KR102466885B1 - 프로스타시클린 및 중간엽 줄기 세포를 사용한 혈관병증의 치료 - Google Patents

Abstract

혈관병증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 프로스타시클린 및 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 MSC-조건화 배양 배지를 투여하거나, 또는 상기 대상체에게 프로스타시클린으로 처리된 MSC 또는 MSC-조건화 배양 배지를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 혈관병증을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 또한, 이러한 치료에 적합한 제약 조성물이 제공된다.

Description

프로스타시클린 및 중간엽 줄기 세포를 사용한 혈관병증의 치료 {TREATMENT OF VASCULOPATHY WITH PROSTACYCLIN AND MESENCHYMAL STEM CELLS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2013년 1월 9일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/750,458을 우선권 주장하며, 그 내용은 그 전문이 본 개시내용에 참조로 포함된다.

본원은 폐동맥 고혈압 (PAH) 및 다른 유형의 폐고혈압, 말초 혈관 질환 (PVD), 중증 사지 허혈 (CLI), 관상 동맥 질환, 당뇨병성 혈관병증 등을 비롯한 혈관병증의 치료에서 중간엽 줄기 세포의 용도에 관한 것이다.

폐동맥 고혈압은 치료하지 않으면 진단 후 평균 2.8년 이내에 사망에 이르게 되는 진행성 폐 장애이다. 폐 순환의 증가하는 수축은 우심장에 스트레스를 증가시키며, 이는 우심부전으로 발전할 수 있다. 정의하자면, 만성 폐고혈압의 경우에 평균 폐 동맥압 (mPAP)은 휴식시 >25 mmHg 또는 운동 동안 >30 mmHg이다 (정상치 <20 mmHg). 폐동맥 고혈압의 병리생리상태는 폐 혈관의 혈관수축 및 재형성을 특징으로 한다. 만성 PAH에서는, 초기에 근육화되지 않은 폐 혈관의 신생근육화가 존재하고, 이미 근육화된 혈관의 혈관 근육의 둘레가 증가한다. 이러한 폐 순환의 증가하는 폐쇄는 우심장에 대해 진행성 스트레스를 생성하여, 우심장으로부터의 박출량을 감소시키고, 결국에는 우심부전을 초래한다 (M. Humbert et al., J. Am. Coll. Cardiol. 2004, 43, 13S-24S). PAH는 유병률이 백만명당 1-2명인 극히 드문 장애이다. 환자의 평균 연령은 36세인 것으로 추정되고, 환자의 10%만이 60세를 넘었다. 남성보다는 여성에서 명백히 더 많이 발병한다 (G. E. D'Alonzo et al., Ann. Intern. Med. 1991, 115, 343-349).

시중에서 입수가능한 표준 요법 (예를 들어, 프로스타시클린 유사체, 엔도텔린 수용체 길항제, 포스포디에스테라제 억제제)은 삶의 질, 운동 내성 및 환자의 예후를 개선할 수 있다. 이들 요법의 원리는 주로, 혈관 긴장도에 영향을 미치지만 병원성 재형성 과정에는 직접적으로 영향을 미치지 않는 혈류역학이다. 또한, 이들 의약의 사용 가능성은 때때로 심각한 부작용 및/또는 복잡한 투여 유형으로 인해 제한된다. 특정 단독요법에 의해 환자의 임상적 상황이 개선되거나 안정화될 수 있는 기간은 한정되어 있다. 결국, 요법을 강화하여, 다수의 의약이 공동으로 제공되어야 하는 조합 요법이 적용된다. 폐동맥 고혈압 요법에서의 모든 진보에도 불구하고, 이러한 심각한 장애의 치유 가망은 아직까지 없다.

용어 말초 혈관 질환 (PVD)은 말초 동맥 및 정맥 내의 손상, 기능장애 또는 폐쇄를 지칭한다. 말초 동맥 질환은 PVD의 가장 흔한 형태이다. 말초 혈관 질환은 미국에서 가장 흔한 동맥 질환이고 매우 흔한 병태이다. 이는 대부분 50세가 넘는 사람에서 발생한다. 말초 혈관 질환은 50세가 넘는 사람 중에서 뿐만 아니라 당뇨병을 갖는 그러한 사람 중에서 장애의 주요 원인이다. 미국에서 약 천만명의 사람이 말초 혈관 질환을 가지고 있으며, 이는 50세가 넘는 사람의 약 5%로 해석된다. 상기 병태를 갖는 사람의 수는 그 집단이 나이가 들수록 증가할 것으로 예상된다. 남성이 여성보다 약간 더 많이 말초 혈관 질환을 가질 가능성이 있다.

진행성 말초 동맥 폐쇄로 인한 중증 사지 허혈 (CLI)은 휴식 시 감소된 혈류 및 산소 전달을 특징으로 하고, 이로 인해 휴식 시 근육 통증 및 비-치유 피부 궤양 또는 괴저가 발생한다 (Rissanen et al., Eur. J. Clin. Invest 31:651-666 (2001); Dormandy and Rutherford, J. Vasc. Surg. 31:S1-S296 (2000)). 중증 사지 허혈은 1년에 개체 백만명당 500 내지 1000명에서 발생하는 것으로 추정된다 ("Second European Consensus Document on Chronic Critical Leg Ischemia", Circulation 84(4 Suppl.) IV 1-26 (1991)). 중증 사지 허혈을 갖는 환자에서, 절단은 그의 연관 이환율, 사망률 및 기능적 영향에도 불구하고 종종 장애 증상에 대한 해결책으로서 권고된다 (M. R. Tyrrell et al., Br. J. Surg. 80: 177-180 (1993); M. Eneroth et al., Int. Orthop. 16: 383-387 (1992)). 중증 사지 허혈에 대한 어떠한 최적의 의료 요법도 존재하지 않는다 (Circulation 84(4 Suppl.): IV 1-26 (1991)).

관상 동맥 질환 (아테롬성동맥경화증)은 인간에서 하나 이상의 관상 동맥이 플라크의 축적으로 인해 점차 폐쇄되는 진행성 질환이다. 이러한 질환을 갖는 환자의 관상 동맥은 종종 풍선 혈관성형술 또는 부분적으로 폐쇄된 동맥을 받쳐 개방하기 위한 스텐트의 삽입에 의해 치료된다. 궁극적으로, 이들 환자는 큰 비용 및 위험 하에 관상 동맥 우회로 수술을 받도록 요구된다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 혈관병증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 프로스타시클린, 및 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 상기 MSC와 접촉되어 있어 MSC의 하나 이상의 성분(들)을 함유하는 배양 배지의 일부를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 혈관병증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 프로스타시클린 및 조성물은 공동으로 또는 개별적으로 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 투여 전에, MSC는 프로스타시클린과 접촉되어 있다. 마찬가지로, 배양 배지 또는 배양 배지로부터 수득되는 MSC는 이러한 투여 전에 프로스타시클린과 접촉되도록 둘 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 방법은 이러한 전처리 단계를 추가로 포함한다.

MSC 배양물의 일부로부터 수득되는 성분의 비제한적 예는 엑소솜, 미세소포, 마이크로RNA, 메신저 RNA, 비-코딩 RNA, 미토콘드리아, 성장 인자 또는 그의 조합을 포함한다.

이러한 방법은, 한 측면에서, 대상체에게 내피 전구 세포 (EPC)를 투여하는 것을 추가로 수반한다. 한 측면에서, EPC는 대상체로부터 수득된다. 일부 측면에서, EPC는 내피 산화질소 신타제 (eNOS), 헴 옥시게나제 (HMOX1) 및 프로스타시클린 신타제 (PTGIS)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 생물학적 활성의 발현을 증가시키는 핵산에 의해 형질전환된다. 한 측면에서, 핵산은 단백질을 코딩한다.

프로스타시클린의 예는, 제한 없이, 에포프로스테놀 소듐, 트레프로스티닐, 베라프로스트, 일로프로스트 및 PGI₂ 수용체 효능제를 포함한다. 한 측면에서, 프로스타시클린은 트레프로스티닐 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 에스테르이다.

또한, 한 실시양태에서, 치료 유효량의 프로스타시클린, 및 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 상기 MSC와 접촉되어 있어 MSC로부터 방출된 화합물을 함유하는 배양 배지를 포함하는 조성물, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 일부 측면에서, 조성물은 내피 전구 세포 (EPC)를 추가로 포함한다.

또 다른 실시양태는 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 프로스타시클린과 접촉시키는 것을 포함하는, MSC 또는 상기 MSC와 접촉되어 있어 MSC로부터 방출된 화합물을 함유하는 배양 배지를 포함하는 생체내 전달을 위한 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 이러한 방법에 의해 수득가능한 처리된 조성물이 제공된다.

다른 실시양태에서, 제약 조성물은 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체 또는 적어도 하나의 치료제를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 혈관병증, 예컨대 폐동맥 고혈압 (PAH), 말초 혈관 질환 (PVD), 중증 사지 허혈 (CLI), 관상 동맥 질환, 또는 당뇨병성 혈관병증을 앓고 있다. 다른 실시양태에서, 본 방법은 폐동맥에서 혈전증을 감소시키거나, 폐동맥에서 염증을 감소시키거나, 폐동맥에서 내막 평활근의 증식을 감소시키거나, 폐동맥에서 총상 병변의 형성을 감소시키거나, 폐동맥에서 산화질소의 양을 증가시키거나, 폐동맥에서 PGI₂의 양을 증가시키거나, 폐동맥에서 엔도텔린-1의 수준을 감소시키거나, 또는 폐동맥에서 성장 인자의 양을 감소시킨다. 다른 실시양태에서, 본 방법은 폐동맥에서 적절한 내피 형태를 촉진한다.

단지 예시에 의해 설명하는 것이지 제한하는 것은 아닌 도면이 본 개시내용의 실시양태로서 제공된다.
도 1은 인간 골수-유래 MSC의 면역표현형 분석의 결과를 제시한다.
도 2는 트레프로스티닐에의 노출 24시간 후 인간 골수 MSC에 의한 VEGF 분비를 제시하는 차트이다.
도 3a-b는 트레프로스티닐에의 노출 24시간 후 VEGF의 MSC 분비 차트 (a) 및 유전자 발현 차트 (b)를 나타낸다.
도 4는 증가하는 농도의 트레프로스티닐에 노출된 MSC의 대표적인 이미지를 나타낸다.
도 5는 트레프로스티닐에 노출된 MSC의 세포 생존율을 제시하는 차트이다.
도 6은 세포 신호전달, 유전자 발현, 및 주변분비 인자의 방출에 대한 트레프로스티닐의 효과의 모델을 예시한다.
도 7a-b는 250 μg/mL 트레프로스티닐의 존재 또는 부재 하에 처리된 MSC를 제시하는 이미지 및 차트를 나타낸다.
도 8은 트레프로스티닐로 처리된 MSC에서 선택된 유전자에서의 변경된 발현을 제시하는 2종의 차트를 나타낸다.
도 9a-b는 대조군으로부터 트레프로스티닐로 처리된 클러스터 MSC의, 가장 유의하게 차등적으로 발현된 유전자 (도 9a) 또는 다른 게놈 서열 또는 발현 태그 (도 9b)의 2종의 열지도를 나타낸다.
도 10은 MSC-유래의 엑소솜 내 RNA 함량이 트레프로스티닐 처리에 의해 변경됨을 제시하는 차트를 나타낸다.
도 11a-b는 트레프로스티닐-처리 및 -비처리 MSC로부터 유래된 엑소솜의 크기 분포를 제시한다.
일부 또는 모든 도면은 예시를 위한 개략적 표현이고; 따라서, 이는 제시된 요소의 실제 상대 크기 또는 위치를 반드시 도시하는 것은 아니다. 도면은 하기 이어지는 청구범위의 범위 또는 의미를 제한하는데 사용되지 않을 것이라는 명확한 이해 하에 하나 이상의 실시양태를 예시하기 위한 목적으로 제공된다.

달리 명시되지 않는 한, 단수 형태는 "하나 이상"을 의미한다.

달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 (예를 들어, 줄기 세포 생물학, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학에서) 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다고 여겨질 것이다.

달리 나타내지 않는 한, 본 개시내용에서 사용되는 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학적 기술은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 표준 절차이다. 이러한 기술은 원천 문헌, 예컨대 [J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B. D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J. E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트 포함)] 전반에 걸쳐 기재되고 설명되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.

프로스타시클린 및 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 둘 다 혈관병증에 대한 치료 활성을 갖는다는 것이 본원에서 발견된다. 또한, 프로스타시클린 및 MSC의 조합은 상승작용 효과를 생성한다. 이러한 조합은 환자에게 프로스타시클린 및 MSC의 공동적 또는 개별적일 수 있는 공-투여일 수 있거나, 또는 환자에게 프로스타시클린으로 전처리된 MSC 조성물의 투여일 수 있다.

MSC가 환자에서 혈관병증을 개선할 수 있는 것으로 제시되며, 이러한 치료 효과는 항염증 및 혈관신생촉진 인자를 이환 부위로 전달함으로써 국부 미세환경을 개선하는 MSC의 능력으로 인해 달성되는 것으로 고려된다. 그러나, MSC는 신체에서 단기-생존하며 재생되지 않는다.

프로스타시클린, 예컨대 트레프로스티닐 (TP)은 폐동맥 고혈압 (PAH) 환자를 치료하기 위해 사용되어 왔다. 이와 관련하여, 프로스타시클린은 혈관확장 및 항혈소판 응집 활성을 갖는 것으로 제시되어 왔다.

프로스타시클린이 혈관병증의 치료를 위한 MSC의 활성을 증진시키며, 이러한 치료에 대한 상승작용을 나타낼 수 있다는 것은 예상하지 못한 발견이다. 이와 관련하여, 프로스타시클린은 혈관 성장에 대한 MSC의 유익한 효과를 증진시키는 것이 관찰된다. 예를 들어, 프로스타시클린은 VEGF의 발현을 단백질 및 유전자 수준 둘 다에서 증가시킨다. 분비된 시토카인에서의 변화는 또한 프로스타시클린 노출의 결과로서 관찰된다. 예를 들어, IL-6은 ~50배 증가되는 한편 MCP-1은 ~6-7배 감소된다.

또한, 이러한 상승작용은 환자에게 내피 전구 세포 (EPC)를 추가로 투여하는 경우에 분명하다. 따라서, 프로스타시클린이 MSC를 통해 EPC의 활성을 증진시킬 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 이러한 상승작용에 의해, 프로스타시클린 및 MSC, 임의로 EPC와 함께하는 조합 사용은 치료 결과를 개선시킬 수 있고/거나 각 작용제 단독의 필요성을 감소시킬 수 있고, 차례로 더 높은 용량의 각 작용제 단독에 의해 잠재적으로 유발되는 부작용을 감소시킬 수 있다.

또한 이러한 상승작용은 MSC-조건화 배양 배지에도 적용될 수 있는 것으로 제시된다. 이로 인해, 프로스타시클린-처리 MSC의 엑소솜은 더 높은 수준의 VEGF-A를 갖고, 이는 수평적 유전자 전달의 메카니즘을 통해 표적 세포에서 증가된 VEGF 생산을 촉진할 수 있는 것으로 관찰된다. 또한, 프로스타시클린에의 노출은 보다 균일한 엑소솜 집단을 생성한다.

본원에 사용된 "MSC-조건화 배양 배지"는 (예를 들어 MSC를 배양하기 위한 목적으로) MSC에 접촉되어 있어 MSC로부터 방출된 화합물을 함유하는 배양 배지를 지칭한다. 이러한 방출된 화합물의 비제한적 예는 엑소솜, 또는 메신저 RNA, 비-코딩 RNA, 마이크로RNA, 미토콘드리아, 성장 인자 또는 다른 유형의 생물활성제를 둘러쌀 수 있는 다른 미세소포를 포함한다.

본원에 사용된 "배양 배지"는 (a) MSC를 배양하는데 사용되는 전형적인 성분, 예컨대 아미노산, 글루코스 및 다양한 염을 MSC의 존재 또는 부재 하에 함유하는 배양 배지, 및 (b) 배양 동안 MSC로부터 방출된 화합물을 함유하는 배양 배지로부터 단리된 조성물 둘 다를 포괄한다.

따라서, 본 개시내용의 한 실시양태는 혈관병증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 프로스타시클린, 및 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 MSC-조건화 배양 배지를 포함하는 조성물 (집합적으로 "MSC 조성물")을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 혈관병증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 프로스타시클린 및 MSC 조성물은 공동으로 투여된다. 또 다른 측면에서, 프로스타시클린 및 MSC 조성물은 개별적으로 투여된다. 개별적으로 투여되는 경우에, 프로스타시클린은 MSC 조성물의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 단리된 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 MSC-조건화 배양 배지를 포함하는 조성물을 프로스타시클린과 접촉시킨 다음, MSC 조성물을 혈관병증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 혈관병증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

혈관병증의 비제한적 예는 폐동맥 고혈압 (PAH), 말초 혈관 질환 (PVD), 중증 사지 허혈 (CLI), 관상 동맥 질환 및 당뇨병성 혈관병증을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "대상체" (또한 본원에서 "환자"로 언급됨)는 온혈 동물, 바람직하게는 인간을 비롯한 포유동물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 영장류이다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

본원에 사용된 용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 혈관병증의 적어도 하나의 증상을 감소시키거나 제거하는데 충분한 치료 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 세포를 투여하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "예방하는", "예방하다" 또는 "예방"은 혈관병증의 적어도 하나의 증상의 발생을 정지시키거나 방해하는데 충분한 치료 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 세포를 투여하는 것을 포함한다.

A. 프로스타시클린

본원에 사용된 용어 "프로스타시클린"은 임의의 프로스타글란딘 I₂ (PGI₂), 임의의 프로스타시클린 유사체, 및 임의의 PGI₂ 수용체 효능제를 분명하게 포함한다. 본 기술에 적합한 프로스타시클린의 비제한적 예는 에포프로스테놀 소듐 (예를 들어 플로란(Flolan)®), 트레프로스티닐 (예를 들어 티바소(TYVASO)®, 레모듈린(Remodulin)®), 일로프로스트 (예를 들어 벤타비스(Ventavis)®) 및 PGI₂ 수용체 효능제 (예를 들어 셀렉시팍(Selexipag))를 포함한다. 한 측면에서, 프로스타시클린은 트레프로스티닐 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 에스테르이다.

B. 중간엽 줄기 세포 (MSC)

중간엽 줄기 세포 (MSC)는 골수, 혈액, 치수 세포, 지방 조직, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장, 간, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 림프절, 흉선, 골, 인대, 건, 골격근, 진피 및 골막에서 발견되는 세포이고; 상이한 배선, 예컨대 중배엽, 내배엽 및 외배엽으로 분화할 수 있다. 따라서, MSC는 지방, 골, 연골, 탄성, 근육 및 섬유 결합 조직을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 세포 유형으로 분화할 수 있다. 이들 세포가 진입하는 특정 계통-수임 및 분화 경로는 역학적 영향 및/또는 내인성 생물활성 인자, 예컨대 성장 인자, 시토카인 및/또는 숙주 조직에 의해 확립된 국부 미세환경 조건으로부터의 다양한 영향에 의존한다. 따라서, MSC는 비-조혈 전구 세포로서, 이는 분열하여 줄기 세포 또는 전구체 세포인 딸세포를 생성하고, 이는 제때에 비가역적으로 분화하여 표현형 세포를 생성할 것이다. MSC의 예는 중간엽 전구체 세포 (MPC)를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "줄기 세포"는 표현형 및 유전자형이 동일한 딸세포 뿐만 아니라 적어도 하나의 다른 최종 세포 유형 (예를 들어, 말단 분화 세포)을 생성할 수 있는 자기-재생 세포를 지칭한다. 용어 "줄기 세포"는 전능성, 만능성 및 다능성 세포 뿐만 아니라 그의 분화로부터 유래된 전구 및/또는 전구체 세포를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "전능 세포" 또는 "전능성 세포"는 완전한 배아 (예를 들어, 배반포)를 형성할 수 있는 세포를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "만능 세포" 또는 "만능성 세포"는 완전한 분화 다기능성, 즉 포유동물 신체의 대략 260가지 세포 유형 중 임의의 유형으로 성장할 수 있는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 만능 세포는 자기-재생될 수 있고, 조직 내에 휴면상태 또는 정지상태로 남아있을 수 있다.

용어 "다능성 세포" 또는 "다능 세포"는 여러 성숙한 세포 유형 중 임의의 유형으로 생성될 수 있는 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 이러한 어구는 성체 또는 배아 줄기 세포 및 전구 세포, 및 이들 세포의 다능성 자손을 포괄한다. 만능 세포와는 달리, 다능 세포는 모든 세포 유형을 형성할 수 있는 능력을 갖지 않는다.

본원에 사용된 용어 "전구 세포" 또는 "전구체 세포"는 특정 유형의 세포로 분화하거나 특정 유형의 조직을 형성하도록 수임된 세포를 지칭한다.

바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 사용되는 세포는 대상체로부터 수득된 샘플에서 풍부화된다. 용어 '풍부화된', '풍부화' 또는 그의 변형은, 비처리 집단과 비교하여 하나의 특정한 세포 유형의 비율 또는 다수의 특정한 세포 유형의 비율이 증가되어 있는 세포 집단을 기재하기 위해 본원에 사용된다.

바람직한 실시양태에서, 본 개시내용에 사용되는 세포는 TNAP⁺, STRO-1⁺, VCAM-1⁺, THY-1⁺, STRO-2⁺, CD45⁺, CD146⁺, 3G5⁺ 또는 그의 임의의 조합이다.

본 발명자들이 세포를 주어진 마커에 대해 "양성"인 것으로 언급하는 경우에, 세포는 마커가 세포 표면 상에 존재하는 정도에 따라 그 마커의 낮은 (lo 또는 dim) 또는 높은 (bright, bri) 발현자일 수 있으며, 여기서 용어는 세포의 색 분류 과정에 사용된 형광 또는 다른 색의 강도에 관한 것이다. lo (또는 dim 또는 dull)와 bri의 구별은 분류할 특정한 세포 집단에 대해 사용된 마커와 관련하여 이해될 것이다. 본 발명자들이 본원에서 세포를 주어진 마커에 대해 "음성"인 것으로 언급하는 경우에, 이는 마커가 그 세포에 의해 전혀 발현되지 않음을 의미하는 것은 아니다. 이는 마커가 그 세포에 의해 비교적 매우 낮은 수준으로 발현되며, 검출가능하게 표지된 경우에 매우 낮은 신호를 생성함을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "TNAP"는 조직 비-특이적 알칼리성 포스파타제의 모든 이소형을 포괄하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 상기 용어는 간 이소형 (LAP), 골 이소형 (BAP) 및 신장 이소형 (KAP)을 포괄한다. 바람직한 실시양태에서, TNAP는 BAP이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 TNAP는 부다페스트 조약의 규정 하에 2005년 12월 19일자로 ATCC에 수탁 번호 PTA-7282로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다.

방법에 유용한 줄기 세포는 성체 조직, 배아, 배아외 조직, 또는 태아로부터 유래될 수 있다. 용어 "성체"는 출생후 대상체를 포함하는 그의 가장 넓은 의미로 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 용어 "성체"는 사춘기후의 대상체를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "성체"는 또한 여성에서 채취한 제대혈을 포함할 수 있다.

일부 측면에서, 줄기 세포는 본원에 기재된 줄기 세포의 시험관내 배양으로부터 생산된 자손 세포 (또한 확장 세포로도 지칭될 수 있음)일 수 있다. 본 개시내용의 확장 세포는 배양 조건 (배양 배지 내의 자극 인자의 수 및/또는 유형을 포함) 및 계대 수 등에 따라 매우 다양한 표현형을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 자손 세포는 모 집단으로부터 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10 계대 후에 수득된다. 그러나, 자손 세포는 모 집단으로부터 임의의 계대 수 이후에 수득될 수 있다.

자손 세포는 임의의 적합한 배지에서 배양하는 것에 의해 수득될 수 있다. 세포 배양과 관련하여 사용된 용어 "배지"는 세포를 둘러싼 환경의 성분을 포함한다. 배지는 고체, 액체, 기체 또는 상과 물질의 혼합물일 수 있다. 배지는 액체 성장 배지 뿐만 아니라 세포 성장을 지속시키지 않는 액체 배지를 포함한다. 배지는 또한 젤라틴성 배지, 예컨대 한천, 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 용어 "배지"는 또한, 아직 세포와 접촉되어 있지 않더라도 세포 배양에 사용하기 위해 의도된 물질을 지칭한다. 즉, 박테리아 배양을 위해 제조된 영양분 풍부 액체가 배지이다.

한 실시양태에서, 자손 세포는 STRO-3 항체로 표지된 자기 비드를 사용하여 골수로부터 TNAP+ 세포를 단리함으로써 수득되고, 20% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민 및 100μm L-아스코르베이트-2-포스페이트로 보충된 α-MEM에 플레이팅된다.

한 실시양태에서, 이러한 확장 세포 (적어도 5 계대 후)는 TNAP-, CC9+, HLA 클래스 I+, HLA 클래스 II-, CD14-, CD19-; CD3-, CD11a-c-, CD31-, CD86- 및/또는 CD80-일 수 있다. 그러나, 가능하게는 본원에 기재된 것과 다른 배양 조건 하에서 여러 마커의 발현이 달라질 수 있다. 또한, 이들 표현형의 세포가 확장 세포 집단에서 우세할 수 있지만, 이러한 표현형(들)을 갖지 않는 세포가 최소 비율이라도 존재하지 않음을 의미하는 것은 아니다 (예를 들어, 적은 백분율의 확장 세포는 CC9-일 수 있음). 한 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 확장 세포는 여전히 상이한 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 갖는다.

한 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 사용되는 확장 세포 집단은 세포의 적어도 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50%가 CC9+인 세포를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 사용되는 확장 세포 집단은 세포의 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 45%가 STRO-1+인 세포를 포함한다.

추가 실시양태에서, 자손 세포는 LFA-3, THY-1, VCAM-1, PECAM-1, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD29, CD18, CD61, 인테그린 베타, 6-19, 트롬보모듈린, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, 렙틴-R, (STRO-2=렙틴-R), RANKL, STRO-1bright 및 CD146 또는 이들 마커의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 발현할 수 있다.

한 실시양태에서, 자손 세포는 WO 2006/032092에 정의된 바와 같은 다능성 확장 MSC 자손 (MEMP)이다. 자손이 유래될 수 있는 MSC의 풍부화 집단을 제조하는 방법이 WO 01/04268 및 WO 2004/085630에 기재되어 있다. 시험관내 상황에서 MSC는 절대적으로 순수한 제제로서 거의 존재하지 않을 것이고, 일반적으로 조직 특이적 수임 세포 (TSCC)인 다른 세포와 함께 존재할 것이다. WO 01/04268은 이러한 세포를 골수로부터 약 0.1% 내지 90%의 순도 수준으로 수거하는 것을 언급하고 있다. 자손이 유래되는 MSC를 포함하는 집단은 조직 공급원으로부터 직접 수거될 수 있거나, 또는 대안적으로 생체외에서 이미 확장된 집단일 수 있다.

예를 들어, 실질적으로 정제된 MSC의 수거된 비확장 집단으로부터 그들이 존재하는 집단의 전체 세포의 적어도 약 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 95%를 포함하는 자손이 수득될 수 있다. 이러한 수준은, 예를 들어 TNAP, STRO-1 ^bri, 3G5+, VCAM-1, THY-1, CD146 및 STRO-2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 마커에 대해 양성인 세포를 선택함으로써 달성될 수 있다.

MSC 출발 집단은 WO 01/04268 또는 WO 2004/085630에 기재된 임의의 하나 이상의 조직 유형, 즉 골수, 치수 세포, 지방 조직 및 피부로부터, 또는 아마도 보다 광범위하게는 지방 조직, 치아, 치수, 피부, 간, 신장, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 비장, 림프절, 흉선, 췌장, 골, 인대, 골수, 건 및 골격근으로부터 유래될 수 있다.

MEMP는 마커 STRO-1bri에 대해서는 양성이고 마커 알칼리성 포스파타제 (ALP)에 대해서는 음성이라는 점에서 새로이 수거된 MSC와 구별될 수 있다. 대조적으로, 새로이 단리된 MSC는 STRO-1^bri 및 ALP 둘 다에 대해 양성이다. 본 개시내용의 바람직한 실시양태에서, 투여된 세포의 적어도 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%는 표현형 STRO-1^bri, ALP-를 갖는다. 추가의 바람직한 실시양태에서, MEMP는 마커 Ki67, CD44 및/또는 CD49c/CD29, VLA-3, α3β1 중 하나 이상에 대해 양성이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, MEMP는 TERT 활성을 나타내지 않고/거나 마커 CD18에 대해 음성이다.

한 실시양태에서, 세포는 혈관병증을 갖는 환자로부터 채취되고, 표준 기술을 사용하여 시험관내 배양되고, 자가 또는 동종 이식으로서 환자에게 투여된다. 대안적 실시양태에서, 확립된 인간 세포주의 하나 이상의 세포가 사용된다. 본 개시내용의 또 다른 유용한 실시양태에서, 비-인간 동물의 세포 (또는 환자가 인간이 아니라면 또 다른 종으로부터의 것)가 사용된다.

본 기술은 비-인간 영장류 세포, 유제류, 개, 고양이, 토끼류, 설치류, 조류 및 어류 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 비-인간 동물 종으로부터의 세포를 사용하여 실시될 수 있다. 본 개시내용이 수행될 수 있는 영장류 세포는 침팬지, 개코원숭이, 시노몰구스 원숭이 및 임의의 다른 신세계 또는 구세계 원숭이의 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용이 수행될 수 있는 유제류 세포는 소, 돼지, 양, 염소, 말, 버팔로 및 들소의 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용이 수행될 수 있는 설치류 세포는 마우스, 래트, 기니 피그, 햄스터 및 저빌 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용이 수행될 수 있는 토끼류 종의 예는 집토끼, 산토끼, 멧토끼, 솜꼬리토끼, 눈신토끼 및 새앙토끼를 포함한다. 닭 (갈루스 갈루스(Gallus gallus))은 본 개시내용이 수행될 수 있는 조류 종의 예이다.

세포는 사용 전 저장될 수 있다. 진핵 세포, 특히 포유동물 세포를 보존 및 저장하기 위한 방법 및 프로토콜은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.] 참조). 단리된 줄기 세포, 예컨대 중간엽 줄기/전구 세포 또는 그의 자손의 생물학적 활성을 유지하는 임의의 방법이 본 개시내용과 관련하여 사용될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 세포는 동결보존을 사용하는 것에 의해 유지되고 저장된다.

세포는 다양한 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 세포-항체 복합체와 연관된 특성 또는 항체에 부착된 표지를 참조하여 세포를 물리적으로 분리하는 다수의 세포-분류 기술이 사용될 수 있다. 이러한 표지는 자기 입자 또는 형광 분자일 수 있다. 항체는 가교되어, 그의 밀도에 의해 분리가능한 다중 세포의 응집체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 항체는 목적하는 세포가 부착되어 있는 고정 매트릭스에 부착될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, TNAP+, STRO-1+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, 3G5+, CD45+, CD146+에 결합하는 항체 (또는 다른 결합제)가 세포를 단리하는데 사용된다. 보다 바람직하게는, TNAP+ 또는 STRO-1+에 결합하는 항체 (또는 다른 결합제)가 세포를 단리하는데 사용된다.

항체-결합된 세포를 미결합 세포로부터 분리하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 세포에 결합된 항체 (또는 항-이소형 항체)를 표지한 다음, 표지의 존재를 검출하는 기계적 세포 분류기에 의해 세포를 분리할 수 있다. 형광-활성화 세포 분류기는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 항-TNAP 항체 및/또는 STRO-1 항체는 고체 지지체에 부착된다. 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 중공 섬유 막, 중합체 및 플라스틱 페트리 디쉬를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 고체 지지체가 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 항체에 의해 결합된 세포는 세포 현탁액으로부터 고체 지지체를 간단하게 물리적으로 분리하는 것에 의해 세포 현탁액으로부터 제거될 수 있다.

초상자성 마이크로입자가 세포 분리에 사용될 수 있다. 예를 들어, 마이크로입자는 항-TNAP 항체 및/또는 STRO-1 항체로 코팅될 수 있다. 이어서, 항체-태그부착된 초상자성 마이크로입자는 관심 세포를 함유하는 용액과 함께 인큐베이션될 수 있다. 마이크로입자는 목적하는 줄기 세포의 표면에 결합하고, 이어서 이들 세포가 자장에서 수집될 수 있다.

또 다른 예에서, 세포 샘플을, 예를 들어 고체 상-연결된 항-TNAP 모노클로날 항체 및/또는 항-STRO-1 모노클로날 항체와 물리적으로 접촉되게 한다. 고체-상 연결은, 예를 들어 플라스틱, 니트로셀룰로스 또는 다른 표면에 항체를 흡착시키는 것을 포함할 수 있다. 항체는 또한 중공 섬유 막의 큰 (세포를 관통시키도록 충분히 큰) 기공의 벽 상에 흡착될 수 있다. 대안적으로, 항체는 표면 또는 비드, 예컨대 파마시아 세파로스(Pharmacia Sepharose) 6 MB 마크로비드에 공유적으로 연결될 수 있다. 고체 상-연결된 항체를 줄기 세포 함유 현탁액과 함께 인큐베이션하는 정확한 조건 및 지속시간은 사용되는 시스템에 특이적인 여러 인자에 의존할 것이다. 그러나, 적절한 조건의 선택은 관련 기술분야의 기술 내에 있다.

이어서, 줄기 세포가 결합되도록 충분한 시간을 허용한 후, 미결합 세포는 생리학적 완충제에 의해 용리되거나 세척 제거된다. 미결합 세포는 목적하는 분리가 달성되었는지 확인하는 적절한 시험이 수행된 후에 회수되어 다른 목적을 위해 사용되거나 폐기될 수 있다. 이어서, 결합된 세포는 주로 고체 상 및 항체의 성질에 따라 임의의 적절한 방법에 의해 고체 상으로부터 분리된다. 예를 들어, 결합된 세포는 강력한 교반에 의해 플라스틱 페트리 디쉬로부터 용리될 수 있다. 대안적으로, 결합된 세포는 고체 상과 항체 사이의 효소-감수성 "스페이서" 서열을 효소적으로 "닉킹" 또는 소화시킴으로써 용리될 수 있다. 아가로스 비드에 결합된 스페이서는, 예를 들어 파마시아로부터 상업적으로 입수가능하다.

이어서, 용리된 풍부화된 세포 분획은 원심분리에 의해 완충제로 세척될 수 있고, 상기 풍부화된 분획은 통상의 기술에 따라 추후의 사용을 위해 생존 상태로 동결보존될 수 있고/거나, 배양 확장될 수 있고/거나, 환자 내로 도입될 수 있다.

C. MSC-조건화 배양 배지

MSC는 성장 또는 분화 동안 세포외 환경으로 방출될 수 있는 화합물을 통해 그의 활동을 수행할 수 있다는 것이 발견되었다. 일부 측면에서, 이러한 화합물은 직경이 약 30 nm 내지 약 200 nm인 엑소솜으로 지칭되는 미세소포를 포함한다. 엑소솜은 생체내에서 숙주 세포에 의해 내재화될 수 있다.

엑소솜은 다소포체 분류 경로로부터 유래된 소포이다. 최근 연구는 엑소솜이 세포간 소통과 면역조절 과정의 촉진에 유용한 생물활성 소포임을 제시한다. MSC 엑소솜은 20S 프로테아솜 및 다수의 RNA (메신저 RNA, 비-코딩 RNA, 마이크로RNA)를 함유한다.

엑소솜에 더하여, MSC는 또한 본 개시내용의 목적에 유용한 다른 생물활성 분자/소포를 방출한다. 이러한 분자 및 소포는, 제한 없이, 미토콘드리아 및 성장 인자를 포함한다. MSC로부터 방출된 이러한 분자 및 소포를 함유하는 배양 배지를 제조하고 추가로 특정한 분자 및 소포를 단리하는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Hu et al., Frontiers in Genetics, 2:56, 1-9 (2012)]을 참조한다.

D. 프로스타시클린에 의한 MSC의 전처리

일부 실시양태에서, 환자에게 MSC 또는 MSC-조건화 배양 배지를 프로스타시클린과 함께 공투여하기 전에, MSC 또는 MSC-조건화 배양 배지는 프로스타시클린으로 임의로 전처리될 수 있다. 따라서, 또한 한 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 MSC-조건화 배양 배지를 프로스타시클린과 접촉시키는 것을 포함하는, 생체내 전달을 위한 MSC 또는 MSC-조건화 배양 배지를 제조하는 방법이 제공된다. 또 다른 실시양태는 이러한 방법에 의해 수득가능한 처리된 MSC 또는 MSC-조건화 배양 배지를 제공한다.

화학적 화합물에 의한 세포 또는 배지의 전처리는 공지된 기술을 포괄한다. 한 측면에서, 프로스타시클린은 MSC를 함유하는 배양 배지에 첨가되어 공동-인큐베이션될 수 있다. 그러나, 임의로, 이러한 공동-인큐베이션은 추가로 성장 인자 (예를 들어, VEGF 및 안지오포이에틴-1 또는 -2, 혈소판-유래 성장 인자)의 첨가 및/또는 저산소상태를 수반할 수 있다.

MSC 또는 MSC-조건화 배양 배지는 다양한 방식으로 프로스타시클린으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 프로스타시클린은 MSC의 확장 동안 생체외에서 MSC를 처리하는데 사용될 수 있고; 프로스타시클린은 또한 투여 후의 MSC를 처리하는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 프로스타시클린의 농도는 적어도 약 100 μg/mL, 또는 적어도 약 150 μg/mL, 200 μg/mL, 또는 250 μg/mL이다. 일부 측면에서, 프로스타시클린의 농도는 약 400 μg/mL 이하, 또는 약 350 μg/mL, 300 μg/mL 또는 250 μg/mL 이하이다.

본 개시내용의 한 실시양태에 따르면, MSC는 수용자 자신의 혈액 또는 골수로부터 제조될 수 있다. 그러한 경우에, 프로스타시클린은 또한 수용자로부터 단리되기 전 MSC를 처리하는데 사용될 수 있다.

E. 내피 전구 세포 (EPC)

제공된 바와 같이, 혈관병증의 치료를 위한 프로스타시클린과 MSC 사이의 상승작용은 또한 환자에게 내피 전구 세포 (EPC)를 추가로 투여하는 경우에 분명하다. 따라서, 본원에 개시된 방법의 임의의 실시양태의 경우에, 환자에게 내피 전구 세포 (EPC)를 추가로 투여한다.

일부 실시양태에서, EPC는 또한 프로스타시클린으로 전처리될 수 있다. 프로스타시클린으로 처리된 EPC는 증진된 혈관신생 특성을 갖는 과다증식성 표현형을 나타내며, 이는 비처리 EPC와 비교하여 혈관병증을 치료하는데 유리하다.

EPC는 다양한 방식으로 프로스타시클린으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 프로스타시클린은 EPC의 확장 동안 생체외에서 EPC를 처리하는데 사용될 수 있고; 프로스타시클린은 EPC와 함께 수용자에게 공-투여될 수 있고; 프로스타시클린은 또한 이식 후의 EPC를 처리하는데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 한 실시양태에 따르면, EPC는 수용자 자신의 혈액 또는 골수로부터 제조된다. 그러한 경우에, 프로스타시클린은 또한 수용자로부터 단리되기 전 EPC를 처리하는데 사용될 수 있다.

EPC는 증식하도록 유도될 수 있는 미분화 세포이다. EPC는 각각의 세포 분열에 의해 적어도 하나의 딸세포가 또한 EPC 세포이도록 자기-유지가 가능하다. EPC는 100, 250, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000배 또는 그 초과로 확장될 수 있다.

EPC의 표현형결정은 이들 세포가 수임 조혈 마커 CD45를 발현함을 밝혀낸다. 추가로, EPC는 VEGFR-2 및/또는 Tie-2에 대해 면역반응성일 수 있다. 임의로, EPC는 CD14에 대해 면역반응성이다. EPC는 다능 전구 세포이다.

혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는, 배아 혈관신생 및 조혈에 필수적인 신호를 운반하는 VEGFR-1 (flt-1) 및 VEGFR-2 (flk-1/KDR) 및 VEGFR-3/Flt-4를 비롯한 특정 티로신 키나제 수용체를 통해 작용한다. VEGF가 모든 3개의 수용체에 결합하지만, 대부분의 생물학적 기능은 VEGFR-2를 통해 매개되고, VEGFR-1의 역할은 현재 공지되어 있지 않다. VEGFR3/Flt4 신호전달은 림프 내피 세포의 발달에 중요한 것으로 공지되어 있고, VEGFR3 신호전달은 내피 세포에 림프 내피-유사 표현형을 부여할 수 있다. VEGFR은 혈관 성장, 혈관이완, 혈관 투과성의 유도, 내피 세포 이동, 증식 및 생존의 자극에 필수적인 과정에 대한 신호를 전달한다. 내피 세포는 모든 다양한 VEGF-R을 발현한다. 배아발생 동안, 단일 전구 세포인 혈관모세포가 조혈계와 혈관계 둘 다를 생성시킬 수 있는 것으로 보고되어 있다.

Tie-2는 내피-특이적 수용체 티로신 키나제이며, 안지오포이에틴 1에 대한 수용체이다. 이는 활발히 성장하는 혈관의 내피에서 우세하게 발현되고 가장 이른 포유동물 내피 세포 계통 마커를 나타낼 수 있는 제I형 막 단백질이다. Tie-2는 내피 세포 증식 및 분화의 조절에 관여할 가능성이 있고, 혈관의 형성 동안 내피 세포의 특별한 배향을 지시할 수 있다.

CD14 항원은 리포폴리사카라이드 (LPS)와 LPS-결합 단백질 (LBP)의 복합체에 대한 높은 친화도 수용체이다. CD14 항원은 CD14, TLR4 및 MD-2로 구성된 기능적 이형체성 LPS 수용체 복합체의 일부이다. CD14는 말초 혈액, 다른 체액 및 다양한 조직, 예컨대 림프절 및 비장 내의 대부분의 인간 단핵구 및 대식세포 상에서 강하게 발현된다. CD14는 인간 호중구 및 골수 수지상 세포의 하위집단 상에서 약하게 발현된다.

CD45 항원은 백혈구 공통 항원 (LCA)으로도 공지되어 있는 티로신 포스파타제이다. CD45는 적혈구 세포, 혈소판 및 그의 전구체 세포를 제외한 조혈 기원의 모든 인간 세포 상에 존재한다. CD45 분자는 T 세포 및 B 세포 활성화에 요구되며, 세포의 활성화 상태에 따라 적어도 5종의 이소형으로 발현된다.

VEGFR-1+, VEGFR-2+ 및 Tie-2+ 세포는 각각 혈액 중 단핵 세포 전체 집단의 대략 3.0.+-.0.2%, 0.8.+-.0.5%, 2.0.+-.0.3%를 구성한다. CD14+/VEGFR-2+ 세포는 혈액 중 단핵구 전체 집단의 대략 2.0.+-.0.5% 및 혈액 중 단핵 세포의 0.08.+-.0.04%를 구성한다.

EPC는 시험관내 장기간 배양물 중에 유지될 수 있다. EPC는 배양물 중에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 또는 그 초과로 계대배양될 수 있다.

EPC는 전형적으로 세포 배양 1-3주 후에 발생하는 내피 콜로니-형성 세포를 포함한다. 내피 콜로니-형성 세포는 내피 계통으로 수임된 전구체 세포의 특성을 가지며, 문헌 [Smardja et al., Angiogenesis 14(1):17-27 (2011)]에 따르면 신생혈관에 합쳐질 수 있다.

EPC의 단리, 정제, 생체외 배양 및 특성화는 문헌 [Hill et al., N. Engl. J. Med. 348:593-600 (2003), Assmus et al., Circulation 106:3009-16 (2002), Wang et al., J. Am. Coll. Cardiol. 49:1566-71 (2007), 및 Kalka et al., P.N.A.S. 97:3422-7 (2000)]에 기재되어 있고, 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한, 내피 콜로니-형성 세포의 단리, 정제, 생체외 배양 및 특성화는 문헌 [Yoder et al., Blood 109:1801-1809 (2007), Ingram et al., Blood 104:2752-2760 (2004), 및 Smardja et al., Angiogenesis 14(1):17-27 (2011)]에 기재되어 있고, 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

예를 들어, 세포 집단은 양성 선택에 의해, 또는 어느 순서로든 양성 및 음성 선택 둘 다의 혼합에 의해 단리된다. 전구 세포 집단은 정제된다. 정제된 EPC 집단은 세포가 단리된 조 세포 집단보다 유의하게 더 높은 비율의 EPC를 함유한다.

예를 들어, 정제 절차는 전체 집단에 대해 EPC를 적어도 5배 증가, 바람직하게는 적어도 10배 증가, 보다 바람직하게는 적어도 15배 증가, 가장 바람직하게는 적어도 20배 증가, 최적으로는 적어도 25배 증가시켜야 한다. 정제된 EPC 집단은 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 25%, 가장 바람직하게는 적어도 35%, 최적으로는 적어도 50%의 EPC를 포함해야 한다.

본원에 기재된 방법은 최대 75%, 바람직하게는 최대 80%, 보다 바람직하게는 최대 85%, 가장 바람직하게는 최대 90%, 최적으로는 최대 95%의 줄기 세포를 포함하는 혼합물을 생성할 수 있다. 이러한 방법은 99%, 99.90%, 심지어 100%의 EPC를 포함하는 혼합물을 생산할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 정제된 집단은 상기 기재된 바와 같이 천연으로 존재하는 집단보다 유의하게 더 높은 수준의 EPC를 함유한다.

정제된 EPC 집단은, EPC의 항원 특성을 발현하는 줄기 세포의 집단을 함유하는 세포의 조 혼합물을 항원의 세포외 부분에 특이적으로 결합하는 분자와 접촉시킴으로써 단리할 수 있다. 이러한 기술은 양성 선택으로 공지되어 있다. 분자에의 EPC의 결합은 EPC가 항원을 발현하지 않는 오염 세포와 충분히 구별되도록 하여, 오염 세포로부터 줄기 세포가 단리되게 한다. 항원은 바람직하게는 VEGFR이고, 보다 바람직하게는 VEGFR-2이다.

오염 세포로부터 전구 세포를 분리하는데 사용되는 분자는 EPC를 특성화하는 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 분자일 수 있다. 분자는, 예를 들어 모노클로날 항체, 모노클로날 항체의 단편, 또는 수용체인 항원의 경우에는 그 수용체의 리간드일 수 있다. 예를 들어, FLK-1과 같은 VEGF 수용체의 경우에, 리간드는 VEGF이다.

본 개시내용의 고유한 단리된 세포는 그의 CD45+ 상태 및 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 예를 들어 VEGFR-2의 보유에 의해 다른 세포로부터 분리될 수 있다. 세포는 통상의 세포 분리 기술, 예컨대 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 시빈(Civin)의 미국 특허 번호 4,714,680, 4,965,204, 5,035,994, 및 5,130,144, 츠가모토(Tsukamoto) 등의 미국 특허 번호 5,750,397, 및 로켄(Loken) 등의 미국 특허 번호 5,137,809에 기재된 기술에 의해 단리될 수 있다. 따라서, 예를 들어, CD45 특이적 모노클로날 항체 또는 VEGFR-특이적 항체는 고체 지지체, 예컨대 니트로셀룰로스, 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 중공 섬유 막, 자기 비드 및 플라스틱 페트리 디쉬 상에 고정될 수 있다. 이어서, 전체 세포 집단은 고체 지지체를 통과하거나 비드에 첨가된다.

결합 분자에 결합된 세포는, 남아있는 세포 현탁액으로부터 고체 지지체를 물리적으로 분리함으로써 세포 현탁액으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체가 줄기 세포에 결합하기에 충분한 시간을 허용한 후, 미결합 세포는 생리학적 완충제로 용리되거나 세척 제거될 수 있다.

결합된 세포는 주로 고체 상 및 결합 분자의 성질에 따라 임의의 적절한 방법에 의해 고체 상으로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 결합된 세포는 강력한 교반에 의해 플라스틱 페트리 디쉬로부터 용리될 수 있다. 대안적으로, 결합된 세포는 고체 상과 항체 사이의 효소-감수성 "스페이서" 서열을 효소적으로 "닉킹" 또는 소화시킴으로써 용리될 수 있다. 아가로스 비드에 결합된 적합한 스페이서 서열은, 예를 들어 파마시아로부터 상업적으로 입수가능하다.

이어서, 용리된 풍부화된 세포 분획은 원심분리에 의해 완충제로 세척되어 통상의 기술에 따라 추후의 사용을 위해 저온에서 생존 상태로 보존될 수 있다. 세포는 또한, 예를 들어 수용자 내로의 정맥내 주입에 의해 즉시 사용될 수 있다.

고체 지지체에 부착된 채로 남아있는 세포는 사용된 항체에 의해 인식된 마커를 함유하는 세포이다. 따라서, 항-CD45 항체가 사용된 경우에, 생성된 집단에는 CD45+ 세포가 매우 풍부할 것이다. 사용된 항체가 VFGFR인 경우에, 생성된 집단에는 VEGFR+ 세포가 매우 풍부할 것이다. 이어서, 다른 마커에 대한 항체가 부착되어 있는 고체 상을 사용하는 단계를 반복함으로써 상기 집단에는 다른 마커가 풍부해질 수 있다.

CD45+ VEGFR+ 세포를 분류하기 위한 또 다른 방법은 유동 세포측정법, 가장 바람직하게는 형광-활성화 세포 분류기 (FACS), 예컨대 벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson)에 의해 팩스캔(FACScan) 또는 팩스칼리버(FACSCalibur)라는 명칭으로 제조된 것에 의해 이루어진다. 이러한 기술에 의해, CD45 마커를 갖는 세포는 특정한 형광 염료에 접합된 항-CD45 항체에 의해 이러한 염료로 태그부착된다. 유사하게, 세포의 VEGFR 마커는 다른 형광 염료에 접합된 항-VEGFR 항체에 의해 다른 염료로 태그부착된다. 염색된 세포가 기기 상에 위치할 때, 세포의 스트림은 형광색소를 여기시키는 아르곤 레이저 빔을 통해 지시되어 광을 방출한다. 이러한 방출광은 일련의 광학 필터에 의해서 형광색소의 방출 파장에 특이적인 광전자증배관 (PMT)에 의해 검출된다. PMT에 의해 검출된 신호는 그 자신의 채널에서 증폭되고, 컴퓨터에 의해 다양한 상이한 형태--예를 들어 히스토그램, 도트 디스플레이 또는 컨투어 디스플레이로 디스플레이된다. 따라서, 하나의 파장에서 방출되는 형광 세포는 특정 형광색소-표지된 시약과 반응성인 분자를 발현하는 반면, 비-형광 세포 또는 다른 파장에서 방출되는 형광 세포는 이러한 분자를 발현하지 않고 다른 파장에서 형광을 내는 형광색소-표지된 시약에 반응성인 분자를 발현할 수 있다. 유동 세포측정기는 또한 세포에 의해 발현된 형광의 양 (형광 강도)을 디스플레이한다는 점에서 반-정량적이다. 이는 상대적 의미에서 세포에 의해 발현된 분자의 수와 상관관계가 있다.

유동 세포측정기는 또한 비-형광 파라미터, 예컨대 세포 부피 또는 세포가 레이저 빔을 통과할 때 세포에 의해 산란된 광을 측정하도록 구비되어 있을 수 있다. 세포 부피는 통상적으로 직접 측정치이다. 광 산란 PMT는 전방각으로 세포에 의해 산란 (전방 산란; FSC)된 광 또는 직각으로 세포에 의해 산란 (측방 산란; SSC)된 광을 검출한다. FSC는 통상적으로 크기의 지수인 반면에 SSC는 세포 복잡성의 지수이고, 파라미터는 둘 다 다른 인자에 의해 영향을 받을 수 있다.

바람직하게는, 유동 세포측정기에는 하나 초과의 PMT 방출 검출기가 구비되어 있다. 추가의 PMT는 다른 방출 파장을 검출할 수 있어서, 각각 개별적 분리 채널에서 하나 초과의 형광색소의 동시 검출이 가능하다. 컴퓨터는 각 채널 또는 각 파라미터와 또 다른 파라미터의 상관관계의 분석을 가능하게 한다. FACS 기계에 전형적으로 사용되는 형광색소는 525 nm에서 방출 피크를 갖는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) (녹색), 575 nm에서 방출 피크를 갖는 R-피코에리트린 (PE) (오렌지색-적색), 620 nm에서 방출 피크를 갖는 아이오딘화프로피듐 (PI) (적색), 660 nm에서 방출 피크를 갖는 7-아미노악티노마이신 D (7-AAD) (적색), 670 nm에서 방출 피크를 갖는 R-피코에리트린 Cy5 (RPE-Cy5) (적색), 및 655-750 nm에서 방출 피크를 갖는 알로피코시아닌 (APC) (진적색)을 포함한다.

이들 및 다른 유형의 FACS 기계는 상이한 특성의 세포를 상이한 용기로 편향시킴으로써 다양한 분획을 물리적으로 분리하기 위한 추가의 능력을 가질 수 있다.

출발 물질, 예컨대 골수, 말초 혈액 또는 제대혈의 CD45+ VEGFR+ 집단을 단리하기 위한 임의의 다른 방법이 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 본 개시내용의 다양한 하위집단 (예를 들어, CD14+, Tie2+, CD144-)은 유사한 방식으로 단리될 수 있다.

조 세포 집단이 상기 기재된 바와 같이 정제되기 전 또는 후에, 전구 세포의 집단은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 추가로 농축될 수 있다. 예를 들어, 전구 세포는 EPC의 하나 이상 항원 특성에 대한 양성 선택에 의해 풍부화될 수 있다. 이러한 항원은, 예를 들어 CD14 또는 Tie-2를 포함한다.

한 실시양태에서, 혈액은 공여자의 순환 말초 혈액으로부터 직접 채혈된다. 혈액은 EPC를 포획하기 위한 고체 상-연결된 결합 분자, 예컨대 항체 VEGFR-2를 함유하는 칼럼을 통해 연속적으로 스며든다. 전구 세포-고갈 혈액은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 혈액성분채집술에 의해 공여자의 순환계에 즉시 되돌려진다. 혈액은 충분한 수의 전구 세포가 칼럼에 결합할 때까지 이러한 방식으로 처리된다. 이어서, 줄기 세포가 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 칼럼으로부터 단리된다. 이러한 방법은 드문 말초 혈액 전구 세포가 매우 많은 부피의 혈액으로부터 수거되도록 하며, 공여자로 하여금 비용 및 골수 수거의 통증 및 마취, 무통각, 수혈 및 감염과 연관된 위험성을 피할 수 있게 한다.

EPC는 본원에 기재된 방법을 사용하여 배양 및 증식된다. 세포는 말초 혈액으로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 단리함으로써 수득된다.

세포 현탁액은 세포를 유지시킬 수 있는 임의의 저장소, 특히 배양 플라스크, 배양 플레이트 또는 롤러 병, 보다 특히 25 cm² 배양 플라스크와 같은 작은 배양 플라스크에 시딩된다. 현탁액에서 배양된 세포는 대략 5x10⁴ 내지 2x10⁵개 세포/ml (예를 들어, 1x10⁵개 세포/ml)로 재현탁된다. 고정 기판 상에 플레이팅된 세포는 대략 2-3x10³개 세포/cm²로 플레이팅된다. 임의로, 배양 플레이트는 콜라겐과 같은 매트릭스 단백질로 코팅된다. 세포는, HEM, DMEM, RPMI, F-12 등을 포함하고 글루타민 및 다른 아미노산, 비타민, 미네랄 및 단백질, 예컨대 트랜스페린 등과 같이 세포 대사에 요구되는 보충물을 함유하는, 세포 성장을 지지할 수 있는 임의의 공지된 배양 배지 내에 놓일 수 있다. 배양 배지는 또한 효모, 박테리아 및 진균에 의한 오염을 방지하기 위한 항생제, 예컨대 페니실린, 스트렙토마이신 및 겐타미신 등을 함유할 수 있다. 배양 배지는 소, 말 및 닭 등으로부터 유래된 혈청을 함유할 수 있다.

배양 조건은 생리학적 조건에 가까워야 한다. 배양 배지의 pH는 생리학적 pH에 가까워야 한다 (예를 들어, pH 6-8, 약 pH 7 내지 7.8, 또는 pH 7.4). 생리학적 온도는 약 30℃ 내지 40℃ 범위이다. EPC는 약 32℃ 내지 약 38℃의 온도에서 배양된다 (예를 들어, 약 35℃ 내지 약 37℃).

임의로, 배양 배지는 적어도 하나의 증식-유도 ("유사분열촉진") 성장 인자로 보충된다. "성장 인자"는 EPC에 대한 성장, 증식-유도, 분화-유도 또는 영양 효과를 갖는 단백질, 펩티드 또는 기타 분자이다. "증식-유도 성장 인자"는 세포의 표면 상의 수용체에 결합하여 세포에 영양 또는 성장-유도 효과를 발휘하는 임의의 분자를 비롯한, EPC가 증식하도록 하는 영양 인자이다. 증식-유도 성장 인자는 EGF, 암피레귤린, 산성 섬유모세포 성장 인자 (aFGF 또는 FGF-1), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF 또는 FGF-2), 형질전환 성장 인자 알파 (TGFα), VEGF 및 그의 조합을 포함한다. 성장 인자는 통상적으로 약 1 fg/ml 내지 1 mg/ml 범위의 농도로 배양 배지에 첨가된다. 약 1 내지 100 ng/ml의 농도가 통상적으로 충분하다. 특정한 성장 인자의 최적 농도를 결정하기 위해 단순 적정 검정이 용이하게 수행될 수 있다.

성장 및 영양 인자의 생물학적 효과는 일반적으로 세포 표면 수용체에의 결합을 통해 매개된다. 다수의 이들 인자들에 대한 수용체가 확인되어 있고, 특정 수용체에 대한 항체 및 분자 프로브가 이용가능하다. EPC는 분화의 모든 단계에서 성장 인자 수용체의 존재에 대해 분석될 수 있다. 많은 경우에서, 특정한 수용체의 확인은 외인성 성장 또는 영양 인자의 첨가에 의해 특정 발달 경로를 따라 세포를 추가로 분화시키는데 있어서의 이용 전략에 대한 지침을 제공한다.

일반적으로, 시험관내에서 약 3-10일 후, EPC의 배양 배지는 배지를 흡인해내고 새로운 배지를 배양 플라스크에 첨가함으로써 보충된다. 임의로, 흡인된 배지는 수집되고 여과되어 EPC를 후속적으로 계대배양하기 위한 조건 배지로서 사용된다. 예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 그 초과의 조건 배지가 사용된다.

EPC 세포 배양물은 용이하게 계대배양되어 증식을 재개시할 수 있다. 예를 들어, 시험관내에서 3-7일 후, 배양 플라스크를 잘 진탕한 다음, EPC를 50 ml 원심분리 튜브에 옮겨 낮은 속도로 원심분리한다. 배지를 흡인해내고, EPC를 소량의 배양 배지에 재현탁시킨다. 이어서, 세포를 계수하고, 목적하는 밀도로 재플레이팅하여 증식을 재개시시킨다. 이러한 절차를 매주 반복하여 각 계대에서 생존 세포 수의 대수적 증가를 야기할 수 있다. 목적하는 수의 EPC가 수득될 때까지 절차를 계속한다.

EPC 및 EPC 자손은 필요할 때까지 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 동결보존될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,071,741, PCT 국제 특허 출원 WO93/14191, WO95/07611, WO96/27287, WO96/29862, 및 WO98/14058, 문헌 [Karlsson et al., 65 Biophysical J. 2524-2536 (1993)] 참조). EPC는 특정한 동결보존제를 함유하는 등장성 용액, 바람직하게는 세포 배양 배지에 현탁될 수 있다. 이러한 동결보존제는 디메틸 술폭시드 (DMSO) 및 글리세롤 등을 포함한다. 이들 동결보존제는 5-15% (예를 들어, 8-10%)의 농도로 사용된다. 세포는 -10℃ 내지 -150℃ (예를 들어, -20℃ 내지 -100℃ 또는 -70℃ 내지 -80℃)의 온도로 서서히 동결된다.

F. 세포의 유전자 변형

한 실시양태에서, 본 개시내용의 세포인 MSC 및/또는 EPC는 유전자 변형된다. 한 측면에서, 이러한 유전자 변형은 세포의 치료 활성을 증진시킨다. 이러한 변형의 비제한적 예는 내피 산화질소 신타제 (eNOS), 헴 옥시게나제 (HMOX1) 및 프로스타시클린 신타제 (PTGIS)의 증진된 발현 또는 활성화를 포함한다.

한 측면에서, 세포는 내피 산화질소 신타제 (eNOS), 헴 옥시게나제 (HMOX1) 및 프로스타시클린 신타제 (PTGIS)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 생물학적 활성의 발현을 증가시키는 핵산에 의해 형질전환된다. 한 측면에서, 핵산은 단백질을 코딩한다.

일부 측면에서, 세포는 이종 단백질을 생산하도록 유전자 변형된다. 때때로, 세포는 이종 단백질이 세포로부터 분비되도록 유전자 변형될 것이다. 그러나, 한 실시양태에서 세포는 기능적 비-단백질 코딩 폴리뉴클레오티드, 예컨대 dsRNA (전형적으로 RNA 침묵화를 위한 것), 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 촉매 핵산 (예컨대 리보자임 또는 DNA자임)을 발현하도록 변형될 수 있다.

유전자 변형 세포는 변형 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 적어도 하나의 시토카인의 존재 하에 배양될 수 있다. 이에 따라 수득된 유전자 변형 세포는 즉시 사용되거나 (예를 들어, 이식에서), 시험관내에서 배양 및 확장되거나, 추후의 사용을 위해 저장될 수 있다. 변형 세포는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 저장될 수 있으며, 예를 들어 액체 질소 중에서 동결될 수 있다.

본원에 사용된 유전자 변형은 본원에 기재된 세포 내로의 외인성 또는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입 또는 상기 세포 내의 내인성 유전자의 변형을 수반하는 임의의 유전자 변형 방법을 포괄한다. 유전자 변형은 형질도입 (시험관내 또는 생체내에서 숙주 또는 공여자로부터의 숙주 DNA의 수용자에게로의 바이러스 매개 전달), 형질감염 (단리된 바이러스 DNA 게놈으로의 세포의 형질전환), 리포솜 매개 전달, 전기천공, 인산칼슘 형질감염 또는 공동침전 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 형질도입 방법은 세포를 생산자 세포와 함께 직접 공동-배양하거나 (Bregni et al., 1992) 또는 적절한 성장 인자 및 다가양이온의 존재 또는 부재 하에 바이러스 상청액 단독과 배양하는 것을 포함한다.

외인성 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 벡터로 세포에 도입된다. 벡터는 바람직하게는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소를 포함한다. 이러한 벡터를 구축하는데 사용되는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 발현 벡터를 구축하기 위한 기술은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (3rd Ed., 2000); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1999)]에 상세하게 기재되어 있다.

벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 및 단순 포진 바이러스; 코스미드; 플라스미드 벡터; 합성 벡터; 및 관련 기술분야에서 전형적으로 사용되는 다른 재조합 비히클을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결될 수 있는 프로모터 및 클로닝 부위를 둘 다 함유하는 벡터가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 벡터는 시험관내 또는 생체내에서 RNA를 전사시킬 수 있고, 스트라타진(Stratagene) (캘리포니아주 라 졸라) 및 프로메가 바이오테크(Promega Biotech) (위스콘신주 매디슨)과 같은 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다. 구체적 예는 스트라타진으로부터의 pSG, pSV2CAT, pXtl; 및 파마시아로부터의 pMSG, pSVL, pBPV 및 pSVK3을 포함한다.

벡터는 레트로바이러스 벡터를 포함할 수 있다 (문헌 [Coffin et al., "Retroviruses", Chapter 9 pp; 437-473, Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1997] 참조). 본 개시내용에 유용한 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지된 절차에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, WO94/29438, WO97/21824 및 WO97/21825는 레트로바이러스 패키징 플라스미드 및 패킹 세포주의 구축을 기재하고 있다. 예시적인 벡터는 pCMV 포유동물 발현 벡터, 예컨대 pCMV6b 및 pCMV6c (키론 코포레이션 (Chiron Corp.)), pSFFV-Neo, 및 pBluescript-Sk+를 포함한다. 유용한 레트로바이러스 벡터의 비제한적 예는 뮤린, 조류 또는 영장류 레트로바이러스로부터 유래된 것이다. 통상적인 레트로바이러스 벡터는 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스를 기반으로 한 것 (MoMLV-벡터)을 포함한다. 다른 MoMLV 유래 벡터는 Lmily, LINGFER, MINGFR 및 MINT를 포함한다. 추가의 벡터는 깁본(Gibbon) 유인원 백혈병 바이러스 (GAIN) 및 몰로니 뮤린 육종 바이러스 (MOMSV) 및 비장 초점 형성 바이러스 (SFFV)를 기반으로 한 것을 포함한다. 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MESV)로부터 유래된 벡터는 MESV-MiLy를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 또한 렌티바이러스를 기반으로 한 벡터를 포함하고, 비제한적 예는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1 및 HIV-2)를 기반으로 한 벡터를 포함한다.

레트로바이러스 벡터 구축물을 생산하는데 있어서, 바이러스 gag, pol 및 env 서열은 바이러스로부터 제거되어, 외래 DNA 서열의 삽입을 위한 공간을 만들 수 있다. 외래 DNA에 의해 코딩된 유전자는 통상적으로 긴 말단 반복부 (LTR)의 강력한 바이러스 프로모터의 제어 하에 발현된다. 적절한 제어 조절 서열의 선택은 사용되는 숙주 세포에 좌우되고, 선택은 통상의 기술자의 기술 내에 있다. LTR의 프로모터에 더하여 다수의 프로모터가 공지되어 있다. 비제한적 예는 파지 람다 PL 프로모터, 인간 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 프로모터; 몰로니 뮤린 육종 바이러스 (MMSV), 라우스(Rous) 육종 바이러스 (RSV) 또는 비장 초점 형성 바이러스 (SFFV)의 U3 영역 프로모터; 그랜자임(Granzyme) A 프로모터; 및 그란자임 B 프로모터를 포함한다. 추가로 유도성 또는 다중 제어 요소가 사용될 수 있다. 적합한 프로모터의 선택은 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

이러한 구축물은, gag, pol 및 env 기능이 패킹 세포주에 의해 트랜스로 제공되면 바이러스 입자 내로 효율적으로 패킹될 수 있다. 따라서, 벡터 구축물이 패키징 세포 내로 도입되는 경우에, 세포에 의해 생산된 gag-pol 및 env 단백질은 벡터 RNA와 조립되어 배양 배지 내로 분비되는 감염성 비리온을 생산한다. 이에 따라 생산된 바이러스는 표적 세포의 DNA를 감염시켜 그 내로 통합될 수 있지만, 필수적인 패키징 서열이 결여되어 있기 때문에 감염성 바이러스 입자를 생산하지 못한다. 현재 사용중인 패킹 세포주의 대부분은 필요한 코딩 서열 중 하나를 각각 함유하는 개별 플라스미드로 형질감염되어서, 복제 적격 바이러스가 생산될 수 있기 전에 다중 재조합 사건이 필요하다. 대안적으로, 패키징 세포주는 프로바이러스를 보유한다. 프로바이러스는, 그것이 감염성 바이러스를 조립하는데 요구되는 모든 단백질을 생산할 수 있을지라도 그 자신의 RNA가 바이러스에 패키징될 수 없도록 무력화된다. 대신에 재조합 바이러스로부터 생산된 RNA가 패키징된다. 따라서, 패키징 세포로부터 방출된 바이러스 스톡은 재조합 바이러스만을 함유한다. 레트로바이러스 패키징 세포주의 비제한적 예는 PA12, PA317, PE501, PG13, PSI.CRIP, RDI 14, GP7C-tTA-G10, ProPak-A (PPA-6), 및 PT67을 포함한다.

다른 적합한 벡터는 아데노바이러스 벡터 (WO 95/27071 참조) 및 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함한다. 이들 벡터는 모두, 예를 들어 문헌 [Stem Cell Biology and Gene Therapy, eds. Quesenberry et al., John Wiley & Sons, 1998]; 및 미국 특허 번호 5,693,531 및 5,691,176에 기재된 바와 같이, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 아데노바이러스-유래 벡터의 사용은, 그들이 비-분열 세포를 감염시킬 수 없기 때문에 특정 상황 하에서 유리할 수 있다. 레트로바이러스 DNA와는 달리, 아데노바이러스 DNA는 표적 세포의 게놈 내로 통합되지 않는다. 또한, 외래 DNA를 운반하는 능력은 레트로바이러스 벡터보다 아데노바이러스 벡터에서 훨씬 더 크다. 아데노-연관 바이러스 벡터는 또 다른 유용한 전달 시스템이다. 이러한 바이러스의 DNA는 비-분열 세포 내로 통합될 수 있고, 다수의 폴리뉴클레오티드가 아데노-연관 바이러스 벡터를 사용하여 다양한 세포 유형 내로 성공적으로 도입되었다.

일부 실시양태에서, 구축물 또는 벡터는 2종 이상의 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 바람직하게는, 추가의 핵산 서열은 선택 마커, 구조 유전자, 치료 유전자 또는 시토카인/케모카인 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

선택 마커는 성공적인 유전자 변형을 모니터링하기 위한 목적으로, 그리고 DNA가 통합된 세포의 선택을 위해 구축물 또는 벡터에 포함될 수 있다. 비제한적 예는 약물 내성 마커, 예컨대 G148 또는 히그로마이신을 포함한다. 추가로, 예를 들어 마커가 HSV-tk 유전자인 음성 선택이 사용될 수 있다. 이러한 유전자는 세포가 아시클로비르 및 간시클로비르와 같은 작용제에 대해 감수성이게 할 것이다. NeoR (네오마이신/G148 내성) 유전자가 흔히 사용되지만, 유전자 서열이 표적 세포에 존재하지 않는 임의의 편리한 마커 유전자가 사용될 수 있다. 추가로, 비제한적 예는 저-친화도 신경 성장 인자 (NGFR), 증진된 형광 녹색 단백질 (EFGP), 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 (DHFR), 박테리아 hisD 유전자, 뮤린 CD24 (HSA), 뮤린 CD8a(lyt), 퓨로마이신 또는 플레오마이신에 대한 내성을 부여하는 박테리아 유전자, 및 .베타.-갈락토시다제를 포함한다.

추가의 폴리뉴클레오티드 서열(들)이 동일한 벡터 상에서 세포 내로 도입될 수 있거나 또는 제2 벡터 상에서 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 선택 마커는 동일한 벡터 상에 폴리뉴클레오티드로서 포함될 것이다.

본 개시내용은 또한, 내인성 유전자의 발현이 상향조절되어 야생형 세포와 비교하여 코딩 단백질의 생산이 증가되도록 내인성 유전자의 프로모터 영역을 유전자 변형하는 것을 포괄한다.

G. 제약 조성물 및 투여 방법

본 개시내용의 한 실시양태는 치료 유효량의 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 MSC-조건화 배양 배지 및 프로스타시클린 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 조성물은 내피 전구 세포 (EPC)를 추가로 포함한다.

한 측면에서, 제약 조성물은 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 어구 "제약상 허용되는"은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 이익/위험 비에 상응하도록 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉시켜 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다. 본원에 사용된 어구 "제약상 허용되는 담체"는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다.

제약상 허용되는 담체는 염수, 수성 완충 용액, 용매 및/또는 분산 매질을 포함한다. 이러한 담체의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 용액은 바람직하게는 멸균이고, 용이하게 주사가능할 수 있을 정도로 유동적이다. 바람직하게는, 용액은 제조 및 저장 조건 하에서 안정하고, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등의 사용을 통해 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존된다.

제약상 허용되는 담체로서 기능할 수 있는 물질 및 용액의 일부 예는 하기를 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원-무함유 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; 및 (22) 제약 제제에 사용되는 다른 비-독성 상용성 물질.

본 개시내용의 방법에 유용한 제약 조성물은 중합체 담체 또는 세포외 매트릭스를 포함할 수 있다.

다양한 생물학적 또는 합성 고체 매트릭스 물질 (즉 고체 지지체 매트릭스, 생물학적 접착제 또는 드레싱, 및 생물학적/의학적 스캐폴드)이 본 개시내용에서 사용하기에 적합하다. 매트릭스 물질은 바람직하게는 생체내 적용에 사용하기 위해 의학적으로 허용된다. 이러한 의학적으로 허용되고/거나 생물학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 또는 상용성인 물질의 비제한적 예는 흡수성 및/또는 비-흡수성인 고체 매트릭스 물질, 예컨대 예를 들어 돼지-유래 (및 다른 SIS 공급원)의 소장 점막하 (SIS); 가교 또는 비가교 알기네이트, 히드로콜로이드, 발포체, 콜라겐 겔, 콜라겐 스폰지, 폴리글리콜산 (PGA) 메쉬, 폴리글락틴 (PGL) 메쉬, 플리스, 발포체 드레싱, 생체접착제 (예를 들어, 피브린 접착제 및 피브린 겔) 및 하나 이상의 층의 죽은 탈-표피화 피부 등가물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

피브린 접착제는 다양한 임상적 상황에서 사용되어 온 외과적 실란트의 부류이다. 통상의 기술자가 인식하고 있을 바와 같이, 다수의 실란트는 본 개시내용의 방법에 사용하기 위한 조성물에서 유용하다. 그러나, 본 개시내용의 바람직한 실시양태는 본원에 기재된 세포와 피브린 접착제의 용도에 관한 것이다.

본원에 사용된 용어 "피브린 접착제"는 칼슘 이온의 존재 하에 피브린 중합체의 가교에 의해 형성된 불용성 매트릭스를 지칭한다. 피브린 접착제는 피브린 매트릭스를 형성하는 생물학적 조직 또는 유체로부터 유래된 피브리노겐 또는 그의 유도체 또는 대사물, 피브린 (가용성 단량체 또는 중합체) 및/또는 그의 복합체로부터 형성될 수 있다. 대안적으로, 피브린 접착제는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 피브리노겐 또는 그의 유도체 또는 대사물, 또는 피브린으로부터 형성될 수 있다.

피브린 접착제는 또한 피브리노겐과 피브린 접착제 형성 촉매 (예컨대 트롬빈 및/또는 인자 XIII)의 상호작용에 의해 형성될 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 피브리노겐은 촉매 (예컨대 트롬빈)의 존재 하에 단백질분해적으로 절단되어 피브린 단량체로 전환된다. 이어서, 피브린 단량체는 중합체를 형성할 수 있고, 이는 가교되어 피브린 접착제 매트릭스를 형성할 수 있다. 피브린 중합체의 가교는 촉매, 예컨대 인자 XIII의 존재에 의해 증진될 수 있다. 피브린 접착제 형성 촉매는 피브리노겐이나 트롬빈을 함유하는 혈장, 동결침전물 또는 다른 혈장 분획으로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 촉매는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다.

응괴가 형성되는 속도는 피브리노겐과 혼합된 트롬빈의 농도에 좌우된다. 효소 의존성 반응이라면, 온도가 높아질수록 (37℃까지) 응괴 형성 속도가 빨라진다. 응괴의 인장 강도는 사용된 피브리노겐의 농도에 좌우된다.

피브린 접착제의 용도 및 그의 제조 및 사용 방법은 미국 특허 번호 5,643,192에 기재되어 있다. 미국 특허 번호 5,643,192는 단일 공여자로부터의 피브리노겐 및 트롬빈 성분의 추출, 및 피브린 접착제로서 사용하기 위한 이들 성분들만의 조합을 개시하고 있다. 미국 특허 번호 5,651,982는 피브린 접착제에 대한 또 다른 제조 및 사용 방법을 기재하고 있다. 미국 특허 번호 5,651,982는 포유동물에서 국소 실란트로서 사용하기 위한 리포솜을 함유하는 피브린 접착제를 제공한다.

여러 공보는 치료제의 전달을 위한 피브린 접착제의 용도를 기재하고 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,983,393은 아가로스, 한천, 염수 용액, 글리코사미노글리칸, 콜라겐, 피브린 및 효소를 포함하는 질내 삽입물로서 사용하기 위한 조성물을 개시하고 있다. 또한, 미국 특허 번호 3,089,815는 피브리노겐 및 트롬빈으로 구성된 주사가능한 제약 제제를 개시하고 있고, 미국 특허 번호 6,468,527은 신체 내 특정 부위에의 다양한 생물학적 및 비-생물학적 작용제의 전달을 용이하게 하는 피브린 접착제를 개시하고 있다. 이러한 절차는 본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있다.

적합한 중합체 담체는 합성 또는 천연 중합체 뿐만 아니라 중합체 용액으로 형성된 다공성 메쉬 또는 스폰지를 포함한다. 매트릭스의 한 형태는 중합체 메쉬 또는 스폰지이고; 다른 형태는 중합체 히드로겔이다. 사용될 수 있는 천연 중합체는 단백질, 예컨대 콜라겐, 알부민 및 피브린; 및 폴리사카라이드, 예컨대 알기네이트 및 히알루론산의 중합체를 포함한다. 합성 중합체는 생분해성 및 비-생분해성 중합체를 둘 다 포함한다. 생분해성 중합체의 예는 히드록시산 중합체, 예컨대 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA) 및 폴리락트산-글리콜산 (PLGA), 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 폴리포스파젠 및 그의 조합을 포함한다. 비-생분해성 중합체는 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 에틸렌 비닐 아세테이트 및 폴리비닐 알콜을 포함한다.

가단성인 이온 또는 공유적으로 가교된 히드로겔을 형성할 수 있는 중합체가 세포를 캡슐화하는데 사용된다. 히드로겔은, 유기 중합체 (천연 또는 합성)가 공유 결합, 이온 결합 또는 수소 결합을 통해 가교되어 3차원의 개방-격자 구조를 생성함으로써 이 구조가 물 분자를 포획하여 겔을 형성하는 경우에 형성되는 물질이다. 히드로겔을 형성하는데 사용될 수 있는 물질의 예는 폴리사카라이드, 예컨대 알기네이트, 폴리포스파진, 및 폴리아크릴레이트 (이는 이온 결합에 의해 가교됨), 또는 블록 공중합체, 예컨대 플루로닉스(Pluronics)™ 또는 테트로닉스(Tetronics)™, 폴리에틸렌 옥시드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체 (이는 각각 온도 또는 pH에 의해 가교됨)를 포함한다. 다른 물질은 단백질, 예컨대 피브린, 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 히알루론산 및 콜라겐을 포함한다.

일반적으로, 하전된 측기를 갖는 이들 중합체 또는 그의 1가 이온성 염은 수용액, 예컨대 물, 완충 염 용액 또는 수성 알콜 용액에 적어도 부분적으로 가용성이다. 양이온과 반응할 수 있는 산성 측기를 갖는 중합체의 예는 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 아크릴산과 메타크릴산의 공중합체, 폴리(비닐 아세테이트) 및 술폰화 중합체, 예컨대 술폰화 폴리스티렌이다. 아크릴산 또는 메타크릴산 및 비닐 에테르 단량체 또는 중합체의 반응에 의해 형성된 산성 측기를 갖는 공중합체가 또한 사용될 수 있다. 산성 기의 예는 카르복실산 기, 술폰산 기, 할로겐화 (바람직하게는 플루오린화) 알콜 기, 페놀계 OH 기 및 산성 OH 기이다. 음이온과 반응할 수 있는 염기성 측기를 갖는 중합체의 예는 폴리(비닐 아민), 폴리(비닐 피리딘), 폴리(비닐 이미다졸) 및 일부 이미노 치환된 폴리포스파젠이다. 중합체의 암모늄 또는 4급 염은 또한 백본 질소 또는 펜던트 이미노 기로부터 형성될 수 있다. 염기성 측기의 예는 아미노 및 이미노 기이다.

또한, 본 개시내용의 방법에 사용되는 조성물은 적어도 하나의 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 염증 또는 통증을 치료하는데 도움을 주기 위한 진통제, 또는 조성물로 치료할 부위의 감염을 방지하기 위한 항감염제를 함유할 수 있다. 보다 구체적으로, 유용한 치료제의 비제한적 예는 하기 치료제 카테고리를 포함한다: 진통제, 예컨대 비스테로이드성 항염증 약물, 오피에이트 효능제 및 살리실레이트; 항감염제, 예컨대 구충제, 항혐기성균제, 항생제, 아미노글리코시드 항생제, 항진균 항생제, 세팔로스포린 항생제, 마크롤리드 항생제, 기타 .베타.-락탐 항생제, 페니실린 항생제, 퀴놀론 항생제, 술폰아미드 항생제, 테트라시클린 항생제, 항미코박테리아제, 항결핵 항미코박테리아제, 항원충제, 항말라리아 항원충제, 항바이러스제, 항레트로바이러스제, 살개선제, 항염증제, 코르티코스테로이드 항염증제, 항소양제/국부 마취제, 국소 항감염제, 항진균 국소 항감염제, 항바이러스 국소 항감염제; 전해질 및 신장 작용제, 예컨대 산성화제, 알칼리화제, 이뇨제, 탄산 안히드라제 억제제 이뇨제, 루프 이뇨제, 삼투성 이뇨제, 칼륨-보존성 이뇨제, 티아지드 이뇨제, 전해질 대체제 및 요산배설촉진제; 효소, 예컨대 췌장 효소 및 혈전용해 효소; 위장제, 예컨대 항설사제, 위장 항염증제, 위장 항염증제, 제산 항궤양제, 위산-펌프 억제 항궤양제, 위 점막 항궤양제, H2-차단 항궤양제, 담석분해제, 소화제, 구토제, 완하제 및 대변 연화제, 및 위장운동촉진제; 전신 마취제, 예컨대 흡입 마취제, 할로겐화 흡입 마취제, 정맥내 마취제, 바르비투레이트 정맥내 마취제, 벤조디아제핀 정맥내 마취제 및 오피에이트 효능제 정맥내 마취제; 호르몬 및 호르몬 개질제, 예컨대 낙태제, 부신 작용제, 코르티코스테로이드 부신 작용제, 안드로겐, 항안드로겐, 면역생물학적 작용제, 예컨대 이뮤노글로불린, 면역억제제, 톡소이드 및 백신; 국부 마취제, 예컨대 아미드 국부 마취제 및 에스테르 국부 마취제; 근골격 작용제, 예컨대 항통풍 항염증제, 코르티코스테로이드 항염증제, 금 화합물 항염증제, 면역억제성 항염증제, 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID), 살리실레이트 항염증제, 미네랄; 및 비타민, 예컨대 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 및 비타민 K.

본 개시내용의 방법에 유용한 조성물은 세포 배양 성분, 예를 들어 아미노산, 금속, 조효소 인자, 뿐만 아니라 그 중 일부는 예를 들어 줄기 세포의 후속 분화에 의해 발생할 수 있는, 다른 세포 소집단을 포함하는 배양 배지를 포함할 수 있다.

본 개시내용의 방법에 유용한 조성물은, 예를 들어 배양 배지로부터 대상 세포를 침강시키고 이를 목적하는 용액 또는 물질에 재현탁시킴으로써 제조될 수 있다. 세포는 배양 배지로부터, 예를 들어 원심분리, 여과, 한외여과 등에 의해 침강되고/거나 변화될 수 있다.

통상의 기술자는 조성물 중의, 및 본 개시내용의 방법에서 투여될, 세포 및 임의의 담체(들)의 양을 용이하게 결정할 수 있다. 한 실시양태에서, (활성 세포(들)에 더하여) 임의의 첨가제는 포스페이트 완충 염수 중 0.001 내지 50% (중량) 용액의 양으로 존재하고, 활성 성분은 마이크로그램 내지 밀리그램 정도로, 예컨대 약 0.0001 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 1 중량%, 보다 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 0.05 중량% 또는 약 0.001 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 10 중량%, 및 보다 더 바람직하게는 약 0.05 내지 약 5 중량%로 존재한다. 물론, 동물 또는 인간에게 투여될 임의의 조성물에 대해, 그리고 임의의 특정한 투여 방법에 대해, 적합한 동물 모델, 예를 들어 설치류, 예컨대 마우스에서 치사 용량 (LD) 및 LD50을 결정하여 독성을 결정하고; 적합한 반응을 유도할 조성물(들)의 투여량, 내부 성분의 농도 및 조성물(들)의 투여 시점을 결정하는 것이 바람직하다. 이러한 결정은 통상의 기술자의 지식, 본 개시내용 및 본원에 인용된 문헌으로부터 과도한 실험을 요구하지 않는다. 그리고, 순차적 투여를 위한 시간은 과도한 실험 없이 확인될 수 있다.

본 개시내용의 방법에 유용한 조성물은 카테터 투여, 전신 주사, 국부 주사, 정맥내 주사, 자궁내 주사 또는 비경구 투여를 비롯하여, 특히 국부 주사를 통해 투여될 수 있다. 본원에 기재된 치료 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)을 투여하는 경우에, 이는 일반적으로 단위 투여량의 주사가능한 형태 (용액, 현탁액, 에멀젼)로 제제화될 것이다.

본 개시내용의 한 실시양태에 따르면, 조성물은 프로스타글란딘 I₂ (PGI₂), 프로스타시클린 유사체, 포스포디에스테라제-5 (PDE-5) 억제제, 엔도텔린 수용체 길항제 (ETRA), 티로신 키나제 억제제 및 가용성 구아닐레이트 시클라제 자극제를 포함하는 적어도 하나의 다른 혈관병증용 의약과 함께 공-투여될 수 있다.

본 개시내용의 한 실시양태에 따르면, 혈관병증을 치료하는 방법은 폐동맥에서 혈전증을 감소시키거나; 폐동맥에서 염증을 감소시키거나; 폐동맥에서 내막 평활근의 증식을 감소시키거나; 폐동맥에서 총상 병변의 형성을 감소시키거나; 폐동맥에서 산화질소의 양을 증가시키거나; 폐동맥에서 PGI2의 양을 증가시키거나; 폐동맥에서 엔도텔린-1의 수준을 감소시키거나; 폐동맥에서 성장 인자의 양을 감소시키거나; 폐동맥에서 적절한 내피 형태를 촉진하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

전구 세포의 투여/이식에 의한 혈관병증의 치료는 문헌 [Wang et al., J. Am. Coll. Cardiol. 49:1566-71 (2007), Zhao et al. Circ. Res. 96:442-450 (2005), 및 Nagaya et al., Circulation 108:889-895(2003)]에 기재되어 있으며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

손상된 혈관 내로의 세포의 투여/이식은 손상된 혈관 조직, 예를 들어 정맥, 동맥, 모세관을 복구시켜 혈관 기능을 회복시키는 잠재력을 갖는다. 그러나, 이식 목적에 적합한 세포의 부재는 이러한 절차의 전체 잠재력이 충족되는 것을 막는다. "적합한" 세포는 하기 기준 중 하나 이상을 충족시키는 세포이다: (1) 다수로 수득될 수 있음; (2) 필요한 경우에 유전 물질의 삽입을 가능하게 하기 위해 시험관내에서 증식될 수 있음; (3) 무기한으로 생존하여 이식 시 혈관 복구를 촉진할 수 있음; 및 (4) 비-면역원성이고, 바람직하게는 환자 자신의 조직 또는 상용성 공여자로부터 수득됨. 적합한 세포는 자가, 동종 또는 이종 세포일 수 있다.

세포는 비정상적 혈관계 또는 관상동맥 부전 증상을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 세포는 수용자 자신의 혈액 또는 골수로부터 제조될 수 있다. 이러한 경우에, EPC는 해리된 조직으로부터 생성되어 상기 기재된 방법을 사용하여 시험관내에서 증식될 수 있다. 세포 수가 적합하게 확장되었을 때, EPC를 수거하고, 필요한 경우에 유전자 변형하고, 수용자의 혈관계로의 직접 주사를 위해 준비할 수 있다.

세포는 숙주에 대해 이종인 공여자 조직으로부터 제조될 수 있다. 이종이식편이 성공적이기 위해서, 이식된 조직에 대한 면역 반응을 감소시키거나 제거하는 몇몇 방법이 통상적으로 사용된다. 따라서, 수용자는 시클로스포린과 같은 면역억제 약물의 사용을 통해, 또는 국부 적용 면역억제제를 사용하는 국부 면역억제 전략을 통해 면역억제될 수 있다. 국부 면역억제는 문헌 [Gruber, 54 Transplantation 1-11 (1992)]에 개시되어 있다. 미국 특허 번호 5,026,365는 국부 면역억제에 적합한 캡슐화 방법을 개시하고 있다.

면역억제 기술을 사용하는 것에 대한 대안으로서, 문헌 [Smithies et al., 317 Nature 230-234 (1985)]에 교시되어 있으며 세포주에서의 유전자 대체 또는 녹아웃 (문헌 [Zheng et al., 88 Proc. Natl. Acad. Sci. 8067-8071 (1991)])으로 확대되는, 배아 줄기 세포에서 상동 재조합을 사용하는 유전자 대체 또는 녹아웃 방법이 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 유전자의 절제를 위해 EPC에 적용될 수 있다. MHC 발현이 결여된 EPC는 수용자를 면역억제시킬 필요없이 동종, 및 아마도 심지어는 이종의 조직적합성 장벽을 넘어 풍부화된 내피 세포 집단의 이식을 가능하게 한다. 공여자 세포의 항원성을 감소시키기 위한 재조합 방법의 사용에 관한 개략적 검토 및 인용이 또한 문헌 [Gruber, 54 Transplantation 1-11 (1992)]에 개시되어 있다. 표면 개질에 의해 이식물의 면역원성을 감소시키기 위한 예시적인 접근이 PCT 국제 특허 출원 WO 92/04033 및 PCT/US99/24630에 개시되어 있다. 대안적으로, MHC 항원을 변경하거나 결실시킨 트랜스제닉 동물로부터 EPC를 제조하여 이식편의 면역원성을 감소시킬 수 있다.

세포는 마이크로캡슐화 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 4,352,883; 4,353,888; 및 5,084,350 참조) 및 마크로캡슐화 (예를 들어, 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,284,761, 5,158,881, 4,976,859 및 4,968,733 및 PCT 국제 특허 출원 WO 92/19195 및 WO 95/05452 참조)를 비롯한 공지의 캡슐화 기술에 따라 캡슐화되어 숙주에게 인자를 전달하는데 사용될 수 있다. 마크로캡슐화는 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,284,761; 5,158,881; 4,976,859; 4,968,733; 5,800,828 및 PCT 국제 특허 출원 WO 95/05452에 기재되어 있다. 다중 마크로캡슐화 장치가 숙주에 이식될 수 있다.

수용자의 조직에 대해 동종인 조직으로부터 제조된 세포는 수용자의 조직적합성 유형과 밀접하게 매칭시키기 위해, 널리 공지된 조직형 결정 방법에 의해 사용에 대해 시험될 수 있다.

혈관계에 투여된 세포는 혈관 이식편을 형성하여, 그 세포가 이식된 또는 기존의 내피 세포와의 접촉을 유지하면서 이웃 혈관 세포와의 정상적인 연결을 형성할 수 있다. 따라서, 이식된 세포는 질환 및 노화로 인해 손상된 혈관 조직을 재확립할 수 있다.

숙주 혈관 조직으로의 이식편의 기능적 통합은 다양한 기능 회복에 대한 이식편의 유효성을 검사하는 것에 의해 평가될 수 있다.

본 개시내용의 한 실시양태에 따르면, 세포는 적어도 하나의 성장 인자, 예컨대 FGF, VEGF-A, VEGF-B, BMP-4, TGF-베타 등과 함께 수용자에게 공-투여될 수 있다.

실시예

본 발명의 기술은 하기 비제한적 실시예를 참조하여 추가로 정의된다. 조성물 및 방법 둘 다에 대한 많은 변형이 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 실시될 수 있다는 것은 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

실시예 1. BM-MSC에서의 세포성 반응을 위한 트레프로스티닐 농도의 최적화

본 실시예는 인간 골수 중간엽 줄기 세포 (BM-MSC)의 혈관신생 잠재력을 증진시키기 위해 요구되는 최소 트레프로스티닐 농도를 확인한다.

단일 바이알의 인간 골수-유래 MSC를 확장시키고, 표준 성장 배지를 사용한 6-웰 플레이트의 20개의 웰에 시딩하였다. 95-99% 전면생장률 시, 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 완전히 세척하였다. 이어서 세포를 0, 0.1, 1.0, 10, 또는 100 μg/mL의 트레프로스티닐을 함유하는 배지에 노출시켰다 (각 농도에 대해 n=4개의 웰).

배양 24시간 후, 각각의 반복물로부터 조건화 배지를 수집하고, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 단백질을 분석하였다. 본 실험의 목표는 MSC에서 세포성 반응을 유도하는데 필요한 트레프로스티닐의 최적 농도를 결정하는 것이다 (판독물로서 VEGF를 사용함).

유동 세포측정 분석 (도 1)은 본 연구에 사용된 골수 MSC가 MSC 마커 CD73, CD105, CD90, 및 HLA-ABC에 대해 양성임을 입증하였다. 세포는 CD34, CD45, CD14, CD19 및 HLA-DR에 대해서는 음성이거나 낮았다. MSC의 정의는 국제 세포 요법 학회에 의해 확립되었다 (Dominici et al., Cytotherapy 8(4):315-7, 2006).

도 2는 트레프로스티닐에 노출된 지 24시간 후 인간 골수 MSC에 의한 VEGF 분비를 제시하는 차트이다. 세포 배양 상청액에 대해 ELISA에 의해 VEGF를 검정하였다 (군당 n=4). 도 2에 제시된 바와 같이, 투여량 군들 사이에 어떠한 통계적 유의차도 관찰되지 않았다 (오차 막대는 시험 군의 표준 편차를 나타냄).

본 실험은 100 μg/mL 이하의 트레프로스티닐 농도가 인간 골수 MSC의 혈관신생 잠재력을 유의하게 증진시킬 수 없음을 시사한다. 그러나, 트레프로스티닐이 증가됨에 따라 VEGF 분비가 증가되는 약한 경향이 존재한다. 후속 실시예는 보다 높은 농도의 트레프로스티닐을 조사하였다.

실시예 2. BM-MSC에서의 세포성 반응을 위한 트레프로스티닐 농도의 최적화

본 실시예는 인간 BM-MSC의 혈관신생 잠재력을 증진시키기 위한 트레프로스티닐의 적절한 농도가 250 μg/mL임을 확인한다.

100 μg/mL를 초과하는 트레프로스티닐 농도가 VEGF의 MSC 분비에 영향을 미치는지를 결정하기 위해 실시예 1에 대한 후속 실험을 수행하였다. 앞서와 같이, 단일 바이알 (동일한 로트/배치)의 골수-유래 MSC를, 표준 성장 배지를 사용한 6-웰 플레이트의 30개의 웰에 확장시켰다. 95-99% 전면생장률 시, 세포를 PBS로 완전히 세척하였다. 이어서 세포를 0, 100, 200, 300, 또는 400 μg/mL의 트레프로스티닐을 함유하는 배지에 노출시켰다 (각 농도에 대해 n=6개의 웰).

트레프로스티닐 노출 24시간 후, 조건화 배지에 대해 ELISA에 의해 VEGF를 분석하였다 (n=4개의 반복물). 이들 반복물로부터의 세포를 용해시키고, RNA를 추출하여 qRT-PCR에 의해 VEGF-A 유전자 발현을 결정하였다. 나머지 2개의 반복물로부터의 세포를 트립신처리하고, 트리판 블루 배제에 의해 세포 생존율을 검정하였다.

세포 배양 상청액에 대해 ELISA에 의해 VEGF 단백질을 검정하였다 (도 3a, n=4). 이들 배양물로부터의 세포 용해물에 대해 qRT-PCR에 의해 VEGF-A 유전자 발현을 검정하고, 대조군 값에 대해 정규화하였다 (도 3b, n=4). 양 도면에서, 오차 막대는 각 시험 군에서의 표준 편차를 나타낸다.

도 4는 증가하는 농도의 트레프로스티닐에 노출된 MSC의 대표적인 이미지를 포함한다. 반올림되어 증가된 수인 가장 높은 용량 (400 μg/mL)에서, 탈착 세포는 MSC에 대한 트레프로스티닐의 세포독성 효과를 시사한다.

MSC를 트리판 블루로 염색하여 각 웰에서 살아있는 세포 및 죽은 세포의 총 개수를 결정하였다 (도 5, 군당 n=2개의 웰). 퍼센트 생존율은 트리판 블루 음성 세포와 총 집단 사이의 비 (100 x 살아있는 세포/총 세포)로서 계산하였다. 반복물이 너무 소수이기 때문에 통계적 분석을 수행할 수 없었지만, 트레프로스티닐 농도가 100 μg/mL를 초과하여 증가될수록 생존율이 감소되는 경향이 존재하였다. 그러나, 세포 생존율은 본 실험에서 시험된 임의의 용량 수준에서 85% 아래로 감소되지는 않았다.

본 실시예는 높은 수준의 트레프로스티닐이 MSC의 세포 생존율에 부정적인 영향을 미침을 입증한다. 100 μg/mL에서, VEGF 분비는 ~2배 증가하였지만, VEGF-A 유전자 발현은 노출 24시간 후의 비처리 대조군과 유의하게 다르지 않았다. VEGF-A 유전자 발현은 200 μg/mL 수준의 트레프로스티닐에서 5배를 초과하여 증가하였고, VEGF 분비는 대조군 값의 ~3배로 관찰되었다. VEGF 분비는 심지어 보다 높은 농도의 트레프로스티닐에 의해서도 이 값을 초과하여 증가되지 않았고, 이는 효과가 포화되었음을 시사한다. 따라서, 250 μg/mL를 후속 연구에 사용하기 위한 최적 트레프로스티닐 농도로서 선택하였다.

실시예 3. 250 μg/mL 트레프로스티닐에 노출된 MSC의 포괄적 분석

상기 실시예에 기초하여, 본 실시예는 MSC에서 세포성 반응을 유도하기 위한 트레프로스티닐 용량으로서 250 μg/mL를 선택하였다. 이 농도는 비처리 대조군 세포와 비교하여 증가된 VEGF 생산, 및 최소 세포독성 효과에 기초한 것이다.

인간 골수 MSC를 확장시키고, 표준 성장 배지를 사용한 6개의 T225 플라스크에 시딩하였다 (표 1). 95-99% 전면생장률 시, 세포를 PBS로 완전히 세척하였다. 3개의 플라스크에 250 μg/mL 트레프로스티닐을 함유하는 기초 배지 (+)Tre를 보급하고, 나머지 3개의 플라스크에는 비보충 기초 배지 (-)Tre를 보급하였다.

<표 1> MSC 활성에 대한 트레프로스티닐의 효과를 평가하기 위한 연구 설계.

배양 24시간 후, (+) Tre 및 (-) Tre 배양물로부터 대표적인 이미지를 캡처하였다. 각 반복물로부터 조건화 배지를 수집하고, 이를 적절한 부피의 2개의 샘플로 나누고, 하기에 대해 별개로 분석하였다: 1) 분비된 단백질 (미리아드 RBM 인플라메이션맵(Myriad RBM InflammationMAP)® 1.0) 및 2) 엑소솜 RNA 함량. 배양 플라스크로부터 세포를 직접 용해하고, 총 RNA 단리를 위해 처리하고, 마이크로어레이 (일루미나 인간 HT12 발현 비드칩)에 의해 유전자 발현을 분석하였다.

도 6은 세포 신호전달, 유전자 발현, 및 주변분비 인자의 방출에 대한 트레프로스티닐의 효과에 대한 모델을 예시하고, 하기 표는 효과를 시험하는데 유용한 검정을 제시한다.

MSC에 대한 트레프로스티닐의 효과를 특성화하기 위해, 세포를 qRT-PCR 및 마이크로어레이에 의해 분석하여 유전자 발현에서의 변화를 확인하였다 (4). 세포 배양 상청액 배지에 대해 비드-기반 면역검정에 의해 선택된 염증성 시토카인을 검정하였다 (2). 세포 배양 상청액으로부터 분비된 소포를 단리하고, qRT-PCR에 의해 RNA 함량에 대해 검정하였다 (7). 또한 소포에 대해 가변 저항 펄스 감지 또는 TRPS에 의해 크기 및 농도를 검정하였다 (7) (실시예 4 참조).

250 μg/mL의 트레프로스티닐에 24시간 동안 노출된 세포 (도 7a, 우측 패널)는 비처리 세포 (도 7a, 좌측 패널)와 비교하여 형태학상 어떠한 분명한 변화도 나타내지 않았다. 트레프로스티닐-처리 및 -비처리 배양물 둘 다에서의 트립신처리 세포에서 세포 생존율을 평가하였다. 트레프로스티닐 노출의 결과로서 어떠한 유의한 세포 사멸도 관찰되지 않았으며, 도 7b를 참조한다 (모든 반복물 및 조건에서 >95% 생존율).

MSC에서 qRT-PCR에 의해 VEGF-A의 유전자 발현을 확인하였다. 트레프로스티닐은 비처리 대조군보다 VEGF-A 발현을 ~3.5배 증가시켰다 (도 8, 상부 패널). 또한, 트레프로스티닐-노출된 MSC로부터 유래된 엑소솜 내 miR-21은 보다 풍부하였지만, let-7b는 대조군과 비교하여 덜 만연하였다 (도 8, 하부 패널; 별표는 통계적 유의성 (p<0.05)을 나타냄).

또한 250 ug/mL 트레프로스티닐의 부재 (-) 또는 존재 (+) 하의 배양물로부터의 MSC에 대해 마이크로어레이 유전자 발현 분석을 수행하였다. 각 조건으로부터 3개의 생물학적 반복물을 분석하였다. 모든 반복물에서 확인된 77,612개의 서열 중에서, 단지 24,273개 만이 50 계수의 임의의 배경 위에서 검출되었다. 2,984개의 RNA 서열은 Tre(-) 배양물에 대해 고유하였고, 1,781개의 RNA 서열은 Tre(+) 배양물에 대해 고유하였다 (패널 A). 양쪽 조건에서 검출된 유전자에 대해 차등 발현을 추가로 분석하였다 (패널). 공통적으로 발현된 19,508개의 유전자 중에서, 단지 1,690개 만이 유의하게 상이하였다 (p<0.01). 268개의 유전자는 비처리 MSC에서 적어도 4배 더 높은 것으로 발견되었고, 171개는 Tre(+) MSC 배양물에서 적어도 4배 더 높은 것으로 발견되었다.

도 9a 및 9b에 제시된 바와 같이, 차등 발현된 유전자는 (클러스터링 면에서) Tre(+) MSC 배양물과 대조군에서 분명하게 분리되고, 이는 트레프로스티닐이 MSC 세포의 기능 또는 활성에 대해 유의한 영향을 나타냄을 시사한다.

표 2-3은 트레프로스티닐에 반응하여 상향조절된 유전자를 열거한다. Tre(+) 배양물에서만 적어도 500 계수의 평균 값으로 발현된 유전자를 표 2에 제시한다. 비처리 세포와 비교하여 Tre(+)에서 적어도 10배 더 높게 발현된 유전자를 표 3에 제시한다.

표 4-5는 트레프로스티닐에 반응하여 하향조절된 유전자를 열거한다. Tre(+) 배양물에서 적어도 10배 하향조절된 유전자를 표 4에 제시한다. Tre(-) 배양물에서만 발현된 유전자 (즉, Tre(+) 배양물에서는 완전히 턴 오프됨)를 표 5에 제시한다.

<표 2> Tre(+)에서만 >500 계수로 발현된 유전자

<표 3> Tre(-)와 비교하여 Tre(+)에서 10배 증가된 유전자

<표 4> Tre(-)와 비교하여 Tre(+)에서 10배 감소된 유전자

<표 5> Tre(-)에서만 >500 계수로 발현된 유전자

비드-기반 면역검정 (루미넥스(Luminex))을 수행하여 세포 배양 상청액 내 46종의 시토카인의 농도를 평가하였다 (미리아드 RBM 휴먼 인플라메이션맵® 1.0). 평가된 46종 중에서, 6종이 트레프로스티닐-처리 및 -비처리 MSC 배양물에서 차등 분비되었다 (표 6 참조, 군당 n=3). 별표는 스튜던트 T 검정에 기초하여 군들 사이의 통계적 유의성을 나타낸다 (*p<0.001, 또는 **p<0.0001).

<표 6> 염증성 시토카인 분비는 트레프로스티닐로 처리된 MSC에서 변경됨

엑소솜 표본으로부터 총 RNA를 추출하고, 모 세포와의 실험에서 사용된 동일한 프라이머/프로브 세트로 qRT-PCR을 수행하였다 (도 8 참조). MSC-유래 엑소솜 내에 존재하는 VEGF-A 유전자 전사체는 트레프로스티닐 노출의 결과로서 ~4배 증가하였다 (도 10). 또한, miR-21 및 miR-199-3p가 트레프로스티닐-처리 세포로부터 유래된 엑소솜 내에서 유의하게 더 풍부해졌다 (p<0.05).

본 실시예는 MSC의 유전자 발현 및 분비 프로파일이 시험관내에서 트레프로스티닐에의 노출 24시간째에 변경됨을 제시한다. VEGF 단백질 및 유전자가 둘 다 증가되는 관찰에 기초하여, 트레프로스티닐은 MSC의 혈관신생 잠재력을 증가시킨다. 또한, 트레프로스티닐-처리 MSC의 엑소솜은 보다 높은 수준의 VEGF-A를 가지며, 이는 수평적 유전자 전달의 메카니즘을 통해 표적 세포에서 증가된 VEGF 생산을 촉진할 수 있다.

또한, miR-21 및 miR-199a-3p가 관찰되었고, 이는 또한 표적 세포의 활성에 영향을 미칠 수 있다 (Lee et al., Circulation 126(22):2601-11, 2012). 분비된 시토카인에서의 변화가 또한 트레프로스티닐 노출의 결과로서 관찰되었다. 특히, IL-6은 대조군 MSC와 비교하여 ~50배 더 생산된 반면에, MCP-1은 ~6-7배 덜 분비되었다.

실시예 4. 250 μg/mL 트레프로스티닐에 노출된 MSC로부터 유래된 엑소솜의 물리적 분석.

실시예 3에 기재된 실험 절차를 반복하여 추가의 분석을 위해 충분한 엑소솜을 생성하였다. 트레프로스티닐-처리 및 -비처리 MSC 배양물로부터의 조건화 배지를 가변 펄스 저항 감지 (TRPS)에 의해 분석하였다. 이 방법은 샘플을 통한 전류의 변화에 기초하여 샘플 중에 현탁된 입자의 수, 뿐만 아니라 각각의 입자의 크기를 정량화한다.

트레프로스티닐-처리 및 -비처리 MSC로부터 유래된 엑소솜의 크기 분포를 도 11a-b에 나타낸다. 트레프로스티닐-처리 MSC (도 11a) 및 -비처리 MSC (도 11b)로부터의 엑소솜 표본에 대해 가변 저항 펄스 감지 (TRPS)에 의해 50-600 nm 크기의 입자를 분석하였다. 각각의 엑소솜 집단에 대한 이들 대표적인 히스토그램은 대부분의 입자가 양쪽 군에서 150-200 nm의 크기임을 입증한다. 트레프로스티닐-처리 MSC는 보다 균일한 엑소솜 집단을 생성하여, 집단의 거의 60%가 ~200 nm 크기 카테고리에 속한다. 각각의 조건에 대한 총 입자 계수는 >500 계수였다.

엑소솜 표본의 입자 농도를 TRPS에 의해 결정하였다. 대조군 (n=1)과 비교하여 (+) 트레프로스티닐 표본에서 보다 소수의 입자가 관찰되었다. 평균 크기, 최빈 크기 및 크기 범위가 2개의 군 사이에 비교가능하였고, 표 7에 포함되어 있다.

<표 7> (+) 트레프로스티닐 및 (-) 트레프로스티닐 표본의 엑소솜 크기 및 농도

본 실시예는 트레프로스티닐이 보다 균일한 엑소솜 집단을 생성할 수 있음을 시사한다.

상기 기재가 특정한 바람직한 실시양태에 관해 언급할지라도, 본 개시내용은 그렇게 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 통상의 기술자는 개시된 실시양태에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 이러한 변형은 본개시내용의 범위 내에 있도록 의도됨을 인식할 것이다.

본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허 출원 및 특허는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

Claims (20)

1. 혈관병증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여되는, 프로스타시클린, 및 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 상기 MSC와 접촉되어 있어 MSC로부터 유래된 엑소솜을 함유하는 배양 배지의 일부를 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 MSC 또는 상기 MSC와 접촉되어 있어 MSC로부터 유래된 엑소솜을 함유하는 배양 배지의 일부는 MSC 또는 MSC의 배양물을 프로스타시클린으로 생체외에서 전-처리함으로써 수득되며, MSC 또는 MSC-유래의 엑소솜은 비처리된 MSC 또는 MSC-유래의 엑소솜과 비교하여 하나 이상의 혈관신생촉진 인자의 증가된 생성을 가지며, 혈관병증은 폐동맥 고혈압 (PAH), 말초 혈관 질환 (PVD), 중증 사지 허혈 (CLI), 관상 동맥 질환 및 당뇨병성 혈관병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 상기 대상체에서 혈관병증을 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물.
2. 제1항에 있어서, 혈관신생촉진 인자가 VEGF인 제약 조성물.
3. 제1항에 있어서, 프로스타시클린 및 조성물이 공동으로 투여되는 것인 제약 조성물.
4. 제1항에 있어서, 프로스타시클린 및 조성물이 개별적으로 투여되는 것인 제약 조성물.
5. 제1항에 있어서, 내피 전구 세포 (EPC)를 추가로 포함하는 제약 조성물.
6. 제5항에 있어서, EPC가 대상체로부터 수득된 것인 제약 조성물.
7. 제5항에 있어서, EPC가 내피 산화질소 신타제 (eNOS), 헴 옥시게나제 (HMOX1) 및 프로스타시클린 신타제 (PTGIS)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 생물학적 활성의 발현을 증가시키는 핵산에 의해 형질전환된 것인 제약 조성물.
8. 제7항에 있어서, 핵산이 상기 단백질을 코딩하는 것인 제약 조성물.
9. 제1항에 있어서, 프로스타시클린이 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 베라프로스트, 일로프로스트, PGI₂ 수용체 효능제 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
10. 제9항에 있어서, 프로스타시클린이 트레프로스티닐 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 에스테르인 제약 조성물.
11. 제1항에 있어서, MSC가 중간엽 전구체 세포 (MPC)인 제약 조성물.
12. 제1항에 있어서, MSC가 골수로부터 수득된 것인 제약 조성물.
13. 제1항에 있어서, 엑소솜이, 프로스타시클린이 배양 동안 첨가되지 않은 중간엽 줄기 세포 배양물로부터 수득된 엑소솜에 비해 적어도 약 4배 증가된 VEGF-A 유전자 전사체 수준을 갖는 것인 제약 조성물.
14. 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 확장 동안 MSC 또는 MSC의 배양물을 프로스타시클린으로 생체외에서 전-처리함으로써 MSC 또는 상기 MSC와 접촉되어 있어 MSC로부터 유래된 엑소솜을 함유하는 배양 배지의 일부를 수득하는 것을 포함하며, 여기서 MSC 또는 MSC-유래의 엑소솜은 비처리된 MSC 또는 MSC-유래의 엑소솜과 비교하여 하나 이상의 혈관신생촉진 인자의 증가된 생성을 갖는 것인, MSC 또는 MSC-유래의 엑소솜을 포함하는 환자에게 투여하기 위한 조성물을 제조하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 혈관신생촉진 인자가 VEGF인 방법.
16. 제14항에 있어서, 엑소솜이, 프로스타시클린이 배양 동안 첨가되지 않은 중간엽 줄기 세포 배양물로부터 수득된 엑소솜에 비해 적어도 약 4배 증가된 VEGF-A 유전자 전사체 수준을 갖는 것인 방법.
17. 폐동맥 고혈압 (PAH), 말초 혈관 질환 (PVD), 중증 사지 허혈 (CLI), 관상 동맥 질환 및 당뇨병성 혈관병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈관병증의 치료에 사용하기 위한, 제14항의 방법에 의해 수득가능한 처리된 조성물.
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제

Images