KR20090031895A - 태반 니치 및 줄기 세포 배양을 위한 이의 용도 - Google Patents

태반 니치 및 줄기 세포 배양을 위한 이의 용도 Download PDF

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안트로제네시스 코포레이션
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Abstract

본 발명은 줄기 세포, 특히 인간 배아 줄기 세포의 배양, 확장 및 분화 방법을 제공한다. 이 방법은 줄기 세포를 콜라겐 바이오패브릭, 특히 포유류 태반으로부터의 양막, 융모막, 또는 양막 및 융모막으로부터 유래된 콜라겐 바이오패브릭 상에서 일정 기간 동안 배양하는 것을 포함한다.
태반, 양막, 융모막, 콜라겐 바이오패브릭, 줄기 세포의 배양, 확장 및 분화

Description

태반 니치 및 줄기 세포 배양을 위한 이의 용도{PLACENTAL NICHE AND USE THEREOF TO CULTURE STEM CELLS}
1. 기술 분야
본 발명은 태반 콜라겐 바이오패브릭(biofabric)을 사용하는 줄기 세포, 특히 인간 배아 줄기 세포의 배양, 확장 또는 분화 방법을 제공한다. 본 발명에는, 예를 들어, 세포 배양, 조직 이식, 약물 개발 및 유전자 요법 영역에서의 용도가 있다.
2. 배경 기술
인간 배아 줄기 (HES) 세포는 포배 단계 배아의 속세포덩이 (ICM: inner cell mass), 또는 배아의 생식선 융기로부터 유래된 다능성(pluripotent) 세포이다. HES 세포는 임의 유형의 세포로 발달하고 임의 유형의 조직, 기관 또는 신체 일부분 (온전한 생물 포함)을 생성하는 잠재력이 있다. 따라서, 요구에 따라 정상적인 클론성 HES 세포를 제공하고 이의 분화를 조작하는 능력이 생체의학, 산업 및 과학 분야에서의 진보를 추진할 수 있는 강력한 도구를 제공할 것으로 예상된다.
그러나, HES 세포의 실제적인 개발에는 상당한 난관들이 남아있다. 예를 들어, ES 세포를 미분화 상태로 유지시키기 위해, 일반적으로 ES 세포가 피 더(feeder) 세포 상에서 배양된다. 그러나, 피더 층-의존적 배양 시스템의 잠재적인 문제점에는 하기의 것들이 포함된다: (1) 동물 피더 세포로부터 HES 세포로 병원체가 전파될 위험 및 현재의 번식 시스템 (인간/동물 또는 인간/인간 공동-배양)이 이종이식물로 구축되었다는 사실, (2) 상당한 로트(lot)-대-로트 편차를 나타내는 1차 세포로부터 피더 세포가 주로 유래되어, 품질 제어를 어렵게 함; (3) 피더 세포의 한정된 공급원 및 수가 HES 세포의 대량 생산 및 응용을 방해함. 따라서, 피더 세포 없이 미분화 HES 세포를 유지하고 증식시키는 것이 요구된다.
Xu 등 ([Nat. Biotechnol., 19 (10): 971-974, (2001)], WO 03/020920 및 U.S. 2003/0017589)은 최초로 미분화 ES 세포를 피더-프리(free) 배양 시스템에서 성공적으로 유지시켰다. 이러한 시스템에서, ES 세포는 마우스 배아 섬유모세포로 조건화된 배지 내의 라미닌 또는 EHS (Engelbreth Holm Swarm) 육종으로부터의 MATRIGEL™ 상에서 배양된다. 그러나, 이같은 합성 매트릭스 및 규정-매트릭스 거대분자는 피더 세포가 제공하는 더욱 복합적인 세포-매트릭스 상호작용을 모방하는데 충분하지 않다. 이러한 배양 시스템이 특정 ES 세포주 (예를 들어, H1 및 H9)에만 적절하고 기타 ES 세포주에는 부적절하다는 것이 연구에서 또한 나타났다 ([Hovattal et al., Hum. Reprod. 18 (7): 1404-1409, 2003]). 또한, 예를 들어, 병원체 또는 비-배아 또는 비-인간 생체분자, 예컨대 시알산 Neu5Gc에 의해, 피더 층 세포가 오염원일 수 있는 것으로 최근 인식되었다.
또한, 모든 공급원으로부터의 줄기 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포에 대한 관심이 증가하고 있기 때문에, 이같은 세포의 개선된 배양 방법이 당업계에서 요구 된다.
따라서, 줄기 세포에 대한 개선된 피더-프리 배양 시스템이 당업계에서 여전히 요구된다. 본 발명은 태반-유래 콜라겐 바이오패브릭을 사용하는 이같은 배양 시스템을 제공한다.
3. 발명의 개요
본 발명은 줄기 세포를 콜라겐 바이오패브릭, 특히 포유류 태반으로부터의 양막, 융모막, 또는 양막 및 융모막으로부터 유래된 콜라겐 바이오패브릭과 함께 일정 기간 동안 배양하는 것을 포함하는, 줄기 세포, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포, 태반 줄기 세포, 예를 들어, CD34- 또는 CD34+ 태반 줄기 세포의 배양에서의 개선에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 배양에서 줄기 세포를 지지하는데 전형적으로 사용된 피더 세포 층을 콜라겐 바이오패브릭이 대체한다. 또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 줄기 세포의 부착 및 증식을 위한 기판을 제공한다.
어떠한 이론에 의해서도 한정되기를 원치 않으면서, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭이 세포 부착을 위한 기저층을 제공하고, 적어도 특정 실시양태에서, 배양 동안 줄기 세포의 성장을 지지하는 적합한 성장 인자를 제공하는 것으로 생각된다.
한 양상에서, 본 발명은 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하고, 이때 상기 콜라겐 바이오패브릭이 태반으로부터 유래되는, 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 콜라겐 바이오패브릭에 대해 외인성이다. 줄기 세포는 당업자에 따라 줄기 세포의 생존에 적합한 조건 하에 이에 적합한 시간 동안 배양될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 배양은 상기 줄기 세포 또는 상기 줄기 세포의 집단의 확장을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 줄기 세포의 분화를 용이하게 하거나 촉진하는 하나 이상의 작용제의 존재 하에 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공한다. 이같은 작용제는, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 성장 인자, 소형 분자 등일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 하나 이상의 이같은 작용제를 포함하거나, 줄기 세포가 배양되는 배양 배지가 하나 이상의 작용제를 포함하거나, 또는 콜라겐 바이오패브릭 및 배양 배지 모두가 하나 이상의 이같은 작용제를 포함한다.
줄기 세포는 세포 배양에서 줄기 세포의 성장을 용이하게 하는 것으로 당업자에게 공지된 조건 하에 배양될 수 있다. 줄기 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포, 예를 들어, CD34- 또는 CD34+ 태반 줄기 세포는 콜라겐 바이오패브릭 상에서 증식될 수 있거나, 또는, 예를 들어, 신경 세포, 지방세포, 연골세포, 골세포, 간세포, 췌장 세포 또는 심장 세포로, 당업자에게 주지된 바와 같은 이같은 세포로의 분화를 용이하게 하거나 촉진하는 적합한 작용제를 사용하여 분화될 수 있다.
배아 줄기 세포, 태반 줄기 세포 (예를 들어, CD34- 또는 CD34+ 태반 줄기 세포), 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 태반혈- 또는 제대혈-유래 줄기 세포, 골수-유래 줄기 세포, 성체 신체 줄기 세포, 기원 세포 (예를 들어, 조혈 기원 세포), 또는 특정 세포 유형으로 분화되도록 지정된 세포가 포함되지만 이에 한정되지 않는 임의의 줄기 세포가 본 발명의 방법에 따라 배양, 확장 또는 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 윤부 세포, 윤부 줄기 세포, 또는 골수로부터의 중간엽 줄기 세포가 아닌 줄기 세포를 배양하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명에서 사용된 콜라겐 바이오패브릭은 포유류 태반으로부터 유래된다. 바람직한 콜라겐 바이오패브릭은 실질적으로 건조하고, 즉 수분 중량이 약 20％ 이하이다. 특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 프로테아제(protease)로 처리되지 않은 것이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭 내의 단백질은 인공적으로 화학적으로 가교되지 않고, 즉 콜라겐 바이오패브릭이 고정되지 않는다. 또다른 특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭에는 태반 세포가 없고, 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭이 탈세포화(decellularization)된다. 또다른 특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 태반 세포를 포함하고, 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭이 탈세포화되지 않는다.
콜라겐 바이오패브릭은 히알루론산, 예를 들어, 히알루론산의 층을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 히알루론산이 가교된다. 더욱 특정한 실시양태에서, 히알루론산이 콜라겐 바이오패브릭에 가교된다.
콜라겐 바이오패브릭은 콜라겐 바이오패브릭에서 천연적으로 발생하지 않는, 또는 생체활성(bioactive) 화합물이 첨가되지 않은 콜라겐 바이오패브릭에서와 상이한 농도로 존재하는 생체활성 화합물을 추가적으로 포함할 수 있다. 더욱 특정한 실시양태에서, 상기 생체활성 화합물은 소형 유기 분자, 항생제, 아미노산, 통증 의약, 항-염증제, 사이토카인, 성장 인자, 효소 억제제, 키나제 억제제, 항-종양제, 항-진균제, 항-바이러스제, 또는 항-감염제이다.
일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 줄기 세포의 분화를 용이하게 하거나 촉진하는 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다. 이같은 작용제는 당업자에게 주지되어 있고, 하기에서 상세하게 기술된다. 콜라겐 바이오패브릭은 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 내인성 또는 외인성인 세포를 또한 포함할 수 있다. 본원에서 이같은 세포가 기술된다.
당업자에게 공지된, 줄기 세포의 배양, 확장 또는 분화에 적절한 임의의 배양 배지, 즉, 특정 줄기 세포에 대한 표준 배양 조건에서 줄기 세포가 증식하는 배양 배지가, 줄기 세포가 유래되는 또는 줄기 세포가 분화될 세포/조직의 공급원에 적합하게, 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 방법에 따라 배양 또는 분화된, 줄기 세포, 기원 세포 또는 특정 세포 유형, 또는 이들의 집단의 용도를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포는 본 발명의 방법에 따라 줄기 세포를 분화시킴으로써 제조된 신경 세포, 지방세포, 연골세포, 골세포, 간세포, 췌장 세포 또는 심장 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 질환 또는 용태를 치료 또는 예방하기 위해 분화되지 않은 또는 분화된 줄기 세포를 본 발명의 방법에 따라 생산된 콜라겐 바이오패브릭과 함께 또는 바이오패브릭 없이 이식하는 것을 제공한다.
본 발명은 세포에 대한 화합물의 독성을 결정하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 줄기 세포가 생존하는, 예를 들어, 증식하는 조건 하에 콜라겐 바이오패브릭과 함께 세포를 배양하는 것을 포함한다. 그후, 세포를 화합물과 접촉시키고, 세포 활성의 변화, 예를 들어, 세포자멸사, 괴사 또는 세포 사멸을 가리키는 세포의 대사 파라메터, 또는 세포자멸사, 괴사 또는 세포 사멸에 대한 경향에서의 변화를 분석한다. 등가의 조건 하에 배양되고 화합물과 접촉되지 않은 세포와 비교하여 변화가 검출되면, 화합물이 세포에 대해 독성인 것으로 확인된다. 세포는 체세포 또는 줄기 세포일 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭 세포 배양 시스템을 사용함으로써 줄기 세포의 분화에 대한 화합물의 효과를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 상기 세포를 세포의 분화에 적절한 조건 하에 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하는 것을 포함한다. 세포를 화합물과 접촉시킨다. 그후, 후보 화합물의 존재 또는 부재 하에서 분화 마커에 대해 세포를 분석한다. 분화 마커는 세포 표면 마커, 세포 형태 또는 하나 이상의 차별적으로 발현된 유전자일 수 있다. 변화가 확인되면, 상기 화합물은 상기 세포의 분화에 대한 효과가 있는 것으로 확인된다.
본원에서 사용된 "콜라겐 바이오패브릭"은 포유류 양막 및/또는 융모막으로부터 유래되거나 수득된, 실질적으로 편평한 또는 시트(sheet)와 유사한 콜라겐-함 유 물질이다. 바람직한 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 실질적으로 미국 특허 출원 공보 번호 2004/0048796 (Hariri)에 기술된 바와 같이, 60℃ 초과로 열 처리되거나 프로테아제로 처리되지 않은, 탈세포화되고 탈수된 (즉, 20％ 이하의 수분 중량) 양막, 융모막, 또는 양막 및 융모막이다. 특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭에는 인공적인 화학적으로 유도된 가교가 없고, 즉, 콜라겐 바이오패브릭이 고정되지 않는다. 전형적으로 콜라겐 바이오패브릭은 본 발명에 따른 세포의 배양, 확장 및/또는 분화 전에, 예를 들어, 배양 배지로, 재수화된다.
도 1은 콜라겐 바이오패브릭 (양막), 콜라겐, 피브로넥틴, 또는 유리 상에서의 배양 후의 태반 줄기 세포를 도해한다.
5. 발명의 상세한 설명
본 발명은 콜라겐 바이오패브릭을 사용하는 줄기 세포의 배양, 확장 또는 분화 방법을 제공한다.
5.1. 줄기 세포
줄기 세포, 예를 들어, 배아 줄기 세포 또는 성체 줄기 세포를 본 발명의 방법에 따라 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "줄기 세포"는 전능성(totipotent), 다능성 및 중복성(multipotent) 세포, 신체 줄기 세포 또는 기원 세포 등을 포함한다. 줄기 세포는, 예를 들어, 태반 줄기 세포 (예를 들어, CD34- 또는 CD34+ 태반 줄기 세포), 제대 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 태반혈- 또는 제대혈-유래 줄기 세포, 골수-유래 줄기 세포, 또는 신체 줄기 세포일 수 있다. 신체 줄기 세포는, 예를 들어, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 또는 상피 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 뇌 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 내배엽 줄기 세포, 외배엽 줄기 세포, 미국 특허 번호 5,486,359, 6,261,549 및 6,387,367 (중간엽 줄기 세포) 및 미국 특허 번호 5,962,325 (태아 간질 세포)에 기술된 세포일 수 있다. 특정 실시양태에서, 줄기 세포는 윤부 줄기 세포가 아니다.
본 발명에서 사용된 줄기 세포는, 예를 들어, 태반, 제대, 골수, 배아, 중간엽, 신경 조직, 췌장 조직, 근육 조직 (예컨대 심장 근육), 간, 피부, 장, 코 상피, 뼈, 췌장 등에서 유래될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에서 사용된 줄기 세포는 인간 태반 줄기 세포이다. 이같은 줄기 세포는, 예를 들어, 미국 출원 공보 번호 2002/0123141, 2003/0032179, 2003/0180269, 2004/0048796 (각각 거명에 의해 전문이 본원에 포함됨)에 기술되어 있고, 상기 공보에 기재된 바와 같이 통상적으로 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에서 사용된 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 배아 줄기 세포는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,843,780, 6,200,806; 및 [Thomson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844]에 기술된 바와 같이 통상적으로 단리될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 사용된 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포이다. 인간 배아 줄기 세포는, 예를 들어, [Thomson et al., 1998, Science, 282: 1145], 및 미국 특허 번호 6,200,806에 기술되어 있다.
본 발명은 골수-유래 중간엽 줄기 세포 또는 윤부 세포, 예를 들어, 윤부 줄기 세포가 아닌 줄기 세포의 배양을 또한 제공한다.
본 발명에서 사용된 줄기 세포는 당업자에게 공지된 방법 또는 재료를 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포를 상업적인 시설, 예를 들어, LifeBank USA (Cedar Knolls, N.J.), ViaCord (Boston Mass.), Cord Blood Registry (San Bruno, Calif.) 및 Cryocell (Clearwater, Fla.)로부터 수득할 수 있다. 또한 줄기 세포를 당업계에 공지된 공정 또는 절차를 사용하여 수집할 수 있다. 영장류 원시 줄기 세포를, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,200,806, 및 6,800,480에 기술된 바와 같이 수득할 수 있다. 태반 줄기 세포를, 예를 들어, 미국 출원 공보 번호 2003/0032179 (이의 내용은 거명에 의해 전문이 본원에 포함됨)에 기술된 바와 같이 수득할 수 있다. 인간 배아 줄기 세포를 천연 공급원, 예컨대 배아, 주머니배 또는 속세포덩이 (ICM) 세포로부터, 또는 배아 세포의 기존 배양물 또는 수립된 배양물로부터 수득할 수 있다. 인간 배아 줄기 세포를 Thomson 등의 문헌 (미국 특허 번호 5,843,780; [Science 282:1145, 1998]; [Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998]) 및 [Reubinoff et al., 2000, Nature Biotech. 18:399], 또는 미국 출원 공보 번호 2003/0032179 등에 의해 기술된 기술을 사용하여 인간 주머니배 세포로부터 제조할 수 있다. 또한 인간 배아 줄기 세포를 인간 배아의 생식선 융기로부터, 예를 들어, [Reubinoff et al., 2000, Nature, 18:399-404], 또는 미국 특허 번호 6,090,622 (인간 배아 생식 세포), 및 6,562,619에 기술된 바와 같이, 또는 냉동 배아로부터, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,921,632에 기술된 바와 같이, 또는 인간 태반으로부터, 미국 출원 공보 번호 2003/0032179, 2002/0123141, 2003/0032179, 2003/0180269, 2004/0048796에 기술된 바와 같이 수득할 수 있고, 상기 문헌들의 내용은 전문이 본원에 포함된다.
본 발명에서 사용된 줄기 세포는 당업자에게 공지된 임의의 종으로부터의 세포일 수 있다. 이같은 줄기 세포는, 예를 들어, 어류, 조류, 파충류, 또는 포유류 줄기 세포일 수 있다. 임의의 포유류 줄기 세포가 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있고, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그, 개, 고양이, 돼지, 양, 소, 말, 원숭이, 인간 등으로부터의 줄기 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 줄기 세포는 마우스 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 영장류 줄기 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 줄기 세포는 인간 줄기 세포이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 줄기 세포는 인간 배아 세포이다.
본 발명에서 사용된 줄기 세포는 상대적으로 정제되지 않은 형태로, 예컨대 제대혈 또는 태반혈로, 또는 성분채집술에 의해 수득된 말초혈 단핵 세포의 집단으로 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 줄기 세포는 상대적으로 단리될 수 있고, 즉 다른 세포 유형으로부터 실질적으로 단리될 수 있다. 줄기 세포는 단일 유형의 줄기 세포, 또는 다중 유형의 줄기 세포를 함유할 수 있다.
본 발명에서 사용된 줄기 세포를 콜라겐 바이오패브릭을 사용하는 배양 전에 또는 배양 동안에 유전자 조작할 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여, 예를 들어, 미국 출원 공보 번호 2004/0028660 (이의 내용은 전문이 거명에 의해 포함됨)에 기술된 바와 같이, 생체역학적 수단 예컨대 DNA의 리포솜 또는 화학물질 매개 흡수에 의해, 또는 바이러스 벡터 예컨대 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 벡터에 의해, 줄기 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입할 수 있다.
5.2. 태반 줄기 세포
콜라겐 바이오패브릭 상에서 배양가능한 태반 줄기 세포, 예를 들어, CD34- 태반 줄기 세포 (이하 간단하게 "태반 줄기 세포"로 지칭됨)는 조직 배양 기판에 부착하고 비-태반 세포 유형으로 분화하는 능력이 있는, 태반 또는 이의 일부분으로부터 수득가능한 줄기 세포이다. 태반 줄기 세포는 기원이 태아 또는 모체일 수 있다 (즉, 태아 또는 어머니의 유전자형을 가질 수 있다). 태반 줄기 세포의 집단, 또는 태반 줄기 세포를 포함하는 세포의 집단은 기원이 단독으로 태아 또는 모체인 태반 줄기 세포를 포함할 수 있거나, 또는 태아 및 모체 기원 양쪽 모두의 태반 줄기 세포의 혼합 집단을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 태반 줄기 세포는, 예를 들어, 미국 출원 공보 번호 2005/0019908 및 2003/0180269 (이의 개시내용은 전문이 본원에 포함됨)에 기술되어 있다. 태반 줄기 세포, 및 태반 줄기 세포를 포함하는 세포의 집단은 하기 논의된 형태학적 특징, 마커 특징 및 배양 특징에 의해 확인 및 선별될 수 있다.
5.2.1 물리적 및 형태학적 특징
태반 줄기 세포는, 1차 배양 또는 세포 배양에서 배양될 때, 조직 배양 기판, 예를 들어, 조직 배양 컨테이너 표면 (예를 들어, 조직 배양 플라스틱)에 부착한다. 배양물 내의 태반 줄기 세포는 일반적으로 섬유모세포 모양의 성상 외관을 나타내고, 다수의 세포질 돌기가 중앙 세포 몸체로부터 확장된다. 그러나, 태반 줄기 세포가 섬유모세포보다 더 많은 수의 이같은 돌기를 나타내기 때문에 태반 줄기 세포는 동일한 조건 하에 배양된 섬유모세포로부터 형태학적으로 구별가능하다. 형태학적으로, 태반 줄기 세포는 배양에서 더욱 둥글거나 자갈 형태를 일반적으로 나타내는 조혈 줄기 세포, 및 피더 층 상에서 또는 기판, 예를 들어, MATRIGEL™ 상에서 배양되든지 둥근 형태를 채택하는 배아 줄기 세포 또는 배아 생식 세포로부터 또한 구별가능하다.
전형적으로, 배양에서, 태반 줄기 세포는 배양체(embryoid)-유사체로 칭해지는, 세포들의 클러스터로 발달되고, 이는 배아 줄기 세포의 배양물에서 발달되는 배양체와 공통점이 있다.
5.2.2 세포 표면, 분자성 및 유전학적 마커
태반 줄기 세포는 줄기 세포를 확인 및/또는 단리하는데 사용될 수 있는 복수개의 마커를 발현한다. 태반 줄기 세포는 전체 태반 또는 이의 임의의 일부분 (예를 들어, 양막, 융모막, 태반엽, 제대 등)으로부터의 줄기 세포를 포함한다. 그러나, 태반 줄기 세포는 영양막이 아니다.
태반 줄기 세포는 일반적으로 마커 CD73, CD105, CD200, HLA-G, 및/또는 OCT-4를 발현하고, 일반적으로 CD34, CD38, 또는 CD45를 발현하지 않는다. 태반 줄기 세포는 HLA-ABC (MHC-1) 및 HLA-DR을 또한 발현할 수 있다. 이러한 마커들이 태반 줄기 세포를 확인하고, 태반 줄기 세포를 다른 줄기 세포 유형으로부터 구별하는데 사용될 수 있다. 태반 줄기 세포는 CD73 및 CD105를 발현할 수 있기 때문에, 중간엽 줄기 세포-유사 특징이 있을 수 있다. 그러나, 태반 줄기 세포는 태아-특이적 마커인 CD200 및 HLA-G를 발현할 수 있기 때문에, CD200 또는 HLA-G를 발현하지 않는 중간엽 줄기 세포, 예를 들어, 골수-유래 중간엽 줄기 세포로부터 구별될 수 있다. 동일한 방식으로, CD34, CD38 및/또는 CD45의 발현 결여로 태반 줄기 세포가 조혈 줄기 세포가 아닌 것으로 확인된다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 SSEA3 및/또는 SSEA4에 대해 음성이다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 SSEA3 및/또는 SSEA4에 대해 양성이다.
따라서, 한 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD200+ 또는 HLA-G+이다. 특정 실시양태에서, 줄기 세포는 CD200+ 및 HLA-G+이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD73+ 및 CD105+이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ 및 CD105+이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 CD200+ 또는 HLA-G+ 줄기 세포는 배양체-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단에서 배양체-유사체의 형성을 용이하게 한다.
CD200 또는 HLA-G 태반 세포를 선별함으로써 상기 세포가 태반 줄기 세포인 것에 의해 태반 줄기 세포가 다수의 태반 세포로부터 선별될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 선별은 CD200+ 및 HLA-G+ 양쪽 모두인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD73+ 및 CD105+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 및 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ 및 CD105+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 배양체-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단에서 배양체-유사체의 형성을 또한 용이하게 하는 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD73+, CD105+, 및 CD200+이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 HLA-G+이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 더욱 특정한 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38-, CD45-, 및 HLA-G+이다. 또다른 특정 실시양태에서, 단리된 CD73+, CD105+, 및 CD200+ 줄기 세포는 배양체-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단이 배양되는 경우 이러한 집단에서 하나 이상의 배양체-유사체의 형성을 용이하게 한다.
CD73+, CD105+, 및 CD200+ 태반 세포를 선별함으로써 상기 세포가 태반 줄기 세포인 것에 의해 태반 줄기 세포가 다수의 태반 세포로부터 또한 선별될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 HLA-G+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 및 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38-, CD45-, 및 HLA-G+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 배양체-유사체의 형성을 용이하게 하는 조건 하에 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단이 배양되는 경우 이러한 집단에서 하나 이상의 배양체-유사체의 형성을 용이하게 하는 CD73+, CD105+, 및 CD200+ 줄기 세포를 선별하는 것을 추가로 포함한다.
또다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD200+ 및 OCT-4+이다. 특정 실시양태에서, 줄기 세포는 CD73+ 및 CD105+이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 HLA-G+이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 더욱 특정한 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ 및 HLA-G+이다. 또다른 특정 실시양태에서, 줄기 세포는 배양체-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단이 배양되는 경우 이러한 집단에 의한 하나 이상의 배양체-유사체의 생산을 용이하게 한다.
CD200+ 및 OCT-4+ 태반 세포를 선별함으로써 상기 세포가 태반 줄기 세포인 것에 의해 태반 줄기 세포가 다수의 태반 세포로부터 또한 선별될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 HLA-G+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 및 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ 및 HLA-G+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 배양체-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단이 배양되는 경우 이러한 집단에 의한 하나 이상의 배양체-유사체의 생산을 또한 용이하게 하는 태반 줄기 세포를 선별하는 것을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD73+, CD105+ 및 HLA-G+이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 OCT-4+이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD200+이다. 더욱 특정한 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ 및 CD200+이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 배양체-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단이 배양되는 경우 이러한 집단에서 배양체-유사체의 형성을 용이하게 한다.
CD73+, CD105+ 및 HLA-G+ 태반 세포를 선별함으로써 상기 세포가 태반 줄기 세포인 것에 의해 태반 줄기 세포가 다수의 태반 세포로부터 또한 선별될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 및 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 OCT-4+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD200+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ 및 CD200+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 배양체-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단이 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배양체-유사체의 형성을 또한 용이하게 하는 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD73+ 및 CD105+이고, 배양체-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 줄기 세포를 포함하는 단리된 태반 세포의 집단이 배양되는 경우 상기 집단에서의 하나 이상의 배양체-유사체의 형성을 용이하게 한다. 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 OCT4+이다. 더욱 특정한 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 OCT4+, CD34-, CD38- 및 CD45-이다.
배양체-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 줄기 세포를 포함하는 단리된 태반 세포의 집단이 배양되는 경우 상기 집단에서의 하나 이상의 배양체-유사체의 형성을 용이하게 하는 CD73+ 및 CD105+ 태반 세포를 선별함으로써 상기 세포가 태반 줄기 세포인 것에 의해 태반 줄기 세포가 다수의 태반 세포로부터 또한 선별될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 및 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 OCT-4+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD200+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ 및 CD200+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 OCT-4+이고, 배양체-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 줄기 세포를 포함하는 단리된 태반 세포의 집단에서의 하나 이상의 배양체-유사체의 형성을 용이하게 한다. 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD73+ 및 CD105+이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38-, 또는 CD45-이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD200+이다. 더욱 특정한 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38-, 및 CD45-이다.
예를 들어, 배양체-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 줄기 세포를 포함하는 단리된 태반 세포의 집단이 배양되는 경우 상기 집단에서의 하나 이상의 배양체-유사체의 형성을 용이하게 하는 OCT-4+ 태반 세포를 선별함으로써 상기 세포가 태반 줄기 세포인 것에 의해 태반 줄기 세포가 다수의 태반 세포로부터 또한 선별될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 및 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD200+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD200+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38-, 및 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭 상에서 배양가능한 또는 분화가능한 태반 줄기 세포는 CD10+, CD34-, CD105+, 및 CD200+이다. 태반 줄기 세포의 단리된 집단은, 예를 들어, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상 또는 약 99％ 이상의 상기 태반 줄기 세포를 포함할 수 있다. 상기 실시양태들의 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 추가적으로 CD90+ 및 CD45-이다. 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포의 집단은 줄기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포의 집단은 이러한 특징들을 디스플레이하지 않는 태반 줄기 세포로부터 단리된다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 단리된 태반 줄기 세포는 기원이 비-모체이다. 또다른 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 상기 단리된 집단 내의 상기 세포의 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 약 99％ 이상은 기원이 비-모체이다.
또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭 상에서 배양가능한 또는 분화가능한 태반 줄기 세포는 HLA-A,B,C-, CD45-, CD133- 및 CD34-이다. 태반 줄기 세포의 단리된 집단은, 예를 들어, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상 또는 약 99％ 이상의 HLA-A,B,C-, CD45-, CD133- 및 CD34-인 태반 줄기 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포의 집단은 줄기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또다른 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 상기 집단은 이러한 특징들을 디스플레이하지 않는 태반 줄기 세포로부터 단리된다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 단리된 태반 줄기 세포는 기원이 비-모체이다. 또다른 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 상기 단리된 집단 내의 상기 세포의 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 약 99％ 이상은 기원이 비-모체이다. 또다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 태반 관류액으로부터 단리된다.
또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭 상에서 배양가능한 또는 분화가능한 태반 줄기 세포는 CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- 및 CD133-이다. 태반 줄기 세포의 단리된 집단은, 예를 들어, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상 또는 약 99％ 이상의 CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- 및 CD133-인 태반 줄기 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포의 집단은 줄기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 단리된 태반 줄기 세포는 기원이 비-모체이다. 또다른 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 상기 단리된 집단 내의 상기 세포의 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 약 99％ 이상은 기원이 비-모체이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포의 집단은 이러한 특징들을 디스플레이하지 않는 태반 줄기 세포로부터 단리된다. 또다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 태반 관류액으로부터 단리된다.
또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭 상에서 배양가능한 또는 분화가능한 태반 줄기 세포는 CD10-, CD33-, CD44+, CD45-, 및 CD117-이다. 태반 줄기 세포의 단리된 집단은, 예를 들어, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상 또는 약 99％ 이상의 CD10-, CD33-, CD44+, CD45-, 및 CD117-인 태반 줄기 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포의 집단은 줄기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 단리된 태반 줄기 세포는 기원이 비-모체이다. 또다른 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 상기 단리된 집단 내의 상기 세포의 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 약 99％ 이상은 기원이 비-모체이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포의 집단은 이러한 특징들을 디스플레이하지 않는 태반 줄기 세포로부터 단리된다. 또다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 태반 관류액으로부터 단리된다.
또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭 상에서 배양가능한 또는 분화가능한 태반 줄기 세포는 CD10-, CD13-, CD33-, CD45-, 및 CD117-이다. 태반 줄기 세포의 단리된 집단은, 예를 들어, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상 또는 약 99％ 이상의 CD10-, CD13-, CD33-, CD45-, 및 CD117-인 태반 줄기 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포의 집단은 줄기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 단리된 태반 줄기 세포는 기원이 비-모체이다. 또다른 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 상기 단리된 집단 내의 상기 세포의 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 약 99％ 이상은 기원이 비-모체이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포의 집단은 이러한 특징들을 디스플레이하지 않는 태반 줄기 세포로부터 단리된다. 또다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 태반 관류액으로부터 단리된다.
또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭 상에서 배양가능한 또는 분화가능한 태반 줄기 세포는 HLA A,B,C-, CD45-, CD34-, CD133-이고/이거나, CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 및/또는 HLA-G에 대해 양성이고/이거나, CD117에 대해 음성이다. 또다른 실시양태에서, 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포의 단리된 집단은 HLA A,B,C-, CD45-, CD34-, CD133-인 줄기 세포를 포함하고, 집단 내의 줄기 세포의 약 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 약 99％ 이상이 CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 및/또는 HLA-G에 대해 양성이고/이거나 CD117에 대해 음성이다. 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포의 집단은 줄기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 단리된 태반 줄기 세포는 기원이 비-모체이다. 또다른 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 상기 단리된 집단 내의 상기 세포의 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 약 99％ 이상은 기원이 비-모체이다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포의 집단은 이러한 특징들을 디스플레이하지 않는 태반 줄기 세포로부터 단리된다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 HLA A,B,C-, CD45-, CD34-, CD133-이고, CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 및/또는 HLA-G에 대해 양성이고/이거나, CD117에 대해 음성인 태반 줄기 세포를 태반 관류액으로부터 단리하는 것을 포함하는, HLA A,B,C-, CD45-, CD34-, CD133-이고, CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 및/또는 HLA-G에 대해 양성이고/이거나, CD117에 대해 음성인 태반 줄기 세포를 수득하는 방법을 제공한다
또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭 상에서 배양가능한 또는 분화가능한 태반 줄기 세포는 항체 결합에 의해 결정된 바와 같이 CD200+ 및 CD10+이고, 항체 결합 및 RT-PCR 모두에 의해 결정된 바와 같이 CD117-이다. 또다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD10+, CD29-, CD54+, CD200+, HLA-G+, HLA 클래스 I- 및 β-2-마이크로글로불린-이다. 또다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포(들)은 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 골수-유래 중간엽 줄기 세포)에 대한 것보다 2배 이상 더 높은 하나 이상의 마커의 발현을 디스플레이한다. 또다른 특정 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포는 기원이 비-모체이다. 또다른 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 단리된 집단 내의 세포의 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 약 99％ 이상은 기원이 비-모체이다.
또다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포의 단리된 집단은 알데히드 탈수소효소 활성 분석법에 의해 평가했을 때 알데히드 탈수소효소 (ALDH)에 대해 양성인 태반 줄기 세포를 포함한다. 이같은 분석법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, [Bostian and Berts, Biochem. J., 173, 787, (1978)] 참조). 특정 실시양태에서, 상기 ALDH 분석법은 ALDEFLUOR® (Aldagen, Inc., Ashland, Oregon)를 알데히드 탈수소효소 활성의 마커로 사용한다. 특정 실시양태에서, 상기 다수는 상기 세포 집단 내의 세포의 약 3％ 내지 약 25％이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 ALDEFLUOR®를 알데히드 탈수소효소 활성의 지표로 사용하는 알데히드 탈수소효소 활성 분석법에 의해 평가했을 때 다수의 제대 줄기 세포가 알데히드 탈수소효소에 대해 양성인, 제대 줄기 세포의 집단을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 다수는 상기 세포 집단 내의 세포의 약 3％ 내지 약 25％이다. 또다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포 또는 제대 줄기 세포의 상기 집단은 세포수가 동일하고 동일한 조건 하에 배양된 골수-유래 중간엽 줄기 세포의 집단보다 3배 이상, 또는 5배 이상 더 높은 ALDH 활성을 나타낸다.
임의의 상기 태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포의 집단의 다양한 실시양태에서, 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포의 집단이 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 12회, 14회, 16회, 18회, 또는 20회, 또는 이를 초과하여 계대되었거나, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 12회, 14회, 16회, 18회, 20회, 22회, 24회, 26회, 28회, 30회, 32회, 34회, 36회, 38회 또는 40회 또는 이를 초과하는 개체수 배가로 확장되었다.
또다른 실시양태에서, 상기 기술된 태반 줄기 세포 또는 줄기 세포들은 ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN 및/또는 ZC3H12A 중 하나 이상인 하나 이상의 유전자를 태반 줄기 세포에 진행된 계대의 수와 동등한 다수의 계대 배양이 진행된 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 검출가능하게 더 높은 수준으로 발현한다. 이러한 유전자들에 상응하는 서열은 Affymetrix GENECHIP®에서 발견된다. 이러한 유전자들을 2006년 12월 현재 GenBank 접속 번호 NM_001615 (ACTG2), BC065545 (ADARB1), (NM_181847 (AMIGO2), AY358590 (ARTS-1), BC074884 (B4GALT6), BC008396 (BCHE), BC020196 (C11orf9), BC031103 (CD200), NM_001845 (COL4A1), NM_001846 (COL4A2), BC052289 (CPA4), BC094758 (DMD), AF293359 (DSC3), NM_001943 (DSG2), AF338241 (ELOVL2), AY336105 (F2RL1), NM_018215 (FLJ10781), AY416799 (GATA6), BC075798 (GPR126), NM_016235 (GPRC5B), AF340038 (ICAM1), BC000844 (IER3), BC066339 (IGFBP7), BC013142 (IL1A), BT019749 (IL6), BC007461 (IL18), (BC072017) KRT18, BC075839 (KRT8), BC060825 (LIPG), BC065240 (LRAP), BC010444 (MATN2), BC011908 (MEST), BC068455 (NFE2L3), NM_014840 (NUAK1), AB006755 (PCDH7), NM_014476 (PDLIM3), BC126199 (PKP-2), BC090862 (RTN1), BC002538 (SERPINB9), BC023312 (ST3GAL6), BC001201 (ST6GALNAC5), BC126160 또는 BC065328 (SLC12A8), BC025697 (TCF21), BC096235 (TGFB2), BC005046 (VTN), 및 BC005001 (ZC3H12A)에서 또한 발견할 수 있다.
더욱 특정한 실시양태에서, 태반 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포들은 ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN 및 ZC3H12A를 골수-유래 중간엽 줄기 세포보다 검출가능하게 더 높은 수준으로 발현한다.
일반적으로, 태반 줄기 세포는 생리학적으로 허용가능한 용액, 예를 들어, 줄기 세포 수집 조성물을 사용하여 포유류 태반으로부터 수득된다. 줄기 세포 수집 조성물은 발명의 영문 명칭이 "Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs"인 관련된 미국 특허 출원 번호 11/648,812 (2006년 12월 28일 출원)에 상세하게 기술되어 있다.
태반 줄기 세포 수집 조성물은 줄기 세포의 수집 및/또는 배양에 적절한 임의의 생리학적으로 허용가능한 용액, 예를 들어, 염수 용액 (예를 들어, 포스페이트-완충 염수, 크렙(Kreb) 용액, 변형 크렙 용액, 이글(Eagle) 용액, 0.9％ NaCl 등), 배양 배지 (예를 들어, DMEM, H.DMEM 등) 등을 포함할 수 있다.
태반 줄기 세포 수집 조성물은 태반 줄기 세포를 보존하는 경향이 있는, 즉, 태반 줄기 세포의 사망을 방지하는 것, 또는 수집 시간에서 배양 시간까지 태반 줄기 세포의 사망을 지연시키는 것, 사망하는 세포 집단 내의 태반 줄기 세포의 수를 감소시키는 것 등의 경향이 있는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 이같은 성분은, 예를 들어, 세포자멸사 억제제 (예를 들어, 카스파제 억제제 또는 JNK 억제제); 혈관확장제 (예를 들어, 황산마그네슘, 항-고혈압 약물, 심방 나트륨이뇨 펩티드 (ANP), 아드레노코르티코트로핀, 코르티코트로핀-방출 호르몬, 소듐 니트로프러시드, 히드랄라진, 아데노신 트리포스페이트, 아데노신, 인도메타신 또는 황산마그네슘, 포스포디에스테라제 억제제 등); 괴사 억제제 (예를 들어, 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노-말레이미드, 피롤리딘 디티오카르바메이트, 또는 클로나제팜); TNF-α 억제제; 및/또는 산소-운반 퍼플루오로카본 (예를 들어, 퍼플루오로옥틸 브로마이드, 퍼플루오로데실 브로마이드 등)일 수 있다.
태반 줄기 세포 수집 조성물은 하나 이상의 조직-분해 효소, 예를 들어, 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 중성 프로테아제, RNA분해효소(RNase), 또는 DNA분해효소(DNase) 등을 포함할 수 있다. 이같은 효소에는 콜라게나제 (예를 들어, 콜라게나제 I, II, III 또는 IV, 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)으로부터의 콜라게나제 등); 디스파제, 써모라이신, 엘라스타제, 트립신, 리베라제(LIBERASE), 히알루로니다제 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
태반 줄기 세포 수집 조성물은 살균 유효량 또는 정균 유효량의 항생제를 포함할 수 있다. 비-제한적인 특정 실시양태에서, 항생제는 마크롤리드 (예를 들어, 토브라마이신), 세팔로스포린 (예를 들어, 세팔렉신, 세프라딘, 세푸록심, 세프프로질, 세파클로르, 세픽심 또는 세파드록실), 클라리트로마이신, 에리트로마이신, 페니실린 (예를 들어, 페니실린 V) 또는 퀴놀론 (예를 들어, 오플록사신, 시프로플록사신 또는 노르플록사신), 테트라사이클린, 스트렙토마이신 등이다. 특정 실시양태에서, 항생제는 그람(+) 및/또는 그람(-) 박테리아, 예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus) 등에 대해 활성이다.
태반 줄기 세포 수집 조성물은 하나 이상의 하기 화합물을 또한 포함할 수 있다: 아데노신 (약 1 mM 내지 약 50 mM); D-글루코스 (약 20 mM 내지 약 100 mM); 마그네슘 이온 (약 1 mM 내지 약 50 mM); 분자량이 20,000 달톤을 초과하는 거대분자 (한 실시양태에서, 내피 온전성 및 세포 생육력을 유지하는데 충분한 양으로 존재) (예를 들어, 합성 또는 천연 발생 콜로이드, 다당류 예컨대 덱스트란 또는 폴리에틸렌 글리콜 (약 25 g/ℓ 내지 약 100 g/ℓ, 또는 약 40 g/ℓ 내지 약 60 g/ℓ으로 존재)); 항산화제 (예를 들어, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 글루타티온, 비타민 C 또는 비타민 E (약 25 μM 내지 약 100 μM로 존재)); 환원제 (예를 들어, N-아세틸시스테인 (약 0.1 mM 내지 약 5 mM로 존재)); 세포 내로의 칼슘 도입을 방지하는 작용제 (예를 들어, 베라파밀 (약 2 μM 내지 약 25 μM로 존재)); 니트로글리세린 (예를 들어, 약 0.05 g/ℓ 내지 약 0.2 g/ℓ); 항응고제 (한 실시양태에서, 잔류 혈액의 응고를 방지하는데 충분한 양으로 존재) (예를 들어, 헤파린 또는 히루딘 (약 1000 유닛/ℓ 내지 약 100,000 유닛/ℓ의 농도로 존재)); 또는 아밀로리드 함유 화합물 (예를 들어, 아밀로리드, 에틸 이소프로필 아밀로리드, 헥사메틸렌 아밀로리드, 디메틸 아밀로리드 또는 이소부틸 아밀로리드 (약 1.0 μM 내지 약 5 μM)).
5.2.2 태반의 수집 및 취급
일반적으로, 인간 태반은 출산 후 이의 만출 직후에 회수된다. 한 실시양태에서, 태반은 환자로부터 사전 동의 후에, 그리고 이 환자의 완전한 병력을 취하여 태반과 관련시킨 후에 회수된다. 바람직하게는, 병력이 분만 이후에 계속된다. 이같은 병력은 태반 또는 이로부터 수득된 줄기 세포의 후속 이용을 조정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 태반 줄기 세포는, 병력에 비추어서, 태반에 관련된 영아 또는 영아의 부모, 형제자매 또는 기타 친척의 개인화된 의약에 사용될 수 있다.
태반 줄기 세포의 회수 전에, 제대혈 및 태반 혈액이 제거된다. 특정 실시양태에서, 분만 후, 태반 내의 제대혈이 제거된다. 태반에 통상적인 제대혈 회수 공정이 적용될 수 있다. 전형적으로, 바늘 또는 캐뉼러(cannula)가, 중력의 보조와 함께, 태반을 방혈시키는데 사용된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,372,581 (Anderson), 미국 특허 번호 5,415,665 (Hessel 등) 참조). 바늘 또는 캐뉼러는 일반적으로 제대 정맥에 놓이고, 태반으로부터 제대혈이 배수되는 것을 돕도록 태반이 부드럽게 마사지될 수 있다. 이같은 제대혈 회수는 상업적으로, 예를 들어 LifeBank Inc., Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry 및 Cryocell에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 제대혈 회수 동안의 조직 파괴를 최소화하도록 태반이 추가적인 조작 없이 중력에 의해 배수된다.
전형적으로, 제대혈의 회수 및 줄기 세포의 수집을 위해 (예를 들어, 관류 또는 조직 해리에 의해), 태반은 분만실 또는 출산실에서 또다른 장소, 예를 들어 실험실로 수송된다. 바람직하게는 태반은 무균성의 단열 수송 장치 (태반의 온도를 20℃ 내지 28℃ 사이에서 유지시킴)에서 수송되고, 예를 들어, 태반을 집게로 집은 근위부 제대와 함께 무균성 집-락(zip-lock) 플라스틱 백에 놓은 후, 이를 단열 컨테이너에 놓는다. 또다른 실시양태에서, 실질적으로 계류 중인 미국 특허 출원 공보 번호 2006/0060494에 기술된 바와 같이 제대혈 수집 키트 내에서 수송된다. 바람직하게는, 태반은 분만 후 4시간 내지 24시간 내에 실험실로 수송된다. 특정 실시양태에서, 근위부 제대가, 바람직하게는 태반 원반 내로의 삽입의 4-5 ㎝ 이내에서, 제대혈 회수 전에 집게로 집어진다. 또다른 실시양태에서, 근위부 제대는 제대혈 회수 후에, 그러나 태반의 추가적인 프로세싱 전에 집게로 집어진다.
태반은, 줄기 세포 수집 전에, 무균성 조건 하에 실온 또는 5 내지 25℃ (섭씨)의 온도에서 보관될 수 있다. 태반은 임의의 잔류 제대혈을 제거하기 위해 태반을 관류하기 전에 48시간을 초과하는 기간, 바람직하게는 4시간 내지 24시간의 기간 동안 보관될 수 있다. 바람직하게는 태반은 5 내지 25℃ (섭씨)의 온도에서 항응고제 용액 내에서 보관된다. 적절한 항응고제 용액은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 헤파린 또는 와파린 소듐(warfarin sodium)이 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항응고제 용액은 헤파린 용액 (예를 들어, 1:1000 용액 내의 1％ w/w)을 포함한다. 바람직하게는, 방혈된 태반이 36시간 이하 동안 보관된 후, 태반 줄기 세포가 수집된다.
일단 일반적으로 상기와 같이 수집 및 제조되면, 포유류 태반 또는 이의 일부분을 임의의 당업계에 공지된 방식으로 처리할 수 있고, 예를 들어, 관류 또는 파괴할 수 있고, 예를 들어, 1가지 이상의 조직-파괴 효소로 소화시켜, 줄기 세포를 수득할 수 있다.
5.2.4 태반 조직의 물리적 파괴 및 효소성 소화
한 실시양태에서, 줄기 세포가 포유류 태반으로부터 기관의 물리적 파괴, 예를 들어, 효소성 소화에 의해 수집된다. 예를 들어, 본 발명의 줄기 세포 수집 조성물과 접촉시키면서, 태반, 또는 이의 일부분을 예를 들어 압착하거나, 전단시키거나, 다지거나, 주사위꼴로 자르거나, 잘게 자르거나, 침연시킬 수 있고, 이어서 조직을 하나 이상의 효소로 소화시킨다. 또한 태반 또는 이의 일부분을 하나 이상의 효소로 물리적으로 파괴시키고 소화시킨 후, 생성된 물질을 본 발명의 줄기 세포 수집 조성물 내에 함침시키거나 이러한 조성물 내로 혼합할 수 있다. 임의의 물리적 파괴 방법이 사용될 수 있고, 단 파괴 방법은, 예를 들어, 트리판 블루 배제에 의해 결정되는 바와 같이, 상기 기관 내의 세포의 다수, 더욱 바람직하게는 대다수, 더욱 바람직하게는 적어도 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％가 생육성이도록 한다.
물리적 파괴 및/또는 효소성 소화 및 줄기 세포 회수 전에 태반이 구성요소들로 해부될 수 있다. 예를 들어, 태반 줄기 세포가 양막, 융모막, 제대, 태반엽, 또는 이들의 임의의 조합물로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 태반 줄기 세포는 양막 및 융모막을 포함하는 태반 조직으로부터 수득된다. 전형적으로, 태반 줄기 세포는 태반 조직의 소형 덩어리, 예를 들어 부피가 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 약 1000 ㎣인 태반 조직의 덩어리의 파괴에 의해 수득될 수 있다.
바람직한 줄기 세포 수집 조성물은 1가지 이상의 조직 파괴성 효소(들)를 포함한다. 바람직하게는 효소성 소화는 효소들의 조합물, 예를 들어 매트릭스 메탈로프로테아제 및 중성 프로테아제의 조합물, 예를 들어, 콜라게나제 및 디스파제의 조합물을 사용한다. 한 실시양태에서, 태반 조직의 효소성 소화는 매트릭스 메탈로프로테아제, 중성 프로테아제 및 히알루론산의 소화를 위한 점액용해 효소의 조합물, 예컨대 콜라게나제, 디스파제 및 히알루로니다제의 조합물, 또는 리베라제(LIBERASE) (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.) 및 히알루로니다제의 조합물을 사용한다. 태반 조직을 파괴하는데 사용될 수 있는 기타 효소에는 파파인, 데옥시리보뉴클레아제, 세린 프로테아제, 예컨대 트립신, 키모트립신, 또는 엘라스타제가 포함된다. 세린 프로테아제는 혈청 내의 알파 2 마이크로글로불린에 의해 억제될 수 있고, 따라서 소화에 사용된 배지는 일반적으로 혈청이 없다. EDTA 및 DNA분해효소가 효소 소화 절차에서 통상적으로 사용되어 세포 회수 효율을 증가시킨다. 점성 소화물 내에 줄기 세포가 포획되는 것을 방지하도록 바람직하게는 소화물이 희석된다.
조직 소화 효소의 임의의 조합물이 사용될 수 있다. 조직 소화 효소에 대한 전형적인 농도에는, 예를 들어, 콜라게나제 I 및 콜라게나제 IV에 대한 50-200 유닛/㎖, 디스파제에 대한 10 유닛/㎖, 엘라스타제에 대한 10-100 유닛/㎖가 포함된다. 프로테아제는 조합되어, 즉 2가지 이상의 프로테아제가 동일한 소화 반응에서 사용될 수 있거나, 또는 태반 줄기 세포를 유리시키기 위해 순차적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 태반 또는 이의 일부분이 먼저 2 ㎎/㎖의 적절한 양의 콜라게나제 I로 30분 동안 소화된 후, 0.25％의 트립신으로 10분 동안 37℃에서 소화된다. 바람직하게는 세린 프로테아제는 다른 효소의 사용 후에 이어서 사용된다.
또다른 실시양태에서, 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포 수집 조성물, 또는 줄기 세포 수집 조성물로의 줄기 세포의 단리 전의 조직이 파괴 및/또는 소화된 용액에 킬레이트제, 예를 들어, 에틸렌 글리콜 비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 첨가함으로써 조직이 추가로 파괴될 수 있다.
전체 태반, 또는 태아 및 모체 세포 모두를 포함하는 태반의 일부분의 경우 (예를 들어, 태반의 일부분이 융모막 또는 태반엽을 함유하는 경우), 수집된 태반 줄기 세포는 태아 및 모체 양쪽에서 유래된 태반 줄기 세포의 혼합물을 포함할 것으로 이해될 것이다. 모체 세포를 포함하지 않거나 무시할 수 있는 갯수의 모체 세포를 포함하는 태반의 일부분 (예를 들어, 양막)의 경우, 수집된 태반 줄기 세포는 거의 배타적으로 태아 태반 줄기 세포를 포함할 것이다.
5.2.5. 태반 관류
포유류 태반의 관류에 의해 태반 줄기 세포가 또한 수득될 수 있다. 포유류 태반을 관류하여 줄기 세포를 수득하는 방법이, 예를 들어, 미국 출원 공보 번호 2002/0123141 (Hariri), 및 발명의 영문 명칭이 "Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs"인 관련된 미국 가출원 번호 60/754,969 (2005년 12월 29일 출원)에 개시되어 있다.
관류 용액으로 줄기 세포 수집 조성물을 예를 들어 사용하여, 예를 들어, 태반 혈관을 통과하는 관류에 의해, 태반 줄기 세포가 수집될 수 있다. 한 실시양태에서, 배꼽 동맥과 배꼽 정맥 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 관류 용액을 통과시킴으로써 포유류 태반이 관류된다. 태반을 통과하는 관류 용액의 흐름은 태반 내로의 중력 흐름을 예를 들어 사용하여 달성될 수 있다. 바람직하게는, 펌프, 예를 들어, 연동(peristaltic) 펌프를 사용하여 태반을 통과하도록 관류 용액을 밀어 넣는다. 예를 들어, 배꼽 정맥에 무균성 연결 기구, 예컨대 무균성 튜빙(tubing)에 연결된캐뉼러, 예를 들어, 테플론(TEFLON)® 또는 플라스틱 캐뉼러가 꽂힐 수 있다. 무균성 연결 기구는 관류 매니폴드(manifold)에 연결된다.
관류에 대비하여, 바람직하게는 태반은 배꼽 동맥 및 배꼽 정맥이 태반의 최고점에 위치하는 방식으로 놓인다 (예를 들어, 매달린다). 태반 혈류계에 또는 태반 혈관계 및 주변 조직에 관류 유체, 예를 들어 본 발명의 줄기 세포 수집 조성물을 통과시킴으로써 태반이 관류될 수 있다. 한 실시양태에서, 배꼽 동맥 및 배꼽 정맥이 동시에 가요성 연결부를 통해 관류 용액의 저장소에 연결된 피펫에 연결된다. 관류 용액이 배꼽 정맥 및 동맥 내로 통과된다. 관류 용액이 태반의 주변 조직 내로 혈관의 벽으로부터 삼출되고/되거나 이러한 벽을 통과하고, 임신 동안 어머니의 자궁에 부착된 태반의 표면으로부터의 적절한 개방형 용기에 수집된다. 또한 관류 용액이 제대 개구부를 통해 도입되어, 모체의 자궁 벽과 계면한 태반의 벽 내의 개구부에서 흘러 나오거나 스며나오게 될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 관류 용액은 배꼽 정맥을 통과하여 배꼽 동맥으로부터 수집되거나, 또는 배꼽 동맥을 통과하여 배꼽 정맥으로부터 수집된다.
한 실시양태에서, 근위부 제대를 관류 동안 집게로 집고, 더욱 바람직하게는 태반 원반 내로의 제대의 삽입의 4-5 ㎝ 이내에서 집게로 집는다.
방혈 과정 동안 포유류 태반으로부터의 관류 유체의 1차 수집물은 일반적으로 제대혈 및/또는 태반 혈액의 잔류 적혈구의 색을 띤다. 관류가 진행되고 잔류 제대혈 세포가 태반으로부터 세정됨에 따라 관류 유체는 더욱 무색이게 된다. 일반적으로, 30 내지 100 ㎖의 관류 유체가 초기에 태반을 방혈시키는데 적절하지만, 관찰된 결과에 따라 더 많거나 더 적은 관류 유체가 사용될 수 있다.
태반 줄기 세포를 수집하는데 사용된 관류 액체의 양은 수집되는 줄기 세포의 수, 태반의 크기, 단일 태반에서 이루어질 수집 횟수 등에 따라 변할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 관류 액체의 양은 50 ㎖ 내지 5000 ㎖, 50 ㎖ 내지 4000 ㎖, 50 ㎖ 내지 3000 ㎖, 100 ㎖ 내지 2000 ㎖, 250 ㎖ 내지 2000 ㎖, 500 ㎖ 내지 2000 ㎖, 또는 750 ㎖ 내지 2000 ㎖일 수 있다. 전형적으로, 태반은 방혈 후 700-800 ㎖의 관류 액체로 관류된다.
태반을 수 시간 또는 수 일에 걸쳐 여러번 관류할 수 있다. 여러 번 관류되는 경우, 태반이 컨테이너 또는 기타 적절한 용기에서 무균 조건 하에 유지 또는 배양될 수 있고, 항응고제 (예를 들어, 헤파린, 와파린 소듐, 쿠마린, 비스히드록시쿠마린)이 있거나 없고, 또한 항균제 (예를 들어, β-메르캅토에탄올 (0.1 mM); 항생제 예컨대 스트렙토마이신 (예를 들어, 40-100 ㎍/㎖), 페니실린 (예를 들어, 40 U/㎖), 암포테리신 B (예를 들어, 0.5 ㎍/㎖))이 있거나 없는 표준 관류 용액 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수 ("PBS")와 같은 생리식염수) 또는 줄기 세포 수집 조성물로 관류될 수 있다. 한 실시양태에서, 관류 및 관류물의 수집 전에 태반이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간, 또는 2일 또는 3일 또는 그 이상 동안 유지 또는 배양되도록, 단리된 태반이 관류물을 수집하지 않으면서 일정 기간 동안 유지 또는 배양된다. 관류된 태반은 1회 이상의 추가적인 시간(들) 동안, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간, 또는 그 이상 동안 유지된 후, 예를 들어 700-800 ㎖의 관류 유체로 2번째로 관류될 수 있다. 태반은 1, 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상으로 관류될 수 있고, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간마다 관류될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 태반의 관류 및 관류 용액, 예를 들어, 줄기 세포 수집 조성물의 수집은 회수된 유핵 세포 수가 100개의 세포/㎖ 미만으로 떨어질 때까지 반복된다. 상이한 시점의 관류액들을 개별적으로 추가적으로 프로세싱하여, 세포, 예를 들어, 줄기 세포의 시간-의존적 집단을 회수할 수 있다. 상이한 시점으로부터의 관류액들을 또한 풀링(pooling)할 수 있다.
임의의 이론에 구속되기를 원치 않으면서, 태반의 방혈 및 충분한 시간의 관류 후, 태반 줄기 세포는 태반의 방혈 및 관류된 미세순환 내로 이동하는 것으로 여겨지고, 여기서 본 발명의 방법에 따라, 바람직하게는 관류에 의해 수집 용기 내로 세정함으로써, 태반 줄기 세포가 수집된다. 단리된 태반의 관류는 잔류 제대혈을 제거하는 것뿐만 아니라, 태반에 산소가 포함되는 적절한 영양소를 제공하는 작용을 한다. 바람직하게는, 항응고제를 첨가하지 않으면서, 잔류 제대혈 세포를 제거하는데 사용된 유사한 용액으로 태반을 배양 및 관류할 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 관류로 상기 용액으로 관류되지 않았고, 줄기 세포를 수득하도록 다른 방식 (예를 들어, 조직 파괴, 예를 들어 효소성 소화)으로 처리되지도 않은 포유류 태반으로부터 수득가능한 수보다 유의하게 더 많은 태반 줄기 세포가 수집된다. 이러한 상황에서, "유의하게 더 많은"은 10％ 이상 더 많은 것을 의미한다. 본 발명의 방법에 따른 관류로, 예를 들어, 태반 또는 이의 일부분이 배양된 배양 배지로부터 수득가능한 태반 줄기 세포의 수보다, 유의하게 더 많은 태반 줄기 세포가 산출된다.
하나 이상의 프로테아제 또는 기타 조직 파괴성 효소를 포함하는 용액으로의 관류에 의해 태반으로부터 줄기 세포가 단리될 수 있다. 특정 실시양태에서, 태반 또는 이의 일부분 (예를 들어 양막, 양막 및 융모막, 태반 소엽 또는 태반엽, 제대, 또는 임의의 상기의 것들의 조합)를 25-37℃로 만들고, 하나 이상의 조직 파괴성 효소와 함께 200 ㎖의 배양 배지에서 30 분 동안 인큐베이션한다. 관류액으로부터의 세포를 수집하고, 4℃로 만들고, 5 mM EDTA, 2 mM 디티오트레이톨 및 2 mM 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 저온 억제제 혼합물로 세정한다. 수 분 후 줄기 세포를 저온 (예를 들어 4℃)의 줄기 세포 수집 조성물으로 세정한다.
팬 방법을 사용하는 관류, 즉 관류액이 모체 측면으로부터 산출된 후 수집되는 관류로 태아 및 모체 세포의 혼합물이 생성된다는 것이 이해될 것이다. 그 결과, 이러한 방법에 의해 수집된 세포는 태아 및 모체 기원 양쪽 모두의 태반 줄기 세포의 혼합 집단을 포함한다. 반면에, 관류 유체가 1개 또는 2개의 태반 혈관을 통과하여 나머지 혈관(들)을 통과하여 단독으로 수집되는, 태반 혈관계만을 통한 관류로는 거의 배타적으로 태아 기원의 태반 줄기 세포의 집단이 수집된다.
5.2.6 태반 줄기 세포의 단리, 분류 및 특성화
관류에 의해 수득되었든지 또는 효소성 소화에 의해 수득되었는지, 먼저 포유류 태반으로부터의 줄기 세포를 피콜(Ficoll) 농도구배 원심분리에 의해 다른 세포로부터 정제할 수 있다. 이같은 원심분리는 원심분리 속도 등에 대해 임의의 표준 프로토콜을 따를 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 태반으로부터 수집된 세포가 실온에서 15분 동안의 5000×g의 원심분리에 의해 관류액으로부터 회수되고, 이는 세포를 예를 들어 잔해물 및 혈소판으로부터 분리한다. 또다른 실시양태에서, 태반 관류액을 약 200 ㎖로 농축하고, 부드럽게 피콜 상에 층상화하고, 22℃에서 20분 동안 약 1100×g로 원심분리하여, 세포의 저밀도 계면층을 추가적인 프로세싱을 위해 수집한다.
세포 펠렛이 신선한 줄기 세포 수집 조성물, 또는 줄기 세포 유지에 적절한 배지, 예를 들어, 2 U/㎖ 헤파린 및 2 mM EDTA (GibcoBRL, NY)를 함유하는 IMDM 무혈청 배지에 재현탁될 수 있다. 예를 들어, 제조업자의 권장 절차에 따라 LYMPHOPREP™ (Nycomed Pharma, Oslo, Norway)를 사용하여, 전체 단핵 세포 분획을 단리할 수 있다.
본원에서 사용된, 태반 줄기 세포의 "단리"는 미처리 포유류 태반에서 정상적으로 줄기 세포와 회합되는 세포의 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상을 제거하는 것을 의미한다. 한 기관으로부터의 줄기 세포는, 미처리 기관에서 줄기 세포가 정상적으로 회합되는 세포의 50％ 미만을 포함하는 세포의 집단 내에 존재하는 경우, "단리"된 것이다.
관류 또는 소화에 의해 수득된 태반 세포는, 예를 들어, 추가로 또는 처음에, 0.2％ EDTA가 있는 0.05％ 트립신 용액 (Sigma, St. Louis MO)을 예를 들어 사용하는 차등 트립신처리에 의해 단리될 수 있다. 전형적으로 태반 줄기 세포는 플라스틱 표면으로부터 약 5분 이내에 탈착되는 반면, 전형적으로 기타 부착성 집단은 20-30분을 초과하는 인큐베이션을 필요로 하기 때문에 차등 트립신처리가 가능하다. 트립신처리 및 트립신 중화 (예를 들어, 트립신 중화 용액 (TNS, Cambrex) 등을 이용)에 이어서, 탈착된 태반 줄기 세포를 수확할 수 있다. 부착성 세포를 단리하는 한 실시양태에서, 예를 들어 약 5-10×106 개의 세포의 분취량을 각각의 여러 T-75 플라스크, 바람직하게는 피브로넥틴이 코팅된 T-75 플라스크에 담는다. 이같은 실시양태에서, 세포를 시판되는 중간엽 줄기 세포 성장 배지 (MSCGM) (Cambrex)와 함께 배양하고, 조직 배양 인큐베이터 (37℃, 5％ CO2) 내에 놓을 수 있다. 10-15일 후, PBS로 세정함으로써 비-부착성 세포가 플라스크로부터 제거된다. 그 후, PBS를 MSCGM으로 대체한다. 바람직하게는 플라스크를 각종 부착성 세포 유형의 존재에 대해, 특히 섬유모세포 모양 세포의 클러스터의 확인 및 확장에 대해 매일 검사한다.
포유류 태반에서 수집된 세포의 수 및 유형을, 예를 들어, 유세포측정, 세포 분류, 면역세포화학 (예를 들어, 조직 특이적 또는 세포 마커 특이적 항체로의 염색), 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 자기 활성화 세포 분류 (MACS)와 같은 표준 세포 검출 기술을 사용하여 형태학 및 세포 표면 마커에서의 변화를 측정하는 것에 의해, 광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하는 세포 형태학의 검사에 의해, 및/또는 당업계에 주지된 기술, 예컨대 PCR 및 유전자 발현 프로파일링(profiling)을 사용하여 유전자 발현에서의 변화를 측정하는 것에 의해, 모니터링할 수 있다. 이러한 기술들은 1가지 이상의 특정 마커에 대해 양성인 세포들을 확인하는데 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, CD34에 대한 항체를 사용하여, 세포가 검출가능한 양의 CD34를 포함하는지 여부를 상기의 기술을 사용하여 결정할 수 있다; 세포가 검출가능한 양의 CD34를 포함하는 경우, 세포는 CD34+이다. 마찬가지로, RT-PCR에 의해 검출가능한 충분한 OCT-4 RNA 또는 성체 세포보다 유의하게 더 많은 OCT-4 RNA를 세포가 생산하는 경우, 세포는 OCT-4+이다. 세포 표면 마커 (예를 들어, CD34와 같은 CD 마커)에 대한 항체, 및 OCT-4와 같은 줄기 세포-특이적 유전자의 서열은 당업계에 주지되어 있다.
태반 세포, 특히 피콜 분리, 차등 부착 또는 이들의 조합에 의해 단리된 세포를 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)를 사용하여 분류할 수 있다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)는 입자의 형광 성질을 기초로 하는, 세포가 포함되는 입자를 분리하기 위한 주지된 방법이다 ([Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165]). 개별적인 입자들 내의 형광 모이어티의 레이저 여기로 작은 전하가 발생하여, 혼합물로부터 양성 입자와 음성 입자가 전자기적으로 분리되도록 한다. 한 실시양태에서, 세포 표면 마커-특이적 항체 또는 리간드가 상이한 형광 표지로 표지된다. 세포가 세포 분류기를 통과하여 프로세싱되어, 사용된 항체에 결합하는 능력을 기초로 세포가 분리되도록 한다. FACS로 분류된 입자들이 96-웰 또는 384-웰 플레이트의 개별적인 웰 내로 직접 침착되어, 분리 및 클로닝을 용이하게 할 수 있다.
한 세포 분류 계획에서, 태반으로부터의 줄기 세포가 마커 CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 및/또는 HLA-G의 발현을 기초로 분류된다. 이는 배양 시의 세포의 부착 성질을 기초로 줄기 세포를 선별하는 절차와 함께 이루어질 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포의 부착성 선별이 마커 발현을 기초로 하는 분류 전 또는 후에 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 먼저 세포가 CD34의 발현을 기초로 분류된다; CD34- 세포는 유지되고, CD200+HLA-G+인 세포를 모든 다른 CD34- 세포로부터 분리한다. 또다른 실시양태에서, 태반으로부터의 세포는 마커 CD200 및/또는 HLA-G의 발현을 기초로 분류된다; 예를 들어, 이러한 마커들 중 하나를 디스플레이하는 세포가 추가적인 사용을 위해 단리된다. CD200 및/또는 HLA-G를 예를 들어 발현하는 세포가, 특정 실시양태에서, CD73 및/또는 CD105, 또는 항체 SH2, SH3 또는 SH4가 인식하는 에피토프의 발현, 또는 CD34, CD38 또는 CD45의 발현 결여를 기초로 추가로 분류될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 태반 세포가 CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 및 CD45의 발현 또는 발현 결여에 의해 분류되고, CD200+, HLA-G+, CD73+, CD105+, CD34-, CD38- 및 CD45-인 태반 세포가 추가적인 사용을 위해 다른 태반 세포들로부터 단리된다.
또다른 실시양태에서, 자기 비드를 사용하여 세포를 분리할 수 있다. 자기 비드 (직경 0.5-100 ㎛)에 결합하는 능력을 기초로 입자를 분류하는 방법인 자기 활성화 세포 분류 (MACS)를 사용하여 세포들을 분류할 수 있다. 특정 세포 표면 분자 또는 합텐(hapten)을 특이적으로 인식하는 항체를 공유 결합으로 부가하는 것을 포함하여, 다양한 유용한 변형이 자기 미세구에 수행될 수 있다. 그후, 비드가 세포와 혼합되어 결합이 허용된다. 그후, 세포를 자기장에 통과시켜, 특정 세포 표면 마커가 있는 세포를 분리해 낸다. 한 실시양태에서, 이어서 이러한 세포들을 단리하고, 추가적인 세포 표면 마커에 대한 항체에 커플링된 자기 비드와 다시 혼합한다. 세포를 자기장에 다시 통과시켜, 양쪽 항체에 결합한 세포를 단리한다. 그후, 이같은 세포를 별도의 접시, 예컨대 클론성 단리를 위한 미량역가 접시 내로 희석할 수 있다.
세포 형태학 및 성장 특성을 기초로 태반 줄기 세포를 또한 특성화 및/또는 분류할 수 있다. 예를 들어, 태반 세포는 배양 시 섬유모세포 모양의 외관을 갖는 것으로 특성화되고/되거나 이러한 외관을 기초로 선별될 수 있다. 또한 태반 줄기 세포는 배양체-유사체를 형성하는 능력이 있는 것으로 특성화되고/되거나 이러한 능력을 기초로 선별될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 섬유모세포 모양의 형상이고, CD73 및 CD105를 발현하며, 배양시 하나 이상의 배양체-유사체를 형성하는 태반 세포가 다른 태반 세포로부터 단리된다. 또다른 실시양태에서, 배양시 하나 이상의 배아유사체를 생산하는 OCT-4+ 태반 세포가 다른 태반 세포로부터 단리된다.
또다른 실시양태에서, 콜로니 형성 단위 분석법에 의해 태반 줄기 세포가 확인 및 특성화될 수 있다. 콜로니 형성 단위 분석법은 MESENCULT™ 배지 (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver British Columbia)와 같이 당업계에 통상적으로 공지되어 있다.
태반 줄기 세포를 생육력, 증식 잠재력 및 수명에 대해 당업계에 공지된 표준 기술, 예컨대 트리판 블루 배제 분석법, 플루오레세인 디아세테이트 흡수 분석법, 요오드화프로피듐 흡수 분석법 (생육력 평가용); 및 티미딘 흡수 분석법, MTT 세포 증식 분석법 (증식 평가용)을 사용하여 평가할 수 있다. 수명은 연장 배양 시 개체수 배가의 최대값을 결정하는 것과 같은 당업계에 주지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
당업계에 공지된 기타 기술, 예를 들어, 원하는 세포의 선택적 성장 (양성 선별), 원치 않는 세포의 선택적 파괴 (음성 선별); 예를 들어 대두 응집소와의 혼합형 집단 내에서의 차별적인 세포 응집성을 기초로 하는 분리; 냉동-해동 절차; 여과; 통상적 및 구역 원심분리; 원심분리성 정화 (카운터-스트리밍(counter-streaming) 원심분리), 단위 중량 분리, 역류(countercurrent) 분배; 전기 영동 등을 사용하여 태반 줄기 세포가 다른 태반 세포로부터 또한 단리될 수 있다.
5.3. 콜라겐 바이오패브릭을 사용한 줄기 세포의 배양
본 발명은 줄기 세포를 배양하는 방법, 특히 배아 줄기 세포 또는 태반 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 이 방법은 줄기 세포를 배양 배지에서 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 줄기 세포는 콜라겐 바이오패브릭에 대해 외인성이고, 즉, 줄기 세포는 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반으로부터의 줄기 세포가 아니다.
일부 실시양태에서, 이 방법은 줄기 세포를 다수의 태반 줄기 세포를 포함하는 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하는 것; 및 상기 줄기 세포를 줄기 세포의 생존에 적합한 조건 하에 배양하는 것을 포함한다.
줄기 세포는 당업자에 따라 일정 기간 동안 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 배양 배지에서 콜라겐 바이오패브릭과 함께 적어도 1시간, 2시간, 5시간, 10시간, 15시간, 20시간 또는 24시간 또는 그 이상 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 적어도 2시간, 5시간, 7시간, 10시간, 14시간, 20시간, 25시간 또는 30시간 또는 그 이상 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 약 2시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 7일, 약 2시간 내지 약 14일, 약 2시간 내지 약 30일, 약 24시간 내지 약 2일, 약 24시간 내지 약 7일, 약 24시간 내지 약 14일, 또는 약 24시간 내지 약 30일 동안 배양된다.
줄기 세포를 당업자에게 주지된 줄기 세포의 성장에 적합한 조건 하에 배양할 수 있다. 줄기 세포를 배양하기 위한 온도는, 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 50℃, 약 35℃ 내지 약 40℃, 약 35℃ 내지 약 50℃, 약 35℃ 내지 약 40℃, 약 35℃ 내지 약 45℃, 또는 약 35℃ 내지 약 50℃일 수 있다. 줄기 세포를 배양하기 위한 온도는, 예를 들어, 약 35℃, 약 36℃, 약 38℃, 약 39℃, 또는 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃일 수 있다. 배양 환경의 CO2 수준은, 예를 들어, 약 3％ CO2 내지 약 20％ CO2, 약 5％ CO2 내지 약 20％ CO2, 약 4％ CO2 내지 약 10％ CO2, 또는 약 5％ CO2일 수 있다.
본 발명의 실행에서 유용한 줄기 세포 배양에 대한 일반적인 기술이, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,387,367 및 6,200,806; 미국 특허 출원 공보 번호 2006/0057718에 개시되어 있다; 또한 [Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987)]; [Guide to Techniques in Mouse Development (P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press 1993)]; [Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993)]; [Properties and Uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (P. D. Rathjen et al., Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998)] 참조.
특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 내인성인 세포를 포함한다. 이같은 세포에는 태반 줄기 세포, 기원 세포, 다능성 세포 및 중복성 세포가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 태반-유래 부착성 세포이다.
특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 외인성인 세포를 포함한다. 이같은 세포는, 예를 들어, 본 발명의 줄기 세포와 공동-배양된 피더 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양된 줄기 세포는 인간 줄기 세포이고, 피더 세포는 인간 기원의 세포이다. 피더 세포는 WO 03/02944, WO 03/014313, [Park et al., Biol. Reprod., 69:2007-2017, 2003], [Amit et al., Biol. Reprod., 68(6):2150-2156, 2003], [Hovattal et al., Hum. Reprod., 18 (7): 1404-1409, 2003], [Richards et al., Nat Biotechnol, 20(9):933-936, 2002], [James et al., Science, 282(6): 1145-1147, 1998] 및 [Cheng et al., Stem Cells, 21 :131-142, 2003]에 예를 들어 기술된 바와 같은 1차 마우스 섬유모세포 (PMEF), 마우스 배아 섬유모세포 세포주 (MEF), 뮤린(murine) 태아 섬유모세포 (MFF), 인간 배아 섬유모세포 (HEF), 인간 태아 근육 세포 (HFM), 인간 태아 피부 세포 (HFS), 성인 피부 세포, 인간 포피 섬유모세포 (HFF), 성인 난관 상피 세포 (HAFT) 또는 인간 골수 간질 세포 (hMSC)가 포함되지만 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 임의의 피더 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 내인성인 세포 및 외인성인 세포의 조합물을 포함한다.
본 발명에서, 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양된 줄기 세포는 콜라겐 바이오패브릭에 대해 외인성이다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 외인성 줄기 세포가 배양되도록 하기 위해 모든 내인성 세포가 제거되도록 프로세싱된다. 내인성 세포를 제거하기 위한 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 순한(mild) 세제, 예를 들어, 데옥시콜산을 사용하여 내인성 세포를 제거할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 줄기 세포를 배양하기 전에 내인성 세포를 사멸시킨다. 세포를 사멸시키는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭에 전자기, UV, X-선, 감마- 또는 베타-방사선을 조사하여 모든 잔존하는 생육성 내인성 세포를 근절시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 방사선, 예를 들어, 500 내지 1500 cGy에의 준치사(sub-lethal) 노출을 사용하여 태반은 보존시키고 원치 않는 세포를 근절시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 국방부의 제5장 <Biophysical and Biological Effects of Ionizing Radiation>이 치사 대 비-치사 이온화 방사선에 대한 국제 기준을 제공한다.
적절한 분포 방식으로, 그리고 세포 생존 및 성장을 촉진하는 배양 배지의 존재 하에, 줄기 세포를 콜라겐 바이오패브릭 상에 플레이팅할 수 있다. 당업자의 판단에 따라 임의의 시점에 임의의 방식으로 줄기 세포를 콜라겐 바이오패브릭 상에 플레이팅할 수 있다. 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭을 줄기 세포 배양물에 세포를 계대시키는 시점에 또는 정기적인 피딩(feeding)의 일부로서 놓을 수 있다. 별법적으로, 단리 후에 직접 콜라겐 바이오패브릭 상에 줄기 세포를 플레이팅할 수 있다.
콜라겐 바이오패브릭의 표면 상에 플레이팅되는 줄기 또는 기원 세포의 수는 변할 수 있지만, 1×103, 3×103, 1×104, 3×104, 1×105, 3×105, 1×106, 3×106, 1×107, 3×107, 1×108, 3×108, 1×109, 3×109, 1×1010, 3×1010, 1×1011, 3×1011, 또는 1×1012 개 이상의 줄기 세포일 수 있거나; 또는 1×103, 3×103, 1×104, 3×104, 1×105, 3×105, 1×106, 3×106, 1×107, 3×107, 1×108, 3×108, 1×109, 3×109, 1×1010, 3×1010, 1×1011, 3×1011, 또는 1×1012 개 이하의 줄기 또는 기원 세포일 수 있다.
본원에서의 배양 실시양태 중 임의의 것의 또다른 실시양태에서, 줄기 세포가 제대, 예를 들어, 제대막으로부터 유래된, 콜라겐을 기초로 하는 생체물질 상에서 배양된다. 바람직한 실시양태에서, 제대-유래 생체물질은 콜라겐 바이오패브릭의 제조를 위해 실질적으로 본원에 개시된 바와 같이 탈세포화되고 프로세싱된다. 바람직하게는, 제대 생체물질의 실질적으로 편평한 시트 또는 조각 상에서 줄기 세포가 배양된다.
5.3.1. 배양 배지
일단 단리되면, 줄기 세포가 배양 배지에서 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양된다. 배양 배지는 줄기 세포를 배양하는데 적절한 임의의 배양 배지, 예를 들어, 피더 세포가 없는 조건에서 줄기 세포를 배양하는데 적절한 배양 배지일 수 있다. 이같은 배양 배지에는 미국 특허 번호 6,800,480, 미국 출원 공보 번호 2005/0153445에 기술된 것들이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용될 수 있는 배양 배지는 약 500 ㎖의 증류수; 60 ㎖의 DMEM (Gibco-BRL); 약 40 ㎖의 물 (pH 7.2)에 용해된 MCDB201 (Sigma); 약 2 ㎖의 FCS (Hyclone); 약 1 ㎖의 100× ITS (인슐린 트랜스페린 셀레늄; Sigma); 페니실린＆스트렙토마이신(pen＆strep); 약 10 ng/㎖ LA; 소 혈청 알부민; 약 50 nM 덱사메타손 (Sigma); 약 10 ng/㎖ PDGF (혈소판-유래 성장 인자; 및 약 10 ng/㎖ EGF (표피 성장 인자)를 포함한다.
사용된 배지는 혈청을 포함하거나 포함하지 않을 수 있지만, 혈청이 지니는 병원체에 세포가 노출되지 않도록 무혈청 배지를 사용하는 것이 유리할 수 있는 것으로 당업자에게 인지된다.
당업자는 줄기 세포가 원래 유래된 조직 또는 줄기 세포가 분화될 조직에 따라, 배양 또는 확장을 용이하게 하는 하나 이상의 확장 인자가 배양 배지에 보충될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 배아 줄기 세포에 대해, 생체외(ex vivo) 확장 인자에는 FGFβ, Wnt-3a, 콜라겐, 피브로넥틴, 및 라미닌 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 중간엽 줄기 세포에 대해, 예를 들어, 생체외 확장 인자에는 하나 이상의 FGFβ, EGF, PDGF, 및 피브로넥틴이 포함될 수 있다. 조혈 줄기 세포에 대해, 생체외 확장 인자에는 IL-3, IL-6, SCF, Flt-3/Flk-2, Tpo, Shh, Wnt-3a, 및 Kirre 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 신경 줄기 세포에 대해, 생체외 확장 인자에는 FGFβ, EGF, 피브로넥틴, 및 시스타틴 C가 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조건화 배지가 콜라겐 바이오패브릭과 함께 줄기 세포를 배양하는데 사용된다. 본원에서 사용된 조건화 배지는 피더 세포가 이미 일정 기간 동안 배양된 배지를 지칭한다.
당업자는 배양 목적 (줄기 세포의 배양, 확장 또는 분화), 줄기 세포가 유래된 원천, 줄기 세포가 분화되도록 유도될 세포의 유형, 배양에서 사용된 콜라겐 바이오패브릭 및 줄기 세포 이외의 세포의 존재 또는 부재에 따라, 상이한 배양 배지가 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
5.4. 콜라겐 바이오패브릭을 사용한 줄기 세포의 확장
본 발명은 줄기 세포 또는 줄기 세포의 집단을 상기 줄기 세포 또는 줄기 세포 집단이 확장되도록 하는 조건 하에 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 줄기 세포 또는 줄기 세포의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
줄기 세포 또는 줄기 세포의 집단을 당업자에 따라 적합한 조건 하에 일정 기간 동안 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 24시간 이상 동안 배양 배지에서 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 2일 이상 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 7일 이상 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 10일 이상 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 14일 이상 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 30일 이상 동안 배양된다.
일부 실시양태에서, 단일 줄기 세포, 또는 약 또는 적어도 또는 최대 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1×103, 5×103, 1×104 또는 5×104 개의 줄기 세포가 배양 배지에서 콜라겐 바이오패브릭과 함께 확장된다. 또다른 실시양태에서, 줄기 세포가 본 발명의 방법에 따라 배양 및 확장되고, 원래 배양된 줄기 세포의 수와 비교하여 줄기 세포의 수가 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1×103, 5×103, 1×104 또는 5×104 배 증가된다. 또다른 실시양태에서, 배양물 내의 줄기 세포의 수가 약 또는 적어도 1×106, 5×106, 1×106, 5×106, 1×107, 5×107, 1×108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1011, 또는 1×1012 개의 줄기 세포로 증가되거나; 또는 1×106, 5×106, 1×107, 5×107, 1×108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1011, 또는 1×1012 개 이하의 줄기 세포일 수 있다.
5.5. 콜라겐 바이오패브릭을 사용한 줄기 세포의 분화
본 발명은 줄기 세포의 분화에 충분한 시간 동안 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는, 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 줄기 세포를 중간엽, 조혈, 지방 세포, 간세포, 신경세포, 아교세포, 연골세포, 혈관세포, 근육세포, 췌장세포, 연골세포 또는 골세포 계통이 포함되지만 이에 한정되지 않는 특정 세포 계통으로 분화시키는 방법을 포함한다.
당업자는 줄기 세포의 분화에 충분한 시간이 배양된 줄기 세포의 유형 및 줄기 세포가 분화될 세포 유형에 따라 변할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 최소, 약 또는 최대 1시간, 2시간, 5시간, 10시간, 15시간, 20시간 또는 24시간 또는 그 이상 동안 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 최소, 약 또는 최대 2일, 5일, 7일, 10일, 14일, 20일, 25일, 또는 30일 또는 그 이상 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 약 2시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 7일, 약 2시간 내지 약 14일, 약 2시간 내지 약 30일, 약 24시간 내지 약 2일, 약 24시간 내지 약 7일, 약 24시간 내지 약 14일, 또는 약 24시간 내지 약 30일 동안 배양된다.
특정 실시양태에서, 이 방법은 줄기 세포를 원하는 분화를 용이하게 하는 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 작용제는 표현형에서의 변화를 유도하거나 또는 용이하게 하거나, 특정 표현형의 세포의 성장을 촉진하거나, 또는 다른 것들의 성장을 느리게 하거나, 또는 미지의 메커니즘을 통해 다른 작용제와 협력하여 작용할 수 있다. 이같은 작용제는 소형 분자 또는 사이토카인, 예컨대 미국 출원 공보 번호 2003/0235909, 2004/0028660 (소형 분자), 미국 특허 번호 6,335,195 (안지오텐시노겐 및 안지오텐신의 존재 하의 조혈 및 중간엽 줄기 세포), 미국 특허 번호 6,022,743 (췌장 실질 세포-3차원 배양물), 미국 특허 번호 6,613,568 (조혈 계통)에 개시된 것들일 수 있다.
줄기 세포는 미국 출원 공보 번호 2005/015344 및 2005/0158855 (일반적), 미국 특허 번호 6,833,269 및 6,887,706 및 미국 출원 공보 번호 2005/0095706 (신경 세포), 미국 출원 공보 번호 2005/0170502 (간 계통), [Kehat, 2003, Methods in Enzymology 365:465-473], 미국 출원 공보 번호 2005/0191744 및 2005/0214939 (심장 세포), 및 [Assady et al., 2001, Diabetes, 50:1691-97] (췌장 세포)에 예를 들어 기술된 바와 같은, 줄기 세포의 분화에 적절한 임의의 배양 배지 또는 조건에서 분화될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 수득된 줄기 세포의 분화 상태의 평가는 특정 세포 표면 마커의 존재 또는 부재에 의해 확인될 수 있다. 태반 줄기 세포는, 예를 들어, 마커 OCT-4 및 ABC-p, 또는 여러 포유류 종에서의 이의 등가물에 의해 확인될 수 있다. 태반 줄기 세포는 마커CD73 또는 CD105의 존재, 및/또는 마커 CD34, CD38, 또는 CD45, 또는 여러 포유류 종에서의 이의 등가물의 부재에 의해 또한 확인될 수 있다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 SSEA3 및/또는 SSEA4에 대해 양성이다. 또다른 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 SSEA3 및/또는 SSEA4에 대해 음성이다. 이같은 세포 표면 마커의 존재 또는 부재는 당업계에 주지된 방법에 따라, 예를 들어, 유동 세포측정에 의해 일상적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, CD34 또는 CD38의 존재를 결정하기 위해, 세포를 PBS에서 세정한 후, 항-CD34 피코에리트린 및 항-CD38 플루오레세인 이소티오시아네이트 (Becton Dickinson, Mountain View, Calif)로 이중 염색할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 분화된 줄기 세포가 당업계에 통상적으로 공지된 콜로니 형성 단위 분석법, 예컨대 MESENCULT™ 배지 (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver British Columbia)에 의해 확인 및 특징화된다.
줄기 세포가 특정 세포 유형으로 분화되었는지의 결정은 당업계에 주지된 방법에 의해, 예를 들어, 세포 유동측정 또는 면역세포화학을 사용하여 형태 및 세포 표면 마커에서의 변화를 측정함으로써 (예를 들어, 세포를 조직-특이적 또는 세포-마커 특이적 항체로 염색함), 광현미경 또는 공초점 현미경을 사용하는 세포 형태의 검사에 의해, 또는 당업계에 주지된 기술, 예컨대 PCR 및 유전자-발현 프로파일링을 사용하여 유전자 발현에서의 변화를 측정함으로써 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 차별적으로 발현된 유전자를 특징화함으로써, 예를 들어, 분화되지 않은 당해 줄기 또는 기원 세포로부터의 다수의 유전자의 발현 수준을 이러한 유형의 기원 세포로부터 유래된 분화된 세포에서의 상기 다수의 유전자의 발현 수준과 비교함으로써 분화된 세포를 확인할 수 있다. 예를 들어, 핵산 증폭 방법 예컨대 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 전사-기반 증폭 방법 (예를 들어, 시험관내 전사 (IVT))를 예를 들어 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이를 사용함으로써 상이한 세포 집단에서의 유전자 발현을 프로파일링하는데 사용할 수 있다. 상이한 유전자 발현을 프로파일링하기 위한 이같은 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, [Wieland et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2720-2724]; [Lisitsyn et al., 1993, Science 259: 946-951]; [Lisitsyn et al., 1995, Meth. Enzymol. 254:291-304]; 미국 특허 번호 5,436,142; 미국 특허 번호 5,501,964; [Lisitsyn et al., 1994, Nature Genetics 6:57-63]; [Hubank and Schatz, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 5640-5648]; [Zeng et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4381-4385]; 미국 특허 번호 5,525,471; 미국 특허 번호 6,271,002 (Linsley 등); 미국 특허 번호 5,716,785 (Van Gelder 등); [Stoflet et al., 1988, Science 239:491-494]; [Sarkar and Sommer, 1989, Science 244:331-334]; 미국 특허 번호 4,683,195 (Mullis 등); 미국 특허 번호 5,130,238 (Malek 등); 미국 특허 번호 5,399,491 (Kacian ＆ Fultz); 미국 특허 번호 5,437,990 (Burg 등); [van Gelder et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1663]; [Lockhart et al., 1996, Nature Biotechnol 14:1675]; 미국 특허 번호 6,132,997 (Shannon); 미국 특허 번호 6,235,503 (Lindemann 등) 참조.
5.5.1. 신경 세포로의 분화
한 양상에서, 본 발명은 줄기 세포의 신경 세포로의 분화를 촉진하는 조건 하에 콜라겐 바이오패브릭 상에서 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는, 줄기 세포를 신경 세포로 분화시키는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 방법은 줄기 세포를 줄기 세포의 신경 세포로의 분화를 용이하게 하는 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 대표적인 작용제에는 베타메르캅토에탄올 ([Woodbury et al., J. Neurosci. Res., 61.364-370]) 또는 부틸화 히드록시아니솔이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 하나 이상의 작용제를 포함한다. 당업계에 공지된 신경 분화에 적절한 임의의 배양 배지가 세포 배양에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 분화가 관찰될 때까지 줄기 세포를 2％ DMSO 및 200 μM 부틸화 히드록시아니솔를 함유하는 DMEM 배지에서 배양함으로써 분화가 유도될 수 있다.
줄기 세포가 신경 세포 유형으로 분화되었는지는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 평가 및 결정될 수 있다. 예를 들어, RT/PCR을 사용하여 예를 들어 신경 성장 인자 수용체 및 신경미세섬유 중쇄 유전자의 발현을 평가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신경 세포는 신경 성장 인자 수용체의 생산; 신경 성장 인자를 코딩하는 유전자의 발현; 신경미세섬유 중쇄의 생산; 또는 신경미세섬유 중쇄를 코딩하는 유전자의 발현을 나타낸다.
5.5.2. 지방세포로의 분화
또다른 양상에서, 본 발명은 줄기 세포의 지방세포로의 분화를 촉진하는 조건 하에 콜라겐 바이오패브릭 상에서 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는, 줄기 세포를 지방세포로 분화시키는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지방세포는 친지성 염료로 검출가능한 세포질내 지질 소포의 생산; 리파제(lipase)를 코딩하는 유전자의 발현; 또는 리파제의 생산을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 분화는 줄기 세포를 콜라겐 바이오패브릭 및 줄기 세포의 지방세포로의 분화를 용이하게 하는 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다. 대표적인 작용제는 덱사메타손, 인도메타신, 인슐린, 및 3-이소부틸-1-메틸잔틴이다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 하나 이상의 작용제를 포함한다.
당업계에 공지된 지방세포 분화에 적절한 임의의 배양 배지가 세포 배양에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 1 μM 덱사메타손, 0.2 mM 인도메타신, 0.01 ㎎/㎖ 인슐린, 0.5 mM IBMX, DMEM-고(高) 글루코스, FBS, 및 항생제를 함유하는 지방발생 유지 배지(Adipogenesis Maintenance Medium) (Bio Whittaker)가 분화를 유도하는데 사용될 수 있다.
줄기 세포가 지방세포 세포 유형으로 분화되었는지는 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 친지성 염료 오일 레드 O를 사용하여 용이하게 관찰할 수 있는 다중 세포질내 지질 소포의 발달에 의해 지방발생을 평가할 수 있다. RT-PCR을 예를 들어 사용하여 리파제 및 지방산 결합 단백질 유전자의 발현을 검출함으로써 분화가 또한 입증될 수 있다.
5.5.3. 연골세포로의 분화
또다른 양상에서, 본 발명은 줄기 세포의 연골세포로의 분화를 촉진하는 조건 하에 콜라겐 바이오패브릭 상에서 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는, 줄기 세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연골세포는 연골세포의 특징적인 세포 형태; 콜라겐 2의 생산; 콜라겐 2를 코딩하는 유전자의 발현, 콜라겐 9의 생산; 또는 콜라겐 9를 코딩하는 유전자의 발현을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 분화는 줄기 세포를 단독 콜라겐 바이오패브릭 및 줄기 세포의 연골세포로의 분화를 용이하게 하는 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다. 대표적인 작용제는 전환 성장 인자-베타-3이다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 하나 이상의 작용제를 포함한다.
당업계에 공지된 연골세포 분화에 적절한 임의의 배양 배지가 세포 배양에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 0.01 ㎍/㎖ TGF-베타-3를 함유하는 완전 연골발생 배지(Complete Chondrogenesis Medium) (Bio Whittaker)가 분화를 유도하는데 사용될 수 있다.
줄기 세포가 연골세포 세포 유형으로 분화되었는지는 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 연골발생이, 예를 들어, 호산구성 기저 물질 생산의 관찰, 연골세포 세포 형태의 발달, 및/또는 예를 들어 RT-PCR을 사용한 콜라겐 2 및 콜라겐 9 유전자 발현의 검출에 의해 입증될 수 있다.
5.5.4. 골세포로의 분화
또다른 양상에서, 본 발명은 줄기 세포의 골세포로의 분화를 촉진하는 조건 하에 콜라겐 바이오패브릭 상에서 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는, 줄기 세포를 골세포로 분화시키는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골세포는 골세포의 특징적인 칼슘 수준; 알칼리성 포스파타제(phosphatase)의 생산; 알칼리성 포스파타제를 코딩하는 유전자의 발현; 오스테오폰틴(osteopontin)의 생산; 또는 오스테오폰틴을 코딩하는 유전자의 발현을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 분화는 줄기 세포를 콜라겐 바이오패브릭 및 당업계에 공지된, 줄기 세포의 골세포로의 분화를 용이하게 하는 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다. 대표적인 작용제는 덱사메타손, 아스코르브산-2-포스페이트, 및 글리세로포스페이트이다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 하나 이상의 작용제를 포함한다.
당업계에 공지된 골세포 분화에 적절한 임의의 배양 배지가 세포 배양에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 0.1 μM 덱사메타손, 0.05 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 mM 베타 글리세로포스페이트를 함유하는 골발생 유도 배지(Osteogenic Induction Medium) (Bio Whittaker)가 분화를 유도하는데 사용될 수 있다.
줄기 세포가 골세포 세포 유형으로 분화되었는지는 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 칼슘-특이적 염색 및 예를 들어 RT-PCR을 사용한 알칼리성 포스파타제 및/또는 오스테오폰틴 유전자 발현의 검출에 의해 분화가 증명될 수 있다.
5.5.5. 간세포로의 분화
또다른 양상에서, 본 발명은 줄기 세포의 간세포로의 분화를 촉진하는 조건 하에 콜라겐 바이오패브릭 상에서 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는, 줄기 세포를 간세포로 분화시키는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간세포는 간세포-특이적 유전자의 발현 또는 간세포-특이적 단백질의 생산을 나타낸다. 이같은 유전자는 당업계에 공지되어 있고, 미국 출원 공보 번호 2005/0170502에 기술된 바와 같이 알부민, 프리(pre)-알부민, 글루코스-6-포스페이트, α1-안티트립신 등일 수 있다.
분화는 줄기 세포를 콜라겐 바이오패브릭 및 줄기 세포의 간세포로의 분화를 용이하게 하는 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 간세포 성장 인자 및/또는 표피 성장 인자. 일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 하나 이상의 작용제를 포함한다. 당업계에 공지된 간세포 분화에 적절한 임의의 배양 배지가 세포 배양에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 간세포 성장 인자 (20 ng/㎖); 및 표피 성장 인자 (100 ng/㎖)가 보충된, 20％ CBS가 있는 DMEM 배지가 분화를 유도하는데 사용될 수 있다. 녹아웃 혈청 대체물(KnockOut Serum Replacement)이 FBS 대신 사용될 수 있다.
알부민, 프리-알부민, 글루코스-6-포스페이트, α1-안티트립신의 생산 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현의 검출에 의해 간세포로의 분화가 증명될 수 있다.
5.5.6. 췌장 세포로의 분화
또다른 양상에서, 본 발명은 줄기 세포의 췌장 세포로의 분화를 촉진하는 조건 하에 콜라겐 바이오패브릭 상에서 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는, 줄기 세포를 췌장 세포로 분화시키는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 췌장 세포는 인슐린의 생산 또는 인슐린을 코딩하는 유전자의 발현을 나타낸다.
분화는 줄기 세포를 콜라겐 바이오패브릭 및 줄기 세포의 췌장 세포로의 분화를 용이하게 하는 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다. 대표적인 작용제는 염기성 섬유모세포 성장 인자, 전환 성장 인자 베타-1, 및 네스틴(nestin)-양성 뉴런 세포로 조건화된 배지이다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 하나 이상의 작용제를 포함한다. 당업계에 공지된 췌장 세포 분화에 적절한 임의의 배양 배지가 세포 배양에서 사용될 수 있다. 예를 들어, DMEM 배지와 혼합된 네스틴-양성 뉴런 세포 배양물로부터의 조건화 배지가 사용될 수 있다.
줄기 세포가 췌장 세포로 분화되었는지는 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 인슐린 생산의 검출, 또는 예를 들어 RT-PCR을 사용한 인슐린 유전자 발현의 검출에 의해 분화가 입증될 수 있다.
5.5.7. 심장 세포로의 분화
또다른 양상에서, 본 발명은 줄기 세포의 심장 세포로의 분화를 촉진하는 조건 하에 콜라겐 바이오패브릭 상에서 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는, 줄기 세포를 심장 세포로 분화시키는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 심장 세포는 박동; 심장 액틴(actin)의 생산; 또는 심장 액틴을 코딩하는 유전자의 발현을 나타낸다.
분화는 줄기 세포를 줄기 세포의 심장 세포로의 분화를 용이하게 하는 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 대표적인 작용제에는 레티노산, 염기성 섬유모세포 성장 인자, 전환 성장 인자 또는 카디오트로핀(cardiotropin)이 포함된다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 하나 이상의 작용제를 포함한다.
당업계에 공지된 심장 세포 분화에 적절한 임의의 배양 배지가 세포 배양에서 사용될 수 있다.. 예를 들어, 레티노산 (1 μM); 염기성 섬유모세포 성장 인자 (10 ng/㎖); 및 전환 성장 인자 베타-1 (2 ng/㎖); 및 표피 성장 인자 (100 ng/㎖)가 보충된, 20％ CBS가 있는 DMEM 배지가 배양에서 사용될 수 있다. 녹아웃 혈청 대체물 (Invitrogen, Carlsbad, California)이 CBS 대신 사용될 수 있다. 별법적으로, 50 ng/㎖ 카디오트로핀-1이 보충된, 20％ CBS가 있는 DMEM 배지가 사용될 수 있다. 또한, 줄기 세포가 단백질이 없는 배지에서 5-7일 동안 유지된 후, 인간 심근 추출물로 자극될 수 있다 (용량을 단계적으로 상승시키는 분석). 심근 추출물은 1％ 제대혈 혈청이 보충된 1％ HEPES 완충제에서 1 g의 인간 심근을 균질화함으로써 생산된다. 현탁액을 60분 동안 인큐베이션한 후, 원심분리하고, 상청액을 수집한다.
줄기 세포가 심장 세포 유형으로 분화되었는지는 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 박동, 심장 액틴의 생산 또는 심장 액틴을 코딩하는 유전자의 발현에 의해 분화가 입증될 수 있다.
5.6. 콜라겐 바이오패브릭
본 발명은 콜라겐 바이오패브릭을 사용하는 줄기 세포의 배양, 확장 또는 분화 방법을 제공한다. 어떠한 이론에 의해서도 한정되기를 원치 않으면서, 콜라겐 바이오패브릭이 세포 부착을 위한 기저층 및 배양물 내의 줄기 세포 성장에 적합한 성장 인자를 제공하는 것으로 생각된다.
콜라겐 바이오패브릭은 건조 형태 또는 천연 형태 (즉, 태반으로부터 절개된 그대로), 또는 탈세포화되거나 탈세포화되지 않은 형태로 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 내인성인 세포를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 외인성인 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 외인성인 세포 및 내인성인 세포 모두를 포함한다.
5.6.1. 설명
본 발명에서 사용된 콜라겐 바이오패브릭은 임의의 포유동물, 예를 들어, 말, 소, 돼지 또는 협비류 원숭이의 양막, 융모막, 또는 양쪽 모두로부터 유래될 수 있지만, 가장 바람직하게는 인간 태반으로부터 유래된다. 바람직한 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 실질적으로 건조하고, 즉, 수분 중량이 20％ 이하이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 프로테아제로 처리되지 않았다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 인공적으로 가교된, 예를 들어, 화학적으로 가교된 콜라겐 및 기타 구조 단백질을 함유하지 않고, 즉 바람직한 콜라겐 바이오패브릭은 고정되지 않는다. 바람직한 콜라겐 바이오패브릭은 본원에 전문이 포함된 미국 출원 공보 U.S. 2004/0048796 (Hariri)에 기술된, 고정되지 않고, 프로테아제로 처리되지 않은, 건조된 양막 물질이고, 이는 상기 공보 및 본원 (실시예 1, 2 참조)에 기술된 방법에 의해 생산된다. 그러나, 본 발명의 방법은 임의의 절차에 의해 제조된 임의의 태반 콜라겐 물질을 사용할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 반투명하다. 또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 불투명하거나, 또는 의학적으로 허용가능한 착색제 또는 염색제를 사용하여, 염색 또는 착색되고, 예를 들어, 영구적으로 염색 또는 착색된다; 이같은 작용제가 콜라겐 바이오패브릭 상에 흡착될 수 있거나, 또는 콜라겐 바이오패브릭이 이같은 작용제로 함침되거나 또는 코팅될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 임의의 공지된 비-독성, 비-자극성 염색제 또는 염료가 사용될 수 있다.
콜라겐 바이오패브릭이 실질적으로 건조할 때, 이는 약 0.1 g/㎠ 내지 약 0.6 g/㎠이다. 특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭의 단일 층은 두께가 2 마이크로미터 이상이다. 또다른 특정 실시양태에서, 고막을 복구하는데 사용된 콜라겐 바이오패브릭의 단일 층은 두께가 약 10-40 마이크로미터이지만, 건조 상태에서는 두께가 약 2-150, 2-100 마이크로미터, 5-75 마이크로미터 또는 7-60 마이크로미터일 수 있다.
한 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 주로 콜라겐 (제I형, 제III형 및 제IV형; 바이오패브릭의 매트릭스의 약 90％), 피브린, 피브로넥틴, 엘라스틴으로 구성되고, 추가로 글리코사미노글리칸 및 프로테오글리칸을 함유한다. 또다른 실시양태에서, 바이오패브릭의 비-구조적 성분은, 예를 들어, 성장 인자, 예를 들어, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 혈관-내피 성장 인자 (VEGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 및 전환 성장 인자-β1을 포함할 수 있다. 따라서 콜라겐 바이오패브릭의 조성은 섬유모세포 및 대식세포의 이동, 따라서 상처 치유의 촉진을 조장하는데 이상적으로 적합하다.
콜라겐 바이오패브릭은 단일층 형식으로, 예를 들어, 단일층 시트 또는 적층되지 않은 막으로서 사용될 수 있다. 별법적으로, 콜라겐 바이오패브릭은 이중층 또는 다중층 형식으로 사용될 수 있고, 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭이 적층될 수 있다. 적층은 치유 프로세스 동안 더 양호한 강성 및 내구성을 제공할 수 있다. 콜라겐 바이오패브릭은, 예를 들어, 하기 기술된 바와 같이 적층될 수 있다.
콜라겐 바이오패브릭은 비-태반 공급원으로부터의 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭의 하나 이상의 층이 정제된 추출 콜라겐으로 코팅 또는 함침될 수 있거나, 또는 이러한 콜라겐이 층상화될 수 있다. 이같은 콜라겐은, 예를 들어, 시판원으로부터 수득될 수 있거나, 또는 공지된 방법, 예컨대 미국 특허 번호 4,420,339, 5,814,328, 및 5,436,135에 개시된 방법에 따라 생산될 수 있다.
콜라겐 바이오패브릭은 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 내인성인 세포를 포함할 수 있다. 또한 콜라겐 바이오패브릭은 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 외인성인 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 외인성인 세포 및 내인성인 세포 모두를 포함할 수 있다.
콜라겐 바이오패브릭은 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반 물질 내에 존재하지 않는 하나 이상의 화합물 또는 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭이 생체활성 화합물로 함침될 수 있다. 이같은 생체활성 화합물에는 소형 유기 분자 (예를 들어, 약물), 항생제 (예컨대 클린다마이신(Clindamycin), 미노사이클린(Minocycline), 독시사이클린(Doxycycline), 젠타마이신(Gentamycin)), 호르몬, 성장 인자, 항-종양제, 항-진균제, 항-바이러스제, 통증 의약, 항-히스타민제, 항-염증제, 은을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항-감염제 (예컨대 질산은 및 실버 술파디아진이 포함되지만 이에 한정되지 않는 은 염), 원소성 은, 항생제, 살균성 효소 (예컨대 라이소자임), 상처치유제 (예컨대 PDGF, TGF가 포함되지만 이에 한정되지 않는 사이토카인; 타이모신), 상처치유제로서의 히알루론산, 상처 봉함제 (예컨대 트롬빈과 함께 또는 트롬빈 없이 사용되는 피브린), 세포성 유인제 및 스캐폴딩(scaffolding) 시약 (예컨대 첨가된 피브로넥틴) 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 하나 이상의 성장 인자, 예를 들어, 섬유모세포 성장 인자, 상피 성장 인자 등으로 함침될 수 있다. 또한 바이오패브릭이 소형 유기 분자 예컨대 특정 생화학적 프로세스의 특이적 억제제, 예를 들어, 막 수용체 억제제, 키나제 억제제, 성장 억제제, 항암 약물, 항생제 등으로 함침될 수 있다. 콜라겐 바이오패브릭을 생체활성 화합물로 함침시키는 것은, 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭을 원하는 농도의 생체활성 화합물의 용액으로 콜라겐 바이오패브릭이 용액을 흡수하여 평형을 이루도록 하는데 충분한 시간 동안 침지시키는 것; 용액을 바이오패브릭 상에 분무하는 것; 바이오패브릭을 용액으로 습윤화시키는 것 등에 의해 달성될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 하이드로젤과 조합될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 하이드로젤 조성물, 예를 들어, 하기의 리뷰 문헌에 개시된 하이드로젤 조성물 중 임의의 것이 본 발명에 포함된다: [Graham, 1998, Med. Device Technol. 9(1): 18-22]; [Peppas et al., 2000, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50(1): 27-46]; [Nguyen et al., 2002, Biomaterials, 23(22): 4307-14]; [Henincl et al., 2002, Adv. Drug Deliv. Rev 54(1): 13-36]; [Skelhorne et al., 2002, Med. Device. Technol. 13(9): 19-23]; [Schmedlen et al., 2002, Biomaterials 23: 4325-32] (이들 모두는 거명에 의해 전문이 본원에 포함됨). 특정 실시양태에서, 하이드로젤 조성물이 콜라겐 바이오패브릭 상에 도포되고, 즉, 콜라겐 바이오패브릭의 표면 상에 배치된다. 하이드로젤 조성물이, 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭 상에 분무되거나 또는 콜라겐 바이오패브릭의 표면 상에 코팅될 수 있거나, 또는 바이오패브릭이 하이드로젤 조성물로 침지, 목욕 또는 포화될 수 있다. 또다른 특정 실시양태에서, 하이드로젤이 콜라겐 바이오패브릭의 2개 이상의 층 사이에 샌드위치된다. 더욱 더 특정한 실시양태에서, 하이드로젤이 콜라겐 바이오패브릭의 2개 이상의 층 사이에 샌드위치되고, 이때 실질적으로 또는 완전하게 하이드로젤을 함유하도록 바이오패브릭의 2개의 층의 가장자리가 밀봉된다.
본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 하이드로젤은 폴리비닐알콜 (PVA), 폴리히드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 히알루론산, 알기네이트, 콜라겐, 젤라틴, 덱스트란 또는 이들의 유도체 또는 유사체가 포함되지만 이에 한정되지 않는, 임의의 당업계에 공지된 수-상호작용성 또는 수용성 중합체로부터 제조될 수 있다.
특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 히알루론산을 포함한다. 예를 들어, 히알루론산이 용액, 예를 들어, 10 mg/㎖ 용액 (예를 들어, 물 또는 생리학적으로 허용가능한 완충제 또는 배양 배지 내의 용액)으로 콜라겐 바이오패브릭에 도포 또는 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 액체 환경에서의 히알루론산의 용해도를 감소시키거나 방지하기 위해 히알루론산이 충분하게 가교된다. 바람직한 실시양태에서, 히알루론산이 콜라겐 바이오패브릭에 가교된다. 히알루론산을 가교시키기 위한, 또는 히알루론산을 콜라겐 바이오패브릭에 가교시키기 위한 가교제는 임의의 가교제일 수 있고, 예를 들어, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDE), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDCI), 디비닐 술폰, 에피클로로히드린, 글루타르알데히드, 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) 등일 수 있다. 콜라겐 바이오패브릭과 히알루론산의 조합물이 임의로 건조될 수 있고,예를 들어, 공기 건조, 동결건조 등으로 건조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이, 히알루론산의 첨가 전 또는 첨가 동안에, 가장자리에 콜라겐 바이오패브릭을 예를 들어 홀딩(holding)하는 프레임 또는 홀더에 놓인다.
본 발명은 콜라겐 바이오패브릭의 적어도 일부분을 히알루론산 용액과 접촉시키는 단계, 히알루론산을 콜라겐 바이오패브릭에 가교시키는 단계, 및 생성된 콜라겐 바이오패브릭을 건조시키는 단계를 포함하는, 줄기 세포 또는 줄기 세포의 집단, 예를 들어, 부착성 CD34- 태반 줄기 세포의 배양에 예를 들어 사용될, 히알루론산을 포함하는 콜라겐 바이오패브릭을 제조하는 방법을 또한 제공한다. 이 방법의 한 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 히알루론산 용액과 접촉되는 시점에 실질적으로 건조하고, 예를 들어, 20％ 이하의 수분을 포함한다. 이 방법의 또다른 실시양태에서, 히알루론산 용액과 접촉되기 전에 콜라겐 바이오패브릭이 탈세포화된다. 또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 외관이 시트와 유사하다. 이 방법의 또다른 특정 실시양태에서, 히알루론산 용액과 접촉되기 전에 콜라겐 바이오패브릭이 탈세포화되지 않는다. 바람직하게는, 콜라겐 바이오패브릭은, 히알루론산 용액과 접촉되는 시점에, 하나 이상의 측면 상에서, 예를 들어, 프레임 내에서 홀딩되어, 접촉 동안 콜라겐 바이오패브릭이 말리는 양을 감소시키거나 또는 말리는 것을 방지한다. 특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 정사각형 또는 직사각형 시트이고, 히알루론산 용액과 접촉되는 동안 콜라겐 바이오패브릭의 4개의 가장자리 모두와 접촉되는 4면 프레임에서 홀딩된다.
상기의 조성물 및 방법 실시양태에 대해, 히알루론산 용액은 접촉된 콜라겐 바이오패브릭의 일부분의 표면 상에 히알루론산이 균일하게 분포되도록 하는 임의의 히알루론산 용액일 수 있다. 예를 들어, 히알루론산 용액은 용액 1 ㎖ 당 최소, 약 또는 최대 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 ㎎의 히알루론산을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 하나 이상의 생체활성 화합물을 포함하고, 하이드로젤과 조합된다. 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭이 하이드로젤과 조합되기 전에 하나 이상의 생체활성 화합물로 함침될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 하이드로젤 조성물이 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭과 접촉되기 전 또는 후에 하나 이상의 생체활성 화합물, 예를 들어, 하기 섹션에 기술된 생체활성 화합물로 추가로 함침된다.
5.6.2. 생체활성 화합물
본 발명의 방법에서 사용된 콜라겐 바이오패브릭은 하나 이상의 생체활성 화합물을 포함할 수 있다 (예를 들어, 이러한 화합물로 함침되거나 코팅될 수 있다). 본원에서 사용된 용어 "생체활성 화합물"은 시험관내에서 또는 생체 내에서 하나 이상의 생물학적 시스템에 대한 측정가능한 효과를 야기하는 임의의 화합물 또는 분자를 의미한다. 생체활성 화합물의 예로는 소형 유기 분자 (예를 들어, 약물), 항생제, 항-바이러스제, 항균제, 항-염증제, 항-증식제, 사이토카인, 효소 또는 단백질 억제제, 항-히스타민제 등이 비제한적으로 포함된다. 다양한 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 항생제 (예컨대 클린다마이신, 미노사이클린, 독시사이클린, 젠타마이신), 호르몬, 성장 인자, 항-종양제, 항-진균제, 항-바이러스제, 통증 의약 (자일로카인(XYLOCAINE)®, 리도카인(Lidocaine), 프로카인(Procaine), 노보카인(Novocaine) 등 포함), 항-히스타민제 (예를 들어, 디펜히드라민, 베나드릴(BENADRYL)® 등), 항-염증제, 은을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항-감염제 (예컨대 질산은 및 실버 술파디아진이 포함되지만 이에 한정되지 않는 은 염), 원소성 은, 항생제, 살균성 효소 (예컨대 라이소자임), 상처치유제 (예컨대 PDGF (예를 들어, 리그라넥스(REGRANEX)®), TGF가 포함되지만 이에 한정되지 않는 사이토카인; 타이모신), 상처치유제로서의 히알루론산, 상처 봉함제 (예컨대 트롬빈과 함께 또는 트롬빈 없이 사용되는 피브린), 세포성 유인제 및 스캐폴딩 시약 (예컨대 피브로넥틴) 등, 또는 상기 물질들 또는 상기 물질들 및 열거되지 않은 기타 화합물들 중 임의의 것의 조합물로 코팅 또는 함침될 수 있다. 이같은 함침 또는 코팅은 임의의 당업계에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있고, 콜라겐 바이오패브릭의 일부 또는 전체가 이렇게 코팅 또는 함침될 수 있다.
콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재는 본원에 열거된 화합물들 중 임의의 것을 제한 없이, 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 본원에 열거된 생물학적으로 활성인 화합물들 중 임의의 것, 및 공막 또는 눈의 정황에 있어 유용한 기타 화합물들이 즉각 방출 또는 장기간의 방출용으로 공지된 방법에 의해 제형될 수 있다. 추가적으로, 콜라겐 바이오패브릭은 2가지 이상의 생물학적으로 활성인 화합물을 상이한 방식들로 포함할 수 있다; 예를 들어, 바이오패브릭이 생물학적으로 활성인 한 화합물로 함침되고 또다른 화합물로 코팅될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 장기간의 방출용으로 제형된 생물학적으로 활성인 한 화합물, 및 즉각 방출용으로 제형된 제 2의 생물학적으로 활성인 화합물을 포함한다.
콜라겐 바이오패브릭은 상처 치유에 필요한 생리적으로 허용가능한 형태의 하나 이상의 영양소로 함침되거나 코팅될 수 있다. 바람직하게는, 영양소는 장기간의 방출용으로 제형된다.
콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재는 항생제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항생제는 마크롤라이드 (예를 들어, 토브라마이신 (토비(TOBI)®)), 세팔로스포린 (예를 들어, 세팔렉신 (케플렉스(KEFLEX)®)), 세프라딘 (벨로세프(VELOSEF)®)), 세푸록심 (세프틴(CEFTIN)®, 세프프로질 (세프질(CEFZIL)®), 세파클로르 (세클로르(CECLOR)®), 세픽심 (수프락스(SUPRAZ)® 또는 세파드록실 (듀리세프(DURICEF)®), 클라리트로마이신 (예를 들어, 클라리트로마이신 (비악신(Biaxin))), 에리트로마이신 (예를 들어, 에리트로마이신 (에마이신(EMYCIN)®)), 페니실린 (예를 들어, 페니실린 V (V-실링크(CILLINK)® 또는 펜 비이크(PEN VEEK)®)) 또는 퀴놀론 (예를 들어, 오플록사신 (플록신(FLOXIN)®), 시프로플록사신 (시프로(CIPRO)®) 오르노르플록사신 (노록신(NOROXIN)®)), 아미노글리코시드 항생제 (예를 들어, 아프라마이신, 아르베카신, 밤베르마이신, 부티로신, 디베카신, 네오마이신, 네오마이신, 운데실레네이트, 네틸미신, 파로모마이신, 리보스타마이신, 시소미신, 및스펙티노마이신), 암페니콜 항생제 (예를 들어, 아지담페니콜, 클로르암페니콜, 플로르페니콜, 및 티암페니콜), 안사마이신 항생제 (예를 들어, 리파미드 및 리팜핀), 카르바세펨 (예를 들어, 로라카르베프), 카르바페넴 (예를 들어, 비아페넴 및 이미페넴), 세팔로스포린 (예를 들어, 세파클로르, 세파드록실, 세파만돌, 세파트리진, 세파제돈, 세포조프란, 세프피미졸, 세프피라미드, 및 세프피롬), 세파마이신 (예를 들어, 세프부페라존, 세피네타졸, 및 세프미녹스), 모노박탐 (예를 들어, 아즈트레오남, 카루모남, 및 티게모남), 옥사세펨 (예를 들어, 플로목세프, 및 목살락탐), 페니실린 (예를 들어, 암디노실린, 암디노실린 피복실, 아목시실린, 바캄피실린, 벤질페니실린산, 벤질페니실린 소듐, 에피실린, 펜베니실린, 플록사실린, 페남실린, 페네타메이트 히드리요오다이드, 페니실린 o-베네타민, 페니실린 O, 페니실린 V, 페니실린 V 벤자틴, 페니실린 V 히드라바민, 페니메피사이클린, 및 페네티실린 포타슘), 린코사미드 (예를 들어, 클린다마이신, 및 린코마이신), 마크롤라이드 (예를 들어, 아지트로마이신, 카르보마이신, 클라리토마이신, 디리트로마이신, 에리트로마이신, 및 에리트로마이신 아시스트레이트), 암포마이신, 바시트라신, 카프레오마이신, 콜리스틴, 엔두라시딘, 엔비오마이신, 테트라사이클린 (예를 들어, 애피사이클린, 클로르테트라사이클린, 클로모사이클린, 및 데메클로사이클린), 2,4-디아미노피리미딘 (예를 들어, 브로디모프림), 니트로푸란 (예를 들어, 푸랄타돈, 및 푸라졸륨 클로라이드), 퀴놀론 및 이의 유사체 (예를 들어, 시녹사신, 시프로플록사신, 클리나플록사신, 플루메퀸, 및 그레파글록사신), 술폰아미드 (예를 들어, 아세틸 술파메톡시피라진, 벤질술파미드, 노프릴술파미드, 프탈릴술파세타미드, 술파크리소이딘 및 술파사이틴), 술폰 (예를 들어, 디아티모술폰, 글루코술폰 나트륨, 및 솔라술폰), 사이클로세린, 뮤피로신 및 튜베린이다.
특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 항-진균제로 코팅 또는 함침될 수 있다. 적절한 항-진균제에는 암포테리신 B, 이트라코나졸, 케노코나졸, 플루코나졸, 인트라테칼, 플루사이토신, 미코나졸, 부토코나졸, 클로트리마졸, 나이스타틴, 테르코나졸, 티오코나졸, 시클로피록스, 에코나졸, 할로프로그린, 나프티핀, 테르비나핀, 운데실레네이트, 및 그리세오풀딘이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
또다른 특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재가 항-염증제로 코팅 또는 함침된다. 유용한 항염증제에는 비-스테로이드성 항-염증 약물 예컨대 살리실산, 아세틸살리실산, 메틸 살리실레이트, 디플루니살, 살살레이트, 올살라진, 술파살라진, 아세트아미노펜, 인도메타신, 술린닥, 에토돌락, 메페남산, 메클로페나메이트 소듐, 톨메틴, 케토롤락, 디클로페낙, 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 소듐, 페노프로펜, 케토프로펜, 플루빈프로펜, 옥사프로진, 피록시캄, 멜록시캄, 암피록시캄, 드록시캄, 피복시캄, 테녹시캄, 나부메톰, 페닐부타존, 옥시펜부타존, 안티피린, 아미노피린, 아파존 및 니메술리드; 질류톤, 오로티오글루코스, 골드 소듐 티오말레이트 및 오라노핀이 포함되지만 이에 한정되지 않는 류코트리엔 길항제; 및 메토트렉세이트, 콜히친, 알로퓨리놀, 프로베네시드, 술핀피라존 및 벤즈브로마론이 포함되지만 이에 한정되지 않는 기타 항-염증제가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재가 항-바이러스제로 코팅 또는 함침된다. 유용한 항바이러스제에는 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 지도부딘, 아시클로비어, 갱시클로비어, 비다라빈, 이독수리딘, 트리플루리딘, 및 리바비린, 뿐만 아니라 포스카르넷, 아만타딘, 리만타딘, 사퀴나비어, 인디나비어, 리토나비어, 및 알파-인터페론이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재가 사이토카인 수용체 조정인자로 또한 코팅 또는 함침될 수 있다. 사이토카인 수용체 조정인자의 예로는 가용성 사이토카인 수용체 (예를 들어, TNF-α 수용체 또는 이의 단편의 세포외 도메인, IL-10 수용체 또는 이의 단편의 세포외 도메인, 및 IL-6 수용체 또는 이의 단편의 세포외 도메인), 사이토카인 또는 이의 단편 (예를 들어, 인터류킨 (IL)-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, TNF-α, TNF-β, 인터페론 (IFN)-α, IFN-β, IFN-γ, 및 GM-CSF), 항-사이토카인 수용체 항체 (예를 들어, 항-IFN 수용체 항체, 항-IL-2 수용체 항체 (예를 들어, 제나팍스(Zenapax) (Protein Design Labs)), 항-IL-4 수용체 항체, 항-IL-6 수용체 항체, 항-IL-10 수용체 항체, 및 항-IL-12 수용체 항체), 항-사이토카인 항체 (예를 들어, 항-IFN 항체, 항-TNF-α 항체, 항-IL-10 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL-8 항체 (예를 들어, ABX-IL-8 (Abgenix)), 및 항-IL-12 항체)가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 사이토카인 수용체 조정인자는 IL-4, IL-10, 또는 이의 단편이다. 또다른 실시양태에서, 사이토카인수용체 조정인자는 항-IL-1 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL-12 수용체 항체, 또는 항-TNF-α 항체이다. 또다른 실시양태에서, 사이토카인 수용체 조정인자는 TNF-α 수용체 또는 이의 단편의 세포외 도메인이다. 특정 실시양태에서, 사이토카인 수용체 조정인자는 TNF-α 길항제가 아니다.
바람직한 실시양태에서, 면역조정제들로서 사용되는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 (항체 포함)은 이러한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드에 대한 면역 응답의 가능성을 감소시키도록 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 수용자와 동일한 종으로부터 유래된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 대상이 인간인 경우, 면역조정제들로서 사용되는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 인간의 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드, 또는 인간화 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드이다.
콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재가 사이토카인으로 또한 코팅 또는 함침될 수 있다. 사이토카인의 예로는 콜로니 자극 인자 1 (CSF-1), 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-4 (IL-4), 인터류킨-5 (IL-5), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-7 (IL-7), 인터류킨-9 (IL-9), 인터류킨-10 (IL-10), 인터류킨-12 (IL-12), 인터류킨 15 (IL-15), 인터류킨 18 (IL-18), 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 에리트로포이에틴 (Epo), 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF) (염기성 또는 산성), 과립구 대식세포 자극 인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 헤파린 결합 표피 성장 인자 (HEGF), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 프로락틴, 및 인터페론 (IFN), 예를 들어, IFN-알파, 및 IFN-감마), 전환 성장 인자 알파 (TGF-α), TGFβ1, TGFβ2, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 간세포 성장 인자 (HGF) 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
콜라겐 바이오패브릭이 호르몬으로 또한 코팅 또는 함침될 수 있다. 호르몬의 예로는 황체형성 호르몬 방출 호르몬 (LHRH), 성장 호르몬 (GH), 성장 호르몬 방출 호르몬, ACTH, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 소마토메딘, 부갑상샘 호르몬, 시상하부 방출 인자, 인슐린, 글루카곤, 엔케팔린, 바소프레신, 칼시토닌, 헤파린, 저분자량 헤파린, 헤파리노이드, 합성 및 천연 아편유사물질, 인슐린 갑상샘 자극 호르몬, 및 엔돌핀이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. β-인터페론의 예로는 인터페론 β 1-a 및 인터페론 β 1-b가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재가 알킬화제로 코팅 또는 함침될 수 있다. 알킬화제의 예로는 질소 머스타드, 에틸렌이민, 메틸멜라민, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아, 트리아젠, 메클로르에타민, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 헥사메틸멜라인, 티오테파, 부술판, 카르무스틴, 스트렙토조신, 다카르바진 및 테모졸로미드가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재가 메토트렉세이트, 레플루노미드, 시클로포스파미드, 시클로스포린 A, 마크롤라이드 항생제들 (예를 들어, FK506 (타크롤리무스)), 메틸프레드니솔론 (MP), 코르티코스테로이드, 스테로이드, 마이코페놀레이트 모페틸, 라파마이신(시롤리무스), 미조리빈, 데옥시스페르구알린, 브레퀴나르, 말로노니트릴로아미드 (예를 들어, 레플루나미드), T 세포 수용체 조정인자, 및 사이토카인 수용체 조정인자, 펩티드 모방체, 및 항체 (예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, Fv, ScFv, Fab 또는 F(ab)2 단편 또는 에피토프 결합 단편), 핵산 분자 (예를 들어, 안티센스(antisense) 핵산 분자 및 삼중 나선), 소형 분자, 유기 화합물, 및 무기 화합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 면역조정제로 또한 코팅 또는 함침될 수도 있다. 특히, 면역조정제에는 메토트렉세이트, 레플루노미드, 시클로포스파미드, 사이톡산, 이뮤란, 시클로스포린 A, 미노사이클린, 아자티오프린, 항생제 (예를 들어, FK506 (타크롤리무스)), 메틸프레드니솔론 (MP), 코르티코스테로이드, 스테로이드, 마이코페놀레이트 모페틸, 라파마이신 (시롤리무스), 미조리빈, 데옥시스페르구알린, 브레퀴나르, 말로노니트릴로아미드 (예를 들어, 레플루나미드), T 세포 수용체 조정인자, 및 사이토카인 수용체 조정자가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. T 세포 수용체 조정인자의 예로는 항-T 세포 수용체 항체 (예를 들어, 항-CD4 항체 (예를 들어, cM-T412 (Boeringer), IDEC-CE9.Is (IDEC 및 SKB), mAb 4162W94, 오르토클론(Orthoclone) 및 OKTcdr4a (Janssen-Cilag)), 항-CD3 항체 (예를 들어, 누비온(Nuvion) (Product Design Labs), OKT3 (Johnson & Johnson), 또는 리툭산((Rituxan) (IDEC)), 항-CD5 항체 (예를 들어, 항-CD5 리신-연결 면역접합체), 항-CD7 항체 (예를 들어, CHH-380 (Novartis)), 항-CD8 항체, 항-CD40 리간드 모노클로날 항체 (예를 들어, IDEC-131 (IDEC)), 항-CD52 항체 (예를 들어, CAMPATH 1H (Ilex)), 항-CD2 항체, 항-CD1 1a 항체 (예를 들어, 자넬림(Xanelim) (Genentech)), 및 항-B7 항체 (예를 들어, IDEC-114) (IDEC))) 및 CTLA4-면역글로뷸린이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, T 세포 수용체 조정인자는 CD2 길항제이다. 또다른 실시양태에서, T 세포 수용체 조정인자는 CD2 길항제가 아니다. 또다른 특정 실시양태에서, T 세포 수용체 조정인자는 CD2 결합 분자, 바람직하게는 MEDI-507이다. 또다른 실시양태에서, T 세포 수용체 조정인자는 CD2 결합 분자가 아니다.
콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재가 IMiD®로 공지된 면역조정 화합물 클래스로 또한 코팅 또는 함침될 수 있다. 달리 지시되지 않는 한 본원에서 사용된 용어 "IMiD®" (Celgene Corporation)은 TNF-α, LPS-유도 단핵구 IL-1β 및 IL12를 현저하게 억제하고, IL6 생산 부분적으로 억제하는 소형 유기 분자를 포함한다. 구체적인 면역조정 화합물이 하기에 논의된다.
이같은 면역조정 화합물의 구체적인 예로는 치환된 스티렌의 시아노 및 카르복시 유도체 예컨대 미국 특허 번호 5,929,117에 개시된 것들; 1-옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3-일)이소인돌린 및 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3-일)이소인돌린 예컨대 미국 특허 번호 5,874,448 및 5,955,476에 기술된 것들; 미국 특허 번호 5,798,368에 기술된 테트라-치환 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-옥소이소인돌린; 미국 특허 번호 5,635,517, 6,476,052, 6,555,554, 및 403,613호에 개시된 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 1-옥소 및 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린 (예를 들어, 탈리도미드의 4-메틸 유도체); 미국 특허 6,380,239에 기술된, 인돌린 고리의 4- 또는 5-위치에서 치환된 1-옥소 및 1,3-디옥소이소인돌린 (예를 들어, 4-(4-아미노-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-4-카르바모일부타논산); 미국 특허 번호 6,458,810에 기술된, 2-위치에서 2,6-디옥소-3-히드록시피페리딘-5-일로 치환된 이소인돌린-1-온 및 이소인돌린-1,3-디온 (예를 들어, 2-(2,6-디옥소-3-히드록시-5-플루오로피페리딘-5-일)-4-아미노이소인돌린-1-온); 미국 특허 번호 5,698,579 및 5,877,200에 개시된 비-폴리펩티드 고리형 아미드 클래스; 아미노탈리도미드, 뿐만 아니라 아미노탈리도미드의 유사체, 가수분해 생성물, 대사산물, 유도체 및 전구체, 및 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일) 프탈리미드 및 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-옥소이소인돌 예컨대 미국 특허 번호 6,281,230 및 6,316,471에 기술된 것들; 및 이소인돌-이미드 화합물 예컨대 미국 특허 출원 번호 09/972,487 (2001년 10월 5일 출원), 미국 특허 출원 번호 10/032,286 (2001년 12월 21일 출원), 및 국제 출원 번호 PCT/US01/50401 (국제 공개 번호 WO 02/059106)에 기술된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본원에서 확인된 특허 및 특허 출원 각각의 전문이 거명에 의해 본원에 포함된다. 면역조정 화합물은 탈리도미드를 포함하지 않는다
콜라겐에 코팅 또는 함침되는 생체활성 화합물의 양은 변할 수 있고, 바람직하게는 전달될 특정 생체활성 화합물 및 원하는 효과에 좌우될 것이다.
다양한 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭은 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 100, 1250, 1500, 2000, 2500, 300, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000 또는 적어도 1000000 나노그램의 생체활성 화합물로 코팅 또는 함침될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 안구 플러그는 최대 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 100, 1250, 1500, 2000, 2500, 300, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000 또는 적어도 1000000 나노그램의 생체활성 화합물로 코팅 또는 함침될 수 있다.
5.6.3. 콜라겐 바이오패브릭의 형상
콜라겐 바이오패브릭은 본 발명의 방법에서 이를 사용하는 것을 용이하게 하는 임의의 모양 또는 형상으로 성형될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭이 줄기 세포의 배양을 용이하게 하는 임의의 모양 또는 형상으로 성형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 배양 플레이트 내에 있고, 배양 플레이트에 따라 모양이 잡힌다. 또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 마이크로웰 플레이트의 웰 내에 있고, 마이크로웰 플레이트의 웰에 따라 모양이 잡힌다.
본 발명의 치료 방법에서 유용한 콜라겐 바이오패브릭은 건조 상태로 또는 생리적으로 혼화성이고 의학적으로 유용한 적절한 액체, 예컨대 생리식염수로 미리 습윤화되어 최종 사용자에게 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 생리식염수가 비제한적으로 상기 섹션 5.6.2에 기술된 바와 같은 하나 이상의 생체활성 화합물을 포함한다.
5.6.4. 콜라겐 바이오패브릭의 제조 방법
양막, 융모막 또는 양쪽 모두로부터 제조된 콜라겐 바이오패브릭은 막의 성분들 (주로 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌, 및 피브로넥틴)의 생화학적 및 구조적 특징을 보존하는 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 바람직한 재료는 전문이 본원에 포함된, 발명의 영문 명칭이 <Collagen Biofabric and Methods of Preparation and Use Therefor>인 미국 출원 공보 번호 U.S. 2004/0048796 A1 (Hariri)에 기술되어 있고 이에 개시된 방법에 따라 생산된 콜라겐 바이오패브릭이다.
바람직하게는, 비-인간 포유동물로부터의 양막으로부터 콜라겐 바이오패브릭이 제조될 수 있지만, 줄기 세포 배양에 사용된 콜라겐 바이오패브릭은 인간 대상에서의 사용을 위해 인간 태반으로부터 유래된다. 콜라겐 바이오패브릭이 비-인간 동물에서 사용되는 경우, 콜라겐 바이오패브릭이 이러한 동물 종으로부터의 태반에서 유래되는 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 태반은 신생아의 분만 후 가능한 한 빠르게 취해진다. 태반을 즉시 사용할 수 있거나, 또는 임의의 추가적인 처리 전에 분만 시점으로부터 2-5일 동안 보관할 수 있다. 전형적으로, 태반을 방혈시키고, 즉 출산 후 잔류하는 제대혈을 배수시킨다. 바람직하게는, 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여, HIV, HBV, HCV, HTLV, 매독, CMV, 및 태반 조직을 오염시키는 것으로 공지된 기타 바이러스성 병원체들을 포함하지만 이에 한정되지 않는 전염병에 대해, 출산 전에 임부를 스크리닝한다.
본 발명의 콜라겐 바이오패브릭을 제조하는 한 대표적인 방법은 하기 단계들을 포함한다:
단계 I. 제대를 태반 원반으로부터 분리하고; 선택적으로, 양막을 융모막으로부터 분리한다. 바람직한 실시양태에서, 태반 막을 절단하기 전에 양막을 융모막으로부터 분리한다. 융모막 및 태반 원반으로부터 양막을 분리한 후, 제대 밑둥(stump)을, 예를 들어, 가위로 절단하고, 태반 원반으로부터 떼어낸다. 그후, 양막을 무균성 생리 식염수 (바람직하게는 완충됨), 예컨대 0.9％ 무균성 NaCl 용액에 보관할 수 있다. 바람직하게는, 적어도 2℃의 온도에서, 냉장에 의해 양막을 보관한다.
단계 II. 양막이 실질적으로 탈세포화된다; 즉, 실질적으로 모든 세포 물질 및 세포 잔해물 (예를 들어, 모든 눈에 보이는 세포 물질 및 세포 잔해물)이 제거된다. 당업자에게 공지된 임의의 탈세포화 프로세스를 사용할 수 있지만, 일반적으로, 본 발명의 양막을 탈세포화하는데 사용된 프로세스는 바이오패브릭을 구성하는 단백질의 천연 형상을 파괴하지 않는다. 양막의 "실질적인 탈세포화"는 바람직하게는 적어도 90％의 세포를 제거하고, 더욱 바람직하게는 적어도 95％의 세포를 제거하며, 가장 바람직하게는 적어도 99％의 세포 (예를 들어, 섬유모세포, 양막세포(amniocyte) 및 융모막세포(chorionocyte))를 제거한다. 본 발명의 방법에 따라 탈세포화된 양막들은 건조 상태의 고유 두께 편차가 약 2 내지 약 150 마이크로미터이면서 균일하게 얇고, 매끄러우며 (촉감에 의해 결정됨), 외관이 투명하다. 탈세포화는, 무균성 용액으로 헹구는 것과 조합하여 물리적 스크레이핑(scraping) (예를 들어, 무균성 세포 스크레이퍼(scraper)를 사용)을 포함할 수 있다. 사용된 탈세포화 기술로 양막의 해부학적 구조의 총체적인 파괴가 초래되거나 양막의 생물역학적 성질이 변하지 않아야 한다. 바람직하게는, 양막의 탈세포화는 세제-함유 용액, 예컨대 비이온성 세제, 트리톤(Triton) X-100, 음이온성 세제, 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 것을 포함한다. 임의의 순한 음이온성 세제, 즉, pH 6가 내지 8이고 저-발포성인 비-부식성 세제가 양막의 탈세포화에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 0.01-10％ 데옥시콜린산 소듐 염 1수화물이 양막의 탈세포화에 사용된다.
바이오패브릭의 제조에서 프로테아제 활성을 제한하는 것이 매우 바람직하다. 용해, 헹굼 및 보관 용액에 대한 첨가제 예컨대 금속 이온 킬레이터, 예를 들어 1,10-페난트롤린 및 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)는 다수의 단백질용해성 효소에 불리한 환경을 생성시킨다. 콜라겐분해효소와 같은 프로테아제에 준-최적의 조건을 제공하는 것은 콜라겐과 같은 양막 성분들을 세포 용해 단계 동안의 분해로부터 보호하는 것을 돕는다. 프로테아제에 대한 준-최적 조건은 용액 내의 이용가능한 칼슘 및 아연 이온의 양을 제거하거나 제한하기 위해 저장성(低張性) 용해 용액을 제형함으로써 달성될 수 있다. 다수의 프로테아제들은 칼슘 및 아연 이온의 존재 하에 활성이고, 칼슘 및 아연 이온이 없는 환경에서는 활성이 많이 손실된다. 바람직하게는, 저장성 용해 용액은, 기저를 이루는 양막을 불리한 단백질용해성 분해로부터 보호하면서 용액이 천연 세포를 최적으로 용해시킬 수 있도록, pH 조건, 칼슘 및 아연 이온의 감소된 이용가능성, 금속 이온 킬레이터의 존재 및 콜라겐분해효소에 특이적인 단백질용해성 억제제들의 사용을 선택함으로써 제조될 것이다. 예를 들어, pH 5.5 내지 8, 바람직하게는 pH 7 내지 8이고, 칼슘 및 아연 이온이 없으며, EDTA와 같은 금속 이온 킬레이터를 포함하는 물의 완충 용액을 저장성 용해 용액이 포함할 수 있다. 추가적으로, 저장성 용해 용액으로 양막을 처리하는 동안 온도 및 시간 파라미터를 제어하는 것이 프로테아제의 활성을 제한하는데 또한 이용될 수 있다.
양막의 탈세포화 처리가 새로운 면역학적 부위의 생성을 또한 제한하는 것이 바람직하다. 효소에 의한 콜라겐의 분해는 상승된 면역원성에 이르는 것으로 여겨지기 때문에, 본 발명은 양막의 조성물의 단백질용해를 최소화하여 양막의 기저를 이루는 구조를 보존하는, 세포성 대사, 단백질 생산 및 세포 분열을 억제하는데 효과적인 효소, 예를 들어, 뉴클레아제로 양막을 처리하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 뉴클레아제의 예는 엑소뉴클레아제(exonuclease) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 모두를 포함하는, 천연 세포 DNA 및 RNA의 소화에 효과적인 것들이다. 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 뉴클레아제의 비-제한적인 예로는 세포 활성을 억제하는 엑소뉴클레아제, 예를 들어, DNase I (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.) 및 RNase A (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.) 및 세포 활성을 억제하는 엔도뉴클레아제, 예를 들어, EcoRI (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.) 및 HindIII (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.)가 포함된다. 선택된 뉴클레아제가 뉴클레아제의 활성에 최적인 이온, 예를 들어, 마그네슘, 칼슘을 함유하는 생리적 완충 용액으로 적용되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 완충 용액의 이온 농도, 처리 온도 및 처리 기간은 원하는 수준의 뉴클레아제 활성을 확실하게 하도록 통상적인 실험에 의해 당업자에 의해 선택된다. 세포 내부에 대한 뉴클레아제의 접근을 촉진하도록 완충제가 저장성인 것이 바람직하다.
상기 단계 I 및 II의 또다른 실시양태에서, 초기 프로세싱 후, 태반을 식염수에서 간략하게 헹궈서 태반 표면으로부터 혈액을 제거한다. 그후, 태반 원반을 약 0.1％ 내지 약 10％ (특정 실시양태에서 약 0.1％ 내지 약 2.0％) 농도의 저온 데옥시콜린산 용액에 침지시킨다. 그후, 태반을 약 1℃ 내지 약 8℃ 사이에서, 약 5일 내지 약 6개월 동안 인큐베이션한다. 특정 실시양태에서, 태반 원반이, 예를 들어, 약 5 내지 약 15일; 약 5 내지 약 30일, 약 5 내지 약 60일 동안, 또는 약 1년까지 침지된다. 전형적으로, 인큐베이션 동안 2-5일 마다 데옥시콜린산 용액을 교체한다. 또다른 특정 실시양태에서, 태반 원반을 0℃ 내지 약 8℃의 온도에서 약 5일 내지 약 15일 동안 약 1％ 농도의 데옥시콜린산 용액에 침지시킨다. 이러한 인큐베이션은 2가지 목적을 만족시킨다. 첫째로, 혈청학적 기준을 충족시키지 않는 태반이 추가로 프로세싱되지 않도록 태반 물질 및 혈액에 대해 혈청학적 테스트가 수행될 시간을 허용한다. 둘째로, 더욱 긴 인큐베이션은 상피 세포 및 섬유모세포의 제거를 개선하고, 이는 물리적 스크레이핑에 의해 양막을 탈세포화시키는데 소모되는 시간의 양을 상당히 감소시킨다. 전형적으로, 스크레이핑 시간이, 예를 들어, 약 40분에서 약 20분으로 감소된다. 그후, 양막을 하기 기술된 바와 같이 건조시킨다.
단계 III. 탈세포화 후, 세포성 단백질, 세포성 지질 및 세포성 핵산을 포함할 수 있는 세포성 잔해물, 뿐만 아니라 세포외 잔해물 예컨대 세포외 가용성 단백질, 지질 및 프로테오글리칸의 제거를 확실히 하기 위해 양막을 세정한다. 세정 용액은 탈이온수 또는 수성 저장성 완충제일 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어, 진동 플랫폼 상에서, 양막을 15-120분 동안 세제 내에서 부드럽게 진탕시켜, 탈세포화를 돕는다. 세제 탈세포화 후, 양막을 다시 상기 기술된 바와 같이 물리적으로 탈세포화시킬 수 있다; 양막의 온전성이 유지되는 한, 눈에 보이는 세포성 물질 및 세포성 잔해물이 남지 않을 때까지, 물리적 및 세제 탈세포화 단계를 필요하다면 반복할 수 있다.
특정 실시양태에서, 탈세포화 및 세정 단계 후 즉각적으로 (즉, 30분 이내에) 양막을 건조시킨다. 별법적으로, 추가적인 프로세싱이 즉각적으로 실행되지 않는 경우, 양막을 냉장할 수 있고, 예를 들어, 약 1℃ 내지 약 20℃, 바람직하게는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 건조 전에 28일까지 보관할 수 있다. 탈세포화된 양막을 3일 초과, 28일 미만 동안 보관하는 경우, 양막을 덮는 무균성 용액을 주기적으로, 예를 들어 1-3일 마다 교체하는 것이 바람직하다.
특정 실시양태에서, 세정 후 양막을 냉장하지 않는 경우, 제조 단계 Ⅳ로 진행하기 전에 양막을 3회 이상 세정한다. 또다른 실시양태에서, 양막을 냉장하고 무균성 용액을 1회 교체했을 때, 제조 단계 Ⅳ로 진행하기 전에 양막을 2회 이상 세정한다. 또다른 실시양태에서, 양막을 냉장하고 무균성 용액을 2회 이상 교체했을 때, 제조 단계 Ⅳ로 진행하기 전에 양막을 1회 이상 세정한다
단계 Ⅳ로 진행하기 전에, 모든 세균학적 및 혈청학적 테스트를 평가하여 모든 테스트가 음성임을 확실하게 하는 것이 바람직하다.
단계 IV. 콜라겐 바이오패브릭 생산 방법의 이러한 실시양태에서의 최종 단계는 본 발명의 탈세포화된 양막을 건조시켜 콜라겐 바이오패브릭을 생산하는 것을 포함한다. 콜라겐의 편평하고 건조한 시트가 생산되도록 양막을 건조시키는 임의의 방법을 사용할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 양막을 진공 건조시킨다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 탈세포화된 양막을 건조시키는 대표적인 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
건조를 위한 탈세포화된 양막의 어셈블리. 탈세포화된 양막을 무균성 용액으로부터 제거하고, 과량의 유체를 부드럽게 짜낸다. 그후, 탈세포화된 양막을, 예를 들어 트레이 상에서, 태아 측면이 아래쪽 위치를 향하도록 하여 편평할 때까지 부드럽게 잡아당긴다. 그후, 탈세포화된 양막을 태아 측면이 위쪽을 향하도록 뒤집어서, 건조 프레임, 바람직하게는 플라스틱 메쉬 건조 프레임 (예를 들어, 퀵 카운트(QUICK COUNT)® 플라스틱 캔버스(Plastic Canvas), Uniek, Inc. (Waunakee, WI))에 놓는다. 또다른 실시양태에서, 건조 프레임은 스테인레스 스틸 메쉬를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 임의의 고압멸균가능한(autoclavable) 물질일 수 있다. 가장 바람직한 실시양태에서, 약 0.5 ㎝의 양막이 건조 프레임의 가장자리에서 삐죽 나온다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 클램프(clamp) 또는 지혈기를 사용하여, 건조 프레임 너머로 내밀어진 삐죽 나온 양막을 프레임의 상부 위로 감싼다. 일단 양막이 건조 프레임 상에 놓이면, 플라스틱 메쉬 건조 프레임 상에 놓인 양막보다 약간 더 넓은 면적이 덮이도록 무균성 거즈(gauze)를 열 건조기 (또는 젤-건조기) (예를 들어, 583 모델, Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA))의 건조 플랫폼 상에 놓는다. 바람직하게는, 거즈 층의 총 두께는 한번 접힌 4×4 거즈의 두께를 초과하지 않는다. 시트-유사 물질을 건조하는데 적절한 임의의 열 건조 장치가 사용될 수 있다. 플라스틱 프레임의 가장자리가 거즈 가장자리를 너머서, 바람직하게는 0.1 내지 1.0 ㎝ 사이, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1.0 ㎝ 내밀어지도록 건조 프레임을 건조 플랫폼 상의 거즈의 상부에 놓는다. 가장 바람직한 실시양태에서, 양막의 태아 측면이 위쪽을 향하면서 양막이 있는 건조 프레임이 무균성 거즈의 상부에 놓인다. 일부 실시양태에서, 또다른 플라스틱 프레임 메쉬가 양막의 상부에 놓인다. 또다른 실시양태에서, 얇은 플라스틱 시트 (예를 들어, 투명한 PVC인 SW 182, AEP Industries Inc. (South Hackensack, NJ)) 또는 생체적합성 실리콘이 막으로 덮인 메쉬의 상부에 시트가 모든 가장자리 너머로 잘 내밀어지도록 놓인다. 이러한 실시양태에서, 제2 메쉬 프레임이 필요하지 않다.
별법적인 실시양태에서, 양막을 TYVEK® 재료의 하나 이상의 무균성 시트 (예를 들어, 의료 포장용 TYVEK®의 시트, Dupont TYVEK®, Wilmington, DE) 상에 놓고, 선택적으로 TYVEK® 시트 하나를 막의 상부에 놓는다 (플라스틱 필름을 놓기 전에). 이러한 별법적인 공정으로 더 매끄러운 버젼의 바이오패브릭이 생산될 수 있고 (즉, 재료의 축을 따라 이에 수직인 차별적인 섬유 압착 영역의 패턴이 없음), 이는 특정 용도, 예를 들어, 세포 확장에 대한 매트릭스로서의 사용에 유리할 수 있다,
양막의 건조. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 양막을 진공 하에 열 건조시키는 것을 포함한다. 진공 하에서의 건조는 약 0℃ 내지 약 60℃의 임의의 온도에서 달성될 수 있지만, 양막은 바람직하게는 약 35℃ 내지 약 50℃ 사이, 가장 바람직하게는 약 50℃에서 건조된다. 약 50℃를 초과하는 온도에서 콜라겐의 약간의 분해가 예상된다는 것을 주지하여야 한다. 연장된 탐침을 사용하는 눈금 디지털 온도계를 사용하여 건조 온도를 설정 및 확인하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 진공 압력을 약 -22 인치의 Hg로 설정한다. 양막의 콜라겐 매트릭스가 실질적으로 건조할 때까지, 즉, 수분 측정기로 예를 들어 측정시 20 중량％ 미만의 수분, 바람직하게는 약 3-12 중량％의 수분을 함유할 때까지 건조 단계를 계속한다. 이를 이루기 위해, 예를 들어, 약 60분 동안, 양막을 열-진공 건조시켜 탈수된 양막이 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 양막을 약 30분 내지 2 시간, 바람직하게는 약 60분 동안 건조시킨다. 어떠한 작용 메커니즘에에 의해서도 속박되기를 원치 않지만, 진공 압력과 결합된 저열 환경은 콜라겐을 변성시키지 않으면서 양막이 탈수 상태가 되도록 하는 것으로 여겨진다.
본 발명에 따른 건조 공정의 완료 후, 진공 펌프를 가동시키면서 양막을 약 2분 동안 냉각한다.
양막의 포장 및 보관. 일단 양막이 건조되면, 막을 건조 프레임으로부터 부드럽게 들어올린다. 막의 "들어올림"은 하기의 단계들을 포함할 수 있다: 펌프를 여전히 가동시키면서, 양막을 아래로 잡으면서 귀퉁이에서 시작하여 양막으로부터 플라스틱 필름을 부드럽게 제거한다; 양막이 있는 프레임을 건조 플랫폼에서 들어올리고, 양막 측면이 위쪽을 향하도록 하여 절단판 상에 놓는다; 프레임의 가장자리로부터 1-2 ㎜ 떨어진 가장자리를 따라 절단하면서 절개가 이루어진다; 양막을 프레임으로부터 벗겨낸다. 바람직하게는, 이러한 단계에서 무균성 장갑을 끼고 양막을 취급한다.
양막을 무균성 컨테이너, 예를 들어, 필(peel) 파우치에 놓고, 밀봉할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭의 적어도 일부분이 배양 접시 또는 멀티웰 플레이트에 놓기에 적절한 조각들로 세분된다. 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭의 하나 이상의 원형 조각을 콜라겐 바이오패브릭이 배양 접시 또는 멀티웰 플레이트의 바닥 (예를 들어, 배양 표면)의 적어도 일부분을 덮도록 배양 접시 또는 멀티웰 플레이트 내에 놓을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 페트리 접시의 전체 원형 배양 표면, 또는 멀티웰 플레이트의 하나 이상의 웰의 원형 배양 표면이 콜라겐 바이오패브릭으로 완전하게 덮일 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 생산된 바이오패브릭을, 단독으로 또는 전형적인 조직 배양 접시 또는 멀티웰 플레이트와 함께, 상기 기술된 바와 같이 장기간 동안 실온에서 보관할 수 있다.
별법적인 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 융모막, 또는 융모막 및 양막 모두를 포함할 수 있다. 상기 기술된 방법들이 융모막, 또는 융모막 및 양막 모두를 포함하는 바이오패브릭의 제조 방법에 적용가능할 것으로 예상된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 양막 및 융모막을 포함하는 태반을 제공하고; 양막을 융모막으로부터 분리하고; 융모막을 탈세포화시킴으로써 제조된 콜라겐 바이오패브릭의 사용을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이오패브릭의 제조는 탈세포화된 융모막의 세정 및 건조를 추가로 수반한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 양막 및 융모막을 포함하는 태반을 제공하고, 양막 및 융모막을 탈세포화시킴으로써 제조된 콜라겐 바이오패브릭의 사용을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 방법은 탈세포화된 양막 및 융모막의 세정 및 건조를 추가로 수반한다.
5.6.5. 콜라겐 바이오패브릭의 보관 및 취급
탈수된 콜라겐 바이오패브릭을, 예를 들어, 탈수 시트로서, 사용 전에 실온 (예를 들어, 25℃)에서 보관할 수 있다. 특정 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭을 적어도 10℃, 적어도 15℃, 적어도 20℃, 적어도 25℃, 또는 적어도 29℃의 온도에서 보관할 수 있다. 바람직하게는, 탈수된 형태의 콜라겐 바이오패브릭이 냉장되지 않는다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 냉장될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 생산된 바이오패브릭은 콜라겐 바이오패브릭의 생화학적 또는 생체물리학적 성질의 어떠한 변동도 없이, 생화학적 또는 구조적 온전성이 변동되지 않으면서 (예를 들어, 분해되지 않음), 임의의 상술된 온도에서 12개월 이상 동안 보관될 수 있다. 콜라겐 바이오패브릭의 생화학적 또는 생체물리학적 성질의 어떠한 변동도 없이, 생화학적 또는 구조적 온전성이 변동되지 않으면서 (예를 들어, 분해되지 않음), 바이오패브릭이 수년 동안 보관될 수 있다. 바이오패브릭은 기관 보관에 적절한 임의의 컨테이너에서 보관될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭은 무균성의 이중 필-파우치 포장으로 보관된다.
콜라겐 바이오패브릭은 줄기 세포, 예를 들어 배아 줄기 세포의 배양, 확장 또는 분화 전에 전형적으로 수화된다. 무균성의 생리학적 완충제를 예를 들어 사용하여 콜라겐 바이오패브릭을 재수화시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 무균성 생리 식염수는 0.9％ NaCl 용액이다. 일부 실시양태에서, 무균성 생리 식염수가 완충된다. 바람직하게는, 줄기 세포의 배양, 확장 또는 분화 전에, 콜라겐 바이오패브릭이 배양 배지, 예를 들어, DMEM, 줄기 세포 배양 배지 또는 섹션 4.2.1에 기술된 배양 배지에서 재수화된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭의 수화는 적어도 2분, 적어도 5분, 적어도 10분, 적어도 15분, 또는 적어도 20분을 필요로 한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭의 수화는 5분 내에 완료된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭의 수화는 10분 내에 완료된다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭의 수화는 10분을 초과하지 않는다. 일단 수화되면, 용액을 예를 들어 3일마다 교환하면서 콜라겐 바이오패브릭이 용액, 예를 들어, 무균성 0.9％ NaCl 용액에서 6개월까지 유지될 수 있다.
5.6.6. 멸균
바이오패브릭의 멸균은 임의의 의학적으로 적합한 방법, 바람직하게는 막 단백질을 현저하게 가교시키거나 변성시키지 않는 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 기체, 예를 들어, 에틸렌디옥시드를 사용하여, 멸균이 달성될 수 있다. 멸균은 방사선, 예를 들어, 감마 방사선을 사용하여 달성될 수 있고, 바람직하게는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, [Gorham, D. Byrom(ed.), 1991, Biomaterials, Stockton Press, New York, 55-122]을 사용하여 전자 빔(beam) 조사에 의해 수행된다. 99.9％ 이상의 세균 또는 잠재적으로 오염을 일으키는 기타 유기체를 사멸시키는데 충분한 임의의 방사선량이 본 발명의 범주 내에 속한다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 18-25 kGy의 선량이 바이오패브릭의 최종 멸균을 달성하는데 사용된다.
5.6.7. 적층물
본 발명은 세포를 콜라겐 바이오패브릭의 적층물과 함께 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는 줄기 세포의 배양, 확장 또는 분화를 추가로 제공한다. 이같은 콜라겐 바이오패브릭은 실질적으로 편평하거나 (예를 들어, 세포 배양에 적절) 또는 3차원일 수 있다.
2개 이상의 콜라겐 바이오패브릭 층을 하나를 다른 하나의 위에 쌓고, 밀봉 또는 건조함으로써 콜라겐 바이오패브릭이 전형적으로 적층된다. 건조된 상태로 또는 재수화 후에 콜라겐 바이오패브릭이 적층될 수 있다. 별법적으로, 예를 들어 양막의 2개 이상의 층이 세포 제거 (예를 들어, 세포 스크레이핑 단계를 통한 제거) 후 초기 건조 전에 적층될 수 있다 (하기 실시예 참조). 초기 건조 전에 적층되는 경우, 2개 이상의 콜라겐 바이오패브릭 층이 하나가 다른 하나의 위에 쌓이고, 이어서, 예를 들어, 냉장-건조 공정 또는 진공과 함께 또는 진공 없이 중등도 가열 하에서의 건조를 사용하여 건조된다. 적용된 열이 콜라겐 바이오패브릭의 단백질 성분, 특히 콜라겐의 파손 또는 분해를 야기하도록 강하지 않은 것이 바람직하다. 전형적으로, 적용된 열은 약 70℃ 이하, 바람직하게는 약 60℃ 이하, 더욱 바람직하게는 약 50℃이다. 적층 시간은 예를 들어 적층될 층의 개수에 따라 가변적이지만, 고막 복원에 사용되는 콜라겐 바이오패브릭의 크기 조각들에 대해 50℃에서 전형적으로 1-2 시간 걸린다.
콜라겐 바이오패브릭 또는 양막의 2개 이상의 층 사이에 도포되는 접착제를 사용하여 콜라겐 바이오패브릭을 또한 적층시킬 수 있다. 이같은 접착제는 바람직하게는 의학 용도에 적합하고, 천연의 생물학적 접착제, 예를 들어 피브린 글루, 합성 접착제, 또는 이들의 조합물들을 포함할 수 있다. 접착제가 적층 공정 동안 전구체로부터 추가적으로 화학적으로 전환될 수 있다.
5.7. 키트
본 발명의 방법에서 유용한 콜라겐 바이오패브릭이 줄기 세포의 배양, 확장 또는 분화를 용이하게 하기 위한 키트의 일부분으로서 포장재 또는 컨테이너 내에서 제공될 수 있다.
한 실시양태에서, 키트는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 하나 이상의 배양 접시 또는 마이크로웰 플레이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭의 각각의 조각이 배양 접시에서 또는 마이크로웰 플레이트의 각각의 웰에서 제공된다. 또다른 실시양태에서, 키트는 별도로 포장되거나 함유된 2개 이상의 콜라겐 바이오패브릭 조각을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 키트는 줄기 세포의 배양에 적절한 배지를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 키트는 줄기 세포가 성체 세포로 분화되도록 하는 하나 이상의 화합물을 포함한다.
5.8. 콜라겐 바이오패브릭 상에서 배양된 줄기 세포의 용도
본 발명에 따라 배양, 확장, 분화된 줄기 세포에는 다양한 용도가 있다. 줄기 세포는, 예를 들어, 미국 출원 공보 번호 2004/0048796 (이의 내용은 거명에 의해 전문이 포함됨)에 기술된 바와 같이, 당업자에게 공지된 임의의 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 원하는 세포 집단, 예컨대 줄기 세포 또는 기원 세포 집단의 생착(engraftment), 이식 또는 주입에 의해 신체 조직 또는 기관이 증대, 복구 또는 대체되는 생체외 치료 프로토콜 및 이식에서 줄기 세포가 사용될 수 있다. 이들은 기존의 조직의 대체 또는 증대, 새로운 또는 변형된 조직의 도입, 또는 생물학적 조직 또는 구조물의 연결에 또한 사용될 수 있다. 또한 콜라겐 바이오패브릭과 함께 줄기 세포 배양물이 외과 시술에서, 예를 들어, 외과용 이식편으로 사용될 수 있다.
콜라겐 바이오패브릭 상에서 배양된 줄기 세포는 콜라겐 바이오패브릭 없이 사용될 수 있다. 즉, 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 트립신처리 및 세정에 의한 제거에 의해 줄기 세포가 콜라겐 바이오패브릭으로부터 단리될 수 있다. 그리고 나서, 이러한 줄기 세포가 추가적인 줄기 세포 배양에, 또는 줄기 세포를 사용하여 치료가능한 질환, 장애 또는 용태를 치료하는데 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭이 질환, 장애 또는 용태를 치료하는데 사용될 수 있는 임의의 용도에서 줄기 세포가 콜라겐 바이오패브릭과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 출원 공보 번호 20040048796 (Hariri 등), 미국 가출원 번호 60/699,441 (Hariri ＆ Smiell, 2005년 7월 13일 출원); 미국 가출원 번호 60/699,440 (Lin ＆ Ray, 2005년 7월 13일 출원); 및 미국 가출원 번호 60/696,197 (Sulner 등, 2005년 6월 30일 출원) 참조. 또다른 실시양태에서, 콜라겐 바이오패브릭 상에서 분화된 줄기 세포 (예를 들어, 성체 세포)가 조직에 적합한 용도에서 콜라겐 바이오패브릭 없이 사용될 수 있다 (예를 들어, 심장 세포로 분화된 줄기 세포가 심근경색증에서 손상된 조직을 복구하는데 사용될 수 있다). 또다른 실시양태에서, 분화된 줄기 세포가 조직에 적합한 용도에서 자신이 분화된 콜라겐 바이오패브릭과 함께 사용될 수 있다 (예를 들어, 연골 세포로 분화된 줄기 세포가, 예를 들어 손상된 관절을 복구하는데, 콜라겐 바이오패브릭과 함께 사용될 수 있다).
5.9. 화합물을 스크리닝하는 방법
본 발명은 줄기 세포의 확장 또는 분화를 조정하거나 세포의 활성을 조정하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 스크리닝될 화합물은 소형 분자, 약물, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 등, 또는 이같은 후보 화합물들의 라이브러리일 수 있다. 세포는 체세포 또는 줄기 세포일 수 있다. 세포는 천연 발생 세포, 또는 재조합 유전자 생성물을 발현하도록 조작된 세포일 수 있다. 줄기 세포의 정황에서, 콜라겐 바이오패브릭이 배양에서 피더 세포를 대체할 수 있기 때문에, 이 방법은 테스트 화합물의 피더 세포의 교란에 의해 야기되는 2차 효과에 의해 복잡해지는 것이 없다는 장점이 있다.
한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭 세포 배양 시스템을 사용하여 세포에 대한 화합물의 독성을 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 상기 세포를 세포의 생존에 적절한 조건 하에 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하는 단계, 세포를 화합물과 접촉시키는 단계, 및 세포자멸사, 괴사 또는 세포 사멸, 또는 세포자멸사, 괴사 또는 세포 사멸에 대한 경향을 검출하는 단계를 포함한다. 화합물과 접촉되지 않은 세포와 비교하여 세포자멸사, 괴사 또는 세포 사멸, 또는 이에 대한 경향이 검출되면, 상기 화합물은 상기 세포에 대해 독성이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 다수의 상기 줄기 세포의 일부분이고, 이때 각각의 상기 줄기 세포를 다수의 화합물 중 하나와 접촉시켜, 세포자멸사 또는 세포 사멸에 대한 효과가 있는 상기 다수의 화합물의 부분집합을 확인한다.
또다른 양상에서, 본 발명은, 예를 들어, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭 세포 배양 시스템을 사용하여, 줄기 세포의 분화에 대한 화합물의 효과를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 상기 세포를 세포의 분화에 적절한 조건 하에 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하는 것을 포함한다. 세포를 화합물과 접촉시킨다. 그후, 세포를 후보 화합물의 존재 또는 부재 하에 분화 마커에 대해 분석한다. 분화 마커는 세포 표면 마커, 세포 형태, 또는 하나 이상의 차별적으로 발현된 유전자일 수 있다. 변화가 확인되면, 상기 화합물은 상기 세포의 분화에 대한 효과가 있다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 다수의 상기 줄기 세포의 일부분이고, 이때 각각의 상기 줄기 세포를 다수의 화합물 중 하나와 접촉시켜, 상기 줄기 세포의 분화에 대한 효과가 있는 상기 다수의 화합물의 부분집합을 확인한다.
6. 실시예
6.1. 실시예 1: 콜라겐 바이오패브릭의 제조 방법
재료
하기의 재료들을 콜라겐 바이오패브릭의 제조에서 사용하였다.
재료/장비
ㆍ 분만 기록 사본
ㆍ 재료/가족 건강력/사전 동의서 사본
ㆍ 공급원 바코드 표지 (도너(donor) ID 번호)
ㆍ 수집 # (들어오는 재료에 순차적인 번호가 배정된다)
ㆍ 조직 프로세싱 기록 (문서 ID # ANT-19F); 각 로트 번호의 프로세싱의 상세한 기록이 유지된다
ㆍ 인간 태반 (프로세싱 시작 시 48시간보다 오래되지 않음)
ㆍ 무균성 수술용 클램프/지혈기
ㆍ 무균성 가위
ㆍ 무균성 스캘펠(scalpel)
ㆍ 무균성 스테리-랩(Steri-Wrap) 시트
ㆍ 무균성 세포 스크레이퍼 (Nalgene NUNC Int. R0896)
ㆍ 무균성 거즈 (비-무균성 PSS 4416, 멸균됨)
ㆍ 무균성 헹굼용 스테인레스 스틸 트레이
ㆍ 소독된 프로세싱용 스테인레스 스틸 트레이
ㆍ 소독된 플라스틱 통
ㆍ 무균성 0.9％ NaCl 용액 (Baxter 2F7124)
ㆍ 멸균수 (Milli Q plus 09195 또는 Baxter 2F7113)
ㆍ 무균성 표본 컨테이너 (VWR 15704-014)
ㆍ 개인용 보호 장비 (무균성 및 비-무균성 장갑 포함)
ㆍ 공인된 클린룸(Clean Room)
ㆍ 미리 제조된 탈세포화 용액 (D-세포); 0.01-1％ 데옥시콜린산 소듐 일수화물
ㆍ 소독된 통
ㆍ 진동 플랫폼 (VWR 모델명 100)
ㆍ 타이머 (VWR 21376890)
ㆍ 소독된 플라스틱 프레임 메쉬
ㆍ PVC 랩 필름
ㆍ 진공 펌프 (Schuco-Vac 5711-130)
ㆍ 젤 건조기 (즉, 열 건조기; BioRad 모델 583)
ㆍ 소독된 스테인레스 스틸 절단판
ㆍ 포장용 파우치
ㆍ 무균성 스테인레스 스틸 자 (General Tools MFG. Co 1201)
ㆍ 추적가능형 디지탈 온도계 (모델 61161-364, Control Company)
ㆍ 아쿠-실(Accu-Seal) 자동 밀봉기 ((Accu-Seal, 모델 630-1B6)
HIV, HBV, HCV, HTLV, 매독, CMV 및 수집될 태반 조직을 오염시킬 수 있는 기타 바이러스성 및 세균성 병원체와 같은 전염병에 대해 출산 시점에 임부를 스크리닝하였다. 모체가 상기 언급된 병원체들에 대해 음성 또는 비-반응성으로 테스트된 도너에서 수집된 조직만이 콜라겐 바이오패브릭을 생산하는데 사용되었다.
정상적인 출산 후, 수축하는 자궁으로부터 태반, 제대 및 제대혈이 자발적으로 방출되었다. 태반, 제대, 및 제대혈을 출산 후 수집하였다. 재료들을 실험실로 운반하여, HEPA 여과 시스템이 있는 클린룸에서 무균 조건 하에 프로세싱하였고, 이때 프로세싱하기 적어도 1시간 전에 상기 여과 시스템을 가동시켰다. 생성물들을 취급하는 동안 항상 장갑 (무균성 또는 비-무균성 장갑을 적합하게 사용)을 착용하였다. 양막/융모막의 미사용 (폐기) 절편 및 조직 프로세싱 동안 생성된 오염액을 모두 가능한 한 빨리 폐기처분하였다.
단계 I.
무균성 스테리-랩 시트를 사용하여 무균성 구역을 설정하고, 하기의 프로세싱용 기구 및 부속품을 그 위에 놓았다.
ㆍ 무균성 트레이 팩
ㆍ 무균성 세포 스크레이퍼
ㆍ 무균성 스캘펠
ㆍ 소독된 프로세싱용 트레이
무균성 팩(pack) ID #을 프로세싱 기록에 기록하였다.
태반을 운송 컨테이너로부터 제거하여, 소독된 스테인레스 스틸 트레이 상에 놓았다. 수술용 클램프 및 가위를 사용하여, 제대를 태반 원반으로부터 약 2 인치에서 절단하였다. 추가적인 프로세싱을 위해 제대를 별도의 무균성 컨테이너에 놓았다. 컨테이너를 조직 ID 바코드로 표지하였다; 존재하는 재료 및 보관 용액(들) (예를 들어, 보존액의 유형)이 확인되었다. 일부 경우에, 또다른 프로젝트에 요청되지 않는다면 제대를 폐기하였다.
태반 막의 가장자리로부터 시작하여, 손가락으로의 비절개 박리를 사용하여 양막을 융모막으로부터 분리하였다. 이는 막을 절단하기 전에 수행되었다.
융모막 및 태반 원반의 전체 표면으로부터 양막을 분리한 후, 양막을 제대 밑둥 주변에서 가위로 절단하고, 태반 원반으로부터 탈착시켰다. 일부 예에서, 조직을 찢지 않으면서 양막과 융모막을 분리하는 것이 가능하지 않으면, 양막 및 융모막을 태반 원반으로부터 1개의 조각으로 절단한 후, 벗겨내어 분리시켰다.
융모막을 또다른 프로젝트에 이용되도록 별도의 표본 컨테이너에 놓았다. 컨테이너를 조직 ID 바코드로 표지하였다; 존재하는 재료 및 보관 용액(들) (예를 들어, 보존액의 유형)이 확인되었고, 이니셜 표기되었으며, 날짜를 적어두었다.
임의의 양막 조각이 여전히 태반 원반에 부착되어 있으면, 이를 원반으로부터 벗겨내었고, 가위로 제대 주변에서 절단하였다. 태반은 또다른 프로젝트에 이용되도록 수송 컨테이너 내로 다시 놓았다.
적합한 데이터를 조직 프로세싱 기록에 기록하였다.
양막을 무균성 0.9％ NaCl 용액이 있는 트레이에서 유지시켰다. 바람직하게 는, 프로세스의 다음 단계 이전에 분만 시점으로부터 최대 72시간 동안 양막을 냉장 보관한다.
단계 II.
양막을 한 번에 한 조각씩 표본 컨테이너로부터 제거하여, 소독된 스테인레스 스틸 트레이 상에 놓았다. 다른 조각들은, 이들이 세정될 준비가 될 때까지, 멸균수로 채워진 별도의 무균성 스테인레스 스틸 트레이에 놓았다. 프로세싱 트레이로부터 여분의 양막 조각들을 제거하고, 멸균수로 채워진 별도의 헹굼 스테인레스 스틸트레이에 놓았다.
혈액, 모체 또는 태아의 유체/물질로 심하게 오염된 경우, 필요에 따라 멸균수를 교체하면서 양막을 헹궜다.
모체 측면이 위쪽을 향하도록 하면서 양막을 프로세싱 트레이 상에 놓았다. 무균성 세포 스크레이퍼를 사용하여, 양막의 모체 측면으로부터 가능한 한 많은 눈에 보이는 오염 및 세포 물질을 조심스럽게 제거하였다. (주: 막이 찢어지는 것을 방지하기 위해 이러한 단계에 최소 압력이 적용되어야 한다). 세포 및 세포성 잔해물의 제거를 보조하기 위해 멸균수를 사용하였다. 양막을 별도의 무균성 스테인레스 스틸 헹굼 트레이에서 멸균수를 사용하여 추가로 헹궜다.
양막을 태아 측면이 위쪽을 향하도록 뒤집고, 프로세싱 트레이 상에 다시 놓고, 멸균수로 헹궜다. 눈에 보이는 세포성 물질 및 잔해물을 세포 스크레이퍼를 사용하여 부드럽게 제거하였다 (주: 막이 찢어지는 것을 방지하기 위해 이러한 단계에 최소 압력이 적용되어야 한다). 세포 및 세포성 잔해물의 제거를 보조하기 위해 멸균수를 사용하였다.
별도의 무균성 헹굼 트레이에서 세정 라운드(round)들 사이에 양막을 멸균수로 헹궜다. 막의 양쪽 측면으로부터 눈에 보이는 세포성 물질 및 잔해물을 전부는 아니여도 대부분 제거하기 위해 필요한 만큼 많은 횟수 (세정 라운드)로 조직을 세정하였다. 헹굼 과정들 사이에 헹굼 트레이에서 멸균수를 교환하였다.
각각의 세정 라운드 후, 프로세싱 트레이를 멸균수로 헹궜다.
모든 또다른 양막 조각들을 동일한 방식으로 프로세싱하고, 동일한 컨테이너에 놓았다. 조직 ID 바코드를 첨부였고, 존재하는 물질 및 보관 용액(들) (예를 들어, 보존액의 유형)을 밝혀두고, 이니셜 및 날짜를 부가하였다.
적합한 정보 및 날짜를 조직 프로세싱 기록에 기록하였다.
단계 III.
양막을 헹굼 트레이로부터 (또는 보관 컨테이너로부터) 제거하고, 과량의 유체를 손가락으로 부드럽게 짜내고, 막을 무균성 표본 컨테이너에 놓았다. 모든 양막이 덮이는 것을 확실하게 하면서 컨테이너를 D-세포 용액으로 150 ㎖ 표식까지 채우고, 컨테이너를 닫았다.
컨테이너를 진동 플랫폼 상의 통에 놓았다. 진동 플랫폼을 작동시키고, 막을 D-세포 용액 내에서 최소 15분, 최대 120분 동안 셋팅 #6에서 진탕시켰다.
단계 Ⅰ에서와 동일한 방식으로 새로운 무균성 기구 및 소독된 트레이로 새로운 무균성 구역을 설정하였다. 무균성 팩 ID #를 프로세싱 기록에 기록하였다.
진탕 완료 후, 진동 플랫폼을 끄고 막을 컨테이너로부터 제거하였다. 막을 새로운 무균성 스테인레스 스틸 프로세싱 트레이에 놓았다. 트레이의 바닥이 덮이도록 무균성 0.9％ NaCl 용액을 첨가하였다.
새로운 무균성 세포 스크레이퍼를 사용하여, 잔류 D-세포 및 세포성 물질 (존재하는 경우)을 조직의 양쪽 측면으로부터 제거하였다. 양쪽 측면 상의 전체 표면으로부터 가능한 한 많은 눈에 보이는 세포성 물질을 제거하기 위해 이러한 단계를 필요한 만큼 많은 횟수로 반복하였다. 막을 세정 라운드들 사이에 별도의 헹굼 트레이에서 무균성 0.9％ NaCl 용액으로 헹궜다. 무균성 0.9％ NaCl 용액을 헹굼 과정들 사이에 헹굼 트레이에서 교환하였다.
마지막 세정 라운드를 완료한 후, 막을 무균성 0.9％ NaCl 용액으로 헹구고, 무균성 0.9％ NaCl 용액으로 채워진 새로운 무균성 표본 컨테이너에 놓았다.
모든 나머지 양막 조각들을 완전히 동일한 방식으로 프로세싱하였다.
모든 양막 조각들이 프로세싱되어 무균성 0.9％ NaCl 용액이 있는 컨테이너 내에 놓였을 때, 컨테이너를 진동 플랫폼 상의 통에 놓고 셋팅 #6에서 최소 5분 동안 진탕시켰다. 진탕이 완료된 후, 막을 표본 컨테이너로부터 제거하고, 컨테이너 내의 무균성 0.9％ NaCl 용액을 교체하고, 막을 표본 컨테이너에 다시 놓았다.
표본 컨테이너를 조직 ID 바코드 및 검역 표지로 표지하였다. 존재하는 물질 및 저장 용액(들) (예를 들어, 보존액의 유형)을 밝혀두고, 이니셜 표기하고 날짜를 적어두었다. 표본 컨테이너를 깨끗한 짚-록(zip-lock) 백 내에 놓고, 냉장고 (2-8℃)에 놓았다.
모든 적합한 데이터를 조직 프로세싱 기록에 기록하였다.
혈청학 결과들이 입수가능해지면, 적합한 표지 (혈청학 음성 또는 연구 전용)을 검역 표지의 상부에 놓고, 이러한 컨테이너들을 검역된 것들로부터 격리시켰다.
단계 Ⅳ.
단계 Ⅳ로의 진행 전에, 조직 상태 리뷰를 점검하여 모든 적용가능한 검사 결과들이 음성임을 확실히 하였다.
단계 II 및 III에서와 동일한 방식으로, 무균성 구역을 설정하고 모든 무균성 및 소독된 기구 및 부속품을 설정하였다.
막을 냉장고에서 제거하여 새로운 무균성 스테인레스 스틸 프로세싱 트레이에 놓았다. 트레이의 바닥이 덮이도록 무균성 0.9％ NaCl 용액을 첨가하였다.
모든 눈에 보이는 세포성 물질 및 잔해물 (존재하는 경우)을 새로운 세포 스크레이퍼를 사용하여 부드럽게 제거하였다 (주: 막이 찢어지는 것을 방지하기 위해 이러한 단계에 최소 압력이 적용되어야 한다). 세포 및 잔해물의 제거를 보조하기 위해 무균성 0.9％ NaCl 용액을 사용하였다.
막을 무균성 0.9％ NaCl 용액으로 채워진 별도의 무균성 스테인레스 스틸 헹굼 트레이에서 헹궜다. 세정 라운드들 사이에 0.9％ NaCl 용액을 교환하였다. 막을 새로운 무균성 표본 컨테이너에 놓고, 컨테이너를 신선한 무균성 0.9％ NaCl 용액으로 채우고, 진동 플랫폼 상에 놓고 셋팅 #6에서 최소 5분 동안의 진탕시켰다.
이전 단계를 3회 반복하고, 각각의 진탕 사이에 무균성 0.9％ NaCl 용액을 교환하였다. 적합한 데이터를 조직 프로세싱 기록에 기록하였다.
막을 한 번에 한 조각씩 표본 컨테이너로부터 제거하고, 과량의 유체를 손가락으로 부드럽게 짜내고, 막을 무균성 프로세싱 트레이 상에 놓았다. 확실하게 태아 측면이 아래쪽이도록 하면서, 막을 편평할 때까지 부드럽게 잡아당겼다.
소독된 플라스틱 시트를 무균성 가위로 절단함으로써 프레임을 제조하였다. 프레임의 크기는 각 방향에서 막 절편보다 약 0.5 ㎝ 더 작아야 한다. 프레임을 무균성 0.9％ NaCl 용액으로 채워진 헹굼 트레이에서 헹궜다.
프레임을 약간 잡아당겨진 막 표면 상에 놓고, 그 위에서 부드럽게 압착하였다. 플라스틱 프레임의 매끄러운 측면이 조직을 향하는 것이 필수적이다.
스캘펠을 사용하여, 프레임 가장자리 너머로 약 0.5 ㎝ 내밀어지도록 하면서 막을 프레임을 둘러서 절단하였다. 과량의 막을 다시 표본 컨테이너에 놓았다.
프레임 너머로 내밀어진 막 가장자리를 클램프 또는 족집게를 사용하여 프레임의 가장자리 위로 감싸고, 동일한 트레이 상에 두었다.
막의 다음 조각을 동일한 방식으로 프로세싱하였다. 건조될 총 면적이 열 건조기 당 300 ㎠를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 막의 조각을 프레임으로 잘라내는 동안, 비-프레임화 조각들은 컨테이너 내의 무균성 0.9％ NaCl 용액에 남아있는 것이 바람직하다.
건조기의 건조 온도를 연장된 탐침이 있는 눈금 디지털 온도계를 사용하여 설정 및 확인하였다. 건조 온도를 50℃로 설정하였다. 데이터를 조직 프로세싱 기록에 기록하였다.
진공 펌프를 작동시켰다.
프레임화된 막의 면적 보다 약간 더 큰 면적을 덮도록 열 건조기의 건조 플랫폼 상에 무균성 거즈를 놓았다. 거즈 층의 총 두께가 한번 접힌 4×4 거즈의 두께를 초과하지 않는 것을 확실하게 하는 것이 중요하다.
플라스틱 프레임화 메쉬의 시트 1개를 거즈의 상부에 위치시켰다. 플라스틱 메쉬의 가장자리는 거즈 가장자리 너머로 약 0.5 - 1.0 ㎝ 내밀어져야 한다.
프레임화된 막을 부드럽게 들어올려, 막 측면이 위쪽을 향하도록 열 건조기 플랫폼에 플라스틱 메쉬의 상부에 놓았다. 최대량의 막 (300 ㎠을 초과하지 않음)이 열 건조기 플랫폼에 놓일 때까지 이를 반복하였다 (주: 양막의 태아 측면이 위를 향함).
열 건조기의 전체 건조 플랫폼 + 여분의 1 피트를 덮기에 충분한 크기로 PVC 랩 필름의 조각을 절단하였다.
진공 펌프를 작동시키면서, 양쪽 측면에서 건조 플랫폼 가장자리 너머로 ½ 피트 내밀어지도록 플라스틱 필름으로 열 건조기의 전체 건조 플랫폼을 부드럽게 덮었다. 막 및 프레임 시트에 대해 필름이 팽팽하게 잡아당겨지고 (즉, 필름이 진공에 의해 "흡인"되고), 조직 영역에 공기 누출 및 주름이 없도록 주의하였다. 이어서, 뚜껑을 닫았다.
진공 펌프를 약 -22인치 Hg의 진공으로 설정하였다. 펌프 게이지를 2-3분의 건조 사이클 후 기록하였다. 막을 약 60분 동안 열 진공 건조시켰다. 건조 공정 내로의 약 15-30분에, 무균성 거즈 층을 열 건조기 내에서 새로운 것으로 대체하였다. 거즈 층의 총 두께는 한번 접힌 4×4 거즈의 두께를 초과하지 않아야 한다.
교환 후, 막 및 프레임 시트에 대해 플라스틱 필름이 팽팽하게 잡아당겨지고 막 영역에 공기 누출 및 주름이 없도록 주의하였다.
펌프 압력 모노미터(monometer)를 점검함으로써 진공 밀봉의 온전성을 주기적으로 점검하였다. 건조 공정 완료 후, 열 건조기를 열고, 펌프를 작동시키면서 약 2분 동안 막을 냉각시켰다.
무균성 스테리-랩 및 그 밑의 소독된 스테인레스 스틸 절단판을 사용하여, 새로운 무균성 구역을 설정하였다. 이 시점에서, 무균성 장갑을 사용하였다. 펌프를 여전히 작동시키면서, 장갑을 착용한 손으로 귀퉁이에서 시작하여 막 시트를 아래로 잡으면서 플라스틱 필름을 막 시트로부터 부드럽게 제거하였다. 프레임을 막과 함께 건조 플랫폼으로부터 부드럽게 들어올리고, 막 측면이 위쪽을 향하도록 하면서 소독된 스테인레스 스틸 절단판 상부의 무균성 구역 상에 놓았다. 스캘펠을 사용하여, 프레임의 가장자리로부터 1-2 ㎜ 떨어진 가장자리를 따라 절개하는 것을 통해 막 시트를 절단하였다. 장갑 (무균성 장갑)을 착용한 손으로 그 자리에서 막을 잡았다. 천천히 벗겨냄으로써 막을 프레임으로부터 부드럽게 들어올리고, 절단판 상의 무균성 구역 상에 놓았다.
스캘펠 또는 날카로운 가위를 사용하여, 막 시트를 규정된 크기의 절편으로 절단하였다. 모든 조각들을 절단하고, 포장 전에 무균성 구역 상에서 안전하게 하였다. 한 손 (비-무균성)으로 파우치를 잡으면서 막의 단일 조각을 다른 한 손 (무균성)으로 내부 필-파우치 포장물의 안쪽에 놓았다. "무균성" 손으로 파우치를 건드리지 않도록 주의하였다. 모든 조각들을 내부 파우치 안쪽에 놓은 후, 이를 밀봉하였다. 파우치 바깥쪽 상의 지정된 영역에 적합한 정보 (예를 들어, 파트#, 로트# 등)와 함께 표지를 부착하였다. 막의 모든 조각들을 동일한 방식으로 프로세싱하였다. 표지되고 밀봉된 필-파우치 포장물을 무균성 설비 또는 배급자에게 선적될 준비가 될 때까지 보관용 방수 짚-락 백에 놓았다. 모든 적합한 데이터를 조직 프로세싱 기록에 기록하였다
6.2. 실시예 2: 콜라겐 바이오패브릭을 제조하는 별법적인 방법
실질적으로 실시예 1의 단계 I에 기재된 바와 같이 상기 실시예의 재료를 사용하여 태반을 제조하였다. HIV, HBV, HCV, HTLV, 매독, CMV 및 수집될 태반 조직을 오염시킬 수 있는 기타 바이러스성 및 세균성 병원체와 같은 전염병에 대해 출산 시점에 임부를 스크리닝하였다. 모체가 상기 언급된 병원체들에 대해 음성 또는 비-반응성으로 테스트된 도너에서 수집된 조직만이 콜라겐 바이오패브릭을 생산하는데 사용되었다.
스테리-랩 시트를 사용하여 무균성 구역을 설정하고, 하기의 프로세싱용 기구 및 부속품을 그 위에 위치시켰다: 무균성 트레이 팩; 헹굼 트레이, 스테인레스 스틸 컵, 클램프/지혈기, 족집게, 가위, 거즈.
태반을 운송 컨테이너로부터 제거하여, 소독된 스테인레스 스틸 트레이 상에 놓았다. 수술용 클램프 및 가위를 사용하여, 제대를 태반 원반으로부터 약 2 인치에서 절단하였다.
태반 막의 가장자리로부터 시작하여, 손가락으로의 비절개 박리를 사용하여 양막을 융모막으로부터 분리하였다. 이는 막을 절단하기 전에 수행되었다. 융모 막 및 태반 원반의 전체 표면으로부터 양막을 분리한 후, 양막을 제대 밑둥 주변에서 가위로 절단하고, 태반 원반으로부터 탈착시켰다. 일부 예에서, 조직을 찢지 않으면서 양막과 융모막을 분리하는 것이 가능하지 않으면, 양막 및 융모막을 태반 원반으로부터 1개의 조각으로 절단한 후, 벗겨내어 분리시켰다.
적합한 데이터를 조직 프로세싱 기록에 기록하였다.
혈액 및 태수 또는 태아 물질을 제거하기 위해 무균성 0.9％ NaCl 용액으로 양막을 헹궜다. 이러한 헹굼 동안 필요하다면 생리 식염수를 교체하였다.
이어서, 양막을 표본 컨테이너 내의 0.9％ 식염수, 1.0％ 데옥시콜린산 용액에 놓고, 3-5일 마다 용액을 교환하면서, 2 내지 8℃에서 15일까지 냉장하였다. 인큐베이션 도중에 또는 인큐베이션 말기에, 상기 언급된 혈청학적 테스트를 평가하였다. 테스트가 하나 이상의 병원체로의 오염을 지시하면, 양막을 거부하고 더 이상 프로세싱하지 않았다. 그러나, CMV-양성 도너로부터 유래된 것으로서 지시된 조직은 바이오패브릭의 제조에 여전히 적합하였다.
일단 인큐베이션이 완료되면, 양막을 표본 컨테이너로부터 제거하고, 무균성 트레이에 놓고, 0.9％ NaCl 용액으로 3회 헹궈서 조직으로부터 데옥시콜린산을 감소시켰다. 모체 측면이 위로 향하도록 양막을 놓으면서, 세포 스크레이퍼를 사용하여 양막을 부드럽게 스크레이핑하여 가능한 한 많은 세포성 물질을 제거하였다. 세포 및 세포성 잔해물의 제거를 보조하기 위해 필요하다면 추가적인 식염수를 첨가하였다. 이러한 단계를 양막의 태아 측면에 대해 반복하였다. 스크레이핑에 이어서 양쪽 측면을 헹궜고, 세포 및 세포성 물질을 제거하는데 필요한 한 만큼 많은 횟수를 반복하였다. 스크레이핑된 양막을 셋팅 #6에서 5-120분 동안 진동 플랫폼 상의 별도의 컨테이너 내의 0.9％ 생리 식염수에 양막을 놓음으로써 헹궜다. 생리 식염수를 교체하고, 진동 헹굼을 반복하였다.
헹굼 완료 후, 선택적으로 양막을 짚-락 백에서 냉장고에서 보관하였다.
이어서, 스크레이핑된 양막을 태아 측면이 아래를 향하도록 무균성 프로세싱 트레이 상에 놓았다. 양막을 손으로 부드럽게 마사지하여 과량의 액체를 제거하고, 막을 편평하게 하였다. 무균성 플라스틱 시트를 이의 치수가 각각의 방향에서 편평한 양막보다 약 0.5 ㎝ 작도록 절단하였다. 이러한 플라스틱 시트를 0.9％ NaCl 용액에서 간단하게 헹궜다. 덮이지 않은 양막의 가장자리를 남기면서, 편평하게 된 양막 상에 플라스틱 시트를 매끄러운 측면을 아래로 하여 놓았다. 시트 가장자리 너머로 약 0.5 ㎝ 내밀어지도록 하면서 스캘펠을 사용하여 양막을 다듬었다. 이러한 내밀어진 양막 가장자리를 플라스틱 시트 위로 감쌌다. 건조될 총 조직 면적은 표준 진공 열 건조기에 대해 300 ㎠를 초과하지 않았다.
무균성 거즈의 시트를 진공 열 건조기에 놓았다. 거즈의 가장자리 너머로 약 0.5-10.0 ㎝ 내밀어지도록, 얇은 플라스틱 메쉬를 거즈 상에 놓았다. 이어서, 양막 및 플라스틱 시트를 조직 측면이 위를 향하도록 진공 열 건조기 내에 메쉬 상부에 놓고, 양막을 PVC 랩 필름의 시트로 덮었다. 건조기를 50℃로 설정하고, 온도를 주기적으로 점검하여 50℃±1℃가 확실하게 유지되도록 하였다. 그후, 진공 펌프를 작동시키고, 약 -22 인치 Hg 진공으로 설정하였다. 건조가 60분 동안 진행되도록 하였다.
그후, 건조된 양막을 이어서 밀봉된 플라스틱 컨테이너에서 추후 사용을 위해 보관하였다.
6.3. 실시예 3: 콜라겐 바이오패브릭 적층물
상기 기술된 방법에 의해 생산된 콜라겐 바이오패브릭을 하기와 같이 적층시켰다. 일부 예에서, 건식 콜라겐 바이오패브릭이 1시간 10분 내지 1시간 30분 동안 무균성 0.9％ NaCl 용액에서 재수화되었다. 건식 콜라겐 바이오패브릭은 상기 (실시예 1)에 개요된 전체 절차에 의해 생산된 후, 적층되었다; 습식 콜라겐 바이오패브릭은 단계 III까지 제조한 후, 적층되었다. 마운팅(mounting) 프레임을 절단한 후, 태아 측면을 아래쪽으로 향하게 놓고, 마운팅 프레임을 조직의 상부에 놓고, 프레임 주변에 약 1 ㎝ 가장자리를 남기면서 조직을 절단함으로써, 재수화된 조직을 마운팅하였다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 1 ㎝ 가장자리를 프레임의 가장자리 위로 접었다. 습식 콜라겐 바이오패브릭의 추가적인 조각들을 부가하기 위해 이러한 단계들을 반복하였다. 그후, 적층된 바이오패브릭을 젤 건조기에 놓고, 실질적인 건조도 (20 중량％ 미만의 수분 함량)까지 건조시켰다. 그후, 적층물을 2×6 ㎝ 샘플로 절단하였다.
적층된 콜라겐 바이오패브릭의 별도의 로트들을 하기와 같이 평가하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 건식 (DT) 및 습식 (WT) 적층 콜라겐 바이오패브릭의 치수를 2, 3, 5 또는 8개의 층들을 함유하는 적층물에 대해 결정하였다.
Figure 112009001019059-PCT00001
표본들은 실온에서 건조 조건 하에 유지되었을 때 적층 후 처음 2일에 걸쳐 층분리 징후를 나타내지 않았다. 추가적으로, 적층된 콜라겐 바이오패브릭은 교반된 0.9％ 식염수에서 실온에서 10일 동안 유지되었을 때 층분리 징후를 나타내지 않았다.
더 큰 적층 콜라겐 바이오패브릭 표본을 적층물 내구성 및 층분리에 대한 저항성에 대해 테스트하였다. 상기 열거된 목록 (즉, DT2, DT3, WT2, WT3, WT5 및 WT8)으로부터의 1×2 ㎝ 표본을 페트리 접시에서 5 ㎖ 포스페이트 완충 염수 내에 놓았다. 표본을 95 RPM에서 약 24 시간 동안 오비탈 진탕기 상에 놓아두었다. 진탕 동안 또는 그후의 간단한 취급 동안, 표본의 층분리가 관찰되지 않았다.
6.4. 실시예 4: 콜라겐 바이오패브릭을 사용하여 줄기 세포를 배양하기 위한 키트
본 실시예는 콜라겐 바이오패브릭을 사용하여 줄기 세포를 배양하거나, 확장시키거나 또는 분화시키기 위한 키트를 제공한다.
키트는, 밀봉된 컨테이너 내에, 줄기 세포의 배양, 확장 또는 분화에 적절한 다수의 마이크로웰 플레이트를 포함하였다. 마이크로웰 플레이트는 세포 배양을 위한 6개, 12개, 24개, 또는 96개의 웰을 포함할 수 있다. 각각의 웰 내에, 콜라겐 바이오패브릭 또는 콜라겐 바이오패브릭 적층물의 시트가 제공되었다. 콜라겐 바이오패브릭 및 콜라겐 패브릭 적층물은 상기 실시예 1-3에 기술된 바와 같이 제조되었다.
키트는 줄기 세포의 배양, 확장 또는 분화를 위한 설명서 셋트를 또한 포함하였다. 추가적으로, 키트는 줄기 세포의 배양, 확장 또는 분화에 적절한 배양 배지의 하나 이상의 컨테이너, 및 줄기 세포의 성장 또는 분화를 용이하게 하는 하나 이상의 작용제를 포함하였다.
6.5. 실시예 5: 콜라겐 바이오패브릭을 사용하는 인간 태반 줄기 세포의 배양, 확장 및 분화
본 실시예는 콜라겐 바이오패브릭을 사용하는 인간 태반 줄기 세포의 배양, 확장 또는 분화를 제공한다.
본원에서 사용되는 인간 태반 줄기 세포는 미국 출원 공보 번호 2003/032179에 기술되어 있다. 이같은 세포는 OCT-4+이고 ABC-p+이다. 인간 태반 줄기 세포를 자궁으로부터의 만출 후에 태반으로부터 수득하였다. 간략하게, 태반을 방혈시키고, 항응고제가 용해되어 있는 수성 등장성 유체와 같은 적절한 수성 관류 유체로 관류시켰다. 태반의 방혈 및 충분한 시간의 관류 후, 태반의 방혈 및 관류된 미세순환으로 태반 줄기 세포가 이동되었음이 관찰되었다. 충분한 시간 동안 태반에서 배양된 후, 유출되는 관류액을 수집 용기에서 수집함으로써 태반 줄기 세포를 수집하였다. 태반으로부터 수집된 태반 세포를 유출되는 관류액으로부터 당업자에게 공지된 기술, 예를 들어, 밀도 구배 원심분리, 유동 세포측정법 등을 사용하여 회수하였다.
그후, 태반 줄기 세포를 실시예 4에서 제공된 바와 같은 키트를 사용하여 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하였다. 약 1 내지 5×105 개의 세포를 키트의 마이크로웰 플레이트의 각 웰 내의 콜라겐 바이오패브릭 상에 플레이팅하였다. 각 웰에 5 ㎖의 배양 배지를 첨가하였다. 배양 배지는 60％ DMEM-LG (Gibco), 40％ MCDB-201 (Sigma), 2％ 소 태아 혈청 (FCS) (Hyclone Laboratories), 1× 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS), 1× 레놀렌산-소 혈청 알부민 (LA-BSA), 10-9 M 덱사메타손 (Sigma), 10-4 M 아스코르브산 2-포스페이트 (Sigma), 표피 성장 인자 (EGF) 10 ng/㎖ (R＆D Systems), 혈소판 유래-성장 인자 (PDGF-BB) 10 ng/㎖ (R＆D Systems), 및 100U 페니실린/1000U 스트렙토마이신을 포함하였다.
마이크로웰 플레이트를 5％ CO2가 있는 습윤화된 대기에서 37℃에서 인큐베이터에서 배양하여, 세포가 회수 및 부착되도록 하였다. 모든 배양 배지를 2일 마다 교환하였다.
인간 태반 줄기 세포를 하기와 같이 뉴런으로 분화되도록 유도하였다. 인간 태반 줄기 세포를 DMEM/20％ FBS 및 1 mM 베타-메르캅토에탄올로 구성된 예비유도(preinduction) 배지에서 24시간 동안 실시예 4에 기술된 키트를 사용하여 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하였다. 예비유도 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세정하였다. DMEM 및 1-10 mM 베타메르캅토에탄올로 구성된 뉴런 유도 배지를 첨가하였다. 별법적으로, DMEM/2％ DMSO/200 μM 부틸화 히드록시아니솔로 구성된 유도 배지를 사용하여 뉴런 분화 효율을 증강시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 무혈청 배지 및 베타메르캅토에탄올에의 노출 후 60분만에 형태학적 및 분자성 변화가 발생할 수 있다 ([Woodbury et al., J. Neurosci. Res.,. 61:364-370]). RT/PCR을 사용하여, 신경 분화를 가리키는 신경 성장 인자 수용체 및 신경미세섬유 중쇄 유전자를 검출하였다. 신경 표현형의 발달, 예를 들어, 가지돌기 및/또는 액손의 발달에 대해 세포를 또한 시험하였다.
인간 태반 줄기 세포를 하기와 같이 지방세포로 분화하도록 유도하였다. 인간 태반 줄기 세포를 실시예 4의 키트를 사용하여 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하여, (1) DMEM/MCDB-201 + 2％ FCS, 0.5％ 히드로코르티손, 0.5 mM 이소부틸메틸잔틴, 60 μM 인도메타신; 또는 (2) DMEM/MCDB-201 + 2％ FCS 및 0.5％ 리놀레산을 포함하는 배지에서 50-70％ 전면성장을 유도하였다. 세포를 형태학적 변화에 대해 시험하였다. 전형적으로, 3-7일 후 오일 액적이 나타났다. 지방발생과 관련된 특이적 유전자, 즉, PPAR-γ2, aP-2, 지질단백질 리파제, 및 오스테오폰틴의 발현을 시험하는 정량적 실시간 PCR에 의해 분화를 평가하였다.
태반 줄기 세포의 연골발생성 분화를 하기와 같이 달성하였다. 태반 줄기 세포를 15％ 제대혈 혈청이 보충된 DMEM (Cambrex) 또는 MSCGM에서 실시예 4의 키트를 사용하여 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하였다. 태반 줄기 세포를 무균성 폴리프로필렌 튜브 내로 분취하였다. 세포를 원심분리하고 (150×g, 5분), 불완전 연골발생 배지 (Cambrex)에서 2회 세정하였다. 마지막 세정 후, 세포를 0.01 ㎍/㎖ TGF-베타-3를 함유하는 완전 연골발생 배지 (Cambrex)에 5×10(5) 개의 세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 0.5 ㎖의 세포를 15 ㎖ 폴리프로필렌 배양 튜브 내로 분취하였다. 세포를 150×g에서 5분 동안 펠렛화시켰다. 펠렛을 배지에서 그대로 방치하였다. 느슨하게 뚜껑이 덮인 튜브를 37℃, 5％ CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 펠렛에 신선하게 제조된 완전 연골발생 배지를 2-3일 마다 공급하였다. 저속 와동기를 사용하여 매일 진탕에 의해 펠렛을 배지 내에 현탁되게 유지시켰다. 연골발생성 세포 펠렛을 배양물에서 14-28일 후 수확하였다. 예를 들어, 호산구성 기저 물질의 생산의 관찰, 세포 형태학의 평가, 및/또는 콜라겐 2 및 콜라겐 9 유전자 발현의 RT/PCR 확인, 및/또는 알시안(Alcian) 블루 세포화학 염색에 의해 확인되는 바와 같은 연골 매트릭스 산 점액다당류의 생산에 의해, 연골발생을 특성화하였다.
태반 줄기 세포의 골발생성 분화를 하기와 같이 달성하였다. 태반 줄기 세포를 골발생성 배지에서 실시예 4의 키트를 사용하여 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하였다. 골발생성 배지를 185 ㎖ Cambrex 분화 기초 배지 - 골발생성 및 SingleQuot (각각 덱사메타손, 1-글루타민, 아스코르베이트, 페니실린/스트렙토마이신, MCGS, 및 β-글리세로포스페이트)로부터 제조하였다. 관류액으로부터의 태반 줄기 세포를 조직 배양 표면적 1 ㎠ 당 약 3×103 개의 세포의 세포로 조직 배양 면적 1 ㎠ 당 0.2-0.3 ㎖의 MSCGM 내에 플레이팅하였다. 전형적으로, 모든 세포가 MSCGM, 37℃, 5％ CO2에서 4-24시간 동안 배양 표면에 부착하였다. 배지를 골발생성 분화 배지로 교체함으로써 골발생성 분화가 유도되었다. 무기질화가 동반되면서, 세포 형태학이 부착성 태반 줄기 세포의 전형적인 방추-형상의 외양에서 입방형 외양으로 변하기 시작하였다. 일부 세포는 분화 동안 조직 배양 표면으로부터 얇은 층으로 분리되었다.
태반 줄기 세포의 췌장성 분화를 하기와 같이 달성하였다. 태반 줄기 세포를 염기성 섬유모세포 성장 인자 (10 ng/㎖); 및 전환 성장 인자 베타-1 (2 ng/㎖)이 보충된 DMEM/20％ CBS에서 실시예 4의 키트를 사용하여 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하였다. 녹아웃 혈청 대체물이 CBS 대신 사용될 수 있다. 네스틴-양성 뉴런 세포 세포 배양물로부터의 조건화 배지를 배지에 50/50 농도로 첨가하였다. 3-4일 마다 재공급하면서, 세포를 14-28일 동안 배양하였다. 인슐린 단백질에 대해 또는 RT/PCR에 의해 인슐린 유전자 발현에 대해 분석함으로써 분화를 특성화하였다.
태반 줄기 세포의 근육성 (심장발생성) 분화를 하기와 같이 달성하였다. 태반 줄기 세포를 레티노산 (1 μM); 염기성 섬유모세포 성장 인자 (10 ng/㎖); 및 전환 성장 인자 베타-1 (2 ng/㎖); 및 표피 성장 인자 (100 ng/㎖)가 보충된 DMEM/20％ CBS에서 실시예 4의 키트를 사용하여 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하였다. 녹아웃 혈청 대체물 (Invitrogen, Carlsbad, California)이 CBS 대신 사용될 수 있다. 별법적으로, 태반 줄기 세포를 50 ng/㎖ 카디오트로핀-1이 보충된 DMEM/20％ CBS에서 24시간 동안 배양하였다. 별법적으로, 태반 줄기 세포를 단백질이 없는 배지에서 5-7일 동안 유지시킨 후, 인간 심근 추출물로 자극하였다 (용량을 단계적으로 상승시키는 분석). 심근 추출물은 1％ 제대혈 혈청이 보충된 1％ HEPES 완충제에서 1 g의 인간 심근을 균질화함으로써 생산되었다. 현탁액을 60분 동안 인큐베이션한 후, 원심분리하고, 상청액을 수집하였다. 3-4일마다 재공급하면서 세포를 10-14일 동안 배양하였다. RT/PCR에 의한 심장 액틴 유전자 발현의 증명에 의해 분화가 입증되었다.
6.6. 실시예 6: 양막 상에서의 태반 줄기 세포 및 섬유모세포의 배양
조직 조작의 주요 목표는 질환 또는 손실 조직/기관의 대체를 위한 살아 있는 조직/기관의 재생성이다. 양막은 세포 부착 및 분화를 위한 천연 미세환경을 제공하기 위한 우수한 스캐폴드(scaffold)이다.
막 제조. 본원에 기술된 바와 같이 제조된 양막은 정상적인 만삭 임식의 태반으로부터 유래되었다. 세제 침지 및 기계적 스크레이핑을 조합하여 사용하여 양막 생성물을 탈세포화시켰다. 최종 생성물을 중등도의 온도에서 탈수시키고, 최종적으로 방사선에 의해 멸균시켰다.
세포 분석법. 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 효소성 소화에 의해 수득된 정상적인 인간 피부 섬유모세포 (Cambrex) 또는 태반 줄기 세포를 양막, 피브로넥틴 (Sigma) 또는 VITROGEN™ (Cohesion으로부터의 소 콜라겐)이 코팅된 표면 상에서 4시간 또는 24시간 동안 배양하였다. 표면 상의 배양된 세포를 포르말린에 고정하고, F-액틴에 대해 염색하였다.
결과. 파종 4시간 후, 다양한 표면에 응답하여 독특한 형태들이 관찰되었다. 피브로넥틴 상의 섬유모세포는 부착성 세포 표현형의 특징인 액틴 스트레스 섬유를 디스플레이하면서 잘 확산된 한편, 콜라겐 상의 섬유모세포는 이렇게 확산되지 않았고, 대신 수많은 사상(filopodial) 돌기를 나타냈다. 양막 상의 섬유모세포는 피브로넥틴 상에서 배양된 세포와 형태학적으로 매우 유사한 것으로 나타났다. 24시간에는, 다양한 기판들 간에 세포 형태에서의 차이가 훨씬 덜 명백했다. 태반 줄기 세포는 실험용 기판에 부착되었고, 섬유모세포와 유사한 차별적인 세포 형태를 나타냈다.
별도의 실험에서, 건조된 양막 상에서의 부착성 태반 줄기 세포의 배양 특징을 피브로넥틴, 콜라겐 또는 유리 상에서의 배양 특징과 비교하였다. 덮개유리 표면에 10 ㎍/㎖ 피브로넥틴 또는 500 ㎍/㎖ VITROGEN™을 흡착시켰다. 건조된 양막을 실리콘 고리가 있는 24웰 플레이트의 바닥에 고정시켰다. 태반 줄기 세포를 약 1×104개의 세포/㎠으로 피브로넥틴, VITROGEN™, 유리 또는 양막 상에서 24시간 동안 배양하였다. 그후, 세포를 고정하고, 액틴 세포골격에 대해 염색하였다. 결과는 양막 상에 확산된 태반 줄기 세포가 피브로넥틴이 코팅된 표면에서 관찰된 것과 매우 유사하였음을 나타냈다. 세포 배양물로 처리된 덮개유리 및 콜라겐 상에서 태반 줄기 세포가 또한 확산되었지만, 비교해보면 태반 줄기 세포가 더욱 얇고 길어진 세포를 디스플레이하는 것으로 나타났다. 도 1 참조.
결론. 세포간 액틴 세포골격의 동적인 구조적 재배열은 부착, 이동 및 증식과 같은 다수의 세포 활성에 기초적이고, 이것이 놓이는 세포외 환경이 이러한 세포성 거동을 조절하는 것에서 역할을 한다. 양막 상의 배양된 섬유모세포 및 태반 줄기 세포는 세포 부착 및 성장에 최적인 것으로 공지된 매트릭스 단백질인 피브로넥틴 상에서 배양된 세포와 유사한 세포성 확산 역학을 나타냈다. 이는 양막이 콜라겐으로 주로 구성되지만, 다른 미량 성분이 세포 부착 및 증식에 또한 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 이러한 결과는 이러한 연구에서 사용된 세포 (미분화 세포 및 최종 분화 세포 모두)에 대해 양막이 부착 및 기능성을 위한 적절한 스캐폴드임을 또한 시사한다.
6.7. 실시예 7: 양막 상에서의 태반 줄기 세포의 분화
본 실시예는 건조된 양막 상에서의 태반 줄기 세포의 골발생성 분화를 설명한다.
재료
골발생성 분화 배지: 10％ 소 태아 혈청 (FBS) 및 1×P/S + 50 uM 아스코르브산 + 100 nM 덱사메타손 + 10 mM 베타 글리세롤 포스페이트 (BGP)가 보충된 DMEM 저(低) 글루코스.
기초 배지: 10％ FBS 및 1×P/S가 보충된 DMEM 저 글루코스.
별법적인 탄소 공급원 배지: 10％ FBS 및 1×P/S + 10 mM BGP가 보충된 DMEM 저 글루코스를 사용하여, 이러한 세포가 포스페이트 공급원 단독으로 유도가능한지를 확인하였다.
방법
무균성의 탈수 양막을 6×8 cm 시트로부터 단일 웰의 크기 (직경 약 1.5 cm)로 절단하였다. 양막 조각을 웰의 크기 (직경 약 1.5 cm)로 절단된 실리콘 O-고리에 의해 그자리에서 유지시켰다. 태반 줄기 세포, 골수-유래 줄기 세포 (BMSC), 및 정상적인 인간 피부 섬유모세포 (NHDF)를 막 상에 약 10000 개의 세포/㎠으로 DMEM + 10％ FBS 및 1×P/S에 파종하였다. 세포를 2-3일에 걸쳐 37℃에서 5％ CO2에서 성장시켰다. 그후, 배지를 분화 배지, 기초 배지, 또는 베타 글리세롤 포스페이트 (BGP)를 포함하는 기초 배지로 바꿨다. 21일 동안 분화가 진행되도록 하였다. 2-3일마다 배지를 교환하였다.
말로리-하이덴하인(Mallory-Heidenhain) 염색 기술을 사용하는 조직학적 염색으로 골발생성 분화를 평가하였다. [James E. Dennis egt al., "In Vivo Osteogenesis Assay; a Rapid Method for Quantitative Analysis," Biomaterials 19:1323-1328 (1998)] 참조. 간략하게, 줄기 세포 배양물을 4％ 파라포름알데히드에 고정하고, 파라핀에 매립시켰다. 5 ㎛ 두께의 절편을 파라핀 블록으로부터 유리 슬라이드 상으로 절단하였다.
염색 용액의 제조. 0.5％ 산성 푹신(Fuchsin): 100 ㎖ 증류수 내의 0.5 g의 산성 푹신. 아닐린 블루 용액: 100 ㎖ 증류수에 용해된 0.5 g 아닐린 블루, 2 g 오렌지 G, 1 g 포스포텅스틴산. 모든 시약은 Sigma-Aldrich 제품이었다.
절차: 절편을 자일렌을 사용하여 탈파라핀화시키고, 등급화 에탄올로 재수화시켰다. 그후, 절편을 증류수로 헹구고 염색하였다. 절편을 먼저 산성 푸신 용액에서 5분 동안 염색하였다. 과량의 염료를 슬라이드로부터 닦아내고, 슬라이드를 아닐린 블루 용액에 1시간 동안 침지시켰다. 슬라이드를 과량의 염료를 제거하기 위해 여러번의 변화로 95％ 에탄올로 옮겼다. 절편이 투명하게 탈수되었고, 합성 수지로 마운팅(mounting)하였다.
6.8. 실시예 8: 가교된 히알루론산을 포함하는 콜라겐 바이오패브릭의 제조
본 실시예는 줄기 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포를 배양하는데 사용하기 위한, 가교된 히알루론산 코팅을 포함하는 복합 콜라겐 바이오패브릭을 설명한다.
재료 및 방법.
콜라겐 바이오패브릭이 탈수 (20％ 이하의 수분), 탈세포화 양막으로 제공되었다. 히알루론산 (Fluka BioChimika)이 초순수 내의 10 mg/㎖ 용액으로 제공되었다. 사용된 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDE; Sigma Aldrich), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDCI; Sigma Aldrich), 또는 디비닐 술폰 (Fluka)이었다.
히알루론산 조성물
히알루론산은 쉽게 입수가능하고, 비싸지 않으며 생체적합성인 글리코사미노글리칸이고, 이는 수분 보유 및 유동학적 성질이 양호하다..
2가지 상이한 히알루론산 가교 방법을 평가하였다. BDDE 또는 디비닐 술폰을 사용하여, 히알루론산을 용액 내에서 각각의 가교제와 조합하는 것 및 하룻밤 동안 교반하는 것을 수반하는 용액 가교를 사용하여 히알루론산을 가교시켰다. EDCI를 사용하여, 히알루론산이 고체 필름 또는 발포체로 제조된 후 가교제를 포함하는 용액에 조성물이 침지되는 침지 가교에 의해, 히알루론산을 또한 가교시켰다.
히알루론산 용액을 초순수를 사용하여 제조하였다. 먼저, pH가 너무 높으면 가교가 발생하지 않을지를 결정하였지만, 초순수에서 문제없이 가교가 진행되었다.
히알루론산 (10 mg/㎖) 용액 2 ㎖를 제조하여, BDDE (용액; 2 ㎕/㎎ 히알루론산) 또는 EDCI (침지 기술; 80:20 EtOH:물 내의 15 mM)와 가교시켰다. 양쪽 기술 모두 가교 필름의 생산에 성공적이었다. 시각적으로, BDDE-가교 필름이 EDCI-가교 필름보다 훨씬 더 팽윤된 것으로 나타났고, 이는 EDCI-가교 필름이 BDDE-가교 필름보다 많은 가교를 함유하였음을 가리킨다 (시차 주사 열량측정법 (DSC) 분석에 의해 확인된 평가). FTIR 분석에 따르면, 히알루론산 필름 내에 본질적으로 가교제가 남아 있지 않았다.
BDDE 가교 필름에서 주목된 다량의 팽윤으로 인해, 가교 밀도가 증가되었다. 샘플을 용액 내의 히알루론산 1 ㎎ 당 1, 2 또는 4 ㎕의 가교제로 제조하였다. 가교는 pH 5 또는 pH 7에서 수행되었다. 각각의 경우에, 용액을 하룻밤 동안 가교시켰고, 스폰지-유사 발포체가 생산되도록 동결건조시켰다. 히알루론산 1 ㎎ 당 4 ㎕의 BDDE에서 생산된 발포체는 매우 취약하고 가벼웠으며, 물에 놓였을 때 죽처럼 부서졌다. 다른 조합에서는 허용가능한 구조를 갖고 물에서 상당히 팽윤된 발포체가 생산되었다. pH 또는 BDDE의 양은 평형 수분 함량 (93％ 내지 98％) 또는 구조 (FTIR에 의해 결정됨)에 대해 차이가 없는 것으로 나타났다.
히알루론산 및 건조된 양막을 조합하기 위한 여러 전략이 시도되었다. 먼저, 가교된 히알루론산 용액을 제조하고, 1 ㎖를 막의 이동 및 용액의 누출을 방지하는 프레임 내에서 유지된 건조된 양막의 절편 상에 놓았다. 복합재를 공기 건조시켰고, 양호한 부착이 주목되었다. 그러나, 물에 놓였을 때, 양막과 히알루론산이 분리되었다.
두번째 전략에서, 1 ㎖의 히알루론산 용액을 양막의 상부에 놓고, 복합재를 동결건조시켰다. 건조 후, 복합재를 80:20 EtOH:물 내의 EDCI 용액에 침지시켰다. 그러나, 다시 동결건조되었을 때, HA가 양막에서 벗겨졌다. 공기-건조로 제2 동결건조를 대체했을 때, 단단한 결합이 양막과 히알루론산 사이에 형성되었다. 물에 놓였을 때, 히알루론산이 막으로부터 분리되지 않으면서 팽윤되었다.
히알루론산을 포함하는 콜라겐 바이오패브릭이 줄기 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포, 예를 들어, CD34- 태반 줄기 세포를 배양하기 위해 본원에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.
등가물:
본 발명은 본원에 기술된 특정 실시양태에 의해 범주가 한정되지 않는다. 실제로, 기술된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 상기의 상세한 설명 및 동반된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이같은 변형은 첨부된 청구항의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
다양한 간행물, 특허 및 특허 출원이 본원에서 인용되고, 이들의 개시 내용은 전문이 거명에 의해 포함된다.

Claims (94)

  1. 줄기 세포를 배양 배지에서 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하는 것을 포함하고, 이때 상기 콜라겐 바이오패브릭이 태반으로부터 유래되고, 상기 줄기 세포가 상기 콜라겐 바이오패브릭에 대해 외인성인, 줄기 세포를 배양하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 포유류 태반으로부터 단리된 양막을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 포유류 태반으로부터 단리된 융모막을 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 포유류 태반으로부터의 양막 및 융모막을 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배양 전에 상기 콜라겐 바이오패브릭이 실질적으로 건조한 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 배양 전에 상기 콜라겐 바이오패브릭이 탈세포화(decellularization)되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 배양 전에 상기 콜라겐 바이오패브릭이 탈세포화되지 않는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이, 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 내인성인 세포를 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이, 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 외인성인 세포를 포함하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭에 방사선이 조사되는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭에 방사선이 조사되는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포가 태반 줄기 세포인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포가 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 태반혈- 또는 제대혈-유래 줄기 세포, 골수-유래 줄기 세포, 또는 성체 신체 줄기 세포 인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 성체 신체 줄기 세포가 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 또는 근육 줄기 세포인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포가 24시간 이상 동안 배양되는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포가 2일 이상 동안 배양되는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포가 7일 이상 동안 배양되는 방법.
  19. 줄기 세포가 확장되도록 줄기 세포를 배양 배지에서 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하는 것을 포함하는, 줄기 세포를 확장시키는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 포유류 태반으로부터 단리된 양막을 포함하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 포유류 태반으로부터 단리된 융모막을 포함하는 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 포유류 태반으로부터의 양막 및 융모막을 포함하는 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 확장 전에 상기 콜라겐 바이오패브릭이 실질적으로 건조한 방법.
  24. 제19항에 있어서, 상기 확장 전에 상기 콜라겐 바이오패브릭이 탈세포화되는 방법.
  25. 제19항에 있어서, 상기 확장 전에 상기 콜라겐 바이오패브릭이 탈세포화되지 않는 방법.
  26. 제19항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이, 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 내인성인 세포를 포함하는 방법.
  27. 제19항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이, 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 외인성인 세포를 포함하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭에 방사선이 조사되는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭에 방사선이 조사되는 방법.
  30. 제19항에 있어서, 상기 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
  31. 제19항에 있어서, 상기 줄기 세포가 태반 줄기 세포인 방법.
  32. 제19항에 있어서, 상기 줄기 세포가 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 태반혈- 또는 제대혈-유래 줄기 세포, 골수-유래 줄기 세포, 또는 성체 신체 줄기 세포인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 성체 신체 줄기 세포가 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 또는 근육 줄기 세포인 방법.
  34. 제19항에 있어서, 상기 줄기 세포가 24시간 이상 동안 확장되는 방법.
  35. 제19항에 있어서, 상기 줄기 세포가 2일 이상 동안 확장되는 방법.
  36. 제19항에 있어서, 상기 줄기 세포가 1주일 이상 동안 확장되는 방법.
  37. 줄기 세포의 분화에 충분한 시간 동안 줄기 세포를 배양 배지에서 콜라겐 바이오패브릭과 함께 배양하는 것을 포함하는, 줄기 세포를 분화시키는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 포유류 태반으로부터 단리된 양막을 포함하는 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 포유류 태반으로부터 단리된 융모막을 포함하는 방법.
  40. 제37항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 포유류 태반으로부터의 양막 및 융모막을 포함하는 방법.
  41. 제37항에 있어서, 상기 분화 전에 상기 콜라겐 바이오패브릭이 실질적으로 건조한 방법.
  42. 제37항에 있어서, 상기 분화 전에 상기 콜라겐 바이오패브릭이 탈세포화되는 방법.
  43. 제37항에 있어서, 상기 분화 전에 상기 콜라겐 바이오패브릭이 탈세포화되지 않는 방법.
  44. 제37항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이, 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 내인성인 세포를 포함하는 방법.
  45. 제37항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이, 콜라겐 바이오패브릭이 유래된 태반에 대해 외인성인 세포를 포함하는 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭에 방사선이 조사되는 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭에 방사선이 조사되는 방법.
  48. 제37항에 있어서, 체세포를 상기 콜라겐 바이오패브릭 상에서 배양하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  49. 제37항에 있어서, 상기 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
  50. 제37항에 있어서, 상기 줄기 세포가 태반 줄기 세포인 방법.
  51. 제37항에 있어서, 상기 줄기 세포가 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 태 반혈- 또는 제대혈-유래 줄기 세포, 골수-유래 줄기 세포, 또는 성체 신체 줄기 세포인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 성체 신체 줄기 세포가 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 또는 근육 줄기 세포인 방법.
  53. 제37항에 있어서, 상기 세포가 신경 세포로 분화되는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 분화가 상기 세포를 베타메르캅토에탄올 또는 부틸화 히드록시아니솔과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 상기 베타메르캅토에탄올 또는 부틸화 히드록시아니솔을 포함하는 방법.
  56. 제53항에 있어서, 상기 신경 세포가 신경 성장 인자 수용체의 생산; 신경 성장 인자를 코딩하는 유전자의 발현; 신경미세섬유 중쇄의 생산; 또는 신경미세섬유 중쇄를 코딩하는 유전자의 발현을 나타내는 방법.
  57. 제37항에 있어서, 상기 세포가 지방세포로 분화되는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 분화가 상기 세포를 덱사메타손, 인도메타신, 인슐린, 및 3-이소부틸-1-메틸잔틴과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 상기 덱사메타손, 인도메타신, 인슐린, 및 3-이소부틸-1-메틸잔틴을 포함하는 방법.
  60. 제57항에 있어서, 상기 지방세포가 친지성 염료로 검출가능한 세포질내 지질 소포의 생산; 리파제(lipase)를 코딩하는 유전자의 발현; 또는 리파제의 생산을 나타내는 방법.
  61. 제37항에 있어서, 상기 세포가 연골세포로 분화되는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 분화가 상기 세포를 전환 성장 인자-베타-3과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 상기 전환 성장 인자-베타-3을 포함하는 방법.
  64. 제61항에 있어서, 상기 연골세포가 연골세포의 특징적인 세포 형태; 콜라겐 2의 생산; 콜라겐 2를 코딩하는 유전자의 발현, 콜라겐 9의 생산; 또는 콜라겐 9를 코딩하는 유전자의 발현을 나타내는 방법.
  65. 제37항에 있어서, 상기 세포가 골세포로 분화되는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 분화가 상기 세포를 덱사메타손, 아스코르브산-2-포스페이트, 및 글리세로포스페이트와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 상기 덱사메타손, 아스코르브산-2-포스페이트, 및 글리세로포스페이트를 포함하는 방법.
  68. 제65항에 있어서, 상기 골세포가 골세포의 특징적인 칼슘 수준; 알칼리성 포스파타제(phosphatase)의 생산; 알칼리성 포스파타제를 코딩하는 유전자의 발현; 오스테오폰틴(osteopontin)의 생산; 또는 오스테오폰틴을 코딩하는 유전자의 발현을 나타내는 방법.
  69. 제37항에 있어서, 상기 세포가 간세포로 분화되는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 분화가 상기 세포를 간세포 성장 인자 및 표피 성장 인자와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 상기 간세포 성장 인자 및 표피 성장 인자를 포함하는 방법.
  72. 제69항에 있어서, 상기 간세포가 간세포-특이적 유전자의 발현 또는 간세포-특이적 단백질의 생산을 나타내는 방법.
  73. 제37항에 있어서, 상기 세포가 췌장 세포로 분화되는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 분화가 상기 세포를 염기성 섬유모세포 성장 인자, 전환 성장 인자 베타-1, 및 네스틴(nestin)-양성 뉴런 세포로 조건화된 배지와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 염기성 섬유모세포 성장 인자 및 전환 성장 인자 베타-1을 포함하는 방법.
  76. 제73항에 있어서, 상기 췌장 세포가 인슐린의 생산 또는 인슐린을 코딩하는 유전자의 발현을 나타내는 방법.
  77. 제37항에 있어서, 상기 세포가 심장 세포로 분화되는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 분화가 상기 세포를 레티노산, 염기성 섬유모세포 성장 인자 및 전환 성장 인자와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 상기 레티노산, 염기성 섬유모세포 성장 인자 및 전환 성장 인자를 포함하는 방법.
  80. 제77항에 있어서, 상기 분화가 상기 세포를 카디오트로핀(cardiotropin)과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 상기 카디오트로핀을 포함하는 방법.
  82. 제77항에 있어서, 상기 심장 세포가 박동; 심장 액틴(actin)의 생산; 또는 심장 액틴을 코딩하는 유전자의 발현을 나타내는 방법.
  83. 세포의 생존에 적절한 조건 하에 콜라겐 바이오패브릭과 함께 세포를 배양하는 단계; 상기 세포를 화합물과 접촉시키는 단계; 및 등가의 조건 하에 배양되고 상기 화합물과 접촉되지 않은 세포와 비교하여, 세포자멸사, 괴사 또는 세포 사멸을 가리키는 세포의 대사 파라메터, 또는 세포자멸사, 괴사 또는 세포 사멸에 대한 경향에서의 변화를 확인하는 단계를 포함하고, 이때 상기 변화가 확인되면 상기 화합물이 상기 세포에 대해 독성인, 세포에 대한 화합물의 독성을 결정하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 세포가 체세포인 방법.
  85. 제83항에 있어서, 상기 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
  86. 제83항에 있어서, 상기 세포가 태반 줄기 세포인 방법.
  87. 제83항에 있어서, 상기 세포가 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 태반혈- 또는 제대혈-유래 줄기 세포, 골수-유래 줄기 세포, 또는 성체 신체 줄기 세포인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 성체 신체 줄기 세포가 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 또는 근육 줄기 세포인 방법.
  89. 다수의 태반 줄기 세포를 포함하는 콜라겐 바이오패브릭과 함께 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 상기 줄기 세포를 줄기 세포의 생존에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 배양하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
  91. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 히알루론산을 포함하는 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 히알루론산이 상기 콜라겐 바이오패브릭에 가교되는 방법.
  93. 제89항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 히알루론산을 포함하는 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 히알루론산이 상기 콜라겐 바이오패브릭에 가교되는 방법.
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