JP2022060520A - 間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法、間葉系幹細胞、細胞集団、並びに医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、上述した着眼点や発想、及び上述の得られた知見に基づき、完成したものである。
[1] 間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、
増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激又は化学的刺激により処理することによって、相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞を選別する選別工程を含み、
選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞が、CD106陰性であり、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が前記物理的刺激又は化学的刺激による処理前よりも増加していることを特徴とする、前記細胞集団の製造方法。
[2] 前記増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激により処理することが、前記細胞集団を凍結した後に解凍することである、[1]に記載の細胞集団の製造方法。
[3] 前記増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激により処理することが、前記細胞集団を凍結保存液に懸濁し、得られた懸濁液を凍結して凍結状態を維持し、解凍する工程を含む、[1]又は[2]に記載の細胞集団の製造方法。
[4] 前記凍結状態を2日間以上維持する、[3]に記載の細胞集団の製造方法。
[5] 前記選別工程で得られた間葉系幹細胞を含む細胞集団を、培養及び/又は継代する工程をさらに含む、[1]から[4]の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
[6] 胎児付属物を酵素処理することにより、増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得する細胞集団取得工程をさらに含む、[1]から[5]の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
[7] 前記細胞集団取得工程で得られた細胞集団を培養する工程をさらに含む、[6]に記載の細胞集団の製造方法。
[8] 前記メタロチオネインファミリー遺伝子が、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X及びMT2Aからなる群から少なくとも1種選択される、[1]から[7]の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
[9] 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞が、SA-β-Gal陰性である、[1]から[8]の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
[10] 前記細胞集団において、SA-β-Gal陰性である前記間葉系幹細胞の平均比率が90%以上である[9]に記載の細胞集団の製造方法。
[11] 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞が、CD105陽性、CD73陽性、CD90陽性、CD45陰性、CD34陰性、CD11b陰性、CD79alpha陰性、及びHLA-DR陰性である、[1]から[10]の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
[12] 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞の比増殖速度が、0.14(1/day)以上である、[1]から[11]の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
[13] 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径が、相対的に増殖能が低い間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径の80%以下である、[1]から[11]の何れか一に記載の細胞集団の製造方法。
[14] CD106陰性であり、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加している、間葉系幹細胞。
[15] 前記メタロチオネインファミリー遺伝子が、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X及びMT2Aからなる群から少なくとも1種選択される、[14]に記載の間葉系幹細胞。
[16] 前記間葉系幹細胞が、SA-β-Gal陰性である、[14]又は[15]に記載の間葉系幹細胞。
[17] 前記間葉系幹細胞が、CD105陽性、CD73陽性、CD90陽性、CD45陰性、CD34陰性、CD11b陰性、CD79alpha陰性、及びHLA-DR陰性である、[14]から[16]の何れか一に記載の間葉系幹細胞。
[18] 前記間葉系幹細胞の比増殖速度が、0.14(1/day)以上である、[14]から[17]の何れか一に記載の間葉系幹細胞。
[19] 前記間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径が、相対的に増殖能が低い間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径の80%以下である、[14]から[18]の何れか一に記載の間葉系幹細胞。
[20] 間葉系幹細胞を含む細胞集団であって、
前記間葉系幹細胞が、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加しており、且つ、CD106陰性である、前記細胞集団。
[21] 前記細胞集団において、CD106陽性である前記間葉系幹細胞の比率が5%未満である、[20]に記載の細胞集団。
[22] 前記細胞集団において、SA-β-Gal陰性である前記間葉系幹細胞の平均比率が90%以上である、[20]又は[21]に記載の細胞集団。
[23] [14]から[19]の何れか一に記載の間葉系幹細胞あるいは[20]から[22]の何れか一に記載の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
[24] ヒトへの間葉系幹細胞の1回の投与量が109個/kg体重以下である、[23]に記載の医薬組成物。
[25] 免疫関連疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、膠原病、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、又はアトピー性皮膚炎から選択される疾患の治療剤である、[23]又は[24]に記載の医薬組成物。
[27] 医薬組成物の製造のための、[14]から[19]の何れか一に記載の間葉系幹細胞あるいは[20]から[22]の何れか一に記載の細胞集団の使用。
[28] 医薬組成物が、ヒトへの間葉系幹細胞の1回の投与量が109個/kg体重以下である医薬組成物である、[27]に記載の使用。
[29] 医薬組成物が、免疫関連疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、膠原病、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、又はアトピー性皮膚炎から選択される疾患の治療剤である、[27]又は[28]に記載の使用。
[30] 疾患の治療において使用するための、[14]から[19]の何れか一に記載の間葉系幹細胞あるいは[20]から[22]の何れか一に記載の細胞集団。
[31] ヒトへの間葉系幹細胞の1回の投与量が109個/kg体重以下である、[30]に記載の間葉系幹細胞あるいは細胞集団。
[32] 疾患が、免疫関連疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、膠原病、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、又はアトピー性皮膚炎から選択される疾患である、[30]又は[31]に記載の間葉系幹細胞あるいは細胞集団。
[33] [14]から[19]の何れか一に記載の間葉系幹細胞あるいは[20]から[22]の何れか一に記載の細胞集団を、治療を必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療方法。
[34] ヒトへの間葉系幹細胞の1回の投与量が109個/kg体重以下である、[33]に記載の疾患の治療法。
[35] 疾患が、免疫関連疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、膠原病、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、又はアトピー性皮膚炎から選択される疾患である、[33]又は[34]に記載の疾患の治療方法。
[36] [14]から[19]の何れか一に記載の間葉系幹細胞と、媒体とを含む、組成物。
[37] [20]から[22]の何れか一に記載の細胞集団と、媒体とを含む、組成物。
本明細書における「胎児付属物」は、卵膜、胎盤、臍帯及び羊水を指す。さらに「卵膜」は、胎児の羊水を含む胎嚢であり、内側から羊膜、絨毛膜及び脱落膜からなる。このうち、羊膜と絨毛膜は胎児を起源とする。「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜を指す。羊膜の内層(上皮細胞層ともよばれる)は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌し、羊膜の外層(細胞外基質層ともよばれ、間質に相当する)は間葉系幹細胞を含む。
i)標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。
ii)表面抗原CD105、CD73、CD90が陽性であり、CD45、CD34、CD11b、CD79alpha、HLA-DRが陰性。
本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、増殖能が異なる間葉系幹細胞(MSC)を含む細胞集団を物理的刺激又は化学的刺激により処理することによって、相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞を選別する選別工程を含む方法である。
本発明における間葉系幹細胞の特性は、CD106陰性であり、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加している。したがって、本発明における間葉系幹細胞(相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞)は、CD106陰性であり、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加している間葉系幹細胞である。
(1)プラスチック製培養容器から、セルスクレーパー(コーニング社製)を用いて非酵素的に接着細胞を剥離し、遠心分離により細胞を回収する。RNA安定化試薬(RNAlater(Thermo Fisher Scientific社製))を用いて細胞を安定保存した後、RNA抽出キット(RNeasy Plus Miniキット(QIAGEN社製))を用いてトータルRNAを抽出、精製する。
(2)精製したトータルRNAを鋳型として用いて逆転写反応によりcDNAを合成し、さらに合成されたcDNAからin vitro transcriptionによりcRNAに転写してビオチン標識を行う。
(3)ビオチン標識cRNAをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Human GeneGenome U133A 2.0 Array(Affymetrix社製)上で16時間のハイブリダイゼーションを行う。GeneChip Fluidics Station 450(Affymetrix社製)にて洗浄し、フィコエリスリン染色後、GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix社製)にてスキャンを行い、AGCC(Affymetrix GeneChip Command Console Software)(Affymetrix社製)にて画像解析し、Affymetrix Expression Console(Affymetrix社製)を用いて数値化する。
(4)2アレイ分の数値データファイルを、解析ソフトGeneSpring GX(アジレント・テクノロジー社製)を用いて比較解析する。間葉系幹細胞のサンプルでのNormalized値を、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞のサンプル(コントロール)でのNormalized値で割ることにより、Fold Change値を算出する。
本発明によれば、間葉系幹細胞を含む細胞集団であって、前記間葉系幹細胞が、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加しており、且つ、CD106陰性である、前記細胞集団が提供される。
(1)測定結果を、縦軸に細胞数、横軸を抗体に標識された色素の蛍光強度としたヒストグラムで展開する。
(2)アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が0.1~1.0%となる蛍光強度を決定する。
(3)特定の発現マーカーに対する抗体で測定した総細胞のうち、上記(2)で決定した蛍光強度よりも蛍光強度が高い細胞の割合を算出する。
蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)、フィコエリスリン(PE)、アロフィコシアニン(APC)等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
また、前記細胞集団において、上記の発現マーカーについて陽性である細胞の比率を測定する他の方法としては、例えば細胞染色が挙げられるが、これに限定されない。細胞染色において、着色するか若しくは蛍光を発する細胞が顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。顕微鏡を用いて同一拡大倍率にて細胞集団を観察し、視野内における全細胞数に対する陽性細胞数の比率を求めることにより、細胞集団における特定の発現マーカーが陽性である細胞の比率を決定することができる。細胞染色は、抗体を使用する免疫細胞染色であってもよく、抗体を使用しない非免疫細胞染色であってもよい。
(1)プラスチック培養容器に接着した細胞集団を用意し、SA-β-Gal特異的基質を用いた細胞染色を行う。
(2)細胞染色の後、同一プラスチック培養容器の少なくとも3箇所を、光学顕微鏡を用いて同一拡大倍率にて観察し、視野内における全細胞数とSA-β-Gal陽性細胞数とを測定する。
(3)各々の測定箇所について、以下の式により、細胞集団におけるSA-β-Gal陰性である細胞の比率を算出する。
細胞集団におけるSA-β-Gal陰性である細胞の比率=100-{(SA-β-Gal陽性細胞数/全細胞数)×100(%)}
(4)細胞集団におけるSA-β-Gal陰性である細胞の平均比率(細胞集団におけるSA-β-Gal陰性である細胞の比率の相加平均値)を算出する。
(1)プラスチック製培養容器から、セルスクレーパー(コーニング社製)を用いて非酵素的に接着細胞集団を剥離し、遠心分離により細胞集団を回収する。RNA安定化試薬(RNAlater(Thermo Fisher Scientific社製))を用いて細胞集団を安定保存した後、RNA抽出キット(RNeasy Plus Miniキット(QIAGEN社製))を用いてトータルRNAを抽出、精製する。
(2)精製したトータルRNAを鋳型として用いて逆転写反応によりcDNAを合成し、さらに合成されたcDNAからin vitro transcriptionによりcRNAに転写してビオチン標識を行う。
(3)ビオチン標識cRNAをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Human GeneGenome U133A 2.0 Array(Affymetrix社製)上で16時間のハイブリダイゼーションを行う。GeneChip Fluidics Station 450(Affymetrix社製)にて洗浄し、フィコエリスリン染色後、GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix社製)にてスキャンを行い、AGCC(Affymetrix GeneChip Command Console Software)(Affymetrix社製)にて画像解析し、Affymetrix Expression Console(Affymetrix社製)を用いて数値化する。
(4)2アレイ分の数値データファイルを、解析ソフトGeneSpring GX(アジレント・テクノロジー社製)を用いて比較解析する。間葉系幹細胞のサンプルでのNormalized値を、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞のサンプル(コントロール)でのNormalized値で割ることにより、Fold Change値を算出する。
本発明による相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞、あるいは上記間葉系幹細胞を含む細胞集団は、医薬組成物として使用することができる。本発明の医薬組成物は、本発明の間葉系幹細胞あるいは本発明の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物である。
本発明の医薬組成物は、免疫関連疾患、虚血性疾患(下肢虚血、虚血性心疾患(心筋梗塞等)、冠動脈性心疾患、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血等)、神経性疾患、移植片対宿主病(GVHD)、クローン病、潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデスを含む膠原病、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、糖尿病、菌状息肉腫(Alibert-Bazin症候群)、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び/又は炎症から起こる疾患、眼疾患、血管新生関連疾患、うっ血性心不全、心筋症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、癌から選択される疾患の治療剤として使用することができる。本発明の医薬組成物を治療部位に効果が計測できる量投与することで、炎症を抑制することができる。
さらに本発明によれば、医薬組成物のために使用される、本発明の間葉系幹細胞あるいは本発明の細胞集団が提供される。さらに本発明によれば、免疫関連疾患、虚血性疾患(下肢虚血、虚血性心疾患(心筋梗塞等)、冠動脈性心疾患、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血等)、神経性疾患、移植片対宿主病(GVHD)、クローン病、潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデスを含む膠原病、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、糖尿病、菌状息肉腫(Alibert-Bazin症候群)、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び/又は炎症から起こる疾患、眼疾患、血管新生関連疾患、うっ血性心不全、心筋症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、癌から選択される疾患の治療のために使用される、本発明の間葉系幹細胞あるいは本発明の細胞集団が提供される。さらに本発明によれば、患者又は被験者に投与して、心筋の再生、心筋細胞の産生、血管新生、血管の修復、又は、免疫応答の抑制のために使用される、本発明の間葉系幹細胞あるいは本発明の細胞集団が提供される。
比増殖速度が高い羊膜MSC(相対的に増殖能が高い羊膜MSC)を、以下の一連の工程1-1から工程1-6により取得した。
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液(Ca・Mg不含有)にて2回洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
(方法)
羊膜1gあたりに、300CDU/mL精製コラゲナーゼ(Worthington社、CLSPA)及び200PU/mLディスパーゼI(和光純薬、品番386-02271)を含有するハンクス平衡塩溶液(Ca・Mg含有)を5mL添加し、37℃にて90分間、60rpmの条件にて震盪攪拌した。ここで、CDU(collagen digestion unit)は、コラーゲンを基質として、37℃、pH7.5において5時間に1μmolのロイシンに相当するアミノ酸及びペプチドを生成する酵素量と定義される。また、PU(protease unit)は、乳酸カゼインを基質として35℃、pH7.2において1分間に1μgのチロシンに相当するアミノ酸及びペプチドを生成する酵素量と定義される。羊膜の酵素処理物を、2倍量の10%ウシ胎児血清(FBS)を含むαMEM(Alpha Modification of Minimum Essential Medium Eagle)にて懸濁した。得られた細胞懸濁液をナイロンメッシュフィルター(ポアサイズ:100μm)を用いて濾過し、羊膜MSCを含む濾液を回収した。ナイロンメッシュフィルター上に残留した未消化の羊膜をヘマトキシリン・エオジン(HE)染色にて評価した。羊膜MSCを含む濾液を400xgにて5分間遠心し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、10%FBSを含むαMEMにて懸濁し、増殖能が異なる羊膜MSCを含む細胞懸濁液を取得した。得られた細胞懸濁液の一部にチュルク染色液を混合し、細胞数を測定した。濾液から回収した羊膜MSCは、標識抗体にて4℃にて15分間染色した後、死細胞除去のためヨウ化プロピジウム(Propidium Iodide)又は7-AAD(7-Amino-Actinomycin D)を添加し、フローサイトメーター(FACSCanto:Becton,Dickinson and Company、日本BD社(以下、BD社と略す))を用いて表面抗原を解析した。標識抗体は、抗CD90-FITC抗体(BD社)を用いた。
ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色の結果、フィルター上に残留した羊膜は上皮細胞層が消化されずに保たれており、上皮細胞層内に多数の上皮細胞が存在していることが分かった。また、フィルター上に残留した羊膜はその細胞外基質層が消化されており、フィルター上に羊膜MSCは確認されなかった。これは、羊膜の細胞外基質層を標的とし、かつ羊膜の上皮細胞層を標的としないコラゲナーゼ及びディスパーゼを採用したことにより、上皮細胞をほとんど含有しない濾液が回収されたことを示している。
羊膜の酵素処理物から得られた細胞集団の一部をプラスチック製培養容器に播種し、10%FBSを含むαMEMにてコンフルエント率90%以上95%以下になるまで培養した。この工程により取得した細胞を前培養1細胞と称す。
(方法)
前培養1細胞を、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)にて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、10%FBSを含むαMEMにて懸濁した。播種密度が2.8×103個/cm2となるようにプラスチック製培養容器に細胞を播種し、10%FBSを含むαMEMにて8日間培養した。この前培養により取得した細胞を前培養2細胞と称す。前培養2細胞を、以降の試験に用いた。
8日間の培養の後、前培養2細胞は4.6×103個/cm2得られた。この場合、前培養2細胞の比増殖速度は0.06(1/day)であった。
(方法)
前培養2細胞を、EDTAにて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、0.5%(w/v)ヒト血清アルブミン(HSA)(ベネシス社製、献血アルブミン25%静注12.5g/50mL)を含むRPMI1640培地にて2.0×107個/mL以下となるように懸濁した。12%(w/v)ヒドロキシエチルデンプン(HES)(ニプロ社製、品番HES40)、10%(w/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma-Aldrich社製、品番D2650)及び8%(w/v)ヒト血清アルブミン(HSA)(ベネシス社製、献血アルブミン25%静注12.5g/50mL)を含む凍結用保存液を調製した。細胞懸濁液と凍結用保存液とを氷上で等量混合し、1mLをクライオチューブに移した。プログラムフリーザーを用いて、クライオチューブを-2℃/分以上-1℃/分以下の速度で-40℃まで冷却し、続いて-10℃/分の速度で-90℃まで冷却した後、-150℃の超低温冷凍庫内にて2日間凍結保存した。凍結保存したクライオチューブを37℃恒温槽に浸し、急速に融解した。融解した細胞懸濁液の一部を採取し、トリパンブルーにて染色し、血球計算盤を用いて細胞の数、生存率及び大きさを計測した。
図1及び表1に示すように、凍結-解凍処理直後の浮遊状態の羊膜MSCには、直径19.9±3.1μm(すなわち、平均直径19.9μm)の細胞群と、直径12.0±1.9μm(すなわち、平均直径12.0μm)の細胞群という、2種類の細胞(すなわち、相対的にサイズが大きい細胞と相対的にサイズが小さい細胞)が含まれていた。凍結-解凍処理直後の細胞生存率は55%であり、(生細胞中の)相対的にサイズが小さい細胞の含有率、すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数/相対的にサイズが大きい細胞の数の比率は、2%(すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数/相対的にサイズが大きい細胞の数=2/98)であった。
尚、凍結-解凍処理に供した細胞(前培養2細胞)における細胞生存率は91%であり、(生細胞中の)相対的にサイズが小さい細胞の含有率は、1%(すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数/相対的にサイズが大きい細胞の数=1/99)であった。
上記の結果から、凍結-解凍処理により羊膜MSCの生存率が低下したこと、また、この生存率の低下は相対的にサイズが大きい細胞(直径の大きな細胞)の死滅に起因することが分かった。
(方法)
凍結-解凍処理後の羊膜MSCを、以下のようにして培養した。融解した細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、10%FBSを含むαMEMにて懸濁した。得られた細胞細胞懸濁液の一部をプラスチック製培養容器に播種し、10%FBSを含むαMEMにてコンフルエント率90%以上95%以下になるまで培養した。この培養により取得した細胞を本培養1細胞と称す。
接着している本培養1細胞を、EDTAにて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、10%FBSを含むαMEMにて懸濁した。得られた細胞細胞懸濁液の一部を、6300cm2(総培養表面積)のプラスチック製培養容器に播種し、10%FBSを含むαMEMにてコンフルエント率90%以上95%以下になるまで培養した。この継代及び培養により取得した細胞を継代1細胞と称す。EDTA-トリプシン処理及び遠心分離により、継代1細胞を回収した。
本培養1細胞及び継代1細胞の一部を採取し、トリパンブルーにて染色し、血球計算盤を用いて細胞の数及び生存率を計測した。Cellular Senescence Detection Kit(SA-β-Gal Staining)(Cell Biolabs社)を用いて、本培養1細胞及び継代1細胞の細胞老化アッセイを行った。また、本培養1細胞及び継代1細胞の一部を採取し、標識抗体にて4℃にて15分間染色した後、死細胞除去のためヨウ化プロピジウム(Propidium Iodide)又は7-AAD(7-Amino-Actinomycin D)を添加し、フローサイトメーター(FACSCanto:BD社)を用いて表面抗原を解析した。上記の標識抗体として、抗CD90-FITC抗体(BD社)、抗CD105-FITC抗体(Ancell社)、抗CD73-PE抗体(BD社)、抗CD106-PE抗体(Miltenyi Biotec社)、抗CD324-PE抗体(BD社)、抗CD326-FITC抗体(BD社)、抗CD45-FITC抗体(BD社)、抗CD34-PE抗体(BD社)及び抗HLA-DR-FITC抗体(BD社)を用いた。細胞集団におけるCD106陽性である間葉系幹細胞の比率は、以下の手順(1)~(3)にて算出した。
(1)測定結果を、縦軸に細胞数、横軸を抗体に標識された色素の蛍光強度としたヒストグラムで展開した。
(2)アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が0.1~1.0%となる蛍光強度を決定した。
(3)CD106に対する抗体で測定した総細胞のうち、上記(2)で決定した蛍光強度よりも蛍光強度が高い細胞の割合を算出した。
凍結-解凍処理後の細胞(本培養1細胞及び継代1細胞)は、コンフルエント率90%以上95%以下に達するまでの日数がそれぞれ10日、11日であった。これらの場合、本培養1細胞の比増殖速度は0.20(1/day)、継代1細胞の比増殖速度は0.19(1/day)であった(表2)。このことから、凍結-解凍処理された羊膜MSCの比増殖速度は非常に高いことが分かった。以上の結果は、相対的にサイズが小さい羊膜MSCは比増殖速度が高い羊膜MSC(すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜MSC)であることを示している。また、得られた継代1細胞の細胞数は2.0×108個であった。このことから、培養1バッチあたり2.9×103(個/cm2/day)の細胞(継代1細胞)が得られたことが分かる。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜MSCを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
凍結-解凍処理を行っていない羊膜MSC(前培養2細胞)は、コンフルエントの状態において、ほとんど全ての細胞が、長軸の長さが78.4±25.3μm(すなわち、長軸の平均長さ78.4μm)が、短軸の長さが22.8±6.0μm(すなわち、短軸の平均長さ22.8μm)の細胞(長軸・短軸の大きな細胞、すなわち、相対的にサイズが大きい細胞)であった(表3)。尚、前述したように、この前培養2細胞における、相対的にサイズが小さい細胞の含有率は1%である。
一方、凍結-解凍処理の後、コンフルエントになるまで培養した細胞(本培養1細胞)は、前記の相対的にサイズが大きい細胞だけでなく、長軸の長さが30.1±13.6μm(すなわち、長軸の平均長さ30.1μm)、短軸の長さが8.7±2.5μm(すなわち、短軸の平均長さ8.7μm)の細胞(長軸・短軸の小さな細胞、すなわち、相対的にサイズが小さい細胞)が含まれていた(表3)。尚、本培養1細胞における相対的にサイズが小さい細胞の含有率は90%(すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数/相対的にサイズが大きい細胞の数=90/10)であり、継代1細胞における相対的にサイズが小さい細胞の含有率は98%(すなわち、相対的にサイズが小さい細胞の数/相対的にサイズが大きい細胞の数=98/2)であった。
以上の結果から、凍結-解凍処理により相対的にサイズが大きい細胞の増殖性(比増殖速度)が著しく低下したため、培養において相対的にサイズが大きい細胞が増殖せず、主として、相対的にサイズが小さい細胞が増殖したことが分かる。
比増殖速度が高い羊膜MSC(相対的に増殖能が高い羊膜MSC)を、以下の一連の工程2-1から工程2-8により取得した。
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液(Ca・Mg不含有)にて2回洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
羊膜1gあたりに、300CDU/mL精製コラゲナーゼ及び200PU/mLディスパーゼIを含有するハンクス平衡塩溶液(Ca・Mg含有)を5mL添加し、37℃にて90分間、60rpmの条件にて震盪攪拌した。羊膜の酵素処理物を、2倍量の10%FBSを含むαMEMにて懸濁した。得られた細胞懸濁液をナイロンメッシュフィルター(ポアサイズ:100μm)を用いて濾過し、羊膜MSCを含む濾液を回収した。得られた濾液を400xgにて5分間遠心し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、10%FBSを含むαMEMにて懸濁し、細胞懸濁液を取得した。
羊膜の酵素処理物から得られた細胞集団を、1890cm2(総培養表面積)のプラスチック製培養容器に播種し、10%FBSを含むαMEMにてコンフルエント率90%以上95%以下になるまで培養した。
工程2-3にて得られた接着状態の細胞に、EDTA-トリプシンを処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、10%FBSを含むαMEMにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の全量を、6300cm2(総培養表面積)のプラスチック製培養容器に播種し、10%FBSを含むαMEMにてコンフルエント率90%以上95%以下になるまで培養した。
工程2-4にて得られた接着状態の細胞に、EDTA-トリプシンを処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、10%FBSを含むαMEMにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の全量を、2.5m2(総培養表面積)のプラスチック製培養容器に播種し、10%FBSを含むαMEMにてコンフルエント率90%以上95%以下になるまで培養した。
工程2-5にて得られた接着状態の細胞に、EDTA-トリプシンを処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、0.5%(w/v)ヒト血清アルブミン(HSA)を含むRPMI1640培地にて2.0×107個/mL以下となるように懸濁した。12%(w/v)HES、10%(w/v)DMSO及び8%(w/v)HSAを含む凍結用保存液を調製した。細胞懸濁液と凍結用保存液とを氷上で等量混合し、4個の凍結用バッグに分注した。プログラムフリーザーを用いて、凍結用バッグを-2℃/分以上-1℃/分以下の速度で-40℃まで冷却し、続いて-10℃/分の速度で-90℃まで冷却した後、-150℃の超低温冷凍庫内にて14日間凍結保存した。凍結保存した4個の凍結用バッグのうち1個を37℃恒温槽に浸し、急速に融解した。
(方法)
工程2-6にて得られた融解した細胞懸濁液(凍結用バッグ1個分)を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、10%FBSを含むαMEMにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の全量を、2.5m2(総培養表面積)のプラスチック製培養容器に播種し、10%FBSを含むαMEMにてコンフルエント率90%以上95%以下になるまで培養した。EDTA-トリプシン処理及び遠心分離により、細胞(比増殖速度が高い羊膜MSCを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜MSCを含む細胞集団)を回収した。
工程2-7にて得られた細胞の数は7.6×108個であった。また、本工程において、細胞を播種してからコンフルエント率90%以上95%以下に達するまでの培養日数は10日であった。これらの結果から、培養1バッチあたり3.0×103(個/cm2/day)の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は0.14(1/day)であった。また、得られた羊膜MSCは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜MSCを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
(方法)
工程2-7にて得られた細胞の全量を、10.1m2(総培養表面積)のプラスチック製培養容器に播種し、10%FBSを含むαMEMにてコンフルエント率90%以上95%以下になるまで培養した。EDTA-トリプシン処理及び遠心分離により、細胞(比増殖速度が高い羊膜MSCを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜MSCを含む細胞集団)を回収した。
工程2-8にて得られた細胞の数は3.0×109個であった。また、本工程において、細胞を播種してからコンフルエント率90%以上95%以下に達するまでの培養日数は9日であった。これらの結果から、培養1バッチあたり3.3×103(個/cm2/day)の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は0.15(1/day)であった。また、得られた羊膜MSCは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜MSCを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
比増殖速度が高い羊膜MSC(相対的に増殖能が高い羊膜MSC)を、以下の一連の工程3-1から工程3-9により取得した。
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液(Ca・Mg不含有)にて2回洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
(方法)
羊膜1gあたりに、300CDU/mL精製コラゲナーゼ及び200PU/mLディスパーゼIを含有するハンクス平衡塩溶液(Ca・Mg含有)を5mL添加し、37℃にて90分間、60rpmの条件にて震盪攪拌した。羊膜の酵素処理物を、2倍量の10%FBSを含むαMEMにて懸濁した。得られた細胞懸濁液をナイロンメッシュフィルター(ポアサイズ:100μm)を用いて濾過し、羊膜MSCを含む濾液を回収した。ナイロンメッシュフィルター上に残留した未消化の羊膜をヘマトキシリン・エオジン(HE)染色にて評価した。得られた濾液を、400xgにて5分間遠心し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、10%FBS及び1×Antibiotic-Antimycotic(Thermo Fisher Scientific社製)を含むαMEMにて懸濁し、細胞懸濁液を取得した。得られた細胞懸濁液の一部にチュルク染色液を混合し、細胞数を測定した。濾液から回収した羊膜MSCは、標識抗体にて4℃にて15分間染色した後、死細胞除去のためヨウ化プロピジウム(Propidium Iodide)又は7-AAD(7-Amino-Actinomycin D)を添加し、フローサイトメーター(FACSCanto:Becton,Dickinson and Company、日本BD社(以下、BD社と略す))を用いて表面抗原を解析した。標識抗体は、抗CD90-FITC抗体(BD社)を用いた。
ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色の結果、フィルター上に残留した羊膜は上皮細胞層が消化されずに保たれており、上皮細胞層内に多数の上皮細胞が存在していることが分かった。また、フィルター上に残留した羊膜はその細胞外基質層が消化されており、フィルター上に羊膜MSCは確認されなかった。これは、羊膜の細胞外基質層を標的とし、かつ羊膜の上皮細胞層を標的としないコラゲナーゼ及びディスパーゼを採用したことにより、上皮細胞をほとんど含有しない濾液が回収されたことを示している。
羊膜の酵素処理物から得られた細胞集団の一部を150cm2のプラスチック製培養容器に播種し、10%FBS及び1×Antibiotic-Antimycoticを含むαMEMにて3日間培養した。
工程3-3にて得られた接着状態の細胞に、TrypLE Select(1×)(Thermo Fisher Scientific社製)を処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、10%FBS及び1×Antibiotic-Antimycoticを含むαMEMにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の一部を150cm2のプラスチック製培養容器に播種し、10%FBS及び1×Antibiotic-Antimycoticを含むαMEMにて7日間培養した。
(方法)
工程3-4にて得られた接着状態の細胞に、TrypLE Select(1×)(Thermo Fisher Scientific社製)を処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、10%FBS及び1×Antibiotic-Antimycoticを含むαMEMにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の一部を150cm2のプラスチック製培養容器に播種し、10%FBS及び1×Antibiotic-Antimycoticを含むαMEMにて8日間培養した。この前培養により取得した細胞を前培養3細胞と称す。前培養3細胞を、以降の試験に用いた。
8日間の培養の後、前培養3細胞は6.7×103個/cm2得られた。この場合、前培養3細胞の比増殖速度は0.11(1/day)であった。
(方法)
工程3-5にて得られた接着状態の細胞(前培養3細胞)に、TrypLE Select(1×)を処理し、プラスチック製培養容器から細胞を剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、0.5%(w/v)ヒト血清アルブミン(HSA)を含むRPMI1640培地にて2.0×106個/mLとなるように懸濁した。12%(w/v)HES、10%(w/v)DMSO及び8%(w/v)HSAを含む凍結用保存液を調製した。細胞懸濁液と凍結用保存液とを氷上で等量混合し、クライオチューブに分注した。プログラムフリーザーを用いて、クライオチューブを-2℃/分以上-1℃/分以下の速度で-40℃まで冷却し、続いて-10℃/分の速度で-90℃まで冷却した後、-150℃の超低温冷凍庫内にて30日間凍結保存した。凍結保存したクライオチューブを37℃恒温槽に浸し、急速に融解した。融解した細胞懸濁液の一部を採取し、トリパンブルーにて染色し、血球計算盤を用いて細胞の数、生存率及び大きさを計測した。
凍結-解凍処理直後の浮遊状態の羊膜MSCの直径は、22.2±5.0μm(すなわち、平均直径22.2μm)であった。
(方法)
工程3-6にて得られた融解した細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、10%FBS及び1×Antibiotic-Antimycoticを含むαMEMにて懸濁した。得られた細胞懸濁液の一部を150cm2のプラスチック製培養容器に播種し、10%FBS及び1×Antibiotic-Antimycoticを含むαMEMにて7日間培養した。TrypLE Select(1×)処理及び遠心分離により、細胞(比増殖速度が高い羊膜MSCを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜MSCを含む細胞集団)を回収した。この工程により取得した細胞を本培養1細胞と称す。
工程3-7にて得られた本培養1細胞の数は2.2×106個であった。この結果から、培養1バッチあたり2.1×103(個/cm2/day)の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は0.21(1/day)であった。また、得られた羊膜MSCは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜MSCを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
(方法)
工程3-7にて得られた本培養1細胞の一部を、播種密度が6.0×103個/cm2となるように150cm2のプラスチック製培養容器に播種し、10%FBS及び1×Antibiotic-Antimycoticを含むαMEMにて5日間培養した。TrypLE Select(1×)処理及び遠心分離により、細胞(比増殖速度が高い羊膜MSCを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜MSCを含む細胞集団)を回収した。この工程により取得した細胞を継代1細胞と称す。
工程3-8にて得られた継代1細胞の数は4.6×106個であった。この結果から、培養1バッチあたり4.4×103(個/cm2/day)の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は0.32(1/day)であった。また、得られた羊膜MSCは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜MSCを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
(方法)
工程3-8にて得られた継代1細胞の一部を、播種密度が2.5×103個/cm2となるように150cm2のプラスチック製培養容器に播種し、10%FBS及び1×Antibiotic-Antimycoticを含むαMEMにて6日間培養した。TrypLE Select(1×)処理及び遠心分離により、細胞(比増殖速度が高い羊膜MSCを含む細胞集団、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜MSCを含む細胞集団)を回収した。この工程により取得した細胞を継代2細胞と称す。
Cellular Senescence Detection Kit(SA-β-Gal Staining)(Cell Biolabs社)を用いて、前培養3細胞及び継代2細胞の細胞老化アッセイ(細胞染色)を行った。また、本培養1細胞、継代1細胞及び継代2細胞の一部を採取し、標識抗体にて4℃にて15分間染色した後、死細胞除去のためヨウ化プロピジウム(Propidium Iodide)又は7-AAD(7-Amino-Actinomycin D)を添加し、フローサイトメーター(FACSCanto:BD社)を用いて表面抗原を解析した。上記の標識抗体として、抗CD90-FITC抗体(BD社)、抗CD105-FITC抗体(Ancell社)、抗CD73-PE抗体(BD社)、抗CD106-PE抗体(Miltenyi Biotec社)、抗CD324-PE抗体(BD社)、抗CD326-FITC抗体(BD社)、抗CD45-FITC抗体(BD社)、抗CD34-PE抗体(BD社)及び抗HLA-DR-FITC抗体(BD社)を用いた。細胞集団における特定の発現マーカー(CD106、CD90)について陽性である間葉系幹細胞の比率は、以下の手順(1)~(3)にて算出した。
(1)測定結果を、縦軸に細胞数、横軸を抗体に標識された色素の蛍光強度としたヒストグラムで展開した。
(2)アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が0.1~1.0%となる蛍光強度を決定した。
(3)特定の発現マーカー(CD106、CD90)に対する抗体で測定した総細胞のうち、上記(2)で決定した蛍光強度よりも蛍光強度が高い細胞の割合を算出した。
工程3-9にて得られた継代2細胞の数は3.9×106個であった。この結果から、培養1バッチあたり3.7×103(個/cm2/day)の細胞が得られたことが分かる。尚、得られた細胞の比増殖速度は0.39(1/day)であった。また、得られた羊膜MSCは、細胞製剤化に好適な生細胞であった。以上の結果は、細胞製剤化に必要な羊膜MSCを大量かつ迅速に調製・製造しうることを示している。
以下の工程4-1から工程4-3により、比増殖速度の異なる羊膜MSCの遺伝子発現の比較解析を行った。
(方法)
実施例3の工程3-5にて得られた接着状態の前培養3細胞(比増殖速度:0.11(1/day))と、実施例3の工程3-9にて得られた接着状態の継代2細胞(比増殖速度:0.39(1/day))を、セルスクレーパー(コーニング社製)を用いてプラスチック製培養容器から剥離し、遠心分離により回収した。得られた細胞ペレットにRNAlater(Thermo Fisher Scientific社製)を添加してRNAを安定保存した後、RNeasy Plus Miniキット(QIAGEN社製)を用いてトータルRNAを抽出、精製した。
LabChipキット及びアジレント2100バイオアナライザーによる泳動パターン解析の結果、いずれのRNAサンプルにおいても明瞭な2本のリボソームRNA(18SrRNA、28SrRNA)のピークが検出された。また、分光光度計NanoDrop(Thermo Fisher Scientific社製)を用いた定量の結果、いずれのRNAサンプルもA260/A280比が1.8から2.1の間の値であった。以上より、両RNAサンプルはアレイ解析用サンプルとして適切な純度であることが確認された。
(方法)
100ngのトータルRNAから逆転写反応によりcDNAを合成し、cDNAからin vitro transcriptionによりcRNAに転写してビオチン標識を行った(3’IVT PLUS Reagent Kitを使用)。10.0μgの標識cRNAをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Human GeneGenome U133A 2.0 Array(Affymetrix社製)上で16時間のハイブリダイゼーションを行った。GeneChip Fluidics Station 450(Affymetrix社製)にて洗浄、フィコエリスリン染色後、GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix社製)にてスキャンを行い、AGCC(Affymetrix GeneChip Command Console Software)(Affymetrix社製)にて画像解析し、Affymetrix Expression Console(Affymetrix社製)を用いて数値化した。
Affymetrix Expression Consoleで解析したデータにおいて、各サンプルにおけるハウスキーピング遺伝子であるGAPDHのシグナル(3’/5’)比が各々0.98、1.04(理想値である3以下)であったことから、得られたcRNAの品質に問題がないことを確認した。
(方法)
2アレイ分の数値データファイルを、解析ソフトGeneSpring GX(アジレント・テクノロジー社製)を用いて比較解析した。継代2細胞のサンプルでのNormalized値を、コントロールである前培養3細胞のサンプルでのNormalized値で割り算し、商が2以上のプローブを選別することにより2倍以上の発現変動をしている遺伝子(2倍以上のFold Change値を示す遺伝子)を探索した。
継代2細胞と前培養3細胞のメタロチオネインのアイソフォームの遺伝子発現を比較した結果を表4に示す。
比増殖速度が高い羊膜MSCを含有する組成物を調製し、当該組成物を凍結保存及び解凍した後、組成物中の細胞の生存率を計測した。
実施例3の工程3-9にて得られた羊膜MSC(継代2細胞)8.0×106個、デキストラン20mg、DMSO52mg及びヒト血清アルブミン40mgを含有するRPMI1640培地1mLからなる組成物を調製した。組成物をクライオチューブに封入し、―150℃にて7日間凍結状態で保存した。凍結保存した組成物を37℃の恒温槽中にて急速解凍した後、25℃(室温)又は37℃(体温)にて1又は2時間静置した。得られた組成物の一部を採取し、トリパンブルーにて染色した後、血球計算盤を用いて細胞の生存率を計測した。
解凍直後の組成物に含まれる細胞の生存率は96.3±1.2%であった。25℃にて1又は2時間静置した組成物に含まれる細胞の生存率は、それぞれ94.7±1.5%、93.0±1.0%であった。37℃にて1又は2時間静置した組成物に含まれる細胞の生存率は、それぞれ92.7±3.1%、90.3±2.9%であった。以上より、25℃及び37℃のいずれにおいても、少なくとも2時間後まで90%以上の高い細胞生存率を維持できることが確認された。
(細胞製剤化と投与)
実施例2の工程2-8又は実施例3の工程3-9にて得られた羊膜MSC(比増殖速度が高い羊膜MSC、すなわち、相対的に増殖能が高い羊膜MSC)の一部を医薬組成物の調製に供した。相対的に増殖能が高い羊膜MSC2.3×108個、HES又はデキストラン0.50g、DMSO1.3g及びヒト血清アルブミン1.0gを含有するRPMI1640培地25mLからなる医薬組成物(細胞製剤)を調製した。当該医薬組成物を凍結用バッグに封入し、凍結状態で保存した。
医薬組成物を使用する際には、まず、凍結保存した医薬組成物を37℃にて急速解凍した後、解凍した医薬組成物を生理食塩水にて希釈する。次に、希釈した組成物中の細胞が均一に分散するよう穏やかに混ぜながら、静脈内注射、点滴静脈注射又は局所への直接注射により医薬組成物を患者に投与することができる。
Claims (25)
- 間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、
増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激又は化学的刺激により処理することによって、相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞を選別する選別工程を含み、
選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞が、CD106陰性であり、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が前記物理的刺激又は化学的刺激による処理前よりも増加していることを特徴とする、前記細胞集団の製造方法。 - 前記増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激により処理することが、前記細胞集団を凍結した後に解凍することである、請求項1に記載の細胞集団の製造方法。
- 前記増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激により処理することが、前記細胞集団を凍結保存液に懸濁し、得られた懸濁液を凍結して凍結状態を維持し、解凍する工程を含む、請求項1又は2に記載の細胞集団の製造方法。
- 前記凍結状態を2日間以上維持する、請求項3に記載の細胞集団の製造方法。
- 前記選別工程で得られた間葉系幹細胞を含む細胞集団を、培養及び/又は継代する工程をさらに含む、請求項1から4の何れか一項に記載の細胞集団の製造方法。
- 胎児付属物を酵素処理することにより、増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得する細胞集団取得工程をさらに含む、請求項1から5の何れか一項に記載の細胞集団の製造方法。
- 前記細胞集団取得工程で得られた細胞集団を培養する工程をさらに含む、請求項6に記載の細胞集団の製造方法。
- 前記メタロチオネインファミリー遺伝子が、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X及びMT2Aからなる群から少なくとも1種選択される、請求項1から7の何れか一項に記載の細胞集団の製造方法。
- 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞が、SA-β-Gal陰性である、請求項1から8の何れか一項に記載の細胞集団の製造方法。
- 前記細胞集団において、SA-β-Gal陰性である前記間葉系幹細胞の平均比率が90%以上である請求項9に記載の細胞集団の製造方法。
- 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞が、CD105陽性、CD73陽性、CD90陽性、CD45陰性、CD34陰性、CD11b陰性、CD79alpha陰性、及びHLA-DR陰性である、請求項1から10の何れか一項に記載の細胞集団の製造方法。
- 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞の比増殖速度が、0.14(1/day)以上である、請求項1から11の何れか一項に記載の細胞集団の製造方法。
- 前記選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径が、相対的に増殖能が低い間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径の80%以下である、請求項1から11の何れか一項に記載の細胞集団の製造方法。
- CD106陰性であり、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加している、間葉系幹細胞。
- 前記メタロチオネインファミリー遺伝子が、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X及びMT2Aからなる群から少なくとも1種選択される、請求項14に記載の間葉系幹細胞。
- 前記間葉系幹細胞が、SA-β-Gal陰性である、請求項14又は15に記載の間葉系幹細胞。
- 前記間葉系幹細胞が、CD105陽性、CD73陽性、CD90陽性、CD45陰性、CD34陰性、CD11b陰性、CD79alpha陰性、及びHLA-DR陰性である、請求項14から16の何れか一項に記載の間葉系幹細胞。
- 前記間葉系幹細胞の比増殖速度が、0.14(1/day)以上である、請求項14から17の何れか一項に記載の間葉系幹細胞。
- 前記間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径が、相対的に増殖能が低い間葉系幹細胞の浮遊状態での平均直径の80%以下である、請求項14から18の何れか一項に記載の間葉系幹細胞。
- 間葉系幹細胞を含む細胞集団であって、
前記間葉系幹細胞が、物理的刺激又は化学的刺激による処理前の細胞より、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が増加しており、且つ、CD106陰性である、前記細胞集団。 - 前記細胞集団において、CD106陽性である前記間葉系幹細胞の比率が5%未満である、請求項20に記載の細胞集団。
- 前記細胞集団において、SA-β-Gal陰性である前記間葉系幹細胞の平均比率が90%以上である、請求項20又は21に記載の細胞集団。
- 請求項14から19の何れか一項に記載の間葉系幹細胞あるいは請求項20から22の何れか一項に記載の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
- ヒトへの間葉系幹細胞の1回の投与量が109個/kg体重以下である、請求項23に記載の医薬組成物。
- 免疫関連疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、膠原病、放射線腸炎、肝硬変、脳卒中、又はアトピー性皮膚炎から選択される疾患の治療剤である、請求項23又は24に記載の医薬組成物。
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