ES2251773T5

ES2251773T5 - Regeneracion del musculo cardiaco usando celulas precursoras mesenquimatosas.

Info

Publication number: ES2251773T5
Application number: ES98934507T
Authority: ES
Inventors: Mark F. Pittenger; Stephen L. Gordon; Alastair Morgan Mackay
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1997-07-14
Filing date: 1998-07-14
Publication date: 2009-05-12
Anticipated expiration: 2018-07-14
Also published as: DE69831957T2; CA2296704A1; EP1007631B2; DE69831957T3; DK1007631T3; EP1007631A4; ES2251773T3; AU8401498A; EP1007631A1; WO1999003973A1; JP4562816B2; DK1007631T4; EP1007631B1; CA2296704C; JP2002511094A; US6387369B1; DE69831957D1; ATE307195T1

Abstract

Utilización de células precursoras mesenquimatosas para fabricar una preparación farmacéutica para el tratamiento de un paciente que tiene el músculo cardiaco dañado con el fin de mejorar la función cardiaca.

Description

Regeneración del músculo cardiaco usando células precursoras mesenquimatosas.

Antecedentes de la invención

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional estadounidense número de serie 60/052910, presentada el 14 de julio de 1997. Esta invención se refiere a la sustitución y regeneración de tejido y músculo cardiacos.

Este año, más de 300.000 norteamericanos morirán de insuficiencia cardiaca congestiva. La habilidad para aumentar el músculo cardiaco debilitado constituiría un avance importante en el tratamiento de la cardiomiopatía y la insuficiencia cardiaca. A pesar de los avances en la terapia médica de la insuficiencia cardiaca, la mortalidad debida a este trastorno sigue siendo alta, ya que la mayoría de los pacientes mueren en un plazo de 1 a 5 años después del diagnóstico.

Una dolencia coronaria común en la población envejecida es la función incorrecta de las válvulas del corazón, particularmente de la válvula aórtica. Se usan mucho las válvulas de sustitución mecánica, pero exigen que el paciente tome continuamente anticoagulantes. Las válvulas obtenidas de cadáveres y xenoinjertos (porcinos) son también usadas frecuentemente para reemplazar el tejido propio de un paciente. Las válvulas son secadas por congelación o químicamente reticuladas, usando, por ejemplo, glutaraldehido para estabilizar la fibrillas de colágeno y disminuir la antigenicidad y la degradación proteolítica. Sin embargo, estas válvulas son acelulares y a menudo fallan al cabo de varios años debido a esfuerzo mecánico o calcificación. Sería preferida una válvula de sustitución, derivada de material biocom-
patible que permitiese el crecimiento interno de las células huésped apropiadas y la renovación del tejido en el tiempo.

Las células precursoras mesenquimatosas (MSCs) son células que son capaces de diferenciarse en más de un tipo de linaje de células mesenquimatosas. Las células precusoras mesenquimatosas (MSCs) han sido identificadas y cultivadas a partir de especies de aves y mamíferos incluido el ratón, la rata, el conejo, el perro y humanos (véase Caplan, 1991, Caplan y cols. 1993 y patente U.S. número 5.486.359). El aislamiento, la purificación y la expansión del cultivo de hMSCs se describen en ella con detalle.

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención se usa células precursoras mesenquimatosas (MSCs) para regenerar o reparar el músculo cardiaco estriado que ha sido dañado por enfermedad o degeneración. Las MSCs se diferencian en células del músculo cardiaco y se integran con el tejido sano del receptor para reemplazar la función de las células muertas o dañadas, regenerando de este modo el músculo cardiaco como un todo. El músculo cardiaco no tiene normalmente potencial reparador. Las MSCs se usan, por ejemplo, en la regeneración del músculo cardiaco para una serie de indicaciones principales: (i) implantes cardiacos isquémicos, (ii) terapia para pacientes con insuficiencia cardiaca congestiva, (iii) prevención de otras enfermedades para pacientes sometidos a injerto de derivación de la arteria coronaria, (iv) regeneración de tejido conductivo, (v) regeneración del músculo liso de los vasos y (vi) regeneración de válvulas. Por tanto, las MSCs se usan también para integrarse con el tejido de una válvula cardiaca de sustitución a colocar en un receptor. Las MSCs, preferiblemente autólogas, efectúan la repoblación del tejido de la válvula, permitiendo un correcto funcionamiento de la válvula.

La terapia del músculo cardiaco con MSCs se basa, por ejemplo, en la siguiente secuencia: recolección de tejido que contiene MSC, aislamiento/expansión de MSCs, implante en el corazón dañado (con o sin una matriz de estabilización y manipulación bioquímica), y formación in situ de miocardio. Este enfoque es diferente de una manipulación de tejidos tradicional, en la que los tejidos se cultivan ex vivo y se implantan en su forma final diferenciada. Disparadores biológicos, bioeléctricos y/o biomecánicos del entorno del huésped pueden ser suficientes, o en determinadas circunstancias pueden aumentarse como parte del régimen terapéutico para establecer un tejido completamente integrado y funcional.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona el uso de células precursoras mesenquimatosas para la fabricación de una preparación farmacéutica para producir cardiomiocitos en un individuo que los necesite. Las células precursoras mesenquimatosas que se utilizan puede ser una composición homogénea o pueden ser una población de células mixtas enriquecida en MSCs. Las composiciones de células precursoras mesenquimatosas humanas homogéneas se obtienen cultivando células adherentes de médula o del periostio; las células precusoras mesenquimatosas pueden ser identificadas por marcadores específicos de la superficie de las células que son identificados con anticuerpos monoclonales únicos. Un método para obtener una población de células enriquecida en células precursoras mesenquimatosas es descrito, por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.486.359.

La administración de las células puede dirigirse hacia el corazón por diversos procedimientos. Se prefiere la administración localizada. Las células precursoras mesenquimatosas pueden proceder de diversas fuentes que incluyen, en orden de preferencia: las autólogas, halogeneicas o xenogeneicas. Existen varias realizaciones en este aspecto, incluidas las siguientes.

En una realización de este aspecto, las MSCs deben ser administradas como una suspensión de células en un medio líquido farmacéuticamente aceptable para inyección. La inyección puede ser local en esta realización, es decir, directamente dentro de la parte dañada del miocardio, o sistémica. Aquí, nuevamente, se prefiere la administración localizada.

En otra realización de este aspecto, deben ser administradas las MSCs en un medio biocompatible que es, o se vuelve in situ, en el lugar donde está presente el daño del miocardio, una matriz semisólida o sólida. Por ejemplo, la matriz puede ser (i) un líquido inyectable que "se endurece" (o polimeriza) bajo la forma de un gel semisólido en el sitio donde está presente el miocardio dañado, tal como colágeno y sus derivados, ácido poliláctico o ácido poliglicólico o (ii) una o más capas de una matriz sólida y flexible que se implante en su forma final, tales como matrices fibrosas impregnadas. La matriz puede ser, por ejemplo, Gelfoam (Upjohn, Kalamazoo, MI). La matriz mantiene las MSCs en su lugar en el sitio donde está presente la lesión, es decir, desempeña la función de "andamiaje". Esto mejora, a su vez, la oportunidad para que las MSCs administradas proliferen, se diferencien y finalmente se vuelvan cardiomiocitos completamente desarrollados. Como resultado de su localización en el entorno del miocardio se integran entonces con el miocardio circundante del receptor. Estos acontecimientos ocurren igualmente en la realización inyectable líquida antes citada, pero puede ser preferible esta realización en aquellos casos en que se indica una terapia más rigurosa.

En otra realización de este aspecto, las MSCs son genéticamente modificadas o manipuladas para contener genes que expresen proteinas de importancia para la diferenciación y/o el mantenimiento de las células del músculo estriado. Los ejemplos incluyen factores del crecimiento (TFG-\beta, IGF-1, FGF), factores miógenos (mioD, miogenina, Mif5, MRF), factores de transcripción (GATA-4), citocinas (cardiotrofin-1), miembros de la familia neoregulina (neoregulina 1, 2 y 3) y genes de homeosecuencia (Csx, tinman, familia NKx). También se contempla los genes que codifican factores que estimulan la angiogénesis y revascularización (por ejemplo, factor de crecimiento endotelial váscular (VEGF)). Cualquiera de los métodos conocidos para introducir ADN son apropiados, sin embargo, actualmente se prefiere la electroporación, vectores retrovirales y vectores de virus adeno-asociados (AAV).

Por tanto, en asociación con la realización del aspecto antes mencionado usando MSCs genéticamente manipuladas, esta invención proporciona también nuevas composiciones de células precursoras mesenquimatosas y tejido genéticamente manipuladas para tratar las mencionadas indicaciones. Las composiciones pueden incluir MSCs genéticamente modificadas y MSCs no modificadas en varias proporciones para regular la cantidad de material exógeno expresado en relación con el número total de MSCs a afectar.

La invención se refiere también al potencial de las MSCs para diferenciarse parcialmente en el fenotipo cardiomiocito usando métodos in vitro. En determinadas circunstancias esta técnica puede optimizar la conversión de las MSCs en el linaje cardiaco por predisposición de ellas en el mismo. Esto tiene también el potencial de acortar el tiempo necesario para la completa diferenciación una vez que se ha administrado las células.

\vskip1.000000\baselineskip

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-1C muestran el músculo cardiaco inyectado, usando una aguja fina, con MSCs marcadas con tinte in vitro. Se utilizaron los tintes lipófilos PKH26 (Sigma Chemical) o CM-DI (Molecular Probes) para marcar las MSCs antes de introducirlas en animales. Estos tintes permanecen visibles cuando se recolecta el sitio del tejido 1-2 meses más tarde. Hemos observado también que tales tintes no intefieren con la diferenciación de las MSCs en ensayos in vitro. La figura 1A muestra la imagen poco aumentada de un corazón de rata que ha sido inyectado con células marcadas con tinte, y posteriormente se ha realizado en el sitio una incisión en T. Las figuras 1A y 1B revelan las MSCs marcadas en la pared del ventrículo vista desde la superficie exterior. La figura 1C muestra una sección transversal de la pared del ventrículo y que las células están presentes en 1-2 mm exteriores del músculo cardiaco de 3 mm de grosor.

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción detallada de realizaciones preferidas

Los estímulos ambientales correctos convierten las MSCs en miocitos cardiacos. La diferenciación de las células precursoras mesenquimatosas en el linaje cardiaco es controlada por factores presentes en el entorno cardiaco. La exposición de las MSCs a un entorno cardiaco simulado dirige estas células hacia la diferenciación cardiaca que es detectada por la expresión de marcadores específicos de linaje del músculo cardiaco. Las influencias ambientales químicas, eléctricas y mecánicas locales alteran las MSCs pluripotentes y convierten en el linaje cardiaco las células injertadas en el corazón.

Tempranamente en el desarrollo embrionario después de la transición epitelios-mesenquima, el supuesto mesenquima del corazón de los lados izquierdo y derecho del cuerpo migra a la línea media ventral. Aquí, la interacción con otros tipos de células induce cardiogénesis continuada. La conversión in vitro de las MSCs en cardiomiocitos es comprobada por co-cultivo o fusión con células precursoras embrionarias murinas o cardiomiocitos, tratamiento de MSCs con lisados celulares cardiacos, incubación con factores del crecimiento solubles, específicos, o exposición de las MSCs a estímulos mecánicos y estimulación eléctrica.

Se describe aquí una serie de tratamientos específicos que son aplicables a las MSCs para inducir expresión de genes cardiacos específicos. Las condiciones son efectivas con células MSCs de rata, caninas y humanas. Los tratamientos de MSCs incluyen (1) co-cultivo de MSCs con células cardiacas de rata fetales, neonatales y adultas, (2) uso de fusígenos químicos (por ejemplo, polietilenglicol o virus sendai) para crear heterocariones de MSCs con cardiomiocitos fetales, neonatales y adultos, (3) incubación de MSCs con extractos de corazones de mamíferos, incluida la matriz extracelular y moléculas análogas encontradas en el tejido del corazón, (4) tratamiento de las MSCs con factores de crecimiento y agentes de diferenciación, (5) estimulación mecánica y/o eléctrica de MSCs y (6) acoplando mecánica y/o eléctricamente MSCs con cardiomiocitos. Las MSCs que progresan hacia cardiomiocitos expresan primeramente proteinas halladas en el tejido cardiaco fetal y después proceden hacia las formas adultas. La detección de expresión de proteinas específicas de cardiomiocitos se consigue usando anticuerpos de, por ejemplo, anticuerpo monoclonal de cadena pesada miosina MF 20 (MF20), ATPasa de calcio de retículo sarcoplásmico (SERCA1) (mAb 10D1) o uniones intercelulares usando anticuerpos a la conexina 43.

La lesión cardiaca promueve respuestas del tejido que mejoran la miogénesis usando MSCs implantadas. De esta manera se introduce MSCs en la zona infartada para reducir el grado de formación de cicatrices y aumentar la función ventricular. Se crea por consiguiente músculo nuevo dentro de un segmento de miocardio infartado. Las MSCs se infiltran directamente en la zona de tejido infartado. La integración y diferenciación subsiguiente de estas células se caracteriza como se ha descrito más arriba. El desarrollo cronológico de la intervención es diseñado para imitar la disposición clínica en la que los pacientes con infarto de miocardio agudo irían primeramente a la atención médica, recibirían terapia de primera línea, seguida por la estabilización, y después intervención con terapia sustitutiva de miocardio, en caso necesario.

De las cuatro cámaras del corazón, el ventrículo izquierdo es principalmente responsable de bombear la sangre bajo presión a través del sistema circulatorio corporal. El mismo tiene las paredes del miocardio más gruesas y es el sitio más frecuente de lesión del miocardio como resultado de la insuficiencia coronaria congestiva. El grado de avance o gravedad de la insuficiencia cardiaca congestiva va desde aquellos casos en los que se indica el trasplante de corazón tan pronto como está disponible un órgano de donante apropiado hasta aquellos en los que se observa poca o ninguna lesión permanente y el tratamiento es principalmente profiláctico.

La gravedad del infarto de miocardio resultante, es decir, el porcentaje de masa muscular del ventrículo izquierdo que está implicada puede oscilar entre el 5 y 40% aproximadamente. Esto representa áreas de tejido afectadas, tanto de una isquemia continua como de la suma de lesiones isquémicas más pequeñas, que tienen áreas horizontales afectadas de entre 2 y 6 cm^{2} aproximadamente y un espesor de 1-2 mm a 1-1,5 centímetros. La gravedad del infarto se ve afectada de manera significativa por los vasos que estén implicados así como por el tiempo que ha transcurrido antes de comenzar la intervención de tratamiento.

Las células precursoras mesenquimatosas usadas de acuerdo con la invención son, en orden de preferencia, autólogas, halogenéicas o xenogenéicas, y la elección puede depender en gran parte de la urgencia de la necesidad de tratamiento. Un paciente que presente una condición de inminente peligro de muerte puede mantenerse en una máquina de corazón/pulmón mientras se cultiva un número suficiente de MSCs autólogas, o se puede proporcionar tratamiento inicial usando MSCs que no sean autólogas.

La terapia con MSCs de la invención puede proporcionarse por varias vías de administración, incluyendo las siguientes. Primeramente, puede usarse inyección de músculo intracardiaco, que evita la necesidad de una intervención quirúrgica abierta, donde las MSCs están en una preparación en suspensión líquida inyectable o donde están en un medio biocompatible que es inyectable en forma líquida y se vuelve semisólido en el sitio del miocardio dañado. Puede usarse una jeringa intracardiaca convencional o un dispositivo de administración artroscópica controlable siempre que la luz o el diámetro interior de la aguja sean suficientes (por ejemplo, calibre 30 o mayor) para que las fuerzas de cizallamiento no ocasionen daño en las MSCs. Las preparaciones MSC en suspensión líquida inyectable pueden administrarse también por vía intravenosa, bien sea por goteo continuo o como un bolo. Durante intervenciones quirúrgicas abiertas, que implican acceso físico directo al corazón, todas las formas descritas de preparaciones de administración MSC constituyen opciones disponibles.

Como ejemplo representativo de un intervalo de dosificación se cita un volumen de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 \mul de suspensión inyectable conteniendo 10-40 x 10^{6} MSCs/ml. La concentración de células por unidad de volumen, tanto si el medio portador es líquido o sólido permanece sustancialmente dentro del mismo intervalo. La cantidad de MSCs administrada será usualmente mayor cuando se realiza una aplicación sólida, tipo "parche" durante una intervención abierta, pero la terapia de seguimiento por inyección será como la descrita anteriormente. Sin embargo, la frecuencia y duración de la terapia variarán dependiendo del grado (porcentaje) de tejido implicado, como ya se ha descrito (por ejemplo, 5-40% de masa ventricular izquierda).

En aquellos casos que tienen una implicación del orden del 5-10% del tejido, es posible tratarlos simplemente con una sola administración de un millón de MSCs en 20-50 \mul de preparación de inyección. El medio de inyección puede ser cualquier líquido isotónico farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos incluyen la solución salina tamponada con fosfato (PBS), medio de cultivo tal como DMEM (preferiblemente sin suero), solución salina fisiológica o dextrosa al 5% en agua (D5W).

En los casos que tienen un mayor nivel de gravedad que implica alrededor del 20% del tejido, se contempla múltiples inyecciones de 20-50 \mul (10-40 x 10^{6} MSCs/ml). La terapia de seguimiento puede implicar dosificaciones adicionales.

En casos muy graves, por ejemplo, de un nivel de gravedad que implica alrededor de un 40% del tejido, se indicarán múltiples dosis equivalentes para una duración más prolongada con dosis de mantenimiento a largo plazo (hasta varios meses) después del tratamiento operatorio.

La presente invención será ilustrada también por el siguiente ejemplo, aunque sin ser limitada por el mismo.

Ejemplo 1

Implante de MSCs en músculo cardiaco normal

Usando MSCs, es deseable mantener el contacto célula-célula in vivo para la conversión de las MSCs en el linaje del músculo. Señales ambientales anteriormente identificadas actúan de conformidad con el señalamiento mecánico y eléctrico in vivo para conducir a la diferenciación cardiaca.

Se introduce MSCs humanas primarias (hMSCs) en tejido de miocardio de rata atímica por inyección directa. La integración de las células implantadas, su diferenciación subsiguiente, formación de uniones con células cardiacas, y su supervivencia a largo plazo son caracterizadas con microscopia de luz, histología, microscopía de inmunofluorescencia confocal, microscopía electrónica e hibridación in situ.

Se examina también si las MSCs humanas son injertadas de forma apropiada en el músculo cardiaco de las ratas atímicas (cepa HSD:RH-RNU/RNU), a las que les falta las respuestas inmunes necesarias para destruir muchas células extrañas.

Se injerta MSCs de rata en los músculos cardiacos de las ratas. Para analizar las células inyectadas en el curso de varias semanas y minimizar la posibilidad de rechazo del sistema inmune, se recolecta MSCs de 344 ratas Fisher, la misma cepa endogámica (genotipo idéntico) que los receptores MSC a los que se destinan.

Se puede marcar las MSCs de diversos modos antes de su introducción en el receptor. Esto posibilita el rastreo de la suerte de las MSCs cuando proliferan y se diferencian en las semanas que siguen al implante de MSCs. Se utiliza varios métodos para identificar positivamente las células inyectadas: tintes lipidos de membrana PKH26 o CM-DI I y marcación genética con virus adeno-asociados (AAV), o retrovirus, tal como el virus de leucemia murina Maloney que expresa proteína fluorescente verde (GFP) o galactosidasa. Se usa también PCR para detectar el marcador del cromosoma Y de células machos implantadas en animales hembras. Las células marcadas con tinte son fácilmente detectadas y ofrecen el método más sencillo para seguir directamente las células inyectadas. Este método es fiable durante al menos 4 semanas. El día de la introducción en los animales receptores, las MSCs son tripsinizadas y marcadas con CM-DI I de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Molecular Probes). Se incuba cultivos monocapa subconfluentes de MSCs con 5 mM CM-DI I en medio exento de suero durante 20 minutos, se tripsinizan, se lavan dos veces en exceso de medio libre de tinte, y se utilizan para inyección.

Alternativamente, las MSCs son marcadas genéticamente antes de la inyección, por ejemplo, usando vector AAV-GFP. A este vector le falta un marcador seleccionable pero interviene en la expresión a alto nivel de los genes transducidos en una variedad de tipos de células post-mitoticas y precursoras. Se añade AAV-GFP recombinante a las monocapas de baja densidad de MSCs en poco contenido de suero. Al cabo de una incubación de cuatro horas a 37ºC se retira el sobrenadante y se reemplaza con producto fresco. A 96 horas después de la transducción, se ensaya las células para determinar la actividad de proteína fluorescente verde (GFP). Típicamente, un 50% de las células expresa el gen transducido. Se utiliza para inyección MSCs no seleccionadas en una línea clonal, aisladas por dilución limitadora. Las células son recolectadas después del tratamiento con tripsina, lavadas y usadas a altas concentraciones para inyección (10 a 100 millones de células por ml).

Para comprobar si las MSCs se convirtieron en cardiomiocitos en el entorno del corazón. Los corazones de ratas atímicas de diez semanas de edad fueron inyectados con MSCs humanas marcadas con tinte o marcadas con GFP. Todos los procedimientos fueron ejecutados bajo condiciones estériles estrictas. Los animales fueron colocados en un tarro de vidrio que contenía una esponja remojada con anestesia de metoxiflurano. En condiciones estériles, se ejecutó una toracotomía anterior de 20 mm, y después de la visualización del ventrículo izquierdo, se inyectaron 10 \mul de la suspensión de células, conteniendo de 10.000 a 100.000 MSCs en medio exento de suero dentro del ápice ventricular izquierdo usando una aguja del calibre 30. Se ejecutó la intervención rápidamente con intubación endotraqueal y asistencia de ventilación mecánica. Se cerró la incisión con suturas. Normalmente fue innecesaria asistencia de ventilación al cabo de un breve periodo después del cierre del pecho. La figura 1A muestra la imagen con poco aumento de un corazón de rata que fue inyectado con células marcadas con tinte, y posteriormente se realizó una incisión en T en el sitio apropiado para revelar las células inyectadas en la pared ventricular. La figura 1A es una foto global de la incisión del corazón. Las figuras 1B y 1C revelan las MSCs marcadas en la pared del ventrículo. La figura 1C muestra que las células estaban presentes en los 1-2 mm exteriores del músculo cardiaco de rata de 3 mm de grosor.

Cuando se sacrificaron, se extrajo el corazón, se examinó por microscopía de luz para determinar la presencia de trombos o émbolos vasculares, se incluyó en parafina, y se seccionó. Se examina la histología de secciones seriadas para determinar la suerte de las células teñidas con tinte. Luego se ensaya secciones para determinar los marcadores inmunohistoquímicos del músculo cardiaco en las áreas de las MSCs introducidas para averiguar si las MSCs donantes se han diferenciado en cardiomiocitos in vivo. Se lleva a cabo cirugías de implante en animales a sacrificar después de 1, 2, 4 y 6 semanas (cuatro animales cada vez) y los corazones que recibieron implantes son analizados tanto histológica como inmunológicamente.

Para la caracterización fenotípica, se extrae los corazones y se procesan para histología por microscopia de inmunofluorescencia. Se determina la diferenciación de las MSCs por la localización mediante inmunofluorescencia de la cadena pesada de miosina, sacomérica, SERCA1 y fosfolamban. Se usa el anticuerpo específico de secuencia para la unión intercelular de proteína conexina 43, que está comercialmente disponible (Zymed) y detecta las uniones intercelulares en el tejido cardiaco.

Se implanta también MSCs en materiales biomatriz para determinar si se observó injerto mejorado, tal como colágeno tipo I. Las MSCs se mezclan rápidamente con la matriz en un pequeño volumen y se inyectan en la pared del ventrículo. Se usa las biomatrices a concentraciones de 0,1 mg/ml o mayores. Por ejemplo, se puede usar las biomatrices a concentraciones de 1 a 3 mg/ml conteniendo de 10 a 100 millones de células/ml. Se analiza el tejido a los tiempos de 1, 2, 4 y 6 semanas como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 2

Regeneración de válvulas cardiacas usando MSCs

Se hace acelulares las válvulas xenoinjerto u homoinjerto por secado mediante congelación, lo que conduce a la muerte celular, o por tratamiento enzimático, seguido por la extracción con detergente de células y residuos de células. Este último enfoque fue realizado por Vesely y colaboradores con válvulas porcinas a repoblar con fibroblastos dérmicos o aórticos. Curtil y cols. 1997 usaron una válvula porcina secada por congelación e intentaron la repoblación de la válvula con fibroblastos humanos y células endoteliales. Estos estudios fueron preliminares y limitados a estudios a corto plazo in vitro.

La válvula acelular a poblar por MSCs autólogas se incuba con hMSCs expandidas en cultivo dentro de un recipiente de tambor para asegurar la carga de las células en todas las superficies de la válvula. Luego se cultiva la válvula con las hMSCs durante 1-2 semanas para permitir que las hMSCs se infiltren y efectúen la repoblación de la válvula. Dentro de la vasija de cultivo, la válvula se fija entonces a una bomba para permitir la actuación de las valvas de la válvula y simular el movimiento de bombeo presente en el cuerpo. Se mantiene la válvula en el modo de bombeo durante 1-2 semanas para permitir el remodelado celular asociado con los esfuerzos de la acción de bombeo. Una vez que se ha producido suficiente remodelado celular, la válvula se implanta en el cuerpo del paciente.

Otra realización de este aspecto de la invención es repoblar primeramente la válvula con hMSCs y después incubar el tejido de la válvula durante la etapa de bombeo con células autólogas de músculo liso aisladas de un injerto vascular que revestirá la luz de la válvula.

Claims

1. Utilización de células precursoras mesenquimatosas para fabricar una preparación farmacéutica para el tratamiento de un paciente que tiene el músculo cardiaco dañado con el fin de mejorar la función cardiaca.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que la preparación farmacéutica se administra directamente en el corazón.

3. Utilización según la reivindicación 2, en la que la preparación farmacéutica se administra por inyección.

4. Utilización según la reivindicación 3, en la que la preparación farmacéutica se administra en un vehículo líquido inyectable, farmacéuticamente aceptable.

5. Utilización según la reivindicación 2, en la que la preparación farmacéutica se administra durante una intervención quirúrgica abierta.

6. Utilización según la reivindicación 1, en la que la preparación farmacéutica se administra por vía sistémica.

7. Utilización según la reivindicación 6, en la que la preparación farmacéutica se administra por vía intravenosa.

8. Utilización según la reivindicación 1, en la que las células precursoras mesenquimatosas son autólogas para el paciente en curso de tratamiento.

9. Utilización según la reivindicación 1, en la que las células precursoras mesenquimatosas son alogenéicas para el paciente en curso de tratamiento.

10. Utilización según la reivindicación 1, en la que dichas células precursoras mesenquimatosas son células precursoras mesenquimatosas humanas.

11. Utilización según la reivindicación 10, en la que dichas células precursoras mesenquimatosas son células precursoras mesenquimatosas alogenéicas humanas.

12. Utilización según la reivindicación 1, en la que al menos una parte de las células precursoras mesenquimatosas han sido modificadas para contener material genético exógeno.

13. Utilización según la reivindicación 12, en la que el material genético exógeno codifica un producto de expresión seleccionado del grupo consistente en factores de crecimiento, factores miógenos, factores de transcripción, citocinas, genes de homeosecuencia, factores estimuladores de la angiogénesis, y factores mejoradores de la revasculariza-
ción.

14. Utilización de células precursoras mesenquimatosas para fabricar una preparación farmacéutica para el tratamiento de un paciente que padece insuficiencia cardiaca congestiva.

15. Utilización según la reivindicación 14, en la que la preparación farmacéutica se administra directamente en el corazón.

16. Utilización según la reivindicación 15, en la que la preparación farmacéutica se administra por inyección.

17. Utilización según la reivindicación 16, en la que la preparación farmacéutica se administra en un vehículo líquido inyectable, farmacéuticamente aceptable.

18. Utilización según la reivindicación 15, en la que la preparación farmacéutica se administra durante una intervención quirúrgica abierta.

19. Utilización según la reivindicación 14, en la que la preparación farmacéutica se administra por vía sistémica.

20. Utilización según la reivindicación 19, en la que la preparación farmacéutica se administra por vía intravenosa.

21. Utilización según la reivindicación 14, en la que las células precursoras mesenquimatosas son autólogas para el paciente en curso de tratamiento.

22. Utilización según la reivindicación 14, en la que las células precursoras mesenquimatosas son alogenéicas para el paciente en curso de tratamiento.

23. Utilización según la reivindicación 14, en la que las células precursoras mesenquimatosas son células precursoras mesenquimatosas humanas.

24. Utilización según la reivindicación 23, en la que las células precursoras mesenquimatosas son células precursoras mesenquimatosas alogenéicas humanas.

25. Utilización según la reivindicación 14, en la que al menos una parte de las células precursoras mesenquimatosas han sido modificadas para contener material genético exógeno.

26. Utilización según la reivindicación 25, en la que el material genético exógeno codifica un producto de expresión seleccionado del grupo consistente en factores de crecimiento, factores miógenos, factores de transcripción, citocinas, genes de homeosecuencia, factores estimuladores de la angiogénesis, y factores mejoradores de la revascularización.

27. Utilización de células precursoras mesenquimatosas autólogas o alogenéicas para fabricar una preparación farmacéutica para producir células del músculo cardiaco en el corazón de un individuo que las necesita.

28. Utilización según la reivindicación 27, en la que dicha preparación farmacéutica se administra a un individuo para regenerar o reparar el músculo cardiaco que ha sido dañado por la enfermedad.

29. Utilización según la reivindicación 28, en la que dicha preparación farmacéutica se administra a un individuo que ha sufrido un infarto de miocardio.

30. Utilización según la reivindicación 28, en la que dicha preparación farmacéutica se administra directamente en el corazón.

31. Utilización según la reivindicación 28, en la que dicha preparación farmacéutica se administra por vía sistémica.

32. Utilización según la reivindicación 31, en la que dicha preparación farmacéutica se administra por inyección.

33. Utilización según la reivindicación 28, en la que dichas células precursoras mesenquimatosas son humanas.

34. Utilización según la reivindicación 33, en la que dicha preparación farmacéutica se administra a un individuo que ha sufrido un infarto de miocardio.

35. Utilización según la reivindicación 34, en la que dicha preparación farmacéutica se administra directamente en el corazón.

36. Utilización según la reivindicación 34, en la que dicha preparación farmacéutica se administra por vía sistémica.

37. Utilización de células precursoras mesenquimatosas autólogas o alogenéicas para fabricar una preparación farmacéutica para reducir la formación de cicatrices en el tejido del corazón infartado.

38. Utilización según la reivindicación 37, en la que dicha preparación farmacéutica se administra por vía sistémica.

39. Utilización según la reivindicación 38, en la que dicha preparación farmacéutica se administra por inyección.

40. Utilización según la reivindicación 37, en la que dichas células precursoras mesenquimatosas son humanas.

41. Utilización según la reivindicación 40, en la que dicha preparación farmacéutica se administra directamente en el corazón.

42. Utilización según la reivindicación 40, en la que dicha preparación farmacéutica se administra por vía sistémica.

43. Utilización según la reivindicación 42, en la que dicha preparación farmacéutica se administra por inyección.