WO2024019063A1 - 間葉系幹細胞の製造方法 - Google Patents

間葉系幹細胞の製造方法 Download PDF

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mesenchymal stem
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泉 小椋
健太郎 中村
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing mesenchymal stem cells that maintain undifferentiated property.
  • Mesenchymal stem cells are somatic stem cells derived from mesodermal tissue (mesenchymal tissue) and have the ability to differentiate into cells belonging to the mesenchymal system. Mesenchymal stem cells are expected to be applied to regenerative medicine such as reconstruction of bones, blood vessels, or myocardium.
  • Patent Document 1 describes a container for stem cell culture, which is a scaffold material for culturing stem cells, which is provided with a resin membrane containing a synthetic resin in at least a part of the stem cell culture area.
  • Patent Document 2 discloses that stem cells adhered to the culture container are grown in a culture container containing a liquid medium, and the grown stem cells are removed from the culture container using a stripping solution that does not contain a proteolytic enzyme but contains at least a chelating agent.
  • a method for culturing stem cells is described. Note that the adherent cell dish (manufactured by TruLine, model number TR4002, diameter 10 cm, made of polystyrene) used in Comparative Example 1 of Patent Document 2 has its surface subjected to corona treatment (hydrophilic treatment).
  • An object of the present invention is to provide a method for producing mesenchymal stem cells that can produce large quantities of mesenchymal stem cells that maintain undifferentiated properties.
  • the present inventors conducted intensive studies to solve the above problems, and found that when mesenchymal stem cells are cultured in a culture vessel in which the water contact angle of the bottom surface in contact with the cells is 70° or more, the mesenchymal stem cells are We have found that the undifferentiated nature of mesenchymal stem cells can be maintained even after being passaged several times.
  • the present invention was completed based on the above findings.
  • ⁇ 1> Cultivating mesenchymal stem cells in a culture vessel in which the water contact angle of the bottom surface in contact with the cells is 70° or more, and passage of the mesenchymal stem cells two or more times.
  • ⁇ 2> The manufacturing method according to ⁇ 1>, wherein the culture container is a culture container of 0.6 L or more.
  • ⁇ 3> The manufacturing method according to ⁇ 2>, wherein the culture container is a multilayer flask.
  • ⁇ 4> The manufacturing method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the mesenchymal stem cells are synovial mesenchymal stem cells or bone marrow mesenchymal stem cells.
  • ⁇ 5> The manufacturing method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the culture container is made of polystyrene.
  • ⁇ 6> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the culture is performed in the absence of a ROCK inhibitor.
  • ⁇ 7> The manufacturing method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the mesenchymal stem cells are passaged five or more times.
  • ⁇ 8> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the culture is performed until PDL, which is the population doubling value after the start of culture, reaches 5 or more.
  • ⁇ 9> Any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, in which the relative expression level of Meflin during the culture period is maintained at 0.40 or more when the expression level of Meflin at the first passage is 1.
  • the manufacturing method described in. ⁇ 10> The manufacturing method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the mesenchymal stem cells to be manufactured are cells for cell therapy.
  • the cells for cell therapy are cells for allogeneic therapy.
  • mesenchymal stem cells that maintain undifferentiated properties can be produced in large quantities.
  • FIG. 1 shows changes in Meflin expression over time in synovial MSCs cultured in a cell culture container (comparative example).
  • FIG. 2 shows changes in Meflin expression over time in bone marrow MSCs cultured in a cell culture container (comparative example).
  • FIG. 3 shows cell proliferation over time of synovial MSCs cultured in a cell culture container (comparative example).
  • FIG. 4 shows changes in Meflin expression over time in synovial MSCs cultured in a polystyrene culture vessel (Example).
  • FIG. 5 shows changes in Meflin expression over time in bone marrow MSCs cultured in a polystyrene culture vessel (Example).
  • FIG. 6 shows cell proliferation over time of synovial MSCs cultured in a polystyrene culture vessel (Example).
  • a numerical range indicated using " ⁇ " means a range that includes the numerical values listed before and after " ⁇ " as the minimum and maximum values, respectively.
  • the method for producing mesenchymal stem cells of the present invention includes culturing mesenchymal stem cells in a culture vessel in which the bottom surface in contact with the cells has a water contact angle of 70° or more, and passage of the mesenchymal stem cells two or more times. Including.
  • mesenchymal stem cells have been cultured using culture vessels whose culture surfaces have been treated with hydrophilic treatment to increase cell adhesion.
  • the undifferentiated marker (Meflin) when mesenchymal stem cells were cultured in a culture vessel made of polystyrene without surface treatment, even after being passaged multiple times and cultured for a long period of time, the undifferentiated marker (Meflin) remained unchanged as in the conventional method. It was possible to culture without decreasing the expression level of . That is, it was found that the method of the present invention allows culturing for 5 or more passages while maintaining the expression of the undifferentiated marker.
  • ROCK-Inhibitor (Y27632) is added during culture, but the method of the present invention does not require ROCK-Inhibitor.
  • mesenchymal stem cells that maintain undifferentiated properties can be produced in large quantities. That is, according to the present invention, it is possible to culture cells that maintain undifferentiated state for a long period of time, thereby making it possible to easily produce large quantities of cells for cell therapy products. Therefore, mesenchymal stem cells produced by the production method of the present invention can be used in industries such as cell therapy that require large amounts of cells.
  • Stem cells refer to immature cells that have the ability to self-renew and differentiate and proliferate. Depending on their differentiation ability, they are classified into pluripotent stem cells, multipotent stem cells, and unipotent stem cells ( unipotent stem cell), etc.
  • stem cells are generally defined as undifferentiated cells that have “self-renewal ability” that allows them to proliferate while maintaining an undifferentiated state, and "pluripotency” that allows them to differentiate into all three germ layer lineages.
  • Pluripotent stem cells refer to cells that have the ability to differentiate into all tissues and cells that make up a living body.
  • Multipotent stem cells refer to cells that have the ability to differentiate into multiple types of tissues and cells, although not all types.
  • Unipotent stem cells refer to cells that have the ability to differentiate into specific tissues or cells.
  • Mesenchymal stem cells are broadly defined as a population of stem cells or their precursor cells that can differentiate into all or some of the mesenchymal cells such as osteoblasts, chondroblasts, and lipoblasts. means.
  • mesenchymal stem cells are not particularly limited, and examples include rodents such as rats, mice, hamsters, and guinea pigs, lagomorphs such as rabbits, ungulates such as pigs, cows, goats, and sheep, dogs, cats, etc.
  • the cells may be cells of primates such as cats, humans, monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, and chimpanzees.
  • the mesenchymal stem cells are human mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells are preferably cells derived from synovium, bone marrow, fat, umbilical cord, dental pulp, fetal-derived compositions, or induced pluripotent stem cells.
  • the mesenchymal stem cells are more preferably synovial mesenchymal stem cells or bone marrow mesenchymal stem cells.
  • mesenchymal stem cells are cultured in a culture vessel in which the bottom surface in contact with the cells has a water contact angle of 70° or more.
  • a culture vessel in which the bottom surface in contact with the cells has a water contact angle of 70° or more.
  • set a contact angle meter PG-X (Matsubo) on the cut out base material and measure the static contact angle using the liquid dripping method. It is possible to analyze and obtain measured values using PG software ver.3.1.
  • the water contact angle of the bottom surface in contact with cells may be 70° or more, but may also be 75° or more, 80° or more, 85° or more, or 90° or more.
  • the upper limit of the water contact angle of the bottom surface in contact with cells is not particularly limited, but is generally 100° or less.
  • the bottom surface of the culture container that comes into contact with the cells is not subjected to hydrophilic treatment (for example, corona treatment, etc.).
  • hydrophilic treatment for example, corona treatment, etc.
  • the water contact angle of the bottom surface in contact with cells is generally less than 70°.
  • the material of the culture container is not particularly limited as long as the water contact angle of the bottom surface in contact with the cells is 70° or more, but for example, polystyrene, polypropylene, polyethylene, etc. can be used, and among the above, polystyrene is particularly preferred. preferable.
  • the culture container is preferably a culture container for mass culture, for example, preferably a culture container of 0.6 L (liter) or more.
  • the capacity of the container may be 1.0L or more, 10L or more, 50L or more, or 100L or more.
  • the upper limit of the capacity of the container is not particularly limited, but is generally 5000 L or less.
  • the form of the culture container is not particularly limited as long as it is capable of culturing mesenchymal stem cells, but may include a flask (for example, a multilayer flask), a tissue culture flask, a dish, a petride, a tissue culture dish, Examples include multidish, microplate, microwell plate, multiplate, multiwell plate, microslide, chamber slide, petri dish, tube, tray, culture bag, and roller bottle.
  • the culture container may be cell-adhesive or non-cell-adhesive, and is appropriately selected depending on the purpose.
  • Mesenchymal stem cells can be cultured using a medium suitable for culturing mesenchymal stem cells.
  • the culture medium described in JP 2021-040551 is Essential amino acids (histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan and valine); Non-essential amino acids, etc.
  • biotin vitamin B12, and at least one other vitamin
  • Inorganic salts such as one or more selected from the group consisting of calcium chloride, magnesium sulfate, potassium chloride, sodium bicarbonate, sodium chloride, and sodium dihydrogen phosphate
  • At least one of saccharides and pyruvate Lipoic acid; Ascorbic acid derivatives (ascorbic acid-2-phosphate, trisodium ascorbic acid-2-phosphate, ascorbic acid-2-phosphate magnesium salt, and ascorbic acid-2-glycoside);
  • the medium may further contain phenol red.
  • the medium may be a serum-containing medium or a serum-free medium.
  • the lower limit of the amount of serum in the serum-containing medium is preferably 2% by volume or more, more preferably 5% by volume or more, and even more preferably 10% by volume or more.
  • the upper limit is generally 20% by volume or less.
  • Serum includes animal-derived serum. Although not particularly limited, serum derived from mammals (eg, fetal bovine serum, human serum, etc.) is preferred.
  • the medium may contain a serum substitute.
  • Serum replacements include growth factors, but other examples include albumin, lipid-rich albumin and albumin replacements such as recombinant albumin, vegetable starches, dextrans, protein hydrolysates, transferrin or other iron transporters. Examples include body fat, fatty acids, insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thioglycerol, or equivalents thereof.
  • Specific examples of serum substitutes include those prepared by the method described in International Publication No. WO 98/30679, commercially available knockout Serum Replacement (KSR), and chemically defined Lipid concentrated (LifeTec). hnologies) and Glutamax ( Life Technologies, Inc.).
  • the medium may further contain a growth factor.
  • growth factors include basic fibroblast growth factor.
  • the medium may further contain an antibiotic.
  • Antibiotics include streptomycin, gentamicin (such as gentamicin sulfate), and penicillin.
  • the medium can contain known additives as necessary.
  • additives include polyamines (for example, putrescine, etc.), reducing agents (for example, 2-mercaptoethanol, etc.), buffers (for example, HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonic acid), etc.), and the like. It will be done.
  • Culture conditions for mesenchymal stem cells can be set as appropriate.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30°C to 40°C, preferably about 37°C.
  • the CO 2 concentration is generally about 1-10%, preferably about 2-5%.
  • mesenchymal stem cells can be cultured in the absence of a ROCK inhibitor (Rho-associated coiled-coil forming kinase inhibitor).
  • ROCK inhibitor Rho-associated coiled-coil forming kinase inhibitor
  • mesenchymal stem cells are passaged two or more times.
  • the number of passages is not particularly limited as long as it is 2 or more times, 3 or more times, 4 or more times, 5 or more times, 6 or more times, 7 or more times, 8 or more times, 9 or more times, 10 or more times, 12 times. 14 or more times, or 16 or more times.
  • the upper limit of the number of passages is not particularly limited, but is generally 100 times or less, and may be 50 times or less.
  • the mesenchymal stem cells can be cultured for a long period of time (10 days or more, 14 days or more, 20 days or more, 25 days or more) while maintaining the undifferentiated nature of mesenchymal stem cells. It is possible to culture mesenchymal stem cells (for at least 30 days, at least 35 days, at least 40 days, or at least 50 days), thereby making it possible to obtain a large amount of mesenchymal stem cells.
  • Passage of mesenchymal stem cells can be performed by a conventional method. Specifically, after culturing cells, the culture supernatant is aspirated and the culture surface is washed with an appropriate buffer. Thereafter, it is treated with an enzyme for cell detachment such as trypsin (eg, TrypLE® Express (Gibco), etc.). The enzyme treatment is carried out, for example, at 30°C to 45°C, preferably 35°C to 40°C, for example 37°C, for 1 minute to 60 minutes, preferably 1 minute to 20 minutes, more preferably 2 minutes to 10 minutes. be able to. After enzyme treatment and neutralization with a medium, detached cells can be collected, centrifuged, and the supernatant can be aspirated.
  • trypsin eg, TrypLE® Express (Gibco), etc.
  • the enzyme treatment is carried out, for example, at 30°C to 45°C, preferably 35°C to 40°C, for example 37°C, for 1 minute to 60
  • the cell density is, for example, 0.01 to 3.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 , preferably 0.05 to 1.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 , more preferably 0.10 to 0.5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 , particularly preferably 0.15 to 0.3 ⁇ 10 4 cells/cm 2 .
  • culture can be performed until the PDL, which is the population doubling value after the start of culture, becomes preferably 5 or more.
  • the PDL, which is the population doubling value after the start of culture is more preferably 10 or more, 15 or more, 20 or more, or 25 or more.
  • the upper limit of PDL is not particularly limited, but is generally 200 or less, and may be 100 or less.
  • PDL (Population doubling level) is a population doubling value and represents the number of times a cell population has divided so far.
  • the relative expression level of Meflin at the time of the first passage when the expression level of Meflin at the time of the first passage is set to 1, it is preferable that the relative expression level of Meflin is maintained at 0.40 or more during the culture period. Maintaining the relative expression level of Meflin, which is a marker of undifferentiated property of mesenchymal stem cells, at 0.40 or more means that the undifferentiated property of mesenchymal stem cells is maintained. In the present invention, when the expression level of Meflin at the first passage is set to 1, it is more preferable that the relative expression level of Meflin is maintained at 0.50 or more during the culture period.
  • the upper limit of the relative expression level of Meflin is not particularly limited, but is generally 10 or less, and may be 5 or less, 3 or less, or 2 or less.
  • the method for measuring the relative expression level of Meflin is not particularly limited, but for example, RNA is extracted from cells, cDNA is synthesized, and Real- A method of performing Time PCR can be mentioned.
  • mesenchymal stem cells produced by the method of the present invention is not particularly limited, but as an example, they can be used for medical purposes as cells for cell therapy.
  • Mesenchymal stem cells can be used undifferentiated or after being differentiated into bone cells, chondrocytes, adipocytes, etc., depending on the target disease.
  • Target diseases include, for example, nonsynthetic necrosis of the lunate, nonseptic necrosis of the femoral head, intractable osteochondritis, lumbar disc herniation, ischemic heart disease, epidermolysis bullosa, and the like.
  • mesenchymal stem cells can also be used for cosmetic surgery after being differentiated into adipocytes.
  • Cells for cell therapy may be cells for allotherapy or cells for autologous therapy, but are preferably cells for allotherapy.
  • a cell culture supernatant can also be obtained.
  • Cell culture supernatants contain various cytokines (proteins) secreted from mesenchymal stem cells, depending on the type of mesenchymal stem cells, and can be applied to treatment and diagnosis.
  • Extracellular vesicles can be extracted from this cell culture supernatant.
  • Extracellular vesicles include substances secreted from cultured cells. Examples include exosomes secreted from cells, microvesicles from which a part of a cell is separated, apoptotic bodies from dead cells, and the like. These extracellular vesicles can also be used for therapeutic and diagnostic purposes; for example, they can be used in cell medicine, etc., which utilizes the intercellular information transmission function played by exosomes.
  • Human synovial mesenchymal stem cells were commercially available from Articular Engineering, LLC (CCD-H-2910-N).
  • human bone marrow mesenchymal stem cells human bone marrow MSC
  • PT-2501 a commercially available product from Lonza
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • the water contact angle of the cell culture container and polystyrene culture container was measured by the following method.
  • the bottoms of the wells of the cell culture containers and polystyrene containers were cut into approximately 2 cm square pieces using an ultrasonic cutter.
  • a contact angle meter PG-X (Matsubo) was set on the cut out base material, and the static contact angle was measured using the liquid drop method.
  • the measurement values were obtained by analysis using PG software ver.3.1. As a result, the water contact angle of the cell culture container was 45°, and the water contact angle of the polystyrene culture container was 80°.
  • the medium was ⁇ MEM (medium A described in the Examples of JP 2021-040551) with fetal bovine serum (Gibco) (final concentration 20%) and Antibiotic-Antimycotic (Gibco) (final concentration 1%). I used something.
  • the culture supernatant was aspirated, the culture surface was washed twice with DPSB (Gibco), and peeling treatment was performed using TrypLE (registered trademark) Express (Gibco) at 37°C for 5 minutes. After neutralization with a medium, the detached cells were collected, centrifuged, and the supernatant was aspirated. The cells were loosened by tapping, a portion of the cell suspension to which a small amount of medium had been added was taken out, and the number of cells was counted.
  • the synthesized cDNA, 18S or Meflin (ISLR) probe, and TaqMan Gene Expression Master Mix (both Applied Biosystems) were mixed, and Real-Time PCR was performed.
  • the analysis was performed using the ⁇ Ct method.
  • the expression level of the cells collected at the first passage was defined as 1, and the expression level within the range of 0.4 to 2 times that level was defined as the range for maintaining expression.
  • the proliferation ability of MSC was evaluated by calculating the population doubling value (PDL) from the cell count at the time of collection. Specifically, a portion of the cell suspension was extracted, mixed with an equal volume of trypan blue solution (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), injected into a hemocytometer, and counted visually using a microscope.
  • Population doubling value (PDL) represents the number of times cells have divided from seeding to harvest. If the population doubling value maintains linearity with respect to the passage number, it can be determined that the proliferation ability is maintained. If the population doubling value for each passage becomes close to zero and no increase in the population doubling value is observed, it can be determined that the proliferation ability is insufficient.
  • FIG. 1 shows changes in Meflin expression over time in synovial MSCs cultured in a cell culture container (comparative example).
  • Figure 2 shows changes in Meflin expression over time in bone marrow MSCs cultured in a cell culture container (comparative example).
  • Figure 3 shows cell proliferation over time of synovial MSCs cultured in a cell culture container (comparative example).
  • Figure 4 shows changes in Meflin expression over time in synovial MSCs cultured in a polystyrene culture vessel (Example).
  • Figure 5 shows changes in Meflin expression over time in bone marrow MSCs cultured in a polystyrene culture vessel (Example).
  • the expression level of Meflin after 2nd passage of bone marrow MSC was 0.43.
  • Figure 6 shows cell proliferation over time of synovial MSCs cultured in a polystyrene culture container (Example).
  • synovial MSCs When a polystyrene culture container was used, synovial MSCs could be cultured for up to 16 passages while maintaining Meflin expression. In the case of synovial MSCs, the population doubling value (PDL) after 16 passages was 30.0. Furthermore, when a polystyrene culture vessel was used, bone marrow MSCs could be cultured up to 15 passages while maintaining Meflin expression.

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Abstract

間葉系幹細胞の研究および細胞治療においては、大量の細胞数を確保する必要がある。本発明の課題は、未分化性を維持した間葉系幹細胞を大量に製造することができるような間葉系幹細胞の製造方法を提供することである。本発明によれば、細胞と接する底面の水接触角が７０°以上の培養容器において間葉系幹細胞を培養すること、および上記間葉系幹細胞を２回以上継代することを含む、間葉系幹細胞の製造方法が提供される。

Description

間葉系幹細胞の製造方法
　本発明は、未分化性を維持した間葉系幹細胞の製造方法に関する。
　間葉系幹細胞は、中胚葉性組織（間葉組織）に由来する体性幹細胞であり、間葉系に属する細胞への分化能を有している。間葉系幹細胞は、骨、血管又は心筋などの再構築などの再生医療への応用が期待されている。
　間葉系幹細胞などの幹細胞を培養するための培養容器についての検討はこれまでにもなされている。例えば、特許文献１には、幹細胞の培養領域の少なくとも一部に、合成樹脂を含有する樹脂膜を備えている、幹細胞培養用足場材料である幹細胞培養用容器が記載されている。特許文献２には、液体培地が入った培養容器内で、培養容器に接着した幹細胞を増殖させ、増殖させた幹細胞を、タンパク質分解酵素を含まず、少なくともキレート剤を含む剥離液により、培養容器から剥離し、剥離した幹細胞を、液体培地中に懸濁する幹細胞の培養方法であって、培養容器のうち、少なくとも幹細胞が接着する部分が脂環構造含有重合体で形成されていることを特徴とする、幹細胞の培養方法が記載されている。なお、特許文献２の比較例１において使用されている接着細胞用ディッシュ（ＴｒｕＬｉｎｅ社製；型番ＴＲ４００２；直径１０ｃｍ；ポリスチレン製）は、その表面がコロナ処理（親水処理）されているものである。
特開２０１９－１１５３２３号公報 特開２０１８－２０１４０３号公報
　間葉系幹細胞の研究および細胞治療においては、大量の細胞数を確保する必要がある。しかし、大量の間葉系幹細胞を得るために間葉系幹細胞の培養期間を長くすると、培養期間の経過とともに間葉系幹細胞の未分化性が低下するという問題がある。本発明は、未分化性を維持した間葉系幹細胞を大量に製造することができるような間葉系幹細胞の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、細胞と接する底面の水接触角が７０°以上の培養容器において間葉系幹細胞を培養した場合には、間葉系幹細胞を２回以上継代しても、間葉系幹細胞の未分化性を維持できることを見出した。本発明は、上記知見に基づいて完成したものである。
　本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　細胞と接する底面の水接触角が７０°以上の培養容器において間葉系幹細胞を培養すること、および上記間葉系幹細胞を２回以上継代することを含む、間葉系幹細胞の製造方法。
＜２＞　上記培養容器が０．６Ｌ以上の培養容器である、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞　上記培養容器が多層フラスコである、＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞　間葉系幹細胞が、滑膜間葉系幹細胞または骨髄間葉系幹細胞である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の製造方法。
＜５＞　培養容器が、ポリスチレン製である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の製造方法。
＜６＞　ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下において培養を行う、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の製造方法。
＜７＞　間葉系幹細胞を５回以上継代する、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の製造方法。
＜８＞　培養開始後の集団倍加値であるＰＤＬが、５以上になるまで培養する、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の製造方法。
＜９＞　１回目の継代時におけるＭｅｆｌｉｎの発現量を１とした時に、培養期間中におけるＭｅｆｌｉｎの相対発現量が０．４０以上に維持される、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の製造方法。
＜１０＞　製造される間葉系幹細胞が、細胞治療用細胞である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の製造方法。
＜１１＞　上記細胞治療用細胞が他家治療用細胞である、＜１０＞に記載の製造方法。
　本発明による間葉系幹細胞の製造方法によれば、未分化性を維持した間葉系幹細胞を大量に製造することができる。
図１は、細胞培養用容器（比較例）で培養した滑膜ＭＳＣの経時的なＭｅｆｌｉｎの発現変化を示す。 図２は、細胞培養用容器（比較例）で培養した骨髄ＭＳＣの経時的なＭｅｆｌｉｎの発現変化を示す。 図３は、細胞培養用容器（比較例）で培養した滑膜ＭＳＣの経時的な細胞増殖を示す。 図４は、ポリスチレン製培養容器（実施例）で培養した滑膜ＭＳＣの経時的なＭｅｆｌｉｎの発現変化を示す。 図５は、ポリスチレン製培養容器（実施例）で培養した骨髄ＭＳＣの経時的なＭｅｆｌｉｎの発現変化を示す。 図６は、ポリスチレン製培養容器（実施例）で培養した滑膜ＭＳＣの経時的な細胞増殖を示す。
　以下、本開示の実施形態の一例について説明する。但し、本開示は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本開示の目的の範囲内において、適宜、変更を加えて実施することができる。本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
　本発明の間葉系幹細胞の製造方法は、細胞と接する底面の水接触角が７０°以上の培養容器において間葉系幹細胞を培養すること、および上記間葉系幹細胞を２回以上継代することを含む。
　従来においては、間葉系幹細胞の培養は、培養表面を親水処理し細胞接着性を高くした培養容器が用いられている。しかし、従来の間葉系幹細胞の培養法においては細胞の未分化性を維持することができず、５継代程度で未分化マーカー（Ｍｅｆｌｉｎ）の発現量が半減する。本発明においては、表面処理をしていないポリスチレン製の培養容器において間葉系幹細胞を培養したところ、複数回継代し、長期間培養しても、従来法のように未分化マーカー（Ｍｅｆｌｉｎ）の発現量が低下することなく培養することができた。即ち、本発明の方法においては未分化マーカーの発現を維持したまま５継代以上培養できることが判明した。
　また、先行文献である特開２０１９－１１５３２３では、培養時にＲＯＣＫ－Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ２７６３２）を添加しているが、本発明の方法ではＲＯＣＫ－Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを必要としない。
　上記の通り、本発明の方法によれば、未分化性を維持した間葉系幹細胞を大量に製造することができる。即ち、本発明によれば、長期間にわたって未分化性を維持した細胞が培養できることにより、細胞治療製品用の細胞を、簡便に大量に製造することができる。従って、本発明の製造方法により製造される間葉系幹細胞は、細胞医療など大量の細胞が必要となる産業において利用可能である。
　また、通常の細胞培養では表面がコーティングされた培養容器を使用するが、本発明においては、未処理のポリスチレン製の培養容器を使用することにより、コーティングの手間が削減され、低コストでの培養が可能となる。
＜間葉系幹細胞＞
　幹細胞とは、自己複製能および分化増殖能を有する未熟な細胞をいい、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ)、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ)、単能性幹細胞(ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ)等が含まれる。「幹細胞」は、一般に、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と、三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞と定義されている。 多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。 単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞および脂肪芽細胞等の間葉系の細胞の全て又はそのうちの一部の細胞への分化が可能な幹細胞またはその前駆細胞の集団を広義に意味する。
　間葉系幹細胞の由来も特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などの細胞であってもよい。間葉系幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞であることが好ましい。
　また、間葉系幹細胞は、滑膜、骨髄、脂肪、臍帯、歯髄、胎児由来組成物または人工多能性幹細胞のいずれかに由来する細胞であることが好ましい。間葉系幹細胞は、さらに好ましくは、滑膜間葉系幹細胞または骨髄間葉系幹細胞である。
＜培養容器＞
　本発明においては、細胞と接する底面の水接触角が７０°以上の培養容器において間葉系幹細胞を培養する。
　培養容器の細胞と接する底面の水接触角を測定するためには、培養容器の細胞と接する底面（培養容器がwellである場合には、well底面）を超音波カッターなどにより適当なサイズ（例えば、約2cm四方）に切り抜き、切り抜いた基材上に接触角計PG-X（マツボー）をセットし、液適法にて静的接触角を測定する。PG software ver.3.1にて解析し、測定値を得ることができる。
　細胞と接する底面の水接触角は、７０°以上であればよいが、７５°以上、８０°以上、８５°以上、または９０°以上でもよい。細胞と接する底面の水接触角の上限は特に限定されないが、一般的には１００°以下である。
　培養容器の細胞と接する底面は、親水化処理（例えば、コロナ処理など）がされていないことが好ましい。親水化処理（例えば、コロナ処理など）がされている場合には、一般的には、細胞と接する底面の水接触角は７０°未満になる。
　培養容器の素材は、細胞と接する底面の水接触角が７０°以上とすることができる限り特に限定されないが、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンなどを使用することができ、上記の中でもポリスチレンが特に好ましい。
　培養容器は、大量培養用の培養容器であることが好ましく、例えば、０．６Ｌ（リットル）以上の培養容器であることが好ましい。容器の容量は、１．０Ｌ以上、１０Ｌ以上、５０Ｌ以上、又は１００Ｌ以上でもよい。容器の容量の上限は特に限定されないが、一般的には５０００Ｌ以下である。
　培養容器の形態は、間葉系幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、フラスコ（例えば、多層フラスコなどでもよい）、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バッグ、およびローラーボトルなどが挙げられる。
　培養容器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。
＜間葉系幹細胞の培養＞
　間葉系幹細胞の培養は、間葉系幹細胞の培養に適した培地を使用して行うことができる。
　間葉系幹細胞の培養に適した培地としては、通常の動物細胞の培養に用いられる培地を使用することができ、例えば、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２＝１：１）、ＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＲＰＭＩ１６４０培地など）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＲＰＭＩの混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２：ＲＰＭＩ＝１：１）などを挙げることができるが、特に限定されない。
　間葉系幹細胞の培養に適した培地としては、特開２０２１－０４０５５１号公報の実施例に記載の培地Ａを使用することが好ましい。
　特開２０２１－０４０５５１号公報に記載した培地は、
　必須アミノ酸（ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリン）；
　非必須アミノ酸等（グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン類、グルタミン酸、プロリン、セリンおよびチロシンからなる群から選択される一以上のもの）
　ビオチン、ビタミンＢ１２、および少なくとも１種のその他のビタミン類；
　無機塩（塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウムからなる群から選択される一以上など）；
　糖類およびピルビン酸塩のうちの少なくとも１種；
　リポ酸；
　アスコルビン酸誘導体（アスコルビン酸－２－リン酸、アスコルビン酸－２－リン酸エステル三ナトリウム、アスコルビン酸－２－リン酸エステルマグネシウム塩、およびアスコルビン酸－２－グリコシドなど）；
を含む培地であり、さらにフェノールレッドを含んでいてもよい。
　培地としては、血清を含む培地でもよいし、血清を含まない培地でもよい。血清を含有する培地における血清の量は、下限値としては、２体積％以上であることが好ましく、５体積％以上であることがより好ましく、１０体積％以上であることがさらに好ましい。上限値としては、２０体積％以下であることが一般的である。
　血清としては、動物由来の血清が挙げられる。特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来の血清（例えばウシ胎仔血清、ヒト血清等）である。
　培地は、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、増殖因子も含まれるが、そのほかの例としては、アルブミン、脂質リッチアルブミンおよび組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン、タンパク質加水分解物、トランスフェリンまたは他の鉄輸送体、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオグリセロールあるいはこれらの均等物などが挙げられる。血清代替物の具体例としては、例えば、国際公開ＷＯ９８／３０６７９号記載の方法により調製されるものや、市販のｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ社）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などが挙げられる。
　培地は、さらに増殖因子を含んでいてもよい。増殖因子としては、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子が挙げられる。
　培地は、さらに抗生物質を含んでいてもよい。抗生物質としては、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン（ゲンタマイシン硫酸塩など）、ペニシリンなどが挙げられる。
　培地には、必要により、公知の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、ポリアミン類（例えばプトレシン等）、還元剤（例えば２－メルカプトエタノール等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）等）等が挙げられる。
　間葉系幹細胞の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０℃～４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、一般的には約１～１０％であり、好ましくは約２～５％である。
　本発明においては、間葉系幹細胞の培養は、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ（Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤）の非存在下において行うことができる。
＜継代＞
　本発明においては、間葉系幹細胞を２回以上継代する。継代の回数は２回以上であれば特に限定されず、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、７回以上、８回以上、９回以上、１０回以上、１２回以上、１４回以上、または１６回以上でもよい。継代の回数の上限は特に限定されないが、一般的には１００回以下であり、５０回以下でもよい。
　本発明においては、上記の通り継代を２回以上行って培養することにより、間葉系幹細胞の未分化性を維持しながら、長期間（１０日以上、１４日以上、２０日以上、２５日以上、３０日以上、３５日以上、４０日以上、または５０日以上）間葉系幹細胞を培養することが可能であり、これにより多量の間葉系幹細胞を得ることが可能となる。
　間葉系幹細胞の継代は、通常の方法により行うことができる。具体的には、細胞を培養した後、培養上清を吸引し、適当な緩衝液で培養表面を洗浄する。その後、トリプシンなどの細胞剥離のための酵素（例えば、ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）など）により処理する。酵素処理は、例えば、３０℃～４５℃、好ましくは３５℃～４０℃、一例としては３７℃で、１分間から６０分間、好ましくは１分間から２０分間、より好ましくは２分間から１０分間行うことができる。酵素処理後、培地にて中和した後、剥離した細胞を回収し、遠心し、上清を吸引することができる。必要に応じ、得られた細胞の細胞数をカウントした後、培地入りの培養容器に、適当な細胞密度で播種すればよい。細胞密度としては、例えば、０．０１～３.０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、好ましくは０．０５～１.０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、より好ましくは０．１０～０．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、特に好ましくは０．１５～０．３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である。
＜集団倍加値およびＭｅｆｌｉｎの発現量＞
　本発明においては、培養開始後の集団倍加値であるＰＤＬが、好ましくは５以上になるまで培養することができる。培養開始後の集団倍加値であるＰＤＬは、より好ましくは１０以上、１５以上、２０以上、又は２５以上になるまで培養することができる。ＰＤＬの上限は特に限定されないが、一般的には２００以下であり、１００以下でもよい。ＰＤＬ（Population doubling level）とは、集団倍加値であり、細胞集団がこれまでに分裂してきた回数を表したものである。
　本発明においては、１回目の継代時におけるＭｅｆｌｉｎの発現量を１とした時に、培養期間中におけるＭｅｆｌｉｎの相対発現量が０．４０以上に維持されることが好ましい。間葉系幹細胞の未分化性のマーカーであるＭｅｆｌｉｎの相対発現量が０．４０以上に維持されていることは、間葉系幹細胞の未分化性が維持されていることを意味する。本発明においては、１回目の継代時におけるＭｅｆｌｉｎの発現量を１とした時に、培養期間中におけるＭｅｆｌｉｎの相対発現量が０．５０以上に維持されることがさらに好ましい。Ｍｅｆｌｉｎの相対発現量の上限は特に限定されないが、一般的には１０以下であり、５以下、３以下、又は２以下でもよい。
　Ｍｅｆｌｉｎの相対発現量の測定方法は、特に限定されないが、例えば、細胞からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡと、１８ＳまたはＭｅｆｌｉｎのプローブと、ＰＣＲ試薬とを用いて、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲを行う方法を挙げることができる。
＜製造される間葉系幹細胞＞
　本発明の方法により製造される間葉系幹細胞の用途は、特に限定されないが、一例としては、細胞治療用細胞として医療用に使用することができる。間葉系幹細胞は、対象疾患等に応じて、未分化のまま、または骨細胞、軟骨細胞もしくは脂肪細胞等へ分化させた後に、使用することができる。対象疾患としては、例えば、月状骨無腐性壊死、大腿骨頭無腐性壊死、難断性骨軟骨炎、腰椎椎間板ヘルニア、虚血性心疾患、表皮水疱症等が挙げられる。また、間葉系幹細胞は、脂肪細胞へ分化させた後、美容整形用に使用することも可能である。
　細胞治療用細胞は、他家治療用細胞または自家治療用細胞のいずれでもよいが、好ましくは他家治療用細胞である。
　さらに、本発明の製造方法においては、細胞培養上清を得ることもできる。細胞培養上清には、間葉系幹細胞の種類によっては、そこから分泌された様々なサイトカイン（タンパク質）などが含まれており、治療や診断に適用することができる。この細胞培養上清から細胞外小胞を抽出することができる。細胞外小胞は培養した細胞から分泌等された物質が挙げられる。例えば、細胞から分泌されたエクソソーム、細胞の一部が分離したマイクロベシクル、細胞が死滅したアポトーシス小体等が含まれる。この細胞外小胞も治療・診断の目的で利用することができ、例えばエクソソームが担う細胞間での情報伝達機能を利用した細胞医療等への活用が可能である。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜材料および方法＞
（１）細胞の入手
　ヒト滑膜間葉系幹細胞（ヒト滑膜ＭＳＣ）は、Ａｒｔｉｃｕｌａｒ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＬＬＣ社（ＣＣＤ－Ｈ－２９１０－Ｎ）の市販品を使用した。
　ヒト骨髄間葉系幹細胞（ヒト骨髄ＭＳＣ）は、Lonza社（ＰＴ－２５０１）の市販品を使用した。
（２）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養
　凍結したＭＳＣを解凍し、０．１５～０．３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で細胞培養用容器（Ｆａｌｃｏｎ社；＃３５３０４６）またはポリスチレン製培養容器（Ｆａｌｃｏｎ社： ＃３５１１４６）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベータ内で３～４日間培養した。
　細胞培養用容器およびポリスチレン製培養容器の水接触角を、以下の方法により測定した。細胞培養用容器およびポリスチレン容器のwell底面を超音波カッターにて約2cm四方に切り抜いた。切り抜いた基材上に接触角計PG-X（マツボー）をセットし、液適法にて静的接触角を測定した。PG software ver.3.1にて解析し、測定値を得た。その結果、細胞培養用容器の水接触角は４５°であり、ポリスチレン製培養容器の水接触角は８０°であった。
　培地は、αＭＥＭ（特開２０２１－０４０５５１号公報の実施例に記載の培地Ａ）にウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）（最終濃度２０％）およびＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ）（最終濃度１％）を加えたものを使用した。
　培養後、培養上清を吸引し、ＤＰＳＢ（Ｇｉｂｃｏ）で培養表面を２回洗い、ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）による剥離処理を３７℃で５分間行った。培地にて中和した後、剥離した細胞を回収し、遠心し、上清を吸引した。細胞をタッピングによりほぐし、少量の培地を添加した細胞懸濁液の一部を抜き取り、細胞数をカウントした。その結果から計算し、新しく用意した培地入りの細胞培養用容器（Ｆａｌｃｏｎ社；＃３５３０４６）またはポリスチレン製培養容器（Ｆａｌｃｏｎ社： ＃３５１１４６）に０．１５～０．３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、連続継代を行った。また、継代時に余った細胞は、未分化マーカーの発現量評価のため回収し、－８０℃で保存した。
（３）未分化マーカー（Ｍｅｆｌｉｎ）の発現量評価
　継代時に回収した細胞は、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ　ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡを合成した。
　合成したｃＤＮＡと、１８ＳまたはＭｅｆｌｉｎ（ＩＳＬＲ）のプローブ、ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（共にＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を混合し、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲを行った。
　解析は、ΔΔＣｔ法にて行った。
　初回の継代時に回収した細胞の発現量を１とし、その０．４倍～２倍の範囲内の発現量を発現維持の範囲とした。
（４）増殖能の評価
　ＭＳＣの増殖能は、回収時の細胞カウントから集団倍加値（ＰＤＬ）を算出し評価した。具体的には、細胞懸濁液の一部を抜き取り、等量のトリパンブルー溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）と混ぜ、血球計算盤に注入し、顕微鏡を用いて目視でカウントした。
　集団倍加値（ＰＤＬ）は、播種してから回収するまでに細胞が分裂した回数を表す。
　集団倍加値が継代数に対し線形性を保持している場合は、増殖能が維持されていると判断できる。継代毎の集団倍加値がゼロに近くなり、集団倍加値の増加が見られない場合は、増殖能が不十分であると判断できる。
＜結果＞
（１）細胞培養用容器（比較例）で培養した比較例
　細胞培養用容器（比較例）で培養した滑膜ＭＳＣの経時的なＭｅｆｌｉｎの発現変化を図１に示す。
　細胞培養用容器（比較例）で培養した骨髄ＭＳＣの経時的なＭｅｆｌｉｎの発現変化を図２に示す。
　細胞培養用容器（比較例）で培養した滑膜ＭＳＣの経時的な細胞増殖を図３に示す。
　細胞培養用容器を使用した場合、滑膜ＭＳＣについてのＭｅｆｌｉｎの発現を維持した状態での継代数は２であり、継代数３以降は、Ｍｅｆｌｉｎの発現が維持されなかった。また、骨髄ＭＳＣについてのＭｅｆｌｉｎの発現を維持した状態での継代数は３であり、継代数４以降は、Ｍｅｆｌｉｎの発現が維持されなかった。また、滑膜ＭＳＣについて、２継代後の集団倍加値（ＰＤＬ）は４．９であった。
（２）ポリスチレン製培養容器（実施例）で培養した実施例
　ポリスチレン製培養容器（実施例）で培養した滑膜ＭＳＣの経時的なＭｅｆｌｉｎの発現変化を図４に示す。
　ポリスチレン製培養容器（実施例）で培養した骨髄ＭＳＣの経時的なＭｅｆｌｉｎの発現変化を図５に示す。なお、骨髄ＭＳＣの２継代後のＭｅｆｌｉｎの発現レベルは０．４３であった。
　ポリスチレン製培養容器（実施例）で培養した滑膜ＭＳＣの経時的な細胞増殖を図６に示す。
　ポリスチレン製培養容器を使用した場合には、Ｍｅｆｌｉｎの発現を維持した状態で滑膜ＭＳＣを１６継代まで培養できた。滑膜ＭＳＣの場合には、１６継代後の集団倍加値（ＰＤＬ）は３０．０となった。また、ポリスチレン製培養容器を使用した場合には、Ｍｅｆｌｉｎの発現を維持した状態で骨髄ＭＳＣを１５継代まで培養できた。
（３）まとめ
　上記した結果から、ポリスチレン製培養容器での培養は、従来法（細胞培養用容器）と比較し、未分化性を維持したまま継代の回数を増やすことができ、長期間培養することが可能であることが明らかとなった。

Claims (11)

  1. 細胞と接する底面の水接触角が７０°以上の培養容器において間葉系幹細胞を培養すること、および前記間葉系幹細胞を２回以上継代することを含む、間葉系幹細胞の製造方法。
  2. 前記培養容器が０．６Ｌ以上の培養容器である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記培養容器が多層フラスコである、請求項２に記載の製造方法。
  4. 間葉系幹細胞が、滑膜間葉系幹細胞または骨髄間葉系幹細胞である、請求項１から３の何れか一項に記載の製造方法。
  5. 培養容器が、ポリスチレン製である、請求項１から３の何れか一項に記載の製造方法。
  6. ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下において培養を行う、請求項１から３の何れか一項に記載の製造方法。
  7. 間葉系幹細胞を５回以上継代する、請求項１から３の何れか一項に記載の製造方法。
  8. 培養開始後の集団倍加値であるＰＤＬが、５以上になるまで培養する、請求項１から３の何れか一項に記載の製造方法。
  9. １回目の継代時におけるＭｅｆｌｉｎの発現量を１とした時に、培養期間中におけるＭｅｆｌｉｎの相対発現量が０．４０以上に維持される、請求項１から３の何れか一項に記載の製造方法。
  10. 製造される間葉系幹細胞が、細胞治療用細胞である、請求項１から３の何れか一項に記載の製造方法。
  11. 前記細胞治療用細胞が他家治療用細胞である、請求項１０に記載の製造方法。
PCT/JP2023/026332 2022-07-20 2023-07-19 間葉系幹細胞の製造方法 WO2024019063A1 (ja)

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