DE69831957T3

DE69831957T3 - Herzmuskelregenerierung unter verwendung mesenchymaler stammzellen

Info

Publication number: DE69831957T3
Application number: DE69831957T
Authority: DE
Inventors: F. Mark PITTENGER; L. Stephen GORDON; Morgan Alastair MACKAY
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1997-07-14
Filing date: 1998-07-14
Publication date: 2009-07-23
Anticipated expiration: 2018-07-15
Also published as: ES2251773T3; JP4562816B2; DE69831957T2; DK1007631T4; DK1007631T3; EP1007631B1; AU8401498A; ATE307195T1; EP1007631A4; CA2296704C; JP2002511094A; US6387369B1; DE69831957D1; CA2296704A1; ES2251773T5; WO1999003973A1; EP1007631A1; EP1007631B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der provisorischen US-Anmeldung Serien-Nr. 60/052,910, eingereicht am 14. Juli 1997. Diese Erfindung betrifft das Ersetzen und Regenerieren von Herzgewebe und -Muskel.
Dieses Jahr werden über 300.000 Amerikaner an kongestivem Herzversagen sterben. Die Möglichkeit, einen geschwächten Herzmuskel zu kräftigen, wäre ein großer Fortschritt bei der Behandlung von Kardiomyopathie und Herzversagen. Trotz Fortschritten bei der medizinischen Therapie des Herzversagens bleibt die Mortalität aufgrund dieser Erkrankung hoch, wobei die meisten Patienten innerhalb von ein bis fünf Jahren nach der Diagnose sterben.
Ein verbreitetes Herzleiden bei der alternden Bevölkerung ist eine fehlerhafte Funktion der Herzklappen, insbesondere der Aortenklappe. Mechanische Ersatzklappen werden in breitem Umfang verwendet, zwingen den Patienten jedoch, dauerhaft blutverdünnende Mittel zu nehmen. Herzklappen von Toten und Xenotransplantate (vom Schwein) werden ebenfalls häufig verwendet, um das eigene Gewebe eines Patienten zu ersetzen. Die Klappen werden einer Gefriertrocknung oder einer chemischen Quervernetzung, z. B. unter Verwendung von Glutaraldehyd, unterzogen, um die Collagenfasern zu stabilisieren und die Antigenität und den proteolytischen Abbau zu verringern. Jedoch bleiben diese Klappen azellulär und versagen oft nach einigen Jahren aufgrund von mechanischer Beanspruchung oder Verkalkung. Eine Ersatzklappe, die aus einem biokompatiblen Material stammt, das ein Einwachsen der geeigneten Wirtszellen und eine mit der Zeit erfolgende Gewebeerneuerung erlaubt, wäre bevorzugt.
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind Zellen, die dazu in der Lage sind, zu mehr als einem Typ der mesenchymalen Zelllabstammungslinie auszudifferenzieren. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind bei Vogel- und Säugerspezies, einschließlich Maus, Ratte, Kaninchen, Hund und Mensch, identifiziert und kultiviert worden (siehe Caplan, 1991, Caplan et al. 1993 und US-Patent Nr. 5,486,359 ). Die Isolierung, Reinigung und Kulturvermehrung von hMSCs wird hier im Detail beschrieben.
Zusammenfassung der Erfindung
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden mesenchymale Stammzellen (MSCs) verwendet, um gestreifte Herzmuskeln, die durch Krankheit oder durch Degeneration geschädigt wurden, zu regenerieren oder zu reparieren. Die MSCs differenzieren zu Herzmuskelzellen und integrieren sich in das gesunde Gewebe des Empfängers, um die Funktion der toten oder geschädigten Zellen zu ersetzen und dabei den Herzmuskel als Ganzes zu regenerieren. Der Herzmuskel besitzt normalerweise kein regeneratives Potential. Die MSCs werden z. B. bei der Herzmuskelregeneration für eine Reihe von Hauptindikationen verwendet: (i) ischämische Herzimplantationen, (ii) Therapie von Patienten mit kongestivem Herzversagen, (iii) eine Verhinderung weiterer Erkrankung bei Patienten, die sich einer koronararteriellen Bypass-Übertragung unterziehen, (iv) Regeneration von leitendem Gewebe, (v) Regeneration glatter Gefäßmuskeln und (vi) Regeneration von Herzklappen. Somit werden die MSCs also auch verwendet, um eine Integration in das Gewebe einer Austauschherzklappe zu vollziehen, die in einen Empfänger eingesetzt werden soll. Die MSCs, bevorzugt autologer Herkunft, besiedeln das Herzklappengewebe wieder und ermöglichen eine korrekte Funktion der Herzklappe.
Die MSC-Herzmuskeltherapie basiert beispielsweise auf der folgenden Abfolge: Ernten von MSC enthaltendem Gewebe, Isolierung/Vermehrung von MSCs, Einsetzen in ein geschädigtes Herz (mit oder ohne eine stabilisierende Matrix und biochemische Manipulation) und in situ erfolgende Ausbildung von Myokardgewebe. Dieser Ansatz unterscheidet sich von der traditionellen Gewebeerzeugung, bei dem die Gewebe ex vivo herangezüchtet und dann in ihrer endgültig differenzierten Form implantiert werden. Biologische, bioelektrische und/oder biomechanische Trigger aus der Wirtsumgebung können ausreichend sein, oder können unter bestimmten Umständen als Teil des Therapieschemas erhöht werden, um ein vollständig integriertes und funktionales Gewebe zu etablieren.
Dementsprechend stellt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung von mesenchymalen Stammzellen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Produktion von Cardiomyozyten bei einem Individuum, das diese benötigt, bereit. Die mesenchymalen Stammzellen, die verwendet werden, können eine homogene Zusammensetzung darstellen oder können eine gemischte Zellpopulation sein, die im Hinblick auf MSCs angereichert ist. Homogene humane mesenchymale Stammzellzusammensetzungen werden erhalten, indem man anhaftende Mark- oder Periostzellen kultiviert; die mesenchymalen Stammzellen können durch spezifische Zelloberflächenmarker, die mit singulären monoklonalen Antikörpern erkannt werden, identifiziert werden. Ein Verfahren zum Erhalt einer Zellpopulation, die im Hinblick auf mesenchymale Stammzellen angereichert ist, wird z. B. im US-Patent Nr. 5,486,359 beschrieben.
Die Verabreichung der Zellen kann über eine Vielzahl von Prozeduren auf das Herz ausgerichtet werden. Eine lokal gebundene Verabreichung ist bevorzugt. Die mesenchymalen Stammzellen können aus einem Spektrum von Quellen stammen, einschließlich, in der Reihenfolge der Präferenz: autolog, allogen oder xenogen. Es gibt zu diesem Aspekt mehrere Ausführungsformen, einschließlich der folgenden.
Bei einer Ausführungsform dieses Aspekts sollen die MSCs als Zellsuspension in einem pharmazeutisch verträglichen flüssigen Medium zur Injektion verabreicht werden. Die Injektion kann bei dieser Ausführungsform lokal sein, d. h. direkt in den geschädigten Teil des Myokards oder systemisch erfolgen. Hier ist wiederum eine lokal gebundene Verabreichung bevorzugt.
Bei einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts sollen die MSCs in einem biokompatiblen Medium verabreicht werden, das in situ, an der Stelle des Myokardschadens, eine halbfeste oder feste Matrix darstellt oder ausbildet. Beispielsweise kann die Matrix (i) eine injizierbare Flüssigkeit sein, die an der Stelle des geschädigten Myokards ein halbfestes Gel aufbaut (oder hierzu polymerisiert), wie etwa Collagen und seine Derivate, Poly-Milchsäure oder Polyglykolsäure, oder (ii) eine oder mehr Schichten einer flexiblen, festen Matrix, die in ihrer endgültigen Form, wie etwa als imprägnierte faserige Matrizes, implantiert werden. Die Matrix kann z. B. Gelfoam (Upjohn, Kalamazoo, MI) sein. Die Matrix hält die MSCs an der Stelle der Verletzung in Position, d. h. erfüllt damit die Funktion eines „Gerüsts". Dies wiederum erhöht die Gelegenheit für die applizierten MSCs, zu proliferieren, sich zu differenzieren und schließlich zu voll entwickelten Cardiomyozyten zu werden. Als Ergebnis ihrer Positionierung in der Umgebung des Herzmuskels integrieren sie sich dann in den umgebenden Herzmuskel des Empfängers. Diese Ereignisse erfolgen ebenso bei der oben genannten flüssig injizierbaren Ausführungsform, jedoch kann diese Ausführungsform bevorzugt sein, wenn eine durchgreifendere Therapie angezeigt ist.
Bei einer anderen Ausführungsform dieses Aspekts sind die MSCs genetisch modifiziert oder gentechnisch behandelt, um Gene zu enthalten, die Proteine exprimieren, die wichtig sind für die Differenzierung und/oder Aufrechterhaltung der gestreiften Muskelzellen. Beispiele hierfür beinhalten Wachstumsfaktoren (TGF-β, IGF-1, FGF), myogene Faktoren (myoD, Myogenin, Myf5, MRF), Transkriptionsfaktoren (GATA-4), Zytokine (Cardiotrophin-1), Mitglieder der Neuregulin-Familie (Neuregulin 1, 2 und 3) und Homeoboxgene (Csx, tinman, NKx-Familie). Ebenfalls in Betracht gezogen werden Gene, die für Faktoren codieren, die die Angiogenese und erneute Gefäßversorgung stimulieren (z. B. vaskulären Endothelwachstumsfaktor (VEGF)). Sämtliche der bekannten Verfahren zur Einführung von DNA sind geeignet, jedoch sind Elektroporation, retrovirale Vektoren und Vektoren auf Basis von Adeno-assoziiertem Virus (AAV) derzeit bevorzugt.
Somit stellt diese Erfindung im Zusammenhang mit der Ausführungsform des obigen Aspekts unter Verwendung genetisch hergestellter MSCs auch neue, genetisch hergestellte mesenchymale Stammzellen und Gewebezusammensetzungen bereit, um die oben genannten Indikationen zu behandeln. Die Zusammensetzungen können genetisch modifizierte MSCs und unmodifizierte MSCs in verschiedenen Mengenverhältnissen enthalten, um die Menge an exprimiertem exogenem Material im Verhältnis zur Gesamtzahl der zu beeinflussenden MSCs zu regulieren.
Die Erfindung betrifft auch das Potential von MSCs unter Verwendung von in vitro-Verfahren partiell zu dem Cardiomyozyten-Phänotyp auszudifferenzieren. Diese Technik kann unter bestimmten Umständen den Umschlag der MSCs in die Herzabstammungslinie optimieren, indem man diese entsprechend im voraus geneigt macht. Dies besitzt auch das Potential, die Zeit zu verkürzen, die für eine vollständige Differenzierung benötigt wird, sobald die Zellen verabreicht worden sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A–1C zeigen einen Herzmuskel, in den in vitro unter Verwendung einer feinen Nadel mit Farbstoff markierte MSCs injiziert wurden. Es wurden die lipophilen Farbstoffe PKH26 (Sigma Chemical) oder CM-DiI (Molecular Probes) verwendet, um die MSCs vor der Einführung in die Tiere zu markieren. Diese Farbstoffe bleiben sichtbar, wenn die Gewebestelle 1–2 Monate später geerntet wird. Wir haben auch gezeigt, dass solche Farbstoffe bei in vitro-Assays nicht störend in die Differenzierung der MSCs eingreifen. 1A zeigt ein unter geringer Vergrößerung erstelltes Bild eines Rattenherzens, in das mit Farbstoff markierte Zellen injiziert wurden und bei dem später ein T-Einschnitt an dieser Stelle vorgenommen wurde. Die 1A und 1B zeigen die markierten MSCs in der Ventrikelwand bei Betrachtung von der Außenoberfläche. 1C zeigt einen Querschnitt der Ventrikelwand, und dass die Zellen in den äußeren 1–2 mm des 3 mm dicken Herzmuskels vorhanden sind.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die richtigen Umgebungs-Stimuli wandeln MSCs in Cardiomyozyten um. Die Differenzierung der mesenchymalen Stammzellen zur Herz-Abstammungslinie wird durch Faktoren kontrolliert, die sich in der Umgebung des Herzens befinden. Die Exposition von MSCs gegenüber einer stimulierten Herzumgebung steuert diese Zellen in Richtung Herzdifferenzierung, wie durch die Expression spezifischer Herzmuskelabstammungsmarker detektiert wurde. örtliche chemische, elektrische und mechanische Umwelteinflüsse verändern pluripotente MSCs und transformieren Zellen, die in das Herz implantiert wurden derart, dass sie die Herzabstammungslinie einschlagen.
Frühzeitig in der Embryonalentwicklung, nach dem Epithel-Mesenchym-Übergang, wandert das präsumtive Herzmesenchym von der linken und rechten Seite des Körpers zu der ventralen Mittellinie. Hier induziert die Interaktion mit anderen Zelltypen eine anhaltende Cardiogenese. Die in vitro-Umwandlung von MSCs zu Cardiomyozyten wird getestet durch Co-Kultur oder Fusion mit murinen embryonalen Stammzellen oder Cardiomyozyten, durch Behandlung der MSCs mit Herzzelllysaten, Inkubation mit bestimmten löslichen Wachstumsfaktoren oder durch die Exposition der MSCs gegenüber mechanischen Stimuli und elektrischer Stimulation.
Es wird hier eine Reihe spezifischer Behandlungen offenbart, die auf MSCs anwendbar sind, um eine Expression von herzspezifischen Genen zu induzieren. Diese Bedingungen sind wirkungsvoll bei MSCs aus Ratte, Hund und Mensch. Die Behandlungen von MSCs beinhalten (1) das Co-Kultivieren von MSCs mit fetalen, neonatalen und adulten Rattenherzzellen, (2) die Verwendung chemischer Fusionsvermittler (z. B. Polyethylenglykol oder Sendaivirus) zur Erzeugung von Heterokaryons von MSCs mit fetalen, neonatalen und adulten Cardiomyozyten, (3) das Inkubieren von MSCs mit Extrakten aus Säugerherzen, einschließlich der extrazellulären Matrix und verwandter Moleküle, die sich im Herzgewebe befinden, (4) die Behandlung von MSCs mit Wachstumsfaktoren und Differenzierungsmitteln, (5) die mechanische und/oder elektrische Stimulation der MSCs und (6) die mechanische und/oder elektrische Kopplung von MSCs mit Cardiomyozyten. MSCs, die sich in Richtung Cardiomyozyten fortentwickeln, exprimieren zunächst Proteine, die sich in fetalem Herzgewebe finden, und schreiten dann zu adulten Formen fort. Die Detektion der Expression von Cardiomyozyten-spezifischen Proteinen wird unter Verwendung von Antikörpern erreicht, z. B. durch den monoklonalen Antikörper MF 20 (MF20) gegen die schwere Myosinkette, den monoklonalen Antikörper gegen die Calcium-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums (SERCA1) (mAb 10D1) oder gegen Gap Junctions unter Verwendung von Antikörpern gegen Connexin 43.
Eine Herzverletzung fördert Gewebeantworten, die die Myogenese unter Verwendung implantierter MSCs verstärken. Somit werden MSCs in die Infarktzone eingeführt, um das Ausmaß der Narbenbildung zu reduzieren und die Ventrikelfunktion zu erhöhen. Dadurch wird neuer Muskel in einem infarktgeschädigten Herzmuskelsegment gebildet. Die MSCs werden direkt in den Bereich des infarktgeschädigten Gewebes infiltriert. Die Integration und nachfolgende Differenzierung dieser Zellen wird charakterisiert, wie oben beschrieben. Der Zeitablauf der Intervention wird so gestaltet, das er das klinische Szenario nachahmt, bei dem Patienten mit akutem Myokardinfarkt zunächst medizinischer erster Hilfe, dem Erhalt einer Eingangstherapie, gefolgt von Stabilisierung und dann, wenn nötig, der Intervention mit einer Myokardaustauschtherapie, unterzogen werden.
Von den vier Herzkammern ist der linke Ventrikel primär dafür verantwortlich, das Blut unter Druck durch das körpereigene Blutkreislaufsystem zu pumpen. Er besitzt die dicksten Herzmuskelwände und ist die häufigste Stelle der Myokardverletzung, die aus kongestivem Herzversagen resultiert. Das Ausmaß des Fortgeschrittenseins oder der Schwere des kongestiven Herzversagens reicht von den Fällen, wo eine Herztransplantation angezeigt ist, sobald ein geeignetes Spenderorgan verfügbar wird, bis hin zu den Fällen, bei denen nur eine geringe oder keine dauerhafte Verletzung beobachtet wird, und bei denen die Behandlung vor allem prophylaktisch ist.
Die Schwere des resultierenden Myokardinfarkts, d. h. der Prozentanteil der Muskelmasse des linken Ventrikels, die involviert ist, kann von etwa 5 bis zu etwa 40 Prozent reichen. Dies repräsentiert betroffene Gewebebereiche, ob nun als eine zusammenhängende Ischämie oder als Summe kleinerer ischämischer Verletzungen mit horizontalen betroffenen Bereichen von etwa 2 cm² bis etwa 6 cm² und einer Dicke von 1–2 mm bis 1–1,5 cm. Der Schweregrad des Infarkts wird signifikant davon beeinflusst, welche(s) Gefäße) beteiligt ist/sind, und wie viel Zeit vergangen ist, bis eine Intervention durch Behandlung beginnt.
Die in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendeten mesenchymalen Stammzellen sind, in der Reihenfolge der Präferenz, autolog, allogen oder xenogen, und die Wahl kann in hohem Maße von der Dringlichkeit der Behandlungserfordernis abhängen. Ein Patient, bei dem eine eindeutig lebensbedrohende Situation gegeben ist, kann an einer Herz-Lungen-Maschine belassen werden, während eine hinreichende Anzahl autologer MSCs kultiviert wird, oder die anfängliche Behandlung kann unter Verwendung anderer als autologer MSCs bereitgestellt werden.
Die MSC-Therapie der Erfindung kann mittels mehrerer Verabreichungsrouten, einschließlich der folgenden, bereitgestellt werden. Zum ersten kann eine intrakardiale Muskelinjektion, die die Notwendigkeit einer offenen chirurgischen Prozedur vermeidet, verwendet werden, wenn sich die MSCs in einer injizierbaren Flüssigsuspensionspräparation befinden, oder, wenn sie sich in einem biokompatiblen Medium befinden, das in flüssiger Form injizierbar ist und an der Stelle des geschädigten Myokards halbfest wird. Es kann eine konventionelle Intrakardialspritze oder eine kontrollierbare arterioskopische Zufuhrvorrichtung verwendet werden, solange das Nadellumen oder die Bohrung von hinreichendem Durchmesser (z. B. 30 Eichmaß oder größer) ist, sodass Scherkräfte die MSCs nicht beschädigen werden. Die als injizierbare Flüssigsuspension vorliegenden MSC-Präparationen können auch intravenös verabreicht werden, entweder durch einen kontinuierlichen Tropf oder als Bolus. Bei offenen chirurgischen Prozeduren, die einen direkten physikalischen Zugang zum Herzen beinhalten, sind alle beschriebenen Formen der MSC-zuführenden Präparationen geeignete Optionen.
Ein repräsentatives Beispiel eines Dosisbereichs ist ein Volumen von etwa 20 bis etwa 50 μl der injizierbaren Suspension mit 10–40 × 10⁶ MSCs/ml. Die Konzentration der Zellen pro Volumeneinheit bleibt im wesentlich im selben Bereich, egal ob das Trägermedium nun flüssig oder fest ist. Die Menge an MSCs, die zugeführt wird, wird gewöhnlich größer sein, wenn eine feste „Pflaster"-artige Applikation während einer offenen Prozedur erfolgt, jedoch wird die nachfolgende Therapie durch Injektion so sein, wie oben beschrieben. Die Häufigkeit und Dauer der Therapie wird jedoch in Abhängigkeit vom Ausmaß (Prozentsatz) des beteiligten Gewebes variieren, wie bereits beschrieben (z. B. 5–40% der linken Ventrikelmasse).
Im Fall einer Gewebebeteiligung im Bereich von 5–10% ist es möglich, mit nur einer einzigen Verabreichung einer Million MSCs in 20–50 μl der Injektionspräparation zu behandeln. Das Injektionsmedium kann jede pharmazeutisch verträgliche isotonische Flüssigkeit sein. Beispiele hierfür beinhalten Phosphat-gepufferte Saline (PBS), Kulturmedien, wie etwa DMEM (bevorzugt serumfrei), physiologische Saline oder 5% Dextrose in Wasser (D5W).
Bei stärker ausgeprägten Fällen mit einem Schweregrad im Bereich von etwa 20% Gewebebeteiligung werden mehrfache Injektionen von 20–50 μl (10–40 × 10⁶ MSCs/ml) ins Auge gefasst. Die nachfolgende Therapie kann zusätzliche Dosierungen beinhalten.
In sehr ernsten Fällen, z. B. mit einem Schweregrad im Bereich von etwa 40% Gewebebeteiligung, können mehrfache gleichwertige Dosen und eine verlängerte Zeitspanne mit langfristig (bis zu mehreren Monaten) verabreichten Erhaltungsdosen zur Nachsorge zutreffend indiziert sein.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, jedoch nicht eingeschränkt.
Beispiel 1
Implantation von MSCs in den normalen Herzmuskel
Bei der Verwendung von MSCs ist es erstrebenswert, den Zell-Zell-Kontakt für die Konversion der MSCs zu der Muskelabstammungslinie in vivo aufrecht zu erhalten. Die oben identifizierten Umgebungssignale wirken in vivo mit mechanischen und elektrischen Signalen zusammen, um zur Herzdifferenzierung zu führen.
Primäre humane MSCs (hMSCs) werden durch direkte Injektion in Myokardgewebe thymusloser Ratten eingeführt. Die Integration der implantierten Zellen, ihre nachfolgende Differenzierung, die Ausbildung von Verbindungen zu den Herzzellen und ihr Langzeitüberleben werden durch Lichtmikroskopie, Histologie, konfokale Immunfluoreszenz-Mikroskopie, Elektronenmikroskopie und in situ-Hybridisierung charakterisiert.
Es wird ebenfalls überprüft, ob sich die humanen MSCs in geeigneter Weise in den Herzmuskel der thymuslosen Ratten (Stamm HSD:RH-RNU/RNU), denen die notwendigen Immunantworten zur Zerstörung vieler Fremdzellen fehlen, integrieren.
Es werden Ratten-MSCs in den Herzmuskel von Ratten transplantiert. Um die injizierten Zellen über mehrere Wochen zu analysieren und die Möglichkeit einer Abstoßung durch das Immunsystem zu minimieren, werden die MSCs aus Fisher 344-Ratten geerntet, demselben inzuchtstamm (identischer Genotyp) wie die beabsichtigten MSC-Empfänger.
Die MSCs können vor ihrer Einführung in den Empfänger auf eine Vielzahl von Weisen markiert werden. Dies macht es möglich, das Schicksal der MSCs zu verfolgen, wenn sie in den Wochen nach der MSC-Implantation proliferieren und differenzieren. Es werden mehrere Verfahren verwendet, um die injizierten Zellen positiv zu identifizieren: die Membranlipid-Farbstoffe PKH26 oder CM-DI I, sowie eine genetische Markierung mit Adeno-assoziiertem Virus (AAV) oder Retroviren, wie etwa dem murinen Moloney Leukämievirus, der Grünes Fluoreszenzprotein (GFP) oder Galactosidase exprimiert. Es wird außerdem PCR verwendet, um den Y-Chromosomenmarker von männlichen Zellen, die in weibliche Tiere implantiert wurden, zu detektieren. Die mit Farbstoff markierten Zellen werden problemlos detektiert und bieten das einfachste Verfahren, die injizierten Zellen direkt zu verfolgen. Dieses Verfahren ist bei Zeitspannen bis zu wenigstens 4 Wochen verlässlich. Am Tag der Einführung in die Empfängertiere werden die MSCs trypsinisiert und gemäß Herstellerempfehlung (Molecular Probes) mit CM-DI I markiert. Subkonfluente Monolayer-Kulturen von MSCs werden mit 5 mM CM-DI I in serumfreiem Medium für 20 Minuten inkubiert, trypsinisiert, zweimal in einem Überschuss an farbstofffreiem Medium gewaschen und für die Injektion verwendet.
Alternativ werden die MSCs vor den Injektionen genetisch markiert, so etwa unter Verwendung des AAV-GFP-Vektors. Diesem Vektor fehlt ein selektierbarer Marker, jedoch vermittelt er eine auf hohem Niveau stattfindende Expression der transduzierten Gene bei einer Vielzahl von postmitotischen Zelltypen und Stammzelltypen. Es wird rekombinantes AAV-GFP zu niedrigdichten Monolagern von MSCs in einem serumarmen Ansatz hinzugegeben. Nach einer vierstündigen Inkubation bei 37°C wird der Überstand entfernt und durch frisches Medium ersetzt. 96 Stunden nach der Transduktion werden die Zellen auf die Aktivität von grünem Fluoreszenzprotein (GFP) hin getestet. Typischerweise exprimieren 50% der Zellen das transduzierte Gen. Unselektierte MSCs einer klonalen Linie, isoliert durch limitierende Verdünnung, werden für die Injektion verwendet. Die Zellen werden nach der Trypsin-Behandlung gesammelt, gewaschen und in hohen Konzentrationen (10 bis 100 Millionen Zellen pro ml) für die Injektion verwendet.
Um zu testen, ob die hMSCs in der Herzumgebung zu Cardiomyozyten werden, wurden Farbstoff-markierte oder GFP-markierte humane MSCs in die Herzen zehn Wochen alter, thymusloser Ratten injiziert. Alle Prozeduren wurden unter streng sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Tiere wurden in ein Glasgefäß gesetzt, das einen mit Methoxyfluran-Anästhetikum getränkten Schwamm enthielt. Unter sterilen Bedingungen wurde eine anteriore Thorakotomie von 20 mm durchgeführt, und nach dem Sichtbarmachen des linken Ventrikels wurden 10 μl der Zellsuspension, enthaltend 10.000 bis 100.000 MSCs in serumfreiem Medium, mittels einer 30-Eichmaß-Spritze in die linke Ventrikelspitze injiziert. Die Prozedur wurde rasch mit endotrachealer intubation und mechanischer Beatmungsunterstützung durchgeführt. Der Einschnitt wurde mit Nahtmaterialien verschlossen. Eine kurze Zeitspanne nach dem Verschließen des Brustraums wurde die Atmungsunterstützung normalerweise nicht mehr benötigt. 1A zeigt ein niedrig vergrößertes Bild eines Rattenherzens, dem Farbstoffmarkierte Zellen injiziert worden waren und bei dem später ein T-Einschnitt an dieser Stelle durchgeführt wurde, um die injizierten Zellen in der Ventrikelwand zu zeigen. 1A ist ein großes Photo des eingeschnittenen Herzens. Die 1B und 1C zeigen die markierten MSCs in der Ventrikelwand. 1C zeigt, dass die Zellen in den äußeren 1–2 mm des 3 mm dicken Rattenherzmuskels vorhanden waren.
Beim Töten der Tiere wird das Herz entnommen, mittels Lichtmikroskopie auf Anwesenheit vaskulärer Thrombi oder Emboli überprüft, in Paraffin eingebettet und geschnitten. Es wird die Histologie der Serienschnitte überprüft, um das Schicksal der mit Farbstoff markierten Zellen zu bestimmen. Man testet die Schnitte dann auf immunhistochemische Marker des Herzmuskels in den Bereichen der eingeführten MSCs, um zu bestimmen, ob sich die MSCs des Donors in vivo zu Cardiomyozyten differenziert haben. Man führt die Implantationschirurgie bei Tieren aus, die nach 1, 2, 4 und 6 Wochen (4 Tiere zu jedem Zeitpunkt) getötet werden sollen; dabei werden die Herzen, die Implantate erhalten haben, histologisch und immunologisch analysiert.
Für die phänotypische Charakterisierung werden die Herzen entnommen und für die Histologie durch Immunfluoreszenzmikroskopie weiterverarbeitet. Die Differenzierung der MSCs wird bestimmt über die Immunfluoreszenzlokalisierung der schweren Kette des sarkomeren Myosins, SERCA1 und Phospholamban. Der sequenzspezifische Antikörper gegen das Gap Junction Protein Connexin 43 ist kommerziell erhältlich (Zymed) und detektiert Gap Junctions, wenn er bei Herzgewebe angewendet wird.
Es werden außerdem MSCs in Biomatrixmaterialien implantiert, um zu bestimmen, ob eine beschleunigte Transplantation, wie etwa mit Typ I Collagen, zu beobachten sein würde. Die MSCs werden in einem kleinen Volumen rasch mit der Matrix gemischt und in die Ventrikelwand injiziert. Die Biomatrizes werden bei Konzentrationen von 0,1 mg/ml oder darüber verwendet. Beispielsweise können die Biomatrizes bei Konzentrationen von 1 bis 3 mg/ml, enthaltend 10 bis 100 Millionen Zellen/ml, verwendet werden. Das Gewebe wird dann gemäß obiger Beschreibung nach Zeitspannen von 1, 2, 4 und 6 Wochen analysiert.
Beispiel 2
Regeneration von Herzklappen unter Verwendung von MSCs
Xenotransplantat- oder Homotransplantat-Herzklappen werden durch Gefriertrocknen, das zum Zelltod führt, azellulär gemacht, oder durch eine enzymatische Behandlung, gefolgt von einer Detergens-Extraktion von Zellen und Zelltrümmern. Dieser letztgenannte Ansatz wurde von Vesely und seinen Mitarbeitern an Schweineherzklappen verwendet, um diese dann mit dermalen Fibroblasten oder Aorten-Fibroblasten erneut zu besiedeln. Curtil et al., 1997, verwendeten eine gefriergetrocknete Schweineherzklappe und versuchten eine erneute Besiedlung der Herzklappe mit humanen Fibroblasten und Endothelzellen. Diese Studien waren von vorläufiger Natur und auf kurzzeitige in vitro-Studien begrenzt.
Die azelluläre Herzklappe, die mit autologen hMSCs besiedelt werden soll, wird in einem Taumelgefäß mit in Kultur vermehrten hMSCs inkubiert, um eine Beladung der Zellen auf alle Klappenoberflächen sicherzustellen. Die Herzklappe wird dann mit den hMSCs für 1–2 Wochen kultiviert, um es den hMSCs zu ermöglichen, die Herzklappe zu infiltrieren und neu zu besiedeln. Innerhalb des Kulturgefäßes wird die Herzklappe dann an eine Pumpe angeschlossen, um die Betätigung der Herzklappensegel zu erlauben und die im Körper vorhandene Pumpbewegung zu simulieren. Die Herzklappe wird für 1–2 Wochen in dem Pumpmodus belassen, um eine zelluläre Umbildung zu erlauben, die mit den Belastungen der Pumpaktion verbunden ist. Sobald eine hinreichende zelluläre Umbildung stattgefunden hat, wird die Herzklappe in den Körper des Patienten implantiert.
Eine weitere Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung besteht darin, die Herzklappe zuerst mit den hMSCs neu zu besiedeln und das Herzklappengewebe dann später während des Pumpstadiums mit autologen glatten Muskelzellen zu inkubieren, die aus einem Gefäßtransplantat isoliert wurden, das das Lumen der Herzklappe säumen wird.

Claims

Verwendung mesenchymaler Stammzellen für die Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung für die Behandlung eines Patienten mit geschädigtem Herzmuskel zur Verbesserung der Herzfunktion.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zubereitung dem Herzen direkt zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die pharmazeutische Zubereitung durch Injektion zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die pharmazeutische Zubereitung in einem pharmazeutisch akzeptablen, flüssigen, injizierbaren Träger zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die pharmazeutische Zubereitung während einer offenen chirurgischen Prozedur zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zubereitung systemisch zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die pharmazeutische Zubereitung intravenös zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die mesenchymalen Stammzellen autolog für den behandelten Patienten sind.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die mesenchymalen Stammzellen allogen für den behandelten Patienten sind.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die mesenchymalen Stammzellen humane mesenchymale Stammzellen sind.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die mesenchymalen Stammzellen humane allogene mesenchymale Stammzellen sind.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei wenigstens ein Teil der mesenchymalen Stammzellen modifiziert worden ist, um exogenes genetisches Material zu enthalten.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das exogene genetische Material für ein Expressionsprodukt codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wachstumsfaktoren, myogenen Faktoren, Transkriptionsfaktoren, Zytokinen, Homeoboxgenen, Angiogenese-stimulierenden Faktoren und Faktoren, die die Revaskularisierung verstärken.
Verwendung mesenchymaler Stammzellen für die Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung eines Patienten mit kongestiver Herzschwäche.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die pharmazeutische Zubereitung dem Herzen direkt zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die pharmazeutische Zubereitung durch Injektion zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die pharmazeutische Zubereitung in einem pharmazeutisch akzeptablen, flüssigen, injizierbaren Träger zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die pharmazeutische Zubereitung während einer offenen chirurgischen Prozedur zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die pharmazeutische Zubereitung systemisch zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die pharmazeutische Zubereitung intravenös zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die mesenchymalen Stammzellen autolog für den behandelten Patienten sind.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die mesenchymalen Stammzellen allogen für den behandelten Patienten sind.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die mesenchymalen Stammzellen humane mesenchymale Stammzellen sind.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei die mesenchymalen Stammzellen humane allogene mesenchymale Stammzellen sind.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei wenigstens ein Teil der mesenchymalen Stammzellen modifiziert worden ist, um exogenes genetisches Material zu enthalten.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei das exogene genetische Material für ein Expressionsprodukt codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wachstumsfaktoren, myogenen Faktoren, Transkriptionsfaktoren, Zytokinen, Homeoboxgenen, Angiogenese-stimulierenden Faktoren und Faktoren, die die Revaskularisierung verstärken.
Verwendung von autologen oder allogenen mesenchymalen Stammzellen für die Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Erzeugung von Herzmuskelzellen im Herzen eines Individuums, das dies benötigt.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei die pharmazeutische Zubereitung einem Individuum zu verabreichen ist, um den Herzmuskel, der durch Erkrankung geschädigt worden ist, zu regenerieren oder zu reparieren.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die pharmazeutische Zubereitung einem Individuum zu verabreichen ist, das einen Myocardinfarkt erlitten hat.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die pharmazeutische Zubereitung dem Herzen direkt zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die pharmazeutische Zubereitung systemisch zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei die pharmazeutische Zubereitung durch Injektion zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die mesenchymalen Stammzellen human sind.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei die pharmazeutische Zubereitung einem Individuum zu verabreichen ist, das einen Myocardinfarkt erlitten hat.
Verwendung nach Anspruch 34, wobei die pharmazeutische Zubereitung dem Herzen direkt zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 34, wobei die pharmazeutische Zubereitung systemisch zu verabreichen ist.
Verwendung von autologen oder allogenen mesenchymalen Stammzellen für die Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Reduzierung der Narbenbildung bei infarktgeschädigtem Herzgewebe.
Verwendung nach Anspruch 37, wobei die pharmazeutische Zubereitung systemisch zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 38, wobei die pharmazeutische Zubereitung durch Injektion zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 37, wobei die mesenchymalen Stammzellen human sind.
Verwendung nach Anspruch 40, wobei die pharmazeutische Zubereitung dem Herzen direkt zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 40, wobei die pharmazeutische Zubereitung systemisch zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 42, wobei die pharmazeutische Zubereitung durch Injektion zu verabreichen ist.