MX2011001991A - Tratamiento de la apoplejia utilizando celulas placentarias aisladas. - Google Patents

Tratamiento de la apoplejia utilizando celulas placentarias aisladas.

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Abstract

Se proporcionan aquí los métodos para el tratamiento de la apoplejía que comprenden administrar a una víctima de apoplejía células madre placentarias, poblaciones de células que comprenden células madre placentarias, y/o composiciones que comprenden células madre placentarias.

Description

TRATAMIENTO DE LA APOPLEJÍA UTILIZANDO CÉLULAS PLACENTARIAS AISLADAS La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana No. 61/090,565 presentada el 20 de Agosto de 2008, la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad. 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan aquí métodos de uso de células placentarias aisladas, por ejemplo, células multipotentes placentarias , poblaciones de tales células placentarias aisladas, y/o composiciones que comprenden las células en el tratamiento de un individuo que tiene lesión hipóxica o una disrupción en el flujo de sangre dentro o alrededor del cerebro, por ejemplo, un síntoma de o un defecto, por ejemplo, un déficit neurologico atribuible a una disrupción en el flujo de sangre dentro o alrededor del cerebro. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La apoplejía, también conocida como un "ataque del cerebro", accidente cerebrovascular (CVA) o síndrome cerebrovascular isquémico agudo, es una pérdida de la(s) función (es) del cerebro, que usualmente se desarrolla rápidamente, que se debe a un disturbio en los vasos sanguíneos que suministran sangre al cerebro o al tallo cerebral. El disturbio puede ser isquemia (falta de sangre) causada por, por ejemplo, trombosis o embolismo, o se puede deber a una hemorragia. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, la apoplejía es un "déficit neurológico de causa cerebrovascular que persiste más allá de 24 horas o se interrumpe por la muerte dentro de 24 horas". La persistencia de los síntomas más allá de 24 horas separa la apoplejía del Ataque Isquémico Transitorio (TIA) , en que los síntomas persisten por menos que 24 horas.
Actualmente, el tratamiento de la apoplejía isquémica típicamente incluye medicación anti-plaquetas tales como la aspirina, clopidogrel, dipiridamol, o medicación anticoagulante, tal como warfarina, para reducir o aliviar el bloqueo que causa la isquemia. Además, los niveles de azúcar en la sangre se llevan a un nivel tan normal como sea posible, y el paciente de apoplejía se provee con oxígeno adecuado y fluidos intravenosos. El tratamiento de la apoplejía hemorrágica generalmente comprende uno o más de administración de un fármaco que aminora la presión sanguínea, administración de una medicación contra el dolor aparte de un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID) , administración de un bloqueador del canal de calcio (por ejemplo, Nimodipina) , y cirugía, si se indica, para reparar las rupturas de los vasos responsables por la hemorragia.
Sin embargo, tales tratamientos sólo intentan mitigar el daño neurológico en curso, y no hacen nada para restaurar la función perdida. Numerosos agentes neuroprotectores no celulares se han probado por eficacia en el tratamiento de la apoplejía, y han fallado, incluyendo antagonistas del receptor de N-metil-D-aspartato, nalmefeno, lubeluzol, clometiazol, bloqueadores del canal de calcio (incluyendo antagonistas del ácido a-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propriónico, agonistas de serotonina (por ejemplo, repinotano) , y moduladores del canal de potasio transmembrana) , tirilazad, anticuerpo anti-ICAM-I , anticuerpo antileucocítico humano (Hu23F2G) , anticuerpo anti-plaquetas (por ejemplo, abciximab) , citicolina (una forma exógena de la citidina-5'-difosfocolina ) , y factor de crecimiento del fibroblasto básico .
No hay tratamientos efectivos para la apoplejía. De esta manera, existe una necesidad por terapias que no sólo mitiguen el daño neurológico que surge de cualquier condición, sino mejoren la prognosis y la función neural. 3. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan aquí, en un aspecto, métodos para el uso de células placentarias aisladas, poblaciones de células placentarias aisladas, poblaciones de células que comprenden células madre placentarias aisladas y composiciones que comprenden las células placentarias aisladas en el tratamiento de un individuo que tiene una disrupción del flujo de sangre dentro o alrededor del sistema nervioso central (SNC) del individuo, por ejemplo el cerebro o la médula espinal. Los métodos comprenden, por ejemplo, el tratamiento de un síntoma o déficit neurologico en un individuo atribuible a una disrupción del flujo de sangre dentro o alrededor del cerebro del individuo, tal como lesión hipóxica, lesión anóxica, apoplejía (por ejemplo, apoplejía isquémica o hemorrágica) , hemorragia no atribuible a la apoplejía o TIA. Como se contempla aquí, el tratamiento de un síntoma o déficit neurologico en un individuo atribuible a una disrupción del flujo de sangre dentro o alrededor del cerebro del individuo incluye el tratamiento de síntomas o déficits neurológicos atribuibles a la lesión por reperfusión que puede acompañar tal disrupción del flujo de sangre dentro o alrededor del cerebro del individuo. El tratamiento exitoso de la apoplejía isquémica, por ejemplo, la lesión anóxica o la lesión hipóxica, se ha demostrado aquí en un modelo de apoplejía animal aceptado. Vea Ejemplo 1 y Ejemplo 2.
En un aspecto, se proporciona aquí un método para tratar un individuo que tiene una disrupción del flujo de sangre dentro o alrededor del cerebro del individuo, por ejemplo, quien tiene un síntoma o déficit neurologico atribuible a una disrupción del flujo de sangre dentro o alrededor del cerebro del individuo o del sistema nervioso central (SNC) , que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de células placentarias humanas adherentes al plástico de cultivo de tejidos aislados, en donde dichas células placentarias aisladas tienen características de células multipotentes o células madre. En ciertas modalidades, la disrupcion del flujo de sangre da como resultado lesión anóxica o lesión hipóxica para el cerebro del individuo o para el SNC .
En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas son células madre placentarias aisladas. En ciertas otras modalidades, las células placentarias aisladas son células multipotentes placentarias aisladas. En una modalidad específica, las células placentarias aisladas son CD34~, CD10+ y CD105+ según se detecta mediante citometría de flujo. En una modalidad más específica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ son células madre placentarias. En otra modalidad más específica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ son células placentarias multipotentes. En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ tienen el potencial para diferenciarse en células de un fenotipo osteogénico, o células de un fenotipo condrogénico . En otra modalidad, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ tienen el potencial para diferenciarse en células de un fenotipo neural. En una modalidad más específica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ son adicionalmente CD200+. En otra modalidad más específica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+ , CD105+ son adicionalmente CD90+ o CD45", según se detecta mediante citometría de flujo. En otra modalidad más especifica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ son adicionalmente CD90+ o CD45", según se detecta mediante citometría de flujo. En una modalidad más específica, las células placentarias CD34", CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ o CD45", según se detecta mediante citometría de flujo. En otra modalidad más específica, las células CD34", CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ y CD45", según se detecta mediante citometría de flujo. En otra modalidad más específica, las células CD34", CD10+, CD105+, CD200+, CD90+, CD45" son adicionalmente CD80" y CD86", según se detecta mediante citometría de flujo.
En una modalidad más específica, las células CD34", CD10+, CD105+ son adicionalmente una o más de CD29+, CD38", CD44+ , CD54+, CD80", CD86", SH3+ o SH4+. En otra modalidad más específica, las células son adicionalmente CD44+. En otra modalidad específica, las células placentarias CD34", CD10+, CD105+ son adicionalmente una o más de CD13+, CD29+, CD33+, CD38", CD44+ , CD45", CD54+, CD62E", CD62L", CD62P", SH3+ (CD73+) , SH4+ (CD73+), CD80", CD86", CD90+, SH2+ (CD105+) , CD 106/VCAM+, CD117", CD144/VE- caderinabaja, CD184/CXCR4", CD200+ , CD133", 0CT-4+ , SSEA3", SSEA4", ABC-p+, KDR" (VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR", HLA-G+, o Ligando de Muerte Programada 1 (PDL1)+, o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad más específica, las células placentarias CD34 , CD10+, CD105+ son adicionalmente CD13+, CD29+, CD33+, CD38", CD44+, CD45", CD54/ICAM+, CD62E", CD62L", CD62P", SH3+ (CD73+ ) , SH4+ (CD73+) , CD80", CD86", CD90+ , SH2+ (CD105+) , CD106/VCAM+, CD117", CD144/VE-caderinabaja, CD184 /CXCR4", CD200+ , CD133", 0CT-4+, SSEA3", SSEA4", ABC-p+, KDR" (VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR", HLA-G+, y Ligando de Muerte Programada 1 (PDL1)+.
En otras modalidades, las células placentarias aisladas son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+, y CD200+; CD200+ y OCT-4+ ; CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias que comprende dichas células placentarias aisladas cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de un cuerpo similar a un embrioide; u 0CT-4+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias que comprende las células placentarias aisladas cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides; o cualquier combinación de las mismas. En otras modalidades, las células placentarias aisladas son CD34", CD10+, CD105+, y adicionalmente son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+, y CD200+; CD200+ y 0CT-4+ ; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias que comprende dichas células placentarias aisladas cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de un cuerpo similar a un embrioide; u 0CT-4+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias que comprende las células placentarias aisladas cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides; o cualquier combinación de las mismas.
En una modalidad especifica, dichas células placentarias CD200+, HLA-G+ son CD34", CD38", CD45", CD73+ y CD105+. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, y CD200+ son CD34", CD38", CD45", y HLA-G+. En otra modalidad específica, dichas células madre CD200+, OCT-4+ son CD34", CD38", CD45", CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ y HLA-G+ son CD34", CD45", 0CT-4+ y CD200+. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD73+ y CD105+ son 0CT-4+, CD34", CD38" y CD45" En otra modalidad específica, dichas células son CD73+, CD105+, CD200+, CD34", CD38", y CD45".
En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas son una o más de CD10+ , CD29+, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54 + , CD90+, SH2+ , SH3+, SH4 +, SSEA3", SSEA4", 0CT-4+, MHC-I+ o ABC-p+, donde ABC-p es una proteína transportadora ABC específica de la placenta (también conocida como proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) y como proteína de resistencia a mitoxantrona (MXR) ) . En una modalidad específica, las células placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+ , SSEA3", SSEA4", y OCT-4 + . En otra modalidad, las células placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD45", CD54+ , SH2+, SH3+, y SH4+ . En otra modalidad, las células placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD45", CD54+, SH2+ , SH3+, SH4+ y OCT-4+. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54+ , CD90+ , HLA-I+, SH2+, SH3+, SH4+ . En otra modalidad, las células placentarias aisladas son OCT-4+ y ABC-p+. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son SH2+ , SH3+, SH4+ y OCT-4+. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son OCT-4+, CD34", SSEA3", y SSEA4". En una modalidad específica, dichas células OCT-4+, CD34", SSEA3", y SSEA4" son adicionalmente CD10+, CD29+, CD34", CD44 +, CD45", CD54+, CD90+, SH2+ , SH3+, y SH4+ . En otra modalidad, las células placentarias aisladas son 0CT-4+ y CD34", y ya sea SH3+ o SH4 + . En otra modalidad, las células placentarias aisladas son CD34" y ya sea CD10+ , CD294, CD44+, CD54+, CD90+, u OCT-4+. En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas son CD10+, CD34", CD105+ y CD200+.
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos son una o más de CD10+ , CD29", CD44+ , CD45", CD54/ICAM", CD62-E", CD62-L", CD62-P", CD80", CD86", CD103", CD104", CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-caderinabaja, CD18 /CXCR4", p2-microglobulinabaja, HLA-I aja, HLA-II", HLA-Gbaja, y/o PDLlbaja. En una modalidad especifica, las células placentarias aisladas son al menos CD29" y CD54". En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son al menos CD44+ y CD106+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son al menos CD29+.
En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes son uno o más de ACTG2, ADARB1, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, EL0VL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3 , PKP2 , RTNl , SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, y ZC3H12A, y en donde dichas células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea han experimentado un número de pasos en cultivo equivalente al número de pasos que dichas células placentarias aisladas han experimentado. En una modalidad más específica, dichas células placentarias aisladas expresan dichos uno o más genes cuando se cultivan durante aproximadamente 3 hasta aproximadamente 35 duplicaciones de la población en un medio que comprende DMEM-LG al 60% (por ejemplo, a partir de Gibco) y MCDB-201 al 40% (por ejemplo, a partir de Sigma); suero de becerro fetal al 2% (por ejemplo, a partir de Hyclone Labs.); lx insulina-transferrina-selenio (ITS); lx ácido linoleico-albumina de suero bovino (LA-BSA); dexametasona 10~9 M (por ejemplo, a partir de Sigma) ; ácido ascórbico 2-fosfato 10~4 M (por ejemplo, a partir de Sigma) ; factor de crecimiento epidérmico 10 ng/mL (por ejemplo, a partir de R&D Systems); y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL (por ejemplo, a partir de R&D Systems) . En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas expresan dichos uno o más genes cuando se cultivan durante desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 35 duplicaciones de la población en un medio que comprende DMEM-LG al 60% (por ejemplo, a partir de Gibco) y MCDB-201 al 40% (por ejemplo, a partir de Sigma) ; suero de becerro fetal al 2% (por ejemplo, a partir de Hyclone Labs.); lx insulina-transferrina-selenio (ITS); lx ácido linoleico-albumina de suero bovino (LA-BSA) ; dexametasona 10"9 M (por ejemplo, a partir de Sigma) ; ácido ascórbico 2-fosfato 10"4 M (Sigma) ; factor de crecimiento epidérmico 10 ng/mL (por ejemplo, a partir de R&D Systems) ; y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL (por ejemplo, a partir de R&D Systems) .
En otra modalidad especifica del método de tratamiento, dichas células madre placentarias expresan los factores de crecimiento neurotróficos , factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , factor de crecimiento placentario (PGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) .
En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas están contenidas dentro de una población de células, al menos 50% de las células de la población son dichas células placentarias aisladas. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas están contenidas dentro de una población de células, al menos 70% de las células de la población son dichas células placentarias aisladas. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas están contenidas dentro de una población de células, al menos 80% de las células de la población son dichas células placentarias aisladas. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas están contenidas dentro de una población de células, al menos 90% de las células de la población son dichas células placentarias aisladas. En ciertas otras modalidades, las células placentarias en dicha población de células están sustancialmente libres de células que tienen un genotipo materno; por ejemplo, al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células placentarias en dicha población tienen un genotipo fetal, es decir, son de origen fetal. En ciertas otras modalidades, la población de células que comprende dichas células placentarias está sustancialmente libre de células que tienen un genotipo materno; por ejemplo, al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en dicha población tienen un genotipo fetal, es decir, son de origen fetal.
En ciertas modalidades, cualquiera de las células placentarias, por ejemplo, las células madre placentarias o las células multipotentes placentarias aquí descritas, son autólogas para un receptor, por ejemplo, un individuo quien ha tenido una apoplejía, o tiene un síntoma de una apoplejía. En ciertas otras modalidades, cualquiera de las células placentarias, por ejemplo, las células madre placentarias o las células multipotentes placentarias aquí descritas, son heterólogas para un receptor, por ejemplo, un individuo quien ha tenido una apoplejía, o tiene un síntoma de una apoplejía.
En otra modalidad específica del método de tratamiento, dichas células placentarias aisladas son criopreservadas antes de dicha administración. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas se obtienen a partir de un banco de células madre placentarias.
En cualquiera de las modalidades anteriormente mencionadas de las células placentarias aisladas, las células placentarias aisladas generalmente no se diferencian durante el cultivo en el medio de crecimiento, es decir, el medio formulado para promover la proliferación, por ejemplo, durante la proliferación en el medio de crecimiento. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas no requieren una capa alimentadora para proliferar. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas no se diferencian en el cultivo como el resultado del cultivo en la ausencia una capa celular alimentadora.
En otra modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas se obtienen mediante perfusión de una placenta después del parto que se ha drenado de sangre y perfusado para remover la sangre residual; drenado de sangre pero no perfusado para remover la sangre residual; o ni drenado de sangre ni perfusado para remover la sangre residual. En otra modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas se obtienen mediante disrupción física y/o enzimática de tejido placentario.
Los marcadores de la superficie celular, moleculares y genéticos de las células placentarias, útiles en los métodos aquí provistos, se describen en detalle en la Sección 5.4.2, debaj o .
En otra modalidad específica, dicha disrupción del flujo de sangre es una apoplejía. En una modalidad más específica, dicha apoplejía es una apoplejía isquémica. En otra modalidad más específica, dicha apoplejía es una apoplejía hemorrágica, por ejemplo, una hemorragia cerebral intracraneal o una hemorragia subaracnoidea espontánea. En otra modalidad específica, dicha disrupción es un hematoma. En modalidades más específicas, el hematoma es un hematoma dural, un hematoma subdural o un hematoma subaracnoideo . En otra modalidad específica, dicho hematoma es causado por una fuerza externa sobre el cráneo, por ejemplo, una lesión en la cabeza. En otra modalidad específica, dicha disrupción es un Ataque Isquémico Transitorio (TIA), por ejemplo, TIA recurrente. En otra modalidad específica, dicha disrupción es un vasoespasmo, por ejemplo, un vasoespasmo que sigue a una apoplejía hemorrágica.
En otra modalidad específica del método, dicha cantidad terapéuticamente efectiva es un número de células placentarias aisladas que da como resultado la eliminación de, una mejora detectable en, disminución de la severidad de, o desaceleración de la progresión de uno o más síntomas de, o déficits neurológicos atribuibles a, una disrupción del flujo de sangre dentro o alrededor del cerebro o SNC exhibida por dicho individuo, por ejemplo, lesión anóxica o lesión hipóxica. En otra modalidad específica, dicha cantidad terapéuticamente efectiva de células placentarias aisladas se administra a dicho individuo de manera profiláctica, por ejemplo, para reducir o eliminar el daño neurológico causado por una segunda o subsiguiente disrupción del flujo de sangre dentro o alrededor del cerebro o SNC que sigue a dicha disrupción del flujo de sangre.
En otra modalidad especifica, dicho síntoma de disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro, por ejemplo, apoplejía, lesión anóxica o lesión hipóxica, es uno o más de hemiplejía (parálisis de un lado del cuerpo); hemiparesía (debilidad en un lado del cuerpo) ; debilidad muscular de la cara; entumecimiento; reducción en la sensación; sentido del olfato, sentido del gusto, audición, o vista alterados; pérdida de olor, sabor, audición, o vista; caída de un párpado (ptosis) ; debilidad detectable de un músculo ocular; reflejo náuseo disminuido; habilidad disminuida de tragar; reactividad disminuida de la pupila a la luz; sensación disminuida de la cara; balance disminuido; nistagmo; velocidad de respiración alterada; ritmo cardiaco alterado; debilidad en el músculo esternocleidomastoideo con habilidad disminuida o incapacidad para girar la cabeza hacia un lado; debilidad en la lengua; afasia (incapacidad de hablar o comprender un lenguaje) ; apraxia (movimientos voluntarios alterados) ; un defecto del campo visual; un déficit de memoria; hemidesatención o desatención hemiespacial (déficit en la atención al espacio en un lado del campo visual opuesto a la lesión) ; pensamiento desorganizado; confusión; desarrollo de gestos hiper-sexuales; anosognosia (negativa persistente de la existencia de un déficit) ; dificultad para caminar; coordinación alterada del movimiento; vértigo; desequilibrio; pérdida del conocimiento; dolor de cabeza; y/o vómitos.
En otra modalidad especifica de los métodos de tratamiento descritos anteriormente, dichas células placentarias aisladas se administran mediante inyección en bolo. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas se administran mediante infusión intravenosa. En una modalidad especifica, dicha infusión intravenosa es infusión intravenosa sobre aproximadamente 1 hasta aproximadamente 8 horas. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas se administran intracranealmente . En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas se administran intraperitonealmente. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas se administran intra-arterialmente . En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas se administran dentro de un área de isquemia. En otra modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas se administran a un área periférica a una isquemia. En otra modalidad especifica del método de tratamiento, dichas células placentarias aisladas se administran intramuscularmente, intradérmicamente, subcutáneamente, o intraocularmente .
En otra modalidad de los métodos de tratamiento descritos anteriormente, dichas células placentarias aisladas se administran mediante implantación quirúrgica en dicho individuo de una composición de materia que comprende dichas células placentarias aisladas. En una modalidad más especifica, dicha composición de materia es una matriz o soporte. En otra modalidad más especifica, dicha matriz o soporte es un hidrogel. En otra modalidad más especifica, dicha matriz o soporte es un tejido descelularizado . En otra modalidad más especifica, dicha matriz o soporte es una composición biodegradable sintética. En otra modalidad más especifica, dicha matriz o soporte es una espuma.
En otra modalidad específica de los métodos de tratamiento descritos anteriormente, dichas células placentarias aisladas se administran una vez a dicho individuo. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas se administran a dicho individuo en dos o más administraciones separadas. En otra modalidad específica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 104 y 1 x 105 células placentarias aisladas, por ejemplo, células madre placentarias por kilogramo de dicho individuo. En otra modalidad específica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 105 y 1 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo. En otra modalidad específica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 106 y 1 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo. En otra modalidad especifica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 107 y 1 x 108 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo. En otras modalidades especificas, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 106 y aproximadamente 2 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 2 x 106 y aproximadamente 3 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 3 x 106 y aproximadamente 4 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 4 x 106 y aproximadamente 5 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 5 x 106 y aproximadamente 6 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 6 x 106 y aproximadamente 7 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 7 x 106 y aproximadamente 8 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 8 x 106 y aproximadamente 9 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; o entre aproximadamente 9 x 106 y aproximadamente 1 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo. En otra modalidad especifica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 107 y aproximadamente 2 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo a dicho individuo. En otra modalidad especifica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1.3 x 107 y aproximadamente 1.5 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo a dicho individuo. En otra modalidad especifica, dicha administración comprende administrar hasta aproximadamente 3 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo a dicho individuo. En una modalidad especifica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 5 x 106 y aproximadamente 2 x 107 células placentarias aisladas a dicho individuo. En otra modalidad especifica, dicha administración comprende administrar aproximadamente 150 x 106 células placentarias aisladas en aproximadamente 20 mililitros de solución a dicho individuo.
En una modalidad especifica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 5 x 106 y aproximadamente 2 x 107 células 'placentarias aisladas a dicho individuo, en donde dichas células están contenidas en una solución que comprende dextrano al 10%, por ejemplo, dextrano-40, albúmina de suero humano al 5%, y opcionalmente un inmunosupresor .
En otra modalidad especifica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 5 x 107 y 3 x 109 células placentarias aisladas intravenosamente. En modalidades más especificas, dicha administración comprende administrar aproximadamente 9 x 108 células placentarias aisladas o aproximadamente 1.8 x 109 células placentarias aisladas intravenosamente. En otra modalidad especifica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 5 x 107 y 1 x 108 células placentarias aisladas intracranealmente . En una modalidad más especifica, dicha administración comprende administrar aproximadamente 9 x 107 células placentarias aisladas intracranealmente.
En otra modalidad especifica, los métodos de tratamiento descritos anteriormente comprenden administrar un segundo agente terapéutico a dicho individuo. En una modalidad más especifica, dicho segundo agente terapéutico es un agente neuroprotector . En una modalidad más especifica, dicho segundo agente terapéutico es NXY-059 (un derivado de disulfonilo de fenilbutilnitrona : N-óxido de 4- ( (ter-butilimino) -metil ) benceno-1 , 3-disulfonato de disodio, o 4- ( (óxido-ter-butil-azanioilideno)metil)benceno-l, 3-disulfonato de disodio; también conocido como disufenton) . En otra modalidad más especifica, el segundo agente terapéutico es un agente trombolítico . En una modalidad más específica, dicho agente trombolítico es activador del plasminógeno tisular (tPA) . En las modalidades en las cuales la disrupción del flujo de sangre dentro o alrededor del cerebro es una hemorragia, el segundo agente terapéutico puede ser un fármaco antihipertensivo, por ejemplo, un beta bloqueador o fármaco diurético, una combinación de un fármaco diurético y un fármaco diurético que ahorra potasio, una combinación de un beta bloqueador y un fármaco diurético, una combinación de un inhibidor de la" enzima convertidora de la angiotensina (ACE) y un diurético, un antagonista de la angiotensina-II y un fármaco diurético, y/o un bloqueador del canal de calcio y un inhibidor de la ACE. En otra modalidad más especifica, el segundo agente terapéutico es un bloqueador del canal de calcio, antagonista de glutamato, agonista del ácido aminobutirico gamma (GABA) , un antioxidante o depurador de radicales libres.
En otra modalidad especifica del método de tratamiento, dichas células placentarias aisladas se administran a dicho individuo dentro de 21-30, por ejemplo, 21 dias de desarrollo de uno o más síntomas de una disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro de dicho individuo, por ejemplo, dentro de 21-30, por ejemplo, 21 días de desarrollo de los síntomas de apoplejía, lesión anóxica o lesión hipóxica. En otra modalidad específica del método de tratamiento, dichas células placentarias aisladas se administran a dicho individuo dentro de 14 días de desarrollo de uno o más síntomas de una disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro de dicho individuo. En otra modalidad específica del método de tratamiento, dichas células placentarias aisladas se administran a dicho individuo dentro de 7 días de desarrollo de uno o más síntomas de una disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro de dicho individuo. En otra modalidad específica del método de tratamiento, dichas células placentarias aisladas se administran a dicho individuo dentro de 48 horas de desarrollo de uno o más síntomas de una disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro de dicho individuo. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas se administran a dicho individuo dentro de 24 horas de desarrollo de uno o más síntomas de una disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro de dicho individuo. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas se administran a dicho individuo dentro de 12 horas de desarrollo de uno o más síntomas de una disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro de dicho individuo. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas se administran a dicho individuo dentro de 3 horas de desarrollo de uno o más síntomas de una disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro de dicho individuo. 3.1 DEFINICIONES Cuando se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" al referirse a un valor numérico establecido, indica un valor dentro de más o menos 20% del valor numérico establecido.
Cuando se utiliza en la presente, el término "lesión anóxica" se refiere a un daño, por ejemplo, una lesión o síntoma neurológico, causado por una falta total de oxígeno en un área del cerebro o SNC.
Cuando se utiliza en la presente, el término "lesión hipóxica" se refiere a una lesión, por ejemplo, lesión o síntoma neurológico, causado por una falta parcial de oxígeno en un área del cerebro o SNC.
Cuando se utiliza en la presente, el término "SH2" se refiere a un anticuerpo que une un epítope en el marcador CD105 celular. Por consiguiente, las células que se mencionan como SH2+ son CD105+.
Cuando se utilizan en la presente, los términos "SH3" y "SH4" se refieren a anticuerpos que unen los epítopes presentes en el marcador celular CD73. Por consiguiente, las células que se mencionan como SH3+ y/o SH4+ son CD73+.
Una placenta tiene el genotipo del feto que se desarrolla dentro de la misma, aunque el mismo también esté en contacto físico cercano con tejidos maternos durante la gestación. Como tal, cuando se utiliza en la presente, el término "genotipo fetal" significa el genotipo del feto, por ejemplo, el genotipo del feto asociado con la placenta a partir del cual se obtienen células placentarias , aisladas, particulares, como se describe en la presente, a diferencia del genotipo de la madre que porta el feto. Cuando se utiliza en la presente, el término "genotipo materno" significa el genotipo de la madre que porta el feto, por ejemplo, el feto asociado con la placenta a partir de la cual se obtienen células placentarias , aisladas, particulares, como se describe en la presente.
Cuando se utiliza en la presente, el término "célula aislada", por ejemplo, "célula madre aislada", significa una célula que sustancialmente está separada de otra, diferentes células del tejido, por ejemplo, placenta, a partir de la cual se deriva la célula madre. Una célula está "aislada" si al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o al menos 99% de las células, por ejemplo, células que no son células madre, con las cuales la célula madre está asociada de manera natural, o células madre que exhiben un perfil de marcador diferente, se remueven de la célula madre, por ejemplo, durante la recolección y/o cultivo de la célula madre.
Cuando se utiliza en la presente, "multipotente" , al referirse a una célula, significa que la célula tiene la capacidad de diferenciarse en algún, aunque no necesariamente todos, los tipos de células del cuerpo, o en células que tienen características de algunos, aunque no todos, los tipos de células del cuerpo. En ciertas modalidades, por ejemplo, una célula placentaria aislada que tiene la capacidad de diferenciarse en una célula que tiene características de células neurogénicas , condrogénicas y/u osteogénicas es una célula multipotente.
Cuando se utiliza en la presente, el término "población de células aisladas" significa una población de células que sustancialmente está separada de otras células de un tejido, por ejemplo, placenta, a partir del cual se deriva la población de células.
Cuando se utiliza en la presente, el término "célula madre placentaria" se refiere a una célula madre o célula progenitora que se deriva de una placenta de mamífero, independientemente de la morfología, marcadores de superficie celular, o el número de pasadas después de un cultivo primario. El término "célula madre placentaria" que se utiliza en la presente, sin embargo, no se refiere a, y una célula madre placentaria no es, sin embargo, un trofoblasto, angioblasto, un hemanglioblasto, una célula germinal embrionaria, una célula madre embrionaria, una célula obtenida de una masa celular interna de un blastocito, o una célula obtenida de una cresta gonadal de un embrión tardío, por ejemplo, una célula germinal embrionaria. Una célula se considera una "célula madre" si la célula exhibe atributos de una célula madre, por ejemplo, un marcador o perfil de expresión genética asociado con uno o más tipos de células madre; la capacidad de replicarse al menos 10-40 veces en el cultivo, y la capacidad de diferenciarse en células que exhiban características de células diferenciadas de una o más de las tres las capas germinales. Los términos "célula madre placentaria" y "célula madre derivada de placenta" pueden utilizarse indistintamente. A menos que se indique de otra manera en la presente, el término "placentario" incluye el cordón umbilical. Las células placentarias aisladas dadas a conocer en la presente, en ciertas modalidades, se diferencian in vitro bajo condiciones de diferenciación, se diferencian in vivo, o en ambas.
Cuando se utiliza en la presente, una célula placentaria es "positiva" para un marcador particular cuando el marcador es detectable arriba del fondo. Por ejemplo, una célula placentaria es positiva, por ejemplo, para CD73 debido a que el CD73 es detectable en células placentarias en una cantidad detectablemente mayor que el fondo (en comparación con, por ejemplo, un control con isotipos) . Una célula también es positiva para un marcador cuando ese marcador se puede utilizar para distinguir la célula de al menos otro tipo de célula, o se puede utilizar para seleccionar o aislar la célula cuando se presenta o expresa por la célula. En el contexto de, por ejemplo, una detección mediada por anticuerpos, "positiva", cuando una indicación de que está presente un marcador de superficie celular, particular, significa que el marcador es detectable utilizando un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo etiquetado fluorescentemente, especifico para ese marcador; "positivo" también se refiere a una célula que exhibe el marcador en una cantidad que produce una señal, por ejemplo, en un citómetro, que es detectable arriba del fondo. Por ejemplo, una célula es "CD200+" cuando la célula se etiqueta detectablemente con un anticuerpo especifico para CD200, y la señal del anticuerpo es detectablemente más alta que la de un control (por ejemplo, fondo o un control con isotipos). Por el contrario, "negativo" en el mismo contexto significa que el marcador de superficie celular no es detectable utilizando un anticuerpo especifico para ese marcador en comparación con un control (por ejemplo, fondo o un control con isotipos) . Por ejemplo, una célula es "CD34~" cuando la célula no se etiqueta de manera detectablemente reproducible con un anticuerpo especifico para el CD34 a un grado mayor al de un control (por ejemplo, fondo o un control de isotipo) . Se determina que los marcadores no detectados, o no detectables, utilizando anticuerpos, son positivos o negativos de una manera similar, utilizando un control apropiado. Por ejemplo, una célula o población de células se puede determinar que es 0CT-4+ si la cantidad de ARN del OCT-4 detectado en el ARN de la célula o población de células es detectablemente mayor que el fondo cuando se determina por ejemplo, mediante un método para detectar ARN tal como RT-PCR, transferencias por ranura, etc. A menos que se indique de otra manera en la presente, se detecta una agregado de marcadores de diferenciación ("CD") utilizando anticuerpos. En ciertas modalidades, se determina que el OCT-4 está presente, y una célula es "0CT-4+" si el OCT-4 es detectable utilizando RT-PCR.
Cuando se utiliza en la presente, "tratar" abarca la cura de, remedio de, mejora de, disminución de la severidad de, o reducción en la evolución de, un padecimiento, trastorno o condición, o cualquier parámetro o síntoma del mismo. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIG. 1: Resultados del Análisis de Oscilación de Cuerpos Elevados. Eje vertical: porcentaje de actividad de oscilación sesgada. Eje horizontal: día que se evalúa la actividad de oscilación. La Línea base es el porcentaje de actividad de oscilación sesgada previo a la isquemia inducida. El porcentaje de actividad de oscilación sesgada también se evaluó el Día 2 post-infarto antes de administrarse intracranealmente células placentarias aisladas, y de nuevo los días 7 y 14 post-infarto. 400K viable: 4 x 105 células placentarias, aisladas, viables. No viable: células madre, placentarias, no viables. CsA: ciclosporina A.
FIG. 2: Resultados del Análisis Bederson. Eje vertical: Puntuación de Déficit Neurológico Medio. Eje horizontal: día que se evalúa el déficit neurológico. La línea base es el déficit neurológico previo a la isquemia inducida; 0 indica que no hay déficit. La actividad neurológica media también se evaluó el Día 2 -post-infarto en el momento que se administraron células placentarias aisladas, y de nuevo los días 7 y 14 post-infarto . 400K viable: 4 x 105 células placentarias, aisladas, viables. No viable: células madre, placentarias, no viables. CsA: ciclosporina A.
FIG. 3: Resultados del Análisis de Oscilación de Cuerpos Elevados. Eje vertical: porcentaje de la actividad de oscilación sesgada. Eje horizontal: día que se evalúa la actividad de oscilación. La Linea Base es el porcentaje de actividad de oscilación sesgada previo a la isquemia inducida. El porcentaje de actividad de oscilación sesgada también se evaluó el Día 2 post-infarto en el momento que se administraron intravenosamente células placentarias aisladas, y de nuevo los días 7 y 14 post-infarto. No viable: células madre, placentarias, no viables. Se administraron 4 x 105, 1 x 106, 4 x 106 u 8 x 106 células placentarias, aisladas, viables (leyenda) .
FIG. 4: Resultados del Análisis Bederson. Eje vertical: Puntuación del Déficit Neurológico Medio. Eje horizontal: dia que se evalúa el déficit neurológico. La linea base es el déficit neurológico previo a la isquemia inducida; 0 indica que no hay déficit. También se evaluó la actividad neurologica el Dia 2 post-infarto en el momento que se administraron intravenosamente las células placentarias aisladas, y de nuevo los días 7 y 14 post-infarto. No viable: células madre, placentarias, no viables. Se administraron 4 x 105, 1 x 106, 4 x 106 u 8 x 106 células placentarias, aisladas, viables (leyenda) .
FIG. 5: Resultados de la prueba de Puntuación de Severidad Neural Modificada. Eje Y: puntuación (ver la Tabla 1 para método de puntuación) . Eje X: Días después de la cirugía de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) . PDA: Células madre placentarias; Control FBC : control con fibroblastos: Dextrano, control sin células; 1PDA, 1 x 106 células; PDA, 4 x 106 células; 8 PDA, 8 x 106 células. Rx: Administración de células o dextrano.
FIG. 6: Resultados de la prueba somatosensorial de remoción adhesiva. Eje Y: Número de segundos para la remoción del artículo de análisis adhesivo. Eje X: Días después de la cirugía de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) . PDA:-Células madre placentarias; Control FBC: control con fibroblastos: Dextrano, control sin células; 1PDA, 1 x 10 células; 4 PDA, 4 x 106 células; 8PDA, 8 x 106 células. Rx: Administración de células o dextrano.
FIG. 7: Resultados de la prueba de falta de saque "foot fault" (prueba para evaluar la función locomotora en individuos con isquemia) . Eje Y: porcentaje de faltas de saque, de 100 pasos, en una rejilla de metal. Eje X: número de días después de que se realizó la prueba de falta de saque para el tratamiento (Rx) . *: Mejora (p<0.05) significativa en la prueba de falta de saque para un animal que recibe 4 x 106 células madre placentarias (PDA-4M) vs . control con vehículo. #: Mejora (p<0.05) significativa en la prueba de falta de saque para un animal que recibe .4 x 106 células madre placentarias (PDA-4M) vs . control de fibroblastos.
FIG. 8: Medición de la angiogénesis 56 días posttratamiento después de la oclusión de la Arteria Cerebral Media. El tratamiento con células madre placentarias incrementa significativamente la proliferación de células endoteliales , y la densidad vascular y el perímetro vascular en la zona limítrofe isquémica (IBZ) . N=10/grupo. FIG. 8A: Mancha de anticuerpos anti-BrdU detectada en secciones del cerebro en parafina. Eje Y: Porcentaje de células endoteliales (ECs) positivas a BrDU en el borde de la lesión isquémica; eje X: condiciones experimentales (MCAo-Dex: oclusión de la Arteria Cerebral Media-dextrano (pre-tratamiento de la condición inicial); Control con células: administración de fibroblastos; PDA-4M: administración de 4 x 106 células madre placentarias) . #: incremento (p<0.05) significativo en la proliferación de células endoteliales en la condición PDA-4M vs. control con fibroblastos. *: Incremento (p<0.05) significativo en la proliferación de células endoteliales en la condición PDA-4M vs . control con dextrano (vehículo) . FIG. 8B: Densidad vascular en la zona limítrofe isquémica después del tratamiento con células madre placentarias. Eje Y: número de vasos por mm3; eje X: condiciones experimentales (MCAo-Dex: oclusión de la Arteria Cerebral edia-dextrano (pre-tratamiento de la condición inicial); Control con células: administración de fibroblastos; PDA-4M: administración de 4 x 106 células madre placentarias ) . #: incremento (p<0.05) significativo en la densidad vascular o de vasos en la condición PDA-4M vs . control con fibroblastos. * : Incremento (p<0.05) significativo en la densidad vascular en la condición PDA-4M vs . control con dextrano (vehículo). FIG. 8C: Incremento en el perímetro vascular alrededor de la zona limítrofe isquémica. Eje Y: longitud del perímetro vascular en milímetros; eje X: condiciones experimentales (MCAo-Dex: oclusión de la Arteria Cerebral Media-dextrano (pre-tratamiento de la condición inicial); Control con células: administración de fibroblastos; PDA-4M: administración de 4 x 106 células madre placentarias). #: incremento (p<0.05) significativo en la longitud del perímetro vascular en la condición PDA-4M vs . control con fibroblastos. *: Incremento (p<0.05) significativo en la longitud del perímetro vascular en la condición PDA-4M vs . control con dextrano (vehículo).
FIG. 9: El tratamiento con células madre placentarias incrementa significativamente la expresión de la Sinaptofisina en el borde isquémico del cerebro con isquemia. N=10/grupo. Eje Y: % del área examinada en una sección de cerebro en parafina en la cual se detecta sinaptofisina; Eje X: condiciones experimentales. MCAo : Expresión de la sinaptofisina al momento de la oclusión de la Arteria Cerebral Media; Control con células: administración de fibroblastos; PDA-4'?: administración de 4 x 106 células madre placentarias ) . *: Incremento significativo en el área de expresión de la sinaptofisina en PDA-4M vs . control celular con fibroblastos. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA 5.1 TRATAMIENTO DE INTERRUPCIONES DEL FLUJO SANGUÍNEO EN Y ALREDEDOR DEL CEREBRO En la presente se proporcionan métodos para el tratamiento de un individuo que tiene una interrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro del individuo, por ejemplo, tratamiento de uno o más síntomas o déficit neurológico atribuible a la interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro del individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de células placentarias, humanas, adherentes al plástico del cultivo de tejido, aisladas, en donde dichas células placentarias aisladas tienen características de células multipotentes o células madre, y en donde dichas células placentarias aisladas no son células mesenquimatosas derivadas de médula ósea, células madre mesenquimatosas derivadas de tejido adiposo, o células mesenquimatosas obtenidas de sangre de cordón umbilical, sangre de placenta, o sangre periférica. En ciertas modalidades, la lesión es una lesión hipóxica o lesión anóxica. En ciertas modalidades proporcionadas en la presente, dicha cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que da como resultado la eliminación de, una mejora detectable en, disminución de la severidad de, o retardo del avance de uno o más síntomas de, o déficit neurologico atribuible a, la interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro del individuo, exhibida por dicho individuo .
En una modalidad específica, uno o más síntomas o déficit neurologico, por ejemplo, síntoma de apoplejía, lesión hipóxica o lesión anóxica, es atribuible al menos en parte, o completamente, al daño por reperfusión después de una interrupción del flujo de sangre. Cuando se utiliza en la presente, "daño por reperfusión" se refiere al daño en el tejido causado cuando el suministro interrumpido de sangre regresa al tejido después de un período de isquemia. La ausencia de oxígeno en la sangre y nutrición durante la isquemia crea una condición en la cual la restauración de la circulación da como resultado la inflamación y daño oxidativo a través de la inducción de estrés oxidativo en vez de la restauración de la función normal.
Cuando se utiliza en la presente, el término "interrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro" en el contexto del tratamiento de tal interrupción, abarca el tratamiento de uno o más síntomas exhibidos por un individuo que tiene la interrupción y el tratamiento de déficits neurológicos en el individuo que son atribuibles a la interrupción, por ejemplo, uno o más síntomas de apoplejía, lesión hipóxica o lesión anóxica. En ciertas modalidades, uno o más síntomas son uno o más síntomas atribuibles principalmente, o por completo, a la isquemia misma. En ciertas otras modalidades, uno o más síntomas son uno o más síntomas atribuibles principalmente, o por completo, al daño por reperfusión, por ejemplo, asociado con isquemia. 5.2 APOPLEJÍA La interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC tratable con los métodos provistos en la presente, puede ser cualquier interrupción del flujo de sangre que causa uno o más síntomas detectables o déficits neurológicos en el individuo afectado (ver más adelante) . En ciertas modalidades, la interrupción de flujo sanguíneo es una apoplejía, por ejemplo, una apoplejía isquémica o una apoplejía hemorrágica, por ejemplo, una hemorragia cerebral intracraneal. En ciertas otras modalidades, la interrupción del flujo sanguíneo es una hemorragia fuera del cerebro, por ejemplo, un hematoma dural, un hematoma subdural o hematoma subaracnoideo . En ciertas otras modalidades, la interrupción del flujo de sangre es transitoria, por ejemplo, un Ataque Isquémico Transitorio (TIA) . En ciertas otras modalidades, la interrupción del flujo sanguíneo es un vasospasmo o espasmo vascular. En una modalidad específica, la interrupción del flujo sanguíneo en el cerebro ocurre en el telencéfalo. En modalidades más específicas, la interrupción ocurre en el lóbulo parietal, lóbulo frontal, lóbulo temporal, o lóbulo occipital del telencéfalo. En otra modalidad específica, la interrupción ocurre en el cerebelo. En otra modalidad específica, la interrupción ocurre en el tronco cerebral o espina dorsal. En ciertas modalidades, la interrupción causa lesión hipoxica o lesión anóxica.
En una modalidad, en la presente se proporciona un método para tratar a un individuo que padece lesión hipoxica o lesión anóxica, por ejemplo, apoplejía (por ejemplo, una víctima de apoplejía) que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de células placentarias adherentes al plástico del cultivo de tejido, aisladas, como se describe en la presente, por ejemplo, en la Sección 5.4.2, posterior. En una modalidad específica, dicha cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que da como resultado la eliminación de, una mejora detectable en, disminución de la severidad de, o retardo del avance de uno o más síntomas de apoplejía exhibidos por dicho individuo. Las células placentarias aisladas, por ejemplo, una pluralidad o población aislada de células placentarias aisladas, puede ser cualquiera de las células placentarias aisladas descritas en alguna otra parte en la presente, por ejemplo, en la Sección 5.4.2, posterior.
La apoplejía tratable de acuerdo a los métodos proporcionados en la .presente puede ser una apoplejía atribuible a cualquier causa. En una modalidad específica, la apoplejía es apoplejía isquémica. En modalidades más específicas, la apoplejía isquémica es apoplejía trombótica o apoplejía por embolia. En otra modalidad específica, la apoplejía se debe a una hipoperfusión sistémica, es decir, una reducción del flujo sanguíneo en todas las partes del cuerpo; o se debe a trombosis venosa. En otras modalidades específicas, la apoplejía isquémica es causada por fibrilación del corazón, por ejemplo, fibrilación atrial; fibrilación atrial, paroxismal; padecimiento reumático; padecimiento de la válvula mitral o aórtica; válvulas de corazón artificial; trombo cardiaco del atrio o ventrículo; síndrome del seno enfermo; palpitación atrial sostenida; infarto del miocardio; infarto del miocardio crónico junto con una fracción de eyección menor de 28 por ciento; insuficiencia cardiaca, congestiva, sintomática, con una fracción de eyección menor de 30 por ciento; cardiomiopatía; endocarditis, por ejemplo, endocarditis de Libman-Sacks , endocarditis marántica o marasmática o endocarditis infecciosa; fibroelastoma papilar; mixoma del atrio izquierdo; cirugía de injerto de derivación arterial coronaria; calcificación del anillo o corona de la válvula mitral; agujero oval evidente; aneurisma septal atrial, aneurisma del ventrículo izquierdo sin trombos, "humo" atrial, izquierdo, aislado en ecocardiografía sin estenosis mitral o fibrilación atrial; y/o ateroma complejo en la aorta ascendente o arco proximal.
En otra modalidad específica, la apoplejía es apoplejía hemorrágica . En modalidades más específicas, la apoplejía hemorrágica es causada por hemorragia intra-axial (derrame de sangre dentro del cerebro) . En otra modalidad más específica, dicha apoplejía hemorrágica es causada por hemorragia extra-axial (sangre dentro del cráneo pero fuera del cerebro) . En modalidades más específicas, la apoplejía es causada por hemorragia intraparenquimatosa, hemorragia intraventricular (sangre en el sistema ventricular) , hematoma epidural (sangrado entre la duramadre y el cráneo) , hematoma subdural (sangrado en el espacio subdural), o hemorragia subaracnoidea (entre la aracnoides y la piamadre) . La mayoría de los síndromes de apoplejía hemorrágica tiene síntomas específicos (por ejemplo, dolor de cabeza, herida en la cabeza previa) . En otras modalidades más específicas, la apoplejía hemorrágica es causada por o está asociada con hipertensión, trauma, trastornos hemorrágicos , angiopatía amiloidea, uso de drogas ilícitas (por ejemplo, anfetaminas o cocaína) , o una malformación vascular.
En otra modalidad, se proporciona en la presente un método de tratamiento de un individuo que tiene una interrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC del individuo, por ejemplo, tratamiento de uno o más síntomas o déficit neurológico atribuible a la interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC del individuo que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de células placentarias aisladas, por ejemplo, células madre placentarias o células multipotentes placentarias, en donde dicha interrupción del flujo de sangre proviene de una causa inmediata aparte de la apoplejía, por ejemplo, un traumatismo de cráneo cerrado o hematoma no relacionado con un impacto. En una modalidad específica, dicha cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que da como resultado la eliminación de, una mejora detectable en, disminución de la severidad de, o retraso del avance de uno o más síntomas de la interrupción exhibida por dicho individuo. Como en el caso de la apoplejía, las células placentarias aisladas puede ser cualquiera de las células placentarias, por ejemplo, células madre placentarias o células multipotentes placentarias, descritas en otra parte de la presentes, por ejemplo, en la Sección 5.4.2, posterior.
Como se indica anteriormente, en ciertas modalidades, el método de tratamiento proporcionado en la presente da como resultado la eliminación de, una mejora detectable en, una disminución de la severidad de, o un retraso del avance de uno o más síntomas de una interrupción de flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC o un déficit neurológico atribuible a una interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC, por ejemplo, apoplejía, hematoma, por ejemplo, que causa lesión hipóxica o lesión anóxica. En modalidades específicas, dichos síntomas o déficits neurológicos comprenden hemiplejía (parálisis de una parte del cuerpo) ; hemiparesis (debilidad en un lado del cuerpo) ; debilidad muscular de la cara; entumecimiento; reducción en la sensación; olfato, gusto, audición, o visión alterada; pérdida de olfato, gusto, audición, o visión; caída del párpado (ptosis) ; debilidad de músculos oculares; reflejos nauseosos disminuidos; capacidad disminuida de deglutir; reactividad de la pupila disminuida a la luz; sensación disminuida de la cara; equilibrio disminuido; oscilación del glóbulo ocular; ritmo respiratorio alterado; ritmo cardiaco alterado; debilidad en el músculo esternocleidomastoideo con capacidad disminuida o incapacidad de voltear la cabeza hacia un lado; debilidad en la lengua; afasia (incapacidad de hablar o entender lenguaje); apraxia (movimientos voluntarios alterados) ; un defecto en el campo visual; un déficit en la memoria; heminegligencia o negligencia hemiespacial (déficit de atención al espacio en el lado del campo visual opuesto a la lesión) ; pensamiento desorganizado; confusión; desarrollo de actitudes hipersexuales; anosognosia (negación persistente de la existencia de una deficiencia) ; dificultad al caminar; coordinación alterada de movimientos; vértigo, desequilibrio; pérdida de la conciencia; dolor de cabeza; y/o vómito.
La severidad de la interrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC, por ejemplo, severidad de apoplejía, o de síntomas de apoplejía y/o déficits neurológicos atribuibles a una apoplejía, se puede evaluar utilizando una o más escalas de función neurológica ampliamente aceptadas.
Por ejemplo, en una modalidad, se proporciona en la presente un método de tratamiento de un individuo que tiene una interrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC del individuo, por ejemplo, un individuo que tiene un síntoma o déficit neurológico atribuible a una interrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro del individuo, por ejemplo, lesión hipóxica o lesión anóxica, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de células placentarias, adherentes, humanas, aisladas, en donde dicha cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad de células placentarias suficiente para dar como resultado una mejora detectable, o detectable y sostenida, en la función neurológica del individuo que se evalúa con uno o más de la Escala de Rankin Modificada, Escala de Enfermedad Cerebrovascular de NIH, Escala Neurológica de Canadá (CNS) , Escala de Estado Comatoso Glasgow (GCS) , Escala de Enfermedad Cerebrovascular Hemisférica, Escala Hunt & Hess, Escala de Enfermedad Cerebrovascular Mathew, Mini-Examen del Estado Mental (MMSE) , Escala de Enfermedad Cerebrovascular Orgogozo, Clasificación del Proyecto de Enfermedad Cerebrovascular de la Comunidad Oxfordshire (Bamford) , Escala de Enfermedad Cerebrovascular Escandinava, Escala de Estado Comatoso de Japón ( JCS) , índice Barthel y/o Escala de Enfermedad Cerebrovascular de Japón (JSS) . En modalidades especificas, la mejora es detectable dentro de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6 días, o dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 ó 12 semanas después de la evaluación inicial, y después de una o más administraciones de células placentarias aisladas. En otras modalidades especificas, dicha evaluación inicial se realiza dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ó 23 horas, o dentro de 1, 2, 3, 4 ó 5 días después del desarrollo de uno o más síntomas de apoplejía. En otras modalidades, la mejora, determinada sin embargo, es sostenida, por ejemplo, por más de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 meses, o 1, 2, 3, 4, 5 ó más años . 5.3 ADMINISTRACIÓN DE CÉLULAS PLACENTARIAS AISLADAS Las células placentarias aisladas utilizadas en los métodos de tratamiento aquí provistos se pueden administrar a un individuo que exhibe uno o más síntomas o déficits neurológicos causados por o atribuibles a una disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC del individuo mediante cualquier método o ruta médicamente aceptable. En una modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva de células placentarias aisladas se administra al individuo intracranealmente, por ejemplo, a un sitio isquémico o hemorrágico en el cerebro afectado o SNC del individuo. Para la administración intracraneal, el sitio de apoplejía (por ejemplo, el área afectada) se puede visualizar, por ejemplo, mediante exploración CT, obtención de imágenes por medio de resonancia magnética (MRI) (por ejemplo, MR ponderada en TI, T2, difusión y/o perfusión), tomografía por Emisión de Positrones de cobalto-55, o tecnología similar. En otra modalidad, dichas células placentarias aisladas se administran al individuo intravenosamente o intra-arterialmente . En otras modalidades, la cantidad terapéuticamente efectiva de células placentarias aisladas se administra al individuo intramuscularmente, intraperitonealmente, intradérmicamente, subcutáneamente, intraocularmente o parenteralmente . Las células placentarias aisladas se pueden administrar mediante inyección en bolo, o mediante infusión intravenosa. En una modalidad específica, dicha infusión intravenosa es infusión intravenosa sobre aproximadamente 1 hasta aproximadamente 8 horas. En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas se administran al individuo mediante una combinación de rutas, por ejemplo, intracranealmente y mediante infusión intravenosa .
La cantidad terapéuticamente efectiva de células placentarias aisladas puede variar de acuerdo con la edad y/o el tamaño del individuo, y el volumen aproximado del área isquémica. El volumen aproximado y la ubicación del área isquémica se pueden estimar, por ejemplo, mediante imágenes seriales de la formación de imágenes por resonancia magnética o exploración mediante tomografia computarizada (CT) .
El número de células placentarias aisladas administradas, por ejemplo, en una sola dosis, puede ser aproximadamente, o al menos, o más que, por ejemplo, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o 5 x 1011 células placentarias aisladas por administración. En modalidades especificas, a un individuo que padece de una disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC, por ejemplo, un individuo que padece de una apoplejía, lesión anóxica o lesión hipóxica, se pueden administrar entre aproximadamente 5 x 107 hasta aproximadamente 3 x 109 células placentarias aisladas intravenosamente. En modalidades más especificas, a un individuo que padece de una disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC, por ejemplo, un individuo que padece de una apoplejía, lesión hipóxica o lesión anóxica, se pueden administrar aproximadamente 9 x 107 células placentarias aisladas, aproximadamente 3.6 x 10 células placentarias aisladas, aproximadamente 9 x 108 células placentarias aisladas, o aproximadamente 1.8 x 109 células placenterías aisladas intravenosamente. En otra modalidad específica, al individuo se administra una dosis de aproximadamente 2 x 108 células placentarias aisladas intravenosamente. En otra modalidad específica, al individuo se administra una dosis de aproximadamente 8 x 108 células placentarias aisladas intravenosamente. En otra modalidad específica, al individuo se administran dos dosis, cada una que comprende aproximadamente 2 x 108 células placentarias aisladas, intravenosamente. En otra modalidad específica, al individuo se administran dos dosis, cada una que comprende aproximadamente 8 x 108 células placentarias aisladas, intravenosamente. En otras modalidades más específicas, a un individuo que padece de una disrupcion del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC, por ejemplo, un individuo que padece de una apoplejía, lesión hipóxica o lesión anóxica, se 7 8 pueden administrar entre aproximadamente 5 x 10 y 1 x 10 células placentarias aisladas intracranealmente . En una modalidad más específica, a dicho individuo se administran aproximadamente 9 x 107 células placentarias aisladas intracranealmente.
A un individuo que padece de una disrupcion del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC, un síntoma de la disrupcion, y/o un déficit neurológico atribuible a la disrupcion, se pueden administrar células placentarias aisladas una vez, o más que una vez, por ejemplo, dos o más veces en el curso de tratamiento. Las células placentarias aisladas se pueden administrar en un volumen adecuado para la administración intracraneal, por ejemplo, en aproximadamente 100 yL, 200 yL, 300 yL, 400 yL, 500 yL, 600 yL, 700 yL, 800 yL, 900 yL, 1000 yL, 1.5 mL, 2 mL, 2.5 mL, 3 mL, 3.5 mL, 4 mL, .5 mL, 5 mL , 5.5 mL , 6.0 mL , 6.5 mL , 7 mL , 7.5 mL , 8 mL , 8.5 mL, 9 mL, 9.5 mL, 10 mL, 11 mL, 12 mL, 13 mL, 14 mL, 15 mL, 16 mL, 17 mL, 18 mL, 19 mL, 20 mL, 21 mL, 22 mL, 23 mL, 24 mL, 25 mL, 26 mL, 27 mL, 28 mL, 29 mL, o aproximadamente 30 mL de una solución farmacéuticamente aceptable. Para la administración intravenosa, una pluralidad de células placentarias aisladas (por ejemplo, aproximadamente 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 10\ 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o 5 x 1011) células placentarias aisladas se pueden entregar en, por ejemplo, aproximadamente, o no más que, 100 mL, 150 mL, 200 mL, 250 mL, 300 mL, 350 mL, 400 mL, 450 mL, 500 mL, 550 mL, 600 mL, 650 mL, 700 mL, 750 mL, 800 mL, 850 mL, 900 mL, 950 mL, 1000 mL, 1.1 L, 1.2 L, 1.3 L, 1.4 L, o 1.5 L, por ejemplo, mediante infusión intravenosa.
En otras modalidades, entre aproximadamente 1 x 10 y aproximadamente 2 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de un individuo (por ejemplo, un individuo que tiene uno o más síntomas o déficits neurológicos causados por o atribuibles a una disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC, o de lesión por reperfusión) ; entre aproximadamente 2 x 106 y aproximadamente 3 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 3 x 106 y aproximadamente 4 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 4 x 106 y aproximadamente 5 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 5 x 106 y aproximadamente 6 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 6 x 106 y aproximadamente 7 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 7 x 106 y aproximadamente 8 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 8 x 106 y aproximadamente 9 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo; o entre aproximadamente 9 x 106 y aproximadamente 1 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo se administran a dicho individuo. En otra modalidad especifica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 107 y aproximadamente 2 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo a dicho individuo. En otra modalidad especifica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1.3 x 107 y aproximadamente 1.5 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo a dicho individuo. En otra modalidad especifica, dicha administración comprende administrar hasta aproximadamente 3 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo a dicho individuo. En otra modalidad especifica, dicha administración comprende administrar aproximadamente 15 x 107 células placentarias aisladas en aproximadamente 20 mililitros de solución a dicho individuo. En una modalidad preferida, la administración de las células placentarias aisladas comprende la administración de no más que 7.5 x 106 células placentarias aisladas por kg de un receptor, en no más que aproximadamente 1 litro de solución. En una modalidad especifica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 5 x 10 y aproximadamente 2 x 107 células placentarias aisladas a dicho individuo, por ejemplo, intracranealmente . En una modalidad especifica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 5 x 106 y aproximadamente 3 x 107 células placentarias aisladas por kg a dicho individuo, en donde dichas células están contenidas en una solución que comprende dextrano al 10%, albúmina de suero humano al 5%, y opcionalmente un inmunosupresor , por ejemplo, ciclosporina A, por ejemplo, intracranealmente. En otra modalidad específica, dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 109 y aproximadamente 3 x 109 células multipotentes placentarias a dicho individuo, en donde dichas células están contenidas en una solución que comprende dextrano al 10%, albúmina de suero humano al 5%, y opcionalmente un inmunosupresor, por ejemplo, ciclosporina A. En otra modalidad especifica, dicha administración comprende administrar aproximadamente 15 x 107 hasta aproximadamente 25 x 107 células placentarias aisladas en aproximadamente 20 mililitros de solución a dicho individuo. En cualquiera de las modalidades anteriormente mencionadas, las células placentarias aisladas se pueden administrar intravenosamente o intra-arterialmente, por ejemplo, como un bolo o goteo. En aún otra modalidad especifica, dicha administración comprende administrar aproximadamente 200 millones de células en aproximadamente 20 mililitros de solución a dicho individuo.
Las células placentarias aisladas se pueden infundir durante cualquier periodo de tiempo médicamente aceptable. En varias modalidades, por ejemplo, el número de células placentarias aisladas descritas anteriormente se puede administrar, por ejemplo, infundir, por ejemplo, intravenosamente o intra-arterialmente, sobre el curso de aproximadamente, o no más que, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o 55 minutos, o sobre el curso de aproximadamente, o no más que, 1 hora, o 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5 o 6 horas.
Las células placentarias aisladas se pueden administrar a un individuo que tiene una disrupcion en el flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC en cualquier momento después del desarrollo de uno o más síntomas de o déficits neurológicos , por ejemplo, lesión hipóxica o lesión anóxica, atribuibles a, la disrupción del individuo en el individuo. En varias modalidades, las células placentarias aisladas se administran dentro de los primeros 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 días de desarrollo del primer síntoma o déficit neurológico exhibido por el individuo; preferiblemente las células placentarias aisladas se administran dentro de los primeros 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 21, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, o 2 horas de desarrollo del primer síntoma o déficit neurológico detectable en el individuo, o dentro de la primera hora de desarrollo del primer síntoma o déficit neurológico detectable en el individuo.
En otras modalidades, las células placentarias aisladas se administran profilácticamente, por ejemplo, antes de que se manifieste o sea detectable uno o más síntomas de dicha disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC, síntoma de apoplejía, lesión hipóxica o lesión anóxica.
El tratamiento de un individuo que tiene una disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC de un individuo, que comprende la administración de células placentarias aisladas al individuo, puede comprender además la administración al individuo de uno o más segundos agentes terapéuticos. Tales segundos agentes terapéuticos se pueden administrar antes de la administración de las células placentarias aisladas, durante la administración de las células placentarias aisladas, o después de la administración de las células placentarias aisladas. Dicho segundos agentes terapéuticos se pueden administrar en menos, más, o igual número de veces que las que se administran las células placentarias aisladas.
Un segundo agente terapéutico puede ser cualquier agente que tenga un beneficio terapéutico para un individuo que tiene una disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC. En una modalidad, el agente terapéutico es un agente, por ejemplo, un fármaco, que se utiliza para tratar apoplejía, lesión hipóxica o lesión anóxica. En una modalidad específica, el segundo agente terapéutico es un agente neuroprotector . En una modalidad específica, el agente neuroprotector es sodio de disufenton (NXY-059; el derivado de disulfonilo de fenilbutilnitrona) , la estructura del cual se muestra debajo: En otra modalidad, en la cual el individuo padece de apoplejía hemorrágica, el segundo agente terapéutico es un agente terapéutico que disminuye la presión sanguínea de dicho individuo. En otra modalidad, el segundo agente terapéutico es un agente trombolitico . En una modalidad especifica, el agente trombolitico es activador del plasminógeno tisular (tPA) . El tPA puede ser de una fuente natural o recombinante . En una modalidad más especifica, el tPA se administra dentro de las primeras tres horas después del desarrollo de uno o más síntomas o déficits neurológicos en el individuo. En otra modalidad más específica, el tPA se administra después de las primeras tres horas después del desarrollo de uno o más síntomas de apoplejía en una víctima de apoplejía. En ciertas modalidades, el uso de un agente trombolitico está contraindicado, por ejemplo, cuando la víctima de apoplejía tiene una lesión en la cabeza, o cuando la apoplejía es causada por una lesión en la cabeza. En otra modalidad específica, el segundo agente terapéutico es un anticoagulante o un agente anti-plaquetas . En las modalidades en las cuales la disrupción del flujo de sangre dentro o alrededor del cerebro o SNC es una hemorragia, el segundo agente terapéutico puede ser un fármaco antihipertensivo, por ejemplo, un beta bloqueador o fármaco diurético, una combinación de un fármaco diurético y un fármaco diurético que ahorra potasio, una combinación de un beta bloqueador y un fármaco diurético, una combinación de un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE) y un diurético, un antagonista de la angiotensina-II y un fármaco diurético, y/o un bloqueador del canal de calcio y un inhibidor de la ACE. En otra modalidad, el segundo agente terapéutico se administra para reducir la presión intracraneal. En una modalidad más especifica, el segundo agente terapéutico es un diurético.
En las modalidades en las cuales las células placentarias aisladas administradas no son autólogas para el individuo que tiene una disrupción del flujo de sangre dentro o alrededor del cerebro o SNC, el segundo agente terapéutico puede ser un agente inmunosupresor . Los agentes inmunosupresores son bien conocidos en el arte e incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-receptor de células T (fragmentos de anticuerpos, monoclonales o policlonales , o derivados de los mismos, por ejemplo, Muromonab-CD3 ) , anticuerpos anti-receptor de IL-2 (por ejemplo, Basiliximab (SIMULECT®) o daclizumab (ZENAPAX ®) , azatioprina, corticoesteroides, ciclosporina, tacrolimus, micofenolato mofetil, sirolimus, inhibidores de calcineurina, y similares. En una modalidad especifica, el agente inmunosupresor es un anticuerpo neutralizante para la proteina inflamatoria del macrófago (???)-?a o MIP-?ß. Preferiblemente, el anticuerpo anti-???-?a o MIP-?ß se administra en una cantidad suficiente para causar una reducción detectable en la cantidad de ???-1a y/o MIP-?ß en dicho individuo, por ejemplo, al momento de la administración. 5.4 CÉLULAS PLACENTARIAS AISLADAS Y POBLACIONES DE CÉLULAS PLACENTARIAS AISLADAS Las células placentarias aisladas útiles en el tratamiento de individuos que tienen una disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC, incluyendo síntomas y déficits neurológicos atribuibles a la misma, son células, obtenibles a partir de una placenta o parte de la misma, que se adhieren a un sustrato del cultivo de tejidos y tienen características de células multipotentes o células madre, pero no son trofoblastos . En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas útiles en los métodos aquí descritos tienen la capacidad de diferenciarse en tipos de células no placentarias. Las células placentarias aisladas útiles en los métodos aquí descritos pueden ser ya sea de origen fetal o maternal (es decir, pueden tener el genotipo de ya sea feto o madre, respectivamente) . Preferiblemente, las células placentarias aisladas y las poblaciones de células placentarias aisladas son de origen fetal. Como se utiliza aquí, la frase "de origen fetal" o "de origen no maternal" indica que las células placentarias aisladas o las poblaciones de células placentarias aisladas se obtienen a partir del cordón umbilical o estructuras placentarias asociadas con el feto, es decir, que tienen el genotipo fetal. Como se utiliza aquí, la frase "de origen maternal" indica que las células o las poblaciones de células se obtienen a partir de estructuras placentarias asociadas con la madre, por ejemplo, que tienen el genotipo maternal. Las células placentarias aisladas, o las poblaciones de células que comprenden las células placentarias aisladas, pueden comprender células placentarias aisladas que son solamente de origen fetal o maternal, o puede comprender una población mixta de células placentarias aisladas tanto de origen fetal como maternal. Las células placentarias aisladas, y las poblaciones de células que comprenden las células placentarias aisladas, se pueden identificar y seleccionar mediante las características morfológicas, del marcador, y del cultivo descritas debajo. En ciertas modalidades, cualquiera de las células placentarias, por ejemplo, las células madre placentarias o las células multipotentes placentarias aquí descritas, son autólogas para un receptor, por ejemplo, un individuo que ha tenido una apoplejía, o tiene un síntoma de una apoplejía. En ciertas otras modalidades, cualquiera de las células placentarias, por ejemplo, las células madre placentarias o las células multipotentes placentarias aquí descritas, son heterólogas para un receptor, por ejemplo, un individuo que ha tenido una apoplejía, o tiene un síntoma de una apoplejía. 5.4.1 Características Físicas y Morfológicas Las células placentarias aisladas aquí descritas, cuando se cultivan en cultivos primarios o en cultivo celular, se adhieren al sustrato del cultivo de tejidos, por ejemplo, la superficie del recipiente del cultivo de tejidos (por ejemplo, el plástico del cultivo de tejidos), o a una superficie del cultivo de tejidos recubierta con matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colágeno (por ejemplo, nativo o desnaturalizado) , gelatina, fibronectina , ornitina, vitronectina, y proteina de la membrana extracelular (por ejemplo, MATRIGEL ® (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)) . Las células placentarias aisladas en el cultivo asumen una apariencia generalmente fibroblastoidea, estrellada, con un número de procesos citoplásmicos que se extienden desde el cuerpo celular central. Las células son, sin embargo, morfológicamente distinguibles de los fibroblastos cultivados bajo las mismas condiciones, ya que las. células placentarias aisladas exhiben un mayor número de tales procesos que los fibroblastos. Morfológicamente, las células placentarias aisladas también son distinguibles de las células madre hematopoyéticas , la cuales generalmente asumen una morfología más redondeada, o adoquinada, en el cultivo.
En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos, cuando se cultivan en un medio de crecimiento, desarrollan cuerpos similares a embrioides. Los cuerpos similares a embrioides son agregados no contiguas de células que pueden crecer en la parte superior de una capa adherente de células placentarias aisladas proliferantes. El término "similar a un embrioide" se utiliza porque las agregados de células parecen cuerpos de embrioides, agregados de células que crecen a partir de cultivos de células madre embriónicas. El medio de crecimiento en el cual se pueden desarrollar los cuerpos similares a embrioides en un cultivo de proliferación de células placentarias aisladas incluye el medio que comprende, por ejemplo, DMEM-LG (por ejemplo, a partir de Gibco) ; suero de becerro fetal al 2% (por ejemplo, a partir de Hyclone Labs.); lx insulina-transferrina- selenio (ITS); lx ácido linoleico-albumina de suero bovino (LA-BSA) ; dexametasona 10"9 M (por ejemplo, a partir de Sigma) ; ácido ascórbico 2-fosfato 10"4 M (por ejemplo, a partir de Sigma) ; factor de crecimiento epidérmico 10 ng/mL (por ejemplo, a partir de R&D Systems); y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL (por ejemplo, a partir de R&D Systems) . 5.4.2. Marcadores de la Superficie Celular , Moleculares y Genéticos Las células placentarias aisladas, por ejemplo, las células multipotentes o las células madre, y las poblaciones de células placentarias aisladas, útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos, son células placentarias humanas adherentes al plástico del cultivo de tejidos que tienen características de células multipotentes o células madre, y expresan una pluralidad de marcadores que se pueden utilizar para identificar y/o aislar las células, o las poblaciones de células que comprenden las células madre. Las células placentarias aisladas, y las poblaciones de células placentarias aqui descritas (es decir, dos o más células placentarias aisladas) incluyen células placentarias y poblaciones de células que tienen células placentarias obtenidas directamente de la placenta, o cualquier parte de la misma (por ejemplo, amnios, corion, cotiledones placentarios , y similares) . Las poblaciones de células placentarias aisladas también incluyen poblaciones de (es decir, dos o más) células placentarias aisladas en cultivo, y una población en un recipiente, por ejemplo, una bolsa. Las células placentarias aisladas aqui descritas no son células mesenquimales derivadas de la médula ósea, células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo, o células mesenquimales obtenidas a partir de la sangre del cordón umbilical, sangre placentaria, o sangre periférica .
En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas son células madre placentarias aisladas. En ciertas otras modalidades, las células placentarias aisladas son células multipotentes placentarias aisladas. En una modalidad, las células placentarias aisladas son CD34", CD10+ y CD105+ según se detecta mediante citometria de flujo. En una modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ son células madre placentarias. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ son células placentarias multipotentes. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ tienen el potencial para diferenciarse en células de un fenotipo neural, células de un fenotipo osteogénico, y/o células de un fenotipo condrogénico . En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD34~, CD10+, CD105+ son adicionalmente CD200+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ son adicionalmente CD45" o CD90+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD34~, CD10+, CD105+ son adicionalmente CD45~ y CD90+, según se detecta mediante citometría de flujo. En una modalidad más especifica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ o CD45", según se detecta mediante citometría de flujo. En otra modalidad más específica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ y CD45", según se detecta mediante citometría de flujo, es decir, las células son CD34", CD10+, CD45", CD90+, CD105+ y CD200+. En una modalidad más específica, dichas células CD34", CD10+, CD45", CD90+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD8CT y CD86".
En una modalidad específica, cualquiera de las células CD34", CD10+, CD105+ descritas anteriormente son adicionalmente una o más de CD29+, CD38", CD44+ , CD54+, SH3+ o SH4 + . En otra modalidad más específica, las células son adicionalmente CD44+. En otra modalidad específica de cualquiera de las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ anteriormente mencionadas, las células son adicionalmente una o más de CD117", CD133", KDR" (VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR", o Ligando de Muerte Programada 1 (PDL1)+, o cualquier combinación de los mismos.
En otra modalidad, las células CD34", CD10+, CD105+ son adicionalmente una o más de CD13+, CD29+, CD33+, CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD62E", CD62L", CD62P", SH3+ (CD73+) , SH4+ (CD73+) , CD80", CD86", CD90+, SH2+ (CD105+) , CD106/VCAM+, CD117", CD144/VE-caderinabaja, CD184 /CXCR4", CD200+, CD133", 0CT-4+, SSEA3", SSEA4", ABC-p+, KDR" (VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR~, HLA-G+, o Ligando de Muerte Programada 1 (PDL1)+, o cualquier combinación de los mismos. En otra modalidad, las células CD34", CD10+, CD105+ son adicionalmente CD13+ , CD29+, CD33+, CD38", CD44+ , CD45", CD54/ICAM+, CD62E", CD62L", CD62P", SH3+ (CD73+) , SH4+ (CD73+) , CD80", CD86", CD90+, SH2+ (CD105+) , CD106/VCAM+, CD117", CD144 /VE-caderinabaja, CD184/CXCR4", CD200+, CD133", 0CT-4 +, SSEA3", SSEA4", ABC-p+, KDR" ( VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR", HLA-G+, y Ligando de Muerte Programada 1 (PDL1)+.
En ciertas modalidades, las células son una o más de SSEA3", SSEA4" o ABC-p+. Las células placentarias aisladas también pueden expresar HLA-ABC (MHC-1) . Estos marcadores se pueden utilizar, en cualquier combinación, para identificar las células placentarias aisladas, por ejemplo, las células madre placentarias aisladas o las células multipotentes aisladas y para distinguir las células placentarias aisladas de otros tipos de células. Debido a que las células placentarias aisladas pueden expresar CD73 y CD105, pueden tener características similares a las células madre mesenquimales . La falta de expresión de CD34, CD38 y/o CD45, por ejemplo, identifica las células placentarias aisladas como células madre no hematopoyéticas .
También se proporcionan aquí poblaciones de las células placentarias aisladas, o poblaciones de células, por ejemplo, poblaciones de células placentarias, que comprenden, por ejemplo, que se enriquecen para, las células placentarias aisladas, que son útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos. Las poblaciones de células preferidas que comprende las células placentarias aisladas, en donde las poblaciones de células son útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos, comprenden, por ejemplo, al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de células placentarias aisladas CD10+, CD105+ y CD34"; es decir, al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de células en dicha población son células placentarias aisladas CD10+, CD105+ y CD34". En una modalidad específica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ son adicionalmente CD200+. En una modalidad más específica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ o CD45~, según se detecta mediante citometría de flujo. E otra modalidad más especifica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD90+ y CD45", según se detecta mediante citometría de flujo. En una modalidad más específica, cualquiera de las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ descritas anteriormente son adicionalmente una o más de CD29+, CD38", CD44+ , CD54+, SH3+ o SH4+. En otra modalidad más específica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+, o las células placentarias aisladas CD34, CD10+, CD105+, CD200+, son adicionalmente CD44+ . En una modalidad específica de cualquiera de las poblaciones de células que comprenden las células placentarias aisladas CD34, CD10+, CD105+ anteriormente mencionadas, las células placentarias aisladas son adicionalmente una o más de CD13+, CD29+, CD33+, CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD62E", CD62L", CD62P", SH3+ (CD73+) , SH4+ (CD73+) , CD80", CD86", CD90+, SH2+ (CD105+) , CD106/VCAM+, CD117", CD144/VE-caderinabaja, CD184/CXCR4", CD133", OCT-4+, SSEA3", SSEA4", ABC-p+, KDR" (VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR", HLA-G+, o Ligando de Muerte Programada 1 (PDL1)+, o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad más específica, las células CD34", CD10+, CD105+ son adicionalmente CD13+, CD29+, CD33+, CD38", CD44+, CD45", CD54/ICAM+, CD62E", CD62L", CD62P", SH3+ (CD73+) , SH4+ (CD73+) , CD80", CD86", CD90+, SH2+ (CD105+) , CD1Q6/VCAM+, CD117", CD144/VE-caderinabaja, CD184 /CXCR4", CD200+, CD133", QCT-4+, SSEA3", SSEA4", ABC-p+, KDR" (VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR~, HLA-G+, y Ligando de Muerte Programada 1 (PDL1)+.
En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos son células placentarias aisladas que son una o más, o todas, de CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3", SSEA4", 0CT-4+, y ABC-p+, en donde dichas células placentarias aisladas se obtienen mediante disrupción física y/o enzimática de tejido placentario. En una modalidad especifica, las células placentarias aisladas son OCT-4+ y ABC-p+. En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas son 0CT-4+ y CD34~, en donde dichas células placentarias aisladas tienen al menos una de las siguientes características: CD10+, CD29+, CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH3+, SH4+, SSEA3", y SSEA4~ . En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas son OCT-4+, CD34", CD10+, CD29+, CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH3+, SH4+, SSEA3", y SSEA4". En otra modalidad, las células placentarias aisladas son 0CT-4+, CD34", SSEA3", y SSEA4". En una modalidad más específica, las células placentarias aisladas son 0CT-4+ y CD34", y son ya sea SH2+ o SH3+. En una modalidad más específica, las células placentarias aisladas son 0CT-4+, CD34", SH2+, y SH3+. En otra modalidad más específica, las células placentarias aisladas son 0CT-4 +, CD34", SSEA3", y SSEA4", y son ya sea SH2+ o SH3+. En otra modalidad más específica, las células placentarias aisladas son 0CT-4+ y CD34", y ya sea SH2+ o SH3+, y son al menos una de CD10+, CD29+, CD44+ , CD45", CD54+ , CD90+, SSEA3", o SSEA4-. En otra modalidad más específica, las células placentarias aisladas son 0CT-4+, CD34", CD10+, CD29+, CD44+ , CD45", CD90+ , SSEA3", y SSEA4", y ya sea SH2+ o SH3+.
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos son SH2+, SH3+, SH4+ y 0CT-4+ . En una modalidad más específica, las células placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD90+, CD34", CD45", SSEA3", o SSEA4". En otra modalidad, las células placentarias aisladas son SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3" y SSEA4". En una modalidad más específica, las células placentarias aisladas son SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3" y SSEA4", CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD90+, 0CT-4+, CD34" o CD45".
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos aquí descritos son CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, y SH4+; en donde dichas células placentarias aisladas son adicionalmente una o más de 0CT-4+, SSEA3" o SSEA4".
En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos, por ejemplo, el tratamiento de la disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC, el tratamiento de apoplejía, son CD200+ o HLA-G+. En una modalidad especifica, las células placentarias aisladas son CD200+ y HLA-G+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son adicionalmente CD34", CD38" o CD45". En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son adicionalmente CD34", CD38~ y CD45~. En otra modalidad especifica, dichas células madre son CD34~, CD38", CD45", CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD200+ o HLA-G+ facilitan la formación de cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias que comprende las células placentarias aisladas, bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no son células madre o multipotentes . En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas se aislan a partir de células madre placentarias que no exhiben estos marcadores.
En otra modalidad, una población de células útil en los métodos de tratamiento aquí descritos es una población de células que comprende, por ejemplo, que se enriquece para, células madre CD200+, HLA-G+. En una modalidad especifica, dicha población es una población de células placentarias. En varias modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD200+, HLA-G+. Preferiblemente, al menos aproximadamente 70% de las células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD200+, HLA-G+. Más preferiblemente, al menos aproximadamente 90%, 95%, o 99% de dichas células son células placentarias aisladas CD200+, HLA-G+. En una modalidad especifica de "las poblaciones de células, dichas células placentarias aisladas CD200+, HLA-G+ también son CD73+ y CD105+. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD200+, HLA-G+ también son CD34", CD38" o CD45". En una modalidad más específica, dichas células placentarias aisladas CD200+ , HLA-G+ también son CD34", CD38", CD45", CD73+ y CD105+. En otra modalidad, dicha población de células produce uno o más cuerpos similares a embrioides cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En otra modalidad específica, dicha población de células se aisla a partir de células placentarias que no son células madre. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD200+, HLA-G+ se aislan a partir de células placentarias que no exhiben estos marcadores.
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos son CD73+, CD105+, y CD200+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son HLA-G+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son CD34", CD38" o CD45". En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son CD34", CD38" y CD45~. En una modalidad más especifica, las células placentarias aisladas son CD34", CD38", CD45", y HLA-G+ . En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD73+, CD105+, y CD200+ facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias que comprende _ las células placentarias aisladas, cuando la población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no son las células placentarias aisladas. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no exhiben estos marcadores.
En otra modalidad, una población de células útil en los métodos de tratamiento aquí descritos es una población de células que comprende, por ejemplo, que se enriquece para, células placentarias aisladas CD73+, CD105+, CD200+. En varias modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD73+, CD105+, CD200+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 70% de dichas células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD73+, CD105+, CD200+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 90%, 95% o 99% de las células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD73+, CD105+, CD200+. En una modalidad especifica de dicha poblaciones, las células placentarias aisladas son HLA-G+ . En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son adicionalmente CD34", CD38~ o CD45". En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son adicionalmente CD34", CD38" y CD45". En una modalidad más especifica, las células placentarias aisladas son adicionalmente C D34 " , C D38 " , C D4 5" , y HLA-G+ . En otra modalidad especifica, dicha población de células produce uno o más cuerpos similares a embrioides cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En otra modalidad especifica, dicha población de células placentarias se aisla a partir de células placentarias que no son células madre. En otra modalidad especifica, dicha población de células madre placentarias se aisla a partir de células placentarias que no exhiben estas características.
En ciertas otras modalidades, las células placentarias aisladas son una o más de CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+ , SSEA3", SSEA4", 0CT-4 + , HLA-G+ o ABC-p+. En una modalidad especifica, las células placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54 +, CD90+, SH2+, SH3+, SH4 +, SSEA3", SSEA4", y OCT-4 + . En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD45", CD54+, SH2+, SH3+, y SH4+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD45", CD54+, SH2+ , SH3+, SH4+ y OCT-4 + . En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, HLA-G+, SH2+ , SH3+, SH4+ . En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son 0CT-4+ y ABC-p+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son SH2+, SH3+, SH4+ y 0CT-4 + . En otra modalidad, las células placentarias aisladas son OCT-4+, CD34", SSEA3-, y SSEA4". En una modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+, CD34", SSEA3", y SSEA4" son adicionalmente CD10+ , CD29+, CD34", CD44+, CD45", CD54+ , CD90+, SH2+, SH3+, y SH4+. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son 0CT-4+ y CD34", y ya sea SH3+ o SH4+ . En otra modalidad, las células placentarias aisladas son CD34" y ya sea CD10+, CD29+, CD44+, CD54 +, CD90+, u OCT-4+.
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos son CD200+ y 0CT-4+. En una modalidad especifica, las células placentarias aisladas son CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas son HLA-G+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD200+, 0CT-4+ son CD34", CD38" o CD45" En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD200+, 0CT-4+ son CD34", CD38" y CD45". En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+ son CD34", CD38", CD45", CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD200+, 0CT-4+ facilitan la producción de uno o más cuerpos similares a embrioides mediante una población de células placentarias que comprende las células aisladas, cuando la población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+ se aislan a partir de células placentarias que no son células madre. En otra ' modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD200+, 0CT-4+ se aislan a partir de células placentarias que no exhiben estas características.
En otra modalidad, una población de células útil en los métodos de tratamiento aquí descritos es una población de células que comprende, por ejemplo, que se enriquece para, células placentarias CD200+, 0CT-4+. En varias modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 70% de dichas células son dichas células placentarias aisladas CD200+, 0CT-4+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 80%, 90%, 95%, o 99% de las células en dicha población de células son dichas células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+. En una modalidad especifica de las poblaciones aisladas, dichas células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+ son adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+ son adicionalmente HLA-G+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+ son adicionalmente CD34", CD38" y CD45". En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+ son adicionalmente CD34", CD38", CD45", CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra modalidad especifica, la población de células produce uno o más cuerpos similares a embrioides cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En otra modalidad especifica, dicha población de células se aisla a partir de células placentarias que no son células placentarias aisladas CD200+, OCT-4+. En otra modalidad especifica, dicha población de células se aisla a partir de células placentarias que no exhiben estos marcadores .
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos son CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD73+, CD105+y HLA-G+ son adicionalmente CD34", CD38" o CD45~. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente 0CT-4+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente CD200+. En una modalidad más especifica, las células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente CD34", CD38", CD45", OCT-4+ y CD200+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ facilitan la formación de cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias que comprende dichas células, cuando la población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ se aislan a partir de células placentarias que no son las células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ se aislan a partir de células placentarias que no exhiben estos marcadores.
En otra modalidad, una población de células útil en los métodos de tratamiento aquí descritos es una población de células que comprende, por ejemplo, que se enriquece para, células placentarias aisladas CD73+, CD105+ y HLA-G+. En varias modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 70% de las células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 90%, 95% o 99% de las células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+. En una modalidad especifica de las poblaciones anteriormente mencionadas, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente CD34", CD38" o CD45". En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente 0CT-4+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente CD200+. En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G+ son adicionalmente CD34", CD38~, CD45" , 0CT-4+ y CD200+. En otra modalidad específica, dicha población de células se aisla a partir de células placentarias que no son células placentarias CD73+, CD105+, HLA-G+. En otra modalidad específica, dicha población de células se aisla a partir de células placentarias que no exhiben estos marcadores.
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos son CD73+ y CD105+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias aisladas que comprende dichas células CD73+, CD105+ cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente CD34", CD38" o CD45". En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente OCT-4+. En una modalidad más específica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente 0CT-4+, CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ se aislan a partir de células placentarias que no son dichas células. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ se aislan a partir de células placentarias que no exhiben estas características.
En otra modalidad, una población de células útil en los métodos de tratamiento aquí descritos es una población de células que comprende, por ejemplo, que se enriquece para, células placentarias aisladas que son CD73+, CD105+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias aisladas que comprende dichas células cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En varias modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 70% de las células en dicha población de células son dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 90%, 95% o 99% de las células en dicha población de células son dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+. En una modalidad específica de las poblaciones anteriormente mencionadas, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente CD34", CD38~ o CD45~. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente CD34", CD38" y CD45~. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente 0CT-4+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente CD200+. En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son adicionalmente CD34", CD38", CD45", 0CT-4+ y CD200+. En otra modalidad especifica, dicha población de células se aisla a partir de células placentarias que no son dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+. En otra modalidad especifica, dicha población de células se aisla a partir de células placentarias que no exhiben estos marcadores .
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos son OCT-4+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias aisladas que comprende dichas células cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En una modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas OCT-4+ son adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas OCT-4+ son adicionalmente CD34", CD38", o CD45". En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ son adicionalmente CD200+. En una modalidad más específica, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ son adicionalmente CD73+, CD105+, CD200+, CD34", CD38", y CD45". En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ se aislan a partir de células placentarias que no son células placentarias 0CT-4+. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ se aislan a partir de células placentarias que no exhiben estas características.
En otra modalidad, una población de células útil en los métodos de tratamiento aquí descritos es una población de células que comprende, por ejemplo, que se enriquece para, células placentarias aisladas que son 0CT-4+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos similares a embrioides en una población de células placentarias aisladas que comprende dichas células cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos similares a embrioides. En varias modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son dichas células placentarias aisladas OCT-4+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 70% de las células en dicha población de células son dichas células placentarias aisladas OCT-4+. En otra modalidad, al menos aproximadamente 80%, 90%, 95% o 99% de las células en dicha población de células son dichas células placentarias aisladas 0CT-4+. En una modalidad especifica de las poblaciones anteriormente mencionadas, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ son adicionalmente CD34", CD38~ o CD45". En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ son adicionalmente CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ son adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas OCT-4+ son adicionalmente CD200+. En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas 0CT-4+ son adicionalmente CD73+, CD105+, CD200+, CD34", CD38", y CD45". En otra modalidad especifica, dicha población de células se aisla a partir de células placentarias que no son dichas células. En otra modalidad especifica, dicha población de células se aisla a partir de células placentarias que no exhiben estos marcadores .
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos son células placentarias aisladas HLA-A, B, C", CD45", CD133" y CD34" . En otra modalidad, una población de células útil para el tratamiento de la disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC es una población de células que comprende células placentarias aisladas, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en dicha población aislada de células son células placentarias aisladas HLA-A,B,C", CD45~, CD133" y CD34". En una modalidad específica, dichas células placentarias aisladas o población de células placentarias aisladas se aisla a partir de células placentarias que no son células placentarias HLA-A, B, C~, CD45", CD133" y CD34". En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas no son de origen maternal. En otra modalidad específica, dicha población aislada de células placentarias está sustancialmente libre de componentes maternales; por ejemplo, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población aislada de células placentarias no son de origen maternal.
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos son células placentarias aisladas CD10+, CD13+, CD33+, CD45", CD117" y CD133". En otra modalidad, una población de células útil para el tratamiento de la disrupcion del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC es una población de células que comprende células placentarias aisladas, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD10+, CD13+, CD33+, CD45", CD117" y CD133" . En una modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas o población de células placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no son dichas células placentarias aisladas. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas CD10+, CD13+, CD33+, CD45", CD117" y CD133" no son de origen maternal, es decir, tienen el genotipo fetal. En otra modalidad especifica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población aislada de células placentarias, no son de origen maternal. En otra modalidad específica, dichas células placentarias aisladas o población de células placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no exhiben estas características.
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos son células placentarias aisladas CD10", CD33", CD44+, CD45", y CD117". En otra modalidad, una población de células útil para el tratamiento de la disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC es una población de células que comprende, por ejemplo, que enriquece para, células placentarias aisladas, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en dicha población de células son células placentarias aisladas CD10", CD33", CD44+, CD45", y CD117". En una modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas o población de células placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no son dichas células. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas no son de origen maternal. En otra modalidad especifica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población de células no son de origen maternal. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas o población de células placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no exhiben estos marcadores .
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos son células placentarias aisladas CD10", CD13", CD33", CD45", y CD117". En otra modalidad, una población de células útil para el tratamiento de la disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC es una población de células que comprende, por ejemplo, que se enriquece para, células placentarias aisladas CD10", CD13", CD33", CD45", y CD117", en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en dicha población son células placentarias CD10", CD13", CD33~, CD45", y CD117". En una modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas o población de células placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no son dichas células. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas no son de origen maternal. En otra modalidad especifica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población de células no son de origen maternal. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas o población de células placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no exhiben estas características.
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos son HLA-A,B,C+, CD45", CD34", y CD133", y son adicionalmente CD10+, CD13+, CD38+, CD44+, CD90+, CD105+, CD200+ y/o HLA-G+, y/o negativas para CD117. En otra modalidad, una población de células útil para el tratamiento de la disrupcion del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC es una población de células que comprende células placentarias aisladas, en donde al menos aproximadamente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o aproximadamente 99% de las células en dicha población son células placentarias aisladas que son HLA A,B,C~, CD45", CD34", CD133", y que son adicionalmente positivas para CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 y/o HLA-G, y/o negativas para CD117. En una modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas o población de células placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no son dichas células. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas no son de origen maternal. En otra modalidad especifica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población de células no son de origen maternal. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas o población de células placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no exhiben estos marcadores.
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aqui descritos son células placentarias aisladas que son CD200+ y CD10+, según se determina mediante enlace al anticuerpo, y CD117", según se determina tanto mediante enlace al anticuerpo como mediante RT-PCR. En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en el tratamiento de la disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC son células placentarias aisladas, por ejemplo, células madre placentarias o células multipotentes placentarias, que son CD10+, CD29", CD54+, CD200+, HLA-G+, HLA clase I" y ß-2-microglobulina" . En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en el tratamiento de la disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC son células placentarias en donde la expresión de al menos un marcador celular es al menos dos veces mayor que para una célula madre mesenquimal (por ejemplo, una célula madre mesenquimal derivada de la médula ósea) . En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas no son de origen maternal. En otra modalidad especifica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población de células no son de origen maternal .
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aqui descritos son células placentarias aisladas, por ejemplo, células madre placentarias o células multipotentes placentarias, que son una o más de CD10+, CD29+, CD44+, CD45", CD54/ICAM+, CD62E", CD62L", CD62P", CD80", CD86", CD103", CD104", CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-caderinabaja, CD184 /CXCR4", 2-microglobulinabaja, MHC-Ibaja, MHC-II", HLA-G aja, y/o PDLlbaja. En una modalidad especifica, las células placentarias aisladas son al menos CD29+ y CD54+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son al menos CD44+ y CD106+. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas son al menos CD29+.
En otra modalidad, una población de células útil en los métodos de tratamiento aquí descritos comprende células placentarias aisladas, y al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en dicha población de células son células placentarias aisladas que son una o más de CD10+, CD29+, CD444, CD45", CD54/ICAM+, CD62-E", CD62-L", CD62-P", CD80" CD86" , CD103", CD104", CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-caderinabaja, CD184/CXCR4", p2-microglobulinabaja, HLA-Ib ja, HLA-II", HLA-Gbaja, y/o PDLlbaja. En una modalidad más especifica, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en dicha población de células son CD10+, CD29+, CD44+, CD45", CD54/ICAM+, CD62-E", CD62-L", CD62-P", CD80", CD86", CD103", CD104", CD105+, CD106/VCA +, CD144 /VE-caderinabaja, CD184 /CXCR4", 2-microglobulinabaja, MHC-I aja, MHC-II", HLA-G aja, y PDLlbaja.
En otra modalidad, las células placentarias aisladas útiles en el tratamiento de la disrupcion del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC son células placentarias aisladas que son una o más, o todas, de CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+ , CD45", CD54+ , CD90+, SH2+, SH3+, SH4 +, SSEA3", SSEA4", OCT-4+, y ABC-p+, donde ABC-p es una proteina transportadora ABC especifica de la placenta (también conocida como proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) y como proteína de resistencia a mitoxantrona ( XR) ) , en donde dichas células placentarias aisladas se obtienen mediante perfusión de una placenta de mamífero, por ejemplo, humano, que se ha drenado de sangre umbilical y perfusado para remover la sangre residual .
El trazado del perfil del gen confirma que las células placentarias aisladas, y las poblaciones de células placentarias aisladas, son distinguibles de otras células, por ejemplo, las células madre mesenquimales, por ejemplo, las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea. Las células placentarias aisladas aquí descritas se pueden distinguir de, por ejemplo, las células madre mesenquimales con base en la expresión de uno o más genes, la expresión de los cuales es significativamente mayor en las células placentarias aisladas, o en ciertas células madre aisladas del cordón umbilical, en comparación con las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea. En particular, las células placentarias aisladas, útiles en los métodos de tratamiento aquí provistos, se pueden distinguir de las células madre mesenquimales con base en la expresión de uno o más genes, la expresión de los cuales es significativamente mayor (es decir, al menos dos veces mayor) en las células placentarias aisladas que en un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde el uno o más genes son ACTG2, ADARB1, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, C0L4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICA 1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, RT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUA 1, PCDH7, PDLI 3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8 , TCF21, TGFB2, VTN, ZC3H12A, o una combinación de cualesquiera de lo anterior, cuando las células se hacen crecer bajo condiciones equivalentes. Vea, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2007/0275362, la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En una modalidad más especifica, dichas células placentarias aisladas expresan dichos uno o más genes cuando se cultivan durante desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 35 duplicaciones de la población en un medio que comprende DMEM-LG (por ejemplo, a partir de Gibco) ; suero de becerro fetal al 2% (por ejemplo, a partir de Hyclone Labs.); lx insulina-transferrina-selenio (ITS); lx ácido linoleico-albumina de suero bovino (LA- BSA) ; dexametasona 10"9 M (por ejemplo, a partir de Sigma) ; ácido ascórbico 2-fosfato 10"4 M (por ejemplo, a partir de Sigma) ; factor de crecimiento epidérmico 10 ng/mL (por ejemplo, a partir de R&D Systems); y factor dé crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL (por ejemplo, a partir de R&D Systems) . En una modalidad especifica, el gen especifico para las células placentarias aisladas o especifico para las células del cordón umbilical aisladas es CD200.
Se pueden encontrar secuencias especificas para estos genes en el Banco de Genes en los números de acceso NM_001615 (ACTG2), BC065545 (ADARB1), (NM_181847 (AMIG02), AY358590 (ARTS-1), BC074884 (B4GALT6) , BC008396 (BCHE) , BC020196 (Cllorf9), BC031103 (CD200), NM_001845 (C0L4A1), NM_001846 (COL4A2), BC052289 (CPA4), BC094758 (D D) , AF293359 ( DSC3 ) , NM_001943 ( DSG2 ) , AF338241 ( EL0VL2 ) , AY336105 ( F2RL1 ) , NM_018215 (FLJ10781), AY416799 (GATA6 ) , BC075798 (GPR126), NM_016235 (GPRC5B) , AF340038 (ICAM1), BC000844 (IER3), BC066339 ( IGFBP ) , BC013142 (IL1A), BT019749 (IL6), BC007461 (IL18), (BC072017) KRT18 , BC075839 (KRT8), BC060825 (LIPG) , BC065240 (LRAP) , BC010444 (MATN2), BC011908 (MEST) , BC068455 (NFE2L3), NM_014840 (NUAK1), AB006755 ( PCDH7 ) , NM_014476 (PDLIM3), BC126199 (PKP-2) , BC090862 (RTN1 ) , BC002538 (SERPINB9), BC023312 (ST3GAL6), BC001201 ( ST6GALNAC5 ) , BC126160 o BC065328 (SLC12A8 ) , BC025697 (TCF21), BC096235 (TGFB2), BC005046 (VTN) , y BC005001 (ZC3H12A) como de Marzo 2008.
En una modalidad más específica, dichas células placentarias aisladas expresan cada uno de ACTG2, ADARB1, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6 , GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, RT18, KRT8 , LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3 , NUA l, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1 , SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8 , TCF21, TGFB2, VTN, y ZC3H12A en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, cuando las células se hacen crecer bajo condiciones equivalentes.
La expresión de los genes referidos anteriormente se puede evaluar mediante técnicas estándar. Por ejemplo, las sondas basadas en la secuencia del gen (es) se pueden seleccionar y construir individualmente mediante técnicas convencionales. La expresión de los genes se puede evaluar, por ejemplo, en un microarreglo que comprende sondas para uno o más de los genes, por ejemplo, un arreglo del Genoma Humano U133A 2.0 de Affymetrix GENECHIP®, o un Genoma Humano U133 Plus 2.0 de Affymetrix GENECHIP® (Santa Clara, California) . La expresión de estos genes se puede evaluar incluso si la secuencia para un número de acceso particular del Banco de Genes está enmendada debido a que las sondas específicas para la secuencia enmendada se pueden generar fácilmente utilizando técnicas estándar bien conocidas.
El nivel de expresión de estos genes se puede utilizar para confirmar la identidad de una población de células placentarias aisladas, para identificar una población de células como que comprende al menos una pluralidad de células placentarias aisladas, o similares. Las poblaciones de células placentarias aisladas, la identidad de las cuales se confirma, pueden ser clónales, por ejemplo, poblaciones de células placentarias aisladas expandidas a partir de una sola célula placentaria aislada, o una población mixta de células madre, por ejemplo, una población de células que comprende solamente células placentarias aisladas que se expanden a partir de múltiples células placentarias aisladas, o una población de células que comprende células placentarias aisladas, como aquí se describe, y al menos otro tipo de célula.
El nivel de expresión de estos genes se puede utilizar para seleccionar las poblaciones de células placentarias aisladas. Por ejemplo, una población de células, por ejemplo, células expandidas clonalmente, se puede seleccionar si la expresión de uno o más de los genes listados anteriormente es significativamente mayor en una muestra de la población de células que en una población equivalente de células madre mesenquimales. Tal selección puede ser de una población a partir de una pluralidad de poblaciones de células placentarias aisladas, a partir de una pluralidad de poblaciones de células, la identidad de las cuales no es conocida, etcétera.
Las células placentarias aisladas se pueden seleccionar con base en el nivel de expresión de uno o más tales genes en comparación al nivel de expresión en dichos uno o más genes en, por ejemplo, un control de célula madre mesenquimal, por ejemplo, el nivel de expresión en dichos uno o más genes en un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea. En una modalidad, el nivel de expresión de dichos uno o más genes en una muestra que comprende un número equivalente de células madre mesenquimales se utiliza como un control. En otra modalidad, el control, para las células placentarias aisladas probadas bajo ciertas condiciones, es un valor numérico que representa el nivel de expresión de dichos uno o más genes en las células madre mesenquimales bajo dichas condiciones .
Las células placentarias aisladas aquí descritas exhiben las características anteriormente mencionadas (por ejemplo, combinaciones de marcadores de superficie celular y/o perfiles de expresión del gen) en cultivo primario, o durante la proliferación en medio que comprende, por ejemplo, DMEM-LG (Gibco) , suero de becerro fetal al 2% (FCS) (Hyclone Laboratories), lx insulina-transferrina-selenio (ITS), lx ácido linoleico-albumina de suero bovino (LA-BSA) , dexametasona 10"9 M (Sigma) , ácido ascórbico 2-fosfato 10" (Sigma) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) 10ng/mL (R&D Systems), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10ng/mL (R&D Systems) , y 100U penicilina/lOOOU estreptomicina .
En otra modalidad específica de dichas células placentarias aisladas o poblaciones de células que comprenden las células placentarias aisladas, dichas células o población se han expandido, por ejemplo, pasado al menos, aproximadamente, o no más que, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 veces, o proliferado durante al menos, aproximadamente, o no más que, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40 duplicaciones de la población. En otra modalidad especifica de las células placentarias aisladas, o poblaciones de células que comprenden células placentarias aisladas, que se describen aquí, dichas células placentarias aisladas son de origen fetal (es decir, tienen el genotipo fetal) .
En ciertas modalidades de las células placentarias aisladas, dichas células placentarias aisladas no se diferencian durante el cultivo en medio de crecimiento, es decir, el medio formulado para promover la proliferación, por ejemplo, durante la proliferación en el medio de crecimiento. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas no requieren una capa alimentadora para proliferar. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas no se diferencian en el cultivo en la ausencia de una capa alimentadora, solamente por la falta de una capa celular alimentadora .
En otra modalidad, las células útiles en el tratamiento de la disrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC son las células placentarias aisladas, en donde una pluralidad de dichas células placentarias aisladas son positivas para la aldehido deshidrogenasa (ALDH) , según se evalúa mediante un ensayo de actividad de la aldehido deshidrogenasa. Tales ensayos son conocidos en el arte (vea, por ejemplo, Bostian and Betts, Biochem. J. , 173, 787, (1978)). En una modalidad especifica, dicho ensayo de ALDH utiliza ALDEFLUOR® (Aldagen, Inc., Ashland, Oregón) como un marcador de la actividad de la aldehido deshidrogenasa. En una modalidad especifica, dicha pluralidad está entre aproximadamente 3% y aproximadamente 25% de células en dicha población de células. En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células aisladas del cordón umbilical, por ejemplo, células del cordón umbilical aisladas multipotentes , en donde una pluralidad de dichas células del cordón umbilical aisladas son positivas para la aldehido deshidrogenasa, según se evalúa por un ensayo de actividad de la aldehido deshidrogenasa que utiliza ALDEFLUOR® como un indicador de la actividad de la aldehido deshidrogenasa. En una modalidad especifica, dicha pluralidad está entre aproximadamente 3% y aproximadamente 25% de células en dicha población de células. En otra modalidad, dicha población de células placentarias aisladas o células del cordón umbilical aisladas muestran al menos tres veces, o al menos cinco veces mayor actividad ALDH que una población de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea que tienen aproximadamente el mismo número de células y cultivadas bajo las mismas condiciones.
En ciertas modalidades de cualquiera de las poblaciones de células que comprenden las células placentarias aisladas aquí descritas, las células placentarias en dicha poblaciones de células están sustancialmente libres de células que tienen un genotipo materno; por ejemplo, al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células placentarias en dicha población tienen un genotipo fetal. En ciertas otras modalidades de cualquiera de las poblaciones de células que comprenden las células placentarias aisladas aquí descritas, las poblaciones de células que comprenden dichas células placentarias están sustancialmente libres de células que tienen un genotipo materno; por ejemplo, al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en dicha población tienen un genotipo fetal.
En una modalidad específica de cualquiera de las células placentarias aisladas o poblaciones de células de células placentarias aisladas anteriormente mencionadas, el cariotipo de las células, o al menos aproximadamente 95% o aproximadamente 99% de las células en dicha población, son normales. En otra modalidad específica de cualquiera de las células placentarias o poblaciones de células anteriormente mencionadas, las células, o las células en la población de células, no son de origen maternal.
Las células placentarias aisladas, o las poblaciones de células placentarias aisladas, que albergan cualquiera de las combinaciones anteriormente mencionadas de marcadores, se pueden combinar en cualquier proporción. Cualesquiera dos o más de las poblaciones de células placentarias aisladas anteriormente descritas se pueden combinar para formar una población de células placentarias aisladas. Por ejemplo, una población de células placentarias aisladas puede comprender una primera población de células placentarias aisladas definida por una de las combinaciones de marcadores anteriormente descritas, y una segunda población de células placentarias aisladas definida por otra de las combinaciones de marcadores anteriormente descritas, en donde dichas primera y segunda poblaciones se combinan en una proporción de aproximadamente 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, o aproximadamente 99:1. En una manera similar, se pueden combinar cualesquiera tres, cuatro, cinco o más de las células placentarias aisladas o poblaciones de células placentarias aisladas anteriormente descritas.
Las células placentarias aisladas útiles para el tratamiento de la disrupcion del flujo de sangre en o alrededor del cerebro o SNC se pueden obtener, por ejemplo, mediante disrupcion de tejido placentario, con o sin digestión enzimática (vea la Sección 5.5.3) o perfusión (vea la Sección 5.5.4) . Por ejemplo, las poblaciones de células placentarias aisladas se pueden producir de acuerdo con un método que comprende perfundir una placenta mamifera que se ha drenado de sangre umbilical y perfusado para remover la sangre residual; perfundir dicha placenta con una solución de perfusión; y colectar dicha solución de perfusión, en donde dicha solución de perfusión después de la perfusión comprende una población de células placentarias que comprende células placentarias aisladas; y aislar una pluralidad de dichas células placentarias aisladas a partir de dicha población de células. En una modalidad especifica, la solución de perfusión se hace pasar tanto a través de la vena umbilical como a través de las arterias umbilicales y se colecta después de que exuda de la placenta. En otra modalidad especifica, la solución de perfusión se hace pasar a través de la vena umbilical y se colecta a partir de las arterias umbilicales, o se hace pasar a través de las arterias umbilicales y se colecta a partir de la vena umbilical.
En varias modalidades, las células placentarias aisladas, contenidas dentro de una población de células obtenida a partir de la perfusión de una placenta, son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99.5% de dicha población de células placentarias. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas colectadas mediante perfusión comprenden células fetales y maternales. En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas colectadas mediante perfusión son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99.5% células fetales.
En otra modalidad especifica, se proporciona aquí una composición que comprende una población de las células placenterías aisladas, como se describe aquí, colectada mediante perfusión, en donde dicha composición comprende al menos una porción de la solución de perfusión utilizada para colectar las células placentarias aisladas.
Las poblaciones aisladas de las células placentarias aisladas aquí descritas se pueden producir digiriendo tejido placentario con una enzima de disrupción de tejido para obtener una población de células placentarias que comprende las células, y aislar, o sustancialmente aislar, una pluralidad de las células placentarias del resto de dichas células placentarias. Toda, o cualquier parte de la placenta se puede digerir para obtener las células placentarias aisladas aquí descritas. En modalidades específicas, por ejemplo, dicho tejido placentario puede ser una placenta entera, una membrana amniótica, un corion, una combinación de amnios y corion, o una combinación de cualquiera de lo anterior. En otra modalidad específica, la enzima de disrupción de tejido es tripsina o colagenasa. En varias modalidades, las células placentarias aisladas, contenidas dentro de una población de células obtenida a partir de la digestión de una placenta, son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99.5% de dicha población de células placentarias .
Las poblaciones aisladas de células placentarias anteriormente descritas, y las poblaciones de células placentarias aisladas generalmente, pueden comprender aproximadamente, al menos, o no más que 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o más de las células placentarias aisladas. Las poblaciones de células placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento aquí descritos comprenden al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99% de células placentarias aisladas viables, según se determina mediante, por ejemplo, exclusión de azul de tripano. 5.4.3 Crecimiento en Cultivo El crecimiento de las células placentarias aisladas, descritas en la Sección 5.4.2, en lo que respecta a cualquier célula de mamífero, depende en parte del medio particular seleccionado para el crecimiento. Bajo condiciones óptimas, las células placentarias aisladas típicamente se duplican en número aproximadamente el día 1. Durante el cultivo, las células placentarias aisladas descritas en la presente, se adhieren a un substrato en cultivo, por ejemplo, la superficie de un contenedor de cultivo de tejido (por ejemplo, el plástico del platillo de cultivo del tejido, plástico recubierto con fibronectina, y similares) y forman una unicapa o monocapa.
Las poblaciones de células placentarias que comprenden las células placentarias aisladas descritas en la presente, cuando se cultivan bajo condiciones apropiadas, pueden formar cuerpos semejantes a embriones, es decir, agregados tridimensionales de células que crecen arriba de la capa de células adherentes. Las células dentro de los cuerpos semejantes a embriones expresan marcadores asociados con células madre muy tempranas, por ejemplo, OCT-4, Nanog, SSEA3 y SSEA . Las células dentro de los cuerpos semejantes a embriones típicamente no son adherentes al substrato del cultivo, como las células placentarias aisladas descritas en la presente, aunque permanecen anexadas a las células adherentes durante el cultivo. Las células de cuerpos semejantes a embriones dependen de las células placentarias aisladas, adherentes, para viabilidad, al igual que los cuerpos semejantes a embriones no se forman en la ausencia de las células placentarias aisladas, adherentes. Las células placentarias aisladas, adherentes, por consiguiente facilitan el crecimiento de uno o más cuerpos semejantes a embriones en una población de células placentarias que comprende las células placentarias aisladas, adherentes. Sin desear limitarse por alguna teoría, se cree que las células de los cuerpos semejantes a embriones crecen en las células placentarias aisladas, adherentes, al igual que las células madre embrionarias crecen en una capa alimentadora de células. 5.5 MÉTODOS PARA OBTENER CÉLULAS PLACENTARIAS AISLADAS 5.5.1 Composición de la Recolección de Células Madre En la presente se proporcionan además métodos para recolectar y aislar células placentarias , por ejemplo, las células placentarias aisladas descritas en la Sección 5.4.2, anterior. En general, tales células se obtienen de una placenta mamifera utilizando una solución fisiológicamente aceptable, por ejemplo, una composición de recolección de células. Una composición de recolección de células, ejemplificarte, se describe con detalle en la Publicación relacionada de la Solicitud de Patente Norteamericana No. 2007/0190042, titulada "Medio Mejorado para Recolectar Células Madre Placentarias y Preservar Órganos", la descripción de la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia .
La composición de recolección de células puede comprender cualquier solución fisiológicamente aceptable para la recolección y/o cultivo de células, por ejemplo, las células placentarias aisladas descritas en la presente, por ejemplo, una solución salina (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato, solución de Kreb, solución de Kreb modificada, solución de Eagle, NaCl al 0.9%, etc.), un medio de cultivo (por ejemplo, DMEM, H.DMEM, etc.), y similares.
La composición de recolección de células puede comprender uno o más componentes que tienden a preservar células placentarias aisladas, es decir, evita que las células placentarias aisladas mueran, o retarda la muerte de las células placenterías aisladas, reduce el número de células placenterías aisladas en una población de células que muere, o similar, desde el momento de la recolección hasta el momento del cultivo. Tales componentes pueden ser, por ejemplo, un inhibidor de apoptosis (por ejemplo, un inhibidor de caspasa o inhibidor JNK) ; un vasodilatador (por ejemplo, sulfato de magnesio, un fármaco anti-hipertensivo, péptido natriurético atrial (ANP) , adrenocorticotropina, hormona liberadora de corticotropina, nitroprusiato de sodio, hidralazina, adenosin-trifosfato, adenosina, indometacina o sulfato de magnesio, un inhibidor de fosfodiesterasa, etc. ) ; un inhibidor de necrosis (por ejemplo, 2- ( lH-Indol-3-il) -3-pentilamino-maleimida, ditiocarbamato de pirrolidina, o clonazepam) ; un inhibidor de TNF-a; y/o un perfluorocarbono de transporte de oxígeno (por ejemplo, bromuro de perfluorooctilo, bromuro de perfluorodecilo, etc. ) .
La composición de recolección de células puede comprender una o más enzimas degradantes de tejidos, por ejemplo, una metaloproteasa, una serina proteasa, una proteasa neutral, una RNasa, o una DNasa, o similares. Tales enzimas incluyen, pero no están limitadas a, colagenasas (por ejemplo, colagenasa I, II, III ó IV, una colagenasa de Clostridium histolyticum, etc.); dispasa, termolisina, elastasa, tripsina, LIBERASE, hialuronidasa, y similares.
La composición de recolección de células puede comprender una cantidad bactericidamente o bacterio-estáticamente efectiva de un antibiótico. En ciertas modalidades no limitativas, el antibiótico es un macrólido (por ejemplo, tobramicina) , una cefalosporina (por ejemplo, cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, cefaclor, cefixima o cefadroxilo) , una claritromicina, una eritromicina , una penicilina (por ejemplo, penicilina V)· o una quinolona (por ejemplo, ofloxacina, ciprofloxacina o norfloxacino) , una tetraciclina, una estreptomicina, etc. En una modalidad particular, el antibiótico es activo contra bacterias Gram ( + ) y/o Gram(-), por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa , Staphylococcus aureus, y similares. En una modalidad, el antibiótico es gentamicina, por ejemplo, desde aproximadamente 0.005% hasta aproximadamente 0.01% (p/v) en medio de cultivo.
La composición de recolección de células también puede comprender uno o más de los siguientes compuestos: adenosina (aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM) ; D-glucosa (aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 100 mM) ; iones de magnesio (aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM) ; una macromolécula de pesó molecular mayor de 20,000 dalton, en una modalidad, presente en una cantidad suficiente para mantener la integridad endotelial y viabilidad celular (por ejemplo, un coloide o solución coloidal sintética o de origen natural, un polisacárido tal como dextrano o un polietilenglicol presente en aproximadamente 25 g/1 hasta aproximadamente 100 g/1, ó en aproximadamente 40 g/1 hasta aproximadamente 60 g/1); un antioxidante (por ejemplo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, glutatión, vitamina C ó vitamina E presente en aproximadamente 25 µ? hasta aproximadamente 100 µ?) ; un agente reductor (por ejemplo, N-acetilcisteina presente en aproximadamente 0.1 mM hasta aproximadamente 5 mM) ; un agente que evita la entrada de calcio a las células (por ejemplo, verapamilo presente en aproximadamente 2 µ? hasta aproximadamente 25 µ?) ; nitroglicerina (por ejemplo, de aproximadamente 0.05 g/L hasta aproximadamente 0.2 g/L); un anticoagulante, en una modalidad, presente en una cantidad suficiente para ayudar a mantener la coagulación de la sangre residual (por ejemplo, heparina o hirudina presente en una concentración de aproximadamente 1000 unidades/1 hasta aproximadamente 100,000 unidades/1); o un compuesto que contiene amilorida (por ejemplo, amilorida, amilorida de etil-isopropilo, amilorida de hexametileno, amilorida de dimetilo o amilorida de isobutilo presente en aproximadamente 1.0 µ? hasta aproximadamente 5 µ?) . 5.5.2 Recolección y Manejo de la Placenta En general, una placenta humana se recupera poco después de su expulsión después del nacimiento. En una modalidad preferida, la placenta se recupera de un paciente después de un consentimiento informado y después de tomar un historial médico completo del paciente y que está asociado con la placenta. Preferiblemente, el historial médico continúa después del parto. Tal historial médico se puede utilizar para coordinar el uso subsecuente de la placenta o las células placentarias aisladas, cosechadas de la misma. Por ejemplo, se pueden utilizar células placentarias, humanas, aisladas, en vista del historial médico, para medicina personalizada para el infante asociado con la placenta, o para los padres, hermanos u otros parientes del infante.
Previo a la recuperación de las células placentarias aisladas, preferiblemente se remueve la sangre del cordón umbilical y la sangre de la placenta. En ciertas modalidades, después del parto, se recupera la sangre del cordón umbilical en la placenta. La placenta se puede someter a un proceso convencional de recuperación de sangre del cordón umbilical. Típicamente se utiliza una aguja o cánula, con la ayuda de la gravedad, para extraer sangre de la placenta (ver, por ejemplo, Anderson, Patente Norteamericana No. 5,372,581; Hessel et al., Patente Norteamericana No. 5,415,665) . La aguja o cánula usualmente se coloca en la vena umbilical y la placenta se puede masajear suavemente para ayudar a drenar la sangre del cordón umbilical de la placenta. Tal recuperación de sangre del cordón umbilical puede realizarse de una manera comercial, por ejemplo, LifeBank USA, Cedar Knolls, N.J. Preferiblemente, la placenta se drena por gravedad sin manipulación adicional para minimizar la alteración del tejido durante la recuperación de sangre del cordón umbilical.
Típicamente, una placenta se transporta desde la sala de partos o alumbramiento a otra ubicación, por ejemplo, un laboratorio, para la recuperación de la sangre del cordón umbilical y la recolección de células madre, por ejemplo, mediante perfusión o disociación de tejido. La placenta preferiblemente se transporta en un dispositivo estéril de transporte, térmicamente aislado (manteniendo la temperatura de la placenta entre 20-28°C), por ejemplo, colocando la placenta, con el cordón umbilical próximo sujetado con pinzas, en una bolsa de plástico estéril con cierre zip-lock, la cual se coloca entonces en un contenedor aislado. En otra modalidad, la placenta se transporta en un kit de recolección de sangre del cordón umbilical sustancialmente como se describe en la Patente de Estados Unidos pendiente No. 7,147,626, la descripción de la cual se incorpora como referencia en la presente. Preferiblemente, la placenta se entrega al laboratorio cuatro a veinticuatro horas después del parto. En ciertas modalidades, el cordón umbilical proximal se sujeta con pinzas, preferiblemente dentro de 4-5 cm (centímetros) de la inserción en el disco de la placenta previo a la recuperación de la sangre del cordón umbilical. En otras modalidades, el cordón umbilical proximal se sujeta con pinzas después de la recuperación de la sangre del cordón umbilical pero antes del procesamiento adicional de la placenta .
La placenta, previo a la recolección de células, se puede almacenar bajo condiciones estériles y ya sea a temperatura ambiente o a una temperatura de 5°C a 25°C. La placenta puede almacenarse durante un periodo de cuatro a veinticuatro horas, hasta cuarenta y ocho horas, o más de cuarenta y ocho horas, previo a la perfusión de la placenta para remover cualquier sangre del cordón umbilical residual. En una modalidad, la placenta se cosecha de entre aproximadamente cero horas hasta aproximadamente dos horas post-expulsión . La placenta preferiblemente se almacena en una solución anticoagulante a una temperatura de 5°C a 25°C. Las soluciones anticoagulantes adecuadas son bien conocidas en técnica. Por ejemplo, se puede utilizar una solución de heparina o warfarina de sodio. En una modalidad preferida, la solución anticoagulante comprende una solución de heparina (por ejemplo, 1% p/p en solución 1:1000). La placenta desangrada preferiblemente se almacena durante no más de 36 horas antes de recolectar las células placentarias.
La placenta mamifera o una parte de la misma, una vez recolectada y preparada generalmente como se menciona anteriormente, se puede tratar de cualquier manera conocida en la técnica, por ejemplo, se puede perfundir o alterarse, por ejemplo, digerirse con una o más enzimas disruptoras de tejidos, para obtener células placentarias aisladas. 5.5.3 Alteración Física y Digestión Enzimática del Tejido Placen ario En una modalidad, se recolectan células madre de una placenta mamifera mediante la alteración física de parte de todo el órgano. Por ejemplo, la placenta, o una porción de la misma, por ejemplo, se puede aplastar, cortar, picar en pedazos, trocear en cubitos, tajar, macerar o similar. El tejido entonces se puede cultivar para obtener una población de células placentarias aisladas. Típicamente, el tejido placentario se altera utilizando, por ejemplo, medio de cultivo, una solución salina, o una composición de recolección de células madre (ver la Sección 5.5.1 y más adelante).
La placenta se puede diseccionar en componentes antes de la alteración física y/o digestión enzimática y recuperación de células madre. Las células placentarias aisladas se pueden obtener de la totalidad o una porción de la membrana amniótica, corion, cordón umbilical, cotiledones placentarios , o cualquier combinación de los mismos, inclusive de una placenta completa. Preferiblemente, se obtienen células placentarias aisladas de tejido placentario que comprende amnios y corion. Típicamente, se pueden obtener células placentarias aisladas mediante la alteración de un pequeño bloque del tejido placentario, por ejemplo, un bloque de tejido placentario que es de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ó aproximadamente 1000 milímetros cúbicos de volumen. Se puede utilizar cualquier método de alteración física, siempre y cuando el método de alteración deje una pluralidad, más preferiblemente una mayoría, y más preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ó 99% de las células en dicho órgano viable, como se determina, por ejemplo, mediante exclusión con azul de tripano.
Las células placentarias, adherentes, aisladas, generalmente se pueden recolectar de una placenta, o porción de la misma, en cualquier momento dentro de aproximadamente los primeros tres días post-expulsión, aunque preferiblemente entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 18 horas postexpulsión .
En una modalidad específica, el tejido alterado se cultiva en medio de cultivo de tejido adecuado para la proliferación de células placentarias aisladas (ver, por ejemplo, la Sección 5.6, más adelante, que describe el cultivo de células madre placentarias) .
En otra modalidad específica, se recolectan células placentarias aisladas mediante la alteración física del tejido placentario, en donde la alteración física incluye digestión enzimática, la cual se puede lograr mediante el uso de una o más enzimas para la digestión de tejidos. La placenta, o una porción de la misma, también puede alterarse físicamente y digerirse con una o más enzimas, y el material resultante se sumerge entonces en, o se mezcla en, una composición de recolección de células.
Una composición preferida de recolección de células comprende una o más enzima (s) disruptoras de tejido. Las enzimas que se pueden utilizar para alterar el tejido de placenta incluyen papaina, desoxirribonucleosa, serina proteasas, tales como tripsina, quimotripsina, colagenasa, dispasa o elastasa. Las serina proteasas pueden inhibirse mediante alfa-2-microglobulina en suero y por lo tanto el medio utilizado para la digestión usualmente está libre de suero. Comúnmente se utiliza EDTA y DNasa en los procedimientos de digestión con enzimas para incrementar la eficiencia de la recuperación de células. El digestato preferiblemente se diluye para evitar atrapar células dentro del digesto viscoso.
Se puede utilizar cualquier combinación de enzimas para la digestión de tejidos. Las concentraciones típicas para la digestión que utilizan tripsina incluyen, 0.1% hasta aproximadamente 2% de tripsina, por ejemplo, aproximadamente 0.25% de tripsina. Se pueden utilizar proteasas en combinación, es decir, dos o más proteasas en la misma reacción de digestión, o se pueden utilizar secuencialmente con el fin de liberar células placentarias , por ejemplo, células madre placentarias y células multipotentes placentarias. Por ejemplo, en una modalidad, una placenta, o parte de la misma, se digiere primero con una cantidad apropiada de colagenasa I en aproximadamente 1 hasta aproximadamente 2 mg/ml, por ejemplo, durante 30 minutos, seguido por una digestión con tripsina, a una concentración de aproximadamente 0.25%, por ejemplo, durante 10 minutos, a 37°C. Las serina proteasas preferiblemente se utilizan en forma consecutiva después del uso de otras enzimas.
En otra modalidad, el tejido se puede alterar además mediante la adición de un compuesto de quelación, por ejemplo, ácido etilenglicol-bis (éter 2-aminoetilico) -N, N, N' N' -tetraacético de (EGTA) o ácido etilendiamintetraacético (EDTA) a la composición de recolección de células madre que comprende las células madre, o a una solución en la cual el tejido se altera y/o digiere previo al aislamiento de las células madre con la composición de recolección de células madre.
Después de la digestión, el digestato se lava, por ejemplo, tres veces con' medio de cultivo, y las células lavadas se siembran en matraces de cultivo. Las células se aislan entonces mediante adherencia diferencial, y se caracterizan, por ejemplo, para viabilidad, marcadores de superficie celular, diferenciación, y similares.
Se apreciará que cuando una placenta entera, o porción de una placenta que comprende tanto células fetales como maternas (por ejemplo, donde la porción de la placenta comprende el corion o cotiledones), las células placentarias aisladas pueden comprender una mezcla de células placentarias derivadas de fuentes tanto fetales como maternas. Cuando una porción de la placenta que no comprende, o comprende un número insignificante de, células maternas (por ejemplo, el amnios) , las células placentarias aisladas de la misma comprenderán casi exclusivamente células placentarias fetales (es decir, células placentarias que tienen el fenotipo del feto) .
Las células placentarias, por ejemplo, las células placentarias descritas en la Sección 5.4.2, anterior, se pueden aislar del tejido placentario alterado mediante tripsinización diferencial (ver la Sección 5.5.5, más adelante) seguido por el cultivo en uno o más contenedores de cultivo nuevos en medio de proliferación recién hecho, opcionalmente seguido por una segunda etapa de tripsinización diferencial . 5.5.4 Perfusión Placentaria Las células placentarias, por ejemplo, las células placentarias descritas en la Sección 5.4.2, anterior, también se pueden obtener mediante la perfusión de la placenta mamifera. Los métodos de la perfusión de una placenta mamifera para obtener células placentarias se dan a conocer, por ejemplo, en Hariri, Patentes Norteamericanas Nos. 7,045,148 y 7,255,729, en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana Nos. 2007/0275362 y 2007/0190042, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.
Se pueden recolectar células placentarias mediante perfusión, por ejemplo, a través de la vasculatura de la placenta, utilizando, por ejemplo, una composición de recolección de células como una solución de perfusión. En una modalidad, una placenta mamifera se perfunde pasando solución de perfusión a través de cualquiera o ambas de la arteria umbilical y vena umbilical. El flujo de la solución de perfusión a través de la placenta puede lograrse utilizando, por ejemplo, flujo por gravedad en la placenta. Preferiblemente, la solución de perfusión se pasa de manera forzada a través de la placenta utilizando una bomba, por ejemplo, una bomba peristáltica. La vena umbilical, por ejemplo, se puede canular con una cánula, por ejemplo, una cánula de TEFLON® o plástico, que se conecta a una aparato de conexión estéril, tal como una tubería o manguera estéril. El aparato de conexión estéril se conecta a un tubo múltiple o colector de perfusión.
En la preparación de la perfusión, la placenta preferiblemente se orienta (por ejemplo, se suspende o cuelga) de tal manera que la arteria umbilical y vena umbilical se ubiquen en el punto más alto de la placenta. La placenta se puede perfundir pasando un fluido de perfusión a través de la vasculatura de la placenta y tejido circundante. La placenta también se puede perfundir pasando un fluido de perfusión a la vena umbilical y mediante la recolección de las arterias umbilicales, o pasando un fluido de perfusión a las arterias umbilicales y mediante la recolección de la vena umbilical.
En una modalidad, por ejemplo, la arteria umbilical y la vena umbilical se conectan simultáneamente, por ejemplo, a una pipeta que se conecta a través de un conector flexible a un depósito de la solución de perfusión. La solución de perfusión se pasa a la vena y arteria umbilical. La solución de perfusión se exuda de y/o pasa a través de las paredes de los vasos sanguíneos a los tejidos circundantes de la placenta, y se recolecta en un recipiente abierto adecuado desde la superficie de la placenta que se anexó al útero de la madre durante la gestación. La solución de perfusión también puede introducirse a través de la abertura del cordón umbilical y se deja fluir o percolar fuera de las aberturas en la pared de la placenta que se acopla con la pared uterina, materna. Las células placentarias que se recolectan mediante este método, que se puede referir como un método de "bandeja", típicamente son una mezcla de células fetales y maternas.
En otra modalidad, la solución de perfusión se pasa a través de las venas umbilicales y se recolecta desde la arteria umbilical, o se pasa a través de la arteria umbilical y se recolecta desde las venas umbilicales. Las células placentarias recolectadas mediante este método, el cual se puede referir como un método de "circuito cerrado", típicamente casi son exclusivamente fetales.
Se apreciará que la perfusión que utiliza el método de bandeja, es decir, mediante el cual se recolecta el liquido sometido a perfusión o perfusado después de que el mismo se ha exudado de la parte materna de la placenta, da como resultado una mezcla de células fetales y maternas. Como resultado, las células recolectadas mediante este método pueden comprender una población mixta de células placentarias, por ejemplo, células madre, placentarias, o células multipotentes placentarias, de origen tanto fetal como materno. En contraste, la perfusión sólo pasa a través de la vasculatura de la placenta en el método de circuito cerrado, por medio del cual el fluido de perfusión se pasa a través de uno o dos vasos de la placenta y se recolecta solamente a través del (los) vaso(s) restante (s), lo que da como resultado la recolección de una población de células placentarias casi exclusivamente de origen fetal.
El método de perfusión de circuito cerrado, en una modalidad, se puede realizar como sigue. Se obtiene una placenta post-parto dentro de aproximadamente 48 horas después del nacimiento. El cordón umbilical se sujeta con pinzas y se corta por arriba de la pinza. El cordón umbilical se puede desechar, o se puede procesar para recuperar, por ejemplo, células madre del cordón umbilical, y/o para procesar la membrana del cordón umbilical para la producción de un biomaterial. La membrana amniótica se puede retener durante la perfusión, o se puede separar del corion, por ejemplo, utilizando disección roma con los dedos. Si la membrana amniótica se separa del corion antes de la perfusión, la misma se puede, por ejemplo, desechar, o procesar, por ejemplo, para obtener células madre mediante digestión enzimática, o para producir, por ejemplo, un biomaterial de membrana amniótica, por ejemplo, el biomaterial descrito en la Publicación de Solicitud Norteamericana No. 2004/0048796, la descripción de la cual se incorpora en su totalidad como referencia en la presente. Después de limpiar todos los coágulos de sangre visibles y la sangre residual de la placenta, por ejemplo, utilizando gasa estéril, los vasos del cordón umbilical se dejan al descubierto, por ejemplo, cortando parcialmente la membrana del cordón umbilical para dejar al descubierto una sección transversal del cordón. Los vasos se identifican, y se abren, por ejemplo, haciendo avanzar una pinza de dientes serrados o pinzas de contacto, cerrada, a través del extremo cortado de cada vaso. El aparato, por ejemplo, manguera de plástico conectada a un dispositivo de perfusión o bomba peristáltica, se inserta entonces en cada una de las arterias placentarias . La bomba puede ser cualquier bomba adecuada para ese propósito, por ejemplo, una bomba peristáltica. La manguera de plástico, conectada a un recipiente de recolección estéril, por ejemplo, una bolsa de sangre tal como una bolsa de recolección de 250 mL, se inserta entonces en la vena de la placenta. Alternativamente, la manguera conectada a la bomba se inserta en la vena de la placenta, y los tubos o sondas a un recipiente (s ) de recolección, se insertan en una o ambas de las arterias de la placenta. La placenta se perfunde entonces con un volumen de solución de perfusión, por ejemplo, de aproximadamente 750 mi de solución de perfusión. Las células en el perfusado se recolectan entonces, por ejemplo, mediante centrifugación. En ciertas modalidades, la placenta se perfunde con solución de perfusión, por ejemplo, 100-300 mL de solución de perfusión, para remover la sangre residual previo a la perfusión para recolectar células placentarias, por ejemplo, células madre placentarias y/o células multipotentes placentarias. En otra modalidad, la placenta no se perfunde con solución de perfusión para remover la sangre residual previo a la perfusión para recolectar células placentarias.
En una modalidad, el cordón umbilical proximal se sujeta con pinzas durante la perfusión, y más preferiblemente, se sujeta con pinzas dentro de 4-5 cm (centímetros) de la inserción del cordón en el disco de la placenta.
La primera recolección del fluido de perfusión de una placenta mamífera durante el proceso de desangramiento generalmente se tiñe con los glóbulos rojos residuales de la sangre del cordón y/o sangre de la placenta. El fluido de perfusión se vuelve más incoloro conforme procede la perfusión y los glóbulos rojos residual del cordón umbilical se lavan fuera de la placenta. Generalmente son adecuados de 30 a 100 mi (mililitros) de fluido de perfusión para desangrar inicialmente la placenta, aunque puede utilizarse más o menos fluido de perfusión dependiendo de los resultados observados.
El volumen de liquido de perfusión utilizado para aislar las células puede variar dependiendo del número de células a recolectarse, el tamaño de la placenta, el número de recolecciones a hacerse de una sola placenta, etc. En varias modalidades, el volumen de liquido de perfusión puede ser de 50 mL a 5000 mL, 50 mL a 4000 mL, 50 mL a 3000 mL, 100 mL a 2000 mL, 250 mL a 2000 mL, 500 mL a 2000 mL, ó 750 mL a 2000 mL. Típicamente, la placenta se perfunde con 700-800 mL de líquido de perfusión después del desangramiento.
La placenta se puede perfundir una pluralidad de veces durante el transcurso de varias horas o varios días. Cuando la placenta se va a perfundir una pluralidad de veces, la misma puede mantenerse o cultivarse bajo condiciones asépticas en un contenedor u otro recipiente adecuado, y perfundirse con la composición de recolección de células, o una solución de perfusión estándar [por ejemplo, una solución salina normal tal como solución salina amortiguada con fosfato ("PBS") ) con o sin un anticoagulante (por ejemplo, heparina, warfarina de sodio, cumarina, bishidroxicumarina) , y/o con o sin un agente antimicrobiano (por ejemplo, ß-mercaptoetanol (0.1 mM) ; antibióticos tales como estreptomicina (por ejemplo, a 40-100 g/ml) , penicilina (por ejemplo, a 40 U/ml) , anfotericina B (por ejemplo, a 0.5 µ?/ml) . En una modalidad, una placenta aislada se mantiene o cultiva durante un periodo de tiempo sin recolectar el perfusado, de tal manera que la placenta se mantenga o cultive durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ó 24 horas, ó 2 ó 3 o más días antes de la perfusión y recolección del perfusado. La placenta perfundida se puede mantener durante una o más vez (es) adicional (es) , por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó más horas, y perfundirse una segunda vez con, por ejemplo, 700-800 mL de fluido de perfusión. La placenta se puede perfundir 1, 2, 3, 4, 5 ó más veces, por ejemplo, una vez cada 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 horas. En una modalidad preferida, la perfusión de la placenta y recolección de la solución de perfusión, por ejemplo, composición de recolección de células, se repite hasta que el número de células nucleadas recuperadas descienda por debajo de 100 células/ml. Los perfusados en diferentes puntos de tiempo se pueden procesar además individualmente para recuperar poblaciones de células dependientes del tiempo, por ejemplo, células madre. Los perfusados de diferentes puntos de tiempo también se pueden reunir. En una modalidad preferida, se recolectan células placentarias en un plazo o plazos entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 18 horas post-expulsión.
Preferiblemente la perfusión da como resultado la recolección de significativamente más células placentarias que el número obtenible de una placenta mamífera no perfundida con dicha solución, y no tratada de otra manera para obtener células placentarias (por ejemplo, mediante alteración del tejido, por ejemplo, digestión enzimática) . En este contexto, "significativamente más" significa al menos 10% más. La perfusión produce significativamente más células placentarias que, por ejemplo, el número de células placentarias aislables de un medio de cultivo en el cual ha sido cultivada una placenta, o porción de la misma.
Las células placentarias se pueden aislar de la placenta mediante . perfusión con una solución que comprende una o más proteasas u otras enzimas disruptoras de tejido. En una modalidad específica, una placenta o porción de la misma (por ejemplo, membrana amniótica, amnios y corion, lóbulo o cotiledón de la placenta, cordón umbilical, o combinación de cualquiera de los antes mencionados) se lleva a 25-37°C, y se incuba con una o más enzimas disruptoras de tejido en 200 mL de un medio de cultivo durante 30 minutos. Se recolectan células del perfusado, se llevan a 4°C, y se lavan con una mezcla de inhibidor frío que comprende EDTA 5 mM, ditiotreitol 2 mM, y beta-mercaptoetanol 2 mM. Las células placentarias se lavan después de varios minutos con una composición fría de recolección de células madre (por ejemplo, 4°C). 5.5.5 Aislamiento, Clasificación, y Caracterización de Células Placentarias Las células placentarias aisladas, por ejemplo, las células descritas en la Sección 5.4.2, anterior, si se obtienen mediante perfusión o alteración física, por ejemplo, mediante digestión enzimática, inicialmente se pueden purificar de (es decir, aislarse de) otras células mediante centrifugación en gradiente Ficoll. Tal centrifugación puede seguir cualquier protocolo estándar de velocidad de centrifugación, etc. En una modalidad, por ejemplo, las células recolectadas de la placenta se recuperan del perfusado mediante centrifugación a 5000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente, la cual separa las células de, por ejemplo, restos contaminantes y plaquetas. En otra modalidad, el perfusado placentario se concentra hasta aproximadamente 200 mi, se coloca en capas suavemente sobre Ficoll, y se centrifuga aproximadamente a 1100 x g durante 20 minutos a 22°C, y la capa de interfaz de baja densidad de células se recolecta para procesamiento adicional.
Los aglomerados de células se pueden re-suspender en composición de recolección de células madre, recién hecha, o un medio adecuado para el mantenimiento de células, por ejemplo, mantenimiento de células madre, por ejemplo, medio libre de suero I DM que contiene 2 U/ml de heparina y EDTA 2 mM (GibcoBRL, NY) . La fracción total de células mononucleares se puede aislar, por ejemplo, utilizando Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) de acuerdo al procedimiento recomendado del fabricante.
Las células placentarias obtenidas mediante perfusión o digestión, por ejemplo, además, o inicialmente, se pueden aislar mediante tripsinización diferencial utilizando por ejemplo, una solución de tripsina al 0.05% con EDTA al 0.2% (Sigma, St . Louis MO) . La tripsinización diferencial es posible debido a que las células placentarias aisladas, que se adhieren al plástico del cultivo de tejido, típicamente se desprenden de las superficies del plástico dentro de aproximadamente cinco minutos mientras que otras poblaciones adherentes típicamente requieren más de 20-30 minutos de incubación. Las células placentarias desprendidas se pueden cosechar después de la tripsinización y neutralización con tripsina, utilizando, por ejemplo, Solución de Neutralización de Tripsina (TNS, Cambrex) . En una modalidad de aislamiento de células adherentes, alícuotas de, por ejemplo, aproximadamente 5-10 x 106 células, se colocan en cada uno de los diversos matraces T-75, preferiblemente matraces T75 recubiertos con fibronectina . En tal modalidad, las células se pueden cultivar con el Medio de Crecimiento de Células Madre Mesenquimatosas (MSCGM) , comercialmente disponible (Cambrex) , y se colocan en una incubadora de cultivo de tejido (37°C, C02 al 5%) . Después de 10 a 15 días, se remueven las células no adherentes de los matraces lavando con PBS. El PBS luego se reemplaza por MSCGM. De manera preferible se examina diariamente la presencia de varios tipos de células adherentes y en particular, la identificación y expansión de agregados de células fibroblastoides en los matraces.
El número y tipo de células recolectadas de una placenta mamifera se puede monitorear, por ejemplo, midiendo los cambios en la morfología y los marcadores de superficie celular utilizando técnicas estándar de detección de células tales como citometría de flujo, clasificación de células, inmunocitoquímica (por ejemplo, tinción con anticuerpos de tejidos específicos o de marcadores celulares específicos), clasificación de células activada por fluorescencia (FACS), selección celular inmunomagnética (MACS) , mediante el examen de la morfología de células utilizando microscopía de luz o confocal, y/o midiendo los cambios en la expresión genética utilizando técnicas bien conocidas en el arte, tal como PCR y creación de perfiles de expresión genética. Estas técnicas se pueden utilizar, también, para identificar células que sean positivas para¦ uno o más marcadores particulares. Por ejemplo, al utilizar anticuerpos para CD34, se puede determinar, utilizando las técnicas anteriores, si una célula comprende una cantidad detectable de CD34; de ser así, la célula es CD34+. Asimismo, si una célula produce suficiente ARN de OCT-4 que sea detectable mediante RT-PCR, o significativamente más ARN de OCT-4 que una célula adulta, la célula es 0CT-4+ . Los anticuerpos para los marcadores de superficie celular (por ejemplo, marcadores CD tales como CD34) y la secuencia de genes específicos de células madre, tales como OCT-4, son bien conocidos en la técnica.
Las células placentarias , particularmente las célula que han sido aisladas mediante separación Ficoll, adherencia diferencial, o una combinación de ambas, pueden clasificarse utilizando una clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) . La clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) es un método bien conocido para separar partículas, incluyendo células, en base a las propiedades fluorescentes de las partículas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165) . La excitación láser de porciones fluorescentes en las partículas individuales da como resultado una pequeña carga eléctrica que permite la separación electromagnética de partículas positivas y negativas de una mezcla. En una modalidad, los anticuerpos o ligandos de marcadores de superficie celular específicos, se etiquetan con distintas etiquetas fluorescentes. Las células se procesan a través del clasificador de células, que permite la separación de células en base a su capacidad de unirse a los anticuerpos utilizados. Las partículas clasificadas por FACS pueden depositarse directamente en pozos individuales de placas de 96 pozos ó 384 pozos para facilitar la separación y clonación.
En un esquema de clasificación, las células de la placenta, por ejemplo, se clasifican en base a la expresión de uno o más de los marcadores CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 y/o HLA-G. Esto se puede lograr en relación con procedimientos para seleccionar tales células en base a sus propiedades de adherencia en cultivo. Por ejemplo, se puede lograr una selección de células que se adhieren al plástico del cultivo de tejido antes o después de clasificarse en base a la expresión del marcador. En una modalidad, por ejemplo, las células se clasifican primero en base a su expresión de CD34; las células CD34" se mantienen, y las células CD34" que son adicionalmente CD200+HLA-G+ se separan de otras células CD34". En otra modalidad, las células de placenta se clasifican en base a su expresión de marcadores CD200 y/o HLA-G; por ejemplo, células que exhiben cualquiera de estos marcadores se aislan para usarse posteriormente. Las células que expresan, por ejemplo, CD200 y/o HLA-G, en una modalidad especifica, se pueden clasificar además en base a su expresión de CD73 y/o CD105, o epitopes reconocidos por los anticuerpos SH2, SH3 ó SH4, o falta de expresión de CD34, CD38 ó CD45. Por ejemplo, en otra modalidad, las células placentarias se clasifican por su expresión, o falta de la misma, de CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 y CD45, y las células placentarias que son CD200+, HLA-G+, CD73+, CD105+, CD34", CD38" y CD45~ se aislan de otras células placentarias para usarse posteriormente .
En modalidades especificas de cualquiera de las modalidades anteriores de células placentarias clasificadas, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 95% de las células en una población celular restante después de la clasificación, son dichas células placentarias aisladas. Las células placentarias se pueden clasificar mediante uno o más de cualquiera de los marcadores descritos en la Sección 5.4.2, anterior.
En una modalidad especifica, las células placentarias que son (1) adherentes al plástico del cultivo celular, y (2) CD10+, CD34" y CD105+ se clasifican a partir de (es decir, se aislan de) otras células placentarias. En otra modalidad especifica, las células placentarias que son (1) adherentes el plástico del cultivo del tejido, y (2) CD10+, CD34", CD105+ y CD200+ se clasifican a partir de (es decir, se aislan de) otras células placentarias. En otra modalidad especifica, las células placentarias que son (1) adherentes al plástico del cultivo del tejido, y (2) CD10+, CD34", CD45", CD90+, CD105+ y CD200+ se clasifican a partir de (es decir, se aislan de) otras células placentarias.
Con respecto a la detección mediada con anticuerpos y clasificación de células placentarias, por ejemplo, se puede utilizar células madre, placentarias, o células mult ipotentes placentarias, cualquier anticuerpo, especifico para un marcador particular, se puede utilizar, en combinación con cualquier fluoróforo u otra etiqueta adecuada para la detección y clasificación de células (por ejemplo, clasificación de células activada por fluorescencia) . Las combinaciones de anticuerpo/fluoróforo para marcadores específicos incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos monoclonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) contra HLA-G (disponible de Serotec, Raleigh, North Carolina) , CD10 (disponible de BD Immunocytometry Systems, San José, California) , CD44 (disponible de BD Biosciences Pharmingen, San José, California) , y CD105 (disponible de R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota); anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina (PE) contra CD44, CD200, CD117, y CD13 (BD Biosciences Pharmingen); anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina-Cy7 (PE Cy7 ) contra CD33 y CD10 (BD Biosciences Pharmingen) ; estreptavidina conjugada con aloficocianina (APC) y anticuerpos monoclonales conjugados contra CD38 (BD Biosciences Pharmingen) ; y CD90 Biotinilado (BD Biosciences Pharmingen) . Otros anticuerpos que se pueden utilizar incluyen, pero no están limitados a, CD133-APC (Miltenyi) , DR-Biotina (CD309, Abeam) , CytokeratinK-Fitc (Sigma o Dako) , ABC-Fitc HLA (BD) , DR, DQ, DP-PE HLA (BD) , ß-2-microglobulina-PE (BD) , CD80-PE (BD) y CD86-APC (BD) .
Otras combinaciones de anticuerpo/etiqueta que se pueden utilizar incluyen, pero no están limitadas a, CD45-PerCP (proteína peridin clorofil) ; CD 4-PE; CD 19-PE; CD10-F ( fluoresceína) ; HLA-G-F y 7-amino-actinomicina-D (7-AAD) ; HLA-ABC; y similares.
Las células placentarias aisladas provistas en la presente se pueden evaluar para CD117 ó CD133 utilizando, por ejemplo, estreptavidina conjugada con ficoeritricina-Cy5 (PE Cy5) y anticuerpos monoclonales conjugados con biotina contra CD117 ó CD133; sin embargo, utilizando este sistema, la célula puede parecer positiva para CD117 ó CD133, respectivamente, debido a un fondo relativamente alto.
Las células placentarias aisladas se pueden etiquetar con un anticuerpo para un solo marcador y detectarse y/o clasificarse. Las células placentarias también se pueden etiquetar simultáneamente con múltiples anticuerpos a diferentes marcadores.
En otra modalidad, se pueden utilizar perlas magnéticas para separar células. Las células se pueden clasificar utilizando una técnica selección celular inmunomagnética (MACS) , un método para separar partículas en base a su capacidad de unir perlas magnéticas (diámetro de 0.5-100 pm) . Una variedad de modificaciones útiles se puede realizar en las microesferas magnéticas, incluyendo la adición covalente de un anticuerpo que específicamente reconoce una molécula de superficie celular particular o hapteno. Las perlas se mezclan entonces con las células para permitir la unión. Las células se pasan entonces a través de un campo magnético para separar las células que tienen el marcador de superficie celular especifico. En una modalidad, estas células se pueden aislar entonces y re-mezclarse con perlas magnéticas acopladas a un anticuerpo contra marcadores adicionales de superficie celular. Las células se pasan de nuevo a través de un campo magnético, aislando las células que se unen ambos anticuerpos. Tales células se pueden diluir entonces en platillos separados, tales como platillos de micro-titulación para aislamiento clónico.
Las células placentarias aisladas también se pueden caracterizar y/o clasificarse en base a la morfología celular y características de crecimiento. Por ejemplo, las células placentarias aisladas se pueden caracterizar por tener, y/o seleccionarse en base a, por ejemplo, una apariencia fibroblastoide en el cultivo. Las células placentarias aisladas también se pueden caracterizar por tener, y/o seleccionarse, en base a su capacidad de formar cuerpos semejantes a embriones. En una modalidad, por ejemplo, las células placentarias tienen forma fibroblastoide, expresan CD73 y CD105, y producen uno o más cuerpos semejantes a embriones en el cultivo, se aislan de otras células placentarias. En otra modalidad, las células placentarias OCT-4+ que producen uno o más cuerpos semejantes a embriones en el cultivo, se aislan de otras células placentarias.
En otra modalidad, las células placentarias aisladas se pueden identificar y caracterizar mediante un ensayo de unidad formadora de colonias. Los ensayos de unidad formadora de colonias comúnmente se conocen en la técnica, tales como el medio MESEN CULT™ médium (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver British Columbia) .
Se puede evaluar la viabilidad, potencial de proliferación, y longevidad de las células placentarias aisladas utilizando técnicas estándar conocidas en el arte, tales como ensayo de exclusión con azul de tripano, ensayo de absorción de diacetato de fluoresceina, ensayo de absorción de yoduro de propidio (para evaluar la viabilidad) ; y ensayo de absorción con timidina, ensayo de proliferación celular MTT (para evaluar la proliferación) . La longevidad puede determinarse mediante métodos bien conocidos en la técnica, tal como determinando el número máximo de duplicación de la población en un cultivo extendido.
Las células placentarias aisladas, por ejemplo, las células placentarias aisladas descritas en la Sección 5.4.2, anterior, también se pueden preparar de otras células placentarias utilizando otras técnicas conocidas en el arte, por ejemplo, crecimiento selectivo de células deseadas (selección positiva) , destrucción selectiva de células indeseables (selección negativa) ; separación en base a una aglutinabilidad o capacidad aglutinante celular diferencial en la población mezclada como, por ejemplo, con aglutinina de soya; procedimientos de congelación-descongelación; filtración; centrifugación convencional y zonal; levigación o decantación centrifuga (centrifugación contra-corriente) ; unidad de separación por gravedad; distribución contracorriente; electroforesis ; y similares. 5.6 CULTIVO DE CÉLULAS PLACENTARIAS AISLADAS 5.6.1 Medio de Cultivo Las células placenterías ¦ aisladas, o poblaciones de células placentarias aisladas, o células o tejido placentario a partir del cual se desarrollan las células madre placentarias, se pueden utilizar para iniciar, o sembrar, cultivos de células. Las células generalmente se transfieren a recipientes estériles de cultivo de tejido ya sea sin recubrir o recubiertos con matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colágeno (por ejemplo, natural o desnaturalizado) , gelatina, fibronectina, ornitina, vitronectina, y proteína de membrana extracelular (por ejemplo, MATRIGEL® (BD Discovery Labware, Bedford, Mass) ) .
Se pueden cultivar células placentarias aisladas en cualquier medio, y bajo cualquier condición, reconocida en la técnica como aceptable para el cultivo de células, por ejemplo, células madre. Preferiblemente, el medio de cultivo comprende suero. Las células placentarias aisladas se pueden cultivar en, por ejemplo, DMEM-LG (Medio Esencial de Dulbecco Modificado, glucosa baja)/MCDB 201 (medio basal de fibroblastos de pollo) que contiene ITS (insulina-transferrina-selenio) , LA+BSA (albúmina de ácido linoleico-suero bovino) , dexametasona ácido L-ascórbico, PDGF, EGF, IGF-I, y penicilina/estreptomicina; DMEM-HG (glucosa elevada) que comprende suero bovino fetal al 10% (FBS) ; DMEM-HG que comprende FBS al 15%; IMDM (medio de Dulbecco modificado de Iscove) que comprende FBS al 10%, suero de caballo al 10%, e hidrocortisona; M199 que comprende FBS del 1% al 20%, EGF, y heparina; a-MEM (medio esencial mínimo) que comprende FBS al 10%, GLUTAMAX™ y gentamicina; DMEM que comprende FBS al 10%, GLUTAMAX™ y gentamicina, etc.
Otros medios en que se puede utilizar para cultivar células placentarias incluyen DMEM (glucosa elevada o baja) , medio basal de Eagle, medio FIO de Ham (FIO) , medio F-12 de Ham (F12), medio de Dulbecco modificado de Iscove, Medio de Crecimiento de células madre Mesenquimatosas (MSCGM) , medio L-15 de Liebovitz, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM avanzado (Gibco) , DMEM/MCDB201 (Sigma), y CELL-GRO FREE.
El medio de cultivo se puede suplementar con uno o más componentes que incluyen, por ejemplo, suero (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS), de manera preferible aproximadamente al 2-15% (v/v) ; suero equino (caballo) (ES) ; suero humano (HS) ) ; beta-mercaptoetanol (BME) , de manera preferible aproximadamente 0.001% (v/v); uno o más factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) , factor 1 de crecimiento similar a insulina (IGF-1), factor inhibidor de la leucemia (LIF) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , y eritropoyetina (EPO) ; aminoácidos, incluyendo L-valina; y uno o más agentes antibióticos y/o antimicótico para controlar la contaminación microbiana, tal como, por ejemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina, y nistatina, ya sea solo o en combinación.
Las células placentarias aisladas se pueden cultivar en condiciones estándar de cultivo de tejido, por ejemplo, en platillos de cultivo de tejido o placas de pozos múltiples. Las células placentarias aisladas también se pueden cultivar utilizando un método de gota suspendida. En este método, las células placentarias aisladas se suspenden aproximadamente a 1 x 104 células por mL en aproximadamente 5 mL de medio, y una o más gotas del medio se colocan en la parte interior de la tapa de un contenedor de cultivo de tejido, por ejemplo, un platillo Petri de 100 mL. Las gotas pueden ser, por ejemplo, gotas individuales, o gotas múltiples de, por ejemplo, una pipeta multicanal. La tapa se voltea cuidadosamente y se coloca por encima del fondo del platillo, que contiene un volumen de liquido, por ejemplo, PBS estéril suficiente para mantener el contenido de humedad en la atmósfera del platillo, y las células madre se cultivan.
En una modalidad, se cultivan células placentarias aisladas en la presencia de un compuesto que actúa para mantener un fenotipo no diferenciado en las células placentarias aisladas. En una modalidad especifica, el compuesto es una 3, -dihidropiridimol [4 , 5-d] pirimidina sustituida. En una modalidad más especifica, el compuesto es un compuesto que tiene la siguiente estructura química: El compuesto se puede poner en contacto con células placentarias aisladas, o una población de células placentarias aisladas, a una concentración de, por ejemplo, entre aproximadamente 1 µ? hasta aproximadamente 10 µ?. 5.6.2 Expansión y Proliferación de Células Placentarias Una vez que una célula placentaria, aislada, o población de células placentarias aisladas (por ejemplo, una célula placentaria o población de células placentarias separadas de al menos 50% de las células placentarias con las cuales la célula madre o población de células madre normalmente está asociada in vivo) , la célula o población de células puede proliferar y expandirse in vitro. Por ejemplo, una población de células placentarias aisladas se puede cultivar en contenedores de cultivo de tejido, por ejemplo, platillos, matraces, placas de pozos múltiples, o similares, durante un tiempo suficiente para que las células proliferen a una confluencia de 70-90%, es decir, hasta que las células y su progenie ocupen 70-90% del área superficial del contenedor del cultivo de tejido.
Las células placentarias aisladas se pueden sembrar en recipientes de cultivo a una densidad que permita el crecimiento celular. Por ejemplo, las células pueden sembrarse a baja densidad (por ejemplo, 1,000 hasta aproximadamente 5,000 células/cm2) a densidad elevada (por ejemplo, aproximadamente 50,000 o más células/cm2) . En una modalidad preferida, las células se cultivan en la presencia de aproximadamente 0 hasta aproximadamente 5 por ciento en volumen de C02 en aire. En algunas modalidades, las células se cultivan de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 25 por ciento de O2 en aire, de manera preferible de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 por ciento de 02 en aire. Las células preferiblemente se cultivan de aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 40°C, de manera preferible a 37°C. Las células preferiblemente se cultivan en una incubadora. El medio de cultivo puede ser estático o agitarse, por ejemplo, utilizando un biorreactor. Las células placentarias, por ejemplo, células madre placentarias o células multipotentes placentarias, preferiblemente se hacen crecer bajo estrés oxidativo bajo (por ejemplo, con la adición de glutatión, ácido ascórbico, catalasa, tocoferol, N-acetilcisteina, o similar) .
Una vez que se obtiene una confluencia menor del 100%, por ejemplo, 70% a 90%, pueden pasarse las células. Por ejemplo, las células se pueden tratar enzimáticamente, por ejemplo, tripsinarse, utilizando técnicas bien conocidas en el arte, para separar las mismas de la superficie del cultivo de tejido. Después de remover las células pipeteando y cuantificando las células, se pasan aproximadamente 10,000-100,000 células/cm2 a un nuevo contenedor de cultivo que contiene medio de cultivo recién hecho. Típicamente, el nuevo medio es del mismo tipo de medio a partir del cual se removieron las células placentarias aisladas. Las células placentarias aisladas se pueden pasar aproximadamente, al menos o no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 veces, o más. 5.6.3 Poblaciones de Células Placentarias Aisladas También se proporcionan en la presente poblaciones de células placentarias aisladas, por ejemplo, las células placentarias aisladas descritas en la Sección 5.4.2, anterior, útiles en el tratamiento de interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC . Se pueden aislar poblaciones de células placentarias aisladas directamente de una o más placentas; es decir, la población celular puede ser una población de células placentarias que comprende las células placentarias aisladas, en donde las células placentarias aisladas se obtienen de, o están contenidas dentro del, perfusado, o se obtienen de, o están contenidas dentro del, tejido placentario alterado, por ejemplo, digestato del tejido placentario (es decir, la recolección de células obtenidas mediante la digestión enzimática de una placenta o parte de la misma) . Las células placentarias aisladas descritas en la presente también se pueden cultivar y expandir para producir poblaciones de las células placentarias aisladas. Las poblaciones de células placentarias que comprende las células placentarias aisladas también se pueden cultivar y expandir para producir poblaciones de células placentarias.
Las poblaciones de células placentarias útiles en los métodos de tratamiento proporcionadas en la presente comprenden las células placentarias aisladas, por ejemplo, las células placentarias aisladas que se describen en la Sección 5.4.2 de la presente. En varias modalidades, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ó 99% de las células en una población de células placentarias son las células placentarias aisladas. Es decir, una población de las células placentarias aisladas puede comprender, por ejemplo, tanto como 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de células que no son las células placentarias aisladas.
Se pueden producir poblaciones de células placentarias aisladas útiles en el tratamiento de interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC, por ejemplo, seleccionando células placentarias aisladas, ya sea derivadas de digestión enzimática o perfusión, que expresan marcadores particulares y/o cultivo particular o características morfológicas. En una modalidad, por ejemplo, se produce una población de células seleccionando células placentarias que (a) se adhieren a un substrato, y (b) expresan CD200 y HLA-G; y aislando dichas células de otras células para formar una población celular. En otra modalidad, se produce una población de células seleccionando células placentarias que expresan el CD200 y HLA-G, y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad, se produce una población de células seleccionando células placentarias que (a) se adhieren a un substrato, y (b) expresan CD73, CD105, y CD200; y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad, se produce una población de células identificando células placentarias que expresan CD73, CD105, y CD200, y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad, se produce una población de células seleccionando células placentarias que (a) se adhieren a un substrato y (b) expresan CD200 y OCT-4; y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad, se produce una población de células seleccionado células placentarias que expresan CD200 y OCT-4, y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad, se produce, una población de células seleccionando células placentarias que (a) se adhieren a un substrato, y (b) expresan CD73 y CD105; y (c) facilitando la formación de uno o más cuerpos semejantes a embriones en una población de células placentarias que comprende dicha célula madre cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de un cuerpo semejante a un embrión; y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad, se produce una población de células seleccionando células placentarias que expresan CD73 y CD105; y facilitando la formación de uno o más cuerpos semejantes a embriones en una población de células placentarias que comprende dicha célula madre cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de un cuerpo semejante a un embrión; y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad, se produce una población de células seleccionando células placentarias que (a) se adhieren a un substrato, y (b) expresan CD73, CD105 y HLA-G; y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad, se produce una población de células seleccionando células placentarias que expresan CD73, CD105 y HLA-G; y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad, el método para producir una población de células comprende seleccionar células placentarias que (a) se adhieren a un substrato, (b) expresan OCT-4; y que (c) facilitan la formación de uno o más cuerpos semejantes a embriones en una población de células que comprende dicha célula madre cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de un cuerpo semejante a un embrión, y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad, se produce una población de células seleccionando células placentarias que expresan OCT-4, y facilitando la formación de uno o más cuerpos semejantes a embriones en una población de células placentarias que comprende dicha célula madre cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de un cuerpo semejante a un embrión, y aislando dichas células de otras células para formar una población de células.
En otra modalidad, se produce una población de células seleccionando células placentarias que se (a) adhieren a un substrato, y (b) expresan CD10 y CD105, y que no expresan CD34; y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad, se produce una población de células seleccionando células placentarias que expresen CD10 y CD105, y que no expresen CD34; y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad, se produce una población de células seleccionando células placentarias que se (a) adhieren a un substrato, y (b) expresen CD10, CD105, y CD200, y que no expresen CD34; y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad, se produce una población de células seleccionando células placentarias que expresen CD10, CD105, y CD200, y que no expresen CD34; y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad más especifica, se produce una población de células seleccionando células placentarias que se (a) adhieren a un substrato, y (b) expresen CD10, CD90, CD105, y CD200, y que no expresen CD34 y CD45; y aislando dichas células de otras células para formar una población de células. En otra modalidad, se produce una población de células seleccionando células placentarias que expresen CD10, CD90, CD105, y CD200, y que no expresen CD34 y CD45; y aislando dichas células de otras células para formar una población de células.
Tales poblaciones de células, o combinaciones de las mismas, se pueden utilizar para tratar la interrupción de flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC, por ejemplo, un síntoma de una interrupción o un déficit neurológico atribuible a tal interrupción.
En cualquiera de las modalidades anteriores, la selección de las poblaciones de células aisladas adicionalmente puede comprender seleccionar células placentarias que expresen ABC-p (una proteina transportadora ABC específica la placenta; ver, por ejemplo, Allikmets et al., Cáncer Res. 58 (23) : 5337-9 (1998)) . El método también puede comprender seleccionar células que exhiban al menos una característica específica para, por ejemplo, una célula madre mesenquimatosa, expresión de CD44, expresión de CD90, o expresión de una combinación de lo anteriormente citado.
En las modalidades anteriores, el substrato puede ser cualquier superficie sobre la cual se puede lograr un cultivo y/o selección de células, por ejemplo, células placentarias aisladas. Típicamente, el substrato es de plástico, por ejemplo, platillo de cultivo de tejido o plástico de la placa de pozos múltiples. El plástico del cultivo de tejido se puede recubrir con una biomolécula, por ejemplo, laminina o fibronectina .
Las células, por ejemplo, células placentarias aisladas, se pueden seleccionar para una población de células placentarias mediante cualquier medio conocido en la técnica de selección de células. Por ejemplo, las células se pueden seleccionar utilizando un anticuerpo o anticuerpos para uno o más marcadores de superficie celular, por ejemplo, en citometría de flujo o FACS. La selección se puede lograr utilizando anticuerpos en conjunción con perlas magnéticas. Los anticuerpos que son específicos para ciertos marcadores relacionados con células madre son conocidos en la técnica.
Por ejemplo, los anticuerpos para OCT-4 (Abeam, Cambridge, A) , CD200 (Abeam), HLA-G (Abeam), CD73 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) , CD 105 (Abeam; BioDesign International, Saco, ME) , etc. Los anticuerpos para otros marcadores también están disponibles comercialmente, por ejemplo, el CD34, CD38 y CD45 están disponibles de, por ejemplo, StemCell Technologies or BioDesign International.
Las poblaciones de células placentarias aisladas pueden comprender células placentarias que no son células madre, o células que no son células placentarias.
Las poblaciones de células placentarias aisladas proporcionadas en la presente se pueden combinar con una o más poblaciones de células no madre o células no placentarias. Por ejemplo, una población de células placentarias aisladas se puede combinar con sangre (por ejemplo, sangre de la placenta o sangre de cordón umbilical), células madre derivadas de la sangre (por ejemplo, células madre derivadas de sangre de la placenta o sangre del cordón umbilical), células madre del cordón umbilical, poblaciones de células nucleadas derivadas de la sangre, células mesenquimatosas derivadas de la médula ósea, poblaciones de células madre derivadas de los huesos, células madre adultas (somáticas) de médula ósea cruda, poblaciones de células madre contenidas dentro del tejido, células madre cultivadas, poblaciones de células totalmente diferenciadas (por ejemplo, condrocitos, fibroblastos, células amnióticas, osteoblastos, células musculares, células cardíacas, etc.) y similares. En una modalidad específica, una población de células útil para el tratamiento de la interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC comprende células placentarias aisladas y células aisladas del cordón umbilical. Las células en una población de células placentarias aisladas se pueden combinar con una pluralidad de células de otro tipo en relaciones de aproximadamente 100,000,000:1, 50,000,000:1, 20,000,000:1, 10,000,000:1, 5,000,000:1, 2,000,000:1, 1,000,000:1, 500,000:1, 200,000:1, 100,000:1, 50,000:1, 20,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 2,000:1, 1,000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1,000; 1:2,000; 1:5,000; 1:10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1:500,000; 1:1,000,000; 1:2,000,000; 1:5,000,000; 1:10,000,000; 1:20,000,000; 1:50,000,000; o aproximadamente 1:100,000,000, comparando los números de células nucleadas totales en cada población. Las células en una población de células placentarias aisladas se pueden combinar con una pluralidad de células de una pluralidad de tipos de células, también.
En otra modalidad, una población aislada de células placentarias se combina con una pluralidad de células madre hematopoyéticas . Tales células madre hematopoyéticas , por ejemplo, pueden estar contenidas dentro de sangre del cordón umbilical o sangre periférica de la placenta sin procesar; en las células nucleadas totales de la sangre de placenta, sangre del cordón umbilical o sangre periférica; en médula ósea sin procesar; en células nucleadas totales de médula ósea; en una población aislada de células CD34+ de médula ósea, o similares. 5.7 PRODUCCIÓN DE UN BANCO DE CÉLULAS PLACENTARIAS Las células aisladas de placentas post-parto, por ejemplo, las células placentarias aisladas descritas en la Sección 5.4.2, anterior, se pueden cultivar en una serie de diferentes maneras para producir un conjunto de lotes, por ejemplo, en donde un lote es un conjunto de dosis administrables individualmente, de células placentarias aisladas. Tales lotes, por ejemplo, se pueden obtener de células del perfusado de placenta o de células del tejido placentario digerido con enzimas. Los conjuntos de lotes de células placentarias, obtenidos de una pluralidad de placentas, se pueden colocar en un banco de células placentarias aisladas, por ejemplo, para almacenamiento a largo plazo. Generalmente, se obtienen células placentarias adherentes al plástico del cultivo de tejido de un cultivo inicial de material de placenta para formar un cultivo de semillas, que se expande bajo condiciones controladas para formar poblaciones de células de números aproximadamente equivalentes de duplicaciones. Los lotes preferiblemente se derivan del tejido de una sola placenta, aunque se pueden derivar del tejido de una pluralidad de placentas.
En una modalidad, se obtienen lotes de células placentarias como sigue. El tejido placentario primero se altera, por ejemplo, picando en trocitos, digerida con una enzima adecuada, por ejemplo, tripsina o colagenasa (ver la Sección 5.5.3, anterior) . El tejido placentario preferiblemente comprende, por ejemplo, el amnios completo, corion completo, o ambos, de una sola placenta, aunque puede comprender solamente una parte de cualquiera del amnios o corion. El tejido digerido se cultiva, por ejemplo, durante aproximadamente 1-3 semanas, de manera preferible aproximadamente 2 semanas. Después de la remoción de células no adherentes, colonias de alta densidad que se forman se recolectan, por ejemplo, mediante tripsinización . Estas células se recolectan y re-suspenden en un volumen conveniente de medio de cultivo, y luego se utilizan para sembrar cultivos de expansión. Los cultivos de expansión pueden ser cualquier arreglo de aparatos de cultivo de células, separados, por ejemplo, un Cell Factory de NUNC™. Las células se pueden subdividir a cualquier grado para sembrar cultivos de "5 3 3 3 expansión con, por ejemplo, 1 x 10 , 2 x 10 , 3 x 10 , 4 x 10 , 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, 1 x 1?\ 1 x 104, 2 x 3 x 104, 4 x 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, ó 10 x 104 células/cm2. De manera preferible, desde aproximadamente 1 x 103 hasta aproximadamente 1 x 104 células/cm2 se utilizan para sembrar cada cultivo de expansión. El número de cultivos de expansión puede ser de mayor o menor número dependiendo de la(s) placenta (s) particular (es ) a partir de la cual se obtienen las células.
Los cultivos de expansión se hacen crecer hasta que la densidad de células en el cultivo alcance un cierto valor, por ejemplo, aproximadamente 1 x 105 células/cm2. Las células pueden ya sea recolectarse o criopreservarse en este punto, o pasarse a nuevos cultivos de expansión como se describe anteriormente. Las células pueden pasarse, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 veces antes de usarse. Un registro del número acumulativo de duplicaciones de la población preferiblemente se mantiene durante el (los) cultivo(s) de expansión. Las células de un cultivo se pueden expandir a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ó 40 duplicaciones, o hasta 60 duplicaciones. Preferiblemente, sin embargo, el número de duplicaciones de población, antes de dividir la población de células en dosis individuales, es de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30. Las células se pueden cultivar continuamente en todo el proceso de expansión, o se pueden congelar en uno o más puntos durante la expansión.
Las células que se utilizan para dosis individuales se pueden congelar, por ejemplo, criopreservar para uso posterior. Las dosis individuales pueden comprender, por ejemplo, aproximadamente 1 millón hasta aproximadamente 50 millones de células por mi, y pueden comprender entre aproximadamente 106 y aproximadamente 1010 células en total.
En una modalidad, por lo tanto, se puede hacer un banco de células placentarias mediante un método que comprende: expandir células placentarias del cultivo primario de una placenta humana post-parto para una primera pluralidad de duplicaciones de población; criopreservar dichas células placentarias para formar un Banco de Células Máster; expandir una pluralidad de células placentarias del Banco de Células Máster para una segunda pluralidad de duplicaciones de población; criopreservar dichas células placentarias para formar un Banco de Células de Trabajo; expandir una pluralidad de células placentarias del Banco de Células de Trabajo para una tercera pluralidad de duplicaciones de población; y criopreservar dichas células placentarias en dosis individuales, en donde dichas dosis individuales componen colectivamente un banco de células placentarias. Opcionalmente, una pluralidad de células placentarias de dicha tercera pluralidad de duplicaciones de población se puede expandir para una cuarta pluralidad de duplicaciones de población y criopreservarse en dosis individuales, en donde dichas dosis individuales componen colectivamente un banco de células madre placentarias.
En otra modalidad especifica, dichas células placentarias del cultivo primario comprenden células placentarias del perfusado placentario. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias del cultivo primario comprenden células placentarias del tejido placentario digerido. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias del cultivo primario comprenden células placentarias del perfusado placentario y del tejido placentario digerido. En otra modalidad especifica, la totalidad de dichas células placentarias en dicho el cultivo primario de células placentarias comprenden son de la misma placenta. En otra modalidad especifica, el método comprende además la etapa de seleccionar células placentarias CD200+ ó HLA-G+ de dicha pluralidad de dichas células placentarias de dicho Banco de Células de Trabajo para formar dosis individuales. En otra modalidad especifica, dichas dosis individuales comprenden desde aproximadamente 104 hasta aproximadamente 105 células placentarias. En otra modalidad especifica, dichas dosis individuales comprenden desde aproximadamente 105 hasta aproximadamente 106 células placentarias. En otra modalidad especifica, dichas dosis individuales comprenden desde aproximadamente 106 hasta aproximadamente 107 células placentarias. En otra modalidad especifica, dichas dosis individuales comprenden desde aproximadamente 101 hasta aproximadamente 108 células placentarias. En otra modalidad especifica, dichas dosis individuales comprenden desde aproximadamente 108 hasta aproximadamente 109 células placentarias . En otra modalidad específica, dichas dosis individuales comprenden desde aproximadamente 109 hasta aproximadamente 1010 células placentarias.
En una modalidad preferida, el donador a partir del cual se obtiene la placenta (por ejemplo, la madre) se analiza para al menos un patógeno. Si los análisis de la madre dan positivo para un patógeno analizado, se desecha el lote completo de la placenta. Tal análisis se puede realizar en cualquier momento durante la producción de lotes de células placentarias, por ejemplo, durante la expansión del cultivo. Los patógenos para los cuales se analiza la presencia pueden incluir, sin limitación, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, virus inmunodeficiencia humana (tipos I y II), citomegalovirus , virus herpes, y similares. 5.8 PRESERVACIÓN DE CÉLULAS PLACENTARIAS Las células placentarias aisladas, por ejemplo, las células placentarias aisladas descritas en la Sección 5.4.2, anterior, se pueden preservar, es decir, colocarse bajo condiciones que permitan su almacenamiento a largo plazo, o condiciones que inhiban la muerte celular, por ejemplo, mediante apoptosis o necrosis.
Las células placentarias se pueden preservar utilizando, por ejemplo, una composición que comprende un inhibidor de apoptosis, inhibidor de necrosis y/o perfluorocarbono de transporte de oxígeno, como se describe en la Publicación relacionada de la Solicitud de Patente Norteamericana No. 2007/0190042, la descripción de la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. En una modalidad, un método para preservar una población de células, útil en el tratamiento de la interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC, comprende poner en contacto dicha población de células con una composición de recolección de células que comprende un inhibidor de apoptosis y un perfluorocarbono de transporte de oxígeno, en donde dicho inhibidor de apoptosis está presente en una cantidad y durante un tiempo suficiente para reducir o prevenir la apoptosis en la población de células, en comparación con una población de células que no está en contacto con el inhibidor de apoptosis. En una modalidad específica, dicho inhibidor de apoptosis es un inhibidor de caspasa. En otra modalidad específica, dicho inhibidor de apoptosis es un inhibidor JNK. En una modalidad más específica, dicho inhibidor JNK no modula la diferenciación o proliferación de dichas células. En otra modalidad, dicha composición de recolección de células comprende dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarbono de transporte de oxígeno en fases separadas. En otra modalidad, dicha composición de recolección de células comprende dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarbono de transporte de oxígeno en una emulsión. En una modalidad especifica, la composición de recolección de células comprende adicionalmente un emulsionante, por ejemplo, lecitina. En otra modalidad, dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarbono están entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 25 °C al momento de estar en contacto con las células. En otra modalidad más especifica, dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarbono están entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 10 °C, o entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 5°C, al momento de estar en contacto con las células. En otra modalidad más especifica, dicho contacto se realiza durante el transporte de dicha población de células. En otra modalidad más específica, dicho contacto se realiza durante la congelación y descongelación de dicha población de células .
Las poblaciones de células placentarias se pueden cosechar, por ejemplo, mediante un método que comprende poner en contacto dicha población de células con un inhibidor de apoptosis y un compuesto preservador de órganos, en donde dicho inhibidor de apoptosis está presente en una cantidad y durante un tiempo suficiente para reducir o evitar la apoptosis en la población de células, en comparación con una población de células que no está en contacto con el inhibidor de apoptosis. En una modalidad específica, el compuesto preservador de órganos es solución UW (descrita en la Patente Norteamericana No. 4,798,824; también conocida como ViaSpan; ver también Southard et al., Transplantation 49 (2 ) : 251-257 (1990)) o una solución descrita en Stern et al., Patente Norteamericana No. 5,552,267. En otra modalidad, dicho compuesto preservador de órganos es almidón de hidroxietilo, ácido lactobiónico, rafinosa, o una combinación de los mismos. En otra modalidad, la composición de recolección de células adicionalmente comprende cómo un perfluorocarbono de transporte de oxigeno, ya sea en dos fases o como una emulsión .
En otra modalidad del método, las células placentarias se ponen en contacto con una composición de recolección de células que comprende un inhibidor de apoptosis y un perfluorocarbono de transporte de oxigeno, compuesto preservador de órganos, o combinación de los mismos, durante la perfusión. En otra modalidad, dichas células se ponen en contacto durante un proceso de alteración de tejido, por ejemplo, digestión enzimática. En otra modalidad, las células placentarias se ponen en contacto con dicho compuesto de recolección de célula después de la recolección mediante perfusión, o después de la recolección mediante alteración de tejido, por ejemplo, digestión enzimática.
Típicamente, durante la recolección enriquecimiento y aislamiento de las células placentarias, es preferible minimizar o eliminar el estrés celular debido a hipoxia o estrés mecánico. En otra modalidad del método, por lo tanto, una célula, o población de células, se expone a una condición hipóxica durante la recolección, enriquecimiento o aislamiento por menos de seis horas durante dicha preservación, en donde una condición hipóxica es una concentración de oxigeno que es menor a la concentración normal de oxigeno en la sangre. En una modalidad más especifica, dicha población de células se expone a dicha condición hipóxica por menos de dos horas durante dicha preservación. En otra modalidad más especifica, dicha población de células se expone a dicha condición hipóxica por menos de una hora, o menos de treinta minutos, o no se expone a una condición hipóxica, durante la recolección, enriquecimiento o aislamiento. En otra modalidad especifica, dicha población de células no se expone a tensión cortante durante la recolección, enriquecimiento o aislamiento.
Las células placentarias se pueden criopreservar , por ejemplo, en medio de criopreservación en pequeños contenedores, por ejemplo, ampolletas. El medio de criopreservación adecuado incluye, pero no está limitado a, medio de cultivo que incluye, por ejemplo, medio de crecimiento, o medio de congelación de células, por ejemplo, medio de congelación de células comercialmente disponible, por ejemplo, C2695, C2639 ó C6039 (Sigma) . El medio de criopreservación preferiblemente comprende DMSO (dimetilsulfóxido) , a una concentración de aproximadamente 2% hasta aproximadamente 15% (v/v) , por ejemplo, aproximadamente 10% (v/v) . El medio de criopreservacion puede comprender agentes adicionales, por ejemplo, metilcelulosa y/o glicerol. Las células placentarias preferiblemente se enfrian aproximadamente a l°C/min durante la criopreservacion. Una temperatura de criopreservacion es de aproximadamente -80 °C hasta aproximadamente 180°C, de manera preferible de aproximadamente -125°C hasta aproximadamente -140°C. Las células criopreservadas se pueden transferir a nitrógeno liquido antes de descongelarse para usarse. En algunas modalidades, por ejemplo, una vez que las ampolletas han alcanzado aproximadamente -90°C, las mismas se transfieren a un área de almacenamiento de nitrógeno liquido. La criopreservacion también se puede hacer utilizando un congelador de grado controlado. Las células criopreservadas preferiblemente se descongelan a una temperatura de aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 40 °C, de manera preferible a una temperatura de aproximadamente 37 °C. 5.9 COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN CÉLULAS PLACENTARIAS AISLADAS Las células placentarias descritas en la presente, por ejemplo, en la Sección 5.4.2, se pueden combinar con cualquier compuesto, composición o dispositivo fisiológicamente aceptable o médicamente aceptable, para usarse en el tratamiento de la interrupción de flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC. Las composiciones útiles en los métodos de tratamiento proporcionadas en la presente pueden comprender cualquiera de una o más de las células placentarias descritas en la presente (ver la Sección 5.4.2, anterior). En ciertas modalidades, la composición es una composición farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, una composición que comprende células placentarias en un portador farmacéuticamente aceptable. Ver la Sección 5.9.2, posterior.
En ciertas modalidades, una composición que comprende las células placentarias aisladas adicionalmente comprende una matriz, por ejemplo, una matriz sin células o una matriz sintética. En una modalidad más especifica, dicha matriz es un armazón tridimensional. En otra modalidad más especifica, dicha matriz comprende colágeno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina, o vitronectina . En otra modalidad más especifica, la matriz es una membrana amniótica o material derivado de la membrana amniótica. En otra modalidad más especifica, dicha matriz comprende una proteina de membrana extracelular . En otra modalidad más especifica, dicha matriz comprende un compuesto sintético. En otra modalidad más especifica, dicha matriz comprende un compuesto bioactivo. En otra modalidad más especifica, dicho compuesto bioactivo es un factor de crecimiento, citocina, anticuerpo, o molécula orgánica menor de 5,000 dalton.
En otra modalidad, una composición útil en los métodos de tratamiento proporcionados en la presente, comprende medio acondicionado mediante cualquiera de las células placentarias antes mencionadas, o cualquiera de las poblaciones de células placentarias antes mencionadas. 5.9.1 Células Placentarias Aisladas Criopreservadas Las poblaciones de células placentarias aisladas útiles para el tratamiento de la interrupción de flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC se pueden preservar, por ejemplo, criopreservarse para usarse posteriormente. Los métodos para la criopreservación de células, tales como células madre, son bien conocidos en la técnica. Se pueden preparar poblaciones de células placentarias aisladas en una forma que sea administrable fácilmente a un individuo, por ejemplo, una población de células placentarias aisladas que esté contenida dentro de un contenedor que sea adecuado para uso médico. Tal contenedor puede ser, por ejemplo, una jeringa, bolsa de plástico estéril, matraz, jarra, u otro contenedor a partir el cual se puede suministrar fácilmente la población de células placentarias aisladas. Por ejemplo, el contenedor puede sr una bolsa de sangre u otra bolsa de plástico médicamente aceptable para la administración intravenosa de un líquido a un receptor. El contenedor preferiblemente es uno que permita la criopreservación de la población de células combinadas.
La población de células placentarias aisladas, criopreservadas, pueden comprender una célula placentaria aislada derivada de un solo donador, o de múltiples donadores.
La población de células placentarias aisladas se puede hacer compatible con HLA completamente a un receptor previsto, o no hacerse compatible con HLA parcial o completamente.
Por consiguiente, en una modalidad, se pueden utilizar células placentarias aisladas para el tratamiento de la interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC en la forma de una composición que comprende una población de células placentarias adherentes al plástico del cultivo de tejido en un contenedor. En una modalidad específica, las células placentarias aisladas se criopreservan . En una modalidad específica, el contenedor es una bolsa, matraz, o jarra. En una modalidad más específica, dicha bolsa es una bolsa de plástico estéril. En una modalidad más específica, dicha bolsa es adecuada para, permite o facilita la administración intravenosa de dicha población de células placentarias aisladas, por ejemplo, mediante infusión intravenosa. La bolsa puede comprender múltiples cavidades o compartimentos que están interconectados para permitir el mezclado de las células placentarias aisladas y una o más de otras soluciones, por ejemplo, un fármaco, previo a, o durante, la administración. En una modalidad específica, la composición comprende uno o más compuestos que facilitan la criopreservación de la población de células combinadas. En otra modalidad específica, dicha población de células placentarias aisladas está contenida dentro de una solución acuosa fisiológicamente aceptable. En una modalidad más especifica, dicha solución acuosa fisiológicamente aceptable es una solución de NaCl al 0.9%. En otra modalidad especifica, dicha población de células placentarias aisladas comprende células placentarias que son igualadas con HLA para un receptor de dicha población de células. En otra modalidad especifica, dicha población de células combinadas comprende células placentarias que son al menos parcialmente no se igualan con HLA para un receptor de dicha población de células. En otra modalidad especifica, dichas células placentarias aisladas se derivan de una pluralidad de donadores .
En ciertas modalidades, las células placentarias aisladas en el contenedor son células placentarias aisladas CD10+, CD34" , CD105+, en donde dichas células han sido criopreservadas , y no están contenidas dentro de un contenedor. En una modalidad específica, dichas células placentarias CD10+, CD34", CD105+, también son CD200+. En una modalidad más específica, dichas células placentarias CD10+, CD34", CD105+, CD200+ también son CD45" ó CD90+. En una modalidad más específica, dichas células placentarias CD10+ , CD34", CD105+, CD200+ también son CD45" ó CD90+. En una modalidad más específica, las células placentarias CD10+, CD34", CD105+ son adicionalmente una o más de CD13+, CD29+, CD33+, CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD62E", CD62L", CD62P", SH3+ (CD73+) , SH4+ (CD73+) , CD80", CD86", CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117", CD144 /VE-cadherinabaja, CD184/CXCR4", CD200+ , CD133", OCT-4 +, SSEA3", SSEA4", ABC-P+, KDR" (VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR", HLA-G+, ó Ligando de Muerte Programada 1 (PDL1)+, o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad más especifica, las células placentarias CD34", CD10+, CD105+ are adicionalmente CD13+, CD29+, CD33+, CD38", CD44+ , CD45", CD54+/ICAM+, CD62E", CD62L", CD62P", SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+) , CD80", CD86", CD90+, SH2+ (CD105+) , CD106/VCAM+, CD117", CD144 /VE-cadherinabaja, CD184/CXCR4", CD200+, CD133", 0CT-4+, SSEA3", SSEA4", ABC-P+, KDR" (VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP , DQ, DR" , HLA-G+, ó Ligando de Muerte Programada 1 (PDL1)+.
En ciertas otras modalidades, las células placentarias aisladas antes mencionadas son células placentarias aisladas CD200+, HLA-G+, en donde dichas célula han sido criopreservadas, y están contenidas dentro de un contenedor. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son células CD73+, CD105+, CD200+ que han sido criopreservadas, y están contenidas dentro de un contenedor. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son células placentarias CD200+, OCT-4+ que han sido criopreservadas, y están contenidas dentro de un contenedor. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son células placentarias CD73+, CD105+ que han sido criopreservadas, y están contenidas dentro de un contenedor, y en donde dichas células placentarias aisladas facilitan la formación de uno o más cuerpos semejantes a embriones cuando se cultivan con una población de células placentarias bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos semejantes a embriones. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son células CD73+, CD105+, HLA-G+ que han sido criopreservadas, y están contenidas dentro de un contenedor. En otra modalidad, las células placentarias aisladas son células placentarias 0CT-4+ que han sido criopreservadas, y están contenidas dentro de un contenedor, y en donde dichas células facilitan la formación de uno o más cuerpos semejantes a embriones cuando se cultivan con una población de células placentarias bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos semejantes a embriones.
En otra modalidad especifica, las células placentarias aisladas antes mencionadas son células madre placentarias o células multipotentes placentarias que son CD34", CD104 y CD105+ que se detectan mediante citometria de flujo. En una modalidad más especifica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ son células madre placentarias. En una modalidad más especifica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ son células placentarias multipotentes. En otra modalidad específica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ son células placentarias tienen el potencial de diferenciarse en células de un fenotipo neural, células de un fenotipo osteogénico, o células de un fenotipo condrogénico . En una modalidad más especifica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ son adicionalmente CD200+. En otra modalidad más especifica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ adicionalmente son CD90+ ó CD45", que se detectan mediante citometria de flujo. En otra modalidad más especifica, las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ adicionalmente son CD90+ ó CD45", que se detectan mediante citometria de flujo. En una modalidad más especifica, las células placentarias CD34~, CD10+, CD105+, CD200+ adicionalmente son CD90+ ó CD45", que se detectan mediante citometria de flujo. En otra modalidad más específica, las células CD34", CD10+, CD105+, CD200+ adicionalmente son CD90+ ó CD45", que se detectan mediante citometria de flujo. En otra modalidad más específica, las células CD34", CD10+, CD105+, CD200+, CD90++ y CD45" adicionalmente son CD80" ó CD86", que se detectan mediante citometria de flujo. En otra modalidad más específica, las células CD34~, CD10+, CD105+, adicionalmente son una o más de CD29+, CD38~, CD44+, CD54 +, CD80", CD86", SH3+ ó SH4+. En otra modalidad más específica, las células adicionalmente son CD44+. En una modalidad específica de cualquiera de las células placentarias aisladas CD34", CD10+, CD105+ anteriores, las células son adicionalmente uno o más de CD117", CD133", KDR" (VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR", y/o PDL1+.
En una modalidad específica de cualquiera de las células placentarias aisladas, criopreservadas , mencionadas anteriormente, dicho contenedor es una bolsa. En varias modalidades especificas, dicho contenedor comprende aproximadamente, al menos, o como máximo 1 x 106 de dichas células placentarias aisladas, 5 x 106 de dichas células placentarias aisladas, 1 x 107 de dichas células placentarias aisladas, 5 x 107 de dichas células placentarias aisladas, 1 x 108 de dichas células placentarias aisladas, 5 x 108 de dichas células placentarias aisladas, 1 x 109 de dichas células placentarias aisladas, 5 x 109 de dichas células placentarias aisladas, 1 x 1010 de dichas células placentarias aisladas, o 1 x 1010 de dichas células placentarias aisladas. En otras modalidades especificas de cualquiera de las poblaciones criopreservadas antes mencionadas, dichas células placentarias aisladas se han pasado aproximadamente, al menos, o no más de 5 veces, no más de 10 veces, no más de 15 veces, o no más de 20 veces. En otra modalidad especifica de cualquiera de las células placentarias aisladas, criopreservadas, antes mencionadas, dichas células placentarias aisladas se han expandido dentro de dicho contenedor. 5.9.2 Composiciones Farmacéuticas Las poblaciones de células placentarias aisladas, o poblaciones de células que comprenden las células placentarias aisladas, se pueden formular en composiciones farmacéuticas para usarse in vivo, por ejemplo, en los métodos de tratamiento proporcionados en la presente. Tales composiciones farmacéuticas comprenden una población de células placentarias aisladas, o una población de células que comprenden células placentarias aisladas, en un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, una solución salina u otra solución fisiológicamente aceptada para administración in vivo. Las composiciones farmacéuticas que comprenden las células placentarias aisladas descritas en la presente pueden comprender cualquiera, o cualquier combinación, de poblaciones de células placentarias aisladas, o células placentarias aisladas, descritas en cualquier parte de la presente. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender células placentarias aisladas fetales, maternas, o tanto fetales como maternas. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente pueden comprender además células placentarias aisladas obtenidas de un solo individuo o placenta, o de una pluralidad de individuos o placentas.
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente pueden comprender cualquier número de células placentarias aisladas. Por ejemplo, una sola dosis unitaria de células placentarias aisladas puede comprender, en varias modalidades, aproximadamente, al menos, o no más de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 ó más células placentarias aisladas.
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente comprenden poblaciones de células que comprenden 50% de células viables o más (es decir, al menos 50% de las células en la población son funcionales o vivas) . Preferiblemente, al menos 60% de las células en la población son viables. Más preferiblemente, al menos 70%, 80%, 90%, 95%, ó 99% de las células en la población en la composición farmacéutica son viables.
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente pueden comprender uno o más compuestos que, por ejemplo, facilitan la implantación (por ejemplo, anticuerpos receptores del receptor anti-células T, un inmunosupresor , o similares); estabilizadores tales como albúmina, dextrano 40, gelatina, almidón de hidroxietilo, plasmalyte, y similares.
Cuando se formulan como una solución inyectable, en una modalidad, la composición farmacéutica comprende aproximadamente 1% a 1.5% de HSA y aproximadamente 2.5% de dextrano. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende desde aproximadamente 5 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 2 x 107 células por mililitro en una solución que comprende 5% de HSA y 10% de dextrano, que comprende . opcionalmente un inmunosupresor, por ejemplo, ciclosporina A, por ejemplo, a 10 mg/kg.
En otras modalidades, la composición farmacéutica, por ejemplo, una solución, comprende una pluralidad de células, por ejemplo, células placentarias aisladas, por ejemplo, células madre placentarias o células multipotentes placentarias, en donde dicha composición farmacéutica comprende entre aproximadamente 1.0 ± 0.3 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 5.0 ± 1.5 x 106 células por mililitro. En otras modalidades, la composición farmacéutica comprende entre aproximadamente 1.5 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 3.75 x 106 células por mililitro. En otras modalidades, la composición farmacéutica comprende entre aproximadamente 1 x 106 células/mL hasta aproximadamente 50 x 106 células/mL, aproximadamente 1 x 106 células/mL hasta aproximadamente 40 x 106 células/mL, aproximadamente 1 x 106 células/mL hasta aproximadamente 30 x 106 células/mL, aproximadamente 1 x 106 células/mL hasta aproximadamente 20 x 106 células/mL, aproximadamente 1 x 106 células/mL hasta aproximadamente 15 x 106 células/mL, o aproximadamente 1 x 106 células/mL hasta aproximadamente 10 x 106 células/mL. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica no comprende agregados de células visibles (es decir, sin agregados de macro-células ) , o sustancialmente no comprende tales agregados visibles. Cuando se utiliza en la presente, "agregados de macro-células" significa una agregación de células visibles sin amplificación, por ejemplo, visibles a simple vista, y generalmente se refiere a una agregación celular más grande de aproximadamente 150 mieras.
En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende aproximadamente 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5% 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5% ó 10% de dextrano, por ejemplo, dextrano 40. En una modalidad específica, dicha composición comprende desde aproximadamente 7.5% hasta aproximadamente 9% de dextrano 40. En una modalidad específica, dicha composición comprende aproximadamente 5.5% de dextrano 40. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica comprende desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 15% de albúmina de suero humano (HSA) . En modalidades específicas, la composición farmacéutica comprende aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 65, 75, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% ó 15% de HSA. En una modalidad específica, dichas células se han criopreservado y descongelado. En otra modalidad específica, dichas células se han filtrado a través de un filtro de 70 µ? a 100 µ?. En otra modalidad específica, dicha composición comprende agregados de células no visibles. En otra modalidad específica, dicha composición comprende menos de aproximadamente 200 agregados de células por 106 células, en donde dichas agregados de células son visibles solamente en un microscopio, por ejemplo, un microscopio de luz. En otra modalidad específica, dicha composición comprende menos de aproximadamente 100 agregados de células por 106 células, en donde dichas agregados de célula son visibles solamente en un microscopio, por ejemplo, un microscopio de luz .
En una modalidad específica, la composición farmacéutica comprende aproximadamente 1.0 ± 0.3 x 106 células por mililitro, aproximadamente 5.5% de dextrano 40 (p/v) , aproximadamente 10% de HSA (p/v) , y aproximadamente 5% de D SO (p/v) .
En otras modalidades, la composición farmacéutica comprende una pluralidad de células, por ejemplo, una pluralidad de células placentarias aisladas en una solución que comprende 10% de dextrano 40, en donde la composición farmacéutica comprende entre aproximadamente 5.0 + 1.5 x 106 células por mililitro, y en donde dicha composición no comprende agregados de células sin ayuda de un lente (es decir, no comprende agregados de macro-células ) . En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende entre aproximadamente 1.5 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 3.75 x 106 células por mililitro. En una modalidad específica, dichas células se han criopreservado y descongelado. En otra modalidad específica, dichas células se han filtrado a través de un filtro de 70 µ? a 10 µ?. En otra modalidad específica, dicha composición comprende menos de aproximadamente 200 agregados de micro-células (es decir, agregados de células visibles solamente con amplificación) por 106 células. En otra modalidad específica, la composición farmacéutica comprende menos de aproximadamente 150 agregados de micro-células por 106 células. En otra modalidad específica, la composición farmacéutica comprende menos de aproximadamente 100 agregados de micro-células por 106 células. En otra modalidad específica, la composición farmacéutica comprende menos de 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, ó 2% de DMSO, ó menos de 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, ó 0.1% de DMSO.
Además se proporcionan en la presente composiciones que comprenden células, en donde dichas composiciones se producen mediante alguno de los métodos dados a conocer en la presente. Por ejemplo, en una modalidad, la composición farmacéutica comprende células, en donde la composición farmacéutica se produce mediante un método que comprende filtrar una solución que comprende células placentarias , por ejemplo, células madre placentarias o células multipotentes placentarias, para formar una solución filtrada que contiene células; diluyendo la solución filtrada que contiene células con una primera solución aproximadamente de 1 a 50 x 106, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, ó 1 a 10 x 106 células por mililitro, por ejemplo, previo a la criopreservación, y diluir la solución filtrada que contiene células, resultante con una segunda solución que comprende dextrano, pero que no comprenden albúmina de suero humano (HSA) para producir dicha composición. En ciertas modalidades, dicha dilución no es más de aproximadamente 15 x 106 células por mililitro. En ciertas modalidades, dicha dilución no es más de aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitro. En ciertas modalidades, dicha dilución no es más de aproximadamente 7.5 x 106 células por mililitro. En ciertas otras modalidades, si la solución filtrada que contiene células, previo a la dilución, comprende menos de aproximadamente 15 x 106 células por mililitro, la filtración es opcional. En ciertas otras modalidades, si la solución filtrada que contiene células, previo a la dilución, comprende menos de aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitro, la filtración es opcional. En ciertas otras modalidades, si la solución filtrada que contiene células, previo a la dilución, comprende menos de aproximadamente 7.5 x 106 células por mililitro, la filtración es opcional.
En una modalidad especifica, las células se criopreservan entre dicha dilución con una primera solución de dilución y dicha dilución con dicha segunda solución de dilución. En otra modalidad especifica, la primera solución de dilución comprende dextrano y HSA. El dextrano en la primera solución de dilución o segunda solución de dilución o cualquier peso molecular, por ejemplo, dextrano que tiene un peso molecular de aproximadamente 10 kDa hasta aproximadamente 150 kDa . En algunas modalidades, dicho dextrano en dicha primera solución de dilución o dicha segunda solución es de aproximadamente 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5% 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5% ó 10% de dextrano. En otra modalidad especifica, el dextrano en dicha primera solución de dilución o dicha segunda solución de dilución es dextrano 40. En otra modalidad especifica, el dextrano en dicha primera solución de dilución y dicha segunda solución de dilución es dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicho dextrano 40 en dicha primera solución de dilución es 5.0% de dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicho dextrano 40 en dicha primera solución de dilución es 5.5% de dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicho dextrano 40 en dicha segunda solución de dilución es 10% de dextrano 40. En otra modalidad especifica, dicho HSA en dicha solución que comprende HSA es 1 a 15% de HSA. En otra modalidad específica, dicho HSA en dicha solución comprende HSA es de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% ó 15% de HSA. En otra modalidad específica, dicho HSA en dicha solución que comprende HSA es 10% de HSA. En otra modalidad específica, dicho primera solución de dilución comprende HSA. En otra modalidad más específica, dicho HSA en dicha primera solución de dilución es de 10% de HSA. En otra modalidad específica, dicha primera solución de dilución comprende un crioprotector. En una modalidad más específica, dicho crioprotector es DMSO. En otra modalidad específica, dicho dextrano 40 en dicha segunda solución de dilución es de aproximadamente 10% de dextrano 40. En otra modalidad específica, dicha composición que comprende células comprende aproximadamente 7.5% hasta aproximadamente 95% de dextrano. En otra modalidad especifica, la composición farmacéutica comprende desde aproximadamente 1.0 ± 0.3 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 5.0 ± 1.5 x 106 células por mililitro. En otra modalidad específica, la composición farmacéutica comprende desde aproximadamente 1.5 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 3.75 x 106 células por mililitro.
En otra modalidad, la composición farmacéutica se hace mediante un método que comprende (a) filtrar una solución que contiene células que comprende células placentarias , por ejemplo, células madre placentarias o células multipotentes placentarias, previo a la criopreservacion para producir una solución que contiene células, filtrada; (b) criopreservar las células en la una solución que contiene células, filtrada, aproximadamente a 1 a 50 x 106, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, ó 1 a 10 x 106 células por mililitro; (c) descongelar las células; y (d) diluir la una solución que contiene células, filtrada, aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 1:11 (v/v) con solución de dextrano 40. En ciertas modalidades, si el número de células es menor de aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitros previo a la etapa (a), la filtración es opcional. En una modalidad más específica, las células en la etapa (b) son criopreservadas aproximadamente a 10 ± 3 x 106 células por mililitro. En una ¦ modalidad más específica, las células en la etapa (b) se criopreservan en una solución que comprende de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 10% de dextrano 40 y HSA. En ciertas modalidades, dicha dilución en la etapa (b) no es más de aproximadamente 15.x 106 células por mililitro.
En otra modalidad, la composición farmacéutica se hace mediante un método que comprende: (a) suspender células placentarias , por ejemplo, células madre placentarias o células mult ipotentes placentarias, en una solución de dextrano 40 al 5.5% que comprende 10% de HSA para formar una solución que contiene células; (b) filtrar la solución que contiene células a través de un filtro de 70 µ?; (c) diluir la solución que contiene células con una solución que comprende 5.5% de dextrano 40, 10% de HSA, y 5% de DMSO aproximadamente de 1 a 50 x 106, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, ó 1 a 10 x 106 células por mililitro; (d) criopreservar las células; (c) descongelar las células; y (f) diluir la solución que contiene células 1:1 a 1:11 (v/v) con 105% de dextrano 40. En ciertas modalidades, dicha dilución en la etapa (c) no es más de aproximadamente 15 x 106 células por mililitro. En ciertas modalidades, dicha dilución en la etapa (c) no es más de aproximadamente 10 ± 3 x 106 células/mL. En ciertas modalidades, dicha dilución en la etapa (c) no es más de aproximadamente 7.5 x 106 células/mL.
En otra modalidad, la composición que comprende células se hace mediante un método que comprende: (a) centrifugar una pluralidad de células para recolectar las células; (b) re-suspender las células en 5.5% de dextrano 40; (c) centrifugar las células para recolectar las células; (d) re-suspender las células en una solución de dextrano 40 al 5.5% que comprende 10% de HSA; (e) filtrar a través de un filtro de 70 µ?; (f) diluir las células en 5.5% de dextrano 40, 10% de HSA, y 5% de DMSO de aproximadamente 1 a 50 x 106, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, ó 1 a 10 x 105 células por mililitro; (g) criopreservar las células; (h) descongelar las células; e (i) diluir las células 1:1 a 1:11 (v/v) con 105% de dextrano 40. En ciertas modalidades, dicha dilución en la etapa (f) no es más de aproximadamente 15 x 106 células por mililitro. En ciertas modalidades, dicha dilución en la etapa (f) no es más de aproximadamente 10 ± 3 x 106 células/mL. En ciertas modalidades, dicha dilución en la etapa (f) no es más de aproximadamente 7.5 x 106 células/mL. En otras ciertas modalidades, si el número de célula es menor de aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitro, la filtración es opcional.
Las composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas que comprenden las células placentarias aisladas, descritas en la presente, pueden comprender cualquiera de las células placentarias aisladas descritas en la presente.
Pueden utilizarse otras formulaciones inyectables, adecuadas para la administración de productos celulares.
En una modalidad, la composición farmacéutica comprende células placentarias aisladas que son sustancialmente, o completamente, de origen no materno, es decir, tienen el genotipo fetal; por ejemplo, al menos aproximadamente 90%, 95%, 98%, 99% ó aproximadamente 100% de origen no materno. Por ejemplo, en una modalidad una composición farmacéutica comprende una población de células placentarias aisladas que son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+, y CD200+; CD200+ y OCT-4+ ; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos semejantes a embriones en una población de células placentarias que comprenden dicha población de células placentarias aisladas cuando dicha población de células placentarias se cultiva bajo condiciones que permitan la formación de un cuerpo semejante a un embrión, o OCT-4+ y facilita la formación de uno o más cuerpos semejantes a embriones en una población de células placentarias que comprende dicha población de células placentarias aisladas cuando dicha población de células placentarias se cultiva bajo condiciones que permitan la formación de un cuerpo semejante a un embrión; o una combinación de lo mencionando anteriormente, en donde al menos 70%, 80%, 90%, 95% ' ó 99% de dichas células placentarias aisladas no son de origen materno. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende una población de células placentarias aisladas que son CD10+, CD105+ y CD34"; CD10+, CD200+ y CD34"; CD10+, CD105+, CD200+, CD34" y al menos uno de CD90+ ó CD45~; CD10+, CD90+, CD105+, CD200+, CD34" y CD45" CD10+, CD90+, CD105+, CD200+, CD34" y CD45"; CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+, y CD200+; CD200+ y 0CT-4+; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilita la formación de uno o más cuerpos semejantes a embriones en una población de células placentarias que comprende dichas células placentarias aisladas cuando dicha población de células placentarias se cultiva bajo condiciones que permitan la formación de un cuerpo semejante a un embrión; 0CT-4+ y facilita la formación de uno o más cuerpos semejantes a embriones en una población de células placentarias que comprende dichas células placentarias aisladas cuando dicha población de células placentarias se cultiva bajo condiciones que permitan la formación de un cuerpo semejante a un embrión; o uno o más de CD117", CD133", KDR~, CD80", CD86", HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR~ y/o PDL1+; o una combinación de lo mencionando anteriormente, en donde al menos 70%, 80%, 90%, 95% ó 99% de dichas células placentarias aisladas no son de origen materno. En una modalidad especifica, la composición farmacéutica comprende adicionalmente una célula madre que no se obtiene de una placenta.
Las células placentarias aisladas en las composiciones, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas, provistas en la presente, puede comprender células placentarias derivadas de un solo donador, o de múltiples donadores. Las células placentarias aisladas se pueden igualar con HLA por completo en un receptor previsto, o no se igualan parcial o completamente con HLA. 5.9.3 Matrices que Comprenden Células Placentarias Aisladas Se proporcionan además en la presente composiciones que comprende matrices, hidrogeles, armazones, y similares que comprenden una célula madre placentaria, o una población de células placentarias aisladas. Tales composiciones se pueden utilizar en lugar de, o además de, células en suspensión liquida para el tratamiento de la interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC.
La células placentarias aisladas descritas en la presente se pueden sembrar en una matriz natural, por ejemplo, un biomaterial de placenta tal como un material de membrana amniótica. Tal material de membrana amniótica puede ser, por ejemplo, una membrana amniótica diseccionada directamente de una placenta mamifera; membrana amniótica fija o tratada con calor, membrana amniótica sustancialmente seca (es decir, <20% de H20) , membrana coriónica, membrana coriónica sustancialmente seca, membrana amniótica y coriónica sustancialmente secas, y similares. Los biomateriales de placenta preferidos en los cuales las células placentarias aisladas se pueden sembrar se describen en Hariri, Publicación de Solicitud Norteamericana No. 2004/0048796, la descripción de la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia .
Las células placentarias aisladas descritas en la presente se pueden suspender en una solución de hidrogel adecuada, por ejemplo, inyección. Los hidrogeles adecuados para tales composiciones incluyen péptidos auto-ensamblables , tales como RAD16. En una modalidad, se puede dejar endurecer una solución de hidrogel que comprende las células, para formar una matriz que tiene células dispersadas en la misma para implantación. Las células placentarias aisladas en tal matriz también se pueden cultivar de modo que las células se expandan mitóticamente antes de la implantación. El hidrogel es, por ejemplo, un polímero orgánico (natural o sintético) que se entrecruza a través de uniones covalentes, iónicas, o de hidrógeno para crear una estructura de retícula abierta, tridimensional, que atrapa moléculas de agua para formar un gel. Los materiales formadores de hidrogel incluyen polisacáridos tales como alginato y sales del mismo, péptidos, polifosfazinas, y poliacrilatos , los cuales se entrecruzan iónicamente, o polímeros de bloque tal como copolímeros de bloque de óxido de polietileno-polipropilenglicol que se entrecruzan mediante temperatura o pH, respectivamente. En algunas modalidades, el hidrogel o matriz es biodegradable .
En algunas modalidades, la .formulación comprende un gel polimerizable in situ {ver, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2002/0022676, la descripción de la cual se incorpora en su totalidad e la presente como referencia; Anseth et al., J. Control Reléase, 78(1-3) : 199-209 (2002); Wang et al., Biomaterials, 24 (22) : 3969-80 (2003) .
En algunas modalidades, los polímeros son al menos parcialmente solubles en soluciones acuosas, tales como agua, soluciones salinas amortiguadas, o soluciones acuosas de alcohol, que tienen grupos laterales cargados, o una sal iónica monovalente de la misma. Los ejemplos de polímeros que tienen grupos laterales de ácido que se pueden hacer reaccionar con cationes son poli ( fosfacenos ) , poli (ácidos acrílicos) , poli (ácidos metacrílieos ) , copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, poli (acetato de vinilo) , y polímeros sulfonados, tales como poliestireno sulfonado. También se pueden utilizar copolímeros que tienen grupos laterales de ácido formados mediante la reacción de ácido acrílico o metacrílico y monómeros o polímeros de éter de , vinilo. Los ejemplos de grupos ácidos son grupos de ácido carboxílico, grupos de ácido sulfónico, grupos de alcohol halogenado (preferiblemente fluorados) , grupos OH fenólicos, y grupos OH ácidos .
Las células placentarias aisladas descritas aproximadamente o co-cultivos de las mismas se pueden sembrar en una estructura o armazón tridimensional e implantarse in vivo. Tal estructura se puede implantar en combinación con cualquiera de uno o más factores de crecimiento, células, fármacos u otros componentes que, por ejemplo, estimulan la formación de tejidos.
Los ejemplos de armazones que se pueden utilizar incluyen esteras no tejidas, espumas porosas, o péptidos auto-ensamblables . Las esteras no tejidas se pueden formar utilizando fibras comprendidas de un copolimero absorbióle sintético de ácidos glicólico y láctico (por ejemplo, PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Somerville, N.J.) . Las espumas, compuestas de, por ejemplo, copolimero de ???(e-caprolactona) / poli (ácido glicólico) (PGA/PLA), formado mediante procesos tales como secado en frío, o liofilización, ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,355,699), también se pueden utilizar como armazones.
En otra modalidad, se pueden sembrar células placentarias aisladas en, o en contacto con, un fieltro, que se puede utilizar, por ejemplo, compuesto de una hebra de multifilamentos hecha de un material bioabsorbible tal como copolimeros o combinaciones de PGA, PLA, PCL, ó ácido hialurónico .
Las células placentarias aisladas proporcionadas en la presente, en otra modalidad, se puede sembrar en armazones de espuma que pueden ser estructuras compuestas. Tales armazones de espuma se pueden moldear en una forma útil, de tal manera que una porción de una estructura especifica en el cuerpo a repararse, reemplazarse o aumentarse. En algunas modalidades, la estructura se trata, por ejemplo, con ácido acético 0.1M seguido por incubación en polilisina, PBS, y/o colágeno, previo a la inoculación de las células con el fin de mejorar la adhesión celular. Las superficies externas de una matriz pueden modificarse para mejorar la adhesión o crecimiento de células y diferenciación de tejido, tal como recubrimiento con plasma la matriz, o además de uno o más proteínas (por ejemplo, colágenos, fibras elásticas, fibras reticulares) , glicocoproteínas, glicosaminoglicanos (por ejemplo, sulfato de heparina, condroitin-4-sulfato, condroitin-6-sulfato, sulfato de dermatán, sulfato de queratina, etc.), una matriz celular, y/u otros materiales tales como, pero no limitados a, gelatina, alginatos, agar, agarosa, y gomas vegetales, y similares .
En algunas modalidades, el armazón comprende, o se trata con, materiales que no se vuelvan trombogénicos . Estos tratamientos y materiales también pueden promover y sostener el crecimiento endotelial, migración, y deposición de matriz extracelular . Los ejemplos de estos materiales y tratamientos incluyen pero no están limitados a materiales naturales tales como proteínas de membrana basal tal como laminina y colágeno Tipo IV, materiales sintéticos tales como EPTFE, y silicones de poliuretanurea segmentados, tales como PURSPAN™ (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif ) . El armazón también puede comprender agentes anti-trombóticos tales como heparina; los armazones también se pueden tratar para alterar la carga superficial (por ejemplo, recubrimiento con plasma) antes de sembrarse con células placentarias aisladas.
En una modalidad, las células placentarias aisladas se siembran en, o se ponen en contacto con, un armazón adecuado en aproximadamente 0.5 x 106 hasta aproximadamente 8 x 106 células/mL . 5.10 LÍNEAS DE CÉLULAS PLACENTARIAS INMORTALIZADAS Las células placentarias de mamífero se pueden inmortalizar condicionalmente mediante transfección con cualquier vector adecuado que contiene un gen promotor del crecimiento, es decir, un gen que codifica una proteína que, bajo condiciones apropiadas, promueve el crecimiento de la célula transíectada, de tal manera que la producción y/o actividad de la proteína promotora del crecimiento es regulable por un factor externo. En una modalidad preferida el gen promotor del crecimiento es un oncogén tal como, pero no limitado a v-myc, N-myc, c-myc, p53, antígeno T grande SV40, antígeno T grande de polioma, adenovirus Ela ó proteína E7 del virus de papiloma humano.
La regulación externa de la proteína promotora del crecimiento se puede lograr colocando el gen promotor de crecimiento bajo el control de un promotor externamente regulable, por ejemplo, un promotor a partir del cual se puede controlar la actividad, por ejemplo, modificando la temperatura de las células transfectadas o la composición del medio en contacto con las células. En una modalidad, se puede emplear un sistema de expresión genética controlado con tetraciclina (tet) (ver Gossen et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 89:5547-5551, 1992; Hoshimaru et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:1518-1523, 1996) . En la ausencia de tet, un transactivador controlado con tet (tTA) dentro de este vector activa fuertemente la transcripción de phaw*~l, un promotor mínimo del citomegalovirus humano fusionado con secuencias operadoras de tet. El tTA es una proteína de fusión del represor (tetR) del operón de resistencia a tet derivado del transposón 10 de Escherichia coli y el dominio ácido de VP16 del virus de herpes simple. Concentraciones bajas, no tóxicas, de tet (por ejemplo, 0.01-1.0 pg/mL) casi anula completamente la transactivación mediante tTA.
En una modalidad, el vector contiene además un gen que codifica un marcador seleccionable, por ejemplo, una proteína que confiere resistencia al fármaco. El gen de resistencia a la neomicina bacteriana (neo") es un marcador tal que se puede emplear dentro de los presentes métodos. Las células que llevan neo" pueden seleccionarse por medios conocidos para aquellos expertos en la técnica, tal como la adición de, por ejemplo, 100-200 pg/mL de G418 al medio de crecimiento.
La transfección se puede lograr mediante cualquiera de una variedad de medios conocidos para aquellos expertos en la técnica, que incluyen, pero no están limitados a, infección retrovirica. En general, puede transfectarse un cultivo de células mediante incubación con una mezcla de medio acondicionado recolectado de la linea celular productora para el vector y suplementos N2 que contienen DMEM/F12. Por ejemplo, un cultivo de células placentarias preparado como se describe anteriormente pueden infectarse después, por ejemplo, cinco días in vitro mediante incubación durante aproximadamente 20 horas en un volumen de medio acondicionado y dos volúmenes de suplementos N2 que contienen DMEM/F12. Las células transfectadas que llevan un marcador seleccionable pueden seleccionarse entonces como se describe anteriormente.
Después de la transfección, los cultivos - se pasan en una superficie que permite la proliferación, por ejemplo, permite duplicar al menos 30% de las células en un periodo de 24 horas. Preferiblemente, el substrato es un substrato de poliornitina/laminina, que consiste de un plástico del cultivo de tejido recubierto con poliornitina (10 pg/mL) , un substrato de polilisina/laminina o una superficie tratada con fibronectina . Los cultivos se alimentan entonces cada 3-4 días con medio de crecimiento, el cual puede o no puede suplementarse con uno o más factores mejoradores de la proliferación. Los factores mejoradores de la proliferación pueden agregarse al medio de crecimiento cuando los cultivos son menos de 50% confluentes.
Las lineas de células placentarias inmortalizadas condicionalmente se pueden pasar utilizando técnicas estándar, tales como mediante tripsinización, cuando son 80-95% confluentes. Hasta aproximadamente la vigésima pasada, es, en algunas modalidades, benéfica para mantener la selección (por ejemplo, mediante la adición de G418 para células que contienen un gen con resistencia a la neomicina) . Las células también pueden congelarse en nitrógeno liquido para almacenamiento a largo plazo.
Las lineas de células clónales se pueden aislar de una linea de células placentarias humanas, inmortalizadas condicionalmente, preparadas como se describe anteriormente. En general, tales lineas de células clónales pueden aislarse utilizando técnicas estándar, tal como mediante dilución limite o utilizando anillos de clonación, y expandirse. Las lineas de células clónales generalmente se pueden alimentar y pasarse como se describe anteriormente.
Las lineas de células placentarias humanas, inmortalizadas condicionalmente, que pueden ser, aunque no necesariamente clónales, generalmente pueden inducirse para diferenciarse suprimiendo la producción y/o actividad de la proteina promotora del crecimiento bajo condiciones de cultivo que facilitan la diferenciación. Por ejemplo, si el gen que codifica la proteina promotora del crecimiento está bajo el control de un promotor regulable externamente, las condiciones, por ejemplo, temperatura o composición del medio, pueden modificarse para suprimir la transcripción del gen promotor del crecimiento. Para el sistema de expresión genética controlado con tetraciclina discutido anteriormente, la diferenciación se puede lograr mediante la adición de tetraciclina para suprimir la transcripción del gen promotor del crecimiento. En general, es suficiente 1 g/mL de tetraciclina durante 4-5 días para iniciar la diferenciación. Para promover la diferenciación adicional, pueden incluirse agentes adicionales en el medio de crecimiento. 5.11 EQUIPOS O KITS En otro aspecto, se proporcionan en la presente kits, adecuados para el tratamiento de un individuo que tiene una interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del SNC, por ejemplo, un individuo que ha tenido una apoplejía, que comprende, en un contenedor separado del contenido restante del kit, células multipotentes placentarias adherentes al plástico del cultivo de tejido, por ejemplo, células madre placentarias o células multipotentes placentarias, y poblaciones aisladas de las mismas por ejemplo, las células descritas en la Sección 5.4.2, anterior, e instrucciones de para usarlas. Preferiblemente, las células madre, placentarias, se proporcionan en una solución farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, una solución adecuada para administración intracraneal o una solución adecuada para administración intravenosa. En ciertas modalidades, las células madre, placentarias, o células multipotentes placentarias son cualquiera de las células placentarias CD10+, CD34", CD105+ descritas en la presente, por ejemplo, células placentarias CD10+, CD34", CD105+, CD200+.
En ciertas modalidades, los kits comprenden uno o más componentes que faciliten el suministro de las células placentarias al individuo. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el kit comprende componentes que faciliten el suministro intracraneal de las células placentarias al individuo. En tales modalidades, el kit puede comprender, por ejemplo, jeringas y agujas adecuadas para el suministro de células al individuo; compuestos radioactivos o no radioactivos que permiten la visualización del tejido de SNC afectado (por ejemplo, cobalto 55), y similares. En tales modalidades, las células placentarias pueden estar contenidas en el kit en una bolsa, o en uno o más viales. En ciertas otras modalidades, el kit comprende componentes que faciliten un suministro intravenoso o intra-arterial de las células placentarias al individuo. En tales modalidades, las células placentarias pueden estar contenidas, por ejemplo, dentro de una frasco o bolsa (por ejemplo, una bolsa de sangre o bolsa similar capaz de contener hasta aproximadamente 1.5 L de solución que comprende las células), y el kit adicionalmente comprende mangueras y agujas adecuadas para el suministro de células al individuo.
Adicionalmente, el kit puede comprender uno o más compuestos que reduzcan el dolor o inflamación en el individuo (por ejemplo, un compuesto analgésico, esteroide, o no esteroide, o similares) . El kit también puede comprender un compuesto antibacteriano o antiviral (por ejemplo, uno o más antibióticos), un compuesto que reduce una respuesta inmune en el individuo (por ejemplo, ciclosporina A) , una anti-histamina (difenhidramina, loratadina, desloratadina, quetiapina, fexofenadina , cetirizina, prometazina, clorefeniramina, levocetirizina, cimetidina, famotidina, ranitidina, nizatidina, roxatidina, lafutidina) .
Adicionalmente, el kit puede comprender materiales desechables, por ejemplo, paños estériles, artículos de papel desechable, guantes, o similares, que facilitan la preparación del individuo para el suministro, o los cuales reducen la probabilidad de infección en el individuo como resultado de la administración de las células placentarias. 6. EJEMPLOS 6.1 EJEMPLO 1: TRATAMIENTO DE APOPLEJÍA UTILIZANDO CÉLULAS PLACENTARIAS ADMINISTRADAS INTRACRANEALMENTE Este Ejemplo demuestra la eficacia de la administración de células placentarias aisladas administradas, en el tratamiento de síntomas asociados con la interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC .
Las células placentarias adherentes al plástico del cultivo de tejido CD34", CD10+, CD105+, CD200+ se obtuvieron mediante digestión enzimática utilizando colagenasa I de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 2 mg/ml, por ejemplo, , durante 30 minutos, seguido por la digestión con tripsina a una concentración de aproximadamente 0.25%, durante 10 minutos a 37 °C. Se utilizaron ratas Sprague-Dawley como un modelo de apoplejía. Las ratas son un animal modelo establecido en el cual se estudian los efectos de la apoplejía y los efectos de varias terapias en los síntomas de apoplejía. Ver, por ejemplo, Chen et al., "A Model of Focal Ischemic Stroke in the Rat: Reproducible Extensive Cortical Infarction", Stroke 17 ( ) : 738-743 (1986) . Se utilizaron 10 animales por condición.
Cirugía para Apoplejía en MCA: Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron bajo condiciones ascépticas. Los animales se anestesiaron con equistesina (300 mg/kg, intraperitonealmente ) y se verificaron sus reflejos de dolor. La cirugía de oclusión de la MCA se realizó en los animales bajo anestesia profunda. La técnica de sutura de la MCA involucra la inserción de un filamento a través de la arteria carótida para llegar a la intersección del MCA, bloqueando por consiguiente el flujo sanguíneo de la artería carótida común, así como del círculo de illis. La artería carótida común, derecha, se identificó y aisló a través de una incisión cervical, media, ventral. El tamaño de sutura fue de 4-0, hecha de sutura no absorbible, estéril (Ethicon, Inc., Somerville NJ) , con el diámetro de la punta de la sutura estrechada a un tamaño de espesor o calibre de 24 a 26 utilizando adhesivo de caucho. Se insertaron aproximadamente 15 a 17 mM del filamento desde la intersección de las arterias carótidas externa e interna para bloquear la MCA. La MCA derecha se ocluyó durante una hora. En base a estudios publicados, una oclusión de una hora de la MCA da como resultado un infarto máximo. Ver Borlongan et al., Neurorep. 9 (16) : 3615-3621 (1998); Borlongan et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 52 ( 1 ): 225-229 (1995); Borlongan et al., Physiol. Behav. 58 (5) : 909-917 (1995). Se utilizó una almohadilla térmica y un termómetro rectal para mantener la temperatura corporal dentro de los límites normales. Para determinar una oclusión y reperfusión exitosas, se utilizó un láser Doppler. La sonda del láser Doppler se colocó en el extremo distal de la MCA para medir el flujo sanguíneo cerebral, durante y después de la oclusión.
Las células placentarias adherentes se administraron mediante inyección intracraneal (aproximadamente 400,000 células en 5 microlitros) directamente al sitio con isquemia 2 días post-isquémica . Se administró vehículo solo a las ratas (10% de dextrano y 5% de albúmina de suero humano), 4 x 105 células viables, 4 x 105 células viables en conjunción con 10 mg/kg de ciclosporina A, ó 4 x 105 células viables y ciclosporina A.
Los días 7 y 14 post-isquemia, se evaluó la asimetría motora inducida por la isquemia en los animales. La asimetría motora se evaluó utilizando la Prueba de Balanceo o Giro Elevado del Cuerpo (EBST) o Prueba Bederson. Ver Borlongan & Sanberg, J. Neurosci 15 ( 7 ) : 5372-5378 (1995) . En la EBST, el animal se levantó tomándolo por su cola, y se registró la frecuencia y dirección del balanceo o giro. Las ratas se colocaron en un caja Plexiglass y se dejaron habituarse durante aproximadamente 2 minutos. Las ratas se sostuvieron aproximadamente a 1 pulgada desde la base de la cola, de tal manera que la nariz de las ratas quedará aproximadamente a 1 pulgada desde una superficie. Las ratas se sostuvieron en un eje vertical, o posición neutral, definida como un giro de no más de 10° de la cabeza hacia la derecha o izquierda. Un giro se registró siempre que la rata movió su cabeza del eje vertical a la derecha o izquierda; se cuantificaron los giros derecho o giros izquierdos cuando la cabeza del animal se movió 10° o más desde el eje vertical derecho o izquierdo, respectivamente. Cuando la rata redobló sus esfuerzos hacia un lado particular, solamente se registró un solo giro. Después de un giro, el animal se colocó de nuevo en la caja Plexiglass y se dejo mover libremente durante 30 segundos previo al reanálisis. Estos pasos se repitieron 20 veces para cada animal (10 animales por condición) .
El número total de giros se contó, como fue el número de giros derechos e izquierdos. El comportamiento de balanceo se consideró influido cuando el número de giros igualó o excedió el 70%. Los resultados se analizaron utilizando un análisis de dos vías de varianza (ANOVA) , y se llevaron a cabo pruebas post-hoc utilizando la prueba Tukey HSD (diferencia honestamente significativamente) .
La reparación inducida con células placentarias de déficits neurológicos en ratas también se evaluó utilizando la Prueba Neurológica Bederson, que mide labores sensoriomotoras . Ver Bederson et al., Stroke 17:472-6 (1986); Altumbabic, Stroke 29:1917-22 (1998) .
Para la Prueba Bederson, se obtuvo una puntuación neurológica de cada rata utilizando 4 pruebas que incluyen: (a) observación de movimientos en circuios, isolaterales , espontáneos, calificada desde 0 (no hay movimientos en círculos) a 3 (movimientos en círculos); (b) retracción de la extremidad posterior contralateral , que mide la capacidad del animal para reemplazar la extremidad posterior después de que la misma se desplaza lateralmente 2 a 3 cm, calificada de 0 (reemplazo o cambio inmediato) a 3 (reemplazo después de minutos o no realiza el reemplazo) ; (c) capacidad de caminar en una barra, calificada de O para una rata que rápidamente atraviesa una barra de 2.4 cm de ancho, 80 cm de largo, a 3 para una rata incapaz de permanecer en la barra 10 segundos; y (d) agarre bilateral de la pata delantera, que mide la capacidad de sostenerse en un varilla de acero de 2 mm de diámetro, calificada como 0 para una rata con un comportamiento de agarre normal de la pata delantera a 3 para una rata incapaz de agarrarse con las patas delanteras. Las puntuaciones de todas las 4 pruebas, realizadas durante un periodo de aproximadamente 15 minutos los dias 7 14 de la evaluación, se agregaron para dar una puntuación de déficit neurológico de 0 a 12, con puntuaciones más bajas que indican ratas más normales neurológicamente.
Resul tados El Día 0, inmediatamente previo a la inducción de la isquemia, todos los animales exhibieron un comportamiento de balanceo o giro aproximadamente normal (imparcial) (FIG. 1, Linea base) . El día 2 post-isquemia, el día de la administración de células placentarias, todos los animales exhibieron una predisposición a la isquemia inducida de casi 100% en el comportamiento de balanceo (FIG. 1), como se esperaba. El Día 7 y Día 14, los animales que recibieron células placentarias viables mostraron una mejora significativa, demostrando una predisposición de balanceo o giro aproximadamente 65% y 60%, respectivamente (FIG. 1, Día 7 y Día 14) . Los animales que recibieron células placentarias no viables y ciclosporina A, o vehículo solo, no mostraron una mejora estadísticamente significativa.
Las ratas evaluadas el Día 0, previo a la inducción de la isquemia, todas fueron neurológicamente normales, y se les dio una puntuación de déficit de cero (FIG. 2, Línea base) en la prueba Bederson. El día 2 después de la inducción de isquemia, el día se administraron células placentarias aisladas, las ratas que recibieron solamente vehículo mostraron una puntuación agregada de déficit medio de aproximadamente 2.5 (FIG. 2, Día 2) . Los Días 7 y 14, las ratas que recibieron células placentarias mostraron una mejora estadísticamente significativa en la puntuación del déficit neurológico, una mejora de una puntuación de aproximadamente 2.5 a una puntuación de aproximadamente 1.7 y 1.1, respectivamente. Al igual que con el EBST, las ratas que recibieron solamente vehículo o células placentarias no viables y ciclosporina A no mostraron una mejora estadísticamente significativa en la puntuación de déficit neurológico.
En conclusión, se demostró con dos pruebas de déficit neurológico que una administración de 4 x 105 células placentarias humanas dos días después de la inducción de la isquemia en un modelo animal aceptado de isquemia, mejora significativamente la función neurológica en los animales modelo. La administración de ciclosporina A, para suprimir cualquier reacción inmune del hospedero en las células placentarias, no parece ser necesaria para una mejora neurológica debido a las células placentarias. 6.2 EJEMPLO 2: TRATAMIENTO DE APOPLEJÍA UTILIZANDO CÉLULAS PLACENTARIAS AISLADAS ADMINISTRADAS INTRAVENOSAMENTE Este Ejemplo demuestra la eficacia de administración de células placentarias aisladas, administradas intravenosamente, en el tratamiento de síntomas asociados con la interrupción de flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o SNC, por ejemplo, de lesión hipóxica o lesión anóxica. Por ejemplo, los resultados presentados aquí indican que la administración intravenosa de células placentarias promueve la recuperación del comportamiento dependiente de la dosis en pruebas tanto motoras como neurológicas en animales con administración de células placentarias humanas, viables, en comparación con los animales que reciben células placentarias, humanas, no viables .
Se obtuvieron células placentarias, adherentes al plástico del cultivo de tejido CD34", CD10+, CD105+, CD200+ mediante digestión enzimática, que se describe en otra parte en la presente. Se utilizaron ratas Sprague-Dawley como un modelo de apoplejía, y se realizó una oclusión de la arteria media como se describe en el Ejemplo 1, anterior. El día 2 post-oclusión, se administraron 4 x 105, 1 x 106, 4 x 106, u 8 x 106 células placentarias a las ratas participantes en aproximadamente 5 L de vehículo (10% de dextrano y 5% de albúmina de suero humano) , o células no viables en el vehículo como un control. Las ratas se evaluaron el día 0 antes de la cirugía, y los días 2, 14, 28, 56 y 84 post-cirugía mediante la Prueba de Balanceo del Cuerpo Levantado (EBST) , como se describe en el Ejemplo 1, anterior. Se realizó una Prueba Bederson modificado, en el cual las ratas participantes se evaluaron para (1) retracción de las patas delanteras, que mide la capacidad del animal para reemplazar la pata delantera después de que se desplazó 2 a 3 cm, calificada de (reemplazo inmediato) a 3 (reemplazo después de varios segundos o no hay reemplazo) ; (2) capacidad de caminar en una barra, calificada con 0 para una rata que atraviesa rápidamente una barra de 2.4 cm de ancho, 80 cm de largo, a 3 para una rata incapaz de permanecer en la barra durante 10 segundos; y (3) agarre bilateral de las patas delanteras, que mide la capacidad de sostenerse en un varilla de acero de 2 mm de diámetro, calificada como 0 para una rata con un comportamiento de agarre normal de la pata delantera a 3 para una rata incapaz de agarrarse con las patas delanteras. Las puntuaciones de todas las 4 pruebas, que se hicieron durante un período de aproximadamente 15 minutos los días 7 14 en cada día de evaluación, se agregaron para dar una puntuación de déficit neurológico medio (puntuación máxima posible, 9 puntos divididos en 3 pruebas = 3) . Los resultados de las pruebas EBST y Bederson se evaluaron mediante un análisis de dosis vías de varianza (ANOVA) , análisis Tukey HSD como se describe en el Ejemplo 1, anterior.
Se dio muerte a las ratas el Día 84 para la necropsia y evaluación de la implantación y diferenciación de las células placentarias . Brevemente, se examinaron tejidos seccionados, colocadas en criostato, de 20 µ?a en amplificación de 40X y se digitalizaron utilizando un programa de computadora Image Tools para PC. Las secciones del cerebro se codificaron en seco. Las secciones de tejidos se procesaron utilizando un método ABC estándar. La implantación celular y los índices de diferenciación de supervivencia del injerto de células madre derivadas de placenta humana, se evaluó utilizando el anticuerpo HuNu específico humano, que no se inter-reacciona con marcadores de superficie celular de roedoras u otra proteínas de roedores. Para detectar la expresión de fenotipo neural en injertos de células, se utilizó análisis inmunohistoquímica utilizando el marcador neuronal MAP2. Las secciones adicionales del cerebro se procesaron para GFAP y 04 para revelar la expresión fenotípica neuroglial y oligodendroglial de células trasplantadas.
El trasplante intravenoso de células derivadas de placenta humana no requiere inmunosupresión .
Todos los animales incluidos en este estudio exhibieron comportamientos normales en la línea base, y alcanzaron el criterio de inducción exitosa de isquemia cerebral el día 2 post-apoplej ia previo al trasplante. Comenzando en el primer punto de tiempo de prueba post-trasplante el día 7 post-apoplejia, las pruebas conductuales revelaron una mejora significativa dependiente de la dosis en las funciones locomotoras y neurológicas en animales con apoplejía que recibieron células derivadas de placenta -humana, viables, en comparación con animales con apoplejía que recibieron células derivadas de placenta humana, no viables. Con el transcurso del tiempo hasta 84 días post-apoplej ía, hubo una tendencia cada vez mayor en una mejora adicional en ambas labores en animales con apoplejía que recibieron células derivadas de placenta humana, viables. No hubo exacerbación detectable de déficits conductuales inducidos por apoplejía en cualquiera de los animales de los animales trasplantados, incluyendo los que recibieron células no viables. Durante el período de maduración del trasplante, hubo una tendencia general de recuperación espontánea del comportamiento en las que recibieron células no viables, aunque esta mejora funcional no mediada por el trasplante, no específica, no logra importancia estadística en comparación con la cirugía pre-trasplante (es decir, el día 2 post-apoplej ía) .
Los animales con apoplejía que recibieron la dosis alta de 8 millones de células viables claramente exhibieron la mejora más robusta tanto en una tarea locomotora y neurológica como en el periodo post-trasplante . Sin embargo, con el paso del tiempo los animales con apoplejía que recibieron dosis más bajas de células viables también exhibieron una profunda atenuación de déficits de comportamiento que generalmente son comparables con la dosis alta de 8 millones de células viables .
Las ratas evaluadas el Día 0, previo a la inducción de la isquemia, todas fueron neurológicamente normales, y se les dio una puntuación de déficit de cero (FIG. 3, Línea Base. El día 2 post-isquemia, el día de la administración de células madre, placentarias , todos los animales exhibieron una predisposición inducida por la isquemia casi del 100% en el comportamiento de balanceo (FIG. 3), como se esperaba. Los animales que recibieron células placentarias aisladas, aisladas, mostraron una mejora significativa dependiente de la dosis en el EBST para cada uno de los Días 7, 14, 28, 56 y 84, en comparación con el control, y adicionalmente mostraron una mejora significativa (p < 0.01) entre dosis, con la excepción de 4 x 106 vs . 8 x 106 células placentarias aisladas para los días, y 4 x 105 x 1 x 106 células placentarias aisladas el Día 7 (p=0.0454) . Ver la FIG. 3. Los animales que recibieron células placentarias aisladas no viables no mostraron una mejora estadísticamente significativa en comparación con los controles .
Para la prueba Bederson, las ratas evaluadas el Día 0, inmediatamente previo a la inducción de la isquemia, todos los animales fueron neurológicamente normales, y se les dio una puntuación de déficit de cero (FIG. 4, Linea base) . El día 2 después de la inducción de la isquemia, el día que se administraron las células placentarias aisladas, las ratas que recibieron solamente células no viables mostraron una puntuación de déficit medio agregado de aproximadamente 2.5 -3.0 (FIG. 2, Día 2) . Los Días 7, 14, 28, 56 y 84, las ratas que recibieron células placentarias aisladas mostraron una mejora estadísticamente significativa en la puntuación del déficit neurológico en comparación con las ratas que recibieron células no viables (p<0.01 en cada caso) . La mejora fue de manera adicional significativamente dependiente de la dosis el Día 7 (4 x 105 vs. 8 x 106 y 1 x 106 vs . 8 x 106) , y los Días 14 y 28 (4 x 105 vs . 4 x 106 y 4 x 105 vs . 8 x 106) , respectivamente, al igual que con la EBST, las ratas que recibieron solamente vehículo o células placentarias aisladas no viables y ciclosporina A no mostraron une mejora estadísticamente significativa en la puntuación del déficit neurológico.
Por consiguiente, la administración intravenosa de células placentarias aisladas promueve la recuperación del comportamiento dependiente de la dosis en pruebas tanto motoras como neurológicas . Fue evidente una mejora funcional ya en los 7 días post-administración, con una tendencia cada vez mayor de mejor recuperación durante el periodo posttrasplante de 3 meses. No se observaron efectos secundarios adversos, aparentes, en el comportamiento en cualquiera de las ratas participantes.
Por consiguiente, los resultados presentados aquí demostraron la seguridad y eficacia de la administración intravenosa de células placentarias aisladas para el tratamiento de síntomas asociados con interrupciones del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro. Por ejemplo, ninguno de los animales trasplantados mostró alguna exacerbación de anormalidades del comportamiento inducidas por la apoplejía. En comparación con animales que reciben células derivadas de placenta humana, no viables, aquéllos que recibieron células viables exhibieron una mejora significativa en los déficits de comportamiento inducidos por la apoplejía y rescate significativo de células hospederas en la penumbra isquémica. Además, no se detectaron tumores o tejido ectópico en ninguno de los animales trasplantados. 6.3 EJEMPLO 3: TRATAMIENTO DE APOPLEJÍA UTILIZANDO CÉLULAS PLACENTARIAS A TRAVÉS DE RUTA INTRAVENOSA - EVALUACIÓN CON OTRAS PRUEBAS NEUROLOGICAS Este Ejemplo demuestra la efectividad del tratamiento de la apoplejía utilizando células madre, placentarias, que se evalúa por medio de pruebas neurológicas aparte de la prueba de balanceo en elevación y prueba Bederson. 6.3.1 Pruebas Neurológicas Se realizó cirugía de oclusión de la arteria cerebral media en ratas Wistar como sigue. Las ratas macho Wistar (270-300 g, 2-3 m) se sometieron a 2 h de oclusión de la arteria cerebral media (MCAo) inducida haciendo avanzar un filamento de nylon quirúrgico en la arteria carótida interna (ICA) para bloquear el origen de MCA. Brevemente, las ratas se anestesiaron con 2% de isoflurano en una jarra para pre-anestesia, y espontáneamente respiraron con isoflurano al 1.5% en mezcla de ?20:?2 2:1 utilizando una máscara facial conectada y regulada con un Vaporizador FLUOTEC 3 (Fraser Harlake, Orchard Park, Nueva York) . La temperatura rectal se mantuvo a 37 °C en todo el procedimiento quirúrgico utilizando un sistema de calentamiento con agua regulado con retroalimentación (una almohadilla recirculante y módulo K y se monitorea a través de un termopar tipo T intra-rectal ) . Se hizo una incisión de 1 cm en el centro del cuello, y la arteria carótida común, derecha (CCA) , artería carótida externa (ECA) , y arteria carótida interna (ICA9 se expusieron bajo un microscopio de operación (Cari Zeiss, Inc., Thornwood, NY) . El CCA e ICA se sujetaron con pinzas utilizando grapas micro-quirúrgicas (Codman & Shurtleff, Inc., Randolf, MA) . Una sutura de nylon 4-0 con su punta redondeada calentándola cerca de una flama, se insertó en la ECA a través de una pequeña punción. Las grapas micro-quirúrgicas se removieron. La longitud de la sutura de nylon, determinada de acuerdo al peso del animal, se hizo avanzar suavemente desde la ECA hacia el lumen de la ICA hasta que la sutura bloqueó el origen de la MCA. El filamento de nylon se retuvo dentro de la ICA durante 2 horas (h) y se cerró la incisión del cuello. Los animales se movieron de su jaula para despertarlos. Después de 2 h de MCAo, los animales se re-anestesiaron con isoflurano, y la restauración del flujo sanguíneo se realizó mediante la extracción del filamento hasta que la punta salió del lumen de la ECA. La incisión se cerró entonces.
Las células placentarias adherentes al plástico del cultivo de tejido, adherentes CD10+, CD34", CD105+, CD200+ se administraron mediante vía intravenosa (inyección en la vena de la cola) . Los animales sometidos a MCAo se distribuyeron al azar en uno de cinco grupos: (1) fibroblastos dérmicos humanos como control celular, (2) control con dextrano, dosis de células placentarias (3) 1 x 106, (4) 4 x 106 y (5) 8 x 106 células, administrados el día 1 después de la MCAo. Las pruebas de comportamiento (prueba adhesiva, prueba de falta de saque y mNSS) se realizaron el día 1 después de la MCAo antes del tratamiento del estudio (línea base), y los días 7, 14, 21, 28, 42, y 56 después de la MCAo. Los efectos de dosis-respuesta de células placentarias en la recuperación funcional se midieron de las tres pruebas de comportamiento descritas posteriormente.
La puntuación de severidad neurológica modificada (mNSS Tabla 1) : se califica en una escala de 0 a 18 (puntuación normal 0; puntuación de déficit máximo 18, Tabla 1). Se otorgó un punto de puntuación para la incapacidad de realizar la prueba o para la falta de un reflejo analizado; por consiguiente, la puntuación más alta, la más severa es la lesión .
Tabla 1: Criterios de calificación de la puntuación de la severidad neurológica modificada.
Prueba Motora Puntos Máximos Levantar a la rata por la cola 3 1 Flexión de la extremidad delantera 1 Flexión de la extremidad posterior 1 Movió la cabeza más de 10o hacia el eje vertical dentro de 30 segundos Caminar en el piso: 3 0 Caminar normal 1 Incapacidad de caminar recto 2 Moverse en círculos hacia el lado paralizado 3 Caerse hacia el lado paralizado Pruebas sensoriales: 2 1 Prueba de ubicación (prueba visual y táctil) 1 Prueba proprioceptiva (sensación profunda, empuje la pata contra el borde la tabla para estimular los músculos de las extremidades Pruebas de equilibrio en barra: 6 0 Equilibrios con postura fija 1 Agarres al lado de la barra 2 Abrazamientos a la barra y un miembro caen de la barra 3 Abrazamientos a la barra y dos miembros caen de la barra, o giros en la barra (>60 seg) 4 Intentos por equilibrarse en la barra sin caerse (> 40 seg.) 5 Intentos por equilibrarse en la barra sin caerse (> 40 seg.) 6 Falla: Ningún intento por equilibrarse o colgarse sobre la barra (< 20 seg.) Prueba Motora Puntos Máximos Reflejos y movimientos anormales: 4 1 Reflejo del pabellón auditivo (una sacudida de cabeza al tocar el meato auditivo) 1 Reflejo de la córnea (un parpadeo al tocar ligeramente la córnea con un algodón) 1 Reflejo de sobresalto (una respuesta motora a un breve ruido de palmadas) 1 Espasmos, mioclonia, miodistonia Puntos máximos: 18 Prueba somatosensorial con remoción de adhesivo: Todas las ratas se familiarizaron con el ambiente de la prueba. En una prueba inicial, dos pequeñas piezas de puntos de papel con adhesivo al dorso (de igual tamaño, 113.1 mm2 para la prueba dentro de un mes; 56.6 mm2 para la prueba después de un mes), se utilizaron como estímulos táctiles bilaterales que ocupan la región distal-radial en la muñeca de cada extremidad delantera. Las ratas se regresaron entonces a sus jaulas. Se registró la hora de remover cada estímulo de las patas delanteras, se registro de 5 intentos por día.
Prueba de falta de saque: Los animales se colocaron en un piso de rejilla elevada (45 cm por 30 cm) , 2.5 cm más alto que un piso de base sólida, con aberturas de 2.5 cm X 2.5 cm de diámetro. Los animales tendieron a moverse sobre la rejilla con sus patas colocadas en el marco de alambre. Cuando los animales colocaron de modo incorrecto una pata, la extremidad delantera cae a través de una de las aberturas en la rejilla.
Cuando una pata cae o se resbala entre los alambres, esto se registró como una falta de saque. Se contabilizaron un total de 100 pasos (movimiento de cada pata delantera) , y se registró el número total de falas de saque para la extremidad delantera izquierda, y se determinó el porcentaje de falta de saque de la pata izquierda para el total de pasos.
Resul tados : Puntuación de severidad neurologica modificada (mNSS) : El grupo de animales tratados con 4.0 x 106 células demostró una mejora en la mNSS en comparación con el control de vehículo los días 7-56 (p<0.05) (FIG. 5) .
Prueba somatosensorial de remoción del adhesivo: El grupo de animales tratados con 4.0 x 106 mostró una mejora (p<0.05) en la prueba somatosensorial de remoción del adhesivo en comparación con el control con vehículo o control celular el día 14 post-tratamiento y la mejora se sostuvo en todo el período de estudio (FIG. 6) . Adicionalmente, los animales tratados con 8.0 x 106 células mostró una mejora (p<0.05) los días 42 y 56 post-tratamiento.
Prueba de falta de saque: El grupo de animales tratado con 4.0 x 106 células demostró una mejora en comparación con el control de vehículo o control celular el día 7 posttratamiento y la mejoró persistió en todo el periodo de estudio (FIG. 7) .
En base a los estudios anteriores, se determinó que el tratamiento de la apoplejía dependiente de la dosis mejora el resultado final después de la apoplejía en ratas en comparación con control con fibroblastos y control con dextrano. La dosis óptima del tratamiento con células madre, placentarias , en las ratas utilizadas en este estudio, se determinó que es de 4 x 106. 6.3.2 Proliferación y Estudios de Plasticidad Sináptica Para evaluar si la administración de células madre, placentarias, facilita la neovascularización, se inyectó 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU; 50 mg/kg en solución salina fisiológica de NaOH 0.007 N, Sigma, St . Louis MO) ) en animales experimentales comenzando 24 horas después de la MCAo y diariamente durante 14 días. Los animales del experimental se sacrificaron y se obtuvieron secciones de tejido cerebral del área ocluida y se tiñeron con BrDU. Los animales del experimental se re-anestesiaron con cetamina (80 mg/kg) y xilazina (13 mg/kg de inyección i.p.) y la profundad de la anestesia se monitoreó mediante el reflujo de pellizco en la pata. Después de la anestesia, se extrajeron 2 mL de sangre del corazón. El suero se preparó y almacenó a -20°C. Luego los animales se sometieron a punción cardíaca con perfusión con solución salina (aproximadamente 200 mi para las ratas) , y luego perfusión con paraformaldehído al 4% (aproximadamente 50 mi para rata) utilizando la Simón Varistaltic Pump.
El cerebro se corta y se fija en paraformaldehído al 4% durante 48 h-72 h, seguido por incrustación en parafina para inmunotinción . Utilizando una matriz cerebral de la rata (Activational Systems Inc. arren, MI) , cada prosencénfalo se cortó en bloques coronarios de 2 mm de grueso para un total de 7 bloques por animal. Se utilizaron secciones del cerebro obtenidas a partir de la dosis óptima (4 x 106 células) de tratamiento con células madre placentarias , control con Dextrano-MCAo y grupos control FBC para inmunotinción. Se obtuvo un bloque de parafina estándar del centro de la lesión (vértice -1 mM a +1 mM) . Se cortó una serie de secciones de 6 µp? de grosor del bloque. Se utilizaron tres secciones del cerebro coronal para cada tinción inmunohistoquimica . El anticuerpo contra BrdU, un marcador de células proliferantes (1:100, Boehringer Mannheim, Indianapolis , IN) , Von illebrand Factor (vWF, 1:400; Dako, Carpenteria, CA) , doublecortina (DCX, un marcador de neuroblastos migrantes) (C-18, anticuerpo IgG policlonal de cabra, dilución 1:200, Santa Cruz) y sinaptofisina (Boehringer Mannheim Biochemica, Anticuerpo monoclonal, clón SY 38, 1:40), se realizó inmunotinción. Las secciones inmuno-teñidas con BrdU se digitalizaron utilizando una mira de 40X (Olympus BX40) a través de un sistema de análisis de imágenes por computadora MCID (Imaging Research, St . Catharines, Canadá) . Se contabilizaron las células positivas al BrDU dentro de un total de 10 recipientes con paredes delgadas y alargadas en el área marginal de la lesión isquémica en cada sección.
Para la semi-cuantificación de la inmuno-reactividad con sinaptofisina, la sección coronal inmuno-teñida y ocho campos de visión desde la penumbra isquémica (corteza y cuerpo estriado) en cada sección, se digitalizaron bajo una mira de 20x. El área positiva se midió. Los datos se presentaron como un porcentaje del área positiva.
Resul tados: Se encontró que una administración de 4 x 106 células madre, placentarias , se incrementó significativamente cuando se midió incrementando la proliferación de células endoteliales y la densidad vascular en el cerebro con isquemia en comparación con un control con FBC y control con Dextrano (Figura 8). Además, la administración de 4 x 106 células madre, placentarias, incrementa significativamente la plasticidad sináptica que se mide por una expresión incrementada de sinaptofisina en el cerebro con isquemia en comparación con el control FBC. 6.4. EJEMPLO 4: TRATAMIENTO DE APOPLEJÍA UTILIZANDO CÉLULAS MULTIPOTENTES PLACENTARIAS Un individuo, de 62 años de edad, que presenta hemiplejía en el lado izquierdo; debilidad muscular en el lado izquierdo de la cara; y entumecimiento y reducción en la sensibilidad en el lado izquierdo del cuerpo. Los síntomas desarrollados en el transcurso de dos horas previo a la presentación. Se hace un diagnóstico de apoplejía. Se administran 100-200 mililitros de células placenterías adherentes al plástico del cultivo celular, mult ipotentes , al individuo, dentro de una hora del diagnóstico, a una concentración de aproximadamente 1 x 107 células por mililitro. Las células placentarias multipotentes administradas se evalúa que son > 90% de CD34", CD10+, CD105+ y CD200+. Se evalúa la mejora discernible en la fuerza muscular o entumecimiento en el lado izquierdo del individuo 12 horas, 24 horas, 48 horas, 4 días y 7 días después de la administración. Se hace opcionalmente una segunda administración . 6.5 EJEMPLO 5: FORMULACIÓN DE CÉLULAS PLACENTARIAS PARA EL TRATAMIENTO DE APOPLEJÍA, LESIÓN HIPÓXICA O LESIÓN ANÓXICA Se filtran células multipotentes placentarias CD34", CD10+, CD105+ y CD200+ para remover agregados, y se colocan 10 ± 3 x 106 células por mililitro en una solución que comprende 5.5% (p/v) de dextrano 40, 10% (p/v) de albúmina de suero humano, y 5% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO) en agua. El número total de células en la formulación es de aproximadamente 4-7 x 109 células.
Las células formuladas así se dividen en alícuotas de 20 mL en contenedor de congelación de 50 mL y se congelan. Las células se colocan en alícuotas y se diluyen para usar con 10% de dextrano 40 en cloruro de sodio en una bolsa de infusión de 100 mL.
Equivalentes : Las composiciones y métodos dados a conocer en la presente no se limitan en su alcance por las modalidades especificas descritas en la presente. De hecho, serán evidentes varias modificaciones de las composiciones y métodos además de las descritas, para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y las figuras acompañantes. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexadas.
En la presente se citan varias publicaciones, patentes y solicitudes de patente, las descripciones de cada de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad.

Claims (61)

REIVINDICACIONES
1. - Un método para tratar a un individuo que tiene una interrupción del flujo de sangre en o alrededor del cerebro, caracterizado porque comprende administrar a dicho individuo una cantidad efectiva de células placentarias , humanas, aisladas, que son: CD10-, CD34", y CD105+; CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+, y CD200+; CD200+ y 0CT-4+; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos semejantes a embriones en una población de células placentarias que comprende dichas células madre dicha célula madre cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de un cuerpo semejante a un embrión; o 0CT-4+ y facilita la formación de uno o más cuerpos semejantes a embriones en una población de células placentarias que comprende la célula madre cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de un cuerpo semejante a un embrión; o cualquier combinación de los mismos.
2. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células CD10+, CD34", CD105+ son adicionalmente CD200+.
3. - El método de la reivindicación 2, caracterizado porque dichas células CD10+ , CD34", CD105+, CD200+ son adicionalmente CD45" ó CD90+.
4. - El método de la reivindicación 3, caracterizado porque dichas células CD10+, CD34", CD105+, CD200+ son adicionalmente CD45" y CD90+.
5. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha cantidad terapéuticamente efectiva es un número de dichas células que da como resultado la eliminación de, una mejora detectable en, una disminución de la severidad de, o retardo del avance de uno o más síntomas de interrupción en el flujo de sangre en o alrededor del cerebro, exhibidos por dicho individuo.
6. - El método de la reivindicación 5, caracterizado porque dicho síntoma es hemiplejía o hemiparesis.
7. - El método de la reivindicación 5, caracterizado porque . dicho síntoma es debilidad muscular de la cara; entumecimiento; reducción en la sensibilidad; olfato, gusto, audición, o visión alterada; pérdida de olfato, gusto, audición, o visión; caída del párpado (ptosis) ; debilidad detectable de un de músculo ocular; reflejo nauseoso disminuido; capacidad disminuida de deglutir; reactividad de la pupila disminuida a la luz; sensibilidad disminuida de la cara; equilibrio 'disminuido; oscilación del glóbulo ocular; ritmo respiratorio alterado; ritmo cardiaco alterado; debilidad en el músculo esternocleidomastoideo con capacidad disminuida o incapacidad de voltear la cabeza hacia un lado; debilidad en la lengua; afasia (incapacidad de hablar o entender lenguaje) ; apraxia (movimientos voluntarios alterados) ; un defecto en el campo visual; un déficit en la memoria; heminegligencia o negligencia hemiespacial (déficit de atención al espacio en el lado del campo visual opuesto a la lesión) ; pensamiento desorganizado; confusión; desarrollo de actitudes hipersexuales ; anosognosia (negación persistente de la existencia de una deficiencia) ; dificultad al caminar; coordinación alterada de movimientos; vértigo, desequilibrio; pérdida de la conciencia; dolor de cabeza; y/o vómito, en donde dicho síntoma es causado por la interrupción en el flujo de sangre en o alrededor del cerebro.
8. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células placentarias , adherentes, humanas, aisladas, son CD10+, CD34", CD105+, CD200+.
9. - El método de la reivindicación 8, caracterizado porque dichas células placentarias, adherentes, humanas, aisladas, son CD45" y CD90+.
10. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células placentarias, adherentes, humanas, aisladas, son CD200+ y HLA-G+.
11. - El método de la reivindicación 10, caracterizado porque dichas células CD200+, HLA-G+ son adicionalmente CD34", CD38", CD45", CD73+ y CD105+.
12.- El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células placentarias , adherentes, humanas, aisladas, son CD73+, CD105+ y HLA-G+.
13.- El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dichas células CD73+, CD105+ y HLA-G+ son adicionalmente CD34", CD45", 0CT-4+ y CD200+.
14. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células CD73+, CD105+, y CD200+ son adicionalmente CD34", CD38", CD45", y HLA-G+.
15. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células CD200+, 0CT-4+ son adicionalmente CD34", CD38", CD45", CD73+ , CD105+ y HLA-G+.
16. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células CD73+ y CD105+, son adicionalmente OCT- 4+ , CD34", CD38" y CD45".
17. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células OCT-4+, son adicionalmente CD73+, CD105+, CD200+, CD34", CD38" y CD45".
18.- El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células placentarias, adherentes, humanas, aisladas, están contenidas dentro de una población de células, al menos 80% de las cuales son células placentarias, adherentes, humanas, aisladas.
19.- El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células placentarias , adherentes, humanas, aisladas, están contenidas dentro de una población de células, al menos 90% de las cuales son células placentarias, adherentes, humanas, aisladas.
20.- Un método para tratar a un individuo que tiene una interrupción en el flujo de sangre en o alrededor del cerebro, caracterizado porque comprende administrar a dicho individuo una cantidad efectiva de células placentarias, adherentes, humanas, aisladas, en donde dichas células expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más alto que una células por mililitro mesenquimatosa derivada de médula ósea, en donde dicho uno o más genes son uno o más de ACTG2, ADARB1, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, C0L4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, EL0VL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, ILLA, IL6, IL18, RT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAKl, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1 , SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8 , TCF21, TGFB2, VTN, y ZC3H12A, en donde dicha célula madre derivada de médula ósea se ha sometido a una serie de pasadas en el cultivo que es equivalente al número de pasadas al que se ha sometido de dicha célula madre placentaria.
21.- El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dicha interrupción del flujo de sangre es apoplejía.
22. - El método de la reivindicación 21, caracterizado porque dicha apoplejía es apoplejía isquémica.
23. - El método de la reivindicación 21, caracterizado porque dicha apoplejía es apoplejía hemorrágica.
24.- El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dicha interrupción es un hematoma.
25.- El método de la reivindicación 24, caracterizado porque dicho hematoma es un hematoma dural, un hematoma subdural, o un hematoma subaracnoideo .
26.- El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dicha interrupción es un vasospasmo.
27.- El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dichas células placentarias aisladas se administran mediante inyección de bolos.
28.- El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dichas células placentarias aisladas se administran mediante infusión intravenosa.
29. - El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dichas células placentarias aisladas se administran intracranealmente .
30. - El método de la reivindicación 29, caracterizado porque dichas células placentarias aisladas se administran dentro de un área de isquemia.
31. - El método de la reivindicación 29, caracterizado porque dichas células placentarias aisladas se administran a un área periférica a una isquemia.
32. - El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dichas células placentarias aisladas se administran intraperitonea.lmente, intramuscularmente , intradérmicamente o intraocularmente .
33. - El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dichas células placentarias, adherentes, aisladas, se administran mediante el implante quirúrgico de una composición que comprende dichas células placentarias adherentes, humanas, aisladas.
34. - El método de la reivindicación 33, caracterizado porque dicha composición es una matriz o armazón.
35. - El método de la reivindicación 34, caracterizado porque dicha matriz o armazón es un hidrogel.
36.- El método de la reivindicación 34, caracterizado porque dicha matriz o armazón es un tejido sin células.
37.- El método de la reivindicación 34, caracterizado porque dicha matriz o armazón es una composición biodegradable, sintética.
38.- El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dichas células placentarias aisladas se administran una vez a dicho individuo.
39.- El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dichas células placentarias aisladas se administran a dicho individuo una pluralidad de veces.
40.- El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 104 y 1 x 105 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo.
41.- El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 105 y 1 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo.
42. - El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 106 y 1 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo.
43. - El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 107 y 1 x 108 células placentarias aisladas por kilogramo de dicho individuo.
44. - El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dicha administración comprende administrar intravenosamente entre aproximadamente 5 x 107 y 3 x 109 células placentarias aisladas.
45. - El método de la reivindicación 44, caracterizado porque dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 9 x 108 células placentarias aisladas.
46. - El método de la reivindicación 44, caracterizado porque dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 1.8 x 109 células placentarias aisladas.
47. - El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dicha administración comprende administrar intracranealmente entre aproximadamente 5 x 107 y 3 x 108 células placentarias aisladas.
48. - El método de la reivindicación 47, caracterizado porque dicha administración comprende administrar entre aproximadamente 9 x 107 células placentarias aisladas.
49.- El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque comprende administrar un segundo agente terapéutico a dicho individuo.
50.- El método de la reivindicación 49, caracterizado porque dicho segundo agente terapéutico es un agente neuroprotector .
51.- El método de la reivindicación 50, caracterizado porque dicho segundo agente terapéutico es NXY-059 (derivado disulfonilo de fenilbutilnitrona ) .
52. - El método de la reivindicación 49, caracterizado porque dicho segundo agente terapéutico es un agente trombolitico .
53. - El método de la reivindicación 52, caracterizado porque dicho agente trombolitico es un activador de plasminógeno de tejido (tPA) .
54. - El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 21, caracterizado porque dichas células placentarias aisladas se administran a dicho individuo dentro de las 48 horas del desarrollo de uno o más síntomas de la interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro en dicho individuo.
55. - El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 21, caracterizado porque dichas células placentarias aisladas se administran a dicho individuo dentro de las 24 horas del desarrollo de uno o más síntomas de la interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro en dicho individuo.
56. - El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 21, caracterizado porque dichas células placentarias aisladas se administran a dicho individuo dentro de las 12 horas del desarrollo de uno o más síntomas de la interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro en dicho individuo.
57. - El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 21, caracterizado porque dichas células placentarias aisladas se administran a dicho individuo dentro de las 3 horas del desarrollo de uno o más síntomas de la interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro en dicho individuo.
58. - El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 21, caracterizado porque dichas células placentarias aisladas se criopreservan antes de dicha administración.
59. - El método de la reivindicación 1 ó reivindicación 20, caracterizado porque dichas células placentarias adherentes, humanas, aisladas, se obtienen de un banco de células madre, placentarias.
60. - El método de la reivindicación 21, caracterizado porque dichas células placentarias , adherentes, humanas, aisladas, expresan dicho uno o más genes al cultivarse durante aproximadamente 3 hasta aproximadamente 35 duplicaciones de población en un medio que comprende 60% de DMEM-LG y 40% de MCDB-201; suero de ternera fetal al 2%; insulina-transferrina-selenio (ITS) lx; albúmina de suero de ácido linoleico-suero bovino (LA-BSA) lx; dexametasona 10~9 ; 2-fosfato de ácido ascórbico 10~4 ; factor de crecimiento epidérmico 10 ng/mL; y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL .
61. - El método de la reivindicación 21, caracterizado porque dichas células placentarias, adherentes, humanas, aisladas, expresan dicho uno o más genes al cultivarse durante aproximadamente 3 hasta aproximadamente 35 duplicaciones de población en un medio que comprende 60% de DMEM-LG (Gibco) y 40% de MCDB-201 (Sigma); suero de ternera fetal al 2% (Hyclone Labs.); insulina-transferrina-selenio (ITS) lx; albúmina de suero de ácido linoleico-suero bovino (LA-BSA) lx; dexametasona 10"9 M (Sigma) ; 2-fosfato de ácido ascórbico 10"4 M (Sigma) ; factor de crecimiento epidérmico 10 ng/mL (R&D Systems); y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL (R&D Systems) . RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan aquí los métodos para el tratamiento de la apoplejía que comprenden administrar a una víctima de apoplejía células madre placentarias, poblaciones de células que comprenden células madre placentarias, y/o composiciones que comprenden células madre placentarias.
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