율마다의 반복 실험별로 합하여, 앞서 말한 것과 같이 최적 비율을 정한다.

본 방법의 다른 태양에서는 분석 도중의 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 생활성 분자를 가하고, 정해진 총 세포 수를 기준으로 같은 세포 수로 태반 줄기세포만을 배양한 경우 또는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만을 배양한 경우보다 더 많은 콜로니-형성 단위 또는 향상된 생착률을 낳는 비율을 찾는다. 이러한 생활성 분자는 분자량이 50 kDa, 30 kDa, 20 kDa, 10 kDa, 5 kDa, 3 kDa, 2 kDa, 1 kDa, 500 Da, 300 Da, 200 Da, 100 Da 미만 또는 그보다 더 작은 소형 유기 분자일 수 있다. 특정 태양에서, 상기 소형 유기 분자는 합성 분자 또는 비천연 분자, 즉 자연계에서 유래하지 않은 분자이다. 다른 특정 태양에서, 상기 생활성 분자는 사이토킨 또는 성장 인자이다. 상기 공동 배양물에 더할 수 있는 생활성 분자로는 Ca^{2 +}, EGF, α-FGF, β-FGF, PDGF, 각질세포 성장 인자(KGF), TGF-β, 사이토킨(예를 들어, IL-1α, IL-1β, IFN-γ, TFN), 레티노산, 트랜스페린, 호르몬(예를 들어, 안드로겐, 에스트로겐, 인슐린, 프롤락틴, 트리요오드화티로닌(triiodothyronine), 하이드로코르티손, 덱사메타손), 부티르산나트륨, TPA, DMSO, NMF, DMF, 세포 매트릭스 구성 요소(예를 들어, 콜라겐, 라미닌, 황산헤파란, Matrigel^TM 또는 이들의 조합을 포함하는 분화 유도제를 들 수 있지만 이들로 한정되지는 않는다. 분화 억제제도 생활성 분자로 부가할 수 있는데, 여기에는 사람 델타-1과 사람 세레이트 1(Serrate-1) 폴리펩티드(2002년 1월 8일자 Sakano 외의 미국 특허 공보 제6,337,387호인 "Differntiation-suppressive polypeptide"를 보라), 백혈병 억제 인자(LIF)와 줄기세포 인자 등을 들 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

생활성 분자를 공동 배양물에 가하는 경우는, 상기 공동 배양 분석을 이용하여 생착능에 대한 양성 작용제를 찾을 수 있다. 본 발명의 한 실시 태양에서는 생착의 양성 작용제를 확인하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 통합 줄기세포군에 상기 생활성 분자를 접촉하는 단계를 포함하며, 이때 상기 생활성 분자를 접촉하지 않은 통합 줄기세포군의 생착보다 측정 가능한 수준으로 통합 줄기세포군의 생착을 향상시키는 생활성 분자는 양성 작용제로 동정하게 된다. 다른 실시 태양에서, 본 발명은 세포 생착의 양성 작용제를 동정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 시험관내에서 상기 생활성 분자의 존재 하에서 하나 이상의 비율로 통합하는 단계; 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 콜로니-형성 단위를 생성하기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계; 상기 하나 이상의 비율마다 콜로니-형성 단위의 수를 측정하는 단계; 상기 생활성 분자의 존재 하에서 콜로니-형성 단위의 수가 상기 생활성 분자의 부존재 하인 경우보다 더 많은 경우가 상기 하나 이상의 비율 중 적어도 하나 있는지 살피고, 있는 경우, 상기 생활성 분자를 세포 생착의 양성 작용제로 확인한는 단계를 포함한다.

상기 시험관내 분석법은 모든 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대하여 생착을 위한 최적 비율을 결정하는데 적용할 수 있다. 이러한 측면에서, 상기 시험관내 분석법은 이식 전에 줄기세포군의 특성을 파악하는 표준적이고 통상적인 방법으로 쓰일 수 있다.

1.2. 생체내 분석법

상기 시험관내 분석법의 결과는 생체내 생착 분석법을 이용하여 확인할 수 있다. 이 생체내 분석법은 또한 시험관내 분석을 하지 않고 세포 생착을 극대화하는 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 최적 비율을 찾는데 쓰일 수도 있다.

상기 생체내 분석의 한 태양에서는, 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 복수의 동물 모형에 이식한 다음, 충분한 시간(전형적으로 6~10 주)을 주어 생착이 일어나도록 한다. 이 동물을 이어서 희생한 다음, 각 동물에서의 생착 정도를 적어도 하나의 조직에 대하여 측정한다. 즉 한 실시 태양에서, 본 발명은 수용 대상의 세포 생착을 위한 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 또는 전구세포의 비율을 확인하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 태반 줄기세포만을 줄기세포가 필요한 개체에 이식한 경우나 제2 세포원의 세포만을 이식한 경우보다, 같은 수의 세포를 동일한 개체에 이식하였을 때 더 높은 생착률을 나타내는 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 비율을 찾는 단계를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대한 태반 줄기세포의 비율을 찾는 상기 단계는 복수의 동물에 대하여 여러 가지 비율로 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 이식하는 단계; 상기 여러 가지 비율별로 상기 동물마다 적어도 하나의 조직에 대하여 생착한 세포 수를 측정하는 단계와 상기 여러 가지 비율 중 가장 많은 수의 세포 생착을 낳은 비율을 찾는 단계를 포함한다.

시험관내 분석에서와 마찬가지로, 상기 태반 줄기세포는 어떠한 방법으로 얻어도 무방하며, 모든 이용 가능한 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 태반 줄기세포는 태반 관류물 속에 함유되거나, 상기 관류물로부터 분리한 총 유핵세포 속에 함유되거나 총 유핵세포로부터 분리한 줄기세포군이거나 효소 소화 태반 조직 속에 함유된 태반 줄기세포이거나, 효소 소화 태반 조직으로부터 분리한 태반 줄기세포이거나 증폭 및/또는 계대 배양된 태반 줄기세포 등일 수 있다.

생체내 공동 배양 분석에서는 모든 표준적 동물 모형을 쓸 수 있다. 이 동물 모형은 외부 이식 조직의 생착이 쉽게 일어나는 것이 바람직하다. 이 동물 모형은 면역 기능 저하(immunocompromised)된 것이 바람직하다. 상기 생체내 분석에 쓰일 수 있는 동물 모형으로는 NOD/SCID(non-obese diabetic/severe combined immune deficiency) 마우스(Hogan 외, Blood 90(1):85-96 (1997)을 보라); BNX(beige/nude/x-linked immunodeficiency) 마우스(Kamal-Reid 외, Science 242:1706 (1988)을 보라); SCID 마우스(Kamal-Reid 외, Science 246:1597 (1989)을 보라)를 들 수 있지만 이들로 한정되지는 않는다. 생착은 다른 동물 모형에서도 이루어질 수 있는데, 예를 들어 양 태아(예를 들어, Shimizu 외, Blood 91(10):3688-3692 (1998); Zanjani 외, Int' J. Hematol 63(3):179-182 (1996)을 보라))가 있다.

수용 대상 조직에서 생착한 세포 수를 결정하는 것은 모든 공지 기술을 써서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 생착한 세포는 생착 세포 특이적 핵산의 검출, 예를 들어 중합 효소 연쇄반응에 의하여 또는 생착 세포 특이적 단백질의 검출, 예를 들어 면역조직화학을 이용하여 검출할 수 있다. 생체내 생착의 확인은 수용 대상의 한 부위 또는 여러 부위로부터 이식 후 한 차례 또는 그 이상, 채취한 시료, 예를 들어 생검 시료를 이용하여 이루어질 수 있다.

한 실시 태양에서, 태반 줄기세포 및/또는 제대혈 유래 줄기세포의 생착은 생검(예를 들어, 골수 흡인물 또는 말초 혈액 시료)와 PCR을 수행하여 비수용 대상 유전자 표지가 존재하는지를 살핌으로써 증명할 수 있는데, 이러한 표지의 존재는 생착을 나타낸다. 다른 태양에서, 생착한 세포는 생착 세포가 발현하는 표지를 인식하는 항체를 하나 이상 선별함으로써 확인할 수 있다. 특정 태양에서, 이 생착 세포는 사람 세포이며, 상기 하나 이상의 항체는 하나 이상의 사람 세포 표지를 특이적으로 인식한다. 항체에 의한 상기 표지의 검출에는 공지 기술의 모든 방법, 예를 들어 면역조직화학적 방법을 쓸 수 있다. 예를 들어, 한 세포 표면 표지가 존재한다는 것을 검출하는 방법은 사람 아닌 숙주 동물을 희생하는 단계, 원하는 조직을 입수하는 단계, 상기 조직을 고정하고 파라핀이나 그와 비슷한 매질에 묻는 단계, 상기 조직의 얇은 절편을 떼어내는 단계, 선택 단계로서 염색하는 단계, 상기 조직을 상기 표지를 인식하는 하나 이상의 항체에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 비슷한 방식으로, 생착한 세포의 분화에 따라 생기는 세포가 발현하는 표지를 인식하는 항체를 이용할 수도 있다. 예를 들어, 태반 줄기세포 또는 제대혈 유래 줄기세포는 CD45와 비멘틴을 발현하는 세포로 분화한다. 따라서 CD45와 비멘틴에 대한 항체를 이용하여 생착하는 줄기세포와 분화하는 줄기세포의 수를 측정할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 표지, 이를테면 마우스 세포 표면 표지보다 사람 세포 표면 표지를 더 잘 인식하는 항체는 이 분야에 잘 알려져 있다.

상기 생체내 방법의 비제한적인 예에서는, 사람 태반 줄기세포와 예를 들어 조혈 줄기세포를 포함하는 제대혈에서 얻은 사람 유핵세포를 복수의 동물 모형, 예를 들어 Mus musculus 종인 복수의 마우스에 복수의 비율로 이식한다. 며칠 또는 몇 주 후(즉 생착을 위한 충분한 시간 후), 상기 숙주 동물을 희생한 다음 조직(예를 들어 지라, 허파 등)을 분석하여 생착한 세포 수를 대략적으로 측정하는데, CD45 및/또는 비멘틴에 대하여 염색되는 세포 수가 그 증거가 된다. CD45는 T 림프구, B-림프구와 과립구, 단핵구와 포식세포를 포함하는 백혈구에 특이적인 표지이다. T29/33 클론(BioDesign, Saco, Maine)과 같은 일부 CD45 항체는 마우스 항원과 교차 반응하지 않는다. 비멘틴은 섬유모세포, 평활근 세포, 지방세포, 슈반 세포, 맥관내피 세포 등을 포함하는 중간엽 세포의 표지이다. V9 클론(BioDesign, Saco, Maine)을 포함하는 일부 비멘틴 항체는 마우스 항원과 교차 반응하지 않는다. 따라서 이들 두 표지에 대한 항체로 염색하면 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 생착 정도를 일반적으로 확립할 수 있다. 이러한 예는 제한적이지 않다. 다른 항체 역시 다른 세포 유형의 생착 정도를 측정하기 위하여 쓰일 수 있다. 장기적인 세포 생착 모형에서, 1차 생착이 일어난 동물, 예를 들어 마우스로부터 분리한 골수 세포를 2차 생착 모형 동물에 이식할 수 있다. 2차 생착에 대한 분석법은 앞서 설명하였으며, 공지 기술로 잘 알려진 방법을 포함한다.

2. 통합 줄기세포군

본 발명은 나아가 태반 줄기세포, 즉 예를 들어 태반 관류물로부터 얻은 세포, 예를 들어, 태반 관류물에서 얻은 유핵세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 함유하는 통합 줄기세포군으로서, 같은 세포 수의 태반 줄기세포 단독 또는 같은 세포 수의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 단독보다 콜로니-형성 단위 분석법에서 더 많은 콜로니-형성 단위를 낳거나 이식 환자에게서 더 향상된 세포 생착을 낳는 통합 줄기세포군을 제공한다. 상기 방법으로 확인한 통합 줄기세포군은 줄기세포원의 특징, 즉 예를 들어 한 단위의 태반 관류물, 한 단위의 제대혈 등의 세포원 속의 생착 가능한 세포 수를 바탕으로 한, 생착 능력이 향상된 줄기세포의 조합을 나타낸다.

따라서 본 발명의 한 실시 태양에서는, 소정의 비율에 따라 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 함유하는 통합 줄기세포군을 포함하는데, 이때 상기 통합 줄기세포군의 줄기세포는 같은 세포 수의 태반 줄기세포만을, 또는 같은 세포 수의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만을 이식한 것보다 더 향상된 생착능을 나타낸다. 한 특정 태양에서는 콜로니-형성 단위의 형성을 허용하기에 충분한 시간과 조건 하에서 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 여러 가지 비율로 통합하고, 상기 여러 가지 비율 중에서 가장 많은 콜로니-형성 단위를 생성하는 비율을 찾음으로써 상기 비율을 확인할 수 있다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 또는 전구세포는 제대혈 줄기세포 또는 전구세포, 골수 줄기세포 또는 전구세포, 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 중간엽 줄기세포 또는 전구세포이다. 다른 특정 태양에서, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 또는 전구세포는 조혈 전구세포이다. 더욱 더 구체적인 태야에서, 상기 조혈 줄기세포는 제대혈 조혈 전구세포이다. 다른 더욱 더 구체적인 태양에서 조혈 세포는 CD34⁺ 세포이다.

다른 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD34⁺ 세포, 예를 들어 CD34⁺CD38⁺ 세포 및/또는 CD34⁺CD38^- 세포를 포함한다. 한 구체 태양에서, 상기 CD34⁺CD38^- 세포는 CD34⁺CD38^-lin^- 세포를 포함한다. 다른 구체적 실시 태양에서, 상기 CD34⁺ 태반 줄기세포는 ALDH⁺인 세포, 즉 CD34⁺, ALDH⁺ 태반 줄기세포를 포함한다.

다른 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺ 또는 ABC-p⁺ 세포이다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺ 이고 ABC-p⁺인 세포이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD34⁺이고 OCT-4⁺ABC-p⁺인 세포를 포함한다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 적혈구와 세포 파편을 실질적으로 가지고 있지 않은 태반 관류물 속에 포함된다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 조성물은 태반 관류물로부터 분리한 태반 줄기세포를 포함한다.

다른 실시 태양에서, 태반 줄기세포는 표지 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73 또는 CD105를 하나 이상 발현하고, 표지 CD34, CD38, CD45, SSEA3과 SSEA4 중 하나 이상을 결여하는 세포를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 태반 줄기세포는 표지 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73 또는 CD105에 대하여 양성이고, 표지 CD34, CD38, CD45, SSEA3과 SSEA4에 대하여 음성인 세포를 포함한다. 다른 태양에서, 태반 줄기세포는 표지 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73과 CD105를 하나 이상 함유하고, 표지 CD34, CD38, CD45, SSEA3과 SSEA4 중 하나 이상을 결여하는 세포를 포함한다. 다른 태양에서, 태반 줄기세포는 표지 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD73과 CD105에 대하여 양성이고, 표지 CD34, CD38, CD45, SSEA3과 SSEA4에 대하여 음성인 세포를 포함한다. 다른 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD34^- 세포를 포함한다. 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD34^-CD38^- 태반 줄기세포이다. 다른 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD10, CD29, CD33, CD44, CD73, CD105, CD117과 CD133 중 적어도 하나에 대하여 양성이고 CD34 또는 CD45 중 적어도 하나에 대하여 음성인 세포를 함유한다. 다른 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD10, CD29, CD33, CD44, CD73, CD105, CD117과 CD133에 대하여 양성이고 CD34 또는 CD45에 대하여 음성인 세포를 함유한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 HLA-ABC⁺인 세포를 함유한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 HLA-ABC^-인 세포를 함유한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 HLA-DR⁺인 세포를 함유한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 HLA-DR^-인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD200⁺이고 HLA-G⁺인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD200⁺이고 OCT-4⁺인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺인 세포를 함유하는데, 이러한 줄기세포들은 이 세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배아유사체(embryoid-like body)의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때, 상기 분리된 태반 세포군이 배아유사체를 형성하도록 촉진한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺인 세포를 함유하는데, 이러한 줄기세포들은 이 세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배아유사체(embryoid-like body)의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때, 상기 분리된 태반 세포군이 배아유사체를 형성하도록 촉진한다.

다른 실시 태양에서, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 제대혈에서 유래한 줄기세포이다.

본 발명의 통합 줄기세포군에서 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 HLA가 동일하게 일치, 즉 같은 개체로부터 유래한 것일 수 있다. 다른 태양에서, 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 HLA 불일치, 즉 서로 다른 개체로부터 유래한 것일 수 있다. 제대혈 또는 제대혈 유래 줄기세포를 함유하는 통합 줄기세포군에서, 이 세포군은 수용 대상에 대하여 HLA 일치이거나, HLA 부분 일치 또는 HLA 불일치하는 줄기세포를 함유할 수도 있다. 비제대혈 줄기세포를 함유하는 통합 줄기세포군에 있어서, 최소한 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 수용 대상에 대하여 HLA 일치하거나 부분적으로 HLA 일치하는 것이 바람직하다.

다양한 실시 태양에서, 태반 줄기세포의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대한 비율은 각 세포군 속의 총 유핵세포의 수 또는 줄기세포의 총수를 비교하여 약 100,000,000:1, 50,000,000:1, 20,000,000:1, 10,000,000:1, 5,000,000:1, 2,000,000:1, 1,000,000:1, 500,000:1, 200,000:1, 100,000:1, 50,000:1, 20,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 2,000:1, 1,000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1,000; 1:2,000; 1:5,000; 1:10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1:500,000; 1:1,000,000; 1:2,000,000; 1:5,000,000; 1:10,000,000; 1:20,000,000; 1:50,000,000 또는 약 1:100,000,000일 수 있다. 한 바람직한 실시 태양에서, 태반 줄기세포의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대한 상기 비율은 약 1:10 내지 약 10:1이다. 다른 바람직한 태양에서, 상기 태반 줄기세포의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대한 비율은 약 3:1 내지 1:3이다.

본 발명의 통합 줄기세포군은 보존, 예를 들어, 장래의 사용을 위하여 냉동보존될 수 있다. 줄기세포 등의 세포의 냉동보존 방법은 이 분야의 공지기술인데, 예를 들어 Boyse 외(1993년 3월 9일 등록 미국 특허 제5,192,553호)와 Hu 외(2000년 12월 7일 공개 WO 00/732421호)의 냉동 보존 방법이 있다. 통합 줄기세포군을 구 성하는 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 냉동보존 전 통합하거나, 각각 별도로 냉동보존할 수 있으며, 사용 몇 시간 전에 해동되어 적절한 비율로 통합할 수 있다.

본 발명의 통합 줄기세포군은 개체에 쉽게 투여할 수 있는 형태로 제조할 수 있다. 예를 들어, 통합 줄기세포군은 의약 용도에 적절한 용기 속에 포함될 수 있다. 이러한 용기는 예를 들어, 멸균 플라스틱 백, 플라스크, 단지 또는 상기 통합 줄기세포군을 쉽게 담을 수 있는 다른 용기일 수 있다. 이 용기는 바람직하게는 통합 줄기세포군의 정맥하 투여를 용이하게 하거나 가능하게 해 주는 용기이다. 이 용기, 예를 들어 백은 태반 유래 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 함께, 예를 들어 혼합 세포군으로 수용하거나, 상기 두 줄기세포군을 따로 수용할 수 있다. 상기 후자의 태양에서, 이 백은 서로 연결된 복수의 빈 내부 구획을 가져서 상기 태반 유래 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포가 투여 전 혹은 도중에 혼합될 수 있게 하는 것이 바람직하다. 이 용기는 상기 통합 줄기세포군의 냉동보존을 지원하는 것이 바람직하다. 상기 용기 속의 통합 줄기세포군은 적어도 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 또는 더 많이 계대배양된 태반 유래 줄기세포, 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 또는 양쪽 모두를 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 함유하는 통합 줄기세포군으로서, 각각을 별도의 줄기세포군 형태로 저장 또는 유지하며, 사용 전, 예를 들어 줄기세포가 필요한 한 개체에 투여하기 전에 상기 두 줄기세포군을 혼합하는 적절한 비율과 함께 제공하는 통합 줄기세포군을 제공한다. 이 실시 태양에서는 통합 줄기세포군이 제1 용기에 태반 유래 줄기세포군을, 제2 용기에 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포군을 포함하며, 상기 두 세포군을 줄기세포가 필요한 개체에 투여하기 전, 또는 투여 도중에 통합하는데 필요한 정보도 포함한다.

따라서 본 발명의 한 실시 태양에서는 한 용기 속에 수용된 통합 줄기세포군을 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 통합 줄기세포군은 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 함유한다. 한 특정 태양에서, 상기 용기는 백, 플라스크 또는 단지(jar)이다. 더 특정한 태양에서, 상기 태반 유래 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 상기 백 속에 함께 담긴다. 다른 더 구체적인 태양에서는, 상기 태반 유래 줄기세포와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포가 상기 백 속에서 각각 수용된다. 다른 특정 태양에서, 상기 조성물은 상기 통합 줄기세포군의 냉동보존을 촉진하는 화합물을 하나 이상 포함한다. 다른 특정 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 생리학적으로 허용되는 용액 속에 포함된다. 더 구체적인 태양에서, 상기 생리학적으로 허용되는 용액은 0.9% NaCl 용액이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 백은 멸균 플라스틱 백이다. 더 구체적인 태양에서, 이 백은 통합 줄기세포군의 정맥하 투여를 용이하게 하거나 가능하게 해 준다. 다른 특정 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포와 HLA 일치하는 태반 줄기세포를 포함한다. 다른 특정 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포와 적어도 부분적으로 HLA 불일치하는 태반 줄기세포를 포함한다. 다른 특정 태양에서, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 복수의 기증자로부터 유래한 것이다.

통합 줄기세포군은 개체에 투여하기 전 얼마간 배양할 수 있다. 예를 들어, 한 실시 태양에서는 상기 통합 줄기세포군의 줄기세포를 노치(Notch) 작용제, 예를 들어 실질적으로 노치 단백질의 세포내 도메인만으로 이루어진 노치 단백질의 결실 형태나 델타 단백질을 함유하는 배지 속에서 배양할 수 있다. 미국 출원 2004/0067583호를 보라.

3. 약학 조성물

본 발명은 본 발명에 따른 통합 줄기세포군과 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약학 조성물을 망라한다.

이러한 실시 태양에 맞추어, 본 발명의 통합 줄기세포군은 주사 가능한 제형(예를 들어 본 명세서에서 그 기재 내용 전부가 참고 문헌인 WO 96/39101)일 수 있다. 다른 태양에서, 본 발명의 통합 줄기세포군은 예를 들어 미국 특허 제5,709,854호와 5,516,532호, 5,654,381호에 기재된 중합 가능한 또는 가교하는 하이드로겔을 이용하여 제제화할 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 상기 통합 줄기세포군 내의 각 줄기세포군이 생체 내에서 상기 통합 줄기세포군을 생성할 수 있도록 순차적으로 투여하거나, 동시에 투여할 수 있는 별도의 약학 조성물 형태로 개체에 투여되기 전까지 유지되도록 한 조성물을 제공한다. 각 성분은 예를 들어 하나의 백(예를 들어 Baxter, Becton-Dickinson, Medcep, National Hospital Products, Terumo 사 등의 혈액 저장 백)과 같은 별도 용기나 한 유형의 세포 또는 세포군을 함유하는 별도 주사기속에서 저장 및/또는 사용될 수 있다. 한 특정 태양에서, 제대혈 또는 제대혈 유래 유핵 또는 줄기세포는 한 백 안에 수용되고, 태반 관류물 또는 태반 관류물에서 얻은 태반 줄기세포는 두 번째 백 속에 수용된다.

태반 줄기세포군은 농축될 수 있다. 특정 태양에서, 태반 줄기세포를 함유하는 세포군은 표준 방법에 따라서 적혈구 및/또는 과립구를 제거함으로써 남은 유핵세포에서 태반 관류물 속 다른 세포 유형에 비하여 태반 줄기세포가 농축되게 할 수 있다. 이러한 농축된 태바 줄기세포군은 동결되지 않은 상태로 사용될 수도 있으며, 또는 나중의 사용을 위해 동결될 수도 있다. 세포군을 동결하려 한다면, 표준 저온 보존제(예를 들어 DMSO, 글리세롤, Epilife^TM 세포 동결 매질(Cascade Biologics)를 동결 전에 풍부한 일군의 세포에 첨가한다.

본 발명의 약학 조성물은 세포 분화를 유도하는 성분을 포함할 수 있다. 일정 실시예에서, 세포 분화를 유도하는 성분은 Ca^{2 +}, EGF, α-FGF, β-FGF, PDGF, 케라티노사이트(keratinocyte) 성장 인자(KGF), TGF-β, 사이토킨(예를 들어, IL-lα, IL-lβ, IFN-γ, TFN), 레티노산, 트랜스페린(transferrin), 호르몬(예를 들어, 안드로젠, 에스트로겐, 인슐린, 프로락틴, 삼요오드화티로닌(triiodothyronine), 하이드로코티손, 덱사메타손), 부티르산나트륨, TPA, DMSO, NMF, DMF, 매트릭스 구성 요소(예를 들어, 콜라겐, 헤파란 설페이트, Matrigel^TM), 또는 그들의 혼합물을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 실시 태양에서, 본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 세포 분화 억제제를 함유할 수도 있다. 일부 태양에서, 세포 분화 억제제에는 사람 델타-1과 사람 세레이트 1(Serrate-1) 폴리펩티드 (2002년 1월 8일자 Sakano 외의 미국 특허 공보 제 6,337,387 호, "Differentiation-suppressive polypeptide" 참고), 백혈병 억제 인자(LIF)와 줄기세포 인자 등이 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여하기 전에 TNF-α의 활성을 조절하는 화합물로 처리할 수 있다. 그러한 화합물들은 예를 들어 미국 출원 제2003/0235909호에 잘 설명되어 있는데, 이 공보의 전체 내용은 본 명세서의 참고 문헌이다. 바람직한 화합물로 IMiDs(immunomodulatory compunds)와 SelCids(selective cytokine inhibitory drugs)을 언급하고 있고, 특히 더 바람직한 화합물은 Actimid^TM과 Revimid^TM, Revlimid^TM라는 상표명으로 이용 가능한 물질이다.

4. 줄기세포의 이식 방법

4.1. 이식 방법

통합 줄기세포군을 동정하는 상기 방법(1절을 보라)을 예를 들어, 태반 관류물 또는 태반 줄기세포와 예를 들어 제대혈, 제대혈 줄기세포 등의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 쌍에 적용하여 줄기세포가 필요한 개체의 진료를 위한 통합 줄기세포군을 생산할 수 있다. 한 실시 태양에서, 상기 개체는 하나 이상의 통합 줄기세포군에 접촉하게 된다. 특정 태양에서, 상기 접촉은 상기 통합 줄기세포군을 상기 개체에 도입, 예를 들어 이식하는 것이다. 즉, 통합 줄기세포군을 생산하는 방법은 줄기세포가 필요한 개체에 줄기세포를 도입하는 절차의 첫 단계로서 수행될 수 있다. 이러한 절차는 상기 통합 줄기세포군을 함유하는 앞서 기술한 약학 조성물을 이용하는 것을 포함할 수 있다.

한 특정 태양에서, 본 발명의 태반 줄기세포군은 줄기세포가 필요한 개체에 투여 전에 같은 세포 수의 태반 줄기세포 단독 또는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 단독 투여보다 더 향상된 세포 생착을 제공하는 비율로 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포군과 혼합된다. 다른 특정 태양에서, 본 발명의 태반 줄기세포군은 줄기세포가 필요한 개체에 투여 도중 또는 투여와 동시에 최적 비율로 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포군 혼합되는데, 이 최적 비율은 태반 줄기세포의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대한 복수의 비율 중에서 콜로니-형성 단위의 형성을 허용하기에 충분한 시간과 조건 하에서 가장 많은 콜로니-형성 단위를 생성하는 비율을 찾음으로써 찾아낼 수 있다. 다른 특정 태양에서, 본 발명의 태반 줄기세포군과 제대혈 세포군은 줄기세포가 필요한 환자에게 최종적인 최적 효율로 투여된다. 한 태양에서는 상기 태반 줄기세포군을 먼저 투여하고, 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포군을 다음에 투여한다. 다른 태양에서는, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포군을 먼저 투여하고, 상기 태반 줄기세포군을 나중에 투여한다.

한 특정 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 한 백 또는 용기 속에 수용된다. 다른 태양에서 본 발명은 이식을 위하여 별도의 백 또는 용기에 각각 수용된 태반 줄기세포군과 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포군을 제공한다. 몇몇 태양에서는 상기 두 개의 백에 수용된 줄기세포군을 줄기세포가 필요한 환자에게 투여하기 전에, 바람직하게는 바로 직 전에 혼합한다. 다른 태양에서는, 각 백의 내용물을 환자에게 따로 투여하는데, 여기서 상기 두 개의 세포군은 생체내에서 부가적으로 쓰인다.

태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포, 예를 들어 제대혈 유래 줄기 또는 전구세포나 혈액 은행에서 온 또는 냉동 보존된 제대혈을 포함하는 제대혈로 이루어진 통합 세포군은 의학적으로 허용되는 모든 수단을 이용하여 이식 전에 혼합할 수 있다. 한 실시 태양에서, 상기 두 개의 세포군은 물리적으로 혼합된다. 본 발명의 다른 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 상기 개체에 투여하기 직전(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10분 전)에 혼합한다. 다른 태양에서는 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 상기 개체에 투여를 5분 이상 앞선 시점에 혼합한다. 본 발명의 다른 태양에서는 상기 태반 줄기세포 및/또는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 상기 개체에 투여하기 전에 냉동보존하고 해동한다. 다른 태양에서는 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 상기 개체에 대한 투여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 이상 전에 혼합하여 통합 줄기세포군을 생성하는데, 여기서 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 중 어느 하나 또는 양쪽 모두는 상기 투여 전에 냉동보존되고 해동된 것이다. 다른 태양에서는 상기 통합 줄기세포군을 한 번 이상 투여할 수 있다.

다른 실시 태양에서 상기 통합 줄기세포군 속에 포함된 줄기세포는 이식 전에 예비 조건화(preconditioning)를 거친다. 바람직한 한 태양에서, 예비 조건화는 상기 세포를 기체 투과성 용기 속에 일반적으로 얼마 동안 약 -5℃ 내지 약 23℃, 약 0℃ 내지 약 10℃, 바람직하게는 약 4℃ 내지 약 5℃ 하에서 저장하는 것을 포함한다. 이 세포들은 18시간 내지 21일, 48시간 내지 10일, 바람직하게는 3~5일 동안 저장할 수 있다. 이 세포들은 예비 조건화 전에 냉동보존하거나, 투여 직전에 예비조건화할 수 있다.

태반 줄기세포의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대한 적절한 비율을 확립한 다음, 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 중 어느 하나 또는 양쪽 모두를 줄기세포가 필요한 개체에 도입하기 전에 세포 분화시킬 수 있다. 예를 들어, 조혈세포 생착을 위해서는 상기 줄기세포를 조혈세포 계통으로 분화할 수 있다. 줄기세포와 분화된 세포의 조합 또는 양쪽 줄기세포원으로부터 분화된 세포를 포함하는 조합은 "통합 줄기세포군"이라는 용어가 망라하고 있다. 따라서 본 발명은 개체에 줄기세포를 도입하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 총 세포 수 중에서 태반 줄기세포가 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대하여 차지하는 비율을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 이 비율은 같은 세포 수로 태반 줄기세포만을 또는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만을 도입하는 것보다 더 높은 세포 생착을 나타내고, 이어서 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 중 어느 한 쪽 또는 양쪽을 다른 세포 유형으로 분화하는 단계와 상기 줄기세포 및/또는 분화된 세포를 개체에 도입하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 태양에서는, 통합 줄기세포군의 이식 방법은 (a) 태반 줄기세포의 분화를 유도하는 단계, (b) 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포, 예를 들어 제대혈 줄기세포를 혼합하여 통합 줄기세포군을 형성하는 단계, (c) 상기 통합 줄기세포군를 줄기세포가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 보 발명의 이식 방법의 다른 태양에서는 (a) 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 분화를 유도하는 단계, (b) 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포와 태반 줄기세포를 혼합하여 통합 줄기세포군을 형성하는 단계, (c) 상기 통합 줄기세포군를 줄기세포가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 태양에서, 통합 줄기세포군의 이식 방법은 (a) 태반 줄기세포와 제대혈 세포군을 혼합하는 단계, (b) 상기 태반 줄기세포와 제대혈 세포의 혼합물의 분화를 유도하는 단계, (c) 상기 혼합물을 줄기세포가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 통합 줄기세포군은 주사, 예를 들어 정맥 주사, 근육 주사, 복강내 주사, 눈 속 주사, 특정 조직에 대한 직접 주사, 수혈 등을 포함하는 약학적 또는 의약적으로 허용된 모든 방식에 따라 환자에게 이식할 수 있다. 예를 들어, 통합 줄기세포군, 이를테면 제대혈 유래 줄기세포와 통합된 태반 줄기세포는 정맥 주입으로 이식할 수 있다. 다른 태양에서는 태반 줄기세포와 심근 줄기세포를 함유하는 현탁액 상태의 통합 줄기세포군을 심근 조직, 예를 들어 심장의 허혈 부위에 직접 주사할 수 있다. 이 통합 줄기세포군은 모든 약학적으로 허용되는 담체르 포함하거나 그 속에 현탁될 수 있다. 상기 통합 줄기세포군은 약학적으로 또는 의학적으로 허용되는 어떠한 담체, 예를 들어 혈액 백, 운반 백, 플라스틱 튜브 또는 비알을 통해서라도 담지되거나 저장되거나 운반될 수 있다.

이식 후, 사람 수용자의 세포 생착은 예를 들어, 핵산 또는 단백질 검출이나 다른 분석 방법을 통하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응, STR, SSCP, RFLP 분석, AFLP 분석 등을 이용하여 수용자로부터 얻은 조직 시료 속의 생착 세포에 특이적인 핵산 서열을 검출할 수 있다. 이러한 핵산 검출과 분석 방법은 공지 기술이다. 한 실시 태양에서, 세포 생착은 수용 대상의 조직 시료 속의 생착 세포에 특이적이고 실험 배경으로부터 구별할 수 있는 핵산의 존재로부터 알 수 있다. 분석할 이 조직 시료는 예를 들어 생검(예를 들어 골수 흡인물) 또는 혈액 시료일 수 있다.

한 실시 태양에서는 예를 들어 골수 절제와 같은 의료 절차의 직전에 환자로부터 말초 혈액 시료를 채취한다. 이 절차 후, 본 발명의 통합 줄기세포군을 환자에게 투여한다. 투여 후 적어도 한 차례, 말초 혈액 시료를 다시 채취한다. 상기 두 시료에 대하여 예를 들어, LabCorp(Laboratory Corporation of America)에서 입수할 수 있는 표지(알릴)에 대한 PCR 프라이머를 이용하여 STR 프로파일을 얻는다. 이식 후 표지(알릴)의 숫자 또는 특성에 차이가 있으면 이는 세포 생착이 일어났음을 나타낸다.

세포 생착은 중성구의 재출현을 검출하는 것으로도 증명할 수 있다.

다른 실시예에서, 생착 세포에 특이적인 표지는 이식된 줄기세포 또는 상기 이식된 줄기세포가 분화하리라고 예상되는 세포에 특이적인 항체를 이용하여 수용 대상의 조직 시료로부터 검출할 수 있다. 한 실시 태양에서, 태반 줄기세포와 제대혈 유래 줄기세포의 통합 세포군의 생착은 CD45⁺, CD19⁺, CD33⁺, CD7⁺ 및/또는 CD3⁺ 세포의 존재를 측정하기 위한 FACS 분석으로 평가할 수 있는데, 여기서는 통합 세포군에 적절한 항체를 가하여 결합하도록 하고, 세척하고(PBS 등으로), 세포를 고정한 다음(예를 들어 1% 파라포름알데히드), 적절한 FACS 장치(예를 들어 FACSCalibur 흐름 세포 측정 장치(Becton Dickinson사))로 분석한다. 다른 태양에서는 태반 줄기세포와 제대혈 유래 줄기세포의 생착을 CD200⁺ 또는 HLA-G⁺ 세포의 존재 여부를 결정함으로써 평가할 수 있다. 태반 줄기세포 및/또는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포가 수용 대상과 성별이 다른 한 개체에서 온 것일 때, 예를 들어, 남성 기증자와 여성 수용자일 때는 세포 생착을 성 특이적 표지, 예를 들어 Y 염색체 특이적 표지의 존재를 검출함으로써 살펴볼 수 있다. 한편 태반 줄기세포 및/또는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포을 고유한 표지나 확인을 돕는 핵산 서열, 예를 들어 RFLP 표지, β-갈락토시다제 또는 녹색 형광 단백질 등을 발현하도록 유전적으로 변형시킬 수도 있다.

세포 생착 정도는 어떠한 공지 수단을 이용해서라도 평가할 수 있다. 한 태양에서, 세포 생착 정도는 다음과 같은 단계별 평가 시스템으로 평가하는데, 여기서는 이식 수용 대상으로부터 세포 고정된 항체 결합 조직의 얇은 절편을 취하여 이용한다. 이 예시 평가 시스템에서, 세포 생착은 다음과 같이 평가한다. : 0 = 생착 양성인 세포 없음(즉 생착 세포에 특이적인 항체와 결합한 세포 없음); 0.5 = 하나 또는 두 개의 양성 세포, 양성일 수는 있지만 실험 배경이나 비특이적 염색 결과와 구별하기 어려움; 1 = 2~20 개의 흩어진 양성 세포; 2 = 약 20~100 개의 흩어지거나 군집한 양성 세포가 조직 전체에 걸쳐 있음; 3 = 100 개의 이상의 양성 세포가 조직의 50% 미만을 차지함; 4 = 세포 중 50% 이상이 양성임. 한 특정 태양에서, 세포 생착은 세포 중 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 7.5%, 10%, 15%, 20% 이상 혹은 이보다 더 많은 세포가 양성으로 염색되었는지에 따라 결정한다.

다른 태양에서, 세포 생착은 생착 세포가 수행하는 생물학적 기능을 하나 이상 얻었는지를 분석하여 결정한다. 예를 들어, 골수 절제를 받은 한 수용자가 태반 줄기세포와 제대혈 유래 줄기세포를 함유하는 통합 줄기세포군를 이식받으면, 세포 생착 정도는 정상 조혈 기능, 혈액 세포군과 혈액 기능이 어느 정도나 정상으로 되돌아가느냐로 결정할 수 다.

상기 통합 줄기세포군 전체 또는 일부분이 수용 대상자와 HLA 불일치하는 경우는 기증자 세포의 면역 거부를 줄이기 위하여 수용 대상자를 치료할 필요가 있을 수 있다. 면역 거부 반응을 줄이는 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,800,539호와 5,806,529호에 나와 있는데, 이들은 본 발명의 참고 문헌이다.

4.2. 용량

예를 들어 골수 이식과 같은 줄기세포 주입을 받는 환자는 한 단위의 유핵세포를 받는 것이 전형적인데, 여기서 한 단위는 대략 1×10⁹ 유핵세포(1~2×10⁶ CD34⁺ 줄기세포에 해당)이다. 한 개체에 대한 통합 줄기세포군의 수혈은, 많은 실시 태양에서, 적어도 1×10⁵, 1×10⁶, 1×10⁷, 1~2×10⁸, 1×10⁹, 3×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 1.5×10¹⁰, 2.0×10¹⁰, 3.0×10¹⁰, 4.0×10¹⁰, 5.0×10¹⁰ 혹은 그 이상의 수로 태반 줄기세포군과 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포군 양쪽 모두로부터 유래한 총 유핵세포를 이식하는 것을 포함하거나, 혹은 이러한 총 유핵세포를 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50 단위 또는 그 이상 이식하는 것을 포함한다. 한 개체에 대한 통합 줄기세포군 이식은, 다른 실시 태양에서는 1~2×10⁷, 1×10⁸, 3×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 1.5×10⁹, 2.0×10⁹, 3.0×10⁹, 4.0×10⁹, 5.0×10⁹, 6.0×10⁹, 7.0×10⁹, 8.0×10⁹, 9.0×10⁹, 10×10⁹ 혹은 그보다 더 많은 줄기세포를 이식하는 것을 포함한다. 다른 태양에서, 한 개체에 투여하는 유핵세포의 수는 골수 이식에 정상적으로 투여하는 세포 수의 적어도 다섯 배 이상이다. 본 발명의 다른 특정에서는 한 개체에 투여하는 유핵세포의 수는 골수 이식에 정상적으로 투여하는 세포 수의 적어도 열 배 이상이다. 본 발명의 다른 특정에서는 한 개체에 투여하는 유핵세포의 수는 골수 이식에 정상적으로 투여하는 세포 수의 적어도 열다섯 배 이상이다. 본 발며의 다른 태양에서, 한 개체에 투여하는, 줄기세포를 포함하는 유핵세포의 총수는 체중 매 kg마다 1~1000×10⁸이다.

5. 통합 줄기세포군 을 이용한 치료 방법

본 발명의 통합 줄기세포군은 생착 가능한 줄기세포가 필요한 개체를 치료하는데 쓰일 수 있다. 이러한 개체는 예를 들어, 조혈 기능 재구성을 위한 줄기세포 이식이 필요할 수 있다. 다른 많은 실시 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 형액암, 리소좀 저장 질환, 염증 질환 또는 자가면역 질환을 가지는 개체를 치료하는데 쓰일 수 있다. 다른 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 장기 재생 또는 수리를 돕거나, 유전자 전달 담체(transgene carrier)에 쓰일 수 있다.

따라서 본 발명의 한 실시 태양에서는 개체의 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 통합 줄기세포군으로 개체를 접촉(예를 들어 투여)하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 태양에서는 통합 줄기세포군을 동정하는 단계와 개체를 상기 통합 줄기세포군에 접촉시키는 단계를 포함하는 개체의 치료 방법을 제공한다. 한 특정 태양에서는 상기 통합 줄기세포군가 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 소정 비율로 함유하는데, 이때 상기 소정 비율은 같은 세포 수로 태반 줄기세포만을 접촉시킨 경우 또는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만을 접촉시킨 경우에 비하여 세포 생착을 향상시키거나 개선하는 비율이다. 다른 태양에서 본 발명은 줄기세포로 치료할 수 있는 질병, 질환, 상태를 가지는 개체의 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 개체에 소정 비율로 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 함유하는 조성물을 도입하는 단계를 포함하며, 이때 상기 소정 비율은 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 조성물을 콜로니-형성 단위의 생성을 허용하는 조건과 시간 동안 시험관내에서 배양하였을 때, 콜로니-형성 단위를 가장 많이 생성하는 비율이며, 이때 콜로니-형성 단위의 각 조건마다 세포 수는 같다. 다른 특정 태양에서, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 제대혈 또는 태반 혈액 줄기세포이다. 다른 특정 태양에서 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 조혈 줄기세포이다. 다른 특정 태양에서, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 골수 유래 줄기세포이다. 다른 특정 태양에서, 상기 치료는 예방적이다. 다른 특정 태양에서, 상기 치료는 치료 목적이다. 다른 다양한 태양에서, 상기 질병, 질환 또는 상태는 아래 열거할 질병, 질환, 상태 중 하나이다. 본 명세서에서 제공하는 질병, 질환과 상태의 목록은 제한 열거적인 목적으로 제시하는 것이 아니다.

줄기세포군, 특히 태반 줄기세포와 제대혈 또는 제대혈 유래 줄기세포를 함유하는 줄기세포군의 용도 중 하나는 예를 들어 항암 치료의 일환으로서 부분적 또는 완전한 골수 절제를 받은 환자의 조혈 기능 재구성이다. 전형적으로는 조혈 기능 재구성을 위하여 골수 줄기세포를 약 이식하게 되는데, 환자의 체중 매 kg마다 약 1x10⁸ 내지 2x10⁸의 골수 단핵 세포 또는 약 1~8×10⁶ CD34⁺ 줄기세포(즉 70kg 기증자에 대하여 약 70 mL의 골수)를 주입하여야 한다. 조혈 기능 재구성은 동등한 수의 총 유핵세포를 가지는 통합 줄기세포군, 예를 들어 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포, 이를테면 태반 혈액 또는 제대혈을 포함하는 통합 줄기세포군을 개체에 도입함으로써 이루어질 수도 있다.

태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 수용 대상자와 면역학적으로 완전히 또는 부분적으로 일치하거나, 혹은 완전히 무관한 개체로부터 온 것일 수 있다. 한 실시 태양에서, 통합 줄기세포군를 받는 개체는 5/6 HLA 짝지은(HLA matched) 세포에 대하여 3.5×10⁷보다 더 많은 총 유핵세포(TNC), 예를 들어, 제대혈 유래 세포를 매 체중 kg마다 수혈받거나, 4/6 HLA 짝지은 세포에 대하여 5.0×10⁷보다 더 많은 총 유핵세포(TNC), 예를 들어, 제대혈 유래 세포를 매 체중 kg마다 수혈받는다. TNC, 예를 들어 제대혈(UCB)로부터 온 TNC의 주입에 이어서, 이를테면 그 직후에 태반 관류물로부터 얻은 TNC 약 5 내지 30×10⁶을 매 체중 kg마다 받는다. 한 개체는 이러한 용량 1회분을 받거나, 여러 회분을 받을 수 있다.

따라서 한 태양에서는, 조혈 줄기세포를 함유하는 통합 줄기세포군을 이용하여 림프종, 백혈병(만성 또는 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, Hodgkin씨 병 등), 골수 이형성증, 골수 이형성 증후군 등의 혈액암을 치료할 수 있다. 다른 태양에서, 상기 질병, 질환 또는 상태는 만성 육아종증이다.

조혈 기능 재구성은 빈혈 치료에도 쓰이기 때문에, 본 발명은 빈혈 또는 혈액 헤모글로빈 이상을 가지는 개체를 본 발명의 줄기세포군으로 치료하는 것도 망라하고 있다. 이러한 빈혈 또는 이상은 자연적인 것(예를 들어 유전 또는 병 때문인 것)이거나 인위적으로 생긴 것(예를 들어 의도적 혹은 우연한 중독, 화학요법 등)일 수 있다. 다른 태양에서, 상기 질병 또는 질환은 골수 기능 부진 증후군(에를 들어 무형성 빈혈, Kostmann 증후군, Diamond-Blackfan 빈혈, 무거대핵세포저혈소판증 등), 골수 이상 또는 조혈 질환 또는 이상이다.

다른 태양에서, 본 발명의 통합 줄기세포군은 생체내 기관 신생과 손상 회복을 위하여 손상된 기관에 도입할 수 있다. 이러한 손상은 심근 경색, 발작 이상, 다발성 경화증, 뇌졸증, 저혈압, 심정지, 허혈, 염증, 나이와 관련된 인식 손상, 뇌성 마비, 신경퇴행성 질환, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, Leigh 병, 에이즈 치매, 기억력 손상, 근육 위축성 측삭 경화증, 허혈 신 질환, 뇌 또는 척수 외상, 심장-폐 바이패스, 녹내장, 망막 허혈, 또는 망막 외상을 포함하는 질환 또는 상태 때문일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

다른 태양에서, 통합 줄기세포군으로 치료할 수 있는 상기 질병, 질환 또는 상태는 테이-삭스(Tay-Sachs), 니만-픽(Niemann-Pick), 파브리(Fabry's), 가우셔(Gaucher's)병(예를 들어 글루코세레브로시다제 결핍증), 헌터(Hunter's) 및 헐러(Hurler's), 마로토-라미(Maroteau-Lamy), 푸코시드 축적증(fucosidosis, 푸코시다제 결핍증), 바텐(Batten) 증후군(CLN3)과 기타 갱글리오시드증(gangliosidosis), 점액다당류증(mucopolysaccharidosis) 및 글리코겐증(glycogenosis)과 같은 리소좀 축적증을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

상기 통합 줄기세포군은 통합 면역결핍증(예를 들어 Wiskott-Aldrich 증후군, 중증 DiGeorge 증후군 등)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 중증 통합 면역 결핍증을 치료하는데 쓰일 수 있다.

다른 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 예를 들어 선천성 대사 이상을 치료하기 위한 유전자 치료에서 자가 또는 이종 이전유전자(transgene) 담체로서 쓰일 수 있는데, 이러한 선천성 대사 이상에는 아드레노류코디스트로피(adrenoleukodystrophy, 예를 들어 co-A 리가아제 결핍증), 이염색 백색질 장애(황산아릴 가수분해효소 A 결핍증, 예를 들어 증상이 나타나거나 증상이 나타나기 전인 영아 후기형 또는 청소년형이 있음), 공세포 백색질 장애(Krabbe병, 갈락토세레브로시다제 결핍증), 산성 지질 분해 효소 결핍증(Wolman 병), 낭종 섬유증, 글리코겐 축적 질환, 하이퍼티로이디즘(hypothyroidism), 겸상 적혈구병(sickle cell anemia), 지중해 빈혈(예를 들어 베타 지중해 빈혈), 페아르손(Pearson) 증후군, 폼페 병, 페닐케톤뇨증(PKU), 포르피리아(porphyrias), 단풍 시럽뇨병, 호모시스틴뇨증(homocystinuria), 점액다당류증, 만성 육아종 질환 및 티로신혈증 및 테이-삭스(Tay-Sachs) 질환이 있고, 이밖에 고상의 암종이나 다른 병리학적 상태를 치료하는데 쓰일 수 있다.

다른 태양에서, 상기 질병, 질환 또는 상태는 하나 이상의 조직의 교체 또는 수리를 요하는 질병, 질환 또는 상태이다. 예를 들어, 본 발명의 통합 줄기세포군은 간, 이자, 콩팥, 허파, 신경계, 근육계, 뼈, 골수, 가슴샘, 지라, 점액 조직, 생식샘 또는 털의 줄기 또는 전구세포를 보충 또는 교체하기 위한 치료적 이식 절차에서 사용될 수 있다. 본 발명의 통합 줄기세포군은 또한 연골(cartilage), 힘줄(tendon), 또는 인대(ligament)의 보강, 회복 또는 보충의 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어 일정 실시예에서, 보철(prostheses, 예를 들어 엉덩이 보철)은 본 발명의 통합 줄기세포군으로부터 자라난 대체 연골 조직 구조물로 가지고 피복된다. 다른 실시예에서, 관절(예를 들어 무릎)은 통합 줄기세포군으로부터 자라난 연골 조직 구조물로 재구성된다. 연골 조직 구조물은 또한 여러 가지 다른 유형의 관절을 위한 재건 외과수술에 적용될 수 있다. (이에 대한 프로토콜은 Resnick, D. 및 Niwayama, G. 등, 1988, Diagnosis of Bone and Joint Disorders, 2d ed., W.B. Saunders Co. 참조). 본 발명의 통합 줄기세포군은 외상, 대사 이상, 또는 질병으로부터 발생한 조직 및 장기의 손상을 회복시키기 위해 사용될 수 있다. 그러한 일실시예에서, 환자는, 예를 들어 심근 경색증에 의하여 손상된 심장 조직과 같이 질병에 의하여 손상된 조직 또는 장기를 회복 또는 재생하기 위하여 통합 줄기세포군을 투여받을 수 있다.

다른 실시 태양에서, 본 발명의 통합 줄기세포군은 치사량 또는 치사량 미만의 방사능을 쬔 개체에 쓰일 수 있다. 이러한 방사능은 사고, 예를 들어 작업 또는 공격을 막론한 핵 유출 사고에 의하여 우연히 또는 치료, 예를 들어 의료 절차의 일환으로서 피폭될 수 있다. 방사능이 특정 유형(예를 들어 알파, 베타, 감마)인가 여부는 중요하지 않다. 본 발명의 통합 줄기세포군은 방사능 피폭 증세, 예를 들어 욕지기, 식욕 감퇴, 무기력, 호흡 곤란, 백혈구수 감소, 만성 빈혈, 피로, 허약, 창백함, 호흡 장애, 권태감 등의 증상을 하나 이상 저감하는데 쓰일 수 있는데, 이는 이러한 증상이 회복 가능한 방사능 피폭 증세이냐 치명적인 증세를 나타내느냐에 무관하다. 다른 태양에서, 상기 개체는 급성 방사능 증후군(ARS) 관련 증세를 하나 이상 가지고 있다. 본 발명의 통합 줄기세포군은 치명적 또는 치사량 미만의 방사능을 받은 개체의 조혈계를 부분적으로 또는 완전히 재구성하는데 이용되어, 상기 개체의 조혈계가 부분적 또는 완전한 키메라가 되도록 할 수도 있다. 이러한 키메라 형성은 일시적일 수도 영구적(예를 들어 1, 2, 3 주 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 개월 또는 그 이상)일 수도 있다. 바람직한 한 태양에서, 본 발명의 통합 줄기세포군은 상기 개체에게 노출 후 24시간 내에 제공된다. 이 개체에게는 통합 줄기세포군을 노출 후 첫 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 15, 18 또는 21시간 안에 투여할 수 있다. 본 발명의 통합 줄기세포군은 방사능 노출 후 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주일, 2주일, 3주일, 4주일 또는 5주일 안에 투여할 수도 있다.

상기 통합 줄기세포군은 염증을 앓고 있는 개체에 투여했을 때 소염 효과를 가질 것으로 예상할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 통합 줄기세포군은 염증으로부터 생긴, 또는 염증과 관련된 어떠한 질병, 병태 또는 이상을 치료하는데 쓰일 수 있다. 염증은 예를 들어 근육, 뇌, 척수 및 말초 신경계를 포함하는 신경계, 심 조직을 포함하는 혈관 조직, 이자, 소장 또는 소화관의 다른 장기, 허파, 콩팥, 간, 생식기, 내피 조직, 또는 내배엽 조직을 포함하는 모든 장기 또는 조직에 존재할 수 있다.

본 발명의 통합 줄기세포군은 또한 염증과 관련된 것을 포함하는 자가면역 또는 면역계-관련 이상을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 따라서 일정 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 통합 줄기세포군을 치료학적으로 유효한 양만큼 자가면역 질환 또는 병태를 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 자가면역 질환 또는 병태를 가진 개체를 치료하는 방법을 포함하는데, 여기서 상기 질병 또는 질환은 당뇨병, 근육 위축성 측삭 경화증, 중중 근무력증, 당뇨병성 신경병증 또는 루푸스를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 관련 실시예에서, 본 발명의 통합 줄기세포군은 만성 또는 급성 알레르기와 같은 면역 관련 이상을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

통합 줄기세포군을 또한 명목상으로 건강한 개체에게 투여하여 그 개체의 전체적인 건강과 웰빙을 증진할 수 있다.

통합 줄기세포군을 이용한 개체의 치료 또는 예방적 시술은 그 질병, 질환 또는 상태가 측정할 수 있는 방식으로 어떻게든 좋아지면 효과가 있다고 볼 수 있다. 이러한 개선 효과는 여러 가지 지표에 의해 나타날 수도 있다. 측정 가능한 지표로는 예를 들어 특정 질환, 이상 또는 병태와 관련된 한 생리적 상태 또는 이러한 상태의 집합의 검출 가능한 변화를 포함한다(이러한 변화는 혈압, 심박, 호흡율, 다양한 혈액 세포 타입의 수, 일정 단백질의 혈액 내 수치, 탄수화물, 지질 또는 사이토킨 또는 질병, 이상 또는 병태와 관련된 유전적 표지들의 조절 발현을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다). 본 발명에 따른 줄기세포 또는 보강된 세포군으로 개체를 치료하는 것은 이러한 지표 중 어느 하나가 상기 치료에 반응하여 정상값에 근접하거나 범위 내에 있는 값으로 변화하면 효과가 있다고 볼 수 있다. 다양한 지표들에 대한 정상 수치는 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 정상 범위를 참조하거나, 또는 그러한 수치들을 대조군과 비교하여 설정할 수 있다. 세포 생착을 위하여 본 발명의 통합 줄기세포군을 도입, 예를 들어 조혈 생착시키는 경우에 상기 통합 줄기세포군을 도입받은 개체가 세포 생착의 어떠한 징후(예를 들어 생착 세포의 표지가 생검 또는 조직 시료 또는 피 시료에서 나타나거나, 생착 세포가 수행하는 생화학적 기능이 하나 이상 검출될 때)라도 나타나게 되면 이는 성공적이라고 볼 수 있을 것이다. 의학에서, 치료의 효율은 또한 종종 개인의 건강 상태에 대한 개인의 인상과 주관적 느낌에 의하여 특성 지워진다. 그러므로 본 발명의 줄기 세포 또는 보충된 세포군의 투여 후에 나타나는 개선은 또한 개체의 주관적 개선 느낌, 증가된 웰빙, 증가된 건강 상태, 개선된 에너지 레벨, 또는 그와 유사한 것과 같은 주관적 지표에 의해 특성 지워질 수 있다.

6. 줄기세포 은행

앞서 기술한 방법, 특히 생체내 방법(1.1.절을 보라)은 예를 들어 태반 관류물, 태반 줄기세포, 제대혈, 제대혈 줄기세포 등의 개별 단위에 대하여 수행할 수 있고, 이렇게 하여 줄기세포가 필요한 개체의 치료를 위한 통합 줄기세포군을 제조할 수 있다. 따라서 이러한 분석 방법은 제대혈 은행을 포함하는 줄기세포 은행 또는 혈액 은행 운용 방법의 일부로 이용할 수 있는데, 여기서 줄기세포를 제공하는 것은 상기 은행 운용의 최소한 일부분을 이룬다. 이 분석 방법은 복수 단위의 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 각 단위에 대하여 적용할 수 있고, 혈액 은행, 줄기세포 등록부 또는 비슷한 기관에 의하여 쓰이거나 제공될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 한 태양에서는 줄기세포 은행 운용 방법을 제공하는데, 이 방법은 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 함유하는 복수 단위의 통합 줄기세포군을 제공하는 단계를 포함하며, 이때 상기 통합 줄기세포군은 같은 세포 수의 태반 줄기세포만 또는 같은 세포 수의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만에 비하여 개선되거나 향상된 세포 생착을 나타낸다. 특정 태양에서, 상기 통합 줄기세포군은 복수의 태반 줄기세포 단위를 제공하는 단계; 복수의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 단위를 제공하는 단계; 상기 태반 줄기세포의 각 단위를 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 각 단위와 짝짓는 단계 및 상기 태반 줄기세포를 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대하여 통합하는 비율을 결정하는 단계를 포함하는 방법으로 생성하되, 이때 상기 통합하는 비율은, 그 비율에 따라 통합된 통합 줄기세포군이 콜로니-형성 단위의 생성을 허용하는 조건과 시간 동안 상기 통합 줄기세포군과 같은 세포 수인 태반 줄기세포만의 집단 또는 같은 세포 수인 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만의 집단보다 콜로니-형성 단위를 더 많이 생성한다. 특정 태양에서, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 제대혈 또는 태반 혈액 줄기세포이다. 다른 특정 태양에서, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 말초 혈액 줄기세포이다. 다른 특정 태양에서, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 골수 줄기세포이다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 무작위적으로 짝지어진다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 상기 태반 줄기세포 단위와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 단위의 특성을 바탕으로 짝지어진다. 더 구체적인 태양에서, 상기 특성은 상기 태반 줄기세포 단위 속의 총 유핵세포 수와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 단위 속의 총 유핵세포 수이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 특성은 상기 태반 줄기세포 단위 속의 줄기세포 수와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 단위 속의 줄기세포 수이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 특성은 상기 태반 줄기세포가 나타내는 면역학적 표지와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포가 나타내는 면역학적 표지이다.

본 발명은 나아가, 태반 유래 줄기세포, 예를 들어 태반 유래 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 단위의 은행을 제공하는데, 여기서는 상기 태반 유래 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 함께 소정의 비율로 제공하며, 이때 상기 소정의 비율은 이때 상기 소정 비율은 상기 태반 유래 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 통합 줄기세포군으로 하여금 상기 통합 줄기세포군과 같은 총수의 세포를 함유하는 태반 유래 줄기세포만의 세포 집단 또는 같은 총수의 세포를 함유하는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만의 세포 집단보다 콜로니-형성 단위 분석에서 콜로니-형성 단위를 더 많이 생성하게 한다. 한 바람직한 태양에서, 상기 은행은 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포와 짝지워진 또는 소정의 비율로 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 하나 이상의 단위와 통합할 수 있는 것으로 확인된 복수 단위의 태반 유래 줄기세포를 함유하는데, 여기서 상기 소정의 비율은 각 단위에 특이적이며, 상기 소정의 비율로 상기 단위들을 통합하면 같은 세포 수의 태반 유래 줄기세포만의 집단 또는 같은 세포 수의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만의 집단보다 콜로니-형성 단위 분석에서 콜로니-형성 단위를 더 많이 형성하거나, 대상에 이식하였을 때 향상된 세포 생착을 나타낸다. 이 은행은 별개의 태반 유래 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 짝지워진(matched) 별개의 단위들을 포함하거나, 통합 줄기세포군의 단위들을 포함한다.

이러한 은행 속 또는 이러한 은행 속의 통합 줄기세포군의 단위들 속에 포함된 태반 유래 줄기세포는, 예를 들어, 태반으로부터 직접 얻은 관류물 속에 포함된 세포, 태반 관류물에서 분리한 태반 유래 줄기세포 또는 태반의 효소 소화물이고 유핵세포 분획 속에 포함된 세포, 남아 있는 태반 세포를 옐르 들어 하나 이상의 세포 표면 표지에 따라 분리한 태반 유래 줄기세포 또는 상기 모든 세포를 배양 및/또는 증폭한 줄기세포군일 수 있다. 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 조직 균질화물 속에 포함된 세포이거나 다른 조직 특이적 세포의 집합, 예를 들어 온 제대혈 또는 태반 혈액, 모든 등급으로 제2 세포원에서 분리한 줄기세포 또는 상기 모든 세포를 배양 및/또는 증폭한 줄기세포일 수 있다.

바람직하게는 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 같은 개체로부터 유래한다. 한 특정 태양에서, 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 태반에서 얻은 제대혈 및/또는 태반 혈액 줄기세포로서, 이들로부터 다시 태반 줄기세포를 얻거나 유래한다. 한 바람직한 태양에서, 상기 은행은 하나의 개체에서 유래한 태반 줄기세포와 제대혈 또는 태반 혈액 단위로부터 얻은 줄기세포를 여러 비율로 함유하는 통합 줄기세포군 단위들을 포함하는데, 이러한 비율은 각 단위에 특이적이며, 이때 상기 통합 줄기세포군은 같은 세포 수의 태반 유래 줄기세포 또는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만의 집단보다 콜로니-형성 단위 분석에서 콜로니-형성 단위를 더 많이 형성하거나, 대상에 이식하였을 때 향상된 세포 생착을 나타낸다.

상기 줄기세포 은행 속의 태반 유래 줄기세포는 적어도 하나의 HLA 표지로 특성 파악되는 것이 바람직하다. 한 바람직한 태양에서, 상기 은행은 HLA-특성 파악한 태반 유래 줄기세포 단위를 복수로 함유한다. 한 태양에서, 본 발명은 태반 유래 줄기세포 단위를 복수로 가지는 줄기세포 은행을 제공하는데, 여기서 상기 태반 유래 줄기세포는 적어도 하나의 HLA 표지에 의하여 특성 파악된다. 한 특정 태양에서는 상기 태반 유래 줄기세포를 태반 관류물로부터 분리한다. 다른 특정 태양에서는 상기 태반 유래 줄기세포를 태반 관류물로부터 분리한 유핵세포군 속에 포함한다. 다른 특정 태양에서는 상기 태반 유래 줄기세포가 CD34⁺ 줄기세포이다. 다른 특정 태양에서는, 상기 태반 유래 줄기세포가 CD105와 CD73에 대하여 양성이거나 항체 SH2, SH3 및/또는 SH4와 결합한다. 다른 특정 태양에서, 상기 태반 유래 줄기세포는 OCT-4 및/또는 HLA-G에 대하여 양성이다.

한 실시 태양에서는 본 발명의 줄기세포 은행이 혈액 또는 혈액 유래 줄기세포 단위, 예를 들어 태반 혈액 또는 제대혈 혹은 제대혈 또는 태반 혈액으로부터 어든 줄기세포 단위들을 복수로 함유한다. 상기 줄기세포 은행에 수용된 혈액 또는 혈액 유래 줄기세포 단위들 중 바람직하게는 적어도 하나 그리고 더 바람직하게는 대다수는 상기 은행 속의 태반 유래 줄기세포 단위들 중 적어도 하나, 바람직하게는 대다수와 HLA-일치한(짝지워진)다. 따라서 다른 특정 태양에서, 본 줄기세포 은행은 혈액 또는 혈액 유래 줄기세포 단위들을 복수로 함유한다. 다른 특정 태양에서, 상기 복수 단위의 혈액 또는 혈액 유래 줄기세포 중 적어도 한 단위는 상기 복수 단위의 태반 유래 줄기세포가 공유하는 HLA 표지 중 적어도 하나에 의해서 동정된다. 다른 특정 태양에서, 상기 복수 단위의 태반 혈액 또는 제대혈 속의 단위들 중 대다수는 상기 복수 단위의 태반 유래 줄기세포 중 대다수가 공유하는 HLA 표지로 동정된다.

상기 줄기세포 은행에 포함되는 태반 유래 줄기세포 단위들과 혈액 유래 줄기세포 단위들은 특정 개체에 도입할 때 조회와 조합을 쉽게 하기 위하여 목록화하고 교차 짝지워지는 것(cross-matching)이 바람직하다. 예를 들어, 특정 HLA 표지 또는 HLA 표지 프로파일을 가지고 있는 특정 개인은 태반 유래 줄기세포 단위들 중 하나 이상에 짝지워질 수 있고, 바람직하게는 혈액 유래 줄기세포, 예를 들어 제대혈 또는 태반 혈액 단위들 중 하나 이상과 짝지워질 수 있다. 바람직하게는 상기 태반 유래 줄기세포와 혈액 줄기세포를 상기 개체에 투여하기 전에 통합하여 본 발명의 통합 줄기세포군을 형성하게 된다. 이러한 통합 줄기세포군은 본 명세서의 다른 부분에서 설명한 방법에 따라 제조할 수 있다.

상기 줄기세포 은행은 어떠한 수의 개체로부터 얻어도 무방한 태반 유래 줄기세포 및/또는 짝지은 혈액 단위(matched blood unit)들을 포함할 수 있다. 다양한 실시 태양에서 본 발명의 줄기세포 은행은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 700000, 800000, 900000, 1000000명 또는 이보다 더 많은 개체에서 얻은 태반 줄기세포 단위들 및/또는 혈액, 예를 들어 태반 혈액 및/또는 제대혈 단위들을 포함할 수 있다.

7. 키트

본 발명은 나아가 본 발명의 통합 줄기세포군을 확인 및/또는 제조하는데 쓰일 수 있는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 사용자로 하여금 태반 줄기세포의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대한 적절한 비율을 결정하여 통합 줄기세포군을 제조하는데 쓸 수 있게 하여준다. 이러한 키트는 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 개별 단위 또는 단위들의 생리학적 상태를 반형하는 통합 줄기세포군을 만드는데 쓰일 수 있으며, 통합 줄기세포군을 제조하는 쓰일 수 있다. 특히 이러한 키트는 사용자로 하여금 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 이용하는 콜로니-형성 단위 분석을 할 수 있게 하여 준다.

따라서 본 발명의 한 실시 태양에서는 태반 줄기세포군과 콜로니-형성 단위 분석에 적합한 복수의 용기를 밀봉 용기 형태로 제공한다. 다른 특정 태양에서, 상기 복수의 용기는 조직 배양 플레이트 속의 웰들이다. 상기 플레이트는 적어도 8, 12, 24, 48, 96 또는 적어도 128개의 웰을 가질 수 있다.

다른 특정 태양에서, 상기 키트는 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 공동 배양을 위한 지시 설명을 가지고 있다. 더 구체적인 태양에서는, 상기 지시 설명은 콜로니-형성 단위 형성을 위한 상기 태반 줄기세포와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 공동 배양에 관한 지시를 담고 있다. 다른 더 구체적인 태양에서는 상기 지시가 상기 태반 줄기세포와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 여러 가지 비율로 공동 배양하고, 상기 여러 가지 비율 중에서 하나를 선택하는데 대한 지시를 담고 있다.

다른 특정 태양에서, 상기 키트는 줄기세포의 분리에 적절한 배지 용기를 하나 이상 포함한다. 다른 특정 태양에서는 상기 키트가 줄기세포를 콜로니-형성 단위로 배양 및/또는 분화하는데 적절한 배지 용기를 적어도 하나 포함한다. 다른 특정 태양에서, 상기 배지는 메틸셀룰로스 기반 또는 녹말 기반 배지이다. 다른 특정 태양에서는 상기 배지가 줄기세포 배양에 적절한 배양 배지이다. 다른 더욱 구체적인 태양에서는 상기 배지가 메토컬트 GF⁺ H4435 배지, 2% 소 태아 혈청과 1% 스템스판(Stemspan) CC100 사이토킨 칵테일로 보강된 RPMI 1640, Dulbecco 변형 Eagle 배지(DMEM) 또는 Iscove 변형 Dulbecco 배지(IMDM)이다.

다른 특정 태양에서 상기 키트는 평가 그리드를 포함하는데, 이 평가 그리드는 콜로니-형성 단위 개수를 세는 것을 돕는다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 키트는 혈구계를 포함한다.

본 발명의 다른 실시 태양에서, 상기 키트는 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 앞서 밝힌 방법에 따라 찾을 수 있는 비율로 통합하고 저장하는데 적합한 용기를 제공한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 용기는 혈액 백이다.

다른 많은 태양에서, 상기 키트는 1회용품(예를 들어 장갑, 작은 타월 등)과 결과를 기록할 기록지, 용기에 붙일 라벨 등을 포함한다.

다른 특정 태야에서, 상기 키트는 상기 태반 줄기세포의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대한 여러 가지 비율 중 어느 것이 다른 값의 비율에 비하여 유의미하게 더 많은 콜로니-형성 단위를 생성하는지 결정하기 위한 통계 소프트웨어를 포함한다.

도 1A~1D는 마우스 골수에 생착한 사람 세포를 CD45 항체를 이용하여 2차례 독립적인 실험을 한 FACS 분석을 요약한 것이다. (A) 1차 실험. 제대혈 세포만의 실험(UCB), 태반 관류물 세포만의 실험(PP) 또는 태반 관류물과 제대혈 세포를 합친 실험(UCB+PP)에서 3주 후 골수 속에 존재하는 CD45⁺ 세포. X축은 매 이식시 세포 수. (B) 1차 실험. 수혈 후 10주째의 CD45⁺ 세포. (C) 2차 실험. 수혈 후 3주째의 CD45⁺ 세포. (D) 2차 실험. 수혈 후 10주째의 CD45⁺ 세포.

도 2는 NOD/SCID 마우스에 생착한 사람 세포들 중 림프골수(lymphomyeloid) 표지를 나타내는 세포의 FACS 분석 결과이다. CD45와 CD19의 공동 발현(각 실험에서 왼쪽 막대), CD45와 CD33의 공동 발현(각 실험에서 가운데 막대) 또는 CD45와 CD7의 공동 발현(각 실험에서 오른쪽 막대). X축은 매 이식시 세포 수. UCB=제대혈 세포만의 이식. PP=태반 관류물만의 이식. UCB+PP=태반 관류물 세포와 결합한 제대혈 세포의 이식.

< 실시예 1> 시험관내 콜로니 -형성 분석법

총 유핵세포는 헤타녹말 분리법에 의하여 한 단위의 제대혈에서 분리한다. 총 유핵세포는 Ficoll 분리법에 의하여 750 mL의 태반 관류물에서 분리한다.

태반과 제대혈로부터 얻은 총 유핵세포를 합치고, 3분하여 메토컬트(Methocult) GF⁺ H4435 배지(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) 또는 2% 소 태앙 혈청과 1% 스템스팬 CC100 사이토킨 칵테일(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)을 보강한 RPMI 1640 배지가 담긴 35 mm 접시에 담는다. 세포를 적어도 두 개의 비율(예를 들어, 2×10⁵ : 2×10⁵; 1×10⁵ : 3×10⁵; 3×10⁵ : 1×10⁵)로 통합하고 14일 동한 배양한다. 이어서 세포의 형태를 위상 대조 현미경(phase contrast microscope)으로 관찰하고 콜로니-형성 단위(예를 들어, CFU-GM, CFU-L, CFU-M, CFU-G, CFU-DC, CFU-GEMM, CFU-E)의 총 수를 기록한다. 그 다음 가장 콜로니-형성 단위를 많이 낳는 비율을 판정한다.

< 실시예 2> 조혈 줄기세포를 이용한 공동 배양 분석법

HLA/기증자가 일치하는 10 개의 태반 관류물과 제대혈 단위들을 해동한 다음 총 유핵세포(TNC)를 Cell-Dyne 1700 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)를 이용하여 측정하였다. 공동 배양물의 콜로니-형성 단위(CFU) 분석은 assays of the co-culture experiments were studied in triplicate in 35 mm dishes in 메토컬트 GF+ H4435 배지(StemCell Technologies, Vancouver, Canada)가 담긴 35 mm 접시 속에서 3회 반복 실험으로 이루어졌다. 단핵세포를 다음과 같이 접종하였다: 태반 관류물 유래 줄기세포(PP)만의 집단을 접시 당 50 (저밀도 접종), 250 (중밀도 접종)과 5000 (고밀도 접종)×10³/mL로 접종하였다. 제대혈 유래 줄기세포(CB)만의 집단을 접시 당 50×10³/mL로 접종하였다. 태반 관류물-유래 줄기세포와 제대혈-유래 줄기세포는 접시 당 접시 당 50×10³/mL의 제대혈-유래 줄기세포를 접시 당 50, 250과 5000×10³/mL의 태반 관류물-유래 줄기세포와 통합하여 접종하였다. CFU 분석은 접종 후 14일째에 판독하였다. 콜로니-형성 단위 총 수의 증가는 다음 식에 따라 계산하였다.

콜로니-형성 단위 총 수의 % 증가 = CB/PP - (CB+PP)/(CB/PP) × 100.

총 10개의 일치하는 CB와 PP 시료를 공동 배양하였다. 상기 공동 배양물 10개 중 4개에서, 총 CFU 활성은 CB 또는 PP 단독 배양과 비교하였을 때 접시 당 활성이 늘어났다. 총 CFU 활성의 증가폭은 백분율로 하여 저밀도 접종의 경우, 7.1%내지 43.1%, 중밀도 접종의 경우, 14.9%에서 42.1%, 고밀도 접종의 경우, 24.4%에서 43.8%였다.

< 실시예 3> SCID 재증식 세포 활성 평가를 이용한 사람 태반 관류물과 제대혈의 조혈 기능 재구성 활성을 평가하기 위한 전임상 연구

3.1. 도입

제대혈(UCB)과 사람 태반 줄기세포(HPSC) 속에 있는 세포의 줄기세포 특성을 면역결핍성 NOD/SCID 마우스를 이용한 이종 발생 이식 모형에 따라 정량적으로 평가하였다. 본 명세서에 기재한 내용은 UCB와 HPSC에서 재증식하는 NOD/SCID 세포의 빈도와 절대 수를 한계 희석 이식법(limiting dilution transplant studies)으로 결정하는 초기 실험 결과이다.

3.2. 실험 재료와 방법

3.2.1. UCB 단위의 수집과 냉동보존

산모에게 충분한 고지 후 동의를 받은 직후, 병원에서 시트르산 / 인산 / 포도당을 함유하는 3중 백 시스템 속에 UCB를 수확하였다. 이 제대혈 단위들을 혈액 수집 후 48시간 이내에 실온 하에서 저장하고 처리하였다. 부피 저감과 RBC 고갈(RBC depletion)을 위하여 헤타녹말에 기반한 방법을 사용하였다. 최종 총 유핵세포는 기체 상태의 액체 질소 탱크 속에 둔 40 mL의 10% DMSO와 자가 혈장을 함유하는 냉동백(cryobag) 속에서 냉동하였다.

3.2.2. 태반 관류물과 HPSC 단위의 냉동보존

태반 줄기세포는 미국 특허 출원 공보 제2002/0123141호와 2003/0032179호에 개시된 바에 따라 태반 관류물로부터 수집하였는데, 이들 공보는 그 전체 내용이 본 명세서의 참고 문헌이다. 간략하게, 제대혈 기증자의 태반으로부터 제대혈을 배수하고 0.9% NaCl 용액으로 압력 조절하에서 태반을 관류하였다. 총 750 mL의 관류물을 얻었다. 이 세포를 농축하고 농도 구배(Ficoll-Hypaque)로 분리하여 RBC와 세포 파편을 고갈시켰다.

3.2.3. 세포 수 계측과 생존능

세포 수는 자동화 세포 분석기(독일 Wiesbaden의 Abbott사제 Cell-Dyn 1700 또는 Cell-Dyn3200)와 수동 계측기로 측정하였다. 세포 생존능은 트리판블루 배제법으로 평가하였다.

3.2.4. 제대혈(UCB)과 태반 관류물(HPSC) 단위의 표현형 분석

단일 기증자에서 유래한 일치하는(matching) UCB와 HPSC 단위들을 사용시까지 액체 질소 속에서 유지하였다. 이식 당일, 이들 단위를 해동하였다. 해동한 직후의 UCB와 HPSC 단위의 생존능은 트리판블루로 평가하였다. 해동 후 총 유핵세포수의 회수율도 또한 평가하였다. 이어서, 이식 전에 막 해동한 세포 분획(0.5 ml)에 대하여 다음 세포 표면 표지들의 FACS 분석을 행하였다: CD34, CD38, CD33, CD14, CD7, CD3, CD56, CD10, CD19.

3.2.5. 한계 희석 NOD/SCID 재증식 세포 분석

한계 희석 SCID 재증식 세포(SRC) 분석을 이용한 정량적 연구를 8~10주령 NOD/SCID 마우스를 이용하여 수행하였다. 이 마우스에 선형 가속기로부터 325~350 cGy의 방사능을 노출율 20 cGy/분으로 이식 전에 쪼여 주엇다. 이어서 제대혈 또는 태반 관류물 또는 제대혈과 태반 관류물의 조합인 세포 200 μL를 측면 꼬리 정맥을 통하여 마우스에 정맥하 이식하였다. 이식물은 kg 당 약 2~10×10⁵ 줄기세포(비증폭 nonexpanded) 또는 매 kg마다 1~2×10⁶ 줄기세포(증폭)를 포함하였다. 재증식 세포의 빈도를 계산하기 위하여 네 가지의 세포 용량을 사용하였고, 그룹마다 6마리의 마우스를 이식하였다. 이어서 이식 후 3주 그리고 이식 후 10주 째의 마우스에서 사람 세포의 생착을 분석하였다. 마우스 대퇴골에서 수확한 25 μL의 골수 흡입물로부터 얻은 세포에 대하여 사람 림프골수계 세포 생착을 FACS 분석하였다. 각 흡입물마다 약 30~40 μL의 PBS를 담은 28 게이지 바늘의 투베르쿨린 주사기를 마련하였다. 10주째에 마우스를 희생하고 세포를 양쪽 대퇴골과 양쪽 정강이뼈와 가슴샘에서 수확하여 생착을 분석하였다. 추가적으로 두 번째 실험에서는 가장 높은 세포 용량에 해당하는 그룹의 모든 마우스를 부검하고 조직학 분석과 사람 세포 존재 확인을 위하여 조직을 수집하였다. 수집한 조직은 지라, 간, 허파, 뇌, 심장, 골격근, 콩팥과 가슴샘을 포함한다. 0.5% 이상의 CD45⁺ 세포를 생착이라고 정의하였다.

3.3. 결과

3.3.1. TNC, 생존율과 실험에 쓰인 HPSC와 UCB 단위로부터의 TNC 회수

짝지은 HPSC 단위 두 개와 그에 대응하는 UCB 단위를 이용하여 각 실험을 독립적으로 수행하였다. 표 1은 TNC와 이들 세포의 해동 후 생존율과 TNC 회수율을 나타내고 있다. 상기 두 단위의 UCB는 각각 1237×10⁶과 778×10⁶의 TNC와 82%와 83%의 생존율을 나타낸다. HPSC 단위들은 UCB 단위들고 비교하여 상대적으로 낮은 TNC 수(752.5×10⁶와 661.5×10⁶) 및 생존율(각각 67%와 66%)을 보였다.

NOD / SCID BTM 세포 생착 실험에서 쓰인 두 단위의 짝지은 태반과 UCB 의 TNC와 생존율

	실험 1 UCB	실험 1 PP	실험 2 UCB	실험 2 PP
냉동 전 TNC(×106)	1237	752.5	778.0	661.5
해동 후 생존율	83%	67%	82%	66%
해동 후 TNC 회수율	99%	53%	>100%	>100%

3.3.2. UCB와 HPSC의 표현형 분석

표 2는 이식 전 제대혈과 태반 관류물 세포의 표현형 분석 결과를 정리한 것이다. 예상대로 실험 1과 2의 제대혈 기증자에서 CD34⁺ 세포의 백분율에 차이가 있었는데, 실험 1에서는 0.56%의 세포가 CD34⁺이었고, 실험 2에서는 1.67%가 CD34⁺이었다. 이러한 차이는 기증자들 사이에 제대혈 속 TNC와 CD34⁺ 세포 수의 자연적인 변이를 반영한다. 어느 경우이건, CD34⁺ 세포의 백분율은 태반 관류물보다 제대혈에서 더 높았다. 이 제대혈은 골수계 표지(CD33과 CD14)에 대해서는 낮았지만 림프계 표지(CD3과 CD7)에 대해서는 더 높았다. HPSC 중 CD10을 발현하는 세포의 비율은 제대혈보다 현저하게 더 높다.

NOD / SCID 마우스 BTM 세포 생착 실험에서 쓰인 두 단위의 짝지은 태반과 UCB 의 FACS 분석 결과

	실험 1 UCB	실험 1 PP	실험 2 UCB	실험 2 PP
CD34+	0.56%	0.28%	1.67%	0.46%
CD34+CD38+	0.56%	0.28%	1.67%	0.46%
CD33+	26.0%	60%	28.00%	76.00%
CD14+	17.0%	46%	22.40%	58.40%
CD7+	38.5%	10.5%	63.00%	18.00%
CD3+	35.2%	11.8%	72.00%	29.00%
CD56+	7.7%	3.7%	16.50%	12.00%
CD10+	16.8%	53.0%	9.50%	59.00%
CD19+	15.6%	11.0%	8.80%	13.00%

3.3.3. 사람 세포의 NOD/SCID 마우스 내 생착

표 3은 두 차례의 독립 실험(실험 1과 2)을 통하여 NOD/SCID 마우스에 주입한 TNC의 세포 용량을 보여 준다. 양쪽 실험에서 UCB 또는 HPSC를 받은 모든 마우스는 UCB 또는 HPSC에서 얻은 같은 수의 CD34⁺ 세포를 이용하였다. 상기 CD34⁺ 세포 수에 필요한 세포 용량의 TNC를 마우스에 주입하였다. 각 용량 그룹마다 6마리의 마우스를 이용하였다.

NOD/SCID 마우스에 이식한 TNC의 세포 용량

A. 실험 1

CD34 등가 용량	TNC/마우스			그룹 당 마우스 수
	UCB	PP	UCB + PP
1.5×105	15×106	15×106	30×106	6
3×104	3×106	3×106	6×106	6
6×103	6×105	6×105	1.2×106	6
1.2×103	1.2×105	1.2×105	2.4×105	6

B. 실험 2

CD34 등가 용량	TNC/마우스			그룹 당 마우스 수
	UCB	PP	UCB + PP
2.4×105	24×106	24×106	48×106	6
8×104	8×106	8×106	16×106	6
1.1×104	1.1×106	1.1×106	2.4×106	6
8.9×103	8.9×105	8.9×105	1.8×106	6

도 1은 CD45 항체를 이용한 두 차례의 실험에서 마우스 골수(BM)에 생착한 사람 세포를 FACS 분석한 결과이다. 3주와 10주째에 마우스 골수 흡입물에 대하여 사람 CD45⁺ 세포의 존재를 FACS로 분석하였다. 양 시점 모두에서 태반 세포만을 받는 마우스는 모든 세포 용량에서 사람 CD45⁺ 세포 수가 매우 낮거나 측정할 수 없었다. 반대로, 제대혈 단독 또는 제대혈과 태반 관류물의 통합 세포군을 받은 마우스에서는 양 시점 모두에서 사람 세포 생착이 관측되었다. 3주째에는 제대혈과 제대혈 및 태반 관류물의 통합 세포군의 사람 세포 생착 수준에 유의한 차이가 없었다. 그러나 10주째에는 제대혈 세포와 태반 관류물을 모두 받은 마우스에서 사람 세포 생착 정도는 제대혈 줄기세포만 또는 태반 줄기세포만 받은 경우와 비교하여 현저하게 향상(실험 1에서는 p = 0.3이고 실험 2에서는 p = 0.0002)되었다. 이는 태반 줄기세포가 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포, 예를 들어 제대혈의 세포 생착을 향상시킨다는 것을 가리킨다.

상기 사람 세포 생착이 림프골수 계통을 포함하였는지를 알아보기 위하여 마우스 골수에서 얻은 CD45⁺ 세포에서 CD19, CD33과 CD9가 공동 발현하는지를 다시 FACS를 이용하여 분석하였다. 이 결과는 도 2에 나와 있다. 이 결과는 UCB를 받는 마우스와 UCB+HPSC를 받는 마우스가 모두 생착한 림프계와 골수계 세포를 함유하였다는 것을 가리킨다.

3.3.4. SCID 재증식 세포(SRC) 빈도

SCID 재증식 세포 빈도는 이식한 총 세포 수에 대하여 개체의 조혈계에 생착하고 재증식할 수 있는 원시적 조혈 줄기세포 수의 비이다. 이 비율은 세포군이 예를 들어 방사선 노출된 개체에 생착할 수 있는 세포를 제공하는 상대적 능력을 가리킨다. 표 4는 실험(상기 내용 참조)의 SRC 계산 결과를 나타낸다. 이 수치는 한계 희석 이식과 StemCell Technologies사의 L-Calc 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 이 실험 결과는 SRC 빈도가 향상되었다는 것을 나타내지는 않으나, 앞서 밝혔듯이, 제대혈과 태반 관류물을 함께 주입하자 전체적인 사람 세포 생착률이 유의미하게 향상되었다는 것을 보여준다. 따라서 이 경우의 데이터는 태반 관류물을 UCB와 함께 주입하면 전체 줄기세포의 수를 늘리기보다는 줄기세포 생착능을 높인다는 것을 가리킨다.

UCB와 HPSC의 SRC 빈도 추량

	빈 도	범 위
	제 3 주
UCB	1/17,791,258	12,060,000~26,245,000
PP	해당 없음
UCB + PP	1/28,728,138	19,782,000~41,719,000
	제 10 주
UCB	1/2,859,018	1,867,000~4,376,000
PP	해당 없음
UCB + PP	1/7,864,065	5,186,000~11,923,000

3.3.5. 비골수 조직에서의 사람 세포의 생착

UCB, HPSC 또는 UCB+HPSC에서 유래한 사람 세포가 골수가 아닌 마우스 조직에 생착하였는지를 살피기 위하여, 실험용 마우스 가슴샘에서 사람 세포의 존재를 FACS 분석하였고, 마우스 지라 조직을 면역조직화학 염색하였다.

실험 1에서 마우스 가슴샘으로부터 얻은 세포의 FACS 분석은 UCB와 HPSC가 함께 주입된 마우스 6마리 중 하나는 0.8%의 사람 CD45⁺ 세포를 가진다고 나타내었다. 실험 2에서 UCB(용량 2)를 주입받은 마우스 6 마리 중 하나는 8%의 CD45⁺ 세포를 나타냈지만, CD3⁺ 또는 CD7⁺ 세포를 나타내지는 않았다. 그러나 UCB+HPSC 그룹에서는 6 마리 모두 3~23%의 CD45⁺ 세포의 생착을 보였으며, 이들 중 한 마리는 CD3/CD7에 대하여 양성인 결과를 나타내었다.

사람 세포의 존재를 살피기 위하여 마우스 지라의 박편을 사람 단백질을 인식하지만 마우스 단백질은 인식하지 않는 항비멘틴 항체와 항CD45 항체로 조사하였다. 사람과 마우스 단백질 모두를 인식하는 평활근 액틴 단백질 항체를 양성 대조군으로, IgG1과 IgG2a 이소타입을 음성 대조군으로 사용하였다. 각 생착 그룹별 염색 결과는 표 5에 나타내었다.

NOD/SCID 마우스의 지라에서 면역조직화학을 이용한 사람 세포의 검출

마우스 번호	세포 산물	비멘틴	CD45	평활근 액틴	IgG1	IgG2a
304	UCB-1과 PP-1	3+	2+	2+	─	─
305		2+	1+(드묾)	2+	─	─
306		3+	2+	2+	─	─
307		3+	2+	2+	─	─
308		3+	2+	2+	─	─
350	PP-1	─	─	2+	─	─
351		─	─	2+	─	─
352		─	─	2+	─	─
353		─	─	2+	─	─
354		±(매우 드묾)	─	2+	─	─
355		─	─	2+	─	─
370	UCB-1	2+	─	2+	─	─
371		1+(드묾)	─	2+	─	─
372		2+	1+(드묾)	2+	─	─
373		±(매우 드묾)	─	2+	─	─
374		1+(드묾)	─	2+	─	─
375		1+(드묾)	─	2+	─	─
사람 편도선	해당 없음	3+	3+	2+	─	─

마우스 지라에서 중간엽 세포 표지인 사람 비멘틴을 발현하는 세포는 UCB만을 주입한 모든 마우스에서 검출되었다. 비멘틴 염색은 HPSC만을 주입받은 마우스에서는 거의 검출되지 않았다. 그러나 UCB와 HPSC 양쪽을 주입받은 마우스에서는 현저하게 높은 수준의 비멘틴 염색이 검출되었다. 상기 지라 조직을 조혈 세 포 표지인 CD45에 대한 항체로 염색하였을 때도 유사한 결과를 발견하였다. 마우스 지라를 평활근 액틴(양성 대조군) 항체로 염색하자 모든 조직이 고르게 염색되었다. 이소타입 음성 대조군 항체는 조직을 염색하지 않았다.

3.4. 토의

상기 실험에서는 같은 기증자로부터 온 태반 세포와 제대혈의 공동 주입이 제대혈만 또는 태반 세포만을 주입한 경우와 비교했을 때 10주 차의 마우스에서 사람 줄기세포의 생착 정도를 향상시킨다는 것이 밝혀졌다. 상기 NOD/SCID 마우스에서의 향상된 사람 세포 생착은 가슴샘과 지라를 포함하는 모든 조직에서 볼 수 있었다. 생착한 세포는 골수계와 림프계 세포를 모두 포함하는 것으로 드러났다. 생착한 사람 세포는 마우스 지라에서 비멘틴에 의하여 양성으로 염색되었는데, 이는 사람 줄기세포의 생착이 UCB-HPSC 공동 주입에 의하여 향상되었다는 것을 가리킨다.

< 실시예 4>: NOD / SCID 마우스에서의 세포 생착

사람 제대혈 세포와 태반 세포를 치사량 미만으로 방사능 조사한 NOD/SCID 마우스에 서로 다른 비율로 투여하여 사람 세포의 생착 정도와 재증식을 측정한 용량 범위에 대한 예비 연구를 수행하였다.

사람 이식 세포 생착의 동물 모형인 NOD/SCID 마우스의 6 가지 그룹을 치사량 미만이 400 cGy 방사능으로 조사하고 제대혈 세포와 태반 세포의 세 가지 세포 용량 중 어느 하나로 정맥하 투여하였는데, 살아 있는 총 유핵세포 수 기준으로 제대혈:태반 세포의 비율은 3:1 또는 1:1이었다. 이 세포들의 통합과 주사 후 FACS 분석을 수행하였다. 마우스의 피와 골수를 채취하여 투여 후 10 주째의 사람 세포 생착을 감시하였다.

마우스에 표 6에 나타낸 것과 같은 제대혈 세포와 태반 세포의 조합을 투여하였다.

NOD/SCID 마우스에 투여한 제대혈 세포와 태반 세포의 조합

제대혈 세포와 태반 세포*를 투여받은 NOD/SCID 마우스의 정량적 SCR 분석
그 룹	세포 비	제대혈 세포 (살아 있는 TNC)	태반 세포 (살아 있는 TNC)	총 세포 (살아 있는 TNC)	세포 용량 (μL)	마우스(수컷)의 수
부분 집합 A
1	1:1	4.5×106	4.5×106	9×106	200	10
2		9×106	9×106	18×106	200	10
3		18×106	18×106	36×106	200	10
부분 집합 B
1	3:1	4.5×106	1.5×106	6×106	200	10
2		9×106	3×106	12×106	200	10
3		18×106	6×106	24×106	200	10

* 세포 비의 각 부분 집합은 매 용량 수준마다 공통의 단위(즉 그룹 1과 4는 같은 단위를 사용하였고, 2와 5도 같은 단위, 3과 6도 같은 단위 사용)를 포함하였다. 가장 높은 용량에서는 결과를 풀하였다.

실험 재료와 방법

동물들은 DHHS 출판물 제(NIH) 86-23호(1985년 개정)와 미국 농무성의 1985 년 동물 복지법(7 U.S.C. 2131) 과 그에 따른 1991년 9 C.F.R. 제3부 기준에 따라 취급하였다.

나이가 7에서 10주차인 NOD/SCID 수컷 마우스(Taconic Laboratories, Germantown, New York)에 약 분당 171 cGy로 ¹³⁷Ce을 이용한 치사량 미만의 방사선(400 cGy)을 조사하였다. 마취하지 않은 마우스를 Mark I Model 68A 세슘 조사기 속에 2.34 분 동안 놓아 두었다.

사람 태반 세포와 제대혈 세포를 양성 압력 수집(PPC) 또는 음성 압력 수집(NPC)을 이용하여 분리하고, 투여 전에 냉동보존하였다. 세포를 37℃ 물 중탕에서 해동하고 희석한 다음 얼음 중탕에 저장하였다. 세포의 희석제는 5% 덱스트란(Baxter사)과 2.5% 사람 혈청 알부민(Bayer사)를 함유하였다. 세포 수를 측정하고 생존율을 평가하였다. 세포를 한 투여량으로 각 마우스의 꼬리 정맥에 투여하였다. 마우스를 표준 조건 하에 둔 다음 조사 후 10주째에 희생하여 세포 생착을 분석하였다.

사람 세포 생착의 증거를 찾기 위하여 CD45⁺ 세포 빈도와 CD34⁺, CD38⁺, CD19⁺, CD33⁺, CD7⁺과 CD3⁺ 세포의 빈도를 평가함으로써 골수와 가슴샘을 FACS 분석하였다. 세포의 수를 센 결과 약 500,000 세포가 웰마다 염색되었으며, 시료마다 두 개의 웰이 해당되었다. 마우스 F_c 블록(정제된 마우스 IgG)을 세포 백만 개당 1 μg의 비율로 가하여 비특이적 결합을 줄였다. 항체를 세포 백만 개당 약 1 μg의 비율로 가하였다. 한 웰은 CD45, CD34, CD38과 CD19에 대한 항체를, 다른 웰은 CD45, CD33, CD7과 CD3에 대한 항체를 포함하였다. 각 항체에 대한 이소타입 대조군 또한 세포 백만 개당 약 1 μg의 비율로 사용하였다. 항체 염색 후 세포를 30 분 동안 2~8℃에서 배양하고 인산 완충 식염수, 1% 소 혈청 알부민과 0.05% 아지드화나트륨으로 세 차례 세척하고 1% 파라포름알데히드로 고정한 다음 2~8℃의 어두운 곳에서 분석할 때까지 저장하였다. 시료를 정면과 측면 분산 게이트를 세포 파편과 덩어리를 배제하도록 설정한 Beckton-Dickinson FACSCalibur로 분석하였다. 최적 전압 설정과 보상값은 이소타입 대조군으로 결정하였다.

사람 특이적인 비멘틴 항체를 이용하여 마우스 흉골의 파라핀 절편을 대상으로 비멘틴 면역염색을 하였다. 평가 점수는 다음 척도를 이용하여 반정량적으로 하였다.

0 점 : 양성인 세포 없음.

0.5 점 : 양성인 세포 하나나 둘, 양성일 것 같지만 배경일 가능성

제외 못함

1 점 : 2~20 개의 흩어진 양성 세포들

2 점 : 조직 전체에 걸쳐서 약 20~100 개의 흩어지거나 무리진

양성 세포들 있음

3 점 : 100 개 넘는 양성 세포가 있지만 조직의 50%에 못 미침

4 점 : 골수 세포의 50%를 넘는 수가 양성임

결과

재증식 데이터를 표 7에 정리하였고, FACS 데이터를 표 8에 정리하였다. 재증식은 모든 동물 모형에서 얼마간은 뚜렷하였고 그 효과는 용량 의존적인 것으로 보였다. 각 표지에 대하여 양성 세포 백분율의 평균을 두 가지 다른 비율에서 비교하였다. CD7, CD33과 CD34는 상기 두 비율에서 통계적으로 유의미한 차이를 보였는데, 상기 1:1 비율에서 3:1 비율보다 양성 세포의 비율이 낮았다.

비멘틴 염색. 거의 모든 흉골 단편은 대략 직사각형 모양인 5~6 개의 뼈속질 공간(marrow cavity)로 이루어졌는데, 그 크기와 모양에서 얼마간 차이가 있었으며, 뼈 조직과 연골 조직으로 둘러싸여 있었다. 모든 비멘틴 양성 세포는 골수 내에서 외부 적혈구계(outer erythroid)와 골수계 전구세포와 더불어 모든 성장 단계마다 관측되었다. 음성 대조군에서는 비멘틴 양성인 세포를 관측할 수 없었다. 각 뼈속질 공간별로 점수를 매겼다. 일반적으로 비멘틴 점수는 주사한 세포의 용량과 상관 관계가 높았다. 가장 많은 수의 줄기세포를 가지는 그룹 3과 6은 비슷하게 높은 점수인 3.4를 받았다. 저용량과 중간 용량 수준에서는 같은 세포 수를 줏한 그룹 사이에 약간의 차이가 있었다. 예를 들어, 그룹 4(제대혈 세포 대 태반 세포의 비 3:1)의 평균 점수는 그룹 1(1:1 비율)보다 약간 더 높았고, 그룹 5(3:1 비율)의 평균 점수는 그룹 2(1:1)보다 약간 더 높았다.

결론

골수에 대한 흐름 세포 측정과 면역조직화학적 평가는 세포 용량에 의 존적인 방식으로 실질적인 재증식이 일어난 것을 밝혀주었다. 두 세포 비율 사이의 차이는 CD7, CD33과 CD34 세포 생착의 경우에 통계적으로 유의미한 수준에 이르렀다. 현저한 차이가 있는 경우, 제대혈 대 태반 세포 비를 3:1로 하여 처리된 동물 쪽이 1:1로 처리된 동물보다 재증식도가 더 높았다.

[표 7]

그룹 번호 정강이뼈(T) 대퇴골(F)

1 9/10 6/10

2 6/7 5/7

3 9/9 9/9

4 4/10 5/10

5 7/7 7/7

6 9/9 9/9

분자는 그룹별로 CD45⁺ 세포의 백분율이 0.5% 이상인 마우스의 수를 나타낸다. 분모는 그룹별로 흐름 세포 측정을 한 마우스의 수를 나타낸다.

FACS 분석 결과의 정리

T = 정강이뼈, F = 대퇴골, A = 정강이뼈와 대퇴골의 평균. 숫자는 표시된 사람 세포 표면 표지에 대하여 양성으로 염색하는 세포의 백분율을 나타낸다.

< 실시예 5> NOD / SCID 마우스의 조혈 기능 재구성

CD34⁺ 태반 유래 줄기세포(HPDSC)에 대한 콜로니-형성 분석은 태반 관류물에 기능적 조혈 줄기세포와 전구세포가 존재한다는 것을 밝혔다. 이에 덧붙여, HPDSC가 제대혈(UCB)에 비하여 더 미성숙한 특징을 가지는 새로운 다른 줄기세포군을 포함한다는 데이터가 있다.

태반 관류물 줄기세포가 면역결핍 NOD/SCID 마우스를 이용한 이종 이식 모형에서 가지는 생착 잠재력을 살펴 보기 위하여 실험을 수행하였다. 이 실험의 첫번째 부분은 태반 관류물 세포와 제대혈을 단독으로 또는 통합하였을 때 생착 잠재력을 평가하였는데, 대조군은 정제된 CD34⁺ 세포를 받았다. 이 실험의 두번째 부분은 태반 관류물 줄기세포가 세포 생착의 향상에 대하여 가지는 영향력이 재증식 세포 수의 증가에 의한 것인지 촉진자 세포(facilitator cell)의 존재 때문인지를 평가하였다. 이 실험에서, 세 그룹의 마우스는 각각 UCB만, HPDSC만 또는 HPDSC와 UDB의 통합 세포군을 받았다. 마우스는 각 그룹마다 같은 숫자의 CD34⁺ 세포를 받았다. 어떤 그룹의 마우스는 또한 HPDSC와 UCB의 조합을 투여받았는데, 여기서 HPDSC 또는 UCB 세포 중 하나는 재증식을 방지하지만 촉진자 세포 효과는 유지하도록 하기 위하여 따로 방사선 조사하였다. 제대혈과 태반 관류물의 개별 단위마다 SCID 재증식 능력이 차이가 있다고 알려져 있기 때문에 이 실험에서는 여러 세포 단위들을 풀(pool)하여 사용하였다.

실험 방법과 실험 설계

8~10 주령의 수컷 NOD/SCID 마우스를 Jackson Laboratory로부터 입수하였다. 마우스는 무균 환경에서 다루었고 표준 실험 관행에 따른 마이크로 아이솔레이터 우리(micro isolator cage) 속에 가두었다. 마우스에게는 물과 음식을 마음껏 주었다.

HPDSC를 담은 냉동 백과 사람 제대혈(UCB)을 담은 냉동 백은 Celgene Cellular Therapeutics에서 공급하였다.

이식하는 날, HPDSC와 UCB 단위들을 액체 질소로부터 들어내어 해동하였다. 세척 후 총 유핵세포(TNC)의 수와 생존율을 각 단위마다 구하였다. 두 번째 재증식 연구 부분에서는 첫번째 부분과 비슷한 방식으로 HPDSC와 UCB 세포를 해동하고 준비하였는데, 다만 HPDSC 또는 UCB 세포를 몇몇 세포 용량 그룹에서 조사하였다는 점이 다르다. HPDSC와 UCB 세포의 통합 세포군은 적절한 수의 HPDSC와 UCB 세포를 혼합하여 제조하였다.

세포 수는 자동화된 세포 분석기(독일 Wiesbaden의 Abbott사제 Cell-Dyne 1700 또는 Cell-Dyne 320)로 측정하였다. 준비한 세포의 생존율은 트리판블루 배제법으로 측정하였다.

SCID 재증식 분석은 8~10 주령인 NOD/SCID 마우스에 대하여 수행하였다. 이 마우스에 선형 가속기로부터 325~350 cGy의 방사능을 노출율 20 cGy/분으로 이식 전에 쪼여 주엇다. 이어서 제대혈 또는 사람 태반 관류물 세포 또는 제대혈과 사람 태반 관류물 세포의 조합을 200 μL 측면 꼬리 정맥을 통하여 마우스에 정맥하 이식하였다. 이어서 이식 후 4주 그리고 이식 후 12주 째의 마우스에서 사람 세포의 생착을 분석하였다.

사람 세포의 생착 분석은 흐름 세포 측정법으로 수행하였다. 간략하게, 시료를 항체로 염색하고, 1% 파라포름알데히드로 고정한 다음 사람 CD45와 CD34, CD7, CD33, CD10, CD7과 CD3을 포함하는 다른 세포 계통의 세포 표면 표지에 대하여 Becton Dickinson FACSCalibur로 분석하였다. 최적 전압 설정과 보상값은 이소타입 대조군으로 결정하였다. 마취한 마우스에서 얻은 골수 흡입물로 4주째 세포 생착을 분석하였고, 12주째에 마우스를 희생하여 대퇴골과 정강이뼈로부터 골수 세포를 씻어내었다. 마우스는 사람 CD45의 백분율이 0.5%를 넘으면 세포가 생착한 것으로 보았다.

실험 설계. 이식하는 날, 마우스를 방사선 조사한 다음 표 9와 10에 보인 바와 같이 서로 다른 처리군으로 무작위 배정하였다.

재증식 연구 A

그 룹	마우스/그룹	세포 용량 (μL)	CD34 숫자/마우스 실제값
UCB	13	200	1×105
HPDSC	13	200	5.1×104
UCB + HPDSC	13	200	1×105 + 5.1×104
대조군 Hi	6	200	2.5×105
대조군 Lo	5	200	1.25×105

재증식 연구 B

그 룹	마우스/그룹	CD34 수/마우스 추측값	CD34 수/마우스 실제값	TNC/마우스 실제값
UCB	15	3.0×105 CD34 /마우스	2.7×105 CD34 /마우스	28.4×106
PP1	15	3.0×105 CD34 /마우스	2.6×105 CD34 /마우스	17.72×106
UCB + PP1 (같은 총 CD34 용량)	15	3.0×105 CD34 /마우스 (1.5+1.5)	2.7×105 CD34 /마우스 (1.4+1.3)	14.8×106 +8.86×106
UCB조사 + PP1 (같은 총 CD34 용량)	15	3.0×105 CD34 /마우스 (1.5+1.5)	2.7×105 CD34 /마우스 (1.4+1.3)	14.8×106 +8.86×106
UCB + PP1조사 (같은 총 CD34 용량)	15	3.0×105 CD34 /마우스 (1.5+1.5)	2.7×105 CD34 /마우스 (1.4+1.3)	14.8×106 +8.86×106
대조군	5	3.0×105 CD34 /마우스

조사 = 방사선 조사된 세포

결과

해동 후 세포 생존율. 재증식 연구에 쓰인 UCB와 HPDSC 단위들의 해동 후 생존율은 70%를 넘었다.

NOD/SCID 마우스 속 사람 세포의 생착. 사람 세포 생착(CD45 기준 0.5% 초과)은 주입 후 4주차의 모든 마우스 그룹에서 관측되었는데, 여기에는 HPDSC 단독 주입도 포함된다. UCB 그룹에서는 6 마리 중 2 마리에서 생착 양성(평균 CD45 백분율 0.62%(, HPDSC 그룹에서는 8 마리 중 2 마리에서 생착 양성(평균 CD45 백분율 0.52%)이었고 UCB와 HPDSC를 모두 주입한 그룹에서는 9 마리 중 8 마리가 양성(평균 CD45 백분율 2.84%)이었다. HPDSC만의 그룹을 UCB+HPDSC 그룹(p = 0.006)에 또는 UCB만의 그룹을 UCB_HPDSC 그룹(p = 0.02)에 비교할 때는 사람 세포 생착에서 유의미한 증가가 관측되었다. 이식 후 12주째에 HPDSC만의 그룹에서는 CD45 관측값이 0.5%를 넘는 마우스가 8 마리 중 1 마리밖에 없는 등 생착 유지가 관측되지 않았다. 반대로 UCB만을 주입받은 마우스와 UCB+HPDSC 그룹 사이에 전체적인 사람 세포 생착 수준에는 유의미한 차이가 없었으나(평균 CD45 백분률이 각각 15.1%와 13.1%, p = 0.82), 상기 UCB 그룹에서는 단지 6 마리 중 3 마리만이 세포 생착한데 반하여, UCB+HPDSC 그룹에서는 9 마리 중 9 마리가 생착하였다. 사람 세포가 생착한 마우스는 또한 림프골수 계통 세포와 다른 계통 세포 유형의 생착을 나타내었다(표 11과 12). 이러한 데이터는 HPDSC와 UCB를 공동 주입하면 단기와 장기적인 사람 세포 생착이 HPDSC 단독 또는 UCB 단독 주입보다 현저하게 향상된다는 것을 가리킨다.

표 11: 사람 태반 유래 줄기세포와 제대혈을 단독으로 또는 조합하여 정맥하 이식받고 4주 후의 NOD/SCID 마우스에서 림프골수 계통과 다른 세포 계통 표지 세포의 생착 백분율

사람 세포 생착의 백분율	UCB	HPDSC	UCB + HPDSC	대조군 ( Hi )	대조군 ( Low )
CD45	0.62±0.92	0.52±0.76	2.84±1.89	1.33±0.90	0.09±0.14
CD33	0.51±0.78	0.43±0.67	2.41±1.52	0.91±0.68	0.02±0.05
CD19	0.17±0.24	0.15±0.31	0.76±1.0	0.44±0.43	0.04±0.08

표 12: 사람 태반 유래 줄기세포와 제대혈을 단독으로 또는 조합하여 정맥하 이식받고 12주 후의 NOD/SCID 마우스에서 림프골수 계통과 다른 세포 계통 표지 세포의 생착 백분율

사람 세포 생착의 백분율	UCB	HPDSC	UCB+HPDSC	대조군 (Hi)	대조군 (Low)
CD45	15.0±22.09	0.65±1.51	13.09±11.56	11.3±8.11	0.04±0.04
CD34	3.67±5.55	0.21±0.54	3.21±3.41	2.76±2.08	0.01±0.01
CD33	6.33±9.18	0.40±1.04	5.61±5.19	4.18±3.56	0.01±0.01
CD19	9.96±16.66	0.30±0.70	8.52±9.97	8.02±5.67	0.02±0.03
CD10	12.02±17.51	0.26±0.59	8.74±10.04	8.28±5.60	0.02±0.02
CD7	1.05±1.65	0.21±0.32	1.01±1.36	1.05±0.78	0.01±0.01
CD3	0.14±0.15	0.03±0.03	0.10±0.07	0.10±0.06	0.02±0.01

촉진자 세포 효과(Facilitator effect). UCB만의 그룹 또는 HPDSC만의 그룹과 비교하였을 때 UCB+HPDSC 그룹에서는 세포 생착이 향상되었음을 관측할 수 있었다(표 13과 14). 더욱이 조사된 HPDSC와 UCB를 주입받은 마우스는 비록 마우스 당 기능성인 CD34 세포 수를 UCB만 또는 UCB+PP1을 주입받은 마우스에 비하여 절반만 받았지만, 이 그룹에서도 동등한 수준의 세포 생착 향상이 있었는데, 이는 HPDSC의 촉진자 세포 효과를 암시한다.

제대혈 이식 후 생착 지연은 임상적으로 중요한 문제거리인데, 이는 심지어 이중 단위 골 절제 제대혈 이식에서도 그러하며, 이 경우 중성구 생착의 중앙값은 약 23일이다. 이 결과는 또한 이식을 위한 HPDSC와 단일 제대혈 단위 또는 이중 제대혈 단위와의 공동 주입이 더 빠른 생착을 위한 잠재성 있는 이식 방법으로서 그에 대한 임상 연구를 암시한다고 할 것이다.

표 13: 사람 태반 유래 줄기세포와 제대혈을 단독으로 또는 조합하여 정맥하 이식받고 4주 후의 NOD/SCID 마우스에서 림프골수 계통과 다른 세포 계통 표지 세포의 생착 백분율

사람 세포의 생착 백분율	UCB	HPDSC	UCB+HPDSC	UC조사+HPDSC	UCB+HPDSC조사	대조군
CD45	11.0±11.52	0.69±0.70	6.84±6.61	0.31±0.48	16.48±19.62	15.83±11.25
CD34	5.45±5.50	0.34±0.34	3.72±3.82	0.08±0.13	9.43±13.99	6.90±5.32
CD33	5.94±5.59	0.52±0.59	5.17±5.26	0.26±0.44	11.79±16.62	6.41±5.10
CD19	5.65±8.07	0.09±0.10	2.06±1.92	0.06±0.10	5.75±5.86	8.23±5.52

표 14: 사람 태반 유래 줄기세포와 제대혈을 단독으로 또는 조합하여 정맥하 이식받고 12주 후의 NOD/SCID 마우스에서 림프골수 계통과 다른 세포 계통 표지 세포의 생착 백분율

사람 세포의 생착 백분율	UCB	HPDSC	UCB+HPDSC	UC조사+HPDSC	UCB+HPDSC조사	대조군
CD45	41.86±28.70	15.10±23.75	48.29±28.18	0.68±0.66	51.62±29.91	33.37±19.18
CD34	8.78±6.20	2.48±3.35	9.32±7.70	0.08±0.09	8.20±6.38	10.29±5.77
CD33	7.98±5.12	2.66±4.01	8.32±6.29	0.17±0.20	6.16±4.35	4.23±2.72
CD19	36.99±25.69	13.48±21.35	41.25±0.49	0.49±0.69	47.04±27.07	28.31±16.69

< 실시예 6> 통합 줄기세포군을 이용한 근육위축성 측삭 경화증의 치료

루게릭 병으로도 불리는 근육위축성 측삭 경화증(ALS)은 피질과 뇌간과 척수의 운동 뉴런에 일어나는 신경 변성 질환이다. ALS는 많게는 매년 5천명의 새 환자가 미국에서 발생하며, 20,000명에게 영향을 미친다. 대부분의 간헐성(S-ALS)이지만 약 5~10%는 유전적(familial, F-ALS)이다. AlS는 불수의 운동을 조절하는 뇌와 척수 속의 특정 신경 세포가 점차 퇴행하면서 일어난다. ALS의 가장 핵심적인 특징은 척수 운동 뉴런의 상실로서, 이들의 통제를 받는 근육이 약해져서 말라죽게 되므로 마비가 온다. ALS는 어느 근육이 먼저 약해지느냐에 따라 여러 가지 다른 방식으로 나타날 수 있다. ALS는 중년 남성을 타격하는데, 여성에 비하여 1.5배 더 발병율이 높다. ALS는 대개 진단 후 5년 내 치명적이다.

ALS는 유전적 형태와 간헐적 형태를 모두 지니며, 유전적 형태는 이제 몇 개의 서로 다른 유전자좌에 연관되어 있다. 유전적 형태의 ALS는 약 5~10%에 그친다. 이들 중에서 15~20%가 Cu/Zn 초과산화물 불균등화 효소 1(SOD 1)을 암호화하는 유전자 때문에 일어난다. 이는 효소에 독성을 부여하는 "기능 획득(gain-of-function)" 돌연변이로 보인다. ALS의 원인으로서의 SOD 돌연변이를 발견한 것은 이 질병의 이해를 진전시키는데 초석이 되었다. 이 질병의 동물 모형은 이제 존재하며 세포의 죽음에 이르는 분자 수준의 사건에 대하여 가설을 제기하고 시험하고 있다.

아래는 ALS를 가지는 한 개인을 통합 줄기세포군으로 치료하는 방법을 예시한 것이다. 이 방법은 말초의 임시 카테터(angiocatheter)를 이용한 정맥 주입에 관련된다.

ALS를 가지는 개인은 먼저 표준적 실험실 분석을 통하여 평가를 받게 된다. 이러한 분석은 대사 프로파일, 차등 CBC(CBC with differential), 지질 프로파일, 피브리노겐 농도, 혈액의 ABO Rh형 분석, 간 기능 검사와 BUN/크레아틴 농도 측정을 포함할 수 있다. 개인들은 이식 하루 전에 다음 약제를 복용하도록 지시받는다. 디펜히드라민(BENADRYL^TM) 25 mg 하루 3회와 프레드니손 10 mg.

통합 줄기세포군은 태반 관류물 한 단위와 이에 짝지어진(matched) 제대혈 단위(즉 상기 관류물을 제대혈을 취한 그 태반으로부터 취함)로부터 제조한다. 상기 관류물과 제대혈로부터 총 유핵세포군을 분리하고 각 시료를 시험관내에서 여러 가지 비율로 시험하여, 콜로니-형성 단위를 가장 많이 생성하는 비율을 결정한다. 상기 두 세포군을 대략 이 비율로 통합하여 통합 줄기세포군을 pw조한다. 이 줄기세포군은 이식 전 약 이틀 동안 약 5℃의 온도에서 유지된다.

이 개인은 정맥 투여, 생리학적 감시와 물리적 관찰을 위한 모든 설비를 갖춘 외래 환자 임상 센터에서 이식을 받는다. 대략 이식 한 시간 전에 이 개인에게 디펜히드라민(BENADRYL^TM) 25 mg과 프레드니손 10 mg을 경구 투여한다. 이는 예방을 위한 것이며 급성 알레르기 반응의 가능성을 줄이기 위함이다. 이식 시에 이 개인의 말단 중 하나에 18 G 내재(indwelling) 말단 정맥선을 꽂고 D5½ 정상 식염수+20 mEg KCl을 TKO(to keep open) 속도로 주입하여 정맥선을 열어 놓는다. 이 개인을 이식 전에 특히 심장 박동, 호흡 속도, 온도에 주의하여 살핀다. 심전도와 혈압 등 다른 감시를 할 수도 있다.

상기 통합 줄기세포군을 이제 약 시간당 1~2×10⁹ 개의 총 유핵세포의 비율로 주입하되, 총 부피를 60 mL로 한다. 마우스의 전임상 데이터에 따르면 체중 매 kg마다 총 2.0~2.5×10⁸ 개의 세포를 투여하여야 한다. 예를 들어 70 kg인 개인은 약 14~18×10⁹ 개의 총 유핵세포를 받게 된다. 이 개인이 알레르기 반응이나 과민 반응을 일으키는지 살펴야 하며, 그 즉시 주입을 멈춘다.

주입 후 이 개인은 누운 채로 적어도 60분 동안 살펴보아야 하며 이동안 그는 정상적인 활동을 할 수도 있다.

본 발명은 여기서 기술한 구체적인 실시예에 의하여 그 범위를 제한받아서는 아니된다. 실제로 앞서 논의한 내용을 바탕으로 할 때 본 명세서에서 기술한 것 외에 본 발명에 대한 다양한 변형이 있을 수 있다는 것은 이 분야의 평균적 기술자에게 자명할 것이다. 이러한 발명의 변형 역시 이하 청구 범위에 속하는 것은 물론이다.

본 명세서에서 인용하는 참고 문헌은 그 내용 전부를 참고 문헌으로 삼고 있으며, 이는 참고 문헌인 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원 각각을 구체적으로 들어 그 내용 전부를 참고 문헌으로 한다고 표시하였건 그렇지 않았건 간에 모든 경우와 용도에 있어서 마찬가지로 해당된다.

인용한 모든 간행물은 출원일 전 개시를 위함이지만, 이 사실이 상기 간행물 때문에 본 발명이 선행 발명일 수 없다고 인정하는 의미는 아니다.

Claims (33)

1. 총 세포 수에서 태반 줄기세포가 제2 세포원(細胞源 source)으로부터 얻은 줄기세포에 대하여 가지는 비율을 정하는 단계를 포함하되,

   이때 상기 비율은 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 콜로니-형성 단위의 형성을 허용하기에 충분한 시간과 조건 하에서 공동 배양하면, 동일한 총 세포 수를 가지는 태반 줄기세포만을 배양 또는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만을 배양한 경우보다 더 많은 콜로니-형성 단위를 형성하게 하는 것을 특징으로 하는, 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 수에 대한 태반 줄기세포의 비율 결정 방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 비율 결정은 상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 여러 가지 비율로, 콜로니-형성 단위를 형성하는데 충분한 시간과 조건 하에서 배양하는 단계 및

   상기 여러 가지 비율 중 가장 많은 수의 콜로니-형성 단위를 생산하는 비율을 확인하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 비율 결정 방법.
3. 제1항에 있어서,

   상기 태반 줄기세포는 하나의 태반에서 유래한 것을 특징으로 하는 비율 결 정 방법.
4. 제1항에 있어서,

   상기 태반 줄기세포는 여러 개의 태반에서 유래한 것을 특징으로 하는 비율 결정 방법.
5. 제1항에 있어서,

   상기 태반 줄기세포는 태반 관류물에서 유래한 줄기세포인 것을 특징으로 하는 비율 결정 방법.
6. 제1항에 있어서,

   상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 제대혈 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 비율 결정 방법.
7. 제1항에 있어서,

   상기 제대혈 유래 줄기세포는 조혈 줄기세포인 것을 특징으로 하는 비율 결정 방법.
8. 제1항에 있어서,

   상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 또는 전구세포를 현탁액 속에서 통합하는 것을 특징으로 하는 비율 결정 방법.
9. 제1항에 있어서,

   상기 공동 배양물에 생활성 분자를 부가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비율 결정 방법.
10. 제9항에 있어서,

    상기 생활성 분자는 사이토킨 또는 성장 인자인 것을 특징으로 하는 비율 결정 방법.
11. 제1항에 있어서,

    상기 태반 줄기세포는 한 개체로부터 얻는 것을 특징으로 하는 비율 결정 방법.
12. 제1항에 있어서,

    상기 태반 줄기세포는 여러 개체들로부터 얻는 것을 특징으로 하는 비율 결정 방법.
13. 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 복수의 동물 속에서 여러 가지 비율로 통합하는 단계;

    상기 여러 가지 비율 중 상기 복수의 동물 중 적어도 하나의 조직에서 가장 높은 수의 세포 생착을 나타내는 비율을 찾는 단계를 포함하는,

    제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대한 태반 줄기세포의 비율 결정 방법.
14. 태반 유래 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 소정 비율로 함유하는 줄기세포 은행으로서,

    이때 상기 소정 비율은 상기 태반 유래 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 통합 줄기세포군으로 하여금 상기 통합 줄기세포군과 같은 총수의 세포를 함유하는 태반 유래 줄기세포만의 세포 집단 또는 같은 총수의 세포를 함유하는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만의 세포 집단보다 콜로니-형성 단위 분석에서 콜로니-형성 단위를 더 많이 생성하게 하는 것이 특징인 줄기세포 은행.
15. 제14항에 있어서,

    상기 태반 유래 줄기세포는 태반 관류물에서 얻은 줄기세포인 것이 특징인 줄기세포 은행.
16. 제14항에 있어서,

    상기 태반 유래 줄기세포는 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포와 별도로 유지되는 것이 특징인 줄기세포 은행.
17. 제14항에 있어서,

    상기 소정 비율은 태반 유래 줄기세포만의 세포 집단 또는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만의 세포 집단보다 향상된 생체내 세포 생착을 나타내는 것이 특징인 줄기세포 은행.
18. 제14항에 있어서,

    상기 소정 비율은 콜로니-형성 단위 분석으로 결정하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 은행.
19. 제14항에 있어서,

    상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 성체 줄기세포인 것이 특징인 줄기세포 은행.
20. 제14항에 있어서,

    상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 제대혈 줄기세포, 골수 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 은행.
21. 제13항에 있어서,

    상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 조혈 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 은행.
22. 복수의 태반 유래 줄기세포 단위와 복수의 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 단위를 소정 비율로 제공하는 단계를 포함하되,

    이때 상기 소정 비율은 상기 태반 유래 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 통합 줄기세포군으로 하여금 상기 통합 줄기세포군과 같은 총수의 세포를 함유하는 태반 유래 줄기세포만의 세포 집단 또는 같은 총수의 세포를 함유하는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만의 세포 집단보다 콜로니-형성 단위 분석에서 콜로니-형성 단위를 더 많이 생성하게 하는 것을 특징으로 하는 통합 줄기세포군의 제조 방법.
23. 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포를 함유하는 복수 단위의 줄기세포군을 제공하는 단계를 포함하되,

    이때 상기 복수 단위의 줄기세포군은 상기 복수 단위의 줄기세포군과 같은 총수의 세포를 함유하는 태반 줄기세포만의 세포 집단 또는 같은 총수의 세포를 함유하는 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만의 세포 집단보다 개선되거나 향상된 세포 생착을 나타내는 것을 특징으로 하는 줄기세포 은행의 수립 방법.
24. 제23항에 있어서,

    상기 복수 단위의 줄기세포군은

    복수의 태반 줄기세포 단위를 제공하는 단계;

    제2 세포원으로부터 얻은 복수의 줄기세포 단위를 제공하는 단계;

    상기 태반 줄기세포의 각 단위를 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 각 단위와 짝짓는 단계 및

    상기 태반 줄기세포를 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포에 대하여 통합하는 비율을 결정하는 단계를 포함하는 방법으로 생성하되,

    상기 통합하는 비율은, 그 비율에 따라 통합된 통합 줄기세포군이 콜로니-형성 단위의 생성을 허용하는 조건과 시간 동안 상기 통합 줄기세포군과 같은 세포 수인 태반 줄기세포만의 집단 또는 같은 세포 수인 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포만의 집단보다 콜로니-형성 단위를 더 많이 생성하게 하는 비율인 것을 특징으로 하는 줄기세포 은행의 수립 방법.
25. 제23항에 있어서,

    상기 태반 줄기세포는 태반 관류물로부터 얻은 태반 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 은행의 수립 방법.
26. 제23항에 있어서,

    상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 제대혈 또는 태반 혈액 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 은행의 수립 방법.
27. 제23항에 있어서,

    상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 말초 혈액 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 은행의 수립 방법.
28. 제23항에 있어서,

    상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 골수 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 은행의 수립 방법.
29. 제23항에 있어서,

    상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 무작위적으로 짝지어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포 은행의 수립 방법.
30. 제23항에 있어서,

    상기 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포는 상기 태반 줄기세포 단위와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 단위의 특성을 바탕으로 짝지어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포 은행의 수립 방법.
31. 제30항에 있어서,

    상기 특성은 상기 태반 줄기세포 단위 속의 총 유핵세포 수와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 단위 속의 총 유핵세포 수인 것을 특징으로 하는 줄기세포 은행의 수립 방법.
32. 제30항에 있어서,

    상기 특성은 상기 태반 줄기세포 단위 속의 줄기세포 수와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포 단위 속의 줄기세포 수인 것을 특징으로 하는 줄기세포 은행의 수립 방법.
33. 제30항에 있어서,

    상기 특성은 상기 태반 줄기세포가 나타내는 면역학적 표지와 상기 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포가 나타내는 면역학적 표지인 것을 특징으로 하는 줄기세포 은행의 수립 방법.

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