ES2963968T3

ES2963968T3 - Tratamiento de la vasculopatía con prostaciclina y células madre mesenquimatosas

Info

Publication number: ES2963968T3
Application number: ES21170653T
Authority: ES
Inventors: Roger Jeffs; Thomas Petersen; Roger M Ilagan; Michael Wade
Original assignee: United Therapeutics Corp
Current assignee: United Therapeutics Corp
Priority date: 2013-01-09
Filing date: 2014-01-08
Publication date: 2024-04-03
Anticipated expiration: 2034-01-08
Also published as: EP2943069A1; US20240100003A1; US11839596B2; AU2017258866A1; US20190160032A1; KR102466885B1; WO2014110094A1; JP6431850B2; KR102348611B1; US10080730B2; IL239603A0; EP3878452B1; AU2014205557A1; IL255547A; EP2943069B1; AU2019200504B2; ES2697573T3; JP2019031566A; CA2897805C; JP2016505623A

Abstract

Se proporcionan métodos para tratar o prevenir vasculopatía en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una prostaciclina y una célula madre mesenquimatosa (MSC) o un medio de cultivo condicionado por MSC o administrar al sujeto una MSC o un cultivo condicionado por MSC. Medio que ha sido tratado con prostaciclina. También se proporcionan composiciones farmacéuticas adecuadas para dichos tratamientos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de la vasculopatía con prostaciclina y células madre mesenquimatosas

Antecedentes

La presente solicitud se refiere al uso de células madre mesenquimatosas en el tratamiento de la vasculopatía, incluyendo hipertensión arterial pulmonar (PAH) y otros tipos de hipertensión pulmonar, enfermedad vascular periférica (PVD), isquemia crítica de las extremidades (CLI), arteriopatía coronaria, vasculopatía diabética, etc.

La hipertensión arterial pulmonar es un trastorno pulmonar progresivo que, si no se trata, conduce a la muerte en un plazo promedio de 2,8 años después de diagnosticarlo. Una constricción creciente de la circulación pulmonar conduce a un aumento de la tensión en el hemicardio derecho, que puede derivar en una insuficiencia del hemicardio derecho. Por definición, la tensión arterial pulmonar media (mPAP) en un caso de hipertensión pulmonar crónica es >25 mmHg en reposo o >30 mmHg durante un esfuerzo (valor normal <20 mmHg). La fisiopatología de la hipertensión arterial pulmonar se caracteriza por una vasoconstricción y remodelación de los vasos pulmonares. En la PAH crónica existe una neomusculación de los vasos pulmonares inicialmente no musculados, y aumenta la circunferencia de los músculos vasculares de los vasos ya musculados. Esa obliteración creciente de la circulación pulmonar da como resultado una tensión progresiva sobre el hemicardio derecho, lo que conduce a un gasto reducido del hemicardio derecho y eventualmente termina en una insuficiencia del hemicardio derecho (M. Humbert et al., J. Am. Coll. Cardiol.

2004, 43, 13S-24S). La PAH es un trastorno extremadamente poco frecuente, con una prevalencia de 1-2 por millón. Se ha estimado que la edad promedio de los pacientes es de 36 años, y solo el 10% de los pacientes eran mayores de 60 años. Se ven afectadas claramente más mujeres que hombres (G. E. D' Alonzo et al., Ann. Intern. Med. 1991, 115, 343-349).

Las terapias convencionales disponibles en el mercado (por ejemplo análogos de prostaciclina, antagonistas del receptor de endotelina, inhibidores de la fosfodiesterasa) son capaces de mejorar la calidad de vida, la tolerancia al ejercicio y el pronóstico de los pacientes. Los principios de esas terapias son principalmente hemodinámicos, que influyen sobre el tono vascular, pero no tienen ninguna influencia directa sobre los procesos patógenos de remodelación. Además, la posibilidad de usar esos medicamentos se ve restringida por los efectos secundarios algunas veces graves y/o los tipos complicados de administración. El periodo a lo largo del cual puede mejorar o estabilizarse la situación clínica de los pacientes mediante una monoterapia específica es limitado. Eventualmente, la terapia se intensifica y por tanto se aplica una terapia de combinación, en la que deben administrarse de manera concurrente una pluralidad de medicamentos. A pesar de todos los avances en la terapia de la hipertensión arterial pulmonar hasta ahora no hay ninguna perspectiva de cura de ese grave trastorno.

La expresión enfermedad vascular periférica (EVP) se refiere al daño, disfunción u obstrucción dentro de las arterias y venas periféricas. La arteriopatía periférica es la forma más común de PVD. La enfermedad vascular periférica es la enfermedad más común de las arterias y es un estado muy común en los Estados Unidos. Se produce principalmente en personas de más de 50 años. La enfermedad vascular periférica es causa principal de discapacidad entre las personas de más de 50 años, así como las personas con diabetes. Aproximadamente 10 millones de personas en los Estados Unidos padecen enfermedad vascular periférica, lo cual se traduce en aproximadamente el 5% de las personas de más de 50 años. Se espera que el número de personas con ese estado aumente a medida que envejece la población. Los hombres tienen ligeramente más probabilidades que las mujeres de contraer la enfermedad vascular periférica.

La isquemia crítica de las extremidades (ICE), debida a una oclusión arterial periférica avanzada, se caracteriza por flujo sanguíneo y suministro de oxígeno reducidos en reposo, dando como resultado dolor muscular en reposo y gangrenas o úlceras cutáneas no cicatrizantes (Rissanen et al., Eur. J. Clin. Invest 31:651-666 (2001); Dormandy y Rutherford, J. Vasc. Surg. 31 :S1 -S296 (2000)). Se estima que se desarrolla una isquemia crítica de las extremidades en 500 a 1000 individuos por millón en un año (“Second European Consensus Document on Chronic Critical Leg Ischemia”, Circulation 84 (4 sup.) IV 1-26 (1991)). En los pacientes con isquemia crítica de las extremidades, con frecuencia se recomienda una amputación, a pesar de la morbimortalidad e implicaciones funcionales asociadas, como solución contra síntomas discapacitantes (M. R. Tyrrell et al., Br. J. Surg. 80: 177-180 (1993); M. Eneroth et al., Int. Orthop. 16: 383-387 (1992)). No existe ninguna terapia médica óptima para la isquemia crítica de las extremidades (Circulation 84 (4 sup.): IV 1-26 (1991)).

La arteriopatía coronaria (aterosclerosis) es una enfermedad progresiva en humanos en la que una o más arterias coronarias se ocluyen gradualmente mediante una acumulación de placa. Las arterias coronarias de pacientes que tienen esa enfermedad se tratan con frecuencia mediante angioplastia con balón o la inserción de endoprótesis para abrir las arterias parcialmente ocluidas. En última instancia, se requiere que esos pacientes se sometan a cirugía de revascularización coronaria con un gasto y riesgo elevados.

El documento US 2008/0050349 A1 se refiere a una terapia basada en células para el sistema pulmonar y proporciona un procedimiento para llevar a cabo una terapia génica en un paciente mamífero que comprende administrar al sistema pulmonar del paciente células de mamífero modificadas genéticamente que contienen al menos un transgén expresable que es capaz de producir al menos un producto génico en la circulación pulmonar después de su administración.

Ruan et al., Tex Heart Inst J 2010; 37(4):391-9, proporciona una revisión de la terapia con prostaciclina para la hipertensión arterial pulmonar.

Compendio

La presente invención se expone en las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Se proporcionan como realizaciones de esta divulgación dibujos que ilustran únicamente a modo de ejemplo y no como limitación.

La FIG. 1 muestra los resultados del análisis del inmunofenotipo de MSCs obtenidas a partir de médula ósea humana.

La FIG. 2 es un gráfico que muestra la secreción de VEGF por las MSCs de la médula ósea humana después de 24 horas de exposición a treprostinilo.

Las FIG. 3A-B presentan un gráfico de secreción de MSC (A) y un gráfico de expresión génica (B) de VEGF después de 24 horas de exposición a treprostinilo.

La FIG. 4 presenta imágenes representativas de MSCs expuestas a concentraciones crecientes de treprostinilo. La FIG. 5 es un gráfico que muestra la viabilidad celular de MSCs expuestas a treprostinilo.

La FIG. 6 ilustra un modelo de los efectos de treprostinilo sobre la señalización celular, la expresión genética y la liberación de factores paracrinos.

La FIG. 7A-B presenta imágenes y un gráfico que muestra MSCs tratadas con o sin 250 pg/mL de treprostinilo. La FIG. 8 presenta dos gráficos que muestran una expresión alterada en genes seleccionados en MSCs tratadas con treprostinilo.

Las FIG. 9A-B presentan dos mapas de calor que agrupan MSCs tratadas con treprostinilo procedentes de controles con genes expresados diferencialmente de manera más significativa. (FIG. 9A) u otras secuencias genómicas o marcadores de expresión (FIG. 9B).

La FIG. 10 presenta gráficos que muestran que el contenido en ARN en los exosomas obtenidos a partir de MSCs se altera con el tratamiento con treprostinilo.

Las FIG. 11A-B muestran una distribución por tamaño de los exosomas obtenidos a partir de MSC tratadas con treprostinilo y sin tratar.

Descripciones detalladas

A menos que se especifique lo contrario, “un” o “una” significa “un/una o más”.

A menos que se defina específicamente lo contrario, se interpretará que todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido normalmente por un experto habitual en la técnica (por ejemplo, en biología de células madre, cultivo celular, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, química de proteínas y bioquímica).

A menos que se indique lo contrario, las técnicas de proteína recombinante, de cultivo celular e inmunológicas usadas en la presente divulgación son procedimientos convencionales, bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales técnicas se describen y se explican a lo largo de la bibliografía en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (compilador), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D. M. Glover y B. D. Hames (compiladores), DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F. M. Ausubel et al. (compiladores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta la fecha), Ed Harlow y David Lane (compiladores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J. E. Coligan et al. (compiladores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta la fecha).

En el presente documento se descubre que tanto la prostaciclina como las células madre mesenquimatosas (MSCs) presentan actividades terapéuticas para la vasculopatía. Además, la combinación de prostaciclina y MSCs produce efectos sinérgicos. Esa combinación puede ser o bien una administración conjunta, que puede ser concurrente o por separado, de prostaciclina y MSCs a un paciente, o bien una administración al paciente de una composición de MSCs que se ha tratado previamente con una prostaciclina.

Se muestra que las MSCs pueden mejorar la vasculopatía en pacientes, y se contempla que se logra un efecto terapéutico de ese tipo debido a la capacidad de las MSCs para mejorar el microentorno local suministrando factores antiinflamatorios y proangiogénicos a la zona enferma. Sin embargo, las MSCs tienen una vida corta en el organismo y no son regenerativas.

Se ha usado prostaciclina, tal como treprostinilo (TP), para tratar pacientes con hipertensión arterial pulmonar (PAH). A este respecto, se ha mostrado que la prostaciclina presenta actividades vasodilatadoras y de antiagregación plaquetaria.

Un descubrimiento inesperado es que la prostaciclina puede potenciar la actividad de las MSCs para el tratamiento de la vasculopatía, mostrando un sinergismo para ese tratamiento. A este respecto, se observa que la prostaciclina potencia el efecto beneficioso de las MSCs sobre el crecimiento de los vasos sanguíneos. Por ejemplo, la prostaciclina aumenta la expresión de VEGF a niveles tanto de proteína como de gen. También se observan cambios en las citocinas secretadas como resultado de una exposición a prostaciclina. Por ejemplo, IL-6 se incrementa ~50 veces mientras que MCP-1 disminuye ~6-7 veces.

Ese sinergismo también resulta evidente cuando al paciente se le administra además una célula progenitora endotelial (EPC). Por tanto, se contempla que la prostaciclina puede potenciar la actividad de las EPCs a través de las MSCs. Por tanto, gracias a tal sinergismo, el uso combinatorio de prostaciclina y MSC, opcionalmente junto con EPC, puede conducir a un resultado terapéutico mejorado y/o una necesidad reducida de cada agente solo, lo que a su vez, puede dar lugar a efectos adversos reducidos posiblemente provocados por cada agente solo, a una dosis superior.

Se muestra adicionalmente que ese sinergismo es aplicable a un medio de cultivo condicionado de MSC. Para ello, se observa que los exosomas de las MSCs tratadas con prostaciclina tienen niveles superiores de VEGF-A, lo cual puede fomentar una producción incrementada de VEGF en las células diana, mediante un mecanismo de transferencia génica horizontal. Además, la exposición a prostaciclina proporciona una población más uniforme de exosomas.

Tal como se usa en el presente documento, un “medio de cultivo condicionado de MSC” se refiere a un medio de cultivo que ha estado en contacto con una MSC (por ejemplo, con el fin de cultivar la MSC) y por tanto contiene compuestos liberados desde la MSC. Ejemplos no limitativos de tales compuestos liberados incluyen exosomas u otras microvesículas que pueden encerrar ARN mensajero, ARN no codificante, microARNs, mitocondrias, factores de crecimiento u otros tipos de agentes bioactivos.

Un “medio de cultivo”, tal como se usa en el presente documento, incluye (a) tanto un medio de cultivo que contiene los componentes típicos usados para cultivar una MSC, tales como aminoácidos, glucosa y diversas sales, con o sin la MSC, como (b) una composición aislada a partir del medio de cultivo que contiene compuestos liberados desde la MSC durante el cultivo.

Por consiguiente, un aspecto de la presente divulgación proporciona un método para tratar o prevenir una vasculopatía en un sujeto que lo requiere, que comprende administrar al sujeto una prostaciclina y una composición que comprende una célula madre mesenquimatosa (MSC) o un medio de cultivo condicionado de MSC (de manera colectiva, una “composición de MSC”).

En un aspecto, la prostaciclina y la composición de MSC se administran de manera concurrente. En otro aspecto, la prostaciclina y la composición de MSC se administran por separado. Cuando se administran por separado, la prostaciclina puede administrarse antes o después de la administración de la composición de MSC.

En otro aspecto, se proporciona un método para tratar o prevenir una vasculopatía en un sujeto que lo requiere, que comprende poner en contacto una composición que comprende una célula madre mesenquimatosa (MSC) aislada o un medio de cultivo condicionado de MSC, con una prostaciclina y después administrar la composición de MSC al sujeto.

Ejemplos no limitativos de vasculopatía incluyen hipertensión arterial pulmonar (PAH), enfermedad vascular periférica (PVD), isquemia crítica de las extremidades (CLI), arteriopatía coronaria y vasculopatía diabética.

Tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto” (también denominado en el presente documento “paciente”) incluye animales de sangre caliente, preferiblemente mamíferos, incluyendo seres humanos. En una realización preferida, el sujeto es un primate. En una realización incluso más preferida, el sujeto es un ser humano.

Tal como se usan en el presente documento, las expresiones “que trata”, “tratar” o “tratamiento” incluyen administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de células, tal como se definen en el presente documento, suficiente para reducir o eliminar al menos un síntoma de la vasculopatía.

Tal como se usan en el presente documento, las expresiones “que previene”, “prevenir” o “prevención” incluyen administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de células, tal como se definen en el presente documento, suficiente para detener o dificultar el desarrollo de al menos un síntoma de la vasculopatía.

A. Prostaciclina

El término “prostaciclina” usado en el presente documento comprende de manera explícita cualquier prostaglandina I2 (PGI2), cualquier análogo de prostaciclina y cualquier agonista del receptor de PGI2. Los ejemplos no limitantes de prostaciclina adecuados para la presente tecnología incluyen epoprostenol sódico (por ejemplo, Flolan®), treprostinilo (por ejemplo, TYVASO®, Remodulin®), ilprost (por ejemplo, Ventavis®) y agonista del receptor de PGI2 (por ejemplo, Selexipag). En un aspecto, la prostaciclina es treprostinilo o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo

B. Células madre mesenquimatosas (MSCs)

Las células madre mesenquimatosas (MSCs) son células que se encuentran en la médula ósea, sangre, células de la pulpa dentaria, tejido adiposo, piel, bazo, páncreas, cerebro, riñón, hígado, corazón, retina, cerebro, folículos pilosos, intestino, pulmón, ganglio linfático, timo, hueso, ligamento, tendón, músculo esquelético, dermis y periostio; y son capaces de diferenciarse en diferentes líneas germinales tales como mesodermo, endodermo y ectodermo. Por tanto, las MSCs son capaces de diferenciarse en una gran cantidad de tipos celulares que incluyen, pero sin limitarse a, tejido adiposo, óseo, cartilaginoso, elástico, muscular y conjuntivo fibroso. La ruta de diferenciación y compromiso de linaje específica en la que entran estas células depende de diversas influencias entre influencias mecánicas y/o factores bioactivos endógenos, tales como factores de crecimiento, citocinas y/o condiciones de microentorno local establecidas por los tejidos anfitriones. Por tanto, las MSCs son células progenitoras no hematopoyéticas que se dividen para producir células hijas que o bien son células madre o bien son células precursoras que con el tiempo se diferenciarán de manera irreversible para producir una célula fenotípica. Ejemplos de las MSCs incluyen las células precursoras mesenquimatosas (MPCs).

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “célula madre” se refiere a células que se autorrenuevan que son capaces de dar lugar a hijas fenotípica y genotípicamente idénticas así como a al menos otro tipo de célula final (por ejemplo, células diferenciadas de manera terminal). La expresión “células madre” incluye células totipotenciales, pluripotenciales y multipotenciales, así como células progenitoras y/o precursoras obtenidas a partir de la diferenciación de las mismas.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “célula totipotente” o “célula totipotencial” se refiere a una célula que es capaz de formar un embrión completo (por ejemplo, un blastocito).

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “célula pluripotente” o “célula pluripotencial” se refiere a una célula que tiene una versatilidad de diferenciación completa, es decir, la capacidad de crecer hasta convertirse en cualquiera de los aproximadamente 260 tipos de células del organismo de mamíferos. Una célula pluripotente puede ser autorrenovable y puede permanecer latente o quiescente dentro de un tejido.

La expresión “célula multipotencial” o “célula multipotente” se refiere a una célula que es capaz de dar lugar a cualquiera entre varios tipos de células maduras. Tal como se usa en el presente documento, esa expresión abarca células progenitoras y células madre adultas o embrionarias, y la progenie multipotencial de esas células. A diferencia de una célula pluripotente, una célula multipotente no tiene la capacidad de formar todos los tipos de células.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “célula progenitora” o “célula precursora” se refiere a una célula que está comprometida para diferenciarse en un tipo específico de célula o para formar un tipo específico de tejido.

En un aspecto preferido, las células usadas en los métodos de la divulgación se enriquecen a partir de una muestra obtenida a partir de un sujeto. Los términos “enriquecido”, “enriquecimiento” o variaciones de los mismos se usan en el presente documento para describir una población de células en la que la proporción de un tipo de célula particular o la proporción de varios tipos de células particulares se incrementa en comparación con la población sin tratar.

En un aspecto preferido, las células usadas en la presente divulgación son TNAP+, STRO-1+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ o cualquier combinación de las mismas.

Cuando se hace referencia a una célula como "positiva" para un marcador dado, puede tener una expresión o bien baja ("lo" o atenuada) o bien alta (brillante, "bri") de ese marcador dependiendo del grado en que esté presente el marcador sobre la superficie de la célula, en donde los términos se refieren a la intensidad de la fluorescencia o de otro color usado en el procedimiento de clasificación por colores de las células. La distinción entre lo (o atenuado o apagado) y bri se entenderá en el contexto del marcador usado en una población celular particular que está clasificándose. Cuando se hace referencia en el presente documento a una célula como “negativa” para un marcador dado, no significa que el marcador no se exprese en absoluto en esa célula. Significa que el marcador se expresa a un nivel relativamente muy bajo en esa célula, y que genera una señal muy baja cuando se marca de manera detectable.

Cuando se usa en el presente documento, se entiende que el término “TNAP” incluye todas las isoformas de fosfatasa alcalina no específicas de tejido. Por ejemplo, el término incluye la isoforma hepática (LAP), la isoforma ósea (BAP) y la isoforma renal (KAP). En un aspecto preferido, la TNAP es BAP. En un aspecto particularmente preferido, TNAP tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que puede unirse al anticuerpo de STRO-3 producido por la línea celular de hibridoma depositada en el ATCC el 19 de diciembre de 2005, según las disposiciones del Tratado de Budapest con el número de registro de depósito PTA-7282.

Las células madre útiles para los métodos se pueden obtener a partir de tejido de adulto, un embrión, tejido extraembrionario o un feto. El término “adulto” se usa en su sentido más amplio para incluir un sujeto posnatal. En un aspecto preferido, el término “adulto” se refiere a un sujeto que es postpuberal. El término, “adulto” tal como se usa en el presente documento, también puede incluir sangre de cordón umbilical tomada de una hembra.

En algunos aspectos, las células madre pueden ser células de la progenie (que también pueden denominarse células expandidas) que se producen a partir del cultivoin vitrode las células madre descritas en el presente documento. Las células expandidas de la divulgación pueden tener una amplia variedad de fenotipos dependiendo de las condiciones de cultivo (incluyendo la cantidad y/o tipo de factores estimulantes en el medio de cultivo), el número de pases y similares. En determinados aspectos, las células de la progenie se obtienen después de aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9 o aproximadamente 10 pases a partir de la población parental. Sin embargo, las células de la progenie pueden obtenerse después de cualquier número de pases a partir de la población parental.

Las células de la progenie pueden obtenerse mediante cultivo en cualquier medio adecuado. El término “medio”, tal como se usa haciendo referencia a un cultivo celular, incluye los componentes del entorno que rodea a las células. Los medios pueden ser sólidos, líquidos, gaseosos o una mezcla de fases y materiales. Los medios incluyen medios de crecimiento líquidos así como medios líquidos que no sostienen el crecimiento celular. Los medios también incluyen medios gelatinosos tales como matrices de agar, agarosa, gelatina y colágeno. El término “medio” también se refiere a un material que está destinado al uso en un cultivo celular, aunque aún no se haya puesto en contacto con células. Dicho de otro modo, un líquido rico en nutrientes preparado para un cultivo bacteriano es un medio.

En un aspecto, las células de la progenie se obtienen aislando células TNAP+ a partir de médula ósea, usando perlas magnéticas marcadas con el anticuerpo de STRO-3, y sembrando en placa en un medio a-MEM complementado con suero de ternera fetal al 20%, L-glutamina 2 mM y L-ascorbato-2-fosfato 100 gm.

En un aspecto, tales células expandidas (al menos después de 5 pases) pueden ser TNAP-, CC9+, HLA de clase I+, HLA de clase II-, CD14-, CD19-; CD3-, CD11a-c-, Cd 31-, CD86- y/o c D80-. Sin embargo, es posible que en unas condiciones de cultivo diferentes de las descritas en el presente documento, la expresión de diferentes marcadores pueda variar. Además, aunque las células con esos fenotipos pueden predominar en la población celular expandida, eso no significa que no haya una proporción minoritaria de las células que no tienen ese/esos fenotipo(s) (por ejemplo, un pequeño porcentaje de las células expandidas pueden ser CC9-). En una realización preferida, las células expandidas de la divulgación todavía tienen la capacidad para diferenciarse en diferentes tipos de células.

En un aspecto, una población celular expandida usada en los métodos de la divulgación comprende células en las que al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50%, de las células son CC9+.

En otro aspecto, una población celular expandida usada en los métodos de la divulgación comprende células en las que al menos el 40%, más preferiblemente al menos el 45%, de las células son STRO-1+.

En un aspecto adicional, las células de la progenie pueden expresar marcadores seleccionados a partir del grupo que consiste en LFA-3, THY-1, VCAM-1, PeCa M-1, P-selectina, L-selectina, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD29, CD18, CD61, integrina beta, 6-19, trombomodulina, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1 -R, NGF-R, FGF-R, leptina-R, (St Ro -2 = leptina-R), rAn KL, STRO-1 brillante y CDM6 o cualquier combinación de estos marcadores.

En un aspecto, las células de la progenie son progenie de MSCs expandidas multipotenciales (MEMPs) tal como se definen en el documento WO 2006/032092. En los documentos WO 01/04268 y WO 2004/085630 se describen métodos para preparar poblaciones enriquecidas de MSCs a partir de las cuales se puede obtener una progenie. En un contextoin vitro,las MSCs pocas veces estarán presentes como una preparación absolutamente pura y generalmente estarán presentes con otras células que son células comprometidas específicas del tejido (TSCCs). El documento WO 01/04268 se refiere a la recogida de tales células a partir de médula ósea con niveles de pureza de aproximadamente el 0,1% al 90%. La población que comprende MSCs a partir de las cuales se puede obtener una progenie, puede recogerse directamente desde una fuente de tejido, o alternativamente puede ser una población que ya se ha expandidoex vivo.

Por ejemplo, la progenie puede obtenerse a partir de una población recogida, no expandida, de MSCs sustancialmente purificadas, que comprende al menos aproximadamente el 0,1, 1,5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 95% de las células totales de la población en la que están presentes. Ese nivel puede lograrse, por ejemplo, seleccionando células que son positivas para al menos un marcador seleccionado a partir del grupo que consiste en TNAP, STRO-1bri, 3G5+, VCAM-1, THY-1, CD146 y STRO-2.

La población de partida de MSCs puede obtenerse a partir de uno cualquiera o más entre los tipos de tejidos indicados en los documentos WO 01/04268 o WO 2004/085630, a saber, médula ósea, células de pulpa dentaria, tejido adiposo y piel, o quizás de manera más amplia a partir de tejido adiposo, dientes, pulpa dentaria, piel, hígado, riñón, corazón, retina, cerebro, folículos pilosos, intestino, pulmón, bazo, ganglio linfático, timo, páncreas, hueso, ligamento, médula ósea, tendón y músculo esquelético.

Las MEMPs se pueden distinguir de las MSCs recién recogidas porque son positivas para el marcador STRO-1bri y negativas para el marcador de fosfatasa alcalina (ALP). En cambio, las MSCs recién aisladas son positivas tanto para STRO-1bri como para ALP. En un aspecto preferido de la presente divulgación, al menos el 15%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o el 95% de las células administradas tiene el fenotipo STRO-1br¡, ALP-. En un aspecto adicional preferido las MEMPs son positivas para uno o más de los marcadores Ki67, CD44 y/o CD49c/CD29, VLA-3, a3p1. En aún un aspecto adicional preferido las MEMPs no muestran actividad TERT y/o son negativas para el marcador CD18.

En un aspecto, las células se toman de un paciente con vasculopatía, se cultivanin vitrousando técnicas convencionales y se administran a un paciente como un trasplante autólogo o alogénico. En un aspecto alternativo, se usan células de una o más de las líneas celulares humanas establecidas. En otro aspecto útil de la divulgación, se usan células de un animal no humano (o si el paciente no es un ser humano, de otra especie).

La presente tecnología puede ponerse en práctica usando células procedentes de cualquier especie animal no humana, incluyendo, pero sin limitarse a, células de primates no humanos, células de ungulados, caninos, felinos, lagomorfos, roedores, aves y peces. Las células de primates con las que puede llevarse a cabo la divulgación incluyen, pero no se limitan a, células de chimpancés, babuinos, macacos cangrejeros y cualquier otro platirrino o cercopitécido. Las células de ungulados con las que puede llevarse a cabo la divulgación incluyen, pero no se limitan a, células de bovinos, porcinos, ovinos, caprinos, equinos, búfalo y bisonte. Las células de roedores con las que puede llevarse a cabo la divulgación incluyen, pero no se limitan a, células de ratón, rata, cobaya, hámster y jerbo. Ejemplos de especies de lagomorfos con las que puede llevarse a cabo la divulgación incluyen conejos domesticados, liebres norteamericanas, liebres, conejos de cola de algodón, liebres americanas y picas. Los pollos (Gallus gallus) son un ejemplo de una especie aviar con la que puede llevarse a cabo la divulgación.

Las células se pueden almacenar antes del uso. En la técnica se conocen bien métodos y protocolos para conservar y almacenar células eucariotas, y en particular células de mamífero (véase, por ejemplo, Pollard, J. W. y Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, segunda edición, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, cuarta edición, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.). En relación con la presente divulgación, se puede usar cualquier método que conserve la actividad biológica de las células madre aisladas tales como células progenitoras/madre mesenquimatosas, o la progenie de las mismas. En un aspecto preferido, las células se conservan y almacenan usando crioconservación.

Se pueden obtener células usando una variedad de técnicas. Por ejemplo, se pueden usar varias técnicas de clasificación celular mediante las cuales se separan físicamente las células haciendo referencia a una propiedad asociada con el complejo célula-anticuerpo, o un marcador fijado al anticuerpo. Ese marcador puede ser una partícula magnética o una molécula fluorescente. Los anticuerpos pueden reticularse de tal manera que forman agregados de múltiples células, que pueden separarse por su densidad. Alternativamente, los anticuerpos pueden unirse a una matriz estacionaria, a la que se adhieren las células deseadas.

En un aspecto preferido, se usa un anticuerpo (u otro agente de unión) que se une a TNAP+, STRO-1+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, 3G5+, CD45+, CD146+ para aislar las células. Más preferiblemente, se usa un anticuerpo (u otro agente de unión) que se une a TNAP+ o STRO-1+ para aislar las células.

Se conocen diversos métodos para separar células unidas a anticuerpo de las células no unidas. Por ejemplo, se puede marcar el anticuerpo unido a la célula (o un anticuerpo anti-isotipo) y después separar las células mediante un clasificador celular mecánico que detecta la presencia del marcador. En la técnica se conocen clasificadores celulares activados por fluorescencia. En un aspecto, se fijan anticuerpos anti-TNAP y/o anticuerpos de STRO-1 a un soporte sólido. Los expertos en la técnica conocen diversos soportes sólidos, incluyendo, pero sin limitarse a, perlas de agarosa, perlas de poliestireno, membranas de fibras huecas, polímeros y placas de Petri de plástico. Las células a las que se une el anticuerpo pueden retirarse de la suspensión celular, simplemente separando físicamente el soporte sólido de la suspensión celular.

Se pueden usar micropartículas superparamagnéticas para separaciones de células. Por ejemplo, las micropartículas pueden recubrirse con anticuerpos anti-TNAP y/o anticuerpos de STRO-1. Después se pueden incubar las micropartículas superparamagnéticas, marcadas con anticuerpo, con una solución que contiene las células de interés. Las micropartículas se unen a las superficies de las células madre deseadas, y después se pueden recoger esas células en un campo magnético.

En otro ejemplo, se deja que la muestra de células entre en contacto físico, por ejemplo, con anticuerpos monoclonales anti-TNAP y/o anticuerpos monoclonales anti-STRO-1 unidos a una fase sólida. La unión a una fase sólida puede comprender, por ejemplo, adsorber los anticuerpos a una superficie de plástico, nitrocelulosa o de otro tipo. Los anticuerpos también pueden adsorberse sobre las paredes de los poros grandes (suficientemente grandes como para permitir el flujo a través de las células) de una membrana de fibras huecas. Alternativamente, los anticuerpos pueden unirse de manera covalente a una superficie o una perla, tal como macroperlas de Pharmacia Sepharose 6 MB. Las condiciones y la duración exacta de la incubación de los anticuerpos unidos a una fase sólida con la suspensión que contiene las células madre, dependerán de varios factores específicos del sistema empleado. Sin embargo, la selección de unas condiciones apropiadas está dentro de los conocimientos de la técnica.

Después, las células no unidas se eluyen o se retiran mediante lavado con tampón fisiológico, después de permitir que pase un tiempo suficiente para que se unan las células madre. Las células no unidas pueden recuperarse y usarse para otros fines o descartarse después de haber realizado pruebas apropiadas para garantizar que se ha logrado la separación deseada. Después, las células unidas se separan de la fase sólida mediante cualquier método apropiado, dependiendo principalmente de la naturaleza de la fase sólida y del anticuerpo. Por ejemplo, las células unidas se pueden eluir desde una placa de Petri de plástico mediante agitación vigorosa. Alternativamente, las células unidas se pueden eluir mediante “mellado” enzimático o digestión de una secuencia “espadadora” sensible a enzimas entre la fase sólida y el anticuerpo. Hay espaciadores unidos a perlas de agarosa comercialmente disponibles, por ejemplo, en Pharmacia.

A continuación la fracción de células eluída, enriquecida se puede lavar con un tampón mediante centrifugación y se puede crioconservar dicha fracción enriquecida en un estado viable para un uso posterior según la tecnología convencional, expandir en cultivo y/o introducir en el paciente.

C. Medios de cultivo condicionados con MSC

Se ha descubierto que las MSCs pueden llevar a cabo sus actividades a través de compuestos que pueden liberarse en el entorno extracelular durante el crecimiento o la diferenciación. En algunos aspectos, tales compuestos incluyen una microvesícula, denominada exosoma, que tiene entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 200 nm de diámetro. Los exosomas pueden ser internalizados por células hospedadorasin vivo.

Los exosomas son vesículas derivadas de la ruta de clasificación de cuerpos multivesiculares. Recientes estudios muestran que los exosomas son vesículas bioactivas útiles para la comunicación intercelular y la facilitación del proceso inmunorregulador. Los exosomas de MSCs contienen proteasomas 20S y numerosos ARNs (ARN mensajero, ARN no codificante, microARN).

Además de los exosomas, las MSCs también liberan otras moléculas/vesículas bioactivas útiles para los fines de la presente divulgación. Tales moléculas y vesículas incluyen, sin limitación, mitocondrias y factores de crecimiento. En la técnica se conocen métodos de preparación de medios de cultivo que contienen tales moléculas y vesículas liberadas a partir de MSCs y aislamiento adicional de moléculas y vesículas particulares. Véase, por ejemplo, Hu et al., Frontiers in Genetics, 2:56, 1-9 (2012).

D. Tratamiento previo de MSC con prostaciclina

En algunos aspectos, antes de la administración conjunta de una MSC o un medio de cultivo condicionado de MSC con prostaciclina a un paciente, opcionalmente puede tratarse previamente la MSC o el medio de cultivo condicionado de MSC con prostaciclina. Por consiguiente, también se describe un método para preparar una célula madre mesenquimatosa (MSC) o un medio de cultivo condicionado de MSC para su administraciónin vivo,que comprende poner en contacto la MSC o el medio de cultivo condicionado de MSC con una prostaciclina. También se describe una MSC o un medio de cultivo condicionado de MSC tratados que se pueden obtener mediante un método de este tipo.

El tratamiento previo de una célula o un medio con un compuesto químico incluye técnicas conocidas. En un aspecto, la prostaciclina se puede añadir a, e incubar juntamente con, un medio de cultivo que contiene una MSC. Sin embargo, opcionalmente, esa incubación conjunta puede implicar además la adición de un factor de crecimiento (por ejemplo, VEGF y angiopoyetina 1 o 2, factor de crecimiento derivado de plaquetas) y/o hipoxia.

Las MSCs o los medios de cultivo condicionados de MSC pueden tratarse con prostaciclina de diversas maneras. Por ejemplo, se puede usar prostaciclina para tratar las MSCsex vivodurante la expansión de las MSCs; también se puede usar prostaciclina para tratar las MSCs después de la administración. En algunos aspectos, la concentración de prostaciclina es de al menos aproximadamente 100 pg/mL o al menos aproximadamente 150 pg/mL, 200 pg/mL o 250 pg/mL. En algunos aspectos, la concentración de prostaciclina no es superior a aproximadamente 400 pg/mL, o no es superior a aproximadamente 350 pg/mL, 300 pg/mL o 250 pg/mL.

Según un aspecto de la presente divulgación, las MSCs se pueden preparar a partir de la sangre o la médula ósea del propio receptor. En ese caso, también se puede usar prostaciclina para tratar las MSCs antes de aislarlas de los receptores.

E. Célula progenitora endotelial (EPC)

Tal como se proporciona, el sinergismo entre prostaciclina y MSCs para el tratamiento de la vasculopatía también es evidente cuando se administra a un paciente adicionalmente una célula progenitora endotelial (EPC). Por tanto, para cualquier aspecto del método actualmente divulgado, al paciente se le administra adicionalmente una célula progenitora endotelial (EPC).

En algunos aspectos, la EPC también puede tratarse previamente con prostaciclina. Las EPCs tratadas con prostaciclina muestran un fenotipo hiperproliferativo con propiedades angiogénicas potenciadas, que son ventajosas en el tratamiento de la vasculopatía en comparación con las EPCs sin tratar.

Las EPCs se pueden tratar con prostaciclina de diversas maneras. Por ejemplo, se puede usar prostaciclina para tratar EPCsex vivodurante la expansión de las EPCs; la prostaciclina se puede administrar junto con las EPCs al receptor; también se puede usar prostaciclina para tratar las EPCs después del trasplante. Según un aspecto de la presente divulgación, se preparan EPCs a partir de la sangre o médula ósea del propio receptor. En ese caso, también se puede usar prostaciclina para tratar las EPCs antes de aislarlas de los receptores.

Una EPC es una célula no diferenciada que se puede inducir para que prolifere. Las EPCs son capaces de automantenimiento, de manera que con cada división celular, al menos una célula hija también será una célula EPC. Las EPCs son capaces de expandirse 100, 250, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o más veces.

El fenotipado de las EPCs revela que esas células expresan el marcador hematopoyético comprometido CD45. Adicionalmente, una EPC puede ser inmunorreactiva frente a VEGFR-2 y/o Tie-2. Opcionalmente, la EPC es inmunorreactiva frente a CD14. La EPC es una célula progenitora multipotente.

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) actúa a través de receptores de tirosina cinasa específicos que incluyen VEGFR-1 (flt-1) y VEGFR-2 (flk-1/KDR) y VEGFR-3/Flt-4 que transmiten señales que son esenciales para la angiogénesis y la hematopoyesis embrionarias. Aunque VEGF se une a los tres receptores, la mayoría de las funciones biológicas están mediadas a través de VEGFR-2 y actualmente se desconoce el papel de VEGFR-1. Se sabe que la señalización de VEGFR3/Flt4 es importante para el desarrollo de células endoteliales linfáticas y la señalización de VEGFR3 puede conferir fenotipos de tipo endotelial linfático a las células endoteliales. Los VEGFRs transmiten señales para procesos esenciales en la estimulación del crecimiento vascular, vasorrelajación, inducción de permeabilidad vascular, migración, proliferación y supervivencia de células endoteliales. Las células endoteliales expresan todos los diferentes VEGFRs. Durante la embriogénesis, se ha notificado que una única célula progenitora, el hemangioblasto, puede dar lugar a los sistemas tanto hematopoyético como vascular.

Tie-2 es una tirosina cinasa receptora específica del endotelio y un receptor para angiopoyetina 1. Es una proteína de membrana de tipo I que se expresa de manera predominante en el endotelio de vasos sanguíneos en crecimiento activo y puede representar el marcador de linaje de células endoteliales de mamífero más temprano. Tie-2 está probablemente implicada en la regulación de la proliferación y diferenciación de células endoteliales y puede dirigir la orientación especial de células endoteliales durante la formación de vasos sanguíneos.

El antígeno CD14 es un receptor de alta afinidad para el complejo de lipopolisacáridos (LPS) y la proteína de unión a LPS (LBP). El antígeno CD14 forma parte del complejo de receptor de LPS heterómero funcional compuesto por CD14, TLR4 y MD-2. CD14 se expresa fuertemente en la mayoría de los monocitos y macrófagos humanos en sangre periférica, otros líquidos corporales y diversos tejidos, tales como ganglios linfáticos y bazo. CD14 se expresa débilmente en subpoblaciones de neutrófilos humanos y células dendríticas mieloides.

El antígeno CD45 es una tirosina fosfatasa, también conocida como antígeno común leucocitario (LCA). CD45 está presente en todas las células humanas de origen hematopoyético, excepto células eritroides, plaquetas y sus células precursoras. La molécula de CD45 se requiere para la activación de linfocitos T y linfocitos B y se expresa en al menos 5 isoformas, dependiendo del estado de activación de la célula.

Las células VEGFR-1+, VEGFR-2+ y Tie-2+ constituyen aproximadamente el 3,0 - 0,2%, el 0,8 - 0,5%, el 2,0 -0,3% de la población total de células mononucleares en la sangre, respectivamente. Las células CD14+/VEGFR-2+ constituyen aproximadamente el 2,0 - 0,5% de la población total de monocitos y el 0,08 - 0,04% de las células mononucleares en la sangre.

Las EPCs se pueden conservarin vitroen cultivos a largo plazo. Las EPCs son capaces de someterse 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más veces a pases en cultivo.

Las EPCs comprenden células formadoras de colonias endoteliales, normalmente desarrolladas después de 1-3 semanas de cultivo celular. Las células formadoras de colonias endoteliales tienen las características de células precursoras comprometidas con el linaje endotelial y son capaces de fusionarse en neovasos, según Smardja et al., Angiogenesis 14 (1 ) :17-27 (2011).

El aislamiento, la purificación, el cultivoex vivoy la caracterización de EPCs se describen en Hill et al., N. Engl. J. Med. 348:593-600 (2003), Assmus et al., Circulation 106:3009-16 (2002), Wang et al., J. Am. Coll. Cardiol. 49:1566-71 (2007) y Kalka et al., P.N.A.S. 97:3422-7 (2000). Además, el aislamiento, la purificación, el cultivoex vivoy la caracterización de las células formadoras de colonias endoteliales se describen en Yoder et al., Blood 109:1801 -1809 (2007), Ingram et al., Blood 104:2752-2760 (2004) y Smardja et al., Angiogenesis 14(1 ):17-27 (2011).

Por ejemplo, la población de células se aísla por medio de una selección positiva, o mediante una mezcla de selección tanto positiva como negativa en cualquier orden. Se purifica la población de células progenitoras. Una población purificada de EPCs contiene una proporción significativamente superior de EPCs que la población bruta de células a partir de la cual se aíslan las células.

Por ejemplo, el procedimiento de purificación debe conducir a al menos un incremento de cinco veces, preferiblemente al menos un incremento de diez veces, más preferiblemente al menos un incremento de quince veces, lo más preferiblemente al menos un incremento de veinte veces y de manera óptima al menos un incremento de veinticinco veces de las EPCs con respecto a la población total. La población purificada de EPCs debe incluir al menos el 15%, preferiblemente al menos el 20%, más preferiblemente al menos el 25%, lo más preferiblemente al menos el 35% y de manera óptima al menos el 50% de EPCs.

Los métodos descritos en el presente documento pueden conducir a mezclas que comprenden hasta el 75%, preferiblemente hasta el 80%, más preferiblemente hasta el 85%, lo más preferiblemente hasta el 90% y de manera óptima hasta el 95% de células madre. Tales métodos son capaces de producir mezclas que comprenden el 99%, el 99,90% e incluso el 100% de EPCs. Por consiguiente, las poblaciones purificadas de la divulgación contienen niveles de EPCs que son significativamente superiores a los que existen en la naturaleza, tal como se ha descrito anteriormente.

La población purificada de EPCs puede aislarse poniendo en contacto una mezcla bruta de células que contiene una población de células madre que expresan un antígeno característico de las EPCs, con una molécula que se une específicamente a la parte extracelular del antígeno. Una técnica de ese tipo se conoce como selección positiva. La unión de las EPCs a la molécula permite distinguir suficientemente las EPCs de las células contaminantes que no expresan el antígeno, para permitir aislar las células madre de las células contaminantes. El antígeno es preferiblemente VEGFR, y más preferiblemente VEGFR-2.

La molécula usada para separar las células progenitoras de las células contaminantes puede ser cualquier molécula que se une específicamente al antígeno que caracteriza a las EPCs. La molécula puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, un fragmento de un anticuerpo monoclonal o, en el caso de un antígeno que es un receptor, el ligando de ese receptor. Por ejemplo, en el caso de un receptor de VEGF, tal como FLK-1, el ligando es VEGF.

Las células aisladas únicas de la presente divulgación pueden separarse de otras células gracias a su estado CD45+ y a presentar receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), por ejemplo VEGFR-2. Las células pueden aislarse mediante técnicas convencionales para separar células, tales como las descritas en Civin, documentos de patentes estadounidenses n° 4.714.680, 4.965.204, 5.035.994 y 5.130.144, Tsukamoto et al., documento de patente estadounidense n° 5.750.397 y Loken et al., patente estadounidense n° 5.137.809. Por tanto, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal específico para CD45 o un anticuerpo específico para VEGFR puede inmovilizarse sobre un soporte sólido tal como nitrocelulosa, perlas de agarosa, perlas de poliestireno, membranas de fibras huecas, perlas magnéticas y placas de Petri de plástico. Después se hace pasar toda la población celular a través del soporte sólido o se añade a las perlas.

Las células que se unen a la molécula de unión pueden retirarse de la suspensión celular separando físicamente el soporte sólido de la suspensión celular restante. Por ejemplo, las células no unidas se pueden eluir o retirar mediante lavado con tampón fisiológico después de permitir que transcurra un tiempo suficiente para que el soporte sólido se una a las células madre.

Las células unidas pueden separarse de la fase sólida mediante cualquier método apropiado, dependiendo principalmente de la naturaleza de la fase sólida y la molécula de unión. Por ejemplo, se pueden eluir células unidas desde una placa de Petri de plástico mediante agitación vigorosa. Alternativamente, se pueden eluir células unidas mediante “mellado” enzimático o digestión de una secuencia “espadadora” sensible a enzimas entre la fase sólida y un anticuerpo. Hay secuencias espaciadoras adecuadas unidas a perlas de agarosa disponibles comercialmente, por ejemplo, en Pharmacia.

A continuación, la fracción celular eluida, enriquecida se puede lavar con un tampón mediante centrifugación y conservar en un estado viable a bajas temperaturas para un uso posterior según la tecnología convencional. Las células también se pueden usar inmediatamente, por ejemplo mediante infusión intravenosa en un receptor.

Las que permanecen fijadas al soporte sólido son las células que contienen un marcador que es reconocido por el anticuerpo usado. Por tanto, si se usa el anticuerpo anti-CD45, entonces la población resultante estará enormemente enriquecida en células CD45+. Si el anticuerpo usado es para VFGFR, entonces la población resultante estará enormemente enriquecida en células VEGFR+. Esa población se puede enriquecer entonces con el otro marcador repitiendo las etapas usando una fase sólida a la que está fijada un anticuerpo para el otro marcador.

Otra manera de clasificar células CD45+ VEGFR+ es por medio de citometría de flujo, lo más preferiblemente por medio de un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS), tal como los fabricados por Becton-Dickinson con los nombres FACScan o FACSCalibur. Por medio de esa técnica, las células que tienen un marcador CD45 sobre las mismas se marcan con un colorante fluorescente particular por medio de un anticuerpo anti-CD45 que se ha conjugado con ese colorante. De manera similar, el marcador VEGFR de las células se marca con un colorante fluorescente diferente por medio de un anticuerpo anti-VEGFR que se ha conjugado con el otro colorante. Cuando se colocan las células teñidas sobre el instrumento, se dirige un flujo de células a través de un haz de láser de argón que excita el fluorocromo para emitir luz. Esa luz emitida se detecta mediante un tubo fotomultiplicador (PMT) específico para la longitud de onda de emisión del fluorocromo gracias a un conjunto de filtros ópticos. La señal detectada por el PMT se amplifica en su propio canal y se visualiza mediante un ordenador en una variedad de formas diferentes, por ejemplo, un histograma, visualización de puntos o visualización de contorno. Por tanto, las células fluorescentes que emiten a una longitud de onda expresan una molécula que es reactiva con el reactivo marcado con un fluorocromo específico, mientras que las células no fluorescentes o las células fluorescentes que emiten a una longitud de onda diferente, no expresan esa molécula pero pueden expresar la molécula que es reactiva con el reactivo marcado con fluorocromo que emite fluorescencia con la otra longitud de onda. El citómetro de flujo también es sem ¡cuantitativo ya que visualiza la cantidad de fluorescencia (intensidad de la fluorescencia) expresada por la célula. Esto se correlaciona, en un sentido relativo, con el número de las moléculas expresadas por la célula.

Los citómetros de flujo también pueden estar equipados para medir parámetros no fluorescentes, tales como volumen celular o luz dispersada por la célula a medida que pasa a través del haz de láser. El volumen celular es habitualmente una medición directa. Los PMTs de dispersión de luz detectan la luz dispersada por la célula o bien en un ángulo frontal (dispersión frontal; FSC) o bien en un ángulo recto (dispersión lateral; SSC). La FSC es habitualmente un índice del tamaño, mientras que la SSC es un índice de la complejidad celular, aunque ambos parámetros pueden verse influidos por otros factores.

Preferiblemente, el citómetro de flujo está equipado con más de un detector de emisión de PMT. Los PMTs adicionales pueden detectar otras longitudes de onda de emisión, permitiendo la detección simultánea de más de un fluorocromo, cada uno en canales individuales independientes. Los ordenadores permiten el análisis de cada canal o la correlación de cada parámetro entre sí. Los fluorocromos que se usan normalmente con aparatos de FACS incluyen isotiocianato de fluoresceína (FITC), que tiene un pico de emisión a 525 nm (verde), R-ficoeritrina (PE), que tiene un pico de emisión a 575 nm (naranja-rojo), yoduro de propidio (PI), que tiene un pico de emisión a 620 nm (rojo), 7-aminoactinomicina D (7-AAD), que tiene un pico de emisión a 660 nm (rojo), R-ficoeritrina Cy5 (RPE-Cy5), que tiene un pico de emisión a 670 nm (rojo) y aloficocianina (APC), que tiene un pico de emisión a 655-750 nm (rojo oscuro).

Estos y otros tipos de aparatos de FACS pueden tener la capacidad adicional de separar físicamente las diversas fracciones, desviando las células con propiedades diferentes en recipientes distintos.

De acuerdo con la presente divulgación, también se puede usar cualquier otro método para aislar la población CD45+ VEGFR+ de un material de partida, tal como médula ósea, sangre periférica o sangre del cordón umbilical. Las diversas subpoblaciones (por ejemplo, CD14+, Tie2+, CD144-) de la presente divulgación pueden aislarse de maneras similares.

O bien antes o bien después de purificar las poblaciones celulares brutas tal y como se ha descrito anteriormente, la población de células progenitoras puede concentrarse adicionalmente mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células progenitoras pueden enriquecerse mediante selección positiva frente a uno o más antígenos característicos de las EPCs. Tales antígenos incluyen, por ejemplo, CD14 o Tie-2.

En un aspecto, se extrae sangre directamente de la sangre periférica circulante de un donante. La sangre se somete a una percolación continua a través de una columna que contiene la molécula de unión unida a la fase sólida, tal como un anticuerpo de VEGFR-2, para capturar las EPCs. Se devuelve inmediatamente la sangre con agotamiento de las células progenitoras al sistema circulatorio del donante mediante métodos conocidos en la técnica, tales como hemaféresis. Se procesa la sangre de esa manera hasta que se une un número suficiente de células progenitoras a la columna. Después se aíslan las células madre de la columna mediante métodos conocidos en la técnica. Este método permite recoger células progenitoras de la sangre periférica poco frecuentes a partir de un volumen muy grande de sangre, evitándole al donante el gasto y el dolor de extraer médula ósea y los riesgos asociados de anestesia, analgesia, transfusión de sangre e infección.

Las EPCs se cultivan y proliferan usando los métodos descritos en el presente documento. Se obtienen células de las sangre periférica aislando células mononucleares de la sangre periférica (PBMCs) mediante centrifugación con gradiente de densidad.

Se siembran suspensiones celulares en cualquier receptáculo capaz de sustentar células, particularmente matraces de cultivo, placas de cultivo o matraces rotatorios, y más particularmente en matraces de cultivo pequeños tales como matraces de cultivo de 25 cm2. Se vuelven a suspender las células cultivadas en suspensión al llegar a aproximadamente 5x104 a 2x105 células/mL (por ejemplo, 1x105 células/mL). Las células sembradas en placa sobre un sustrato fijo se siembran con aproximadamente 2-3x103 células/cm2. Opcionalmente, se recubren las placas de cultivo con una proteína matricial tal como colágeno. Las células pueden colocarse en cualquier medio de cultivo conocido capaz de favorecer el crecimiento celular, incluyendo HEM, DMEM, RPMI, F-12 y similares, que contiene complementos que se requieren para el metabolismo celular tales como glutamina y otros aminoácidos, vitaminas, minerales y proteínas tales como transferrina y similares. El medio de cultivo también puede contener antibióticos para evitar una contaminación con levaduras, bacterias y hongos, tales como penicilina, estreptomicina, gentamicina y similares. El medio de cultivo puede contener suero obtenido a partir de animales bovinos, equinos, pollos y similares.

Las condiciones del cultivo deben ser cercanas a las condiciones fisiológicas. El pH del medio de cultivo debe ser cercano al pH fisiológico (por ejemplo, entre pH 6-8, entre aproximadamente pH 7 y 7,8, o a pH 7,4). Las temperaturas fisiológicas oscilan entre aproximadamente 30°C y 40°C. Las EPCs se cultivan a temperaturas entre aproximadamente 32°C y aproximadamente 38°C (por ejemplo, entre aproximadamente 35°C y aproximadamente 37°C).

Opcionalmente, el medio de cultivo se complementa con al menos un factor de crecimiento inductor de la proliferación (“mitogénico”). Un “factor de crecimiento” es una proteína, un péptido u otra molécula que tiene un efecto inductor del crecimiento, de la proliferación, inductor de la diferenciación o trófico sobre las EPCs. Los “factores de crecimiento que inducen la proliferación” son factores tróficos que permiten que las EPCs proliferen, incluyendo cualquier molécula que se une a un receptor sobre la superficie de la célula para ejercer un efecto trófico o inductor del crecimiento sobre la célula. Los factores de crecimiento inductores de la proliferación incluyen EGF, anfiregulina, factor de crecimiento de fibroblastos ácido (aFGF o FGF-1), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF o FGF-2), factor de crecimiento transformante alfa (TGFa), VEGF y combinaciones de los mismos. Habitualmente se añaden factores de crecimiento al medio de cultivo en concentraciones que oscilan entre aproximadamente 1 fg/mL y 1 mg/mL. Concentraciones entre aproximadamente 1 y 100 ng/mL son habitualmente suficientes. Pueden realizarse fácilmente ensayos de titulación simples para determinar la concentración óptima de un factor de crecimiento particular.

Los efectos biológicos de factores de crecimiento y tróficos están generalmente mediados a través de la unión a receptores de la superficie celular. Se han identificado receptores para varios de esos factores y están disponibles anticuerpos y sondas moleculares para receptores específicos. Las EPCs pueden analizarse para determinar la presencia de receptores de factor de crecimiento en todas las fases de diferenciación. En muchos casos, la identificación de un receptor particular proporciona una orientación para la estrategia que va a usarse en la diferenciación adicional de las células a lo largo de rutas de desarrollo específicas, con la adición de factores de crecimiento o tróficos exógenos.

Generalmente, después de aproximadamente 3-10 díasin vitro, se repone el medio de cultivo de las EPCs aspirando el medio y añadiendo medio nuevo al matraz de cultivo. Opcionalmente, se recoge el medio aspirado, se filtra y se usa como medio condicionado para someter posteriormente las EPCs a los pases. Por ejemplo, se usa el medio condicionado al 10%, 20%, 30%, 40% o más.

El cultivo celular de las EPCs puede someterse fácilmente a pases para reiniciar la proliferación. Por ejemplo, después de 3-7 díasin vitro,se agitan bien los matraces de cultivo y después se transfieren las EPCs a un tubo de centrífuga de 50 mL y se centrifugan a baja velocidad. Se aspira el medio, se resuspenden las EPCs en una pequeña cantidad de medio de cultivo. Después se cuentan las células y se vuelven a sembrar en placa con la densidad deseada para reiniciar la proliferación. Este procedimiento puede repetirse semanalmente para dar como resultado un aumento logarítmico del número de células viables en cada pase. El procedimiento continúa hasta que se obtiene el número deseado de EPCs.

Las EPCs y la progenie de EPCs se pueden crioconservar mediante cualquier método conocido en la técnica, hasta que se necesiten (véanse, por ejemplo, los documentos de patente estadounidense n° 5.071.741, solicitudes de patente internacional PCT WO93/14191, WO95/07611, WO96/27287, WO96/29862 y WO98/14058, Karlsson et al., 65 Biophysical J. 2524-2536 (1993)). Las EPCs pueden suspenderse en una solución isotónica, preferiblemente un medio de cultivo celular, que contiene un crioconservante particular. Tales crioconservantes incluyen dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol y similares. Estos crioconservantes se usan con una concentración del 5-15% (por ejemplo, 8-10%). Las células se congelan gradualmente hasta una temperatura de -10°C a -150°C (por ejemplo, de -20°C a -100°C, o de -70°C a -80°C).

F. Modificación genética de las células

En un aspecto, las células de la presente divulgación, MSCs y/o EPCs, se modifican genéticamente. En un aspecto, tal modificación genética potencia la actividad terapéutica de las células. Ejemplos no limitativos de esa modificación incluyen la expresión o activación potenciadas de una óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), hemo oxigenasa (HMOX1) y prostaciclina sintasa (PTGIS).

En un aspecto, la célula se transforma con un ácido nucleico que aumenta la expresión de la actividad biológica de una proteína seleccionada a partir del grupo que consiste en óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), hemo oxigenasa (HMOX1) y prostaciclina sintasa (PTGIS). En un aspecto, el ácido nucleico codifica la proteína.

En algunos aspectos, las células se modifican genéticamente para producir una proteína heteróloga. Algunas veces, las células se modificarán genéticamente de tal manera que la proteína heteróloga se secreta desde las células. Sin embargo, en un aspecto, las células pueden modificarse para expresar un polinucleótido funcional que no codifica una proteína tal como ARNbc (normalmente para el silenciamiento de ARN), un oligonucleótido antisentido o un ácido nucleico catalítico (tal como una ribozima o enzima de ADN).

Las células genéticamente modificadas se pueden cultivar en presencia de al menos una citocina en una cantidad suficiente para favorecer el crecimiento de las células modificadas. Las células genéticamente modificadas así obtenidas se pueden usar inmediatamente (por ejemplo, en trasplante), cultivar y expandirin vitro,o almacenar para usos posteriores. Las células modificadas pueden almacenarse mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, congeladas en nitrógeno líquido.

La modificación genética tal como se usa en el presente documento, incluye cualquier método de modificación genética que implique la introducción de un polinucleótido exógeno o foráneo en una célula descrita en el presente documento o la modificación de un gen endógeno dentro de la célula. Una modificación genética incluye, pero no se limita a, transducción (transferencia mediada por un virus de ADN desde un hospedador o donante hasta un receptor, bienin vitrooin vivo),transfección (transformación de células con genomas de ADN vírico aislado), transferencia mediada por liposoma, electroporación, transfección o coprecipitación con fosfato de calcio y otras. Los métodos de transducción incluyen el cultivo conjunto directo de células con células productoras (Bregni et al., 1992) o el cultivo con material sobrenadante vírico solo con o sin factores de crecimiento y policationes apropiados.

Preferiblemente se introduce un polinucleótido exógeno en la célula en un vector. El vector incluye preferiblemente los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. En la técnica se conocen bien métodos usados para construir tales vectores. Por ejemplo, se describen en detalle técnicas para construir vectores de expresión adecuados en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (3a ed., 2000); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1999).

Los vectores pueden incluir, pero no se limitan a, vectores víricos, tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados y virus del herpes simple; cósmidos; vectores de plásmidos; vectores sintéticos; y otros vehículos de recombinación usados normalmente en la técnica. En la técnica se conocen bien vectores que contienen tanto un promotor como un sitio de clonación en el que se puede ligar funcionalmente un polinucleótido. Tales vectores son capaces de transcribir ARNin vitrooin vivo,y están comercialmente disponibles en fuentes tales como Stratagene (La Jolla, Calif.) y Promega Biotech (Madison, Wis.). Ejemplos específicos incluyen, pSG, pSV2CAT, pXtl de Stratagene; y pMsG, pSVL, pBPV y psVK3 de Pharmacia.

Los vectores pueden incluir vectores retrovirales (véase, Coffin et al., “Retroviruses”, capítulo 9, págs. 437-473, Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1997). Los vectores útiles en la divulgación se pueden producir de manera recombinante mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los documentos WO94/29438, WO97/21824 y WO97/21825 describen la construcción de plásmidos de empaquetamiento retroviral y líneas celulares de empaquetamiento. Los vectores a modo de ejemplo incluyen los vectores de expresión en mamífero de pCMV, tales como pCMV6b y pCMV6c (Chiron Corp.), pSFFV-Neo y pBluescript-Sk+. Ejemplos no limitativos de vectores retrovirales útiles son los obtenidos a partir de retrovirus murinos, aviares o de primates. Los vectores retrovirales comunes incluyen los basados en el virus de la leucemia murina de Moloney (vector VLMMo). Otros vectores derivados de VLMMo incluyen Lmily, LINGFER, MINGFR y MINT. Los vectores adicionales incluyen los basados en el virus de la leucemia del gibón (GAIN) y el virus del sarcoma murino de Moloney (VSMMo) y el virus formador de focos esplénicos (VFFE). Los vectores obtenido a partir del virus de células madre murinas (VCCM) incluyen MESV-MiLy. Los vectores retrovirales también incluyen vectores basados en lentivirus, y ejemplos no limitativos incluyen vectores basados en virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2).

En la producción de estructuras artificiales de vectores retrovirales, las secuencias gag, pol y env virales se pueden eliminar del virus, creando espacio para la inserción de secuencias de ADN foráneo. Los genes codificados por un ADN foráneo se expresan habitualmente bajo el control de un promotor viral fuerte en la repetición terminal larga (LTR). La selección de secuencias reguladoras de control apropiadas depende de la célula hospedadora usada y la selección se encuentra dentro de las capacidades de un experto en la técnica. Se conocen numerosos promotores además del promotor de la LTR. Ejemplos no limitativos incluyen el promotor del fago lambda PL, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV); el promotor de la región U3 del virus del sarcoma murino de Moloney (VSMMo), virus del sarcoma de Rous (VSR) o virus formador de focos esplénicos (VFFE); el promotor de granzima A; y el promotor de granzima B. Adicionalmente, se pueden usar elementos de control inducibles o múltiples. La selección de un promotor adecuado resultará evidente para los expertos en la técnica.

Una estructura artificial de ese tipo se puede empaquetar de manera eficaz dentro de partículas virales si las funciones de gag, pol y env se proporcionan en trans mediante una línea celular de empaquetamiento. Por tanto, cuando se introduce la estructura artificial del vector en la célula de empaquetamiento, las proteínas gag-pol y env producidas por la célula se ensamblan con el ARN del vector para producir viriones infecciosos que se secretan en el medio de cultivo. El virus así producido puede infectar e integrarse en el ADN de la célula diana, pero no produce partículas virales infecciosas ya que carece de secuencias de empaquetamiento esenciales. La mayoría de las líneas celulares de empaquetamiento actualmente en uso han sido transfectadas con plásmidos distintos, en donde cada uno contiene una de las secuencias codificantes necesarias, de modo que se necesitan múltiples acontecimientos de recombinación antes de poder producir un virus competente para la replicación. Alternativamente, la línea celular de empaquetamiento alberga un provirus. El provirus se ha paralizado de modo que aunque puede producir todas las proteínas requeridas para ensamblar virus infecciosos, su propio ARN no puede empaquetarse en un virus. En vez de eso, se empaqueta el ARN producido por el virus recombinante. Por tanto, la reserva de virus liberada desde las células de empaquetamiento solo contiene virus recombinante. Ejemplos no limitativos de líneas de empaquetamiento retrovirales incluyen PA12, PA317, PE501, PG13, PSI.CRIP, RDI 14, GP7C-tTA-G10, ProPak-A (PPA-6) y PT67.

Otros vectores adecuados incluyen vectores adenovirales (véase el documento WO 95/27071) y vectores virales adenoasociados. Todos esos vectores se conocen bien en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en Stem Cell Biology and Gene Therapy, compiladores Quesenberry et al., John Wiley & Sons, 1998; y los documentos de patentes estadounidenses n° 5.693.531 y 5.691.176. El uso de vectores obtenidos a partir de adenovirus puede ser ventajoso en una determinada situación porque no son capaces de infectar células que no se dividen. A diferencia del ADN retroviral, el ADN adenoviral no se integra en el genoma de la célula diana. Además, la capacidad para transportar ADN foráneo es mucho mayor en los vectores adenovirales que en los vectores retrovirales. Los vectores virales adenoasociados son otro sistema de administración útil. El ADN de ese virus puede integrarse en células que no se dividen, y se han introducido satisfactoriamente varios polinucleótidos en diferentes tipos de células usando vectores virales adenoasociados.

En algunos aspectos, la estructura artificial o el vector incluirá dos o más secuencias de polinucleótidos heterólogos.

Preferiblemente la secuencia de ácido nucleico adicional es un polinucleótido que codifica un marcador selectivo, un gen estructural, un gen terapéutico o un gen de citocina/quimiocina.

Se puede incluir un marcador selectivo en la estructura artificial o el vector con el fin de realizar un seguimiento de la modificación genética exitosa y para la selección de células en las que se ha integrado un ADN. Ejemplos no limitativos incluyen marcadores de resistencia a fármacos, tales como G148 o higromicina. Adicionalmente se puede usar una selección negativa, por ejemplo en la que el marcador es el gen de HSV-tk. Ese gen hará que las células sean sensibles a agentes tales como aciclovir y ganciclovir. Habitualmente se usa el gen NeoR (resistencia a neomicina/G148), pero se puede usar cualquier gen marcador conveniente cuyas secuencias génicas no estén ya presentes en la célula diana. Ejemplos no limitativos adicionales incluyen el factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (NGFR), la proteína verde fluorescente potenciada (EFGP), el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR), el gen bacteriano hisD, CD24 murino (HSA), CD8a(lyt) murino, genes bacterianos que confieren resistencia a puromicina o fleomicina, y beta-glactosidasa.

La(s) secuencia(s) de polinucleótidos adicional(es) puede(n) introducirse en la célula en el mismo vector o puede(n) introducirse en las células hospedadoras en un segundo vector. En un aspecto preferido, se incluirá un marcador selectivo en el mismo vector que el polinucleótido.

La presente divulgación también incluye modificar genéticamente la región promotora de un gen endógeno de tal manera que se regula al alza la expresión del gen endógeno dando como resultado el aumento de la producción de la proteína codificada en comparación con una célula de tipo natural.

G. Composiciones farmacéuticas y métodos de administración

Un aspecto de la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula madre mesenquimatosa (MSC) o un medio de cultivo condicionado de MSC y una prostaciclina y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la composición comprende además una célula progenitora endotelial (EPC).

En un aspecto, la composición farmacéutica comprende además al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión “farmacéuticamente aceptable” se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, de manera proporcional a una razón de riesgo/beneficio razonable. La expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” tal como se usa en el presente documento, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un material que encapsula una carga líquida o sólida, un diluyente, un excipiente o un disolvente.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina, soluciones acuosas de tampón, disolventes y/o medios de dispersión. El uso de tales vehículos se conoce bien en la técnica. La solución es preferiblemente estéril y fluida en la medida en que existe la capacidad para pasar a través de una aguja. Preferiblemente, la solución es estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conserva frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos mediante el uso, por ejemplo, de parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares.

Algunos ejemplos de materiales y soluciones que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) goma tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de semilla de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua exenta de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones con pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

Las composiciones farmacéuticas útiles para los métodos de la divulgación pueden comprender un vehículo polimérico o una matriz extracelular.

Una variedad de materiales de matriz sólida biológica o sintética (es decir, matrices sólidas de soporte, apósitos o adhesivos biológicos y estructuras biológicas/médicas) son adecuados para el uso en esta divulgación. Preferiblemente el material de matriz es médicamente aceptable para uso en aplicacionesin vivo.Ejemplos no limitativos de tales materiales médicamente aceptables y/o biológica o fisiológicamente aceptables o compatibles incluyen, pero no se limitan a, materiales de matriz sólida que se pueden absorber y/o no se pueden absorber, tales como submucosa del intestino delgado (SIS), por ejemplo, de origen porcino (y otras fuentes de SIS); alginato reticulado o no reticulado, hidrocoloide, espumas, gel de colágeno, esponja de colágeno, malla de poli(ácido glicólico) (PGA), malla de poliglactina (PGL), lana, apósito de espuma, bioadhesivos (por ejemplo, adhesivo de fibrina y gel de fibrina) y equivalentes de piel desepidermizada muerta en una o más capas.

Los adhesivos de fibrina son una clase de sellantes quirúrgicos que se han usado en diversos entornos clínicos. Tal como conocerá el experto, numerosos sellantes son útiles en composiciones para uso en los métodos de la divulgación. Sin embargo, un aspecto preferido de la divulgación se refiere al uso de adhesivos de fibrina con las células descritas en el presente documento.

Cuando en el presente documento se usa la expresión “adhesivo de fibrina”, se refiere a la matriz insoluble formada por la reticulación de polímeros de fibrina en presencia de iones de calcio. El adhesivo de fibrina puede formarse a partir de fibrinógeno o un derivado o metabolito del mismo, fibrina (monómeros o polímeros solubles) y/o complejos de la misma obtenidos a partir de tejido o líquido biológico que forma una matriz de fibrina. Alternativamente, el adhesivo de fibrina puede formarse a partir de fibrinógeno, o un derivado o metabolito del mismo, o fibrina, producida mediante tecnología de ADN recombinante.

El adhesivo de fibrina también puede formarse mediante la interacción de fibrinógeno y un catalizador de la formación de adhesivo de fibrina (tal como trombina y/o factor XIII). Tal como apreciarán los expertos en la técnica, el fibrinógeno se escinde proteolíticamente en presencia de un catalizador (tal como trombina) y se convierte en un monómero de fibrina. Los monómeros de fibrina pueden entonces formar polímeros que pueden reticularse para formar una matriz de adhesivo de fibrina. La reticulación de polímeros de fibrina puede potenciarse por la presencia de un catalizador tal como el factor XIII. El catalizador de la formación de adhesivo de fibrina se puede obtener a partir de plasma sanguíneo, crioprecipitado u otras fracciones de plasma que contienen fibrinógeno o trombina. Alternativamente, el catalizador puede producirse mediante tecnología de ADN recombinante.

La tasa a la que se forma el coágulo depende de la concentración de trombina mezclada con fibrinógeno. Al ser una reacción dependiente de enzima, cuanto mayor es la temperatura (hasta 37 grados centígrados) más rápida es la tasa de formación del coágulo. La resistencia a la tracción del coágulo depende de la concentración del fibrinógeno usado.

El uso de adhesivo de fibrina y los métodos para su preparación y el uso se describen en el documento de patente estadounidense n° 5.643.192. El documento de patente estadounidense n° 5.643.192 describe la extracción de componentes de fibrinógeno y trombina a partir de un único donante, y la combinación de solo esos componentes para uso como adhesivo de fibrina. El documento de patente estadounidense n° 5.651.982 describe otra preparación y método de uso para adhesivo de fibrina. El documento de patente estadounidense n° 5.651.982 proporciona un adhesivo de fibrina con liposomas para uso como sellante tópico en mamíferos.

Varias publicaciones describen el uso de adhesivo de fibrina para la administración de agentes terapéuticos. Por ejemplo, el documento de patente estadounidense n° 4.983.393 describe una composición para uso como inserto intravaginal que comprende agarosa, agar, solución salina, glucosaminoglucanos, colágeno, fibrina y una enzima. Además, el documento de patente estadounidense n° 3.089.815 describe una preparación farmacéutica inyectable compuesta por fibrinógeno y trombina, y el documento de patente estadounidense n° 6.468.527 describe un adhesivo de fibrina que facilita la administración de diversos agentes biológicos y no biológicos a sitios específicos dentro del organismo. Tales procedimientos se pueden usar en los métodos de la divulgación.

Los vehículos poliméricos adecuados incluyen mallas o esponjas porosas formadas por polímeros sintéticos o naturales, así como soluciones de polímeros. Una forma de matriz es una malla o una esponja polimérica; la otra es un hidrogel polimérico. Los polímeros naturales que se pueden usar incluyen proteínas tales como colágeno, albúmina y fibrina; y polisacáridos tales como alginato y polímeros de ácido hialurónico. Los polímeros sintéticos incluyen polímeros tanto biodegradables como no biodegradables. Ejemplos de polímeros biodegradables incluyen polímeros de ácidos hidroxílicos tales como poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA) y poli(ácido láctico-glicólico) (PLGA), poliortoésteres, polianhídridos, polifosfacenos y combinaciones de los mismos. Los polímeros no biodegradables incluyen poliacrilatos, polimetacrilatos, etileno-acetato de vinilo y poli(alcoholes vinílicos).

Se usan polímeros que pueden formar hidrogeles reticulados de forma covalente o iónicos que son maleables para encapsular células. Un hidrogel es una sustancia formada cuando se reticula un polímero orgánico (natural o sintético) mediante enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno para crear una estructura reticular abierta tridimensional que atrapa moléculas de agua para formar un gel. Ejemplos de materiales que se pueden usar para formar un hidrogel incluyen polisacáridos tales como alginato, polifosfacinas y poliacrilatos, que están iónicamente reticulados, o copolímeros en bloque tales como Pluronics™ o Tetronics™, copolímeros en bloque de poli(óxido de etileno)-polipropilenglicol que se reticulan por temperatura o pH, respectivamente. Otros materiales incluyen proteínas tales como fibrina, polímeros tales como polivinilpirrolidona, ácido hialurónico y colágeno.

En general, esos polímeros son al menos parcialmente solubles en soluciones acuosas, tales como agua, soluciones salinas tamponadas o soluciones acuosas de alcohol, que tienen grupos laterales cargados, o una sal iónica monovalente de los mismos. Ejemplos de polímeros con grupos laterales ácidos que pueden reaccionar con cationes son polifosfacenos, poli(ácidos acrílicos), poli(ácidos metacrílicos), copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, poli(acetato de vinilo) y polímeros sulfonados, tales como poliestireno sulfonado. También se pueden usar copolímeros que tienen grupos laterales ácidos formados mediante reacción de ácido acrílico o metacrílico y monómeros o polímeros de vinilo. Ejemplos de grupos ácidos son grupos ácido carboxílico, grupos ácido sulfónico, grupos alcohol halogenado (preferiblemente fluorado), grupos OH fenólico y grupos OH ácido. Ejemplos de polímeros con grupos laterales básicos que pueden reaccionar con aniones son polivinilaminas, polivinilpiridina, polivinilimidazol, y algunos polifosfacenos sustituidos con imino. La sal de amonio o cuaternaria de los polímeros también puede formarse a partir de los nitrógenos de la estructura principal o grupos imino colgantes. Ejemplos de grupos laterales básicos son grupos amino e imino.

Además, una composición usada para un método de la divulgación puede comprender al menos un agente terapéutico. Por ejemplo, la composición puede contener un analgésico para ayudar en el tratamiento de inflamación o dolor, o un agente antiinfeccioso para prevenir una infección del sitio tratado con la composición. Más específicamente, ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos útiles incluyen las siguientes categorías terapéuticas: analgésicos, tales como fármacos antiinflamatorios no esteroideos, agonistas opiáceos y salicilatos; agentes antiinfecciosos, tales como antihelmínticos, antianaerobios, antibióticos, antibióticos de aminoglicósido, antibióticos antifúngicos, antibióticos de cefalosporina, antibióticos de macrólidos, diversos antibióticos de beta-lactama, antibióticos de penicilina, antibióticos de quinolona, antibióticos de sulfonamida, antibióticos de tetraciclina, antimicobacterianos, antimicobacterianos antituberculosis, antiprotozoarios, antiprotozoarios antimalaria, agentes antivirales, agentes antirretrovirales, escabicidas, agentes antiinflamatorios, agentes antiinflamatorios corticosteroides, antipruriginosos/anestésicos locales, antiinfecciosos tópicos, antiinfecciosos tópicos antifúngicos, antiinfecciosos tópicos antivirales; agentes electrolíticos y renales, tales como agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, diuréticos, diuréticos inhibidores de anhidrasa carbónica, diuréticos del asa, diuréticos osmóticos, diuréticos ahorradores de potasio, diuréticos de tiazida, reponedores de electrolitos, y agentes uricosúricos; enzimas, tales como enzimas pancreáticas y enzimas trombolíticas; agentes gastrointestinales, tales como antidiarreicos, agentes antiinflamatorios gastrointestinales, agentes antiinflamatorios gastrointestinales, agentes antiulcerosos antiácidos, agentes antiulcerosos inhibidores de la bomba de ácido gástrico, agentes antiulcerosos de la mucosa gástrica, agentes antiulcerosos bloqueadores H2, agentes colelitolíticos, digestivos, eméticos, laxantes y laxantes emolientes, y agentes procinéticos; anestésicos generales, tales como anestésicos por inhalación, anestésicos por inhalación halogenados, anestésicos intravenosos, anestésicos intravenosos de barbiturato, anestésicos intravenosos de benzodiazepina, y anestésicos intravenosos de agonistas opiáceos; hormonas y modificadores de hormonas, tales como abortivos, agentes suprarrenales, agentes suprarrenales corticosteroides, andrógenos, antiandrógenos, agentes inmunobiológicos, tales como inmunoglobulinas, inmunosupresores, toxoides y vacunas; anestésicos locales, tales como anestésicos locales de amida y anestésicos locales de éster; agentes musculoesqueléticos, tales como agentes antiinflamatorios antigota, agentes antiinflamatorios corticosteroides, agentes antiinflamatorios de compuestos de oro, agentes antiinflamatorios inmunosupresores, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), agentes antiinflamatorios de salicilato, minerales; y vitaminas, tales como vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina D, vitamina E y vitamina K.

Las composiciones útiles para los métodos de la presente divulgación pueden incluir componentes de cultivo celular, por ejemplo, medios de cultivo que incluyen aminoácidos, metales, factores coenzimáticos, así como pequeñas poblaciones de otras células, por ejemplo, algunas de las cuales pueden surgir por una posterior diferenciación de las células madre.

Las composiciones útiles para los métodos de la presente divulgación se pueden preparar, por ejemplo, separando por sedimentación las células objeto del medio de cultivo y volviendo a suspenderlas en la solución o el material deseado. Las células se pueden sedimentar y/o sacar fuera del medio de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación, filtración, ultrafiltración, etc.

El experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad de células y vehículo(s) opcional(es) en las composiciones y que van a administrarse en métodos de la divulgación. En un aspecto, cualquier aditivo (además de la(s) célula(s) activa(s)) está presente en una cantidad de solución del 0,001 al 50% (peso) en solución salina tamponada con fosfato, y el principio activo está presente en el orden de microgramos a miligramos, tal como de aproximadamente el 0,0001 a aproximadamente el 5% en peso, preferiblemente de aproximadamente el 0,0001 a aproximadamente el 1% en peso, todavía más preferiblemente de aproximadamente el 0,0001 a aproximadamente el 0,05% en peso o de aproximadamente el 0,001 a aproximadamente el 20% en peso, preferiblemente de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 10% en peso, y todavía más preferiblemente de aproximadamente el 0,05 a aproximadamente el 5% en peso. Evidentemente, para cualquier composición que va a administrarse a un animal o ser humano, y para cualquier método de administración particular, se prefiere determinar por tanto: la toxicidad, tal como determinando la dosis letal (DL) y DL50 en un modelo animal adecuado, por ejemplo, roedor tal como ratón; y la dosificación de la(s) composición/composiciones, la concentración de componentes en la(s) misma(s) y el momento de la administración de la(s) composición/composiciones, que provocan una respuesta adecuada. Tales determinaciones no requieren una experimentación excesiva basada en el conocimiento del experto, esta divulgación y los documentos citados en el presente documento. Y el tiempo para las administraciones secuenciales puede determinarse sin una experimentación excesiva.

Las composiciones útiles para los métodos de la presente divulgación pueden administrarse, entre otras cosas, mediante inyección localizada, incluyendo administración con catéter, inyección sistémica, inyección localizada, inyección intravenosa, inyección intrauterina o administración parenteral. Cuando se administra una composición terapéutica descrita en el presente documento (por ejemplo, una composición farmacéutica), generalmente se formulará en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, emulsión).

Según un aspecto de la presente divulgación, las composiciones pueden administrarse junto con al menos otro medicamento para la vasculopatía, que comprende prostaglandina I2 (PGI2), análogos de prostaciclina, inhibidor de fosfodiesterasa-5 (PDE-5), antagonista de receptor de endotelina (ETRA), inhibidores de tirosina cinasa y estimulante de guanilato ciclasa soluble.

Según un aspecto de la presente divulgación, el método para tratar la vasculopatía puede comprender además reducir la trombosis en las arterias pulmonares; reducir la inflamación en las arterias pulmonares; reducir la proliferación del músculo liso de la íntima en las arterias pulmonares; reducir la formación de lesiones plexiformes en las arterias pulmonares; aumentar la cantidad de óxido nítrico en las arterias pulmonares; aumentar la cantidad de PGI2 en las arterias pulmonares; reducir el nivel de endotelina-1 en las arterias pulmonares; reducir la cantidad de factores de crecimiento en las arterias pulmonares; o fomentar una morfología endotelial apropiada en las arterias pulmonares.

En Wang et al., J. Am. Coll. Cardiol. 49:1566-71 (2007), Zhao et al. Circ. Res. 96:442-450 (2005) y Nagaya et al., Circulation 108:889-895(2003) se describe el tratamiento de la vasculopatía mediante administración/trasplante de células progenitoras.

La administración/trasplante de células en los vasos sanguíneos dañados tiene el potencial de reparar el tejido vascular dañado, por ejemplo, venas, arterias, capilares, restaurando así la función vascular. Sin embargo, la ausencia de células adecuadas para los fines de un trasplante ha impedido desarrollar todo el potencial de este procedimiento. Las células “adecuadas” son células que cumplen uno o más de los siguientes criterios: (1) pueden obtenerse en grandes cantidades; (2) pueden proliferarin vitropara permitir la inserción de material genético, si es necesario; (3) son capaces de sobrevivir indefinidamente y facilitar la reparación vascular en el trasplante; y (4) no son inmunogénicas, preferiblemente se obtienen a partir de tejido del propio paciente o de un donante compatible. Las células adecuadas pueden ser autólogas, alogénicas o xenogénicas.

Las células pueden administrarse a un sujeto con un sistema vascular anómalo o síntomas de insuficiencia coronaria. Las células pueden prepararse a partir de la sangre o la médula ósea del propio receptor. En tales casos, las EPCs pueden generarse a partir de tejido disociado y proliferarin vitrousando los métodos descritos anteriormente. Tras una expansión adecuada de la cantidad de células, las EPCs se pueden recoger, modificar genéticamente si es necesario, y preparar para una inyección directa en el sistema vascular del receptor.

Las células pueden prepararse a partir de tejido de un donante que es xenogénico con respecto al hospedador. Para que los xenoinjertos sean satisfactorios, habitualmente se emplea algún método de reducción o eliminación de la respuesta inmunitaria frente al tejido implantado. Por tanto, se puede inmunosuprimir a los receptores, o bien mediante el uso de fármacos inmunosupresores tales como ciclosporina, o bien mediante estrategias de inmunosupresión local que emplean inmunosupresores aplicados de manera local. La inmunosupresión local está descrita por Gruber, 54 Transplantation 1-11 (1992). El documento de patente estadounidense n° 5.026.365 describe métodos de encapsulación adecuados para una inmunosupresión local.

Como alternativa al empleo de técnicas de inmunosupresión, se pueden aplicar métodos de sustitución génica o desactivación génica usando recombinación homóloga en células madre embrionarias, descritos por Smithies et al., 317 Nature 230-234 (1985), y ampliados a una sustitución o desactivación génica en líneas celulares (Zheng et al., 88 Proc. Natl. Acad. Sci. 8067-8071 (1991)), a las EPCs para la ablación de genes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Las EPCs que carecen de expresión del MHC permiten el injerto de poblaciones de células endoteliales enriquecidas a través de barreras de histocompatibilidad alogénica, y quizás incluso xenogénica, sin la necesidad de inmunosuprimir al receptor. Gruber, 54 Transplantation 1-11 (1992) también describe revisiones generales y citas para el uso de métodos recombinantes para reducir la antigenicidad de las células de un donante. Los documentos de solicitud de patente internacional PCT WO 92/04033 y PCT/US99/24630 describen enfoques a modo de ejemplo para la reducción de la inmunogenicidad de trasplantes mediante una modificación de la superficie. Alternativamente, la inmunogenicidad del injerto puede reducirse preparando las EPCs a partir de un animal transgénico que tiene antígenos de MHC alterados o delecionados.

Las células se pueden encapsular y usar para administrar factores al hospedador, según tecnologías de encapsulación conocidas, que incluyen microencapsulación (véanse, por ejemplo, los documentos de patentes estadounidenses n° 4.352.883; 4.353.888; y 5.084.350) y macroencapsulación (véanse, por ejemplo, los documentos de patentes estadounidenses n° 5.284.761, 5.158.881, 4.976.859 y 4.968.733 y de las solicitudes de patente internacional PCT WO 92/19195 y WO 95/05452). La macroencapsulación se describe en los documentos de patentes estadounidenses n25.284.761; 5.158.881; 4.976.859; 4.968.733; 5.800.828 y la solicitud de patente internacional PCT WO 95/05452. Se pueden implantar múltiples dispositivos de macroencapsulación en el hospedador.

Las células preparadas a partir de un tejido que es alogénico con respecto al del receptor, pueden someterse a ensayo para determinar el uso mediante métodos bien conocidos de tipificación tisular, para que coincidan estrechamente con el tipo de histocompatibilidad del receptor.

Las células administradas al sistema vascular pueden formar un injerto vascular, de modo que las células forman conexiones normales con células vasculares circundantes, manteniendo el contacto con células endoteliales trasplantadas o existentes. Por tanto, las células trasplantadas pueden restablecer el tejido vascular que se ha dañado debido a enfermedad y envejecimiento.

Una integración funcional del injerto en el tejido vascular del hospedador puede evaluarse examinando la eficacia de los injertos sobre la restauración de diversas funciones.

Según un aspecto de la presente divulgación, las células se pueden coadministrar al receptor con al menos un factor de crecimiento, tal como FGF, VEGF-A, VEGF-B, BMP-4, TGF-beta, etc.

Ejemplos

Ejemplo 1. Optimización de la concentración de treprostinilo para la respuesta celular en BM-MSC

Este ejemplo identifica las concentraciones mínimas de treprostinilo requeridas para mejorar el potencial angiogénico de las células madre mesenquimatosas de la médula ósea humana (BM-MSC).

Se expandió un único vial de MSCs obtenidas a partir de médula ósea humana y se sembró en veinte (20) pocillos de placas de 6 pocillos usando un medio de crecimiento convencional. Al llegar a una confluencia del 95-99%, las células se lavaron exhaustivamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después se expusieron las células a medios que contenían 0, 0,1, 1,0, 10 o 100 gg/mL de treprostinilo (n=4 pocillos para cada concentración).

Tras 24 horas de cultivo, se recogieron los medios condicionados de cada réplica y se analizaron para determinar la proteína del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). El objetivo de este experimento era determinar la concentración óptima de treprostinilo necesaria para provocar una respuesta celular en MSCs (usando VEGF como lectura).

Un análisis con citometría de flujo (FIG. 1) demostraba que las MSCs de la médula ósea usadas en este estudio eran positivas para los marcadores de MSC, CD73, CD105, CD90 y HLA-ABC. Las células eran negativas o pocas para CD34, c D45, CD14, CD19 y HLA-DR. La definición de MSC se estableció por la Sociedad internacional de terapia celular (Dominici et al.,Cytotherapy8(4):315-7, 2006).

La FIG. 2 es un gráfico que muestra la secreción de VEGF por las MSCs de la médula ósea humana después de 24 horas de exposición a treprostinilo. Se sometió a ensayo el material sobrenadante del cultivo celular para determinar VEGF mediante ELISA (n=4 por grupo). Tal como se muestra en la FIG. 2, no se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa entre los grupos de dosificación (las barras de error representan la desviación estándar del grupo de prueba).

Este experimento sugiere que concentraciones de treprostinilo de 100 gg/mL o menos pueden no mejorar significativamente el potencial angiogénico de las MSCs de la médula ósea humana. Sin embargo, existe una ligera tendencia al aumento de la secreción de VEGF a medida que se incrementa el treprostinilo. Ejemplos posteriores investigaron concentraciones superiores de treprostinilo.

Ejemplo 2. Optimización de la concentración de treprostinilo para una respuesta celular en BM-MSC

Este ejemplo identifica 250 gg/mL como una buena concentración de treprostinilo para mejorar el potencial angiogénico de las BM-MSC humanas.

Se llevó a cabo un experimento de seguimiento con respecto al Ejemplo 1 para determinar si concentraciones de treprostinilo superiores a 100 gg/mL afectaban a la secreción de VEGF de las MSCs. Como anteriormente, se expandió un único vial (mismo lote/serie) de MSCs obtenidas a partir de la médula ósea en treinta (30) pocillos de placas de 6 pocillos usando un medio de crecimiento convencional. Al llegar a una confluencia del 95-99%, las células se lavaron exhaustivamente con PBS. Después las células se expusieron a medios que contenían 0, 100, 200, 300 o 400 gg/mL de treprostinilo (n=6 pocillos para cada concentración).

Se sometieron a ensayo los medios condicionados para determinar VEGF mediante ELISA, después de 24 horas de exposición a treprostinilo (n=4 réplicas). Se sometieron a lisis las células procedentes de esas réplicas y se extrajo el ARN para determinar la expresión del genVEGF-Amediante qRT-PCR. Las células de las dos (2) réplicas restantes se sometieron a tripsinización, y se sometieron a ensayo para determinar la viabilidad celular mediante exclusión con azul tripano.

Se sometió a ensayo el material sobrenadante del cultivo celular para determinar la proteína VEGF mediante ELISA (FIG. 3A, n=4). Se sometieron a ensayo lisados celulares de esos cultivos para determinar la expresión del genVEGF-Amediante qRT-PCR, y se normalizaron con respecto al valor del control (FIG. 3B, n=4). En ambas figuras, las barras de error representan la desviación estándar en cada grupo de prueba.

La FIG. 4 incluye imágenes representativas de MSCs expuestas a concentraciones crecientes de treprostinilo. Con la dosis más alta (400 gg/mL), el aumento de la cantidad de células desprendidas, redondeadas sugería un efecto citotóxico de treprostinilo sobre las MSCs.

Las MSCs se tiñeron con azul tripano para determinar el número total de células vivas y muertas en cada pocillo (FIG.

5, n=2 pocillos por grupo). Se calculó la viabilidad en porcentaje como la razón entre células negativas para azul tripano y la población total (100 x vivas/total). Aunque había demasiadas pocas réplicas como para realizar un análisis estadístico, había una tendencia a la disminución de la viabilidad a medida que aumentaba la concentración de treprostinilo por encima de 100 pg/mL. Sin embargo, la viabilidad celular no disminuía por debajo del 85% con ningún nivel de dosis sometido a prueba en este experimento.

Este ejemplo demuestra que niveles altos de treprostinilo tenían un impacto negativo sobre la viabilidad celular de las MSCs. Con 100 pg/mL, la secreción de VEGF aumentaba ~2 veces, pero la expresión del genVEGF-Ano era significativamente diferente de los controles sin tratar después de 24 horas de exposición. La expresión del genVEGF-Aaumentaba más de 5 veces con el nivel de 200 pg/mL de treprostinilo, y se observó una secreción de VEGF con ~3 veces los valores de control. La secreción de VEGF no aumentaba por encima de ese valor, ni siquiera con concentraciones superiores de treprostinilo, lo que sugiere que el efecto estaba saturado. Por tanto, se seleccionó 250 pg/mL como la concentración óptima de treprostinilo para uso en estudios posteriores.

Ejemplo 3. Análisis completo de MSCs expuestas a 250 pg/mL de treprostinilo

Basándose en los ejemplos anteriores, este ejemplo seleccionó 250 pg/mL como dosis de treprostinilo para provocar una respuesta celular en las MSCs. Esta concentración se basaba en una producción de VEGF incrementada en comparación con las células de control sin tratar y con efectos citotóxicos mínimos.

MSCs de médula ósea humanas se expandieron y se sembraron en seis (6) matraces T225 usando medio de crecimiento convencional (Tabla 1). Al llegar a una confluencia del 95-99%, las células se lavaron exhaustivamente con PBS. Se rellenaron tres (3) matraces con medios basales que contenían 250 pg/mL de treprostinilo, (+)Tre, y se rellenaron los tres (3) matraces restantes con medios basales sin complementar, (-)Tre.

Tabla 1. Diseño del estudio para evaluar los efectos de treprostinilo sobre la actividad de las MSCs.

Después de 24 horas de cultivo, se captaron imágenes representativas de los cultivos (+) Tre y (-) Tre. Se recogieron medios condicionados de cada réplica, se dividieron en dos muestras con volúmenes apropiados, y se analizaron por separado para determinar: 1) proteínas secretadas (Myriad RBM InflammationMAP® 1.0) y 2) contenido de ARN en el exosoma. Las células se sometieron a lisis directamente desde los matraces de cultivo, se procesaron para el aislamiento de ARN total y se analizaron para determinar la expresión génica mediante una micromatriz (Illumina Human HT12 Expression BeadChip).

La FIG. 6 ilustra un modelo para los efectos de treprostinilo sobre la señalización celular, la expresión génica y la liberación de factores paracrinos, y con la siguiente tabla que muestra ensayos útiles para someter a ensayo los efectos.

Para caracterizar el efecto de treprostinilo sobre las MSCs, se analizaron las células mediante qRT-PCR y en micromatriz para identificar cambios en la expresión génica (4). Se sometió a ensayo el medio de un material sobrenadante de cultivo celular para detectar citocinas inflamatorias seleccionadas mediante inmunoensayos basados en perlas (2). Se aislaron vesículas secretadas a partir del material sobrenadante del cultivo celular, y se sometieron a ensayo para determinar el contenido en ARN mediante qRT-PCR (7). También se sometieron a ensayo vesículas para determinar el tamaño y la concentración mediante detección de pulso resistivo sintonizable o TRPS (7) (véase el Ejemplo 4).

Las células que se expusieron a 250 pg/mL de treprostinilo durante 24 horas (FIG. 7A, panel derecho) no mostraron ningún cambio evidente en la morfología en comparación con las células sin tratar (FIG. 7A, panel izquierdo). Se evaluó la viabilidad celular en las células sometidas a tripsinización en cultivos, tanto tratados con treprostinilo como sin tratar. No se observó muerte celular significativa como resultado de la exposición a treprostinilo, véase la FIG. 7B (>95% de viabilidad en todas las réplicas y condiciones).

Se confirmó la expresión génica deVEGF-Aen las MSCs mediante qRT-PCR. El treprostinilo aumentaba la expresión deVEGF-A~3,5 veces con respecto a los controles sin tratar (FIG. 8, panel superior). Adicionalmente,miR-21era más abundante en los exosomas obtenidos a partir de las MSCs expuestas a treprostinilo, mientras quelet-7bera menos prevalente en comparación con los controles (FIG. 8, panel inferior; los asteriscos indican significación estadística (p<0,05)).

También se realizó un análisis de la expresión génica con micromatrices en MSCs procedentes de cultivos sin (-) o con (+) 250 pg/mL de treprostinilo. Se analizaron tres (3) réplicas biológicas de cada condición. De las 77.612 secuencias identificadas entre todas las réplicas, solo se detectaron 24.273 por encima del fondo arbitrario de 50 recuentos. Para los cultivos T re(-), 2.984 secuencias de ARN eran únicas mientras que 1.781 secuencias de ARN eran únicas para los cultivos Tre(+) (panel A). Se analizaron adicionalmente genes detectados en ambas condiciones para determinar la expresión diferencial (panel). De los 19.508 genes expresados habitualmente, solo 1.690 diferían significativamente (p<0,01). Se encontró que 268 genes eran al menos 4 veces superiores en las MSCs sin tratar, y se encontró que 171 eran al menos 4 veces superiores en los cultivos de MSCs Tre(+).

Tal como se muestra en las FIG. 9A y 9B, los genes expresados de manera diferencial diferenciaban claramente (en cuanto a agrupación) los cultivos de MSC Tre(+) de los controles, sugiriendo que treprostinilo mostraba un impacto significativo sobre la función o actividad de las células MSCs.

Las Tablas 2-3 indican genes que se regulan al alza como respuesta a treprostinilo. En la Tabla 2 se muestran genes que solo se expresan en cultivos Tre(+) con un valor promedio de al menos 500 recuentos. En la Tabla 3 se muestran genes que se expresan al menos 10 veces más en Tre(+) que en comparación con las células sin tratar.

Las Tablas 4-5 indican genes que se regulan a la baja como respuesta a treprostinilo. En la Tabla 4 se muestran genes que se regulan a la baja al menos 10 veces en cultivos Tre(+). En la Tabla 5 se muestran genes que solo se expresan en cultivos Tre(-) (es decir, completamente desactivados en los cultivos Tre(+)).

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Se realizaron inmunoensayos basados en perlas (Luminex) para evaluar la concentración de 46 citocinas en el material sobrenadante de cultivos celulares (Myriad RBM Human InflammationMAP® 1.0). De las 46 evaluadas, 6 se secretaban de manera diferencial en cultivos de MSCs tratadas con treprostinilo y sin tratar (véase la Tabla 6, n=3 por grupo). Los asteriscos indican significación estadística entre los grupos basándose en una prueba T de Student (*p<0,001 o *p<0,0001).

Tabla 6. La secreción de citocinas inflamatorias se altera en MSCs tratadas con treprostinilo

Se extrajo ARN total a partir de preparaciones de exosomas y se realizó una qRT-PCR con los mismos conjuntos de cebador/sonda usados en los experimentos con las células originales (véase la FIG. 8). Los transcritos del genVEGF-Apresentes en los exosomas obtenidos a partir de MSCs se incrementaban ~4 veces como resultado de la exposición a treprostinilo (FIG. 10). Adicionalmente,miR-21ymiR-199-3peran significativamente más abundantes en los exosomas obtenidos a partir de las células tratadas con treprostinilo (p<0,05).

Este ejemplo muestra que la expresión génica y los perfiles de secreción de las MSCs se alteraban después de 24 horas de exposición a treprostiniloin vitro.El treprostinilo aumentaba el potencial angiogénico de las MSCs basándose en la observación de que tanto la proteína como el gen de VEGF estaban incrementados. Además, los exosomas de las MSCs tratadas con treprostinilo tenían niveles superiores deVEGF-A,lo cual podía fomentar una producción de VEGF aumentada en las células diana mediante un mecanismo de transferencia génica horizontal.

Además, se observaronmiR-21ymiR-199-3p,lo que también podía influir en la actividad en las células diana (Lee et al.,Circulation126(22):2601-11, 2012). También se observaron cambios en las citocinas secretadas como resultado de una exposición a treprostinilo. En particular, IL-6 se producía ~50 veces más en comparación con las MSCs de control, mientras que MCP-1 se secretaba ~6-7 veces menos.

Ejemplo 4. Análisis físico de exosomas obtenidos a partir de MSCs expuestas a 250 pg/mL de treprostinilo

Se repitió el procedimiento experimental descrito en el Ejemplo 3 para generar suficientes exosomas para un análisis adicional. Se analizaron medios condicionados a partir de cultivos de MSCs tratadas con treprostinilo y sin tratar, mediante detección de pulso resistivo sintonizable (TRPS). Este método cuantifica el número de partículas suspendidas en una muestra, así como el tamaño de cada partícula, basándose en cambios en la corriente eléctrica a través de la muestra.

En las FIG. 11A-B se presenta la distribución por tamaño de exosomas obtenidos a partir de MSCs tratadas con treprostinilo y sin tratar. Se analizaron las preparaciones de exosomas de MSCs tratadas con treprostinilo (FIG. 11A) y de MSCs sin tratar (FIG. 11B) para detectar partículas con un tamaño de 50-600 nm mediante detección de pulso resistivo sintonizable (TRPS). Esos histogramas representativos para cada población de exosomas demostraban que la mayoría de las partículas tenían 150-200 nm de tamaño en ambos grupos. Las MSCs tratadas con treprostinilo proporcionaban una población de exosomas más uniforme, encontrándose casi el 60% de la población en la categoría de tamaño de ~200 nm. El recuento de partículas totales para cada condición era de >500 recuentos.

Se determinó la concentración de partículas en preparaciones de exosomas mediante TRPS. Se observaron menos partículas en la preparación de (+) treprostinilo en comparación con el control (n=1). El tamaño medio, el tamaño modal y el intervalo de tamaño eran comparables entre los dos grupos y se incluyen en la Tabla 7.

Tabla 7. Tamaño y concentración de los exosomas en preparaciones (+) treprostinilo y (-) treprostinilo

Este ejemplo sugiere que el treprostinilo podía proporcionar una población más uniforme de exosomas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un medio de cultivo que ha estado en contacto con una célula madre mesenquimatosa (MSC) y contiene compuestos liberados desde la MSC para uso en un método para tratar o prevenir la vasculopatía en un sujeto que lo requiere, comprendiendo dicho método administrar al sujeto una prostaciclina y dicha composición, comprendiendo además, antes de la administración, poner en contacto la MSC con una prostaciclina para obtener el medio de cultivo, en donde la MSC tiene una producción incrementada de un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en comparación con una MSC sin tratar.

2. La composición para uso en el método según la reivindicación 1, en donde la prostaciclina y la composición se administran de forma simultánea o por separado.

3. La composición para uso en el método según la reivindicación 1, en donde la MSC se pone en contacto con prostaciclina a una concentración de al menos 100 pg/mL, más preferiblemente aquí la MSC se pone en contacto con prostaciclina a una concentración desde aproximadamente 200 pg/mL a aproximadamente 300 pg/mL.

4. La composición para uso en el método según la reivindicación 1, que comprende además administrar al sujeto una célula progenitora endotelial (EPC).

5. La composición para uso en el método según la reivindicación 4, en la que la EPC se obtiene a partir del sujeto.

6. La composición para uso en el método según la reivindicación 5, en donde la EPC se transforma con un ácido nucleico que aumenta la expresión de la actividad biológica de una proteína seleccionada a partir del grupo que consiste en óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), hemo oxigenasa (HMOX1) y prostaciclina sintasa (PTGIS).

7. La composición para uso en el método según la reivindicación 6, en donde el ácido nucleico codifica la proteína.

8. La composición para uso en el método según la reivindicación 1, en donde la prostaciclina se selecciona a partir del grupo que consiste en epoprostenol, treprostinilo, beraprost, ilprost, un agonista del receptor de PGI 2 y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

9. La composición para uso en el método según la reivindicación 1, en donde la MSC es una célula precursora mesenquimatosa (MPC) o se obtiene a partir de la médula ósea.

10. La composición para uso en el método según la reivindicación 1, en donde la vasculopatía se selecciona a partir del grupo que consiste en hipertensión arterial pulmonar (PAH), enfermedad vascular periférica (PVD), isquemia crítica de las extremidades (CLI), arteriopatía coronaria y vasculopatía diabética.

11. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una prostaciclina y una composición que comprende un medio de cultivo que ha estado en contacto con una célula madre mesenquimatosa (MSC) y contiene uno o más componentes de la MSC y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. La composición según la reivindicación 11, en donde la MSC ha estado en contacto con una prostaciclina, en donde la MSC se ha puesto en contacto con prostaciclina a una concentración de al menos 100 pg/mL, más preferiblemente en donde la MSC se ha puesto en contacto con prostaciclina a una concentración desde aproximadamente 200 pg/mL a aproximadamente 300 pg/mL.

13. La composición según la reivindicación 11, que comprende además una célula progenitora endotelial (EPC).

14. Un método para preparar una composición que comprende un medio de cultivo que ha estado en contacto con una célula madre mesenquimatosa (MSC) para una administraciónin vivo,que comprende poner en contacto la MSC con una prostaciclina, preferiblemente en donde la prostaciclina está presente en una concentración de al menos 100 pg/mL, más preferiblemente en donde la MSC se ha puesto en contacto con prostaciclina a una concentración desde aproximadamente 200 pg/mL a aproximadamente 300 pg/mL.