CN115505566A - 一种基于人源间充质干细胞的脱细胞基质材料及其制备方法 - Google Patents

一种基于人源间充质干细胞的脱细胞基质材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于再生医学及组织工程技术领域，涉及一种基于人源间充质干细胞的脱细胞基质材料及其制备方法，包括：向贴壁生长的人源间充质干细胞中加入含有抗坏血酸的成膜培养基与不含有抗坏血酸的扩增培养基进行交替更换培养，形成细胞膜片；将细胞膜片与皿壁剥离开，得到所述细胞膜片；将制备得到的细胞膜片进行脱细胞化处理，得到所述脱细胞基质材料。制备所得到的细胞膜片脱细胞化后任然可以保持膜片状态有效，且所得到的脱细胞基质材料中的DNA成分得到有效除去，充分保留了细胞外基质的核心成分及相关成分、三维结构、无内毒素、无有机溶剂和有毒溶剂残留。

Description

一种基于人源间充质干细胞的脱细胞基质材料及其制备方法
技术领域
本发明属于再生医学及组织工程技术领域，涉及一种基于人源间充质干细胞的脱细胞基质材料及其制备方法。
背景技术
传统上，ECM产品多采用同种异体或者异种组织制备而成，国内外已有来源于猪、马、牛等动物和人尸来源的真皮、心包、小肠等组织的脱细胞ECM材料产品进入临床应用。根据不同来源组织生物活性成分的差异，将分为两类惰性组织源材料和细胞外基质源材料。惰性组织源材料仅保留来源组织三维超微结构，组成成分中无生物活性成分，含有大量降解缓慢的弹性纤维，人体不易吸收，可导致修复区远期变形，易形成收缩性瘢痕化修复区域。
细胞外基质源材料以猪小肠黏膜下层(SIS)为代表。这种材料保留了多种生物活性成分，产品植入机体后可以主动诱导和促进周围细胞的迁入、黏附、增殖和分化，迁入的细胞对材料进行改造、降解和塑形，实现组织的形成和结构重塑。对已上市的异种脱细胞基质材料的临床试验结果分析表明，现有的产品均不同程度存在浆液肿、感染、免疫排斥反应、组织愈合不良等并发症。低免疫原性和无病毒传染风险是脱细胞ECM产品的基本要求。
与动物源或人尸源脱细胞ECM的脱细胞化过程比较，细胞源性脱细胞ECM过程简单，容易，更有利于排除不良反应，较好的保留ECM应有的活性。并且细胞培养过程更容易标准化，质量可控可溯。细胞膜片生成是细胞衍生细胞外基质的前提，目前较常用的细胞膜片制备方法主要是温敏法和机械分离法，虽然取得了一些成效，但细胞膜片的制备相对来说还是复杂，需要包被，需要特殊的温敏材料PIPA-Am，批量获取困难。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于人源间充质干细胞的脱细胞基质材料及其制备方法。
一方面，本发明提供了一种制备人源间充质干细胞膜片的方法，包括如下步骤：
向贴壁生长的人源间充质干细胞中加入含有抗坏血酸的成膜培养基与不含有抗坏血酸的扩增培养基进行交替更换培养，形成细胞膜片；将细胞膜片与皿壁剥离开，得到所述细胞膜片。
相较于现有制备细胞膜片的方法，本发明所提供的上述制备人源间充质干细胞膜片的方法，通过将所述含有抗坏血酸的成膜培养基与不含有抗坏血酸的扩增培养基对贴壁生长的人源间充质干细胞进行交替更换培养，使得培养形成的细胞膜片的膜片完整性好、薄厚均匀、质地均匀，且不需要包被，也不需要特殊的温敏材料，且节约成本。
在一些实施方案中，包括如下步骤：
S1：选取融合度达60％-90％、传代数为4-10代的人源间充质干细胞；
S2：向贴壁生长的人源间充质干细胞中加入成膜培养基进行培养，每隔2-6天，用扩增培养基与所述成膜培养基进行交替更换，连续培养9-15天；
S3：将培养基吸出，对所形成的细胞膜片表面进行清洗，将细胞膜片与皿壁剥离开，得到所述细胞膜片。
在一些实施方案中，所选取的人源间充质干细胞的融合度达80％-90％、传代数为6-8代。
在一些实施方案中，所述培养的条件为：37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。
在一些实施方案中，所述扩增培养基包括：基础培养基和添加物，所述添加物包括人血清白蛋白、L-谷氨酰胺、非必须氨基酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、FGF、PDGF-BB、IGF-1、地塞米松中的一种或任意多种组合；所述成膜培养基包括：基础培养基和添加物，所述添加物包括抗坏血酸以及人血清白蛋白、L-谷氨酰胺、非必须氨基酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、FGF、PDGF-BB、IGF-1、地塞米松中的一种或任意多种组合。
在一些实施方案中，所述扩增培养基的添加物包括：人血清白蛋白1-5％、L-谷氨酰胺1-5mM、非必须氨基酸0.1-1mg/mL，胰岛素1-10ug/mL、转铁蛋白5-20mg/mL、亚硒酸钠1-50mg/mL、EGF 0.1-10ng/mL、FGF 0.1-5ng/mL、PDGF-BB 1-10ug/mL、IGF-1 1-10ug/mL、地塞米松2-50nM。
在一些实施方案中，所述扩增培养基的添加物包括：人血清白蛋白2-3％、L-谷氨酰胺2-3mM、非必须氨基酸0.2-0.5mg/mL，胰岛素8-10ug/mL、转铁蛋白18-20ug/L、亚硒酸钠10-20ug/L、EGF 8-10ng/mL、FGF 1-3ng/mL、PDGF-BB 2-4ug/mL、IGF-1 1-3ug/mL、地塞米松5-10nM。
在一些实施方案中，所述扩增培养基的添加物包括：人血清白蛋白2％、L-谷氨酰胺2mM、非必须氨基酸0.2mg/mL，胰岛素10ug/mL、转铁蛋白18-20ug/L、亚硒酸钠20ug/L、EGF10ng/mL、FGF 1ng/mL、PDGF-BB 2ug/mL、IGF-1 1ug/mL、地塞米松5nM。
在一些实施方案中，所述扩增培养基的基础培养基包括：DMEM/F12、a-MEM、DMEM、IMDM、Knock out DMEM/F12中的任意一种；优选地，所述基础培养基包括a-MEM。
在一些实施方案中，所述成膜培养基的添加物包括：人血清白蛋白1-5％、L-谷氨酰胺1-5mM、非必须氨基酸0.1-1mg/mL，胰岛素1-10ug/mL、转铁蛋白5-20mg/mL、亚硒酸钠1-50mg/mL、EGF 0.1-10ng/mL、FGF 0.1-5ng/mL、PDGF-BB 1-10ug/mL、IGF-1 1-10ug/mL、地塞米松2-50nM、抗坏血酸25-100ug/mL。
在一些实施方案中，所述成膜培养基的添加物包括：人血清白蛋白2-3％、L-谷氨酰胺2-3mM、非必须氨基酸0.2-0.5mg/mL，胰岛素8-10ug/mL、转铁蛋白18-20ug/L、亚硒酸钠10-20ug/L、EGF 8-10ng/mL、FGF 1-3ng/mL、PDGF-BB 2-4ug/mL、IGF-1 1-3ug/mL、地塞米松5-10nM、抗坏血酸50-60ug/mL。
在一些实施方案中，所述成膜培养基的添加物包括：人血清白蛋白2％、L-谷氨酰胺2mM、非必须氨基酸0.2mg/mL，胰岛素10ug/mL、转铁蛋白18-20ug/L、亚硒酸钠20ug/L、EGF10ng/mL、FGF 1ng/mL、PDGF-BB 2ug/mL、IGF-1 1ug/mL、地塞米松5nM、抗坏血酸50ug/mL。
在本发明所提供的上述方案中，当将本发明所提供的添加物替换为现有公开的添加物组合或者将本发明中的添加物任意去掉一种，制备得到的细胞膜片均会出现完整性差，膜片薄，不均匀，质地脆的问题。
在一些实施方案中，所述成膜培养基的基础培养基包括：DMEM/F12、a-MEM、DMEM、IMDM、Knock out DMEM/F12中的任意一种；优选地，所述基础培养基包括a-MEM。
在一些实施方案中，所述人源间充质干细胞从人体不同部位分离得到，所述人源间充质干细胞的分离部位包括：骨髓、脂肪、脐带；优选地，所述人源间充质干细胞分离自：脐带；优选地，所述人源间充质干细胞分离自：脐带的沃顿胶面。
另一方面，本发明还提供了一种制备脱细胞基质材料的方法，所述方法包括：将通过所述方法制备得到的细胞膜片进行脱细胞化处理，得到所述脱细胞基质材料；
其中，所述脱细胞化处理包括：将反复冻融与渗透压溶液相结合、以反复多次的方式进行脱细胞化处理。
在一些实施方案中，所述脱细胞化处理包括如下步骤：
1)将冷冻后的所述细胞膜片进行溶解；
2)加入超纯水进行一次震荡，更换超纯水，进行二次震荡，至少重复一次；
3)将超纯水换为渗透压溶液，进行三次震荡，震荡结束后，弃去液体将细胞膜片进行冷冻，过夜；
4)重复步骤1)至步骤3)。
在一些实施方案中，所述冷冻的温度为-75--95℃；优选地，所述冷冻的温度为-80℃。
在一些实施方案中，所述溶解的温度为35-40℃；优选地，所述溶解的温度为37℃。
在一些实施方案中，所述一次震荡的条件为：震荡温度35-40℃、频率110-130r/min、震荡时间为11-20min；优选地，震荡温度37℃、频率120r/min、震荡时间为15min。
在一些实施方案中，所述二次震荡的条件为：震荡温度37℃、频率120r/min、震荡时间为0.5-2小时；所述二次震荡的条件为：震荡温度35-40℃、频率110-130r/min、震荡时间为1小时。
在一些实施方案中，所述渗透压溶液包括：氯化钠溶液；优选地，所述氯化钠溶液浓度为0.01-3mol/L，pH值不超过7.8；优选地，所述氯化钠溶液浓度为0.015mol/L。
在一些实施方案中，所述三次震荡的条件为：震荡温度35-40℃、频率110-130r/min、震荡时间为1-4小时；所述三次震荡的条件为：震荡温度37℃、频率120r/min、震荡时间为3小时。
在一些实施方案中，所述步骤4)重复的次数为：4-6次；优选地，所述重复的次数为5次。
针对脱细胞的方法，现有技术虽然也已报道了很多可以采用的方法，但大多存在：难以将供体组织DNA去除完全；或多采用多种有机物和高强度酸碱溶剂，耗时较长，导致ECM材料中的活性成分被破坏，有害溶剂残留，引起不同程度的并发症和副作用，影响组织修复效果。而通过本发明所提供的方法对细胞膜片进行脱细胞处理，不仅对活性成分无损伤，所得到的脱细胞基质材料中无细胞和细胞碎片残留，DNA成分得到有效去除，且有大量胶原纤维存在，这些胶原纤维彼此交织成有空隙的条索，同时维持着组织整体的稳定性。
在一些实施方案中，所述方法还包括：对脱细胞化处理后的细胞外基质进行冷冻干燥；所述冷冻干燥包括如下步骤：将脱细胞化处理后的细胞外基质放入运输盒中运输至真空冷冻干燥仪处进行冷冻干燥。
在一些实施方案中，所述真空冷冻干燥仪的室温为：24℃，冷阱温度为：-64℃，真空为：0.2mbar。
再另一方面，本发明还提供了一种通过所述的方法制备得到的细胞膜片或者通过所述的方法制备得到的脱细胞基质材料。
本发明还提供了一种所述的细胞膜片或者所述的脱细胞基质材料在制备修复材料中的应用。
综上所述，本申请具有以下有益技术效果：
(1)本发明所提供的人源间充质干细胞膜片以及制备方法，通过将所述成膜培养基与扩增培养基对贴壁生长的人源间充质干细胞进行交替更换培养，使得制备得到的细胞膜片厚度可达百微米级别、薄厚均匀、质地均匀，且脱细胞化后任然可以保持膜片状态。所述方法无需特殊装置、也无需培养板包。
(2)本发明所提供的脱细胞化方法，有效除去了DNA成分，且充分保留天然细胞外基质的核心成分及相关成分、三维结构、无内毒素、无有机溶剂和有毒溶剂残留。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例2所制备得到的人脐带间充质干细胞膜片的代表性图片；
图2为本发明实施例2所制备得到的人脐带间充质干细胞膜片与对比例1所制备得到的人脐带间充质干细胞膜片的HE染色对比图；
图3为通过对比例4采用冻融与酶解结合的脱细胞方式处理所得到的脱细胞基质材料的HE染色图片；
图4为通过本发明实施例3脱细胞方法制备所得到的脱细胞基质材料的HE染色图片；
图5为通过本发明实施例3脱细胞方法制备所得到的脱细胞基质材料的超微结构图片；
图6为通过本发明实施例3脱细胞方法制备所得到的脱细胞基质材料的主要组成成分免疫组织化学图片；
图7为通过本发明实施例3脱细胞方法制备所得到的脱细胞基质材料的全身毒性试验结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
关于本发明实施例中所使用的各培养基及成分的具体信息如下：
Figure BDA0003874512210000051
Figure BDA0003874512210000061
实施例1人脐带间充质干细胞原代分离与培养
(1)用高压灭菌手术剪将脐带剪成3-5cm长的小段，放在一次性10cm塑料培养皿中用于分离。用中号镊子轻轻挤压脐带，使残留在血管中的血液流出。从横切面找到脐静脉和脐动脉，先沿动脉管用镊子纵向将脐带撕开，拽出血管弃掉，静脉做同样处理。将去掉血管的脐带平展在培养皿上，挨着血管的一面朝上，此面为脐带沃顿胶面，用镊子将上层沃顿胶轻轻撕下。
(2)将轻轻撕下的沃顿胶放入新的10cm培养皿，加入10ml PBS，进行剪碎处理，剪为2-3mm*2-3mm大小的组织块。将剪好的组织用PBS清洗两遍。将清洗好的组织块，用组织镊将组织块依次铺到一新的10ml塑料培养皿中(为方便观察，以培养皿底类似九宫格画线，优选25格，每格接种一块儿组织)。
(3)将培养皿盖朝下放置在37℃，5％CO2的培养箱3小时后取出细胞，用移液枪抵住培养皿管壁以1毫升每分钟的速率加入完全培养基(配方为含10％胎牛血清的a-MEM培养基)3毫升，用枪尖引流至全皿覆盖有培养基。此处加液切记不要把组织块吹起，放入培养箱继续培养。24h内不要摇动细胞培养皿，防止组织块脱落，24小时时加入2毫升培养基，放入培养箱继续培养。
(4)48h后，取出培养皿，用移液枪小心吸走组织块空隙中的培养基，更换新鲜培养基10毫升。以后每2-3天换液一次待镜下观察有贴壁细胞长出，且单组织块爬出细胞融合度达70-80％时，即可进行传代操作，传代操作具体步骤如下：
待细胞融合度达60-80％时，吸出原培养基，沿皿壁缓慢加入适量PBS，轻轻摇动培养皿吸出PBS以清洗细胞表面残留培养基；根据培养器皿大小加入适量的EDTA-胰酶，镜下观察细胞松散成近圆形，轻轻晃动培养器皿，用移液枪头吹吸打散细胞为单细胞，吸出放入离心管；原培养器皿种加入等体积MSC完全培养基进行冲洗，将完全培养基进行冲洗吸出一并放入前离心管内，于800g条件下，离心5min，弃上清，加入适量培养基重悬细胞；取100ul细胞计数后，以1*106个细胞/10ml培养基密度重新铺入新的10cm的培养皿中，混匀，放入培养箱继续培养，2-3天换液一次。细胞每进行一次上述传代操作，代数增加1。
实施例2人脐带间充质干细胞细胞膜片制备
选取融合度达80％-90％的6-8代间充质干细胞，镜下观察细胞贴壁分布均匀，边缘无脱离皿壁的空隙；将原培养基吸出，每孔加2毫升成膜培养基(本实施例所述的培养基体积，是以6孔板为例，其余培养器材按对应要求使用)，将细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养，每隔3天换用扩增培养基，与成膜培养基交替更换，连续培养14天，将培养基吸出，每孔加适量PBS(加液时贴侧壁缓慢加液，避免直接冲击细胞)，水平轻摇，清洗细胞表面残留培养基后吸走，再在每孔中加入适量PBS；用移液枪尖沿着膜片的外周一圈，剥离开细胞膜片和皿壁，使膜片渐渐脱离皿底；剥离下整片完整的细胞膜片，置50ml离心管中，-80℃冰箱冷藏。本实施例所使用的成膜培养基的配方包括基础培养基和添加物，基础培养基选择a-MEM，添加物包括人血清白蛋白2％、L-谷氨酰胺2mM、非必须氨基酸0.2mg/mL，胰岛素10ug/mL、转铁蛋白20mg/mL、亚硒酸钠10mg/mL、EGF 10ng/mL、FGF 1ng/mL、PDGF-BB 2ug/mL、IGF-11ug/mL、地塞米松5nM、抗坏血酸50ug/mL；本实施例所使用的扩增培养基的配方包括基础培养基和添加物，基础培养基选择a-MEM，添加物包括人血清白蛋白2％、L-谷氨酰胺2mM、非必须氨基酸0.2mg/mL，胰岛素10ug/mL、转铁蛋白20mg/mL、亚硒酸钠10mg/mL、EGF10ng/mL、FGF 1ng/mL、PDGF-BB 2ug/mL、IGF-11ug/mL、地塞米松5nM，即上述所使用的成膜培养基与扩增培养基的不同之处在于是否含有抗坏血酸，将含有和不含有抗坏血酸的培养基交替更换培养制备得到细胞膜片，制备得到的细胞膜片代表性图片如图1所示，细胞膜片完整，厚度均匀，且该实施例将含有和不含有抗坏血酸的培养基交替更换培养制备细胞膜片，不仅制备得到的细胞膜片完整，厚度均匀，且节约成本。
对比例1
该对比例1为：将实施例2中交替更换培养所使用的成膜培养基与扩增培养基替换成现有技术公开的用于对间充质干细胞进行扩增培养制备细胞膜片的培养基，如文献“Native extracellular matrix preserves mesenchymal stem cell“stemness”anddifferentiation potential under serum-free culture conditions”公开了一种对间充质干细胞进行扩增培养制备细胞膜片的培养基，培养基的配方为：基础培养基：α-MEM，添加物：谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)、15％FBS、50uM抗坏血酸，并按照实施例2的方法制备得到细胞膜片。即该对比例与实施例2的不同之处仅在于所使用的培养基不同，该对比例制备得到的膜片完整性差，膜片薄，不均匀，质地脆。对通过本发明实施例2制备所得到的人脐带MSCs细胞膜片与通过上述现有文献所公开的培养基制备所得到的人脐带MSCs细胞膜片进行HE染色，结果如图2所示，结果表明：本发明实施例所制备得到的细胞膜片完整，厚度均匀，约为130.1±22.0um，使用现有文献所公开的培养基制备所得到的膜片略显细碎、菲薄，且细胞外基质不丰富，厚度不均匀，约为21.7±32.3um。
对比例2
该对比例2为：将实施例2所使用的包含：a-MEM基础培养基和添加物，添加物包括人血清白蛋白2％、L-谷氨酰胺2mM、非必须氨基酸0.2mg/mL，胰岛素10ug/mL、转铁蛋白20mg/mL、亚硒酸钠10mg/mL、EGF 10ng/mL、FGF 1ng/mL、PDGF-BB 2ug/mL、IGF-1 1ug/mL、地塞米松5nM的扩增培养基替换为包含：a-MEM基础培养基和添加物，添加物包括人血清白蛋白2％、L-谷氨酰胺2mM、非必须氨基酸0.2mg/mL，胰岛素10ug/mL、转铁蛋白20mg/mL、亚硒酸钠10mg/mL、FGF 1ng/mL、PDGF-BB 2ug/mL、IGF-1 1ug/mL、地塞米松5nM的扩增培养基，该对比例所使用的成膜培养在所使用的扩增培养基基础上添加等量的抗坏血酸，同样按照实施例2的方法制备得到细胞膜片。即该对比例2与实施例2的区别仅在于：将本发明实施例2中所使用的成膜培养基与扩增培养基中的成分EGF去掉，该对比例2中的所使用的成膜培养基与扩增培养基均不含有成分EGF，结果表明，使用对比例2的培养基制备得到的细胞膜片细碎、菲薄、成膜片效果不好。
对比例3
该对比例3为：将实施例2中交替更换培养所使用的成膜培养基与扩增培养基替换成仅使用扩增培养基更换培养，即该对比例仅采用不含抗坏血酸的扩增培养基，按照实施例2的方法制备得到细胞膜片，结果表明，使用对比例3的培养基制备得到的细胞膜片不成膜状。
实施例3人脐带间充质干细胞脱细胞基质材料的制备
一、对人脐带间充质干细胞细胞膜片进行脱细胞化处理
(1)将装有脐带间充质干细胞细胞膜片的50ml离心管从-80℃冰箱取出放入水浴锅内溶解，溶解温度37℃；
(2)膜片溶解后加入适量超纯水，超纯水的加入量以覆盖膜片为准，放入恒温振荡器震荡孵育，震荡孵育温度37℃、频率120r/min、震荡时间为15分钟；更换新的超纯水后，继续震荡，震荡温度37℃、频率120r/min、震荡时间为1小时，再重复一次；
(3)将超纯水换为氯化钠溶液，继续震荡，氯化钠溶液浓度为0.015mol/L、pH值不超过7.8；震荡温度37℃、频率120r/min、震荡时间为3小时；震荡结束后，弃去液体放入-80℃冰箱过夜；
(4)重复(1)-(3)的步骤5次；
(5)将经过上述脱细胞化步骤处理之后的膜片收集到50ml离心管中，放入-80℃冰箱待冷冻干燥。
二、对脱细胞化细胞外基质(dECM)进行冷冻干燥
(1)从-80℃冰箱取出装有脱细胞化细胞外基质(dECM)的50ml离心管放入装有适量干冰的运输盒中，运输到真空冷冻干燥仪处。
(2)真空冷冻干燥仪室温为24℃，将需冷冻干燥的50ml离心管放入冷阱仓内，调节冷阱温度-64℃，真空0.2mbar进行冷冻干燥。
(3)冷冻干燥结束后取出离心管，4℃保存。
对比例4
该对比例4与实施例3不同之处在于，冻融温度采用深低温速冻与室温复温的脱细胞方式，具体为：液氮速冻10分钟，37度水浴锅复温10分钟，反复3-5次，结果表明：脱细胞化后无法保持膜片状态。
对比例5
该对比例与实施例3不同的是，采用冻融与酶解结合的脱细胞方式，具体为：0.5％胰酶37℃作用半小时，PBS漂洗，然后采用上述脱细胞化方法，反复冻融3次，结果表明：对细胞外基质成分有较强的破坏力，脱细胞后保留细胞外基质成分保留较少。直径3cm的细胞膜片采用本发明实施例3中方法脱细胞冷冻干燥后的质量5.40±0.50mg；采用冻融和酶法结合的方法脱细胞冷冻干燥后质量2.40±0.20mg。并且采用冻融与酶解结合的脱细胞方式DNA不易从基质洗脱，导致大量DNA残留，具体如图3所示。
实施例4对人脐带间充质干细胞脱细胞基质材料的理化性质、组织学、主要成分和生物学性能进行检测
一、理化性能检测，包括杨氏模量、吸液量和DNA含量
(1)杨氏模量检测：采用Piuma Nanoindenter纳米压痕测试仪(PiumaNanoindenter，Optics11，荷兰)对制备得到的脱细胞基质材料的杨氏模量进行测定。测量参数如下，探头刚度为0.48N/m，探头直径为46μm，以5μm/s的速度进行探测，采用赫兹模型对卸载-压痕数据曲线加载段80％的数据计算杨氏模量。按照上述方法对通过上述方法制备得到的3批样品进行检测。结果：杨氏模量大小为100-200Pa。
(2)吸液量检测：按照YY/T 1511-2017胶原蛋白海绵推荐的吸液性检测方法进行。即取精密称量质量为20mg的测试样品。浸入盛有20℃±1℃水的烧杯中，用手指轻揉直至完全浸湿，排除所有空气，吸足水分后，用小镊子轻轻夹住一角将其从水中取出，轻持镊子在水面上排水1min后，再次称量。按公式A＝(m2–m1)/m1)计算样本的吸液变化倍数。式中A代表试样吸水倍数，m1未吸液前样本质量，m2吸液后样本质量。按照上述方法对按照上述方法制备得到的3批样品进行检测。结果：可容纳自身质量17.02±0.79倍的液体量。
(3)DNA残留量检测：依据生物制剂残留DNA检测方法(《中国药典》2020，附录IX-B外源性DNA残留量测定法)，采用荧光染色法检测通过上述方法制备得到的脱细胞基质材料样本的DNA残留量。结果：材料DNA残留量不超过10ng/mg干重。
二、组织学检测
(1)光学显微镜观察：将制备所得到的脱细胞基质材料用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，进行组织形态学分析。H&E溶液染色：将组织切成5μm薄片，脱蜡复水，用苏木精和伊红，即H&E染色，并用尼康数码显微成像系统(Nikon DS-Ri1-U3)拍照。
结果如图4所示：无细胞和细胞碎片残留，大量胶原纤维存在，这些胶原纤维彼此交织成有空隙的条索，维持着组织整体的稳定性。
(2)扫描电镜超微结构观察：将制备所得到的脱细胞基质材料加入4℃预冷的2.5％戊二醛溶液固定24小时以上。固定完成后，4℃预冷PBS浸洗3次后，乙醇梯度脱水，梯度4℃预冷酒精/乙酸异戊酯浸洗，临界点干燥(Leica EM CPD300，徕卡，德国)，喷金后扫描电镜下观察(S-3400N，日立，日本)。
结果如图5所示：材料呈多孔状结构，孔径均匀，孔径大小为10-100微米。
三、主要组成成分检测
方法：将制备所得到的脱细胞基质材料用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，进行Masson染色检测胶原纤维，地伊红染色检测弹力纤维。使用尼康数码显微成像系统(NikonDS-Ri1-U3)拍照。结果如图6所示：显示脱细胞后仍见大量胶原纤维存在，这些胶原纤维彼此交织成有空隙的条索，维持着组织整体的稳定性。地衣红染色结果可以看到，在脱细胞后组织中，也同样保留了弹力纤维的成分，这些皮下结缔组织中常见的纤维成分在经过一系列的脱细胞过程后，均被保留下来。
四、生物学性能检测，包括细胞毒性、全身毒性试验、皮肤刺激试验
(1)细胞毒性：按照6cm2样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，24±2小时制备浸提液，浸提基质：含血清的DMEM培养基。取样品浸提液按照GB/T16886.5-2017(《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》)中规定的试验方法进行试验。结果：无细胞溶解，无细胞增殖下降情况，细胞毒性反应小于1级。
(2)全身毒性试验：按照并实施动物实验中所有合理有效的替代、减少和优化的替代方法指导下，通过SD大鼠皮下包埋材料，包埋材料重量按照人体用量的50倍计算。本实验所制备的直径5cm，厚约200um的dECM材料重约5mg。本实验中按照体重60kg成年人人体表面积损伤5％，即1000cm2范围平铺100-200μm厚度材料计算所用材料重量约250mg。按照所用材料质量250mg的50倍，即50mg材料包埋于体重200±20g大鼠皮下，阳性对照组采用皮下包埋同质量同形状的PLGA，同时设假手术组。按照GB/T16886.11-2011(《医疗器械生物学评价第11部分：全身毒性试验标准》)中规定的试验方法进行试验。结果如图7示。
(3)皮肤刺激试验：按照6cm2样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，24±2小时制备浸提液，浸提基质为：生理盐水和芝麻油。按照GB/T16886.10-2015(《医疗器械生物学评价第10部分：刺激和迟发型超敏反应试验》)中规定的试验方法进行试验。结果：试验结果显示注射72小时后，各注射点均无红斑及水肿现象；试验样品和溶剂对照平均记分之差小于1.0。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims (10)

1.一种制备人源间充质干细胞膜片的方法，其特征在于，包括如下步骤：
向贴壁生长的人源间充质干细胞中加入含有抗坏血酸的成膜培养基与不含有抗坏血酸的扩增培养基进行交替更换培养，形成细胞膜片；
将细胞膜片与皿壁剥离开，得到所述细胞膜片。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：选取融合度达60％-90％、传代数为4-10代的人源间充质干细胞；
S2：向贴壁生长的人源间充质干细胞中加入成膜培养基进行培养，每隔2-6天，用扩增培养基与所述成膜培养基进行交替更换，连续培养9-15天；
S3：将培养基吸出，对所形成的细胞膜片表面进行清洗，将细胞膜片与皿壁剥离开，得到所述细胞膜片；
优选地，所选取的人源间充质干细胞的融合度达80％-90％、传代数为6-8代；
优选地，所述培养的条件为：37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。
3.如权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述扩增培养基包括：基础培养基和添加物，所述添加物包括人血清白蛋白、L-谷氨酰胺、非必须氨基酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、FGF、PDGF-BB、IGF-1、地塞米松中的一种或任意多种组合；
所述成膜培养基包括：基础培养基和添加物，所述添加物包括抗坏血酸以及人血清白蛋白、L-谷氨酰胺、非必须氨基酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、FGF、PDGF-BB、IGF-1、地塞米松中的一种或任意多种组合。
4.如权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述扩增培养基的添加物包括：
人血清白蛋白1-5％、L-谷氨酰胺1-5mM、非必须氨基酸0.1-1mg/mL，胰岛素1-10ug/mL、转铁蛋白5-20mg/mL、亚硒酸钠1-50mg/mL、EGF 0.1-10ng/mL、FGF 0.1-5ng/mL、PDGF-BB 1-10ug/mL、IGF-11-10ug/mL、地塞米松2-50nM；
优选地，所述扩增培养基的添加物包括：人血清白蛋白2-3％、L-谷氨酰胺2-3mM、非必须氨基酸0.2-0.5mg/mL，胰岛素8-10ug/mL、转铁蛋白18-20ug/L、亚硒酸钠10-20ug/L、EGF8-10ng/mL、FGF 1-3ng/mL、PDGF-BB 2-4ug/mL、IGF-11-3ug/mL、地塞米松5-10nM；
优选地，所述扩增培养基的基础培养基包括：DMEM/F12、a-MEM、DMEM、IMDM、Knock outDMEM/F12中的任意一种；优选地，所述基础培养基包括a-MEM。
5.如权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述成膜培养基的添加物包括：人血清白蛋白1-5％、L-谷氨酰胺1-5mM、非必须氨基酸0.1-1mg/mL，胰岛素1-10ug/mL、转铁蛋白5-20mg/mL、亚硒酸钠1-50mg/mL、EGF 0.1-10ng/mL、FGF 0.1-5ng/mL、PDGF-BB 1-10ug/mL、IGF-11-10ug/mL、地塞米松2-50nM、抗坏血酸25-100ug/mL；
优选地，所述成膜培养基的添加物包括：人血清白蛋白2-3％、L-谷氨酰胺2-3mM、非必须氨基酸0.2-0.5mg/mL，胰岛素8-10ug/mL、转铁蛋白18-20ug/L、亚硒酸钠10-20ug/L、EGF8-10ng/mL、FGF 1-3ng/mL、PDGF-BB 2-4ug/mL、IGF-11-3ug/mL、地塞米松5-10nM、抗坏血酸50-60ug/mL；
优选地，所述成膜培养基的基础培养基包括：DMEM/F12、a-MEM、DMEM、IMDM、Knock outDMEM/F12中的任意一种；优选地，所述基础培养基包括a-MEM。
6.如权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述人源间充质干细胞从人体不同部位分离得到，所述人源间充质干细胞的分离部位包括：骨髓、脂肪、脐带；优选地，所述人源间充质干细胞分离自：脐带；优选地，所述人源间充质干细胞分离自：脐带的沃顿胶面。
7.一种制备脱细胞基质材料的方法，其特征在于，所述方法包括：将如权利要求1-6任一所述方法制备得到的细胞膜片进行脱细胞化处理，得到所述脱细胞基质材料；
其中，所述脱细胞化处理包括：将反复冻融与渗透压溶液相结合、以反复多次的方式进行脱细胞化处理；
优选地，所述脱细胞化处理包括如下步骤：
1)将冷冻后的所述细胞膜片进行溶解；
2)加入超纯水进行一次震荡，更换超纯水，进行二次震荡，至少重复一次；
3)将超纯水换为渗透压溶液，进行三次震荡，震荡结束后，弃去液体将细胞膜片进行冷冻，过夜；
4)重复步骤1)至步骤3)；
优选地，所述冷冻的温度为-75--95℃；优选地，所述冷冻的温度为-80℃；
优选地，所述溶解的温度为35-40℃；优选地，所述溶解的温度为37℃；
优选地，所述一次震荡的条件为：震荡温度35-40℃、频率110-130r/min、震荡时间为11-20min；优选地，震荡温度37℃、频率120r/min、震荡时间为15min；
优选地，所述二次震荡的条件为：震荡温度37℃、频率120r/min、震荡时间为0.5-2小时；所述二次震荡的条件为：震荡温度35-40℃、频率110-130r/min、震荡时间为1小时；
优选地，所述渗透压溶液包括：氯化钠溶液；优选地，所述氯化钠溶液浓度为0.01-3mol/L，pH值不超过7.8；优选地，所述氯化钠溶液浓度为0.015mol/L；
优选地，所述三次震荡的条件为：震荡温度35-40℃、频率110-130r/min、震荡时间为1-4小时；所述三次震荡的条件为：震荡温度37℃、频率120r/min、震荡时间为3小时；
优选地，所述步骤4)重复的次数为：4-6次；优选地，所述重复的次数为5次。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对脱细胞化处理后的细胞外基质进行冷冻干燥；所述冷冻干燥包括如下步骤：将脱细胞化处理后的细胞外基质放入运输盒中运输至真空冷冻干燥仪处进行冷冻干燥；优选地，所述真空冷冻干燥仪的室温为：24℃，冷阱温度为：-64℃，真空为：0.2mbar。
9.一种通过如权利要求1-6任一所述的方法制备得到的细胞膜片或者一种通过如权利要求7-9任一所述的方法制备得到的脱细胞基质材料。
10.如权利要求9所述的细胞膜片或者所述的脱细胞基质材料在制备修复材料中的应用。
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赵文芝;李玉成;李义山;张军;: "生物功能化多层膜及其在组织工程中的应用", 内蒙古大学学报(自然科学版) *
邹刚;尤奇;沈梦杰;张骏;汤井沣;金瑛;刘毅;: "体外构建人羊膜间充质干细胞膜片及成骨分化潜能", 中国组织工程研究 *

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