JP6431850B2 - プロスタサイクリンおよび間葉系幹細胞による脈管障害の処置 - Google Patents

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本出願は、２０１３年１月９日に出願された米国仮出願番号第６１／７５０，４５８号に対する３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ １１９条（ｅ）に基づく利益を請求する。その内容は、その全体が参照により本開示内に組み込まれる。

本出願は、脈管障害、例えば、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）および他の種類の肺高血圧症、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症下肢虚血（ＣＬＩ）、冠状動脈疾患、糖尿病性脈管障害等の処置における間葉系幹細胞の使用に関する。

肺動脈性高血圧症は、進行性の肺傷害であり、未処置の場合、診断された後、平均２．８年以内に死に至る。肺循環の進行する狭窄が、右心のストレス増大をもたらし、右心不全に発展し得る。定義によれば、慢性の肺高血圧症の症例における平均肺動脈圧（ｍＰＡＰ）は、安静時に２５ｍｍＨｇより大きく、労作中に３０ｍｍＨｇより大きい（正常値は、２０ｍｍＨｇ未満である。）。肺動脈性高血圧症の病態生理学は、血管収縮および肺血管の組織修復により特徴付けられる。慢性ＰＡＨでは、最初に筋肥大していない肺血管の筋肥大新生が存在し、既に筋肥大した血管の血管筋は、外周で増加する。肺循環のこの進行する閉塞は、右心における進行性のストレスをもたらす。前記ストレスは、右心からの低下した出力をもたらし、最終的に、右心不全をもたらす（M. Humbert et al., J. Am. Coll. Cardiol. 2004, 43, 13S-24S）。ＰＡＨは、１００万人あたりに１〜２人の有病率である、非常に稀な障害である。患者の平均年齢は、３６歳であると推定されており、患者の１０％のみが、６０歳を超えていた。明確に、男性より女性が罹患する（G. E. D'Alonzo et al., Ann. Intern. Med. 1991, 115, 343-349）。

上市されている標準的な治療剤（例えば、プロスタサイクリン類似体、エンドセリン受容体アンタゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤）は、患者の生活の質、運動耐性および予後を改善することが可能である。これらの治療剤の原理は、主に、血管緊張に影響を及ぼすが、病原性の組織修復プロセスにおける直接的な影響を有しない血流力学的なものである。さらに、これらの薬剤を使用する可能性は、場合により、深刻な副作用および／または混合型の投与により制限される。患者の臨床状態が特定の単剤療法により改善または安定化され得る期間は限定的である。最終的には、治療は段階的に拡大するため、混合療法が適用される。この場合、複数の薬剤が、同時に提供されなければならない。肺動脈性高血圧症の治療における全ての利点に関わらず、この深刻な障害の治癒の見通しは未だに存在しない。

末梢血管疾患（ＰＶＤ）の用語は、末梢の動脈および静脈内の傷害、機能不全または障害を意味する。末梢動脈疾患は、ＰＶＤの最も一般的な形式である。末梢血管疾患は、動脈の最も一般的な疾患であり、米国において非常に一般的な症状である。末梢血管疾患は、ほとんどが、５０歳を超える人々において起こる。末梢血管疾患は、５０歳を超える人々および糖尿病を有するそれらの人々における能力障害の主因である。米国において約１０００万人が、末梢血管疾患を有し、これは、５０歳を超える人々の約５％に換算される。前記症状を有する人数は、人口の高齢化と共に増加することが予測される。男性は、女性よりわずかに多く、末梢血管疾患を有するであろう。

進行した末梢動脈閉塞による重症下肢虚血（ＣＬＩ）は、休息時の血流および酸素輸送の低下により、休息時の筋肉痛および、非治癒性の皮膚潰瘍または壊疽を生じることにより特徴付けられる（Rissanen et al., Eur. J. Clin. Invest 31:651-666 (2001)；Dormandy and Rutherford, J. Vasc. Surg. 31: S1-S296 (2000)）。重症下肢虚血は、１年間で、１００万人あたりに５００〜１０００人において発症すると推測される（「Second European Consensus Document on Chronic Critical Leg Ischemia」, Circulation 84(4 Suppl.) IV 1-26 (1991)）。重症下肢虚血を有する患者において、その関連する病的状態、死亡および機能的関連に関わらず、切断が、多くの場合、身体的障害の兆候に対する解決策として推奨される（M. R. Tyrrell et al., Br. J. Surg. 80: 177-180 (1993)；M. Eneroth et al., Int. Orthop. 16: 383-387 (1992)）。重症下肢虚血に最適な医療的治療は存在しない（Circulation 84(4 Suppl.): IV 1-26 (1991)）。

冠状動脈疾患（アテローム硬化症）は、ヒトにおける進行性疾患である。この場合、１つ以上の冠状動脈が、プラークの蓄積により徐々に閉塞される。この疾患を有する患者の冠状動脈は、多くの場合、部分的に閉塞した動脈を開くのを支える、バルーン血管形成またはステントの挿入により処置される。最終的に、これらの患者は、非常に高価でリスクのある、冠状動脈バイパス手術を受ける必要がある。

一実施形態では、本開示は、対象に、プロスタサイクリンと、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣと接触しており、ＭＳＣの１つ以上の成分を含む培地の一部を含む組成物とを投与することを含む、必要とする対象において脈管障害を治療または予防するための方法に関する。プロスタサイクリンおよび組成物は、同時または別々に投与され得る。

一部の実施形態では、投与前に、ＭＳＣは、プロスタサイクリンと接触している。同様に、培地またはＭＳＣ（該ＭＳＣから培地を取得する）は、このような投与の前に、プロスタサイクリンとの接触に供され得る。したがって、一部の実施形態では、前記方法は、さらに、このような前処理工程を含む。

ＭＳＣ培養物の一部から取得された成分の非限定的な例としては、エクソソーム、微小小胞、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ミトコンドリア、増殖因子またはそれらの組み合わせがあげられる。

一態様において、このような方法は、さらに、対象に、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を投与することを必要とする。一態様において、ＥＰＣは、対象から取得される。一部の態様では、ＥＰＣは、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＯＸ１）およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＴＧＩＳ）からなる群から選択されるタンパク質の生物学的活性の発現を増大させる核酸により形質転換される。一態様において、核酸は、タンパク質をコードする。

プロスタサイクリンの例としては、限定されるものではないが、エポプロステノールナトリウム、トレプロスチニル、ベラプロスト、イルプロストおよびＰＧＩ_２受容体アゴニストがあげられる。一態様において、プロスタサイクリンは、トレプロスチニルまたは薬学的に許容され得るその塩もしくはそのエステルである。

実施形態において、さらに、治療的に有効量のプロスタサイクリンと、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣと接触しており、ＭＳＣから放出された化合物を含む培地と、薬学的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が提供される。一部の態様では、組成物は、さらに、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む。

さらに別の実施形態は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣと接触しており、ＭＳＣから放出された化合物を含む培地を含む、ｉｎ ｖｉｖｏ送達用の組成物を調製するための方法であって、ＭＳＣをプロスタサイクリンと接触させることを含む方法を提供する。このような方法により取得可能な処理された組成物も提供される。

他の実施形態では、医薬組成物は、さらに、少なくとも１つの薬学的に許容され得るキャリアまたは少なくとも１つの治療剤を含む。別の実施形態では、対象は、脈管障害、例えば、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症下肢虚血（ＣＬＩ）、冠状動脈疾患または糖尿病性脈管障害に罹患している。他の実施形態では、本方法は、肺動脈における血栓症を低減し、肺動脈における炎症を低減し、肺動脈における内膜平滑筋の増殖を低減し、肺動脈における叢状病変の形成を低減し、肺動脈における一酸化窒素の量を増加させ、肺動脈におけるＰＧＩ_２の量を増加させ、肺動脈におけるエンドセリン−１のレベルを低下させ、または、肺動脈における増殖因子の量を低下させる。他の実施形態では、本方法は、肺動脈における適切な内皮形態を促進する。

この開示の実施形態として図面を提供するが、これは例示のみを目的とし、限定するものではない。

ヒト骨髄由来のＭＳＣにおける免疫表現型分析の結果を示す。

トレプロスチニルに対する暴露の２４時間後のヒト骨髄ＭＳＣによる、ＶＥＧＦ分泌を示すチャートである。

トレプロスチニルに対する暴露の２４時間後におけるＶＥＧＦの、ＭＳＣ分泌チャートを表す。 トレプロスチニルに対する暴露の２４時間後におけるＶＥＧＦの、遺伝子発現チャートを表す。

増大した濃度のトレプロスチニルに曝されたＭＳＣの典型的な画像を表す。

トレプロスチニルに曝されたＭＳＣの細胞生存率を示すチャートである。

細胞のシグナル伝達、遺伝子発現およびパラクリン因子の放出における、トレプロスチニルの効果についてのモデルを図示する。

２５０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルで処理されたＭＳＣまたは同処理をされていないＭＳＣを示す、画像を表す。 ２５０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルで処理されたＭＳＣまたは同処理をされていないＭＳＣを示す、チャートを表す。

トレプロスチニルで処理されたＭＳＣにおいて、選択された遺伝子の変化した発現を示す２つのチャートを表す。

最も明確に特異的に発現した遺伝子を用いて、トレプロスチニルで処理されたＭＳＣをコントロールからクラスター化する、２つのヒートマップを表す。 他の遺伝子配列もしくは配列タグを用いて、トレプロスチニルで処理されたＭＳＣをコントロールからクラスター化する、２つのヒートマップを表す。

ＭＳＣ由来のエクソソームにおけるＲＮＡ含量が、トレプロスチニル処理により変化することを示すチャートを表す。

トレプロスチニル処理ＭＳＣ由来のエクソソームのサイズ分布を示す。 トレプロスチニル未処理ＭＳＣ由来のエクソソームのサイズ分布を示す。

一部または全ての図は、例示のための模式的表現である。このため、それらは、示された構成要素の実際の相対的なサイズまたは位置を必ずしも図示しない。図は、それらが、以下の特許請求の範囲の範囲または意味を限定するのに使用されないであろうという明白な理解を伴って、１つ以上の実施形態を説明する目的のために表される。

特に断らない限り、「ａ」または「ａｎ」は、「１以上（one or more）」を意味する。

特に他に規定しない限り、本願明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、（例えば、幹細胞の生物学、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学および生化学における）当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有するであろう。

特に断らない限り、本開示において使用される組換えタンパク質、細胞培養および免疫技術は、当業者に周知の標準的な手法である。このような技術は、例えば、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)、T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)、D. M. Glover and B. D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)およびF. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience（1988、現在までの全てのアップデートを含む）、Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)ならびにJ. E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons（現在までの全てのアップデートを含む）の出典における文献全体を通して記載され、説明される。これらの文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。

本願明細書において、プロスタサイクリンおよび間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の両方が、脈管障害についての治療活性を有することが見出される。さらに、プロスタサイクリンおよびＭＳＣの組み合わせは、相乗効果を生じさせる。このような組み合わせは、患者に対する、プロスタサイクリンおよびＭＳＣの同時もしくは別々であり得る共投与、または、プロスタサイクリンにより前処理されているＭＳＣ組成物の患者への投与のいずれかであり得る。

ＭＳＣが、患者における脈管障害を改善し得ることが示され、このような治療効果は、抗炎症因子および血管新生促進因子を疾患領域に送達させることにより、局所微小環境を改善するＭＳＣの能力によって達成されると考えられる。ただし、ＭＳＣは、身体において短命であり、再生しない。

プロスタサイクリン、例えば、トレプロスチニル（ＴＰ）は、肺動脈性高血圧（ＰＡＨ）の患者を処置するのに使用されてきた。この観点から、プロスタサイクリンは、血管拡張活性および抗血小板凝集活性を有することが示されてきた。

プロスタサイクリンが、脈管障害の処置のためのＭＳＣの活性を増大させて、このような処置についての相乗性を示し得ることは、予期せぬ発見である。この観点から、プロスタサイクリンが、血管成長におけるＭＳＣの有益な効果を増大させることが観察される。例えば、プロスタサイクリンは、タンパク質および遺伝子のレベルの両方において、ＶＥＧＦの発現を増大させる。分泌されたサイトカインの変化も、プロスタサイクリン暴露の結果として観察される。例えば、ＩＬ−６は、約５０倍増大する。一方、ＭＣＰ−１は、約６〜７倍低下する。

このような相乗性は、患者が、さらに、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を投与された場合にも証明される。このため、プロスタサイクリンは、ＭＳＣによりＥＰＣの活性を増大させ得ると考えられる。したがって、このような相乗性により、プロスタサイクリンとＭＳＣとの組み合わせ（任意に、ＥＰＣも一緒に）の使用は、改善された治療結果および／または各作用剤単独の必要性の低下を導くことができ、それは、次に、より高い用量において各作用剤単独により潜在的に引き起こされる悪影響の低下をもたらすことができる。

さらに、このような相乗性は、ＭＳＣ馴化培地に適用可能であると考えられる。この目的のために、プロスタサイクリン処理ＭＳＣのエクソソームが、より高いレベルのＶＥＧＦ−Ａを有し、それが、遺伝子水平伝播のメカニズムにより、ターゲット細胞におけるＶＥＧＦ産生の増大を促進し得ることが観察される。さらに、プロスタサイクリンに対する暴露は、より均質な集合のエクソソームを生じさせる。

本願明細書で使用する場合、「ＭＳＣ馴化培地」は、（例えば、ＭＳＣを培養する目的で）ＭＳＣと接触しているため、ＭＳＣから放出された化合物を含む培地を意味する。このような放出された化合物の非限定的な例としては、メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ミトコンドリア、増殖因子もしくは他の種の生物学的活性剤を封入し得るエクソソームまたは他の微小小胞があげられる。

本願明細書で使用する場合、「培地」は、（ａ）ＭＳＣを培養するのに使用される典型的な成分、例えば、アミノ酸、グルコースおよび種々の塩を含む、ＭＳＣを含むかもしくは含まない培地、ならびに、（ｂ）培養中にＭＳＣから放出された化合物を含む培地から単離された組成物の両方を包含する。

したがって、本開示の一実施形態は、必要とする対象において脈管障害を治療または予防するための方法であって、対象に、プロスタサイクリンおよび間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ馴化培地を含む組成物（まとめて、「ＭＳＣ組成物」）を投与することを含む方法を提供する。

一態様では、プロスタサイクリンおよびＭＳＣ組成物は、同時に投与される。別の態様では、プロスタサイクリンおよびＭＳＣ組成物は、別々に投与される。別々に投与される場合、プロスタサイクリンは、ＭＳＣ組成物の投与前または同投与後に投与され得る。

別の実施形態では、必要とする対象において脈管障害を治療または予防するための方法であって、単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ馴化培地を含む組成物をプロスタサイクリンと接触させ、ついで、ＭＳＣ組成物を対象に投与することを含む方法が提供される。

脈管障害の非限定的な例としては、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症下肢虚血（ＣＬＩ）、冠状動脈疾患および糖尿病性脈管障害があげられる。

本願明細書で使用する場合、「対象」（本願明細書では、「患者」とも呼ばれる）の用語は、温血動物、好ましくは哺乳類、例えば、ヒトを含む。好ましい実施形態では、対象は、霊長類である。さらにより好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。

本願明細書で使用する場合、「治療すること（treating）」、「治療する（treat）」または「治療（treatment）」の用語は、脈管障害の少なくとも１つの兆候を低減または除去するのに十分な治療的に有効量の本願明細書に規定された細胞を投与することを含む。

本願明細書で使用する場合、「予防すること（preventing）、「予防する（prevent）または「予防（prevention）」の用語は、脈管障害の少なくとも１つの兆候の進行を停止または防止するのに十分な治療的に有効量の本願明細書に規定された細胞を投与することを含む。

Ａ．プロスタサイクリン
本願明細書で使用される「プロスタサイクリン」の用語は、任意のプロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）、任意のプロスタサイクリン類似体および任意のＰＧＩ_２受容体アゴニストを明示的に含む。本技術に適したプロスタサイクリンの非限定的な例としては、エポプロステノールナトリウム（例えば、Ｆｌｏｌａｎ（登録商標））、トレプロスチニル（例えば、ＴＹＶＡＳＯ（登録商標）、レモジュリン（登録商標））、イルプロスト（例えば、Ｖｅｎｔａｖｉｓ（登録商標））およびＰＧＩ_２受容体アゴニスト（例えば、Ｓｅｌｅｘｉｐａｇ）があげられる。一態様では、プロスタサイクリンは、トレプロスチニルまたは薬学的許容され得る塩もしくはそのエステルである。

Ｂ．間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靭帯、腱、骨格筋、真皮および骨膜において見出される細胞であり、種々の生殖細胞株、例えば、中胚葉、内胚葉および外胚葉に分化可能である。例えば、ＭＳＣは、数多くの細胞種、例えば、限定されるものではないが、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋肉組織および線維性結合組織に分化可能である。特定の分化系列決定およびこれらの細胞が入る分化経路は、機械的影響および／または内在的生体活性因子、例えば、増殖因子、サイトカインおよび／または宿主組織により確立された局所微小環境条件からの種々の影響により決まる。ＭＳＣは、非造血前駆細胞であり、娘細胞を産生する。娘細胞は、分割されて、やがては不可逆的に分化して表現型細胞を生じさせるであろう、幹細胞または前駆細胞のいずれかである。ＭＳＣの例としては、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）があげられる。

本願明細書で使用する場合、「幹細胞」の用語は、表現型的および遺伝子型的に同一の娘および少なくとも１つの他の最終的な細胞種（例えば、最終的に分化した細胞）を産生し得る自己再生細胞を意味する。「幹細胞」の用語は、全能性、多能性および多分化能の細胞ならびにそれらの分化由来の前駆細胞および／または前駆体細胞を含む。

本願明細書で使用する場合、「全能性細胞（totipotent cellまたはtotipotential cell）」の用語は、完全な胚（例えば、胞胚）を形成可能な細胞を意味する。

本願明細書で使用する場合、「多能性細胞（pluripotent cellまたはpluripotential cell）」の用語は、完全に分化した万能性、すなわち、哺乳類の身体の約２６０の細胞種のいずれかに成長する能力を有する細胞を意味する。多能性細胞は、自己再生することができ、組織内で休止または静止したままであることができる。

「多分化能細胞（multipotential cell）」または「多分化能細胞（multipotent cell）」の用語は、複数の成熟細胞種のいずれかを生じ得る細胞を意味する。本願明細書で使用する場合、この表現は、成体性または胚性の幹細胞および前駆細胞ならびにこれらの細胞の多分化能子孫を包含する。多能性細胞と違って、多分化能細胞は、細胞種の全てを形成する能力を有していない。

本願明細書で使用する場合、「前駆細胞（progenitor cell）」または「前駆体細胞（precursor cell）」の用語は、特定種の細胞に分化するか、または、特定種の組織を形成することを約束された細胞を意味する。

好ましい実施形態では、本開示の方法に使用される細胞は、対象から取得されたサンプルから濃縮される。「濃縮される（enriched）」、「濃縮（enrichment）」の用語またはそれらの変形は、本願明細書において、未処理の集合と比較した場合、１つの特定の細胞種の割合または複数の特定の細胞種の割合が増加している細胞集合を説明するのに使用される。

好ましい実施形態では、本開示に使用される細胞は、ＴＮＡＰ^＋、ＳＴＲＯ−１^＋、ＶＣＡＭ−１^＋、ＴＨＹ−１^＋、ＳＴＲＯ−２^＋、ＣＤ４５^＋、ＣＤ１４６^＋、３Ｇ５^＋またはそれらの任意の組み合わせである。

細胞が所定のマーカーについて「陽性」であると言う場合、その細胞は、マーカーが細胞表面上に存在する度合いに応じて、そのマーカーの低い（ｌｏもしくは薄暗い）または高い（明るい、ｂｒｉ）表現体のいずれかであり得る。ここで、用語は、細胞のカラー分類プロセスにおいて使用される蛍光または他の色の強度に関連する。ｌｏ（または薄暗いもしくはくすんでいる）とｂｒｉの区別は、分類される特定の細胞集合に使用されるマーカーに関連して理解されるであろう。本願明細書において、細胞が所定のマーカーについて「陰性」であると言う場合、それは、マーカーがその細胞により全く発現されていないことを意味しない。マーカーが相対的に非常に低いレベルでその細胞により発現されていること、および、検出可能に標識された場合、非常に低いシグナルを生成することを意味する。

本願明細書で使用する場合、「ＴＮＡＰ」の用語は、組織非特異的アルカリホスファターゼの全てのアイソフォームを包含することを意図する。例えば、前記用語は、肝臓のアイソフォーム（ＬＡＰ）、骨のアイソフォーム（ＢＡＰ）および腎臓のアイソフォーム（ＫＡＰ）を包含する。好ましい実施形態では、ＴＮＡＰは、ＢＡＰである。特に好ましい実施形態では、本願明細書で使用する場合、ＴＮＡＰは、２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託された、ブダペスト条約の条項に基づいた受託番号ＰＴＡ−７２８２に基づく、ハイブリドーマ細胞株により産生されるＳＴＲＯ−３抗体と結合し得る分子を意味する。

前記方法に有用な幹細胞は、成体性組織、胚、胚体外組織または胎児由来であり得る。「成体性」の用語は、出生後の対象を含むその最も広い意味に使用される。好ましい実施形態では、「成体性」の用語は、思春期後の対象を意味する。本願明細書で使用する場合、「成体性」の用語は、女性から採取した臍帯血も含み得る。

一部の態様では、幹細胞は、本願明細書に記載された幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養から生じた子孫細胞であり得る（増殖細胞（expanded cell）とも呼ばれ得る）。本開示の増殖細胞は、培養条件（例えば、培地中の刺激性因子の数および／または種類）、継代の回数等に応じた広い各種の表現型を有し得る。特定の実施形態では、子孫細胞は、親集合から、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回または約１０回の継代後に取得される。ただし、子孫細胞は、親集合から任意の回数の継代後に取得され得る。

子孫細胞は、任意の適切な培地において培養することにより取得され得る。細胞培養に言及して使用される場合の「培地」の用語は、細胞周囲の環境の成分を含む。培地は、固体、液体、気体または相および材料の混合物であり得る。培地としては、液体増殖培地および細胞増殖を維持しない液体培地があげられる。培地は、ゼラチン状の培地、例えば、アガー、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲンマトリクスも含む。「培地」の用語は、それがまだ細胞と接触していなくとも、細胞培養において使用することを意図した材料も意味する。すなわち、細菌培養用に調製された栄養分の高い液体は、培地である。

一実施形態において、子孫細胞は、ＳＴＲＯ−３抗体により標識された磁性ビーズを使用して、骨髄からＴＮＡＰ＋細胞を単離することにより取得され、２０％ ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１００μｍ Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸を添加したα−ＭＥＭに播種される。

一実施形態では、（少なくとも５回の継代後の）このような増殖細胞は、ＴＮＡＰ−、ＣＣ９＋、ＨＬＡクラスＩ＋、ＨＬＡクラスＩＩ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−；ＣＤ３−、ＣＤ１１ａ−ｃ−、ＣＤ３１−、ＣＤ８６−および／またはＣＤ８０−であり得る。ただし、本願明細書に記載された条件と異なる培養条件下においては、種々のマーカーの発現が変動し得ることが可能である。また、これらの表現型の細胞が増殖細胞集合において優位を占め得るが、このことは、少ない割合のこの表現型を有さない細胞が存在しないことを意味しない（例えば、小さい割合の増殖細胞は、ＣＣ９−であり得る。）。好ましい一実施形態では、本開示の増殖細胞は、種々の細胞種に分化する能力をまだ有する。

一実施形態では、本開示の方法に使用される増殖細胞集合は、少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％の細胞が、ＣＣ９＋である細胞を含む。

別の実施形態では、本開示の方法に使用される増殖細胞集合は、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％の細胞が、ＳＴＲＯ−１＋である細胞を含む。

更なる実施形態では、子孫細胞は、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、３Ｇ５、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリン ベータ，６−１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ、（ＳＴＲＯ−２＝レプチン−Ｒ）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１ブライトおよびＣＤ１４６またはこれらのマーカーの任意の組み合わせからなる群から選択されるマーカーを発現し得る。

一実施形態では、子孫細胞は、国際公開第２００６／０３２０９２号パンフレットに規定された多分化能の増殖ＭＳＣ子孫（ＭＥＭＰ）である。子孫が派生し得るＭＳＣの濃縮された集合を調製するための方法は、国際公開第０１／０４２６８号パンフレットおよび国際公開第２００４／０８５６３０号パンフレットに記載されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏの状況において、ＭＳＣは、絶対的に純粋な調製物としてはめったに存在しないであろうし、組織特異的関連細胞（ＴＳＣＣ）である他の細胞と共に一般的に存在するであろう。国際公開第０１／０４２６８号パンフレットは、約０．１％〜９０％の純度レベルでの、骨髄からのこのような細胞の採取に言及する。子孫が派生するＭＳＣを含む集合は、組織供給源から直接的に採取することができ、あるいは、集合は、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて既に増殖している集合であってもよい。

例えば、子孫は、実質的に精製されたＭＳＣの採取された未増殖の集合から取得され得る。精製されたＭＳＣは、それらが存在する集合の総細胞の少なくとも約０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９５％を含む。このレベルは、例えば、ＴＮＡＰ、ＳＴＲＯ−１^ｂｒｉ、３Ｇ５＋、ＶＣＡＭ−１、ＴＨＹ−１、ＣＤ１４６およびＳＴＲＯ−２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーについて陽性である細胞を選択することにより達成され得る。

ＭＳＣ開始集合は、国際公開第０１／０４２６８号パンフレットまたは国際公開第２００４／０８５６３０号パンフレットに提示された任意の１つ以上の組織種、すなわち、骨髄、歯髄細胞、脂肪組織および皮膚、または、おそらくより広義に、脂肪組織、歯、歯髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、膵臓、骨、靭帯、骨髄、腱および骨格筋由来であり得る。

ＭＥＭＰは、それらがマーカーであるＳＴＲＯ−１ ｂｒｉについて陽性であり、マーカーであるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）について陰性である点で、新鮮に採取されたＭＳＣから区別され得る。対照的に、新鮮に単離されたＭＳＣは、ＳＴＲＯ−１^ｂｒｉおよびＡＬＰの両方について陽性である。本開示の好ましい実施形態では、投与された細胞の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％が、ＳＴＲＯ−１^ｂｒｉ、ＡＬＰ−の表現型を有する。更なる好ましい実施形態では、ＭＥＭＰは、１つ以上のマーカー、Ｋｉ６７、ＣＤ４４および／またはＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＶＬＡ−３、α３β１について陽性である。さらに更なる好ましい実施形態では、ＭＥＭＰは、ＴＥＲＴ活性を示さず、および／または、マーカーであるＣＤ１８について陰性である。

一実施形態では、細胞は、脈管障害を有する患者から取得され、標準的な技術を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養され、自家移植または同種移植として患者に投与される。別の実施形態では、１つ以上の確立されたヒト細胞株の細胞が使用される。本開示の別の有用な実施形態では、非ヒト動物（または、患者がヒトでない場合、別の種由来）の細胞が使用される。

本技術は、任意の非ヒト動物種、例えば、限定されるものではないが、非ヒト霊長類の細胞、有蹄類、イヌ科、ネコ科、ウサギ目、げっ歯類、鳥類および魚類の細胞を使用して実施され得る。本開示が行われ得る霊長類の細胞としては、限定されるものではないが、チンパンジー、ヒヒ、マカクならびに任意の他の新世界または旧世界のサルの細胞があげられる。本開示が行われ得る有蹄類の細胞としては、限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、スイギュウおよびバイソンの細胞があげられる。本開示が行われ得るげっ歯類の細胞としては、限定されるものではないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスターおよびアレチネズミの細胞があげられる。本開示が行われ得るウサギ目種の例としては、家畜化されたウサギ、ジャックウサギ、ノウサギ、ワタオウサギ、カンジキウサギおよびナキウサギがあげられる。ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）は、本開示が行われ得る鳥類種の例示である。

細胞は、使用前に保存され得る。真核細胞、および特に哺乳類の細胞を保持および保存するための方法およびプロトコルは、当分野において周知である（参照．例えば、Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.；Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.）。単離された幹細胞、例えば、間葉系幹細胞／前駆細胞またはそれらの子孫の生物学的活性を維持する任意の方法は、本開示と共に使用され得る。好ましい一実施形態では、細胞は、凍結保存を使用することにより維持および保存をされる。

細胞は、各種の技術を使用して取得され得る。例えば、細胞が細胞−抗体複合体または抗体に結合した標識と関連する特性を参照することにより物理的に分離される、数多くの細胞分取技術が使用され得る。この標識は、磁性粒子または蛍光分子であり得る。抗体は、それらが複数の細胞の凝集体を形成するように、架橋され得る。凝集体は、その密度により分離可能である。また、抗体は、所望の細胞が付着する固定マトリクスに結合し得る。

好ましい実施形態では、ＴＮＡＰ＋、ＳＴＲＯ−１＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋、３Ｇ５＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４６＋と結合する抗体（または他の結合剤）が、細胞を単離するために使用される。より好ましくは、ＴＮＡＰ＋またはＳＴＲＯ−１＋と結合する抗体（または他の結合剤）が、細胞を単離するために使用される。

非結合の細胞から抗体結合細胞を分離する種々の方法が公知である。例えば、細胞に結合した抗体（または抗−同位体抗体）は標識され得、ついで、細胞は、標識の存在を検出する機械的なセルソーターにより分離され得る。蛍光活性化セルソーターは、当分野において周知である。一実施形態では、抗−ＴＮＡＰ抗体および／またはＳＴＲＯ−１抗体は、固体支持体に結合する。種々の固体支持体が、当業者に公知であり、例えば、限定されるものではないが、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空の繊維膜、ポリマーおよびプラスチックペトリ皿である。抗体が結合した細胞は、細胞懸濁液から固体支持体を単に物理的に分離することにより、細胞懸濁液から除去され得る。

超常磁性の微小粒子は、細胞分離に使用され得る。例えば、微小粒子は、抗−ＴＮＡＰ抗体および／またはＳＴＲＯ−１抗体により覆われ得る。ついで、抗体タグ付き超常磁性微小粒子は、所望の細胞を含む溶液と共にインキュベートされ得る。微小粒子は、所望の幹細胞の表面に結合し、ついで、これらの細胞は、磁界において採取され得る。

別の例では、細胞のサンプルは、例えば、固相結合した抗−ＴＮＡＰモノクローナル抗体および／または抗−ＳＴＲＯ−１モノクローナル抗体と物理的に接触させる。固相結合は、例えば、プラスチック、ニトロセルロースまたは他の表面への抗体の吸着を含み得る。抗体は、中空の繊維膜の大きな孔（細胞が通るのに十分大きい）の壁にも吸着され得る。または、抗体は、ビーズ、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＭＢマクロビーズの表面に共有結合され得る。固相結合抗体と幹細胞含有懸濁液とのインキュベーションの正確な条件および期間は、使用されるシステムに特異的な複数の要因により決まるであろう。ただし、適切な条件の選択は、十分に当業者の技術範囲内である。

ついで、非結合の細胞は、幹細胞を結合させるのに十分な時間後に、生理学的なバッファーにより溶出または洗浄をされる。非結合の細胞は回収され、他の目的に使用されるか、または、適切な試験によって所望の分離が達成されていることを確認した後に廃棄され得る。ついで、結合した細胞は、固相から任意の適切な方法により、主に固相および抗体の性質に応じて分離される。例えば、結合した細胞は、プラスチックペトリ皿から、激しい振とうにより溶出され得る。あるいは、結合した細胞は、酵素的に「切れ目を入れること」または、固相と抗体との間における酵素感受性の「スペーサ」配列を消化することにより溶出され得る。アガロースビーズに結合するスペーサは、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａから市販されている。

ついで、溶出され、濃縮された細胞画分は、遠心によりバッファーで洗浄され得る。前記濃縮画分は、従来の技術に基づいて後の使用のために、生きた状態で凍結保存され、培養増殖され、および／または、患者に導入され得る。

Ｃ．ＭＳＣ馴化培地
ＭＳＣは、増殖または分化中に細胞外環境内に放出され得る化合物を介してその活性を発揮し得ることが見出されている。一部の態様では、このような化合物としては、エクソソームと呼ばれる微小小胞があげられる。微小小胞は、直径が約３０ｎｍ〜約２００ｎｍである。エクソソームは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、宿主細胞により取り込まれ得る。

エクソソームは、多小胞体選別経路由来の小胞である。最近の研究は、エクソソームが、細胞内伝達および免疫調節プロセスの容易化に有用な生体活性小胞であることを示している。ＭＳＣエクソソームは、２０Ｓプロテアソームおよび数多くのＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）を含む。

エクソソームに加えて、ＭＳＣは、本開示の目的に有用な他の生体活性分子／小胞も放出する。このような分子および小胞としては、限定されるものではないが、ミトコンドリアおよび増殖因子があげられる。ＭＳＣから放出されたこのような分子および小胞を含む培地を調製する方法ならびに特定の分子および小胞をさらに単離する方法は、当分野において公知である。例えば、Hu et al., Frontiers in Genetics, 2:56, 1-9 (2012)を参照のこと。

Ｄ．プロスタサイクリンによるＭＳＣの前処理
一部の実施形態では、ＭＳＣまたはＭＳＣ馴化培地とプロスタサイクリンとを、患者に共に投与する前に、ＭＳＣまたはＭＳＣ馴化培地は、任意に、プロスタサイクリンにより前処理され得る。したがって、一実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ送達用の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ馴化培地を調製するための方法であって、ＭＳＣまたはＭＳＣ馴化培地をプロスタサイクリンと接触させることを含む方法が提供される。さらに別の実施形態は、このような方法により取得可能な、処理されたＭＳＣまたはＭＳＣ馴化培地を提供する。

化合物による細胞または培地の前処理は、公知の技術を包含する。一態様では、プロスタサイクリンは、ＭＳＣを含む培地に添加され、同培地と共にインキュベートされ得る。ただし、任意に、このような共インキュベートは、さらに、増殖因子（例えば、ＶＥＧＦおよびアンジオポイエチン−１または−２、血小板由来の増殖因子）および／または低酸素の添加を含み得る。

ＭＳＣまたはＭＳＣ馴化培地は、種々の方法において、プロスタサイクリンにより処理され得る。例えば、プロスタサイクリンは、ＭＳＣの増殖中に、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＭＳＣを処理するために使用することができ、プロスタサイクリンは、投与後に、ＭＳＣを処理するために使用することもできる。一部の態様では、プロスタサイクリン濃度は、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、または、少なくとも約１５０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬもしくは２５０μｇ／ｍＬである。一部の態様では、プロスタサイクリン濃度は、約４００μｇ／ｍＬ以下、または、約３５０μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬもしくは２５０μｇ／ｍＬ以下である。

本開示の一実施形態に基づいて、ＭＳＣは、レシピエント自身の血液または骨髄から調製され得る。その場合、プロスタサイクリンは、ＭＳＣがレシピエントから単離される前に、ＭＳＣを処理するためにも使用され得る。

Ｅ．内皮前駆細胞（ＥＰＣ）
上述したように、患者が、さらに内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を投与される場合に、脈管障害を処置するためのプロスタサイクリンとＭＳＣとの間の相乗性も証明される。例えば、本開示の方法の任意の実施形態について、患者は、さらに、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を投与される。

一部の実施形態では、ＥＰＣも、プロスタサイクリンにより前処理され得る。プロスタサイクリンにより処理されたＥＰＣは、増大した血管新生特性を有する過剰増殖の表現型を示し、未処理のＥＰＣと比較して、脈管障害を処置するのに有利である。

ＥＰＣは、種々の方法において、プロスタサイクリンにより処理され得る。例えば、プロスタサイクリンは、ＥＰＣの増殖中に、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、ＥＰＣを処理するために使用され得る。プロスタサイクリンは、レシピエントに対して、ＥＰＣと共に投与され得る。プロスタサイクリンは、移植後に、ＥＰＣを処理するためにも使用され得る。本開示の一実施形態に基づいて、ＥＰＣは、レシピエント自身の血液または骨髄から調製される。その場合、プロスタサイクリンは、ＥＰＣがレシピエントから単離される前に、ＥＰＣを処理するためにも使用され得る。

ＥＰＣは、増殖が誘導され得る未分化細胞である。ＥＰＣは、各細胞分割に関して、少なくとも１つの娘細胞もＥＰＣ細胞であるように、自己維持可能である。ＥＰＣは、１００、２５０、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００倍またはそれ以上に増殖し得る。

ＥＰＣの表現型検査は、これらの細胞が、関連する造血マーカーであるＣＤ４５を発現することを証明する。さらに、ＥＰＣは、ＶＥＧＦＲ−２および／またはＴｉｅ−２について免疫反応性であり得る。任意に、ＥＰＣは、ＣＤ１４について免疫反応性である。ＥＰＣは、多分化能前駆細胞である。

血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、胚の血管新生および造血に必須であるシグナルを伝達する、ＶＥＧＦＲ−１（ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ−２（ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）ならびにＶＥＧＦＲ−３／Ｆｌｔ−４を含む、特定のチロシンキナーゼ受容体を介して作用する。ＶＥＧＦは、３つ全ての受容体に結合するが、ほとんどの生物学的機能は、ＶＥＧＦＲ−２により媒介される。ＶＥＧＦＲ−１の役割は、現在未知である。ＶＥＧＦＲ３／Ｆｌｔ４のシグナル伝達は、リンパ性内皮細胞の発達に重要であることが公知であり、ＶＥＧＦＲ３のシグナル伝達は、内皮細胞に対して、リンパ性内皮様表現型を付与し得る。ＶＥＧＦＲは、血管成長、血管弛緩、血管透過の誘導、内皮細胞の遊走、増殖および生存の刺激に必須のプロセスについてのシグナルを中継する。内皮細胞は、全ての種々のＶＥＧＦ−Ｒを発現する。胚形成中に、前駆細胞である血管芽細胞が造血系および血管系の両方をもたらし得ることが報告されてきた。

Ｔｉｅ−２は、内皮特異的受容体チロシンキナーゼであり、アンジオポイエチン１に対する受容体である。それは、活発に成長している血管の内皮において優先的に発現され、最も初期の哺乳類の内皮細胞系統マーカーを表し得るＩ型膜タンパク質である。Ｔｉｅ−２は、内皮細胞の増殖および分化の調節におそらく関与し、血管の形成中に内皮細胞の特定の配向を方向付け得る。

ＣＤ１４抗原は、リポポリ多糖類（ＬＰＳ）とＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）との複合体に対する高親和性受容体である。ＣＤ１４抗原は、ＣＤ１４、ＴＬＲ４およびＭＤ−２から構成された機能性ヘテロマーＬＰＳ受容体複合体の一部である。ＣＤ１４は、末梢血、他の体液ならびに種々の組織、例えば、リンパ節および脾臓における大部分のヒト単球およびマクロファージにおいて強力に発現される。ＣＤ１４は、ヒト好中球および骨髄樹状細胞の亜集合において弱く発現される。

ＣＤ４５抗原は、白血球共通抗原（ＬＣＡ）としても公知のチロシンホスファターゼである。ＣＤ４５は、赤血球系細胞、血小板およびその前駆細胞を除く、造血性由来の全てのヒト細胞に存在する。ＣＤ４５分子は、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化に必要とされ、細胞の活性化状態に応じて、少なくとも５つのアイソフォームで発現される。

ＶＥＧＦＲ−１＋、ＶＥＧＦＲ−２＋およびＴｉｅ−２＋の細胞は、血液における単核細胞の全集合の、それぞれ、約３．０＋−０．２％、０．８＋−０．５％、２．０＋−０．３％を構成した。ＣＤ１４＋／ＶＥＧＦＲ−２＋の細胞は、単球の全集合の約２．０＋−０．５％を構成し、血液における単核細胞の０．０８＋−０．０４％を構成した。

ＥＰＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける長期培養において維持され得る。ＥＰＣは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２回またはそれ以上の培養において継代され得る。

ＥＰＣは、典型的には、１〜３週間の細胞培養後に増殖した、内皮コロニー形成細胞を含む。内皮コロニー形成細胞は、内皮系統に関連付けられる前駆細胞の特徴を有し、Smardja et al., Angiogenesis 14(1):17-27 (2011)に基づいて、新生血管内に混合可能である。

ＥＰＣの単離、精製、ｅｘ ｖｉｖｏにおける培養および特徴決定は、Hill et al, N. Engl. J. Med. 348:593-600 (2003)、Assmus et al., Circulation 106:3009-16 (2002)、Wang et al., J. Am. Coll. Cardiol. 49:1566-71 (2007)および、Kalka et al., P.N.A.S. 97:3422-7 (2000)に記載されており、その内容は、その全体が参照により組み込まれる。さらに、内皮コロニー形成細胞の単離、精製、ｅｘ ｖｉｖｏにおける培養および特徴決定は、Yoder et al., Blood 109:1801-1809 (2007)、Ingram et al., Blood 104:2752-2760 (2004)および、Smardja et al., Angiogenesis 14(1):17-27 (2011)に記載されており、その内容は、その全体が参照により組み込まれる。

例えば、細胞集合は、ポジティブ選択により、または、いずれかの順序でポジティブおよびネガティブ選択の両方を組み合わせて単離される。前駆細胞の集合は精製される。ＥＰＣの精製された集合は、その細胞が単離された細胞の粗集合より有意に高い割合のＥＰＣを含む。

例えば、精製手法は、総集合に対するＥＰＣにおける、少なくとも５倍の増大、好ましくは少なくとも１０倍の増大、より好ましくは少なくとも１５倍の増大、最も好ましくは少なくとも２０倍の増大、および最適には少なくとも２５倍の増大をもたらすべきである。精製されたＥＰＣの集合は、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも３５％、および最適に少なくとも５０％のＥＰＣを含むべきである。

本願明細書に記載された方法は、７５％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは８５％以下、最も好ましくは９０％以下、および最適には９５％以下の幹細胞を含む混合物をもたらし得る。このような方法は、９９％、９９．９０％およびさらに１００％のＥＰＣを含む混合物を製造可能である。したがって、精製された本開示の集合は、上記したように、天然に存在するそれらより顕著に高いレベルのＥＰＣを含む。

精製されたＥＰＣの集合は、ＥＰＣの抗原特性を発現する幹細胞の集合を含む細胞の粗製混合物を、抗原の細胞外部分に特異的に結合する分子と接触させることにより単離され得る。このような技術は、ポジティブ選択として公知である。分子に対するＥＰＣの結合は、ＥＰＣが、抗原を発現しない汚染細胞から十分に区別されることを可能にして、汚染細胞から幹細胞を単離することを可能にする。抗原は、好ましくはＶＥＧＦＲであり、より好ましくはＶＥＧＦＲ−２である。

汚染細胞から前駆細胞を分離するのに使用される分子は、ＥＰＣを特徴付ける抗原に特異的に結合する任意の分子であり得る。分子は、例えば、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメントであることができ、または、受容体である抗原の場合には、その受容体のリガンドであることができる。例えば、ＶＥＧＦ受容体、例えば、ＦＬＫ−１の場合には、リガンドは、ＶＥＧＦである。

本開示の固有の単離された細胞は、そのＣＤ４５＋状態および血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、例えば、ＶＥＧＦＲ−２を有することにより、他の細胞から分離され得る。細胞は、細胞を分離するための従来技術、例えば、Ｃｉｖｉｎの米国特許第４，７１４，６８０号、同第４，９６５，２０４号、同第５，０３５，９９４号および同第５，１３０，１４４号明細書、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌの米国特許第５，７５０，３９７号明細書ならびにＬｏｋｅｎ ｅｔ ａｌの米国特許第５，１３７，８０９号明細書に記載されたものにより単離され得る。前記文献はそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる。そして、例えば、ＣＤ４５特異的モノクローナル抗体またはＶＥＧＦＲ特異的抗体は、固体支持体、例えば、ニトロセルロース、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空の繊維メンブレン、磁性ビーズおよびプラスチックペトリ皿上に固定され得る。ついで、細胞集合全体が、固体支持体を通過するか、または、ビーズに添加される。

結合分子に結合した細胞は、残った細胞懸濁液から固体支持体を物理的に分離することにより、細胞懸濁液から除去され得る。例えば、未結合の細胞は、固体支持体に幹細胞を十分な時間結合させた後に、生理学的バッファーにより溶出または洗浄され得る。

結合した細胞は、主に、固相および結合分子の性質に応じて、固相から任意の適切な方法により分離され得る。例えば、結合した分子は、激しい振とうにより、プラスチックペトリ皿から溶出され得る。あるいは、結合した細胞は、酵素的に「切れ目を入れること」、または、固相と抗体との間における酵素感受性の「スペーサ」配列を消化することにより溶出され得る。アガロースビーズに結合した適切なスペーサ配列は、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａから市販されている。

ついで、溶出され、濃縮された細胞画分は、遠心分離によりバッファーで洗浄され得、従来技術に基づいて後の使用のために、生きた状態で低温において保存され得る。細胞は、例えば、レシピエントの静脈内に注入されることにより、直ちに使用されてもよい。

固体支持体に付着したままのものは、使用された抗体により認識されるマーカーを含む細胞である。例えば、抗−ＣＤ４５抗体が使用される場合、得られる集合は、ＣＤ４５＋細胞にかなり富んでいるであろう。使用される抗体がＶＦＧＦＲである場合、得られる集合は、ＶＥＧＦＲ＋細胞にかなり富んでいるであろう。その後、その集合は、他のマーカーに対する抗体が結合している固体支持体を使用して、工程を繰り返すことにより、他のマーカーに富んだものとなり得る。

ＣＤ４５＋ＶＥＧＦＲ＋細胞を分取する別の方法は、フローサイトメトリー、最も好ましくは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）、例えば、名称ＦＡＣＳｃａｎまたはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎにより製造されたものによる。この技術により、ＣＤ４５マーカーをその上に有する細胞は、このような染料にコンジュゲートしている抗−ＣＤ４５抗体による特定の蛍光染料によりタグ付けされる。同様に、細胞のＶＥＧＦＲマーカーは、他の染料にコンジュゲートした抗−ＶＥＧＦＲ抗体による異なる蛍光染料によりタグ付けされる。染色された細胞が機器上にある場合、細胞流が、光を発する蛍光色素を励起するアルゴンレーザビームにより方向付けられる。この発光は、一連の光学フィルタによる蛍光色素の発光波長に特異的な光電子増倍管（ＰＭＴ）により検出される。ＰＭＴにより検出されたシグナルは、それ自体のチャネルにおいて増幅され、各種の方式、例えば、ヒストグラム、ドット表示または対比表示において、コンピュータにより表示される。例えば、１つの波長を発する蛍光細胞は、特異的な蛍光色素標識試薬と反応性である分子を発現する。一方、非蛍光細胞または異なる波長において発光する蛍光細胞は、この分子を発現しないが、他の波長で蛍光を発する蛍光色素標識試薬と反応性である分子を発現し得る。フローサイトメーターは、細胞により発せられた蛍光の量（蛍光強度）を表示する点で、半定量的でもある。これは、相対的な意味で、細胞により発現された分子の数に相関する。

フローサイトメーターは、細胞がレーザビームを通過する際に、非蛍光パラメータ、例えば、細胞容積または細胞により散乱された光を測定する装備も有し得る。細胞容積は、通常、直接測定である。光散乱ＰＭＴは、前方角（前方散乱；ＦＳＣ）または直角（側方散乱；ＳＳＣ）のいずれかにおける、細胞により散乱された光を検出する。ＦＳＣは、通常、サイズの指標である。一方、ＳＳＣは、細胞の複雑性の指標であるが、両方のパラメータは、他の要因により影響を受け得る。

好ましくは、フローサイトメーターは、２つ以上のＰＭＴ発光検出器を備える。更なるＰＭＴは、他の発光波長を検出し、個々の分離したチャネルそれぞれにおいて、２つ以上の蛍光色素の同時検出を可能にする。コンピュータは、各チャネルの分析または別のものとの各パラメータの相関を可能にする。ＦＡＣＳ機器と共に典型的に使用される蛍光色素としては、５２５ｎｍ（緑色）に発光ピークを有するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５７５ｎｍ（オレンジ色〜赤色）に発光ピークを有するＲ−フィコエリスリン（ＰＥ）、６２０ｎｍ（赤色）に発光ピークを有するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、６６０ｎｍ（赤色）に発光ピークを有する７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、６７０ｎｍ（赤色）に発光ピークを有するＲ−フィコエリスリンＣｙ５（ＲＰＥ−Ｃｙ５）および６５５〜７５０ｎｍ（紅色）に発光ピークを有するアロフィコシアニン（ＡＰＣ）があげられる。

これらおよび他の種類のＦＡＣＳ機器は、異なる特性の細胞を異なる容器に向かわせることにより、種々の画分を物理的に分離するための更なる能力を有し得る。

開始材料、例えば、骨髄、末梢血または臍帯血のＣＤ４５＋ＶＥＧＦＲ＋集合を単離するための任意の他の方法も、本開示に基づいて使用され得る。本開示の種々の亜集合（例えば、ＣＤ１４＋、Ｔｉｅ２＋、ＣＤ１４４−）は、類似する方法で単離され得る。

粗製細胞集合が上述したように精製される前後のいずれかに、前駆細胞の集合は、さらに、当分野において公知の方法により濃縮され得る。例えば、前駆細胞は、ＥＰＣの１つ以上の抗原特性についてのポジティブ選択により濃縮され得る。このような抗原としては、例えば、ＣＤ１４またはＴｉｅ−２があげられる。

一実施形態では、血液は、ドナーの循環抹消血から直接回収される。血液は、ＥＰＣを捕捉するための結合分子、例えば、抗体であるＶＥＧＦＲ−２を結合した固相を含むカラムを通して連続的にろ過される。前駆細胞枯渇血液は、当分野において公知の方法、例えば、血漿交換により、ドナーの循環系に直ちに戻される。血液は、十分な数の前駆細胞がカラムに結合するまで、この方法で処理される。ついで、幹細胞が、当分野において公知の方法により、カラムから単離される。この方法は、骨髄を採取する費用および痛み、ならびに、麻酔、痛覚消失症、輸血および感染の関連するリスクをドナーに対して負わせることなく、少ない末梢血前駆細胞を、非常に多量の血液から採取することを可能にする。

ＥＰＣは、本願明細書に記載された方法を使用して、培養および増殖をされる。細胞は、密度勾配遠心により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離することにより末梢血から取得される。

細胞懸濁液は、細胞を維持可能な任意の容器、特に培養フラスコ、培養プレートまたはローラーボトル、およびより具体的には、小さな培養フラスコ、例えば、２５ｃｍ^２の培養フラスコに播種される。懸濁液において培養された細胞は、約５×１０^４〜２×１０^５個／ｍｌ（例えば、１×１０^５個／ｍｌ）で再懸濁される。固定された基材に播種される細胞は、約２〜３×１０^３個／ｃｍ^２で播種される。任意に、培養プレートは、マトリクスタンパク質、例えば、コラーゲンによりコートされる。細胞は、細胞増殖を補助可能な任意の公知の培地、例えば、細胞の代謝に必要とされる添加物、例えば、グルタミンおよび他のアミノ酸、ビタミン、ミネラルならびにタンパク質、例えば、トランスフェリン等を含む、ＨＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｆ−１２等に入れられ得る。培地は、酵母、細菌および糸状菌による汚染を予防する抗生物質、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等も含み得る。培地は、ウシ、ウマ、ニワトリ等由来の血清を含み得る。

培養のための条件は、生理学的条件に近くあるべきである。培地のｐＨは、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ６〜８、約ｐＨ７か〜７．８またはｐＨ７．４）に近くあるべきである。生理学的温度は、約３０℃〜４０℃の範囲である。ＥＰＣは、約３２℃〜約３８℃（例えば、約３５℃〜約３７℃）の温度で培養される。

任意に、培地は、少なくとも１つの増殖誘引（「分裂促進」）増殖因子を添加される。「増殖因子」は、ＥＰＣにおける増殖、増殖誘引、分化誘引もしくは栄養作用を有するタンパク質、ペプチドまたは他の分子である。「増殖誘引増殖因子」は、ＥＰＣが増殖することを可能にする栄養因子、例えば、細胞の表面上の受容体に結合して、細胞上において栄養または増殖誘引作用を果たす、任意の分子である。増殖誘引増殖因子としては、ＥＧＦ、アンフィレグリン、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦまたはＦＧＦ−１）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦα）、ＶＥＧＦおよびそれらの組み合わせがあげられる。増殖因子は、通常、培地に、約１ｆｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加される。約１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、通常十分である。単純な滴定アッセイが、特定の増殖因子の最適な濃度を決定するのに、容易に行われ得る。

増殖因子および栄養因子の生物学的効果は、一般的には、細胞表面の受容体に結合することにより媒介される。数多くのこれらの因子に対する受容体が特定されてきており、特定の受容体に対する抗体および分子プローブが利用可能である。ＥＰＣは、分化の全ての段階における増殖因子受容体の存在について分析され得る。多くの場合、特定の受容体の特定は、外因性の増殖因子または栄養因子の添加による特定の増殖経路に沿って、細胞をさらに分化させるのに使用するための戦略についてのガイダンスを提供する。

一般的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて約３〜１０日後に、ＥＰＣの培地は、培地を吸引し、培養フラスコに新鮮な培地を添加することにより補給される。任意に、吸引された培地は、回収、ろ過され、後にＥＰＣを継代するための馴化培地として使用される。例えば、１０％、２０％、３０％、４０％またはそれ以上の馴化培地が使用される。

ＥＰＣ細胞培養物は、増殖を再開するために容易に継代され得る。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの３〜７日後、培養フラスコは、十分振とうされ、ついで、ＥＰＣは、５０ｍｌの遠沈管に移され、低速で遠心分離される。培地は吸引される。ＥＰＣは、少量の培地に再懸濁される。ついで、細胞は計測され、増殖を再開するために、所望の密度で再度播種される。この手順は、毎週繰り返されて、各継代での生きた細胞の数における対数増加をもたらし得る。手順は、所望の数のＥＰＣが取得されるまで継続される。

ＥＰＣおよびＥＰＣの子孫は、それらが必要とされるまで、当分野における任意の公知の方法により凍結保存され得る（例えば、米国特許第５，０７１，７４１号明細書、国際公開第９３／１４１９１号、同第９５／０７６１１号、同第９６／２７２８７号、同第９６／２９８６２号および同第９８／１４０５８号パンフレット、Karlsson et al., 65 Biophysical J. 2524-2536 (1993)を参照のこと。）。ＥＰＣは、等張性溶液、好ましくは、特定の凍結保存剤を含む細胞培地に懸濁され得る。このような凍結保存剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール等があげられる。これらの凍結保存剤は、５〜１５％（例えば、８〜１０％）の濃度で使用される。細胞は、−１０℃〜−１５０℃（例えば、−２０℃〜−１００℃または−７０℃〜−８０℃）の温度に徐々に凍結される。

Ｆ．細胞の遺伝子組換え
一実施形態では、本開示の細胞であるＭＳＣおよび／またはＥＰＣは、遺伝子組み換えされる。一態様では、このような遺伝子組換えは、細胞の治療活性を増大させる。このような修飾の非限定的な例としては、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＯＸ１）およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＴＧＩＳ）の増大した発現または活性化があげられる。

一態様では、細胞は、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＯＸ１）およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＴＧＩＳ）からなる群から選択されるタンパク質の生物学的活性の発現を増加させる核酸により形質転換される。一態様では、核酸は、タンパク質をコードする。

一部の態様では、細胞は、異種タンパク質を産生するように遺伝子組み換えされる。任意に、細胞は、異種タンパク質が細胞から分泌されるように遺伝子組み換えされるであろう。ただし、実施形態において、細胞は、機能性の非タンパク質コードポリヌクレオチド、例えば、ｄｓＲＮＡ（典型的には、ＲＮＡサイレンシング用）、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは触媒性核酸（例えば、リボザイムもしくはＤＮＡザイム）を発現するように修飾され得る。

遺伝子組み換えされた細胞は、修飾された細胞の増殖を補助するのに十分な量の少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養され得る。このため、取得された遺伝子組換え細胞は、（例えば、移植において）直ちに使用され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養および増殖され、または、後の使用のために保存され得る。修飾された細胞は、当分野において周知の方法、例えば、液体窒素における凍結により保存され得る。

本願明細書で使用する場合、遺伝子組換えは、本願明細書に記載された細胞への外因性もしくは外来性のポリヌクレオチドの導入、または、細胞内の内在性遺伝子の修飾を含む、任意の遺伝子組換え法を包含する。遺伝子組換えとしては、限定されるものではないが、形質導入（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでの、宿主またはドナーからレシピエントへの宿主ＤＮＡのウイルス媒介性転移）、トランスフェクション（単離されたウイルスＤＮＡゲノムによる細胞の形質転換）、リポソーム媒介性転移、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクションまたは共沈等があげられる。形質導入法としては、細胞と産生細胞との直接共培養（Bregni et al., 1992）または、適切な増殖因子およびポリカチオンを伴うか伴わずに、ウイルス上清のみと培養することがあげられる。

外因性ポリヌクレオチドは、好ましくは、ベクターにおいて細胞に導入される。ベクターは、好ましくは、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必須のエレメントを含む。このようなベクターを構築するのに使用される方法は、当分野において周知である。例えば、適切な発現ベクターを構築するための技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (3rd Ed., 2000)；および、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1999)に詳細に記載されている。

ベクターは、限定されるものではないが、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよび単純ヘルペスウイルス；コスミド；プラスミドベクター；合成ベクター；および、当分野において典型的に使用される他の組換え媒体を含み得る。ポリヌクレオチドが操作可能に結合され得るプロモータおよびクローニングサイトの両方を含むベクターは、当分野において周知である。このようなベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＲＮＡを転写可能であり、供給元、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）から市販されている。具体的な例としては、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＳＧ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＸｔｌ；ならびに、ＰｈａｒｍａｃｉａからのｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＰＶおよびｐＳＶＫ３があげられる。

ベクターは、レトロウイルスベクターを含み得る（Coffin et al., 「Retroviruses」, Chapter 9 pp; 437-473, Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1997を参照のこと。）。本開示に有用なベクターは、当分野において周知の手法により組換え的に産生され得る。例えば、国際公開第９４／２９４３８号、同第９７／２１８２４号および同第９７／２１８２５号パンフレットには、プラスミドをパッケージングし、細胞株をパッキングするレトロウイルスの構築が記載されている。例示となるベクターとしては、ｐＣＭＶ哺乳類発現ベクター、例えば、ｐＣＭＶ６ｂおよびｐＣＭＶ６ｃ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）、ｐＳＦＦＶ−ＮｅｏならびにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｓｋ＋があげられる。有用なレトロウイルスベクターの非限定的な例は、マウス、鳥類または霊長類のレトロウイルス由来のものである。一般的なレトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ−ベクター）に基づくものがあげられる。他のＭｏＭＬＶ由来のベクターとしては、Ｌｍｉｌｙ、ＬＩＮＧＦＥＲ、ＭＩＮＧＦＲおよびＭＩＮＴがあげられる。更なるベクターとしては、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＩＮ）およびモロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＯＭＳＶ）および脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）に基づくものがあげられる。マウス幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）由来のベクターとしては、ＭＥＳＶ−ＭｉＬｙがあげられる。レトロウイルスベクターとしては、レンチウイルスに基づくベクターもあげられ、非限定的な例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）に基づくベクターがあげられる。

レトロウイルスベクター構築物の産生において、ウイルスのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ配列が、ウイルスから除去され、外来性のＤＮＡ配列の挿入用の余地を形成し得る。外来性ＤＮＡによりコードされた遺伝子は、通常、長い末端反復（ＬＴＲ）における強力なウイルスプロモータの制御下において発現される。適切な制御調節配列の選択は、使用される宿主細胞により決まり、選択は、当業者の技術範囲内である。数多くのプロモータが、ＬＴＲのプロモータに加えて公知である。非限定的な例としては、ファージラムダＰＬプロモータ、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモータ；モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）または脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域プロモータ；グランザイムＡプロモータ；およびグランザイムＢプロモータがあげられる。さらに、誘導性または複数の制御エレメントが使用され得る。適切なプロモータの選択は、当業者に明らかであろう。

このような構築物は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの機能がパッキング細胞株によりｔｒａｎｓで提供された場合、効率的にウイルス粒子内に詰め込まれ得る。したがって、ベクター構築物がパッキング細胞内に導入された場合、細胞により産生されたｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖのタンパク質は、ベクターＲＮＡと共にアッセンブリされ、培地中に分泌される感染性のウイルス粒子を産生する。このため、産生されたウイルスは感染し、標的細胞のＤＮＡ内に組み込まれ得るが、必須のパッケージング配列を欠いているため、感染性のウイルス粒子を産生しない。現在使用されているパッキング細胞株のほとんどは、別々のプラスミドにより形質転換されており、複数の組換え事象が、複製コンピテントウイルスが産生され得る前に必要となるように、それぞれ、必須のコード配列の１つを含む。あるいは、パッキング細胞株は、プロウイルスを有する。プロウイルスは、それが感染性ウイルスをアッセンブリするのに必要とされる全てのタンパク質を産生し得るが、それ自体のＲＮＡが、ウイルス内に詰め込まれ得ないように、無能にされている。組換えウイルスから産生されたＲＮＡが、代わりにパーケージングされる。したがって、パーケージング細胞から放出されたウイルスストックは、組換えウイルスのみを含む。レトロウイルスパーケージング系統の非限定的な例としては、ＰＡ１２、ＰＡ３１７、ＰＥ５０１、ＰＧ１３、ＰＳＩ．ＣＲＩＰ、ＲＤＩ １４、ＧＰ７Ｃ−ｔＴＡ−Ｇ１０、ＰｒｏＰａｋ−Ａ（ＰＰＡ−６）およびＰＴ６７があげられる。

他の適切なベクターとしては、アデノウイルスベクター（国際公開第９５／２７０７１号パンフレットを参照のこと。）および、アデノ関連ウイルスベクターがあげられる。これらのベクターは全て、例えば、Stem Cell Biology and Gene Therapy, eds. Quesenberry et al., John Wiley & Sons, 1998；ならびに、米国特許第５，６９３，５３１号および同第５，６９１，１７６号明細書に記載されているように、当分野において周知である。アデノウイルス由来のベクターの使用は、特定の状況下において有利である。それらが、非分割細胞に感染し得ないためである。レトロウイルスＤＮＡと違って、アデノウイルスＤＮＡは、標的細胞のゲノム内に組み込まれない。さらに、外来性ＤＮＡを運ぶ能力は、レトロウイルスベクターよりアデノウイルスベクターにおいて非常に大きい。アデノ関連ウイルスベクターは、別の有用な送達システムである。このウイルスのＤＮＡは、非分割細胞内に組み込まれることができ、数多くのポリヌクレオチドが、アデノ関連ウイルスベクターを使用して、種々の細胞種内に上手く導入されている。

一部の実施形態では、構築物またはベクターは、２つ以上の異種性のポリヌクレオチド配列を含むであろう。好ましくは、更なる核酸配列は、選択マーカー、構造的遺伝子、治療遺伝子またはサイトカイン／ケモカインの遺伝子をコードするポリヌクレオチドである。

選択マーカーは、成功した遺伝子組換えをモニターする目的で、および、ＤＮＡが組み込まれている細胞の選択用に、構築物またはベクターに含まれ得る。非限定的な例としては、薬剤耐性マーカー、例えば、Ｇ１４８またはヒグロマイシンがあげられる。例えば、マーカーがＨＳＶ−ｔｋ遺伝子である場合、さらに、ネガティブ選択が使用され得る。この遺伝子は、作用剤、例えば、アシクロビルおよびガンクロビルに感受性の細胞を形成するであろう。ＮｅｏＲ（ネオマイシン／Ｇ１４８耐性）遺伝子が一般的に使用されるが、マーカー遺伝子配列が、使用され得る標的細胞に予め存在しない場合には、任意の都合の良いマーカー遺伝子が使用され得る。更なる非限定的な例としては、低親和性神経成長因子（ＮＧＦＲ）、増大した蛍光緑色タンパク質（ＥＦＧＰ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）、細菌性のｈｉｓＤ遺伝子、マウスＣＤ２４（ＨＳＡ）、マウスＣＤ８ａ（ｌｙｔ）、プロマイシンまたはフレオマイシンに対する耐性を付与する細菌性遺伝子およびベータ−ガラクトシダーゼがあげられる。

更なるポリヌクレオチド配列は、同じベクターにおいて、細胞内に導入されてもよいし、または、第２のベクターにおいて、宿主細胞内に導入されてもよい。好ましい実施形態では、選択マーカーは、ポリヌクレオチドとして、同じベクター上に含まれるであろう。

本開示は、内因性の遺伝子の発現が上方制御され、野生型細胞と比較して、コードされたタンパク質の増大した産生をもたらすように、内因性遺伝子のプロモータ領域を遺伝子組み換えすることも包含する。

Ｇ．医薬組成物および投与方法
本開示の一実施形態は、治療的に有効量の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ馴化培地およびプロスタサイクリンと、薬学的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物を提供する。一態様では、組成物は、さらに、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む。

一態様では、医薬組成物は、さらに、少なくとも１つの薬学的に許容され得るキャリアを含む。「薬学的に許容され得る」の表現は、正常な医療判断の範囲内において、合理的な利益／リスク比と釣り合った、過剰の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触させるのに適した、それらの化合物、材料、組成物および／または剤形を意味する。本願明細書で使用する場合、「薬学的に許容され得るキャリア」の表現は、薬学的に許容され得る材料、組成または媒体、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤または溶媒封入材料を意味する。

薬学的に許容され得るキャリアとしては、生理食塩水、バッファー水溶液、溶媒および／または分散媒体があげられる。このようなキャリアの使用は、当分野において周知である。溶液は、好ましくは、無菌であり、容易シリンジ性が存在する程度まで流動性である。好ましくは、溶液は、製造および保存条件下において安定であり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の使用により、微生物、例えば、細菌および糸状菌の汚染作用に対して保存される。

薬学的に許容され得るキャリアとして機能し得る材料および溶液のいくつかの例としては、（１）、糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、セルロースカルボキシメチルナトリウム、エチルセルロースおよびセルロースアセテート；（４）粉末状のトラガント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ひまわり油、ゴマ油、オリーブ油、とうもろこし油および大豆油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えば、エチルオレエートおよびエチルラウレート；（１３）アガー；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；ならびに（２２）薬学的配合物に使用される他の非毒性の適合性物質があげられる。

本開示の方法に有用な医薬組成物は、ポリマー性キャリアまたは細胞外マトリクスを含み得る。

各種の生物学的または合成の固体マトリクス材料（すなわち、固体支持体マトリクス、生物学的接着剤またはドレッシング材および生物学的／医療的骨格）は、この開示における使用に適している。マトリクス材料は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用するのに医療的に許容され得る。このような医療的に許容され得るおよび／または生物学的にもしくは生理学的に許容され得るまたは適合性の材料の非限定的な例としては、限定されるものではないが、吸収性および／または非吸収性の固体マトリクス材料、例えば、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、例えば、ブタ由来（および他のＳＩＳ供給源）；架橋または非架橋のアルギン酸、親水コロイド、フォーム、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）メッシュ、ポリグラクチン（ＰＧＬ）メッシュ、フリース、フォームドレッシング材、生体接着剤（例えば、フィブリンのりおよびフィブリンゲル）および、１つ以上の層における死んだ非表皮化皮膚相当物があげられる。

フィブリンのりは、種々の臨床状態で使用されてきた手術用シーラントの分類である。長年の取り組みから気付き得るように、数多くのシーラントが、本開示の方法に使用するための組成物に有用である。ただし、本開示の好ましい実施形態は、本願明細書に記載された細胞と組み合わせたフィブリンのりの使用に関する。

本願明細書で使用する場合、「フィブリンのり」の用語は、カルシウムイオンの存在下で、フィブリンポリマーの架橋により形成される不溶性のマトリクスを意味する。フィブリンのりは、フィブリノゲンまたはその誘導体もしくは代謝物、フィブリン（可溶性のモノマーもしくはポリマー）および／または、フィブリンマトリクスを形成する生体組織もしくは流体由来のそれらの複合体から形成され得る。あるいは、フィブリンのりは、組換えＤＮＡ技術により産生された、フィブリノゲンまたはその誘導体もしくは代謝物またはフィブリンから形成され得る。

フィブリンのりは、フィブリノゲンとフィブリンのり形成触媒（例えば、トロンビンおよび／または因子ＸＩＩＩ）との相互作用によっても形成され得る。当業者に理解され得るように、フィブリノゲンは、触媒（例えば、トロンビン）の存在下において、タンパク質分解的に開裂され、フィブリンモノマーに変換される。ついで、フィブリンモノマーは、フィブリンのりマトリクスを形成するために架橋し得るポリマーを形成し得る。フィブリンポリマーの架橋は、触媒、例えば、因子ＸＩＩＩの存在により増大し得る。フィブリンのり形成触媒は、血漿、クリオプレシピテートまたは、フィブリノゲンもしくはトロンビンを含む他の血漿画分に由来し得る。あるいは、触媒は、組換えＤＮＡ技術により産生され得る。

血塊形成の速度は、フィブリノゲンと混合されたトロンビンの濃度により決まる。酵素依存性反応であるため、温度が高いほど（３７℃まで）、血塊形成速度は速くなる。血塊の引張強度は、使用されるフィブリノゲンの濃度により決まる。

フィブリンのりの使用ならびにその調製および使用方法は、米国特許第５，６４３，１９２号明細書に記載されている。米国特許第５，６４３，１９２号明細書には、単独のドナーからのフィブリノゲンおよびトロンビン成分の抽出ならびにフィブリンのりとして使用するためのこれらの成分のみの組み合わせが開示されている。米国特許第５，６５１，９８２号明細書には、フィブリンのりの別の調製および使用方法が記載されている。米国特許第５，６５１，９８２号明細書は、哺乳類における局所シーラントとして使用するために、リポソームと共にフィブリンのりを提供する。

複数の刊行物には、治療剤を送達するためのフィブリンのりの使用が記載されている。例えば、米国特許第４，９８３、３９３号明細書には、アガロース、アガー、グリコサミノグリカン生理食塩水溶液、コラーゲン、フィブリンおよび酵素を含む膣内挿入物として使用するための組成物が開示されている。さらに、米国特許第３，０８９，８１５号明細書には、フィブリノゲンおよびトロンビンから構成された注射用医薬調製物が開示されている。米国特許第６，４６８，５２７号明細書には、身体内の特定部位への種々の生物学的製剤および非生物学的製剤の送達を容易にするフィブリンのりが開示されている。このような手法は、本開示の方法に使用され得る。

適切なポリマー性キャリアとしては、合成もしくは天然のポリマーから形成された多孔質のメッシュもしくはスポンジ、ならびに、ポリマー溶液があげられる。マトリクスの一形態は、ポリマー性のメッシュまたはスポンジであり、他のものは、ポリマー性ヒドロゲルである。使用され得る天然ポリマーとしては、タンパク質、例えば、コラーゲン、アルブミンおよびフィブリン；ならびに、多糖類、例えば、アルギン酸塩およびヒアルロン酸のポリマーがあげられる。合成ポリマーとしては、生分解性および非生分解性のポリマーの両方があげられる。生分解性ポリマーの例としては、ヒドロキシ酸のポリマー、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリホスファゼンおよびそれらの組み合わせがあげられる。非生分解性ポリマーとしては、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エチレンビニルアセテートおよびポリビニルアルコールがあげられる。

展性のある、イオン性または共有的架橋性のヒドロゲルを形成し得るポリマーが、細胞を封入するのに使用される。ヒドロゲルは、有機ポリマー（天然または合成）が、共有結合、イオン結合または水素結合を介して架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元的開格子構造を形成する際に形成される物質である。ヒドロゲルを形成するのに使用され得る材料の例としては、イオン的に架橋される多糖類、例えば、アルギン酸塩、ポリホスファジンおよびポリアクリレート、または、温度もしくはｐＨそれぞれにより架橋される、ブロックコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）もしくはＴｅｔｒｏｎｉｃｓ（商標）、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーがあげられる。他の材料としては、タンパク質、例えば、フィブリン、ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸およびコラーゲンがあげられる。

一般的には、これらのポリマーは、水溶液、例えば、水、緩衝化された塩溶液またはアルコール水溶液において、少なくとも部分的に可溶性である。ポリマーは、荷電した側鎖またはその一価のイオン性塩を有する。カチオンと反応し得る酸性側鎖を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ（ビニルアセテート）およびスルホン酸化ポリマー、例えば、スルホン酸化ポリスチレンである。アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテルモノマーまたはポリマーとの反応により形成された酸性側鎖を有するコポリマーも使用され得る。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくは、フッ化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基および酸性ＯＨ基である。アニオンと反応し得る塩基性側鎖を有するポリマーの例は、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）および一部のイミノ置換されているポリホスファゼンである。ポリマーのアンモニウムまた四級塩は、骨格窒素またはペンダント性イミノ基からも形成され得る。塩基性側鎖の例は、アミノ基およびイミノ基である。

さらに、本開示の方法に使用される組成物は、少なくとも１つの治療剤を含んでもよい。例えば、組成物は、炎症もしくは疼痛を処置するのに役立つ鎮痛剤、または、組成物により処置された部位の感染を予防する抗感染症剤を含んでもよい。より具体的には、有用な治療剤の非限定的な例としては、下記治療剤カテゴリー：鎮痛剤、例えば、非ステロイド抗炎症薬、オピエートアゴニスト、サリチル酸塩；抗感染症剤、例えば、駆虫剤、抗嫌気性菌、抗生物質、アミノグリコシド抗生物質、抗真菌抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、マクロライド系抗生物質、種々のベータ−ラクタム系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、キノロン系抗生物質、スルホンアミド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、抗マイコバクテリア、抗結核抗マイコバクテリア、抗原虫、抗マラリア性抗原虫剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、殺疥癬虫薬、抗炎症剤、副腎皮質ステロイド抗炎症剤、鎮痒剤／局所麻酔剤、局所抗感染症剤、抗真菌性局所抗感染症剤、抗ウイルス性局所抗感染症剤；電解質および腎臓作用剤、例えば、酸性化剤、アルカリ性化剤、利尿剤、炭酸脱水酵素阻害性利尿剤、ループ利尿剤、浸透圧利尿剤、カリウム保持性利尿剤、チアジド利尿剤、電解質置換および尿酸排泄剤；酵素、例えば、膵酵素および血栓溶解酵素；胃腸薬、例えば、止瀉薬、胃腸性抗炎症剤、胃腸性抗炎症剤、制酸性抗潰瘍剤、胃酸ポンプ阻害性抗潰瘍剤、胃粘膜性抗潰瘍剤、Ｈ２ブロッカ抗潰瘍剤、胆石溶解性剤、消化薬、催吐剤、緩下剤、便軟化剤および消化管運動改善薬；全身麻酔剤、例えば、吸入麻酔、ハロゲン化吸入麻酔、静脈内麻酔、バルビツール酸静脈内麻酔、ベンゾジアゼピン静脈内麻酔およびオピエート作動性静脈内麻酔；ホルモンおよびホルモン修飾因子、例えば、堕胎剤、副腎性剤、副腎皮質ステロイド副腎性剤、アンドロゲン、抗アンドロゲン、免疫生物学剤、例えば、免疫グロブリン、免疫抑制剤、トキソイドおよびワクチン；局所麻酔、例えば、アミド局所麻酔およびエステル局所麻酔；筋骨格剤、例えば、抗痛風性抗炎症剤、副腎皮質ステロイド抗炎症剤、金化合物抗炎症剤、免疫抑制抗炎症剤、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、サリチル酸塩抗炎症剤、ミネラル；ならびに、ビタミン、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥおよびビタミンＫがあげられる。

本開示の方法に有用な組成物は、細胞培養成分、例えば、アミノ酸、金属、補酵素因子を含む培地および少数の他の細胞、例えば、幹細胞のその後の分化により生じ得るいくつかのものを含み得る。

本開示の方法に有用な組成物は、例えば、対象となる細胞を、培地から沈降させ、それらを所望の溶液または材料中に再懸濁させることにより調製され得る。細胞は、例えば、遠心、ろ過、限外ろ過等により、培地から沈降および／または取り出され得る。

当業者は、本開示の方法で投与するために、組成物中の細胞および任意にキャリアの量を容易に決定し得る。一実施形態において、（活性な細胞に加えて）任意の添加剤が、リン酸緩衝生理食塩水中に、０．００１〜５０％（重量）の量の溶液で存在する。活性成分は、マイクログラムからミリグラムの単位、例えば、約０．０００１〜約５ｗｔ％、好ましくは約０．０００１〜約１ｗｔ％、さらにより好ましくは約０．０００１〜約０．０５ｗｔ％または約０．００１〜約２０ｗｔ％、好ましくは約０．０１〜約１０ｗｔ％、およびさらにより好ましくは、約０．０５〜約５ｗｔ％で存在する。当然、動物またはヒトに投与される任意の組成物について、および、任意の具体的な投与方法について、例えば、適切な動物モデル、例えば、げっ歯類、例えば、マウスにおける致死量（ＬＤ）およびＬＤ５０を決定することによる毒性、適切な応答を引き出す組成物の用量、組成物における成分濃度、および組成物を投与するタイミングを決定するのが好ましい。このような決定は、当業者の知識、この開示および本願明細書に引用された文献から、過度の試行錯誤を必要としない。そして、連続的な投与のタイミングは、過度の試行錯誤をすることなく確定され得る。

本開示の方法に有用な組成物は、特に、局所注入、例えば、カテーテル投与、全身性注入、局所注入、静脈内注入、子宮内注入または非経口投与により投与され得る。本願明細書に記載された治療組成物（例えば、医薬組成物）を投与する際、それは、一般的には、単位用量の注入剤型（溶液、懸濁液、エマルジョン）に製剤化されるであろう。

本開示の一実施形態に基づいて、組成物は、脈管障害用の少なくとも１つの他の薬剤と共に投与され得る。薬剤は、プロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）、プロスタサイクリン類似体、ホスホジエステラーゼ−５（ＰＤＥ−５）阻害剤、エンドセリン受容体アンタゴニスト（ＥＴＲＡ）、チロシンキナーゼ阻害剤および可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激剤を含む。

本開示の一実施形態に基づいて、脈管障害を処置するための方法は、さらに、肺動脈における血栓症を低減し、肺動脈における炎症を低減し、肺動脈における内膜平滑筋の増殖を低減し、肺動脈における叢状病変の形成を低減し、肺動脈における一酸化窒素の量を増加させ、肺動脈におけるＰＧＩ２の量を増加させ、肺動脈におけるエンドセリン−１のレベルを低下させ、肺動脈における増殖因子の量を低下させ、または、肺動脈における適切な内皮形態を促進することを含み得る。

前駆細胞を投与／移植することにより脈管障害を処置することは、Wang et al., J. Am. Coll. Cardiol. 49:1566-71 (2007)、Zhao et al. Circ. Res. 96:442-450 (2005)および、Nagaya et al., Circulation 108:889-895(2003)に記載されている。それらの内容は、その全体が参照により組み込まれる。

傷ついた血管内への細胞の投与／移植は、傷ついた血管組織、例えば、静脈、動脈、毛細血管を修復する可能性を有することにより、血管機能を回復させる。ただし、移植目的に適した細胞が存在しないことは、この手法の最大の可能性が満たされるのを妨げてきた。「適切な」細胞は、下記評価基準の１つ以上に合致する細胞である。（１）大量に取得され得る；（２）必要であれば、遺伝子材料の挿入を可能にするためにｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖され得る；（３）無期限に生存可能であり、移植において血管修復を容易にする、および（４）非免疫原性である、好ましくは、患者自身の組織または適切なドナーから取得される。適切な細胞は、自家、同種または異種であり得る。

細胞は、異常な脈管構造または冠動脈不全の兆候を有する対象に投与され得る。細胞は、レシピエント自身の血液または骨髄から調製され得る。このような例では、ＥＰＣは、分離された組織から産生され得、上述した方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増殖され得る。細胞数の適切な増殖に基づいて、ＥＰＣは、採取され、必要に応じて遺伝子組み換えされ、レシピエントの脈管構造内への直接注入用に準備され得る。

細胞は、宿主に対して異種であるドナー組織から調製され得る。成功した異種移植片について、移植組織への免疫応答を低下または除去するいくつかの方法が、通常使用される。例えば、レシピエントは、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンの使用、または、局所適用された免疫抑制剤を使用する局所免疫抑制戦略のいずれかにより、免疫抑制され得る。局所免疫抑制は、Gruber, 54 Transplantation 1-11 (1992)により開示されている。米国特許第５，０２６，３６５号明細書には、局所免疫抑制に適した封入法が開示されている。

免疫抑制技術を使用する代替手段として、Smithies et al., 317 Nature 230-234 (1985)により教示され、細胞株における遺伝子置換またはノックアウトに拡大された（Zheng et al., 88 Proc. Natl. Acad. Sci. 8067-8071 (1991)）、胚性幹細胞における相同組換えを使用する遺伝子置換またはノックアウトの方法が、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子の除去について、ＥＰＣに適用され得る。ＭＨＣ発現を欠くＥＰＣにより、レシピエントを免疫抑制する必要なく、同種、おそらくさらに異種の組織適合性障壁を超えた、濃縮された内皮細胞集合の移植が可能となる。ドナー細胞の抗原性を低下させる組換え法の使用についての全体的なレビューおよび引用は、Gruber, 54 Transplantation 1-11 (1992)によっても開示されている。表面修飾による移植の免疫原性低下に対する例示となるアプローチは、国際公開第９２／０４０３３号パンフレットおよび国際特許出願ＵＳ９９／２４６３０号により開示されている。あるいは、移植片の免疫原性は、ＭＨＣ抗原が変異または欠失しているトランスジェニック動物からＥＰＣを調製することにより低下し得る。

細胞は、公知の封入技術、例えば、マイクロ封入（例えば、米国特許第４，３５２，８８３号；同第４，３５３，８８８号および同第５，０８４，３５０号明細書を参照のこと。同文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。）および、マクロ封入（例えば、米国特許第５，２８４，７６１号、同第５，１５８，８８１号、同第４，９７６，８５９号および同第４，９６８，７３３号明細書ならびに国際公開第９２／１９１９５号および同第９５／０５４５２号パンフレットを参照のこと。それぞれは、参照により本願明細書に組み込まれる。）に基づいて、宿主に因子を送達するために、封入され、使用され得る。マクロ封入は、米国特許第５，２８４，７６１号；同第５，１５８，８８１号；同第４，９７６，８５９号；同第４，９６８，７３３号；同第５，８００，８２８号明細書および国際公開第９５／０５４５２号パンフレットに記載されている。それぞれは、参照により本願明細書に組み込まれる。複数のマクロ封入装置が、宿主に埋め込まれ得る。

レシピエントの組織に対して同種である組織から調製された細胞は、組織分類の周知の方法により、使用するために試験され、レシピエントの組織適合性型を密接にマッチさせる。

脈管構造に投与された細胞は、細胞が隣の血管細胞と正常な結合を形成し、移植された内皮細胞または既存の内皮細胞との接触を維持するように、血管グラフトを形成し得る。例えば、移植された細胞は、疾患および加齢により傷害されている血管組織を再確立し得る。

宿主の血管組織内への移植片の機能的な一体化は、種々の機能の回復における移植片の有効性を試験することにより評価され得る。

本開示の一実施形態に基づいて、細胞は、レシピエントに、少なくとも１つの増殖因子、例えば、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＢＭＰ−４、ＴＧＦ−ベータ等と共に投与され得る。

本技術は、さらに、下記の非限定的な実施例への言及により規定される。組成物および方法の両方に対する多くの修飾が、本発明の範囲を逸脱することなく実施されてもよいことは、当業者に明らかであろう。

実施例１．ＢＭ−ＭＳＣにおける細胞応答のためのトレプロスチニル濃度の最適化
この実施例では、ヒト骨髄の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）の血管新生能を増大させるのに必要とされる、最少トレプロスチニル濃度を特定する。

１つのバイアルのヒト骨髄由来のＭＳＣを、標準的な増殖培地を使用して、増殖させ、６ウェルプレートの２０ウェルに播種した。９５〜９９％の培養密度において、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で十分洗浄した。ついで、細胞を、０、０．１、１．０、１０または１００μｇ／ｍＬのトレプロスチニルを含む培地に曝した（各濃度について、ｎ＝４ウェル）。

２４時間の培養後、馴化培地を、各レプリケートから回収し、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）タンパク質について、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により分析した。この実験の目的を、（出力としてＶＥＧＦを使用して）ＭＳＣにおける細胞応答を引き出すのに必要とされるトレプロスチニルの最適濃度を決定することとした。

フローサイトメトリー分析（図１）は、この試験において使用した骨髄ＭＳＣは、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０およびＨＬＡ−ＡＢＣについて陽性であったことを証明した。細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＨＬＡ−ＤＲについて、陰性または低かった（ｌｏｗ）。ＭＳＣの定義は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（Dominici et al., Cytotherapy 8(4):315-7, 2006）により確立された。

図２は、トレプロスチニルに対する暴露２４時間後のヒト骨髄ＭＳＣによる、ＶＥＧＦ分泌を示すチャートである。細胞培養上清を、ＶＥＧＦについてＥＬＩＳＡによりアッセイした（群あたりにｎ＝４）。図２に示したように、統計学的に有意な差異は、用量群において観察されなかった（エラーバーは、試験群の標準偏差を表す。）。

この実験は、１００μｇ／ｍＬ以下のトレプロスチニル濃度が、ヒト骨髄ＭＳＣの血管新生能を顕著に増大させないことを示唆する。しかしながら、トレプロスチニルを増加させた場合、ＶＥＧＦ分泌のわずかな増加傾向が存在している。次の実施例では、より高い濃度のトレプロスチニルについて試験した。

実施例２．ＢＭ−ＭＳＣにおける細胞応答のためのトレプロスチニル濃度の最適化
この実施例では、ヒトＢＭ−ＭＳＣの血管新生能を増大させるための、トレプロスチニルの良好な濃度として、２５０μｇ／ｍＬを特定する。

実施例１に対する追跡実験を行い、１００μｇ／ｍＬを上回るトレプロスチニル濃度が、ＭＳＣのＶＥＧＦ分泌に影響を及ぼすかどうかを決定した。前述のように、１つのバイアル（同ロット／バッチ）の骨髄由来のＭＳＣを、標準的な増殖培地を使用して、６ウェルプレートの３０ウェルに増殖させた。９５〜９９％の培養密度において、細胞を、ＰＢＳで十分洗浄した。ついで、細胞を、０、１００、２００、３００または４００μｇ／ｍＬのトレプロスチニルを含む培地に曝した（各濃度について、ｎ＝６ウェル）。

馴化培地を、トレプロスチニル暴露の２４時間後、ＶＥＧＦについてＥＬＩＳＡにより分析した（ｎ＝４レプリケート）。これらのレプリケートからの細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出して、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。残りの２つのレプリケートからの細胞をトリプシン処理し、細胞生存率についてトリパンブルー色素排除によりアッセイした。

細胞培養上清を、ＶＥＧＦタンパク質についてＥＬＩＳＡによりアッセイした（図３Ａ、ｎ＝４）。それらの培養からの細胞ライゼートを、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子発現について、ｑＲＴ−ＰＣＲによりアッセイし、コントロール値に対して正規化した（図３Ｂ、ｎ＝４）。両図において、エラーバーは、各試験群における標準偏差を表す。

図４は、増大した濃度のトレプロスチニルに曝されたＭＳＣの典型的な画像を含む。最も高い用量（４００μｇ／ｍＬ）において、増加した数の集まった剥離細胞は、ＭＳＣにおけるトレプロスチニルの細胞傷害作用を示唆した。

ＭＳＣを、トリパンブルーで染色して、各ウェルにおける生細胞および死細胞の総数を測定した（図５、群あたりにｎ＝２ウェル）。パーセント生存率を、トリパンブルー陰性細胞と総数との間の比として算出した（１００×生細胞／総数）。統計学的分析を行うには、レプリケートが少なすぎるが、トレプロスチニル濃度を、１００μｇ／ｍＬを上回って増大させた場合、生存率の低下傾向が存在した。ただし、細胞生存率は、この実験において試験したいずれの用量レベルにおいても、８５％を下回って低下しなかった。

この実施例は、高レベルのトレプロスチニルが、ＭＳＣの細胞生存率にネガティブな影響を及ぼしたことを証明した。１００μｇ／ｍＬにおいて、ＶＥＧＦ分泌は、約２倍に増加したが、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の発現は、暴露の２４時間後に、処理されていないコントロールとは顕著な差異がなかった。ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の発現は、２００μｇ／ｍＬレベルのトレプロスチニルにおいて、５倍を超えて増大し、ＶＥＧＦ分泌は、コントロール値の約３倍観察された。ＶＥＧＦ分泌は、より高い濃度のトレプロスチニルによっても、この値を上回って増大しなかった。このことは、作用が飽和したことを示唆する。したがって、２５０μｇ／ｍＬを、その後の試験に使用する最適なトレプロスチニル濃度として選択した。

実施例３．２５０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルに曝されたＭＳＣの網羅的分析
先の実施例に基づいて、この実施例では、ＭＳＣにおける細胞応答を引き出すトレプロスチニル用量として、２５０μｇ／ｍＬを選択した。この濃度は、処理されていないコントロール細胞と比較したＶＥＧＦ産生および最少の細胞毒性作用に基づいた。

ヒト骨髄ＭＳＣを、標準的な増殖培地を使用して増殖させ、６本のＴ２２５フラスコに播種した（表１）。９５〜９９％の培養密度において、細胞を、ＰＢＳで十分洗浄した。３本のフラスコを、２５０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルを含む基本培地で満たした、（＋）Ｔｒｅ。残りの３本のフラスコを、トレプロスチニルを添加していない基本培地で満たした、（−）Ｔｒｅ。

２４時間の培養後、典型的な画像を、（＋）Ｔｒｅおよび（−）Ｔｒｅの培養物から得た。馴化培地を、各レプリケートから回収し、適切な容量の２つのサンプルに分割し、１）分泌タンパク質（Ｍｙｒｉａｄ ＲＢＭ ＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎＭＡＰ（登録商標）１．０）、および、２）エクソソームＲＮＡ含量について、別々に分析した。細胞を、培養フラスコから直接溶解し、全ＲＮＡ単離用に処理し、遺伝子発現について、マイクロアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ ＨＴ１２ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ）により分析した。

図６は、細胞のシグナル伝達、遺伝子発現およびパラクリン因子の放出における、トレプロスチニルの効果についてのモデルを図示する。以下の表を用いて、効果を試験するのに有用なアッセイを示す。

ＭＳＣにおけるトレプロスチニルの効果を特徴付けるために、細胞を、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイにより分析して、遺伝子発現における変化を特定した（４）。細胞培養上清培地を、選択した炎症性サイトカインについて、ビーズ系免疫アッセイによりアッセイした（２）。分泌された小胞を、細胞培養上清から単離し、ｑＲＴ−ＰＣＲによりＲＮＡ含量をアッセイした（７）。小胞も、サイズおよび濃度について、調節可能な抵抗パルスセンシングまたはＴＲＰＳによりアッセイした（７）（実施例４を参照のこと）。

２５０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルに２４時間曝された細胞（図７Ａ、右パネル）は、処理されていない細胞（図７Ａ、左パネル）と比較して、形態学において、明確な変化を示さなかった。細胞生存率を、トリプシン処理された細胞において、トレプロスチニル処理された培養物およびトレプロスチニル処理されていない培養物の両方において評価した。顕著な細胞死は、トレプロスチニル暴露の結果として観察されなかった。図７Ｂを参照のこと（全てのレプリケートおよび条件において、＞９５％の生存率）。

ＶＥＧＦ−Ａの遺伝子発現を、ＭＳＣにおいてｑＲＴ−ＰＣＲにより確認した。トレプロスチニルは、処理されていないコントロールに対して、ＶＥＧＦ−Ａ発現を約３．５倍増大させた（図８、上側パネル）。さらに、ｍｉＲ−２１は、トレプロスチニル暴露ＭＳＣ由来のエクソソームにおいて、より多量であった。一方、ｌｅｔ−７ｂは、コントロールと比較して、より少なかった（図８、下側パネル；アスタリスクは、統計学的有意（ｐ＜０．０５）を示す。）。

マイクロアレイ遺伝子発現分析も、２５０ｕｇ／ｍＬのトレプロスチニルを含まない（−）または含む（＋）培養物からのＭＳＣにおいて行った。各条件からの３つの生物学的レプリケートを分析した。全てのレプリケートにおいて特定された７７，６１２個の配列のうち、２４，２７３個のみが、５０カウントの任意のバックグラウンドを上回って検出された。２，９８４個のＲＮＡ配列は、Ｔｒｅ（−）培養物に固有であったが、１，７８１個のＲＮＡ配列は、Ｔｒｅ（＋）培養物に固有であった（パネルＡ）。両条件において検出された遺伝子を、特異的発現について、さらに分析した（パネル）。通常に発現した１９，５０８個の遺伝子のうち、１，６９０個のみが、有意に異なった（ｐ＜０．０１）。２６８個の遺伝子が、処理されていないＭＳＣにおいて、少なくとも４倍以上高いことが見出された。１７１個は、Ｔｒｅ（＋）ＭＳＣ培養物において、少なくとも４倍以上高いことが見出された。

図９Ａおよび９Ｂに示したように、特異的に発現した遺伝子は、Ｔｒｅ（＋）ＭＳＣ培養物とコントロールとを（クラスター化に関して）明確に分離した。このことは、トレプロスチニルが、ＭＳＣ細胞の機能または活性に顕著な影響を示したことを示唆する。

表２〜３は、トレプロスチニルに対する応答において上方制御された遺伝子を列記する。少なくとも５００カウントの平均値を有し、Ｔｒｅ（＋）培養物においてのみ発現した遺伝子を、表２に示す。処理されていない細胞と比較して、Ｔｒｅ（＋）において少なくとも１０倍以上発現した遺伝子を、表３に示す。

表４〜５は、トレプロスチニルに対する応答において下方制御された遺伝子を列記する。Ｔｒｅ（＋）培養物において少なくとも１０倍下方制御された遺伝子を、表４に示す。Ｔｒｅ（−）培養物においてのみ発現された（すなわち、Ｔｒｅ（＋）培養物において完全に発現されなかった）遺伝子を、表５に示す。

ビーズ系免疫アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を行い、細胞培養上清中の４６個のサイトカイン濃度を評価した（Ｍｙｒｉａｄ ＲＢＭ Ｈｕｍａｎ ＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎＭＡＰ（登録商標）１．０）。評価した４６個のうちの６個が、トレプロスチニル処理および未処理ＭＳＣ培養物において、特異的に分泌された（表６を参照のこと。群あたりにｎ＝３）。アスタリスクは、スチューデントｔ検定に基づいて、群間における統計学的有意性を示す（^＊ｐ＜０．００１または^＊＊ｐ＜０．０００１）。

全ＲＮＡを、エクソソーム調製物から抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲを、親細胞についての実験（図８を参照のこと。）において使用したのと同じプライマー／プローブセットにより行った。ＭＳＣ由来エクソソーム中に存在するＶＥＧＦ−Ａ遺伝子転写物は、トレプロスチニル暴露の結果として、約４倍増大した（図１０）。さらに、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１９９−３ｐは、トレプロスチニル処理された細胞由来のエクソソーム中に、有意により豊富であった（ｐ＜０．０５）。

この実施例は、ＭＳＣの遺伝子発現および分泌プロファイルが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、トレプロスチニルに２４時間曝されたことに基づいて変化したことを示す。トレプロスチニルは、ＶＥＧＦタンパク質および遺伝子の両方が増大した観察に基づいて、ＭＳＣの血管新生能を増大させた。さらに、トレプロスチニル処理されたＭＳＣのエクソソームは、より高いレベルのＶＥＧＦ−Ａを有した。前記より高いレベルのＶＥＧＦ−Ａは、遺伝子水平伝播のメカニズムにより、ターゲット細胞におけるＶＥＧＦの産生増大を促進し得た。

さらに、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１９９ａ−３ｐが観察された。ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ１９９ａ−３ｐは、ターゲット細胞における活性にも影響を及ぼし得た（Lee et al., Circulation 126(22):2601-11, 2012）。分泌されたサイトカインにおける変化も、トレプロスチニル暴露の結果として観察された。特に、ＩＬ−６が、コントロールＭＳＣと比較して、約５０倍高く産生された。一方、ＭＣＰ−１は、約６〜７倍少なく分泌された。

実施例４．２５０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルに曝されたＭＳＣ由来のエクソソームの物理的分析
実施例３に記載された実験手法を繰り返して、更なる分析に十分なエクソソームを生成した。トレプロスチニル処理および未処理のＭＳＣ培養物からの馴化培地を、調節可能な抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）により分析した。この方法は、サンプルに懸濁した粒子数および各粒子のサイズを、サンプルを通る電流の変化に基づいて定量する。

トレプロスチニル処理および未処理ＭＳＣ由来のエクソソームのサイズ分布を、図１１Ａ〜Ｂに表す。トレプロスチニル処理されたＭＳＣからのエクソソーム調製物（図１１Ａ）および未処理ＭＳＣ（図１１Ｂ）を、５０〜６００ｎｍサイズの粒子について、調節可能な抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）により分析した。各エクソソーム集合についてのこれらの典型的なヒストグラムは、大部分の粒子が、両群において、１５０〜２００ｎｍのサイズであったことを証明した。トレプロスチニル処理ＭＳＣは、ほぼ６０％の集合が約２００ｎｍサイズのカテゴリーに入る、より均質なエクソソーム集合を生じさせた。各条件についての合計粒子カウントは、＞５００カウントであった。

エクソソーム調製物の粒子濃度を、ＴＲＰＳにより測定した。より少ない粒子が、コントロール（ｎ＝１）と比較して、（＋）トレプロスチニル調製物において観察された。平均サイズ、モードサイズおよびサイズ範囲は、二群間において類似し、表７に含まれる。

この実施例は、トレプロスチニルが、より均質なエクソソーム集合を生じさせ得たことを示唆する。

前述は、特定の好ましい実施形態を意味するが、本開示は、そのように限定されないことが理解されるであろう。種々の修飾が開示された実施形態になされ得ること、および、このような修飾が本開示の範囲内であることを意図することが、当業者に明らかとなるであろう。

この明細書において引用された刊行物、特許出願および特許は全て、その全体が参照により本願明細書に組み込まれる。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］
必要とする対象において脈管障害を治療または予防するための方法であって、前記対象に、プロスタサイクリンと、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または前記ＭＳＣと接触しており、前記ＭＳＣの１つ以上の成分を含む培地の一部を含む組成物とを投与することを含む、方法。
［２］
前記プロスタサイクリンおよび前記組成物が、同時に投与される、［１］に記載の方法。
［３］
前記プロスタサイクリンおよび前記組成物が、別々に投与される、［１］に記載の方法。
［４］
さらに、前記投与前に、前記ＭＳＣまたは前記培地の一部を、プロスタサイクリンと接触させることを含む、［１］に記載の方法。
［５］
前記ＭＳＣの成分が、エクソソーム、微小小胞、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ミトコンドリア、増殖因子およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［６］
さらに、前記対象に、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を投与することを含む、［１］に記載の方法。
［７］
前記ＥＰＣが、前記対象から取得される、［６］に記載の方法。
［８］
前記ＥＰＣが、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＯＸ１）およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＴＧＩＳ）からなる群から選択されるタンパク質の生物学的活性の発現を増大させる核酸により形質転換されている、［６］に記載の方法。
［９］
前記核酸が、前記タンパク質をコードする、［８］に記載の方法。
［１０］
前記プロスタサイクリンが、エポプロステノール、トレプロスチニル、ベラプロスト、イルプロスト、ＰＧＩ _２ 受容体アゴニストおよび薬学的に許容され得るそれらの塩からなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［１１］
前記プロスタサイクリンが、トレプロスチニルまたは薬学的に許容され得るその塩もしくはそのエステルである、［９］に記載の方法。
［１２］
前記ＭＳＣが、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）である、［１］に記載の方法。
［１３］
前記ＭＳＣが、骨髄から取得される、［１］に記載の方法。
［１４］
前記脈管障害が、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症下肢虚血（ＣＬＩ）、冠状動脈疾患および糖尿病性脈管障害からなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［１５］
治療的に有効量のプロスタサイクリンと、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または前記ＭＳＣと接触しており、前記ＭＳＣの１つ以上の成分を含む培地の一部を含む組成物と、薬学的に許容され得るキャリアとを含む、医薬組成物。
［１６］
前記ＭＳＣまたは前記培地の一部が、プロスタサイクリンと接触している、［１５］に記載の組成物。
［１７］
さらに、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む、［１５］に記載の組成物。
［１８］
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または前記ＭＳＣと接触しており、前記ＭＳＣの１つ以上の成分を含む培地を含む、ｉｎ ｖｉｖｏ送達用の組成物を調製するための方法であって、
前記ＭＳＣをプロスタサイクリンと接触させることを含む、方法。
［１９］
前記プロスタサイクリンが、約２００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬの濃度で存在する、［１８］に記載の方法。
［２０］
［１８］に記載の方法により取得可能な処理された組成物。

Claims (14)

1. 対象において血管新生の促進が要求される疾患を治療または予防するための医薬組成物であって、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含むか、またはＭＳＣを培養するために使用した培地であって前記ＭＳＣから放出された血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含む培地を含み、前記ＭＳＣは、少なくとも約１００μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンでＭＳＣをｅｘ ｖｉｖｏ処理することによって得られたものであり、前記処理されたＭＳＣは、処理されていないＭＳＣと比較して増大した血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を有する、医薬組成物。
2. さらに、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記ＥＰＣが、前記対象から取得される、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 前記ＥＰＣが、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＯＸ１）およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＴＧＩＳ）からなる群から選択されるタンパク質の生物学的活性の発現を増大させる核酸により形質転換されている、請求項２に記載の医薬組成物。
5. 前記核酸が、タンパク質をコードする、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 前記プロスタサイクリンが、エポプロステノール、トレプロスチニル、ベラプロスト、イルプロスト、ＰＧＩ_２受容体アゴニストおよび薬学的に許容され得るそれらの塩からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
7. 前記プロスタサイクリンが、トレプロスチニルまたは薬学的に許容され得るその塩もしくはそのエステルである、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 前記ＭＳＣが、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）である、請求項１に記載の医薬組成物。
9. 前記ＭＳＣが、骨髄から取得される、請求項１に記載の医薬組成物。
10. 前記疾患が、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症下肢虚血（ＣＬＩ）、冠状動脈疾患および糖尿病性脈管障害からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
11. 治療的に有効量のプロスタサイクリンと、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣを培養するために使用した培地であって前記ＭＳＣから放出された血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含む培地を含む組成物と、薬学的に許容され得るキャリアとを含む、血管新生の促進が要求される疾患を治療または予防するための医薬組成物であって、前記ＭＳＣは、処理されたＭＳＣが処理されていないＭＳＣと比較して増大した血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）産生を有するように、培地において少なくとも約１００μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンでｅｘ ｖｉｖｏ処理することによって得られたものである、医薬組成物。
12. さらに、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む、請求項１１に記載の組成物。
13. 間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含むか、またはＭＳＣを培養するために使用した培地であって前記ＭＳＣから放出された血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含む培地を含む、ｉｎ ｖｉｖｏ送達用の組成物を調製するための方法であって、
    （ａ）培地においてＭＳＣを増殖させることと、
    （ｂ）前記ＭＳＣの増殖中に、培地中で、前記ＭＳＣを少なくとも１００μｇ／ｍＬの濃度で存在するプロスタサイクリンとｅｘ ｖｉｖｏで接触させることと
    を含む、方法。
14. 前記プロスタサイクリンが、約２００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１３に記載の方法。