JP7105195B2 - 胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団とその製造方法、及び医薬組成物 - Google Patents

胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団とその製造方法、及び医薬組成物 Download PDF

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Description

本発明は、胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団に関する。本発明は、上記細胞集団の製造方法、並びに上記細胞集団を含む医薬組成物に関する。さらに本発明は、細胞集団における特定のマーカーを発現する間葉系幹細胞の比率を指標として利用する、間葉系幹細胞の増殖性のモニタリング方法、ドナー及び／又はドナーから採取した試料の評価方法、並びに酵素処理条件の確認及び／又は予測方法にも関する。
間葉系間質細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ）ともよばれる間葉系幹細胞は、骨髄などに存在することが報告されている体性幹細胞であり、骨、軟骨及び脂肪などに分化する能力を有する。間葉系幹細胞は、細胞治療における有望な細胞ソースとして注目され、最近では、胎盤、臍帯、卵膜などの胎児付属物にも存在することが明らかになっている。
間葉系幹細胞は、分化能以外に免疫抑制能を有することで注目されており、骨髄間葉系幹細胞を用いた、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、及び炎症性腸疾患であるクローン病に対する実用化が進んでいる。間葉系幹細胞として種々の細胞が知られており、なかでも、羊膜間葉系幹細胞は免疫抑制効果が高く、また細胞ソースである羊膜が非侵襲的に採取可能であることから、様々な免疫関連疾患を対象とした細胞治療への応用が期待されている（特許文献１）。
特許文献１には、羊膜間葉系細胞組成物の製造方法及び凍結保存方法、並びに治療剤について記載されている。特に、ジメチルスルホキシドを５～１０質量％含有し、ヒドロキシルエチルデンプンを５～１０質量％またはデキストランを１～５質量％含有する溶液中に羊膜間葉系細胞を含む混合物を凍結保存することによって、凍結保存された羊膜間葉系細胞を移植に至適化した細胞製剤として製造できることが記載されている。また、特許文献２には、（Ｄ）哺乳動物の羊膜から間葉系細胞の細胞集団を採取するステップと、（Ｅ）前記採取された細胞集団を４００～３５０００／ｃｍ2の細胞濃度において播種し、２～３日間初期培養するステップと、（Ｆ）前記初期培養の１／５０００以上１／１０未満の細胞濃度において播種し、１週間に２回の培地交換を行う継代培養を３～４回繰り返すステップと、（Ｇ）前記継代培養において紡錘状の形態を有する細胞のコロニーが形成されたとき、細胞がコンフルエントになるまで同一の培養皿で培養を維持するステップとを含む、羊膜間葉系幹細胞集団を調製する方法が記載されている。
特開２０１５－６１５２０号公報 国際公開ＷＯ２０１３／０７７４２８号公報
本発明者らの予備的な検討において、羊膜間葉系幹細胞は増殖性が低く、また継代を３回重ねると、それ以降はほとんど増殖せず、継代数や倍加回数が延びないことを確認した。そのため、細胞製剤化に必要な細胞を大量かつ迅速に調製・製造することは必ずしも容易ではないことが分かった。特許文献１には、羊膜間葉系細胞を含む混合物を、特定の凍結保存液にて凍結保存することにより、解凍後の羊膜間葉系細胞の生存率減少を抑制し、凍結保存された羊膜間葉系細胞を移植に至適化した細胞製剤として製造できることは記載されている。しかしながら、間葉系幹細胞の中から特定の優れた特長を有する間葉系幹細胞を選択的に調製すること、具体的には、細胞製剤を大量かつ迅速に製造するために有用な増殖性が高い間葉系幹細胞を多く含む細胞集団を、間葉系幹細胞の特性を指標として選択的に調整することについては、一切記載されていない。また、特許文献２には、低密度で細胞を播種することによって、高い増殖能と分化能を有する間葉系幹細胞集団を調製しているものの、間葉系幹細胞集団に含まれる間葉系幹細胞の特性を指標として、高増殖性を維持して培養する方法、並びに、前記間葉系幹細胞の特性を有し、且つ、増殖性が高い間葉系幹細胞を多く含む細胞集団については記載も示唆もない。
本発明は、細胞製剤を大量かつ迅速に製造するために有用な、増殖性が高い間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、上記間葉系幹細胞を含む細胞集団、その製造方法、並びに上記細胞集団を含む医薬組成物を提供することを課題とする。さらに本発明は、間葉系幹細胞を含む細胞集団に関する指標を利用して、間葉系幹細胞の増殖性のモニタリング方法、ドナー及び／又はドナーから採取した試料の評価方法、並びに最適な酵素処理条件の判断及び／又は予測方法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、胎児付属物から採取した細胞を含む細胞集団においてＣＤ１０５+を呈する間葉系幹細胞の比率が所定値以上であり、ＣＤ２００+を呈する間葉系幹細胞の比率とＣＤ１０６+を呈する間葉系幹細胞の比率がそれぞれ所定値未満に維持する条件下において培養すると、常に高い増殖性を示す間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得できることを見出した。さらに本発明者らは、胎児付属物から採取した間葉系幹細胞を含む細胞集団においてＣＤ１０５+を呈する間葉系幹細胞の比率が所定値以上であり、ＣＤ２００+を呈する間葉系幹細胞の比率とＣＤ１０６+を呈する間葉系幹細胞の比率がそれぞれ所定値未満であることを指標として利用することによって、間葉系幹細胞の増殖性をモニタリングでき、増殖性の高い間葉系幹細胞を効率的に取得するという観点から、ドナー及び／又はドナーから採取した試料の品質を評価でき、さらに、ドナーから採取した試料の最適な酵素処理条件を判断及び／又は予測できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
（１） 胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団であって、
前記細胞集団において、ＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上であり、ＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満であり、ＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満である、前記細胞集団。
（２） 前記細胞集団において、少なくともＣＤ１４+を呈する前記間葉系幹細胞を含む、（１）に記載の細胞集団。
（３） 前記細胞集団において、ＣＤ１４+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％以上である、（２）に記載の細胞集団。
（４） 前記間葉系幹細胞が、生体外での培養開始後４０日以降まで増殖停止することなく培養することが可能である、（１）から（３）の何れか一に記載の細胞集団。
（４－１） 前記間葉系幹細胞が、生体外での培養開始後７０日以降まで増殖停止することなく培養することが可能である、（１）から（４）の何れか一に記載の細胞集団。
（５） 前記間葉系幹細胞が、生体外での培養開始後、倍加回数が１０回以上になるまで培養することが可能である、（１）から（４）及び（４－１）の何れか一に記載の細胞集団。
（５－１） 前記間葉系幹細胞が、生体外での培養開始後、倍加回数が３０回以上になるまで培養することが可能である、（１）から（４）、（４－１）及び（５）の何れか一に記載の細胞集団。
（６） 前記間葉系幹細胞の倍加時間が２日以下である（１）から（４）、（４－１）、（５）及び（５－１）の何れか一に記載の細胞集団。
（７） （１）から（４）、（４－１）、（５）、（５－１）及び（６）の何れか一に記載の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
（８） 胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、
胎児付属物から採取した細胞を含む細胞集団を、前記細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上、前記細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満、前記細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満に維持する条件下において培養する工程を含む、前記細胞集団の製造方法。
（９） 前記胎児付属物から採取した細胞を含む細胞集団が、胎児付属物から採取した上皮細胞層と間葉系幹細胞層とを含む試料を少なくともコラゲナーゼで処理して得た細胞集団である、（８）に記載の細胞集団の製造方法。
（１０） 上記胎児付属物から採取した細胞を含む細胞集団を、４００～５，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種し、培養することを複数回繰り返す工程を含む、（８）又は（９）に記載の細胞集団の製造方法。
（１１） 上記培養期間が、４～１０日間である、（１０）に記載の細胞集団の製造方法。
（１２） 胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団において、
ＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率、ＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率及びＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上、前記細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満、前記細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満であることを指標として間葉系幹細胞の増殖性をモニタリングする方法。
（１２－１） 前記細胞集団において、さらにＣＤ１４+を呈する前記間葉系幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるＣＤ１４+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％以上であることを指標として間葉系幹細胞の増殖性をモニタリングする、（１２）に記載の方法。
（１３） ドナーから胎児付属物由来の間葉系幹細胞を含む細胞集団を採取し、ＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率、ＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率及びＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上、前記細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満、前記細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満であることを指標として評価する、ドナー及び／又はドナーから採取した試料の評価方法。
（１３－１） 前記細胞集団において、さらにＣＤ１４+を呈する前記間葉系幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるＣＤ１４+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％以上であることを指標として評価する、（１３）に記載のドナー及び／又はドナーから採取した試料の評価方法。
（１４） ドナーから採取した試料を酵素処理して得られた細胞集団に対して、ＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率、ＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率及びＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上、前記細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満、前記細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満であることを指標として評価する、前記試料の最適な酵素処理条件を判断及び／又は予測する方法。
（１４－１） 前記細胞集団において、さらにＣＤ１４+を呈する前記間葉系幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるＣＤ１４+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％以上であることを指標として評価する、（１４）に記載の前記試料の最適な酵素処理条件を判断及び／又は予測する方法。
本発明によれば、増殖性が高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を得ることができる。また、本発明によれば、増殖性の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団形成の指標として、各種表面抗原の陽性率を使用することができる。これにより細胞製剤（医薬組成物）を大量かつ迅速に製造することができる。本発明によれば、細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する間葉系幹細胞の比率が５０％以上であり、細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する間葉系幹細胞の比率が１０％未満であり、細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する間葉系幹細胞の比率が５％未満であることを指標とすることによって、間葉系幹細胞の増殖性をモニタリングすることができる。特に、前記指標を経時的に測定することで、間葉系幹細胞の増殖性の変化を迅速に把握し、予測することができる。さらに本発明によれば、前記の指標を利用することによって、ドナー自体及び／又はドナーから採取した試料の品質を評価することができる。さらに本発明によれば、前記指標を使用することによって、ドナーから採取した試料を酵素処理する際の酵素処理方法が、最適かどうかを判断及び／又は予測することができる。
図１は、羊膜ＭＳＣを継代培養（通常培養）した時の細胞の写真を示す。 図２は、継代培養(通常培養)によって得られた継代毎の羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５）の陽性率を解析した結果を示す。 図３は、本発明による培養において７継代目の羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、ＣＤ１０６、ＣＤ２００、ＣＤ１４）の陽性率を解析した結果を示す。 図４は、本発明による培養において９継代目の羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、ＣＤ１０６、ＣＤ２００、ＣＤ１４）の陽性率を解析した結果を示す。 図５は、本発明による培養において１１継代目の羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、ＣＤ１０６、ＣＤ２００、ＣＤ１４）の陽性率を解析した結果を示す。 図６は、羊膜ＭＳＣを通常培養と本発明による培養によってそれぞれ培養した時の羊膜ＭＳＣの増殖曲線を示す。 図７は、羊膜ＭＳＣを本発明による培養によって継代培養した時の細胞の写真を示す。 図８は、本発明による培養において２、４、６、８及び１０継代目の羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、ＣＤ１０６、ＣＤ２００）の陽性率を解析した結果を示す。 図９は、図８で取得した羊膜ＭＳＣの増殖曲線を示す。 図１０は、本発明による培養で得られた羊膜ＭＳＣの免疫調節作用を検討した結果を示す。 図１１は、羊膜ＭＳＣを、本発明の方法で酵素処理した時の増殖曲線を示す。 図１２は、本発明による酵素処理後、国際公開ＷＯ２０１３／０７７４２８号公報の請求項７に記載の方法による培養において９継代目の羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ４５、ＣＤ３２６、ＣＤ１４、ＳＳＥＡ－４）の陽性率を解析した結果を示す。 図１３は、異なるドナーから得られた羊膜ＭＳＣ（＃４及び＃５）を本発明の培養によって継代培養した時の６継代目の羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメトリーを用いて各種表面抗原（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、ＣＤ１０６、ＣＤ２００）の陽性率を解析した結果を示す。 図１４は、ドナーの異なる羊膜ＭＳＣ＃４及び＃５を本発明による培養によってそれぞれ培養したときの羊膜ＭＳＣの増殖曲線を示す。
以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、下記の説明は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が下記の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も本発明の範囲に含まれる。
［１］用語の説明
本明細書における「胎児付属物」は、卵膜、胎盤、臍帯及び羊水を指す。さらに「卵膜」は、胎児の羊水を含む胎嚢であり、内側から羊膜、絨毛膜及び脱落膜からなる。このうち、羊膜と絨毛膜は胎児を起源とする。「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜を指す。羊膜の内層（上皮細胞層ともよばれる）は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌し、羊膜の外層（細胞外基質層ともよばれ、間質に相当する）は間葉系幹細胞を含む。
本明細書における「間葉系幹細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ)」は、下記の定義を満たす幹細胞を指し、「間葉系間質細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ)」と区別なく用いられる。本明細書において、「間葉系幹細胞」は「ＭＳＣ」と記載されることがある。
間葉系幹細胞の定義
i)標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。
ii)表面抗原ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａｌｐｈａ、ＣＤ１９、ＨＬＡ－ＤＲが陰性。
本明細書における「羊膜間葉系幹細胞」は、羊膜に由来する間葉系幹細胞を指し、「羊膜間葉系間質細胞」と区別なく用いられる。本明細書において、「羊膜間葉系幹細胞」は「羊膜ＭＳＣ」と記載されることがある。
本明細書における「間葉系幹細胞集団」は、間葉系幹細胞を含む細胞集団を意味し、その形態は特に限定されず、例えば、細胞ペレット、細胞凝集塊、細胞浮遊液又は細胞懸濁液などが挙げられる。
本明細書における「増殖能」とは、細胞が細胞分裂を行うことにより、細胞数が増加する能力のことをいう。本発明において、「増殖能が高い」は「増殖性が高い」と区別無く用いることができる。羊膜間葉系幹細胞集団における羊膜間葉系幹細胞（羊膜ＭＳＣ）の増殖能は、培養１バッチあたりの取得細胞数、増殖速度、倍加回数、倍加時間及び／又は継代回数を用いて評価することができる。
本明細書における「細胞集団における、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+、ＣＤ１０６+、ＣＤ１４+、ＣＤ７３+、ＣＤ９０+、及びＣＤ４５+から選択される表面抗原を呈する間葉系幹細胞の比率」とは、後記する実施例に記載の通り、フローサイトメトリーによって解析した上記表面抗原について陽性である細胞の比率を示す。本明細書において、「表面抗原について陽性である細胞の比率」は「陽性率」と記載されることがある。
［２］胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団
本発明により提供される胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団は、前記細胞集団において、ＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上であり、ＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満であり、ＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満であることを特徴とする。
また、本発明により提供される胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団が、ＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上であり、ＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満であり、ＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満の条件を満たすと、増殖性の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を形成する。そのため、本発明においては、前記条件を増殖性の高い又は高い増殖能を有する間葉系幹細胞を含む細胞集団形成の指標とすることができる。また、前記指標を経時的に測定することで、間葉系幹細胞の増殖性の変化を迅速に把握し、予測することができる。さらに本発明によれば、前記の指標を利用することによって、ドナー自体及び／又はドナーから採取した試料の品質を評価することができる。さらに本発明によれば、前記指標を使用することによって、ドナーから採取した試料を酵素処理する際の酵素処理方法が、最適かどうかを判断及び／又は予測することができる。
前記細胞集団において、ＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率は、好ましくは５５％以上であり、さらに好ましくは６０％以上であり、さらに好ましくは６５％以上であり、さらに好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは７５％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９６％以上であり、さらに好ましくは９７％以上であり、さらに好ましくは９８％以上である。
前記細胞集団において、ＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率は、好ましくは９％以下であり、さらに好ましくは８％以下であり、さらに好ましくは７％以下であり、さらに好ましくは６％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは４％以下である。
前記細胞集団において、ＣＤ１０６+を呈する間葉系幹細胞の比率は、好ましくは４％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは２％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、さらに好ましくは０％である。
本発明の細胞集団は、好ましくは、少なくともＣＤ１４+を呈する間葉系幹細胞を含んでいてもよい。本発明の細胞集団が、ＣＤ１４+を呈する間葉系幹細胞を含む場合、前記細胞集団において、ＣＤ１４+を呈する前記間葉系幹細胞の比率は、好ましくは５％以上であり、さらに好ましくは６％以上であり、さらに好ましくは７％以上であり、さらに好ましくは８％以上である。
前記細胞集団において、ＣＤ７３+を呈する間葉系幹細胞の比率は、好ましくは５５％以上であり、さらに好ましくは６０％以上であり、さらに好ましくは６５％以上であり、さらに好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは７５％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９６％以上であり、さらに好ましくは９７％以上であり、さらに好ましくは９８％以上であり、さらに好ましくは９９％以上である。
前記細胞集団において、ＣＤ９０+を呈する間葉系幹細胞の比率は、好ましくは５５％以上であり、さらに好ましくは６０％以上であり、さらに好ましくは６５％以上であり、さらに好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは７５％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９６％以上であり、さらに好ましくは９７％以上であり、さらに好ましくは９８％以上であり、さらに好ましくは９９％以上であり、さらに好ましくは１００％である。
前記細胞集団において、ＣＤ４５+を呈する間葉系幹細胞の比率は、好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは９％以下であり、さらに好ましくは８％以下であり、さらに好ましくは７％以下であり、さらに好ましくは６％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは４％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは２％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、さらに好ましくは０％である。
本発明において、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+、ＣＤ１０６+、ＣＤ１４+、ＣＤ７３+、ＣＤ９０+、及びＣＤ４５+とはそれぞれ、ＣＤ１０５、ＣＤ２００、ＣＤ１０６、ＣＤ１４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ４５の発現が陽性であることを意味し、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+、ＣＤ１０６+、ＣＤ１４+、ＣＤ７３+、ＣＤ９０+、又はＣＤ４５+を呈するとは、上記の各発現マーカーの発現が陽性であることが示されることを意味する。
発現マーカー（ＣＤ１０５、ＣＤ２００、ＣＤ１０６、ＣＤ１４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ４５）は、当該技術分野において公知の任意の検出方法により検出することができる。発現マーカーを検出する方法としては、例えばフローサイトメトリー又は細胞染色が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーにおいて、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞染色において、着色するか若しくは蛍光を発する細胞が顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。細胞染色は、抗体を使用する免疫細胞染色であってもよく、抗体を使用しない非免疫細胞染色であってもよい。
本発明の細胞集団においては、間葉系幹細胞は、生体外での培養開始後、好ましくは４０日以降まで、さらに好ましくは４５日以降まで、５０日以降まで、５５日以降まで、６０日以降まで、６５日以降まで、７０日以降まで、７５日以降まで、８０日以降まで、８５日以降まで、９０日以降まで、９５日以降まで、１００日以降まで、１０５日以降まで、又は１１０日以降まで、増殖停止することなく培養することが可能である。
本発明の細胞集団においては、間葉系幹細胞は、生体外での培養開始後、倍加回数が好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１５回以上、２０回以上、２５回以上、３０回以上、３５回以上、４０回以上、４５回以上、又は５０回以上になるまで培養することが可能である。
倍加回数とは、ある一定の培養期間において細胞が分裂した回数であり、[ｌｏｇ10（培養終了時の細胞数）－ｌｏｇ10（培養開始時の細胞数）]／ｌｏｇ10（２）の計算式にて算出される。継代を行った場合は、各継代数毎の倍加回数を上記の式で計算した後、累積することによって、総倍加回数が算出される。
本発明の細胞集団における間葉系幹細胞の継代可能回数は、１回以上、好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上、さらに好ましくは６回以上、さらに好ましくは７回以上、さらに好ましくは８回以上、さらに好ましくは９回以上、さらに好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１１回以上、さらに好ましくは１２回以上、さらに好ましくは１３回以上、さらに好ましくは１４回以上、さらに好ましくは１５回以上、さらに好ましくは１６回以上、さらに好ましくは１７回以上、さらに好ましくは１８回以上、さらに好ましくは１９回以上、さらに好ましくは２０回以上、さらに好ましくは２５回以上である。また、継代可能回数の上限は、特に限定されないが、例えば、５０回以下、４５回以下、４０回以下、３５回以下又は３０回以下である。
本発明の細胞集団における倍加時間は、細胞の倍加に必要な日数又は時間であり、培養日数又は時間を倍加回数で除することにより算出される。例えば６継代目における倍加時間は、６継代目の細胞を播種してから回収するまでの日数を、６継代目の細胞を播種してから回収するまでの倍加回数で除することによって算出される。１継代あたりの倍加時間を継代毎に算出することにより、細胞の増殖速度の経時変化を評価することができる。本明細書においては倍加時間としては２日以下、好ましくは１．９日以下、より好ましくは１．８日以下、さらに好ましくは１．７日以下、さらに好ましくは１．６日以下、さらに好ましくは１．５日以下、さらに好ましくは１．４日以下、さらに好ましくは１．３日以下、さらに好ましくは１．２日以下、さらに好ましくは１．１日以下、さらに好ましくは１日以下である。
本発明の間葉系幹細胞集団は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。上記の間葉系幹細胞集団は、間葉系幹細胞以外に、任意の成分を含んでもよい。かかる成分としては、例えば、塩類、多糖類（例えば、ＨＥＳ、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ＤＭＳＯ、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
［３］間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法
本発明による胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、胎児付属物から採取した細胞を含む細胞集団を、前記細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上、前記細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満、前記細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満に維持する条件下において培養する工程を含む方法である。
前記条件は、増殖性の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団形成の指標であり、本発明の培養方法は、前記指標を満たせば特に制限されない。
本発明の製造方法は、羊膜などの胎児付属物を酵素処理することにより、間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得する細胞集団取得工程を含むものでもよい。
羊膜は、上皮細胞層と細胞外基質層からなり、後者には羊膜ＭＳＣが含まれている。羊膜上皮細胞は、他の上皮細胞同様、特徴として上皮カドヘリン（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ：ＣＤ３２４）及び上皮接着因子（ＥｐＣＡＭ：ＣＤ３２６）を発現しているのに対し、羊膜ＭＳＣはこれら上皮特異的表面抗原マーカーを発現しておらず、フローサイトメトリーで容易に区別可能である。上記の細胞集団取得工程は、羊膜を帝王切開により得る工程を含む工程でもよい。
本発明における胎児付属物から採取した細胞を含む細胞集団は、好ましくは胎児付属物から採取した上皮細胞層と間葉系幹細胞層とを含む試料を少なくともコラゲナーゼで処理して得た細胞集団である。
胎児付属物から採取した試料（好ましくは上皮細胞層と間葉系幹細胞層とを含む試料）の酵素処理は、好ましくは、胎児付属物の細胞外基質層に含まれる間葉系幹細胞を遊離することができ、かつ上皮細胞層を分解しない酵素（又はその組み合わせ）による処理である。かかる酵素としては、特に限定されないが、例えば、コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼを挙げることができる。金属プロテイナーゼとしては、非極性アミノ酸のＮ末端側を切断する金属プロテイナーゼであるサーモリシン及び／又はディスパーゼを挙げることができるが、特に限定されない。
コラゲナーゼの活性濃度は、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは４００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、コラゲナーゼの活性濃度は、特に限定されないが、例えば、１０００ＰＵ／ｍｌ以下、９００ＰＵ／ｍｌ以下、８００ＰＵ／ｍｌ以下、７００ＰＵ／ｍｌ以下、６００ＰＵ／ｍｌ以下、５００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｕｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、ＦＩＴＣ－ｃｏｌｌａｇｅｎ １ｕｇを１分間で分解する酵素量と定義する。
金属プロテイナーゼ（例えば、サーモリシン及び／又はディスパーゼ）の活性濃度は、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは４００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、金属プロテイナーゼの活性濃度は、好ましくは１０００ＰＵ／ｍｌ以下、より好ましくは９００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは８００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは７００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは６００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは５００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、金属プロテイナーゼとしてディスパーゼを用いた態様において、ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｕｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、乳酸カゼインから１分間に１ｕｇのチロシンに相当するアミノ酸を遊離する酵素量と定義される。上記の酵素濃度の範囲において、胎児付属物の上皮細胞層に含まれる上皮細胞の混入を防止しながら、細胞外基質層に含まれる間葉系幹細胞を効率よく遊離させることができる。コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼの好ましい濃度の組み合わせは、酵素処理後の胎児付属物の顕微鏡観察や、取得した細胞のフローサイトメトリーにより決定することができる。
生細胞を効率的に回収する観点から、コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを組み合わせて胎児付属物を処理することが好ましい。さらに好ましくは、前記組み合わせによって胎児付属物を同時一括に処理する。この場合の金属プロテイナーゼとしては、サーモリシン及び／又はディスパーゼを使用することができるが、これらに限定されない。コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを含有する酵素液を用いて胎児付属物を一回のみ処理することにより、間葉系幹細胞を簡便に取得することができる。また、同時一括に処理することにより、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクを低減することができる。
胎児付属物の酵素処理は、生理食塩水やハンクス平衡塩溶液等の洗浄液を用いて洗浄した羊膜を酵素液に浸漬し、撹拌手段によって撹拌しながら処理することが好ましい。かかる撹拌手段としては、胎児付属物の細胞外基質層に含まれる間葉系幹細胞を効率よく遊離させる観点から、例えば、スターラー又はシェーカーを使用することができるが、これらに限定されない。撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、５ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、２０ｒｐｍ以上、３０ｒｐｍ以上、４０ｒｐｍ以上又は５０ｒｐｍ以上である。また、撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、１００ｒｐｍ以下、９０ｒｐｍ以下、８０ｒｐｍ以下、７０ｒｐｍ以下又は６０ｒｐｍ以下である。酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、１０分以上、２０分以上、３０分以上、４０分以上、５０分以上、６０分以上、７０分以上、８０分以上又は９０分以上である。また、酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、６時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、２時間以下、１１０分以下、１００分以下である。酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、１５℃以上、１６℃以上、１７℃以上、１８℃以上、１９℃以上、２０℃以上、２１℃以上、２２℃以上、２３℃以上、２４℃以上、２５℃以上、２６℃以上、２７℃以上、２８℃以上、２９℃以上、３０℃以上、３１℃以上、３２℃以上、３３℃以上、３４℃以上、３５℃以上又は３６℃以上である。また、酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、４０℃以下、３９℃以下、３８℃以下又は３７℃以下である。
本発明の製造方法において、所望により、遊離した間葉系幹細胞を含む酵素溶液からフィルター、遠心分離や中空糸分離膜、セルソーター等の公知の方法により遊離した間葉系幹細胞を分離及び／又は回収することができる。好ましくは、フィルターによって遊離した間葉系幹細胞を含む酵素溶液を濾過する。前記酵素溶液をフィルターによって濾過する態様においては、遊離した細胞のみがフィルターを通過し、分解されなかった上皮細胞層はフィルターを通過できずにフィルター上に残るため、遊離した間葉系幹細胞を容易に分離及び／又は回収することができるだけでなく、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクも低減することができる。フィルターとしては、特に限定されないが、例えば、メッシュフィルターを挙げることができる。メッシュフィルターのポアサイズ（メッシュの大きさ）は、特に限定されないが、例えば、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、又は９０μｍ以上である。また、メッシュフィルターのポアサイズは、特に限定されないが、例えば、２００μｍ以下、１９０μｍ以下、１８０μｍ以下、１７０μｍ以下、１６０μｍ以下、１５０μｍ以下、１４０μｍ以下、１３０μｍ以下、１２０μｍ以下、１１０μｍ以下、又は１００μｍ以下である。濾過速度に関しては特に限定されないが、メッシュフィルターのポアサイズを上記の範囲とすることにより、間葉系幹細胞を含む酵素溶液を自然落下により濾過することができ、これにより細胞生存率の低下を防止することができる。
メッシュフィルターの材質としては、ナイロンが好ましく用いられる。研究用として汎用されるＦａｌｃｏｎセルストレーナーなどの４０μｍ、７０μｍ、９５μｍ又は１００μｍのナイロンメッシュフィルターを含有するチューブが利用可能である。また、血液透析などで使用されている医療用メッシュクロス（ナイロン及びポリエステル）が利用できる。さらに、体外循環時に使用される動脈フィルター（ポリエステルメッシュフィルター、ポアサイズ：４０μｍ以上１２０μｍ以下）も利用可能である。他の材質、例えば、ステンレスメッシュフィルター等も用いることが可能である。
間葉系幹細胞をフィルター通過させる場合、自然落下（自由落下）が好ましい。ポンプ等を用いた吸引など強制的なフィルター通過も可能であるが、細胞に損傷を与えることを避けるため、できるだけ弱い圧力とすることが望ましい。
フィルターを通した間葉系幹細胞は、倍量又はそれ以上の培地又は平衡塩緩衝液で濾液を希釈した後、遠心分離により回収することができる。平衡塩緩衝液としては、ダルベッコリン酸バッファー（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸バッファー（ＰＢＳ）等を用いることができるが、これらに限定されない。
上記の細胞集団取得工程で得られた細胞集団は、前記細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上、前記細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満、前記細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満に維持する条件下において培養する。前記条件は、増殖性の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得する際の指標として有用である。培養方法としては、前記指標を満たすものであれば、特に限定されない。そのような方法としては、例えば、胎児付属物から採取した細胞を含む細胞集団を、４００～５，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種し、培養することを複数回繰り返す工程を挙げることができる。細胞集団を播種する際の密度はさらに好ましくは５００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは６００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは７００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは８００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは９００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは１０００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは１１００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは１２００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは１３００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは１４００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは１５００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは１６００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは１７００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは１８００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは１９００細胞／ｃｍ2以上であり、さらに好ましくは２０００細胞／ｃｍ2以上である。細胞集団を播種する際の密度はさらに好ましくは４８００細胞／ｃｍ2以下であり、さらに好ましくは４６００細胞／ｃｍ2以下であり、さらに好ましくは４４００細胞／ｃｍ2以下であり、さらに好ましくは４２００細胞／ｃｍ2以下であり、さらに好ましくは４０００細胞／ｃｍ2以下であり、さらに好ましくは３８００細胞／ｃｍ2以下であり、さらに好ましくは３６００細胞／ｃｍ2以下であり、さらに好ましくは３４００細胞／ｃｍ2以下であり、さらに好ましくは３２００細胞／ｃｍ2以下であり、さらに好ましくは３０００細胞／ｃｍ2以下であり、さらに好ましくは２８００細胞／ｃｍ2以下であり、さらに好ましくは２６００細胞／ｃｍ2以下であり、さらに好ましくは２４００細胞／ｃｍ2以下であり、さらに好ましくは２２００細胞／ｃｍ2以下である。
上記の１回の培養の培養期間としては、例えば４～１０日間を挙げることができ、より具体的には、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間又は１０日間を挙げることができる。
上記の培養に用いる培地は、任意の動物細胞培養用液体培地を基礎培地とし、必要に応じて他の成分（血清、血清代替試薬、増殖因子など）を適宜添加することにより調製することができる。なお、前記基礎培地に増殖因子を添加する態様においては、増殖因子を培地中で安定化させるための試薬（ヘパリンなど）を、増殖因子に加えて、さらに添加することにより調製してもよいし、増殖因子をあらかじめゲルや多糖類などで安定化しておき、その後、安定化した増殖因子を前記基礎培地に対して添加することで調製してもよい。
基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２ Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。
他の成分としては例えば、アルブミン、血清、血清代替試薬又は増殖因子などが挙げられる。アルブミンの場合、０．０５％より多く５％以下の濃度が好ましい。血清の場合、５％以上の濃度が好ましい。
また、上記の培養に用いる培地は、一般的に市販されている無血清培地を用いても良い。例えば、ＳＴＫ１やＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメディカル社）、ＥＸＰＲＥＰ ＭＳＣ Ｍｅｄｉｕｍ（バイオミメティクスシンパシーズ社）、Ｃｏｒｎｉｎｇ ｓｔｅｍｇｒo ヒト間葉系幹細胞培地（コーニング社）などが挙げられるが、特に限定されない。
間葉系幹細胞の培養は、例えば、以下のような工程にて行うことができる。まず、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。次に、プラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上５％以下のＣＯ2濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、例えば、αＭＥＭ、Ｍ１９９、或いはこれらを基礎とする培地を挙げることができるが、これらに限定されない。上記のような培養により取得した細胞は、１回培養した細胞である。
上記の１回培養した細胞は、例えば、以下のようにさらに継代し、培養することができる。まず、１回培養した細胞を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）にて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させる。次に、得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。最後に、プラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上、５％以下のＣＯ2濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、例えば、αＭＥＭ、Ｍ１９９、或いはこれらを基礎とする培地を挙げることができるが、これらに限定されない。上記のような継代及び培養により取得した細胞は、１回継代した細胞である。同様の継代及び培養を行うことにより、Ｎ回継代した細胞を取得することができる（Ｎは１以上の整数を示す）。継代回数Ｎの下限は、細胞を大量に製造する観点から、例えば、１回以上、好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上、さらに好ましくは６回以上、さらに好ましくは７回以上、さらに好ましくは８回以上、さらに好ましくは９回以上、さらに好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１１回以上、さらに好ましくは１２回以上、さらに好ましくは１３回以上、さらに好ましくは１４回以上、さらに好ましくは１５回以上、さらに好ましくは１６回以上、さらに好ましくは１７回以上、さらに好ましくは１８回以上、さらに好ましくは１９回以上、さらに好ましくは２０回以上、さらに好ましくは２５回以上である。また、継代回数Ｎの上限は、細胞の老化を抑える観点から、例えば、５０回以下、４５回以下、４０回以下、３５回以下、３０回以下であることが好ましい。
本発明の製造方法によれば、増殖能が高い間葉系幹細胞を得ることができ、これにより細胞製剤（医薬組成物）を大量かつ迅速に製造することができる。培養１バッチあたりの取得細胞数（単位表面積あたり、単位培養日数あたりの得られる細胞数）の下限は、播種細胞数、播種密度等によって異なるが、例えば、１．０×１０5（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以上、２．０×１０5（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以上、３．０×１０5（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以上、４．０×１０5（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以上、５．０×１０5（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以上、６．０×１０5（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以上、７．０×１０5（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以上、８．０×１０5（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以上、９．０×１０5（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以上又は１０．０×１０5（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以上である。また、培養１バッチあたりの取得細胞数の上限は、特に限定されないが、例えば、１０．０×１０8（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以下、９．０×１０8（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以下、８．０×１０8（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以下、７．０×１０8（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以下、６．０×１０8（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以下、５．０×１０8（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以下、４．０×１０8（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以下、３．０×１０8（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以下、２．０×１０8（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以下又は１．０×１０8（個／ｃｍ2／ｄａｙ）以下である。
本発明の製造方法によれば、増殖能が高い間葉系幹細胞を得ることができる。これにより、本発明の製造方法によって得られる間葉系幹細胞は、生体外での培養開始後、好ましくは４０日以降まで、さらに好ましくは４５日以降まで、５０日以降まで、５５日以降まで、６０日以降まで、６５日以降まで、７０日以降まで、７５日以降まで、８０日以降まで、８５日以降まで、９０日以降まで、９５日以降まで、１００日以降まで、１０５日以降まで、又は１１０日以降まで、増殖停止することなく培養することが可能である。
また、本発明の製造方法によって得られる間葉系幹細胞は、生体外での培養開始後、倍加回数が好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１５回以上、２０回以上、２５回以上、３０回以上、３５回以上、４０回以上、４５回以上、又は５０回以上になるまで培養することが可能である。
本発明の製造方法は、間葉系幹細胞を含む細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上、前記細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満、前記細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満であることを指標として、増殖性の高い間葉系幹細胞を含む集団を識別する識別工程を含むものでもよい。
また、本発明の製造方法は、前記間葉系幹細胞を含む細胞集団を凍結保存する工程を含むことができる。前記細胞集団を凍結保存する工程を含む態様においては、前記細胞集団を解凍後、必要に応じて前記細胞集団を分離、回収及び／又は培養してもよい。また、前記細胞集団を解凍後、そのまま使用してもよい。
前記間葉系幹細胞を含む細胞集団を凍結保存するための手段は、特に限定されないが、例えば、プログラムフリーザー、ディープフリーザー、液体窒素への浸漬などが挙げられる。凍結する際の温度は、好ましくは－３０℃以下、－４０℃以下、－５０℃以下、－６０℃以下、－７０℃以下、－８０℃以下、－９０℃以下、－１００℃以下、－１１０℃以下、－１２０℃以下、－１３０℃以下、－１４０℃以下、－１５０℃以下、－１６０℃以下、－１７０℃以下、－１８０℃以下、－１９０℃以下、又は－１９６℃（液体窒素温度）以下である。凍結する際の好ましい凍結速度は、例えば、－１℃／分、－２℃／分、－３℃／分、－４℃／分、－５℃／分、－６℃／分、－７℃／分、－８℃／分、－９℃／分、－１０℃／分、－１１℃／分、－１２℃／分、－１３℃／分、－１４℃／分又は－１５℃／分である。かかる凍結手段としてプログラムフリーザーを用いた場合、例えば、－２℃／分以上－１℃／分以下の凍結速度で－５０℃以上－３０℃以下の間の温度（例えば、－４０℃）まで温度を下げ、さらに－１１℃／分以上－９℃／分以下（例えば、－１０℃／分）の凍結速度で－１００℃以上－８０℃以下の温度（例えば、－９０℃）まで温度を下げることができる。
上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の保存容器に入った状態で凍結されてよい。かかる保存容器としては、例えば、クライオチューブ、クライオバイアル、凍結用バッグ、輸注バッグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
凍結用保存液は、相対的に増殖能が高いＭＳＣの生存率を高める観点から、０質量％より多い所定濃度のアルブミンを含有することが好ましい。アルブミンの好ましい濃度は、例えば、０．５質量％以上、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上又は８質量％以上である。また、アルブミンの好ましい濃度は、例えば、４０質量％以下、３５質量％以下、３０質量％以下、２５質量％以下、２０質量％以下、１５質量％以下、１０質量％以下又は９質量％以下である。アルブミンとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、マウスアルブミン、ヒトアルブミン等を挙げることができるが、これに限定されない。
［４］間葉系幹細胞の増殖性をモニタリングする方法、ドナー及び／又はドナーから採取した試料の評価方法、並びに酵素処理条件を確認及び／又は予測する方法
本発明においては、間葉系幹細胞を含む細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上、前記細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満、前記細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満であることを指標として測定することによって（好ましくは経時的に測定することによって）、間葉系幹細胞の増殖性をモニタリングすることができる。前記モニタリングが必要な工程としては、例えば、培養する工程、凍結保存する工程及び／又は製剤化する工程である。
培養する工程においては、指標を経時的に測定することで、間葉系幹細胞の増殖性の変化を迅速に把握且つ予測することができる。上記指標を満たす間葉系幹細胞を含む細胞集団においては、間葉系幹細胞の増殖性が高いことが分かる。一方上記指標から値が逸脱した培養状態が継続している場合には、間葉系幹細胞の増殖性が低下しつつあることが予測できる。例えば、上記指標を満たす間葉系幹細胞を含む細胞集団においては、倍加時間が一定の数値以下を維持している。一方、上記指標から値が逸脱した培養状態が継続している場合には、倍加時間が一定の数値を超えるデータが得られる。増殖性が低下しつつあることを指標から読み取った場合には、培養条件（播種密度、培地、増殖因子の添加、血清の変更など）を必要に応じて適切に変更することによって、間葉系幹細胞の増殖性を向上させることができる。また、上記指標を満たさない場合には、例えばセルソーティング技術を利用することによって、上記指標を満たす間葉系幹細胞を含む細胞集団を分取することができる。前記細胞集団における間葉系幹細胞を再度播種して継代培養することによって、間葉系幹細胞の増殖性を向上させることができる。培養初期段階においては、その工程の最終段階において前記指標を満たすように培養条件（播種密度、培地、増殖因子の添加、血清の変更など）を設計して、少なくとも最終段階においては、上記指標を満たすことができればよい。
本発明においては、ドナーから胎児付属物由来の間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得し、ＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率、ＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率及びＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上、前記細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満、前記細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満であることを指標として評価することによって、ドナー自体及び／又はドナーから採取した試料の品質を評価することができる。上記指標を満たす間葉系幹細胞を含む細胞集団が得られる場合（好ましくは容易に得られる場合）には、ドナー及び／又はドナーから採取した試料の品質が良好であることを確認できる。一方、前記間葉系幹細胞を含む細胞集団における上記比率が、上記指標から逸脱している場合には、ドナーから採取した試料の品質が不良であるため、培養条件（播種密度、培地、増殖因子の添加、血清の変更など）を適切に変更することによって、間葉系幹細胞の増殖性を向上させることができる。また、前記間葉系幹細胞を含む細胞集団における上記比率が、上記指標から逸脱している場合には、例えばセルソーティング技術を利用することによって、上記指標を満たす間葉系幹細胞を含む細胞集団を分取し、前記細胞集団における間葉系幹細胞を播種して培養することによって、間葉系幹細胞の増殖性を向上させることができる。培養初期段階においては、その工程の最終段階において前記指標を満たすように培養条件（播種密度、培地、増殖因子の添加、血清の変更など）を設計して、少なくとも最終段階においては、上記指標を満たすことができればよい。なお、ドナーから採取した試料の品質を確認する場合については、試料の調製及び処理方法、細胞集団の培養方法は特に限定されず、任意の方法を採用することができる。
本発明においては、ドナーから採取した試料を酵素処理して得られた細胞集団に対して、ＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率、ＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率及びＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上、前記細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満、前記細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満であることを指標として評価することで、前記試料の最適な酵素処理条件を判断及び／又は予測することができる。上記指標を満たす間葉系幹細胞を含む細胞集団が得られる場合（好ましくは容易に得られる場合）には、ドナーから採取した試料の酵素処理方法が適切であることを判断及び／又は予測することができる。一方、上記指標から値が逸脱した培養状態が継続している場合には、ドナーから採取した試料の酵素処理方法が不適切であることを判断及び／又は予測することができる。なお、最適な酵素処理方法を判断及び／又は予測する場合については、試料の調製及び処理方法、細胞集団の培養方法は特に限定されず、任意の方法を採用することができる。
上記の指標は必要なタイミングで測定すればよく、特に限定されないが、生体試料から細胞を分離した直後、培養工程の途中、培養工程における純化後、Ｎ回継代した直後（Ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、又は医薬品組成物として製剤化する前などが挙げられる。
［５］医薬組成物
本発明による胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団は、医薬組成物として使用することができる。即ち、本発明によれば、本発明による胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物が提供される。
本発明の医薬組成物は、細胞治療剤、例えば、難治性疾患治療剤として使用することができる。
本発明の医薬組成物は、免疫性疾患、虚血性疾患（下肢虚血、虚血性心疾患（心筋梗塞等）、冠動脈性心疾患、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血等）、神経性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデスを含む膠原病、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、糖尿病、菌状息肉腫（Ａｌｉｂｅｒｔ－Ｂａｚｉｎ症候群）、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、眼疾患、血管新生関連疾患、うっ血性心不全、心筋症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、癌等から選択される疾患の治療剤として使用することができる。本発明の医薬組成物を治療部位に効果が計測できる量投与することで、上記疾患を治療することができる。
本発明によれば、医薬組成物のために使用される、本発明による胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明によれば、細胞治療剤のために使用される、本発明による胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明によれば、免疫性疾患、虚血性疾患（下肢虚血、虚血性心疾患（心筋梗塞等）、冠動脈性心疾患、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血等）、神経性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデスを含む膠原病、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、糖尿病、菌状息肉腫（Ａｌｉｂｅｒｔ－Ｂａｚｉｎ症候群）、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、眼疾患、血管新生関連疾患、うっ血性心不全、心筋症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、癌等から選択される疾患の治療のために使用される、本発明による胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明によれば、患者又は被験者に投与して、心筋の再生、心筋細胞の産生、血管新生、血管の修復、又は、免疫応答の抑制のために使用される、本発明による胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明によれば、患者又は被験者に、本発明による胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団の治療有効量を投与する工程を含む、患者又は被験者に細胞を移植する方法、並びに患者又は被験者の疾患の治療方法が提供される。
本発明によれば、医薬組成物の製造のための、本発明による胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明によれば、細胞治療剤の製造のための、本発明による胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明によれば、免疫性疾患、虚血性疾患（下肢虚血、虚血性心疾患（心筋梗塞等）、冠動脈性心疾患、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血等）、神経性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデスを含む膠原病、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、糖尿病、菌状息肉腫（Ａｌｉｂｅｒｔ－Ｂａｚｉｎ症候群）、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、眼疾患、血管新生関連疾患、うっ血性心不全、心筋症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、癌等から選択される疾患の治療剤の製造のための、本発明による胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明によれば、患者又は被験者に投与して、心筋の再生、心筋細胞の産生、血管新生、血管の修復、又は、免疫応答の抑制に必要な治療剤の製造のための、本発明による胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明の医薬組成物の投与量としては、患者又は被験者に投与した場合に、投与していない患者又は被験者と比較して疾患に対して治療効果を得ることができるような細胞の量である。具体的な投与量は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重及び症状等によって適宜決定することができる。投与量は、特に限定されないが、例えば、１０4個／ｋｇ体重以上、１０5個／ｋｇ体重以上又は１０6個／ｋｇ体重以上である。また、投与量は、特に限定されないが、例えば、１０9個／ｋｇ体重以下、１０8個／ｋｇ体重以下又は１０7個／ｋｇ体重以下である。
本発明の医薬組成物の投与方法は、特に限定されないが、例えば、皮下注射、リンパ節内注射、静脈内注射、腹腔内注射、胸腔内注射又は局所への直接注射、又は局所に直接移植することなどが挙げられる。
本発明の医薬組成物は、他の疾患治療目的に注射用製剤、或いは細胞塊又はシート状構造の移植用製剤、或いは任意のゲルと混合したゲル製剤として用いることも可能である。
本発明の患者又は被験者とは典型的にはヒトであるが、他の動物であってもよい。他の動物としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、フェレット等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。本発明の医薬組成物は、ヒトの治療の際に用いられる任意の成分を含んでもよい。かかる成分としては、例えば、塩類、多糖類（例えば、ＨＥＳ、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ＤＭＳＯ、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
また、本発明の医薬組成物は、羊膜間葉系幹細胞集団を、製薬上許容し得る媒体として使用される輸液製剤により希釈したものでもよい。本明細書における「輸液製剤（製薬上許容し得る媒体）」としては、ヒトの治療の際に用いられる溶液であれば特に限定されないが、例えば、生理食塩液、５％ブドウ糖液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、開始液（１号液）、脱水補給液（２号液）、維持輸液（３号液）、術後回復液（４号液）等を挙げることができる。
患者又は被験者において間葉系幹細胞を含む細胞集団を用いて治療することができる疾患等の他の例、前記疾患等の更なる具体例、及び、治療の具体的な手順は、Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， ２００９ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ８； ５４（２４）： ２２７７－２２８６、Ｈｏｎｍｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ ２０１１： １３４； １７９０－１８０７、Ｍａｋｈｏｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｓｕｒｇ． ２０１３； ９５： １８２７－１８３３、特許第５９０５７７号公報、特開２０１０－５１８０９６号公報、特表２０１２－５０９０８７号公報、特表２０１４－５０１２４９号公報、特開２０１３－２５６５１５号公報、特開２０１４－１８５１７３号公報、特表２０１０－５３５７１５号公報、特開２０１５－０３８０５９号公報、特開２０１５－１１０６５９号公報、特表２００６－５２１１２１号公報、特表２００９－５４２７２７号公報、特開２０１４－２２４１１７号公報、特開２０１５－０６１８６２号公報、特表２００２－５１１０９４号公報、特表２００４－５０７４５４号公報、特表２０１０－５０５７６４号公報、特表２０１１－５１４９０１号公報、特開２０１３－０６４００３号公報、特開２０１５－１３１７９５号公報等に記載された事項を参照することができる。
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜比較例１＞
（工程１－１：羊膜の採取）
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
（工程１－２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収）
上皮細胞層と間葉系幹細胞層とを含む羊膜を４８０ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼ及び４００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）に浸し、３７℃にて９０分間、５０ｒｐｍの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き９５μｍのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、羊膜ＭＳＣを含む細胞懸濁液を回収した。得られた細胞懸濁液に関し、フローサイトメーターを用いて、ＭＳＣの代表的な陽性マーカーとして知られている表面抗原の一つであるＣＤ９０の発現が陽性である細胞の比率を解析したところ、ＣＤ９０発現が陽性である細胞の比率は８９％であり、高純度で羊膜から羊膜ＭＳＣを分離できていることを確認した。
表面抗原解析は、ベクトン・ディッキンソン（ＢＤ）社のＢＤ ＡｃｃｕｒｉTM Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用い、測定条件は解析細胞数：１０，０００ｃｅｌｌｓ、流速設定：Ｓｌｏｗ（１４μＬ／ｍｉｎ）とした。アイソタイプコントロール用の抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社／型番：５５０６１６）を、ＣＤ９０抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ９０（ＢＤ社／型番：５５５５９５）を使用した。ＣＤ９０抗原に対して陽性である細胞の比率は、以下の手順で算出した。
（１）測定結果を縦軸に細胞数、横軸を抗体に標識された色素の蛍光強度としたヒストグラムで展開した。
（２）アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が０．１～１．０％となる蛍光強度を決定した。
（３）ＣＤ９０抗原に対する抗体で測定した総細胞のうち、（２）で決定した蛍光強度よりも蛍光強度が高い細胞の割合を算出した。
（工程１－３：羊膜ＭＳＣの培養；通常培養）
上述の「羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」で得られた、羊膜ＭＳＣを含む細胞集団を４，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ2の密度でプラスチック製培養容器に播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで培養した。その後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて細胞を剥離し、１／４量の細胞を先の培養と同じスケールのプラスチック製培養容器に播種することにより、継代培養を行った。培地交換は週２回の頻度で実施した。このようにして継代培養を続けたところ、４回目まで継代することが可能であったが、４回目の継代終了後に羊膜ＭＳＣの増殖は停止した。細胞形態を観察したところ、２継代目までは紡錘形であったが、３継代目以降は扁平状であった（図１）。
細胞形態から、本培養における羊膜ＭＳＣは、３継代目の段階から培養状態不良に陥ったと推察された。本継代培養によって得られた継代毎の羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５）の陽性率を解析した（図２）。Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４はそれぞれ、継代数０、継代数１、継代数２、継代数３及び継代数４の細胞を意味する。本測定では、アイソタイプコントロール用抗体として、ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社／型番：５５５７４９）、ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社／型番：５５０６１６）を使用し、ＣＤ７３抗原に対する抗体としてＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ７３（ＢＤ社／型番：５５０２５７）を、ＣＤ９０抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ９０（ＢＤ社／型番：５５５５９５）を、ＣＤ１０５抗原に対する抗体としてＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＦＩＴＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＡｎＣｅｌｌ社／型番：３２６－０４０）を使用した。細胞の測定及び陽性となる細胞の比率の算出は、上述の「羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」と同様の手順で行った。その結果、２継代目ではこれら表面抗原に対して陽性である細胞の比率が高かったのに対し、３継代目以降では陽性である細胞の比率が低下していた。このことからＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５の陽性率が低下すると間葉系幹細胞の増殖性が急激に低下し、培養状態不良となることが分かった。したがって、間葉系幹細胞の増殖性を評価するに際してはＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５等の表面抗原に対する陽性率を指標とすることができる。また、継代毎の倍加回数を計算し、増殖曲線を作成した（図６の通常培養）。
＜実施例１：羊膜ＭＳＣの培養（本発明による培養）＞
上述の「工程１－２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」で得られた、羊膜ＭＳＣを含む細胞集団を２，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ2の密度でプラスチック製培養容器に播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にて１週間培養した。培地交換は週２回の頻度で実施した。その後、同様にして２，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ2の密度で播種する継代培養を繰り返した。その結果、継代を繰り返すごとに紡錘形かつサイズの小さい細胞の割合が増えていき、４継代目の段階で大多数が紡錘形かつサイズの小さい細胞となった（図７）。
この段階で得られた細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にて上記と同様の密度で継代する継代培養を繰り返した。
上記の培養方法で培養した７、９、１１継代目の羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（羊膜ＭＳＣマーカーとして知られているＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ１０６、ＣＤ２００）に対して陽性となる細胞の比率を解析した（７継代目：図３のｂＦＧＦ（-）、９継代目：図４のｂＦＧＦ（-）、１１継代目：図５のｂＦＧＦ（-））。その結果、ＣＤ１０５の陽性率は５０％以上（具体的には７継代目：９８％、９継代目：８８％、１１継代目：７３％）、ＣＤ２００の陽性率は１０％未満（具体的には７継代目：４％、９継代目：６％、１１継代目：５％）、ＣＤ１４の陽性率は５％以上（具体的には７継代目：８％、９継代目：１６％、１１継代目：１８％）、ＣＤ１０６の陽性率は５％未満（具体的には７継代目：０％、９継代目：４％、１１継代目：４％）であった。つまり、本発明の方法より得られた胎児附属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団には、単球マーカーであるＣＤ１４の陽性を呈する間葉系幹細胞が存在し、また、胎児特異的マーカーであるＣＤ２００の陽性を呈する間葉系幹細胞がごく微量にしか存在しないことが判明した。
なお、本測定では、アイソタイプコントロール用抗体として、ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社／型番：５５５７４９）、ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社／型番：５５０６１６）、ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＲＥＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ (Ｓ)－ＰＥ アイソタイプコントロール抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社／１３０－１０４－６１２）を使用し、ＣＤ７３抗原に対する抗体としてＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ７３（ＢＤ社／型番：５５０２５７）を、ＣＤ９０抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ９０（ＢＤ社／型番：５５５５９５）を、ＣＤ１０５抗原に対する抗体としてＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＦＩＴＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＡｎＣｅｌｌ社／型番：３２６－０４０）を、ＣＤ１４抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４（ＢＤ社／型番：５５５３９７）を、ＣＤ４５抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ４５（ＢＤ社／型番：５５５４８２）を、ＣＤ２００抗原に対する抗体としてＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ２００（ＢＤ社／型番：５６１７６２）を、ＣＤ１０６抗原に対する抗体としてＣＤ１０６－ＰＥ, ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社／１３０－１０４－１６３）を使用した。
細胞の測定及び陽性となる細胞の比率の算出は、上述の「工程１－２；羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」と同様の手順で行った。
上記１１継代目の羊膜ＭＳＣを上記の培養方法でさらに培養を継続したところ、少なくとも総培養日数１０７日まで、倍加回数４６回まで、羊膜ＭＳＣは増殖停止することなく培養することが可能であった。このように培養した羊膜ＭＳＣに関しても、「工程１－３；羊膜ＭＳＣの培養；通常培養」と同様にして増殖曲線を作成した（図６の本発明の培養（ｂＦＧＦ-））。また、７継代目における倍加時間は１．６日、９継代目における倍加時間は１．５日、１１継代目における倍加時間は１．３日であった。
これらの結果から、ＣＤ１０５の陽性率は５０％以上、ＣＤ２００の陽性率は１０％未満、ＣＤ１４の陽性率は５％以上、ＣＤ１０６の陽性率は５％未満の条件を満たす羊膜ＭＳＣは、増殖性が高く、倍加時間も２日以下であることが示された。
＜実施例２：羊膜ＭＳＣの培養（塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の添加）＞
上述の「工程１－２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」で得られた、羊膜ＭＳＣを含む細胞集団を２，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ2の密度でプラスチック製培養容器に播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にて１週間培養した。培地交換は週２回の頻度で実施した。その後、同様にして２，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ2の密度で播種する継代培養を繰り返した。その結果、継代を繰り返すごとに紡錘形かつサイズの小さい細胞の割合が増えていき、４継代目の段階で大多数が紡錘形かつサイズの小さい細胞となった。
この段階で得られた細胞を、終濃度にして１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にて、上記と同様の密度で継代する継代培養を繰り返した。
上記の培養方法で培養した７、９、１１継代目の羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（羊膜ＭＳＣマーカーとして知られているＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ１０６、ＣＤ２００）に対して陽性となる細胞の比率を解析した（７継代目：図３のｂＦＧＦ（+）、９継代目：図４のｂＦＧＦ（+）、１１継代目：図５のｂＦＧＦ（+））。その結果、ＣＤ１０５の陽性率は５０％以上（具体的には７継代目：７９％、９継代目：８６％、１１継代目：８７％）、ＣＤ２００の陽性率は１０％未満（具体的には７、９、１１継代目のいずれも０％）、ＣＤ１４の陽性率は５％以上（具体的には７継代目：１２％、９継代目：８％、１１継代目：８％）、ＣＤ１０６の陽性率は５％未満（具体的には７、９、１１継代目のいずれも０％）であった。つまり、本発明の方法より得られた胎児附属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団には、単球マーカーであるＣＤ１４の陽性を呈する間葉系幹細胞が存在し、また、胎児特異的マーカーであるＣＤ２００の陽性を呈する間葉系幹細胞がごく微量にしか存在しないことが判明した。
上記１１継代目の羊膜ＭＳＣを上記の培養方法でさらに培養を継続したところ、少なくとも総培養日数１０７日まで、倍加回数４３回まで、羊膜ＭＳＣは増殖停止することなく培養することが可能であった。このように培養した羊膜ＭＳＣに関しても、「羊膜ＭＳＣの培養；通常培養」と同様にして増殖曲線を作成した（図６の本発明の培養（ｂＦＧＦ+））。また、７継代目における倍加時間は１．６日、９継代目における倍加時間は１．３日、１１継代目における倍加時間は１．４日であった。これらの結果から、ＣＤ１０５の陽性率は５０％以上、ＣＤ２００の陽性率は１０％未満、ＣＤ１４の陽性率は５％以上、ＣＤ１０６の陽性率は５％未満の条件を満たす羊膜ＭＳＣは、培養方法によらず増殖性が高く、倍加時間が２．０日以下であることが示された。
また、培地にｂＦＧＦを添加すると、ｂＦＧＦを添加しない態様と比較して、ＣＤ２００の陽性率は低く（図３～５）、羊膜ＭＳＣの増殖性も向上した。このことより、各種表面抗原の中で、特にＣＤ２００の陽性率は羊膜ＭＳＣの増殖性に関与していることが示唆された。
つまり、本発明においては、ＣＤ１０５の陽性率は５０％以上、ＣＤ２００の陽性率は１０％未満、ＣＤ１４の陽性率は５％以上、ＣＤ１０６の陽性率は５％未満を維持する条件を満たす培養方法であれば、いずれの場合も、増殖性の高い間葉系幹細胞を含む細胞集団を得られることが判明した。つまり、本発明によれば、間葉系幹細胞を含む細胞集団におけるＣＤ１０５の陽性率が５０％以上、ＣＤ２００の陽性率が１０％未満、ＣＤ１４の陽性率が５％以上、ＣＤ１０６の陽性率が５％未満であることを指標として測定することによって（好ましくは経時的に測定することによって）、間葉系幹細胞の増殖性をモニタリングすることができることが示された。
本測定では、アイソタイプコントロール用抗体として、ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社／型番：５５５７４９）、ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社／型番：５５０６１６）、ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＲＥＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ (Ｓ)－ＰＥ アイソタイプコントロール抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社／１３０－１０４－６１２）を使用し、ＣＤ７３抗原に対する抗体としてＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ７３（ＢＤ社／型番：５５０２５７）を、ＣＤ９０抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ９０（ＢＤ社／型番：５５５５９５）を、ＣＤ１０５抗原に対する抗体としてＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＦＩＴＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＡｎＣｅｌｌ社／型番：３２６－０４０）を、ＣＤ１４抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４（ＢＤ社／型番：５５５３９７）を、ＣＤ４５抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ４５（ＢＤ社／型番：５５５４８２）を、ＣＤ２００抗原に対する抗体としてＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ２００（ＢＤ社／型番：５６１７６２）を、ＣＤ１０６抗原に対する抗体としてＣＤ１０６－ＰＥ, ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社／１３０－１０４－１６３）を使用した。
細胞の測定及び陽性となる細胞の比率の算出は、上述の「工程１－２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」と同様の手順で行った。
＜実施例３：羊膜ＭＳＣの増殖性のモニタリング＞
上述の「工程１－１：羊膜の採取」で得られた、上皮細胞層と間葉系幹細胞層とを含む羊膜を２４０ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼ及び２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）に浸し、３７℃にて９０分間、５０ｒｐｍの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き９５μｍのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、羊膜ＭＳＣを含む細胞懸濁液を回収した。これを６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ2の密度でＣｅｌｌＳｔａｃｋに播種し、終濃度にして１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで培養した。その後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて１継代目の細胞を剥離し、１／５量の細胞を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳｔａｃｋに播種することにより、継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて２継代目の細胞を剥離し、細胞濃度が２×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１溶液（ＣＰ－１：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、クライオバイアルに移して－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、解凍して約１８，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ2の密度で３継代目の細胞をＣｅｌｌＳｔａｃｋに播種し、終濃度にして１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで培養した。その後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて３継代目の細胞を剥離し、１／５量の細胞を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳｔａｃｋに播種することにより、継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて４継代目の細胞を剥離し、細胞濃度が４×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１溶液（ＣＰ－１：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、クライオバイアルに移して－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、解凍して約６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ2の密度で５継代目の細胞をＣｅｌｌＳｔａｃｋに播種し、終濃度にして１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで培養した。その後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて５継代目の細胞を剥離し、１／５量の細胞を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳｔａｃｋに播種することにより、継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて６継代目の細胞を剥離し、細胞濃度が４×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１溶液（ＣＰ－１：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、クライオバイアルに移して－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。７継代目以降は全て約６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ2の密度で細胞をＣｅｌｌＳｔａｃｋに播種し、終濃度にして１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで培養した。その後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて剥離し、継代培養を１０継代目まで繰り返した。上記の培養方法で培養した２、４、６、８、１０継代目の羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（羊膜ＭＳＣマーカーとして知られているＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、ＣＤ１０６、ＣＤ２００）に対して陽性となる細胞の比率を解析した（図８）。その結果、ＣＤ１０５の陽性率はいずれの継代数においても５０％以上であった（具体的には２継代目：９８％、４継代目：９９％、６継代目：９９％、８継代目：９９％、１０継代目：９９％）。ＣＤ２００の陽性率は４継代目までは１０％以上であり、６継代目以降においては１０％未満となった（具体的には２継代目：７７％、４継代目：３２％、６継代目：２％、８継代目：１％、１０継代目：０％）。ＣＤ１０６の陽性率は４継代目までは５％以上であり、６継代目以降においては５％未満であった（具体的には２継代目：１４％、４継代目：７％、６継代目：３％、８継代目：０％、１０継代目：０％）。このように培養した羊膜ＭＳＣに関しても、「工程１－３；羊膜ＭＳＣの培養；通常培養」と同様にして増殖曲線を作成した（図９）。また、倍加時間を算出したところ、２継代目における倍加時間は２．９日であり、４継代目における倍加時間は５日であり、６継代目における倍加時間は１．３日であり、８継代目における倍加時間は１．３日であり、１０継代目における倍加時間は１．６日であった。これらの結果から、ＣＤ１０５の陽性率は５０％以上、ＣＤ２００の陽性率は１０％未満、ＣＤ１０６の陽性率は５％未満の条件を満たす羊膜ＭＳＣ（具体的には６継代目以降の羊膜ＭＳＣ）は増殖性が高く、倍加時間も２日以下となることが示された。一方、上記条件を満たさない羊膜ＭＳＣ（具体的には２及び４継代目の羊膜ＭＳＣ）は増殖性が低く、倍加時間も２日を超えることが示された。
つまり本発明においては、間葉系幹細胞を含む細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上、前記細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満、前記細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満であることを指標として経時的に間葉系幹細胞の各表面抗原の陽性率を測定することによって、間葉系幹細胞の増殖性をモニタリングできることが示された。また、指標の測定結果から増殖性が低いと判断した場合には、培養条件を適切に変更することによって、間葉系幹細胞の増殖性を向上させることができることも示された。
なお、本測定では、アイソタイプコントロール用抗体として、ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社／型番：５５５７４９）、ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社／型番：５５０６１６）、ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社／型番：５５５５７３）を使用し、ＣＤ７３抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ７３（ＢＤ社／型番：５６１２５４）を、ＣＤ９０抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ９０（ＢＤ社／型番：５５５５９５）を、ＣＤ１０５抗原に対する抗体としてＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＦＩＴＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社／型番：３２３２０３）を、ＣＤ４５抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ４５（ＢＤ社／型番：５５５４８２）を、ＣＤ２００抗原に対する抗体としてＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ２００（ＢＤ社／型番：５５２４７５）を、ＣＤ１０６抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ１０６（ＢＤ社／型番：５５１１４６）を使用した。細胞の測定及び陽性となる細胞の比率の算出は、上述の「工程１－２；羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」と同様の手順で行った。
＜実施例４：羊膜ＭＳＣの免疫調節作用の検討＞
上述の「実施例１：羊膜ＭＳＣの培養（本発明による培養）」で培養した羊膜ＭＳＣをプラスチック製培養容器に１．５×１０4ｃｅｌｌｓ/ｃｍ2の密度で播種し、１０％ＦＢＳと２０μＭ２－メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて６時間培養した。培養した羊膜ＭＳＣに、１．５×１０5ｃｅｌｌｓ/ｃｍ2の密度でヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を播種し、共培養した。また、ヒトＰＢＭＣを１．５×１０5ｃｅｌｌｓ/ｃｍ2の密度で単独培養した。さらに、並行して、ヒトＰＢＭＣの増殖活性を上げるため、羊膜ＭＳＣとヒトＰＢＭＣの共培養、ヒトＰＢＭＣ単独培養に対して終濃度２．５μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を添加して培養した。それぞれ４８時間培養した後、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｓｓａｙキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いて各細胞集団の細胞増殖活性を評価した。細胞増殖活性の評価は、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｓｓａｙキットに従い、励起光５６８ｎｍ／蛍光５８５ｎｍの波長における蛍光強度を測定することにより実施した。結果を図１０に示す。図１０の縦軸の単位は、励起光５６８ｎｍ／蛍光５８５ｎｍの波長における蛍光強度である。羊膜ＭＳＣは、活性化されたヒトＰＢＭＣの増殖活性を抑制した（図１０）。
＜実施例５：酵素処理方法の検討＞
上述の「工程１－２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」で得られた、羊膜ＭＳＣを含む細胞集団をＷＯ２０１３／０７７４２８号公報の請求項７並びに段落００４５の＜羊膜間葉系細胞の細胞集団の調製＞の記載の方法にて培養した。即ち羊膜ＭＳＣを含む細胞集団を、約１０，０００cells/ｃｍ2の密度でプラスチック製培養容器に播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にて３日間培養（初期培養）した。３日後、羊膜ＭＳＣを５００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ2の密度で継代し、1週間培養した。その後、５００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ2の密度で継代培養を繰り返した。紡錘状の形態を有する羊膜ＭＳＣがある程度純化されたことを確認した後、通常密度（約５，０００～１０，０００ｃｅｌｌｓ）での継代培養を行った。このように培養した羊膜ＭＳＣに関して、「工程１－３；羊膜ＭＳＣの培養；通常培養」と同様にして増殖曲線を作成した（図１１）。
上記で得られた培養曲線（図１１）とＷＯ２０１３／０７７４２８号公報の図４（ｄ）を比較した。上記で取得された羊膜ＭＳＣとＷＯ２０１３／０７７４２８号公報の請求項７並びに段落００４５の方法で取得された羊膜ＭＳＣでは、酵素処理条件のみが異なっており、酵素処理後の培養方法は、どちらも同一である。培養方法が同一であるにも関わらず、ＷＯ２０１３／０７７４２８号公報では、細胞分裂回数（倍加回数）が１０回に至るまでには６０日程度の培養日数が必要であるのに対して、本発明における酵素処理方法では、３０日程度の培養日数で倍加回数は１０回に達している（図１１）。即ち本発明の条件で酵素処理した羊膜ＭＳＣは、ＷＯ２０１３／０７７４２８号公報に記載の条件で酵素処理した羊膜ＭＳＣと比較して、羊膜ＭＳＣの増殖性が高かった。
また、上記実施例５の方法で酵素処理並びに培養方法で培養した９継代目の羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（羊膜ＭＳＣマーカーとして知られているＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ４５、ＣＤ３２６、ＣＤ１４）に対して陽性となる細胞の比率を解析した（図１２）。その結果、ＣＤ１０５の陽性率は５０％以上（具体的には８６％）、ＣＤ１４の陽性率は５％以上（具体的には１２％）であった。
つまり、本発明によれば、ＣＤ１０５の陽性率は５０％以上、ＣＤ２００の陽性率は１０％未満、ＣＤ１４の陽性率は５％以上、ＣＤ１０６の陽性率は５％未満であることを、最適な酵素処理条件を判断及び／又は予測する際の指標として用いることができ、増殖性の高いＭＳＣの含有量が高い試料を予め選定することができる。それにより、製造コストを下げることが可能となり、また培養期間を短縮することができる。
＜実施例６：ドナーから採取した試料の品質評価＞
３名のインフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取し、それぞれの胎児付属物を「工程１－１：羊膜の採取」、「工程１－２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」に沿って処理し、羊膜ＭＳＣを取得する。３名の胎児付属物から得られた羊膜ＭＳＣはそれぞれ＃１、＃２、＃３とする。
上記で得られる＃１、＃２、＃３の羊膜ＭＳＣを含む細胞集団を「実施例１：羊膜ＭＳＣの培養（本発明による培養）」の方法で培養する。
上記の培養方法で培養する羊膜ＭＳＣに関しては、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原に対して陽性となる細胞の比率を解析することができる。また、上記の培養方法で培養した羊膜ＭＳＣに関して、「工程１－３；羊膜ＭＳＣの培養；通常培養」と同様にして増殖曲線を作成することができる。
このようにして、ドナーの異なる＃１、＃２、＃３の羊膜ＭＳＣにおいて、ＣＤ１０５、ＣＤ２００、ＣＤ１０６及びＣＤ１４の陽性率を調べれば、ドナー自体及びドナーから採取した試料の品質を評価することができる。つまり、本発明によれば、ＣＤ１０５の陽性率は５０％以上、ＣＤ２００の陽性率は１０％未満、ＣＤ１４の陽性率は５％以上、ＣＤ１０６の陽性率は５％未満であることを指標とすることによって、ドナー自体及びドナーから採取した試料の品質を評価することができ、増殖性の高いＭＳＣの含有量が高い試料を予め選定することができる。それにより、製造コストを下げることが可能となり、また培養期間を短縮することができる。
＜実施例７：異なるドナーから採取した試料の品質評価＞
２名のインフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取し、それぞれの胎児付属物を実施例３に沿って処理し、羊膜ＭＳＣを取得した。２名の胎児付属物から得られた羊膜ＭＳＣはそれぞれ＃４、＃５とした。上記で得られた＃４、＃５の羊膜ＭＳＣを含む細胞集団を実施例３と同じ方法で６継代目まで培養した。前記６継代目の羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（羊膜ＭＳＣマーカーとして知られているＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、ＣＤ１０６、ＣＤ２００、ＣＤ１４）に対して陽性となる細胞の比率を解析した（図１３）。＃４においては、ＣＤ１０５の陽性率は９９％であり、ＣＤ２００の陽性率は２％であり、ＣＤ１０６の陽性率は３％であり、ＣＤ１４の陽性率は７％であった。一方＃５においては、ＣＤ１０５の陽性率は９９％であり、ＣＤ２００の陽性率は３２％であり、ＣＤ１０６の陽性率は３８％であり、ＣＤ１４の陽性率は１１％であった。また、＃４と＃５の６継代目における羊膜ＭＳＣの倍加時間を比較すると、＃４の羊膜ＭＳＣの倍加時間は２日以下（具体的には１．３日）であったのに対して＃５の羊膜ＭＳＣの倍加時間は２日を超えており（具体的には２．７日）、＃４と比較して２倍以上遅いことが明らかとなった。また、＃４及び＃５の羊膜ＭＳＣに関して、「工程１－３；羊膜ＭＳＣの培養；通常培養」と同様にして増殖曲線を作成したところ、（図１４）＃４の羊膜ＭＳＣの方が高い増殖性を示した。以上の結果から、羊膜から同一の方法で羊膜ＭＳＣを採取・培養しても、ドナーの相違によって取得した羊膜ＭＳＣの増殖性に大きく差がでることが示され、ＣＤ１０５、ＣＤ２００、ＣＤ１０６及びＣＤ１４の陽性率を調べれば、ドナー自体及びドナーから採取した試料の品質を評価できることが示唆された。つまり、本発明によれば、ＣＤ１０５の陽性率は５０％以上、ＣＤ２００の陽性率は１０％未満、ＣＤ１０６の陽性率は５％未満であることを指標とすることによって、ドナー自体及びドナーから採取した試料の品質を評価することができ、増殖性の高いＭＳＣの含有量が高い試料を選定することができる。
＜実施例８：医薬組成物の製造＞
上記の「実施例１：羊膜ＭＳＣの培養（本発明による培養）」で得られた羊膜ＭＳＣの一部を医薬組成物の調製に供する。羊膜ＭＳＣ２．３×１０8個、デキストラン０．５０ｇ、ＤＭＳＯ１．３ｇ及びヒト血清アルブミン１．０ｇを含有するＲＰＭＩ１６４０培地２５ｍＬからなる医薬組成物（細胞製剤）を調製する。当該医薬組成物を凍結用バッグに封入し、凍結状態で保存する。尚、使用時に医薬組成物を解凍し、患者に供することができる。

Claims (10)

  1. 胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団であって、
    前記細胞集団において、ＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上であり、ＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満であり、ＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満であり、ＣＤ１４ + を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％以上である、
    前記細胞集団。
  2. 前記間葉系幹細胞が、生体外での培養開始後４０日以降まで増殖停止することなく培養することが可能である、請求項１に記載の細胞集団。
  3. 前記間葉系幹細胞が、生体外での培養開始後、倍加回数が１０回以上になるまで培養することが可能である、請求項１又は２に記載の細胞集団。
  4. 前記間葉系幹細胞において、倍加時間が２日以下である請求項１から３の何れか一項に記載の細胞集団。
  5. 請求項１から４の何れか一項に記載の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
  6. 胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、
    胎児付属物から採取した細胞を含む細胞集団を３８００細胞／ｃｍ 2 以下の密度で播種し、培養することを４回以上繰り返す工程を含み、
    前記胎児付属物から採取した細胞を含む細胞集団が、胎児付属物から採取した上皮細胞層と間葉系幹細胞層とを含む試料をコラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼで処理して得た細胞集団である、
    前記細胞集団の製造方法。
  7. 上記培養期間が、４～１０日間である、請求項６に記載の細胞集団の製造方法。
  8. 胎児付属物に由来する間葉系幹細胞を含む細胞集団において、
    ＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率、ＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率及びＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上、前記細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満、前記細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満、かつ、前記細胞集団におけるＣＤ１４ + を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％以上であることを指標として間葉系幹細胞の増殖性をモニタリングする方法。
  9. ドナーから胎児付属物由来の間葉系幹細胞を含む細胞集団を採取し、ＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率、ＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率及びＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上、前記細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満、前記細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満、かつ、前記細胞集団におけるＣＤ１４ + を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％以上であることを指標として評価する、ドナー及び／又はドナーから採取した胎児付属物由来の間葉系幹細胞を含む試料の評価方法。
  10. ドナーから採取した試料を酵素処理して得られた細胞集団に対して、ＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率、ＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率及びＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるＣＤ１０５+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５０％以上、前記細胞集団におけるＣＤ２００+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が１０％未満、前記細胞集団におけるＣＤ１０６+を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％未満、かつ、前記細胞集団におけるＣＤ１４ + を呈する前記間葉系幹細胞の比率が５％以上であることを指標として評価する、前記試料の最適な酵素処理条件を判断及び／又は予測する方法。
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