JP2021040551A - 培地組成物、キット、間葉系幹細胞組成物の製造方法、間葉系幹細胞組成物、間葉系幹細胞、細胞培養上清および細胞外小胞 - Google Patents

Abstract

【課題】特別な装置、機材を用いることなく、より多くの間葉系幹細胞を短期間で増殖させ、細胞の性質の変化を抑制する培地組成物、これを含むキット、これを用いた間葉系幹細胞組成物の製造方法、間葉系幹細胞組成物、間葉系幹細胞、細胞培養上清、細胞外小胞を提供すること。【解決手段】アスコルビン酸に代えて、アスコルビン酸誘導体を含む間葉系幹細胞を増殖させるための培地組成物。【選択図】なし

Description

本発明は、培地組成物、キット、間葉系幹細胞組成物の製造方法、間葉系幹細胞組成物、間葉系幹細胞、細胞培養上清および細胞外小胞に関する。

間葉系幹細胞は、全世界で６００例以上の臨床試験が実施されている細胞である。間葉系幹細胞は、培養期間が長く、分裂回数が多くなると、増殖速度の低下、細胞形態の変化、分化能の低下を示す細胞と知られている。

特許文献１には、少なくとも１種のアミノ酸の濃度が、グリシン５μｍｏｌ／Ｌ未満、アラニン５μｍｏｌ／Ｌ未満、セリン３μｍｏｌ／Ｌ未満、プロリン５μｍｏｌ／Ｌ未満、アスパラギン１μｍｏｌ／Ｌ未満、アスパラギン酸２μｍｏｌ／Ｌ未満、および／またはグルタミン酸３μｍｏｌ／Ｌ未満である、間葉系幹細胞用培地が記載されている。

特許文献２には、（ａ）特定の第一の培地でヒト多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）第一の培地を、特定の第二の培地に交換してヒト多能性幹細胞を培養するステップ；（ｃ）第一の培地でヒト多能性幹細胞を継代培養するステップを含む、未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養する方法が記載されている。

また、非特許文献１には、イーグルの細小必須培地に所定の成分を添加したα培地が記載されている。

Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２３０ Ｍａｒｃｈ １０ １９７１ ｐｐ．５２−５４

国際公開第２０１６／０２７８５０号パンフレット 特開２０１６−７３３２３号公報

間葉系幹細胞の研究、細胞治療においては、大量の細胞数を確保する必要があり、この増殖速度の低下が問題となる。また、研究や治療においては、再現性および均質性が重要であり、細胞の形態の変化や分化能の低下を抑制することが求められる。

本発明は、特別な装置、機材を用いることなく、より多くの間葉系幹細胞を短期間で増殖させ、細胞の性質の変化を抑制する培地組成物、これを含むキット、これを用いた間葉系幹細胞組成物の製造方法、間葉系幹細胞組成物、間葉系幹細胞、細胞培養上清、細胞外小胞を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、アスコルビン酸を含む培地中において間葉系幹細胞を培養した場合には、培地中に含有されているアスコルビン酸の不安定性に起因して、間葉系幹細胞の増殖不全が生じることが考えられた。培地中にアスコルビン酸の代わりにアスコルビン酸誘導体を含ませることにより間葉系幹細胞をより安定に培養できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によれば、以下の発明が提供される。

＜１＞ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリンを含み；
グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン類、グルタミン酸、プロリン、セリンおよびチロシンからなる群から選択される一以上を含み；
ビオチン、ビタミンＢ１２、および少なくとも１種のその他のビタミン類を含み；
少なくとも１種の無機塩を含み；
糖類およびピルビン酸塩のうちの少なくとも１種を含み；
リポ酸を含み；
アスコルビン酸誘導体を含み；
リノール酸を含まない；
間葉系幹細胞を増殖させるための培地組成物。
＜２＞上記アスコルビン酸誘導体が、アスコルビン酸−２−リン酸、アスコルビン酸−２−リン酸エステル三ナトリウム、アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム塩、およびアスコルビン酸−２−グリコシドからなる群から選択される一以上である、＜１＞に記載の培地組成物。
＜３＞アスコルビン酸誘導体の濃度が０．０３ｍｍｏｌ／Ｌ以上である、＜１＞または＜２＞に記載の培地組成物。
＜４＞アスコルビン酸誘導体の濃度が０．１４ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．５７ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、＜１＞または＜２＞に記載の培地組成物。
＜５＞上記その他のビタミン類が、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサール類、リボフラビン、チアミン塩酸塩およびｉ−イノシトールからなる群から選択される一以上である、＜１＞から＜４＞の何れか一項に記載の培地組成物。
＜６＞ピリドキサール類が、ピリドキサールまたはピリドキシンのいずれかである＜５＞に記載の培地組成物。
＜７＞上記無機塩が、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウムからなる群から選択される一以上である、＜１＞から＜６＞の何れか一項に記載の培地組成物。
＜８＞上記糖類が、Ｄ−グルコースであり、上記ピルビン酸塩が、ピルビン酸ナトリウムである、＜１＞から＜７＞の何れか一項に記載の培地組成物。
＜９＞アミノ酸として、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含み、
ビタミン類として、ビオチン、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサール類、リボフラビン、チアミン塩酸塩、およびビタミンＢ１２およびｉ−イノシトールを含み、
無機塩類として、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウムを含み、
さらに、グルタミン類、Ｄ−グルコース、フェノールレッド、リポ酸、およびピルビン酸ナトリウムを含む、
＜１＞から＜８＞の何れか一項に記載の培地組成物。

＜１０＞アミノ酸として、
０．３３〜１．３４ｍｍｏｌ／Ｌのグリシン、
０．１４〜０．５６ｍｍｏｌ／Ｌのアラニン、
０．３０〜１．２ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン、
０．１６〜０．６６ｍｍｏｌ／Ｌのアスパラギン、
０．１１〜０．４６ｍｍｏｌ／Ｌのアスパラギン酸、
０．０５〜０．２０ｍｍｏｌ／Ｌのシスチン、
０．２８〜１．１４ｍｍｏｌ／Ｌのシステイン、
０．２５〜１．０２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン酸、
０．１０〜０．４０ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン、
０．２０〜０．８０ｍｍｏｌ／Ｌのイソロイシン、
０．２０〜０．８０ｍｍｏｌ／Ｌのロイシン、
０．２０〜０．８０ｍｍｏｌ／Ｌのリジン、
０．０５〜０．２０ｍｍｏｌ／Ｌのメチオニン、
０．０９〜０．３８ｍｍｏｌ／Ｌのフェニルアラニン、
０．１７〜０．７０ｍｍｏｌ／Ｌのプロリン、
０．１２〜０．４８ｍｍｏｌ／Ｌのセリン、
０．２０〜０．８０ｍｍｏｌ／Ｌのスレオニン、
０．０２５〜０．１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリプトファン、
０．１０〜０．４０ｍｍｏｌ／Ｌのチロシン、
０．１９〜０．７８ｍｍｏｌ／Ｌのバリン、
ビタミン類として、
２．０５〜８．２０×１０^−４ｍｍｏｌ／Ｌのビオチン、
０．００３〜０．０１４ｍｍｏｌ／Ｌの塩化コリン、
０．００１〜０．００４ｍｍｏｌ／Ｌのパントテン酸カルシウム、
０．００１〜０．００４ｍｍｏｌ／Ｌの葉酸、
０．００４〜０．０１６ｍｍｏｌ／Ｌのナイアシンアミド、
０．００２〜０．０１０ｍｍｏｌ／Ｌのピリドキサール類、
０〜５．３２×１０^−４ｍｍｏｌ／Ｌのリボフラビン、
０．００１〜０．００６ｍｍｏｌ／Ｌのチアミン塩酸塩、
０．０００５〜０．００２ｍｍｏｌ／ＬのビタミンＢ１２、
０．００５〜０．０２ｍｍｏｌ／Ｌのｉ−イノシトール、
無機塩類として、
０．９０〜３.６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム、
０．４０〜１．６２ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸マグネシウム、
２．６６〜１０．６６ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウム、
１３．０９〜５２．３８ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、
５８．６２〜２３４．４８ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、
０．５０〜２．０２ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム
その他の成分として、
１．００〜４．００ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン類、
２．７８〜１１．１２ｍｍｏｌ／ＬのＤ−グルコース、
０〜０．０６ｍｍｏｌ／Ｌのフェノールレッド、
４．８５〜１９．４２×１０^−４ｍｍｏｌ／Ｌのリポ酸、
０．５０〜２．００ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウム
を含む、
＜９＞に記載の培地組成物。

＜１１＞グルタミン類が、グルタミンおよびアラニル−グルタミンのいずれかである、＜１＞から＜１０＞の何れか一項に記載の培地組成物。
＜１２＞さらに２〜２０体積％の血清を含む、＜１＞から＜１１＞の何れか一項に記載の培地組成物。
＜１３＞ さらに血清代替物の一以上を含む、＜１＞から＜１２＞の何れか一項に記載の培地組成物。
＜１４＞ さらに増殖因子の一以上を含む、＜１＞から＜１３＞の何れか一項に記載の培地組成物。
＜１５＞ 増殖因子が、塩基性線維芽細胞増殖因子である、＜１４＞に記載の培地組成物。
＜１６＞さらに抗生物質を含む、＜１＞から＜１５＞の何れか一項に記載の培地組成物。
＜１７＞間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である、＜１＞から＜１６＞の何れか一項に記載の培地組成物。
＜１８＞間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪、歯髄、胎児由来組成物または人工多能性幹細胞のいずれかに由来する細胞である、＜１＞から＜１７＞の何れか一項に記載の培地組成物。

＜１９＞＜１＞から＜１８＞の何れか一に記載の培地組成物と、血清、血清代替物、サイトカイン及び抗生物質からなる群から選択される一以上とを含む、培地キット。
＜２０＞＜１＞から＜１８＞の何れか一に記載の培地組成物と骨髄、脂肪、歯髄、胎児由来組成物または人工多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞を含む細胞群とを接触させることによって、上記細胞群を単離または、分化させることを含む、間葉系幹細胞の製造方法。
＜２１＞＜１＞から＜１８＞の何れか一項に記載の培地組成物中において、間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞組成物の製造方法。
＜２２＞＜２０＞または＜２１＞に記載の方法により得られる間葉系幹細胞組成物。
＜２３＞＜２０＞または＜２１＞に記載の方法により得られる、細胞治療用の間葉系幹細胞。
＜２４＞＜２０＞または＜２１＞に記載の方法により得られる、細胞培養上清。
＜２５＞＜２０＞または＜２１＞に記載の方法により得られる細胞培養上清から抽出した、細胞外小胞。

本発明の培地組成物、キット、および間葉系幹細胞組成物の製造方法によれば、特別な装置や機材を用いることなく、より多くの間葉系幹細胞を短期間で増殖させ、細胞の性質の変化を抑制することができる。本発明の間葉系幹細胞組成物、間葉系幹細胞、細胞培養上清、および細胞外小胞は、細胞治療などにおいて有用である。

図１は、増殖曲線の比較を示す。１つの細胞が分裂して２つになった際にはＰＤＬは１つ上がる。 図２は、４継代の一日当たりの平均増殖倍率を示す。 図３は、各培地で４継代したときのＭＳＣの細胞形態を示す。 図４は、培地Ａで４継代し、その後、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞に分化させたときの染色写真を示す。 図５は、表面抗原マーカーを調べた結果を示す。ＭＳＣの表面抗原マーカーのうち陽性はＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５であり、陰性はＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲである。 図６は、培地の成分分析の結果を示す。Ｔｈｅｒｍｏは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを示し、ＦＦＷＫは富士フイルム和光純薬を示す。ＭＥＭαの処方値を１００％としたときの濃度を示す。 図７は、各社基礎培地の増殖能（培地変更後、４継代の平均増殖倍率）の比較を示す。Ｔｈｅｒｍｏは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを示し、ＦＦＷＫは富士フイルム和光純薬を示す。 図８は、基礎培地中のアスコルビン酸類の濃度とＭＳＣの増殖能との関係を示す。 図９は、アスコルビン酸類縁体について、培地変更後、４継代の平均増殖倍率を示す。ＡＰＮはアスコルビン酸−２−リン酸エステル三ナトリウム、ＡＰＭはアスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物、ＡＧはアスコルビン酸−２−グリコシドを示す。 図１０は、初代培養時のコロニー形成数の比較を示す。 図１１は、初代培養時のコロニー形成の比較を示す。 図１２は、初代培地として各培地を用いた際の増殖能の比較を示す。１つの細胞が分裂して２つになった際にはＰＤＬは１つ上がる。 図１３は、各培地にて１０継代した時の細胞形態を示す。 図１４は、各培地で１０継代した細胞の分化能を確認した結果を示す。 図１５は、牛胎児血清（ＦＢＳ）量が各培地の増殖能（培地変更後、４継代の平均増殖倍率）に与える影響を調べた結果を示す。 図１６は、ＬＯＮＺＡ社ＢＭＳＣを各培地で培養したときの増殖能（培地変更後、４継代の平均増殖倍率）を示す。 図１７は、ＬＯＮＺＡ社ＢＭＳＣを各培地で培養したときの細胞形態を示す。 図１８は、基礎培地中のリボフラビンの濃度とＭＳＣの増殖能（培地変更後、４継代の平均増殖倍率）の関係を示す。括弧内の数値は基礎培地Ｃに加えたリボフラビンの濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。 図１９は、フェノールレッドがＭＳＣの増殖能（培地変更後、４継代の平均増殖倍率）に与える影響を示す。 図２０は、アラニル−グルタミン（Ａｌａ−Ｇｌｎ）がＭＳＣの増殖能（培地変更後、４継代の平均増殖倍率）に与える影響を示す。 図２１は、ピリドキシンがＭＳＣ（培地変更後、４継代の平均増殖倍率）の増殖能に与える影響を示す。 図２２は、リノール酸がＭＳＣの増殖能に与える影響を示す。 図２３は、培地Ａおよびタイプ培地で培養した異なる２人のドナー由来のＭＳＣの増殖能を示す。

以下において、本発明の内容について詳細に説明する。なお、本明細書において「〜」とはその前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。
また、本明細書において実質的に含まない、ないし単に含まないと言うときには、特に断らない限り、該当する成分が５×１０^−５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であることを意味する。逆に、含むと言うときには、特に断らない限り、５×１０^−５ｍｍｏｌ／Ｌ以上で含まれることを指す。

本発明の培地組成物は必須アミノ酸を含んでいる。すなわち、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリンを含んでいる。培地組成物における必須アミノ酸の濃度は特に限定されないが、各必須アミノ酸の濃度が、０．００３ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。
必須アミノ酸は合計濃度としては、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。

本発明の培地組成物は非必須アミノ酸等を含む。ここで、非必須アミノ酸等とは非必須アミノ酸とグルタミン類とを規定する意味である。非必須アミノ酸等としては、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン類、グルタミン酸、プロリン、セリンおよびチロシンからなる群から選択される一以上のものが挙げられる。

非必須アミノ酸等として、グリシン、アラニン、セリン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン類、または／およびグルタミン酸を含む場合、これらの各々は０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ（５μｍｏｌ／Ｌ）以上であり、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましい。上限値としては、３ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。グルタミン類として好ましくは、グルタミンおよびアラニル−グルタミンが挙げられる。
非必須アミノ酸等の合計濃度としては、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。

アミノ酸の検出および測定方法は公知の方法によればよいが、例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によるアミノ酸の定量、ニンヒドリン法によるアミノ酸分析方法（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９７）,Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．８，ｐ１４２１−１４２８を参照）等により行うことができる。

本明細書中に記載されるアミノ酸は、Ｌ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体のいずれであってもよい。またアミノ酸は遊離体のみならず塩を形成していてもよい。塩の形態には酸付加塩や塩基との塩等を挙げることができる。酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸またはモノメチル硫酸等の有機酸が挙げられる。また、そのような塩を形成する塩基としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等の金属の水酸化物あるいは炭酸化物や、アンモニア等の無機塩基、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機塩基が挙げられる。塩は水和物（含水塩）であってもよい。

本発明の培地組成物は、ビオチン、ビタミンＢ１２、および少なくとも１種のその他のビタミン類を含む。その他のビタミン類としては、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサール類、リボフラビン、チアミン塩酸塩およびｉ−イノシトールが挙げられる。ピリドキサール類としては、ピリドキサールおよびピリドキシンが挙げられる。上記のビオチン、ビタミンＢ１２、および少なくとも１種のその他のビタミン類は遊離体のみならず塩を形成していてもよい。塩の形態には酸付加塩や塩基との塩等を挙げることができる。具体的には、アミノ酸について上記したものが挙げられる。

本発明の培地組成物におけるビタミン類の含有濃度は、各々が０．０００５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、１ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。
本発明の培地組成物におけるビタミン類の含有濃度は、合計で、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、２ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。

本発明の培地組成物は、少なくとも１種の無機塩を含む。無機塩は、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウムからなる群から選択される一以上であることが好ましい。無機塩の濃度は特に限定されないが、合計で、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、８０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、１，０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。

本発明の培地組成物は、糖類およびピルビン酸塩のうちの少なくとも１種を含む。糖類としてはＤ−グルコースが挙げられる。ピルビン酸塩としては、ピルビン酸ナトリウムが挙げられる。糖類およびピルビン酸塩の濃度は、合計で、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。

本発明の培地組成物は、リポ酸を含む。リポ酸の濃度は、５×１０^−５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．０００１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．０００５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。

本発明の培地組成物には、アスコルビン酸（下記式ａ）に代えて、アスコルビン酸誘導体を含む。アスコルビン酸誘導体としては、アスコルビン酸−２−リン酸（下記式ｂ）、アスコルビン酸−２−リン酸エステル三ナトリウム（下記式ｃ、以下これを「ＡＰＮ」と呼ぶことがあり、アスコルビン酸誘導体を「ＡＰＮ等」と呼ぶことがある）、アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム塩（下記式ｄ）、およびアスコルビン酸−２−グリコシドが挙げられ、アスコルビン酸−２−リン酸エステル三ナトリウム又はアスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム塩が好ましく、アスコルビン酸−２−リン酸エステル三ナトリウムがより好ましい。

上述のとおり、本発明の培地組成物においては、アスコルビン酸に代えて、その代替物を含むことが重要である。これは、実験的に裏付けられてきたものではあるが、不安定なアスコルビン酸に代え、アスコルビン酸誘導体を採用したことにより、培地としての安定性が向上したと考えられる。

本発明の培地組成物において、アスコルビン酸誘導体の濃度は、合計で、０．０３ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．１４ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、５．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましく、０．５７ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがさらに好ましい。

本発明の培地組成物はアスコルビン酸を含むことを妨げないが、 含まないことが好ましい。本発明の培地組成物はリノール酸を含まないことが好ましい。さらに、本発明の培地組成物は核酸を含まないことが好ましい。
ここで含まないとは、本発明の効果との関係で実質的に含まれていないことを言い、不可避的に混入するものを排除する意味ではない。実質的に含まれない例としては、アスコルビン酸の場合は、通常、５×１０^−５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であり、好ましくは、０ｍｍｏｌ／Ｌである。リノール酸の場合は、通常、０．００１５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であり、好ましくは、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは、０．０００５ｍｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは、０．０００３ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、特に好ましくは、０．０００１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、最も好ましくは、０ｍｍｏｌ／Ｌである。また、核酸の場合は、通常、５×１０^−５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であり、好ましくは、０ｍｍｏｌ／Ｌである。

本発明の培地組成物は、フェノールレッドを含んでいてもよい。フェノールレッドの濃度は、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが一般的である。

本発明の培地組成物は、血清を含んでいてもよい。血清を含有する培地組成物における血清の量は、下限値としては、２体積％以上であることが好ましく、５体積％以上であることがより好ましく、１０体積％以上であることがさらに好ましい。上限値としては、２０体積％以下であることが一般的である。
本発明の培地組成物は血清、血清代替物、増殖因子及び抗生物質からなる群から選択される一以上と組み合わせて培地キットとしてもよい。
血清としては、動物由来の血清が挙げられる。特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来の血清（例えばウシ胎仔血清、ヒト血清等）であり、より好ましくはヒト血清である。

本発明の培地組成物は、さらに血清代替物を含んでいてもよい。
血清代替物としては、増殖因子も含まれるが、そのほかの例としては、アルブミン、脂質リッチアルブミンおよび組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン、タンパク質加水分解物、トランスフェリンまたは他の鉄輸送体、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオグリセロールあるいはこれらの均等物などが挙げられる。血清代替物の具体例としては、例えば、国際公開ＷＯ９８／３０６７９号記載の方法により調製されるものや、市販のｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ社）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などが挙げられる。

本発明の培地組成物は、さらに増殖因子を含んでいてもよい。増殖因子としては、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子が挙げられる。増殖因子の濃度は、各増殖因子の濃度として、０．１μｇ／Ｌ以上であることが好ましく、０．５μｇ／Ｌ以上であることがより好ましく、１．０μｇ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、５０．０μｇ／Ｌ以下であることが一般的である。

本発明の培地組成物は、さらに抗生物質を含んでいてもよい。抗生物質としては、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン（ゲンタマイシン硫酸塩など）、ペニシリンなどが挙げられる。抗生物質の濃度は、その合計濃度として、０．１ｍｇ／Ｌ以上であることが好ましく、０．５ｍｇ／Ｌ以上であることがより好ましく、１０．０ｍｇ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。上限値としては、１０００ｍｇ／Ｌ以下であることが一般的である。

本発明の培地組成物には、上述した成分以外に、必要により、公知の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、ポリアミン類（例えばプトレシン等）、還元剤（例えば２−メルカプトエタノール等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）等）等が挙げられる。

本発明の培地組成物について、好ましい実施形態を成分全体にわたって規定しなおすと、下記のような濃度範囲のものが挙げられる。すなわち、
アミノ酸として、
０．３３〜１．３４ｍｍｏｌ／Ｌのグリシン、
０．１４〜０．５６ｍｍｏｌ／Ｌのアラニン、
０．３０〜１．２ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン、
０．１６〜０．６６ｍｍｏｌ／Ｌのアスパラギン、
０．１１〜０．４６ｍｍｏｌ／Ｌのアスパラギン酸、
０．０５〜０．２０ｍｍｏｌ／Ｌのシスチン、
０．２８〜１．１４ｍｍｏｌ／Ｌのシステイン、
０．２５〜１．０２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン酸、
０．１０〜０．４０ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン、
０．２０〜０．８０ｍｍｏｌ／Ｌのイソロイシン、
０．２０〜０．８０ｍｍｏｌ／Ｌのロイシン、
０．２０〜０．８０ｍｍｏｌ／Ｌのリジン、
０．０５〜０．２０ｍｍｏｌ／Ｌのメチオニン、
０．０９〜０．３８ｍｍｏｌ／Ｌのフェニルアラニン、
０．１７〜０．７０ｍｍｏｌ／Ｌのプロリン、
０．１２〜０．４８ｍｍｏｌ／Ｌのセリン、
０．２０〜０．８０ｍｍｏｌ／Ｌのスレオニン、
０．０２５〜０．１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリプトファン、
０．１０〜０．４０ｍｍｏｌ／Ｌのチロシン、
０．１９〜０．７８ｍｍｏｌ／Ｌのバリン、
ビタミン類として、
２．０５〜８．２０×１０^−４ｍｍｏｌ／Ｌのビオチン、
０．００３〜０．０１４ｍｍｏｌ／Ｌの塩化コリン、
０．００１〜０．００４ｍｍｏｌ／Ｌのパントテン酸カルシウム、
０．００１〜０．００４ｍｍｏｌ／Ｌの葉酸、
０．００４〜０．０１６ｍｍｏｌ／Ｌのナイアシンアミド、
０．００２〜０．０１０ｍｍｏｌ／Ｌのピリドキサール類、
０〜５．３２×１０^−４ｍｍｏｌ／Ｌのリボフラビン、
０．００１〜０．００６ｍｍｏｌ／Ｌのチアミン塩酸塩、
０．０００５〜０．００２ｍｍｏｌ／ＬのビタミンＢ１２、
０．００５〜０．０２ｍｍｏｌ／Ｌのｉ−イノシトール、
無機塩類として、
０．９０〜３.６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム、
０．４０〜１．６２ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸マグネシウム、
２．６６〜１０．６６ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウム、
１３．０９〜５２．３８ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、
５８．６２〜２３４．４８ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、
０．５０〜２．０２ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム
その他の成分として、
１．００〜４．００ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン類、
２．７８〜１１．１２ｍｍｏｌ／ＬのＤ−グルコース、
０〜０．０６ｍｍｏｌ／Ｌのフェノールレッド、
４．８５〜１９．４２×１０^−４ｍｍｏｌ／Ｌのリポ酸、
０．５０〜２．００ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウム
を含む、培地組成物が挙げられる。

本発明の培地組成物は、間葉系幹細胞（本明細書において「ＭＳＣ」と呼ぶことがある）を増殖させるための培地組成物である。

幹細胞とは、自己複製能および分化増殖能を有する未熟な細胞をいい、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)、単能性幹細胞(ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)等が含まれる。「幹細胞」は、一般に、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と、三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞と定義されている。 多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。 単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。

間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞および脂肪芽細胞等の間葉系の細胞の全て又はそのうちの一部の細胞への分化が可能な幹細胞またはその前駆細胞の集団を広義に意味する。

間葉系幹細胞の由来も特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などの細胞であってもよい。
間葉系幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞であることが好ましい。
また、間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、歯髄、胎児由来組成物または人工多能性幹細胞のいずれかに由来する細胞であることが好ましい。

本発明の培地組成物は、これを間葉系幹細胞と接触させることによって培養し、骨髄、脂肪、歯髄、胎児由来組成物または人工多能性幹細胞から間葉系幹細胞を単離する、間葉系幹細胞組成物の製造方法に適用してもよい。

本発明の間葉系幹細胞組成物の製造方法においては、好ましくは、培地組成物と骨髄、脂肪、歯髄、胎児由来組成物または人工多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞を含む細胞群とを接触させることによって、当該細胞群を単離または、分化させてもよい。ここで言う「単離」とは、例えば、上記細胞群を本発明の培地組成物で満たされた後述の培養器に播種し、当該培養器に付着した細胞以外を除去することによりなされればよい。この製造方法で得られる間葉系幹細胞組成物は細胞治療に用いることができる。また、この製造方法により細胞培養上清を得ることが好ましい。細胞培養上清には、間葉系幹細胞の種類によっては、そこから分泌された様々なサイトカイン（タンパク質）などが含まれており、治療や診断に適用することができる。本発明においては、この細胞培養上清から細胞外小胞を抽出することができる。細胞外小胞は培養した細胞から分泌等された物質が挙げられる。例えば、細胞から分泌されたエクソソーム、細胞の一部が分離したマイクロベシクル、細胞が死滅したアポトーシス小体等が含まれる。この細胞外小胞も治療・診断の目的で利用することができ、例えばエクソソームが担う細胞間での情報伝達機能を利用した細胞医療等への活用が可能である。

本発明の培地組成物によれば、増殖能を維持したまま長期に効率よく間葉系幹細胞の培養を行うことが可能となる。例えば、本発明の培地組成物により、５０日以上、好ましくは７０日以上、より好ましくは９０日以上、さらに好ましくは１００日以上の間、増殖能を維持したまま間葉系幹細胞の培養が可能である。また、本発明の培地組成物によれば、間葉系幹細胞の増殖能が失われないため、必要により、培養により多量の間葉系幹細胞を得ることが可能となる。

間葉系幹細胞の培養に用いられる培養器は、間葉系幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、およびローラーボトルが挙げられる。

培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質でコーティングされたものであり得る。細胞支持用基質は、間葉系幹細胞の接着を目的とする任意の物質であり得、ＥＣＭを用いたマトリゲル、あるいはコラーゲンやゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン等が挙げられる。

培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり得る。ＣＯ_２濃度は、約１〜１０％、好ましくは約２〜５％であり得る。酸素濃度は、１〜２０％、好ましくは１〜１０％であり得る。

本発明の培養方法によって得られる間葉系幹細胞組成物は、細胞治療用などの医療用に好適に使用することができる。間葉系幹細胞は、対象疾患等に応じて、未分化のまま、または骨細胞、軟骨細胞もしくは脂肪細胞等へ分化させた後に、使用することができる。対象疾患としては、例えば、月状骨無腐性壊死、大腿骨頭無腐性壊死、難断性骨軟骨炎、腰椎椎間板ヘルニア、虚血性心疾患、表皮水疱症等が挙げられる。また、間葉系幹細胞は、脂肪細胞へ分化させた後、美容整形用に使用することも可能である。

本発明の好ましい実施形態によれば、間葉系幹細胞は増殖が遅く継代するごとに増殖能が低下する細胞であるところ、アスコルビン酸をアスコルビン酸誘導体（ＡＰＮ等）に置き換えることにより、以下の利点が得られる。
・間葉系幹細胞の増殖能の向上、細胞形態の維持
・初代培地として間葉系幹細胞の培養に使用する場合、コロニー形成率の向上、増殖能の向上、分化能の向上、細胞形態の維持
・使用する血清量を低減することができる。
・細胞増殖因子を添加せずに添加した場合と同等の増殖能が得られる。
・長期間、培地の成分を維持することができる。
・ＩＳＣＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）によって定義される間葉系幹細胞の条件(分化能、表面抗原)を維持しうる。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明がこれにより限定して解釈されるものではない。

（材料と方法）
１．細胞
Ａｌｌｃｅｌｌｓ社より購入した、骨髄液（Ｗｈｏｌｅ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ， Ｆｒｅｓｈ， １０ｍＬ、型番：ＡＬＬ−ＡＢＭ００１、ロット：Ｂ００３、Ｂ００９およびＢ０１０）より単離したＭＳＣおよび、ＬＯＮＺＡ社より購入したヒト間葉系幹細胞（型番：ＰＴ−２５０１）

２．基礎培地
タイプ基礎培地：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 ＭＥＭ ａｌｐｈａ ｎｏ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ （型番：１２５６１）
基礎培地Ａ〜Ｆ：詳細は下記表１（表１−１〜１−８）に記載

３．間葉系幹細胞の培養
間葉系幹細胞の培養には、２．に記載のそれぞれの基礎培地に抗生物質としてゲンタマイシン硫酸塩（「高田製薬ゲンタシン注６０」）を２０μｇ／ｍＬ、および、牛胎児血清（ＳＡＦＣ社 型番：１２００７Ｃもしくは、Ｓｅｌｂｏｒｎｅ社 型番：ＦＢＳ−０４）を最終濃度１０％（ｖ／ｖ）もしくは１５％（ｖ／ｖ）になるように添加し、使用した。

間葉系幹細胞の単離は、購入した骨髄液（ロット：Ｂ００３、Ｂ００９、およびＢ０１０）を１，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行い、血漿を除去したものに、タイプ培地もしくは、培地Ａを血漿除去する前の１０倍量になるように加え、０．２０ ｍＬ／ｃｍ^２になるようにフラスコに播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気下のインキュベータ内で培養を行った。３日または４日間ごとに培地交換を行い、播種から１１日〜１４日間培養を行ったのち、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（以下、トリプシン、ライフテクノロジーズ 型番：２５３００）で剥離を行った。剥離後、等量の培地でトリプシンの中和を行い、別に用意したチューブに移した。培養フラスコをさらに等量の培地で洗いこみを行い、上記チューブに加え、残った細胞を回収した。チューブは２００×ｇで５分間遠心を行い、その上清を除去した。残ったペレットに適切な量の培地を加え、血球計算板を用いて、細胞カウントを行った。最終濃度が０．２５〜０．５０×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２になるようにフラスコに播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気下のインキュベータ内で培養をした。３日もしくは４日間培養し、フラスコ底面の６０％以上を細胞が満たしたときに、上記と同様の操作で継代を繰り返した。ロットＢ００３はタイプ培地で単離・拡大培養を行った。２継代目終了時の細胞を遠心し、終濃度が１０％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ 型番：Ｄ２６５０）となるように、タイプ培地に混ぜた凍結液で １００×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２になるように調整し、培地評価用の細胞ストック（Ｂ００３−ｔｙｐｅ−Ｐ３と称する）を作製し、これを以降の培地の評価で用いた。

各培地の評価は、凍結したＢ００３−ｔｙｐｅ−Ｐ３を３７℃ウォーターバスにて解凍し、２００×ｇで５分間遠心し、凍結液を除去し、タイプ培地を加え、０．２５〜０．５０ ×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２になるようにフラスコに播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気下のインキュベータ内で培養を３日もしくは４日間行った。フラスコ底面の６０％以上を細胞が満たしたときに、トリプシンで剥離し、上記した方法で、回収した細胞を各培地に置き換え、０．２５〜０．５０×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２になるようにフラスコに播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気下のインキュベータ内で培養を３日もしくは４日間行った。この操作を計４継代もしくは５継代行い、ＭＳＣの増殖能、細胞形態を評価した。

ロットＢ００９およびＢ０１０に関しては、上記の方法でタイプ培地、培地Ａで単離・拡大培養を１０継代まで行い、初代培地としての性能を評価した。

４．間葉系幹細胞の分化能の確認
＜骨芽細胞への分化＞
各種培地で４継代培養したＭＳＣをＣｏｒｎｉｎｇ社 Ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｃｅｌｌｗａｒｅ ２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに０．５０ 〜０．７５×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となるように播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気下のインキュベータ内で培養を３日間行った。培養上清をＰｒｏｍｏｃｅｌｌ社 間葉系幹細胞骨芽細胞分化培地（型番：Ｃ−２８０１３）に置き換え、３日もしくは４日ごとに培地交換を行い、計２１日間、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気下のインキュベータ内で培養した。各ｗｅｌｌを４％パラホルムアルデヒドで固定を行い、アリザリンレッドで染色を行い、骨分化を評価した。

＜脂肪細胞への分化＞
各種培地で４継代培養したＭＳＣをＣｏｒｎｉｎｇ社 Ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｃｅｌｌｗａｒｅ ２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに０．５０ ×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となるように播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気下のインキュベータ内で培養を３日間行った。培養上清をＰｒｏｍｏｃｅｌｌ社 間葉系幹細胞脂肪細胞分化培地２（型番：Ｃ−２８０１６）に置き換え、３日もしくは４日ごとに培地交換を行い、計２１日間、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気下のインキュベータ内で培養した。各ｗｅｌｌを４％パラホルムアルデヒドで固定を行い、オイルレッド−ｏで染色を行い、脂肪分化を評価した。

＜軟骨細胞への分化（１）＞
各種培地で４継代培養したＭＳＣ（２０×１０^４ ｃｅｌｌｓ）の細胞懸濁液を１．５ｍＬチューブに移し、２００×ｇで遠心し、上清の各種培地をＰｒｏｍｏｃｅｌｌ社 間葉系幹細胞軟骨細胞分化培地（型番：Ｃ−２８０１２）０．２ｍＬに置き換え、住友ベークライト社 ９６ｗｅｌｌｓ， Ｕ ｂｏｔｔｏｍプレートに播種した。プレートを２００×ｇで５分間遠心し、ｗｅｌｌの底面に細胞のスフェロイドを作り、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気下のインキュベータ内で培養を２１日間行った。培地交換は３日もしくは４日ごとに行った。分化終了後のスフェロイドは、切片を作製し、アルシャンブルー染色液で染色を行い、軟骨分化を評価した。

＜軟骨細胞への分化（２）＞
各種培地で４継代培養したＭＳＣをＣｏｒｎｉｎｇ社 Ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｃｅｌｌｗａｒｅ ２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに０．５０ ×１０^４ ｃｅｌｌｓ ／ｃｍ^２となるように播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気下のインキュベータ内で培養を３日間行った。培養上清をＰｒｏｍｏｃｅｌｌ社 間葉系幹細胞軟骨細胞分化培地（型番：Ｃ−２８０１２）に置き換え、３日もしくは４日ごとに培地交換を行い、計２１日間、３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気下のインキュベータ内で培養した。各ｗｅｌｌを４％パラホルムアルデヒドで固定を行い、アルシャンブルーで染色を行い、軟骨分化を評価した。

（結果）
実施例１ タイプ培地、培地ＡでのＭＳＣの培養の比較
ＭＳＣの凍結ストックＢ００３−ｔｙｐｅ−Ｐ３を用いて、タイプ培地、培地Ａで４継代培養を行い、増殖能を比較した結果、培地Ａで培養したＭＳＣの増殖能はタイプ培地に比べ、有意に高いことを見出した。図１に増殖曲線の比較を示す。図２に４継代の一日当たりの増殖倍率を示す。

図３に、各培地で４継代したときのＭＳＣの細胞形態を示す。培地Ａの細胞形態は、タイプ培地に比べ、細胞が小さく、扁平な細胞が少なく、継代数が若いときの形態に近い。

図４に、培地Ａで４継代し、その後、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞に分化させたときの染色写真を示す。培地Ａで培養したＭＳＣは骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞に分化することがわかった。

図５に、表面抗原マーカーを調べた結果を示す。ＩＳＣＴが定義するＭＳＣの定義を満たしていることが確認できた。

実施例２ 基礎培地Ａとタイプ基礎培地およびその他の各社の市販ＭＥＭα培地の成分分析および、ＭＳＣの増殖能の比較
培地の成分分析の結果を図６および表２に示す。タイプ基礎培地、市販ＭＥＭα培地ではアスコルビン酸がほとんど検出されなかった。基礎培地ＡではＡＰＮが処方値の通り検出された。唯一アスコルビン酸が検出された培地は製造から測定までの日数が２か月であったため、６％残存していたと考えられる。ＭＳＣの凍結ストックＢ００３−ｔｙｐｅ−Ｐ３を用いて、タイプ培地、各社ＭＥＭαに１５％ 牛胎児血清、２０μｇ／ｍＬゲンタマイシン硫酸塩を加えた培地で培養した結果を図７に示す。結果、市販の基礎培地はタイプ培地と同等の増殖能を示し、培地Ａより増殖能は劣っていた。

※含有量は測定時点での値を示す。
Ｔｈｅｒｍｏ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
ＦＦＷＫ：富士フイルム和光純薬
ＡＰＮ：アスコルビン酸−２−リン酸エステル三ナトリウム
ＡＳ：アスコルビン酸
ＡＮ：アスコルビン酸ナトリウム
Ａｌａ−Ｇｌｎ：アラニル−グルタミン

実施例３ アスコルビン酸およびＡＰＮの容量依存性試験
アスコルビン酸類が不含の培地Ｂを作製し、アスコルビン酸もしくはＡＰＮの容量を変えた培地を作製し、ＭＳＣの増殖能を評価した。結果、基礎培地中のアスコルビン酸類の濃度が０．１４２ ｍｍｏｌ／Ｌ未満になったときに、増殖能の低下が確認され、ＭＳＣの増殖能とアスコルビン酸類に容量依存性があることが分かった。図８に結果を示す。

実施例４ アスコルビン酸類縁体の評価
ＡＰＮの類縁体として、アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物（以下、ＡＭＧ）、アスコルビン酸−２−グリコシド（以下、ＡＧ）を評価した。アスコルビン酸類が不含の培地Ｂを作製し、上記アスコルビン酸類縁体を基礎培地中の濃度が０．２８４ ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、ＭＳＣの増殖能を評価した。結果としてはＡＰＮと同等、それ以上の増殖能を示した。図９に結果を示す。

実施例５ タイプ培地、培地Ａの初代培地としての性能の比較
骨髄液ロットＢ００９およびＢ０１０を用いて、初代培地としての性能評価を行った。Ｂ００９では、培地Ａの初代培養のコロニー形成数はタイプ培地に比べて、約１．８倍であった。コロニー形成数の結果を図１０、その際のフラスコの写真を図１１に示す。次に、各培地で１０継代培養を行った結果、タイプ培地に比べて、培地Ａの方が有意に増殖能が高い結果となった。５継代で得られる累積細胞数は約３０倍、１０継代で約９４０倍の細胞が得られる。その際の増殖曲線を図１２に示す。図１２の増殖曲線からもわかる通り、通常、ＭＳＣを長期間培養すると増殖能が徐々に低下していくが、培地Ａで培養したＭＳＣはタイプ培地に比べ、増殖能の低下が著しく遅い。１０継代した時の細胞形態は図１３に示す。タイプ培地の細胞形態は培地Ａに比べて、細胞が大きく、扁平な細胞が多い。１０継代した細胞の分化能を調べた結果、培地Ａで培養したＭＳＣは１０継代しても分化能を維持しており、タイプ培地に比べて、分化能が高いことが分かった。結果を図１４に示す。

本発明によれば、ＭＳＣを長期間培養することが可能で、大量のＭＳＣが必要となる同種の細胞治療や、細胞バンキング、早期に細胞を増殖させたい自家の細胞移植に有用である。

一方、Ｂ０１０においては、培地Ａ、タイプ培地で培養したＭＳＣの増殖能は同等であった。図２３に結果を示す。Ｂ０１０由来のＭＳＣは増殖能が高かったため、増殖能の差分がほとんどなかったと考えられる。つまり、培地Ａは、増殖能が悪いドナーのＭＳＣについては、増殖能を改善し、増殖能の良いドナーのＭＳＣに関しては、増殖能は同等になる。また、その増殖能の改善効果の結果の増殖能はドナーによらず、ほぼ同等となる。つまり、ドナーによる増殖能のばらつきを軽減することができる。
自家ＭＳＣの培養においては、ドナー由来のＭＳＣの増殖能が分からないため、予備培養を行ない、播種密度や培養日数などを変更することがあるが、培地Ａを用いることで、ドナー間の増殖能のばらつきが軽減されるので、播種密度や培養日数を統一することが可能になり、さらに、予備培養も不要になる。

実施例６ 牛胎児血清（以下、ＦＢＳ）の使用量低減の検討
タイプ培地および、基礎培地ＡのＦＢＳの含有率を変えて、増殖能に与える影響を調べた。結果、培地Ａでは、ＦＢＳを１０％に下げると、増殖能は低下するが、ＦＢＳを１５％含有しているタイプ培地よりも増殖能が高かった。つまり、血清を低減しても、市販の基礎培地よりも性能が高いことから、血清を低減することができる可能性が示された。結果を図１５に示す。

実施例７ 別細胞での培地Ａの増殖能促進効果の確認
他社のＭＳＣ（ＬＯＮＺＡ社 ＢＭＳＣ（骨髄間葉系幹細胞））を用いて、培地Ａの増殖能促進効果を検証した。ＬＯＮＺＡ社ＢＭＳＣをＬＯＮＺＡ社推奨培地（以下、ＭＳＣＧＭ、型番ＰＴ−３００１）および、タイプ培地、培地Ａで４継代培養し、その増殖能を比較した結果、培地Ａでの増殖能が最も高く、細胞形態も小さく、扁平な細胞が少ない結果となった。結果を図１６、図１７に示す。

実施例８ 各因子のＭＳＣの増殖能への寄与の確認
１） リボフラビン 他社基礎培地の成分解析にて、含有量にばらつきの見られた、リボフラビンについてリボフラビン不含の培地Ｃを作製し、リボフラビンの容量依存性試験を実施した。しかしながら、リボフラビンは不含でも増殖性能に影響を与えないことが分かり、０〜０．１０ ｍｇ／Ｌの範囲では、増殖能に影響を与えないことが分かった。結果を図１８に示す。
２） フェノールレッド フェノールレッド不含の培地Ｄを作製し、フェノールレッドがＭＳＣの増殖に与える影響を確認した結果、フェノールレッドは増殖に影響しないことが分かった。結果を図１９に示す。

実施例９ 不安定な化合物を安定な誘導体に変えることで培地の安定性を向上させる確認
アミノ酸のグルタミンやビタミンのピリドキサールは培地中に含まれるが、不安定な成分として知られる。これらを安定な誘導体に変え、培地の安定性を向上できるか検証した。培地Ａ中のアラニル−グルタミンをグルタミンに変更した培地Ｄ、ピリドキサールを含有した培地Ｅとそれをピリドキシンに変更した培地Ｆを作製し、ＭＳＣの増殖能を評価した。結果、グルタミンをアラニル−グルタミンに、ピリドキサールをピリドキシンに変更しても、ＭＳＣの増殖能に影響を与えないことが確認できた。結果を図２０、図２１に示す。

実施例１０ ＭＳＣの増殖に対するリノール酸の影響の確認
培地Ａに最終濃度が３．０、１．５、０．３０、０．１５、０μｍｏｌ／Ｌとなるようにリノール酸を加え、ＭＳＣの増殖に対するリノール酸の影響を評価した。本評価は、以下のように実施した。凍結したＢ００３−ｔｙｐｅ−Ｐ３のＭＳＣを培地ＡでＰ６まで培養した細胞を、上記の異なる濃度のリノール酸を含んだ培地に０．２５〜０．５０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２になるように６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下のインキュベータ内で培養を４日間行ったのち、細胞数をカウントし、増殖倍率を算出した。その結果、リノール酸の濃度依存的に増殖は低下し、リノール酸が１．５μｍｏｌ／Ｌ以上ではＭＳＣは全く増殖しないことが分かり、リノール酸はＭＳＣの増殖に負の影響を与えることが分かった。結果を図２２に示す。

上記の結果から分かるとおり、本発明の培地組成物は、間葉系幹細胞の培地として優れている。本発明の培地組成物により培養した細胞は細胞医療に好適に利用することができ、培養した後の培養上清やエクソソームは医療用途に利用することができる。

Claims (25)

1. ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリンを含み；
   グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン類、グルタミン酸、プロリン、セリンおよびチロシンからなる群から選択される一以上を含み；
   ビオチン、ビタミンＢ１２、および少なくとも１種のその他のビタミン類を含み；
   少なくとも１種の無機塩を含み；
   糖類およびピルビン酸塩のうちの少なくとも１種を含み；
   リポ酸を含み；
   アスコルビン酸誘導体を含み；
   リノール酸を含まない；
   間葉系幹細胞を増殖させるための培地組成物。
2. 前記アスコルビン酸誘導体が、アスコルビン酸−２−リン酸、アスコルビン酸−２−リン酸エステル三ナトリウム、アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム塩、およびアスコルビン酸−２−グリコシドからなる群から選択される一以上である、請求項１に記載の培地組成物。
3. アスコルビン酸誘導体の濃度が０．０３ｍｍｏｌ／Ｌ以上である、請求項１または２に記載の培地組成物。
4. アスコルビン酸誘導体の濃度が０．１４ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．５７ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１または２に記載の培地組成物。
5. 前記その他のビタミン類が、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサール類、リボフラビン、チアミン塩酸塩およびｉ−イノシトールからなる群から選択される一以上である、請求項１から４の何れか一項に記載の培地組成物。
6. ピリドキサール類が、ピリドキサールまたはピリドキシンのいずれかである、請求項５に記載の培地組成物。
7. 前記無機塩が、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウムからなる群から選択される一以上である、請求項１から６の何れか一項に記載の培地組成物。
8. 前記糖類が、Ｄ−グルコースであり、前記ピルビン酸塩が、ピルビン酸ナトリウムである、請求項１から７の何れか一項に記載の培地組成物。
9. アミノ酸として、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含み、
   ビタミン類として、ビオチン、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサール類、リボフラビン、チアミン塩酸塩、およびビタミンＢ１２およびｉ−イノシトールを含み、
   無機塩類として、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウムを含み、
   さらに、グルタミン類、Ｄ−グルコース、フェノールレッド、リポ酸、およびピルビン酸ナトリウムを含む、
   請求項１から８の何れか一項に記載の培地組成物。
10. アミノ酸として、
    ０．３３〜１．３４ｍｍｏｌ／Ｌのグリシン、
    ０．１４〜０．５６ｍｍｏｌ／Ｌのアラニン、
    ０．３０〜１．２ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン、
    ０．１６〜０．６６ｍｍｏｌ／Ｌのアスパラギン、
    ０．１１〜０．４６ｍｍｏｌ／Ｌのアスパラギン酸、
    ０．０５〜０．２０ｍｍｏｌ／Ｌのシスチン、
    ０．２８〜１．１４ｍｍｏｌ／Ｌのシステイン、
    ０．２５〜１．０２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン酸、
    ０．１０〜０．４０ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン、
    ０．２０〜０．８０ｍｍｏｌ／Ｌのイソロイシン、
    ０．２０〜０．８０ｍｍｏｌ／Ｌのロイシン、
    ０．２０〜０．８０ｍｍｏｌ／Ｌのリジン、
    ０．０５〜０．２０ｍｍｏｌ／Ｌのメチオニン、
    ０．０９〜０．３８ｍｍｏｌ／Ｌのフェニルアラニン、
    ０．１７〜０．７０ｍｍｏｌ／Ｌのプロリン、
    ０．１２〜０．４８ｍｍｏｌ／Ｌのセリン、
    ０．２０〜０．８０ｍｍｏｌ／Ｌのスレオニン、
    ０．０２５〜０．１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリプトファン、
    ０．１０〜０．４０ｍｍｏｌ／Ｌのチロシン、
    ０．１９〜０．７８ｍｍｏｌ／Ｌのバリン、
    ビタミン類として、
    ２．０５〜８．２０×１０^−４ｍｍｏｌ／Ｌのビオチン、
    ０．００３〜０．０１４ｍｍｏｌ／Ｌの塩化コリン、
    ０．００１〜０．００４ｍｍｏｌ／Ｌのパントテン酸カルシウム、
    ０．００１〜０．００４ｍｍｏｌ／Ｌの葉酸、
    ０．００４〜０．０１６ｍｍｏｌ／Ｌのナイアシンアミド、
    ０．００２〜０．０１０ｍｍｏｌ／Ｌのピリドキサール類、
    ０〜５．３２×１０^−４ｍｍｏｌ／Ｌのリボフラビン、
    ０．００１〜０．００６ｍｍｏｌ／Ｌのチアミン塩酸塩、
    ０．０００５〜０．００２ｍｍｏｌ／ＬのビタミンＢ１２、
    ０．００５〜０．０２ｍｍｏｌ／Ｌのｉ−イノシトール、
    無機塩類として、
    ０．９０〜３.６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム、
    ０．４０〜１．６２ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸マグネシウム、
    ２．６６〜１０．６６ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウム、
    １３．０９〜５２．３８ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、
    ５８．６２〜２３４．４８ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、
    ０．５０〜２．０２ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム
    その他の成分として、
    １．００〜４．００ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン類、
    ２．７８〜１１．１２ｍｍｏｌ／ＬのＤ−グルコース、
    ０〜０．０６ｍｍｏｌ／Ｌのフェノールレッド、
    ４．８５〜１９．４２×１０^−４ｍｍｏｌ／Ｌのリポ酸、
    ０．５０〜２．００ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウム
    を含む、
    請求項９に記載の培地組成物。
11. グルタミン類が、グルタミンおよびアラニル−グルタミンのいずれかである、請求項１から１０の何れか一項に記載の培地組成物。
12. さらに２〜２０体積％の血清を含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の培地組成物。
13. さらに血清代替物の一以上を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の培地組成物。
14. さらに増殖因子の一以上を含む、請求項１から１３の何れか一項に記載の培地組成物。
15. 増殖因子が、塩基性線維芽細胞増殖因子である、請求項１４に記載の培地組成物。
16. さらに抗生物質を含む、請求項１から１５の何れか一項に記載の培地組成物。
17. 間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である、請求項１から１６の何れか一項に記載の培地組成物。
18. 間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪、歯髄、胎児由来組成物または人工多能性幹細胞のいずれかに由来する細胞である、請求項１から１７の何れか一項に記載の培地組成物。
19. 請求項１から１８の何れか一項に記載の培地組成物と、血清、血清代替物、サイトカイン及び抗生物質からなる群から選択される一以上とを含む、培地キット。
20. 請求項１から１８の何れか一項に記載の培地組成物と骨髄、脂肪、歯髄、胎児由来組成物または人工多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞を含む細胞群とを接触させることによって、前記細胞群を単離または、分化させることを含む、間葉系幹細胞の製造方法。
21. 請求項１から１８の何れか一項に記載の培地組成物中において、間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞組成物の製造方法。
22. 請求項２０または２１に記載の方法により得られる間葉系幹細胞組成物。
23. 請求項２０または２１に記載の方法により得られる、細胞治療用の間葉系幹細胞。
24. 請求項２０または２１に記載の方法により得られる、細胞培養上清。
25. 請求項２０または２１に記載の方法により得られる細胞培養上清から抽出した、細胞外小胞。

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