JP2020536683A - 軟骨移植片の再細胞化を可能にするエラスチン低減 - Google Patents
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Abstract
Description
[0014]軟骨試料が無菌でない場合、軟骨試料は、エラスチンの低減前または低減後に汚染除去ステップに付され得る。
[0017]本発明の方法は、細胞を、エラスチンが低減された軟骨スキャフォールドへ接着させることによって、エラスチンが低減された軟骨スキャフォールドを再細胞化するステップを含み得る。これは、細胞を、エラスチンが低減された軟骨スキャフォールドへ播種することによって、または細胞を、エラスチンが低減された軟骨スキャフォールドへ注入することと、上記細胞を、エラスチンが低減された軟骨スキャフォールドの空の通路および小腔へ遊走させることとによって達成され得る。細胞を、軟骨スキャフォールドへ注入するために、針を使用してもよい。
[0030]「軟骨スキャフォールド」という用語は、本明細書中で使用する場合、主にコラーゲン線維、非コラーゲン性糖タンパク質およびプロテオグリカンで構成される軟骨の細胞外物質を指す。「同種」という用語は、本明細書中で使用する場合、移植片のレシピエントではない個体に由来することを指す。
[0033]「エラスターゼ」という用語は、本明細書中で使用する場合、ペプチダーゼS1ファミリーのセリンエンドペプチダーゼを指す(http://enzyme.expasy.org/peptidas.txtを参照のこと)。好ましいエラスターゼは、EC番号3.4.21.36、3.4.21.37または3.4.21.71を有する種類由来の酵素である。エラスターゼは、エラスチンを含むタンパク質を加水分解する。エラスターゼ1ユニットは、pH8および25℃で、1分当たりN−スクシニル−L−Ala−Ala−Ala−p−ニトロアニリド1.0μmを加水分解する酵素の量として定義される。エラスターゼは、膵エラスターゼ、膵エラスターゼII、白血球エラスターゼ、および好中球エラスターゼからなる群から選択され得る。本発明の一実施形態において、エラスターゼは、膵エラスターゼである。
[0037]「関節軟骨」という用語は、本明細書中で使用する場合、滑膜関節中の骨の相対する表面、関節接合を覆う軟骨を指す。
[0040]「軟骨細胞」という用語は、本明細書中で使用する場合、軟骨を構成および産生する特殊な細胞を指す。
[0042]「骨髄由来間質細胞」、またはBMSCという用語は、本明細書中で使用する場合、骨髄に由来して、プラスチックへの付着性ならびにCD45およびCD14等の造血マーカー発現の欠如によって同定される間葉系細胞を指す。
[0046]「骨形成能」という用語は、本明細書中で使用する場合、細胞が骨を産生することができることを指す。
[0048]「障害」という用語は、本明細書中で使用する場合、機能、構造、またはその両方の異常を指し、発達中の遺伝性機能不全もしくは胚性機能不全に、または外傷もしくは疾患等の外因性要因に起因する。
軟骨スキャフォールドの提供
[0051]軟骨は通常、組織学的な外観に基づいて、3つのタイプに分類される:a)関節、肋骨、鼻または気管に由来され得る硝子軟骨、b)椎間板、瘢痕組織および半月板に見られ得る線維軟骨、およびc)咽頭蓋、外耳および耳管から得られ得る弾性軟骨。好ましい軟骨試料は、弾性軟骨試料である。
軟骨スキャフォールドにおけるエラスチンの低減
[0057]とりわけ、弾性軟骨は、エラスチンの大きな線維束を含有し、弾性軟骨に優れた柔軟性を付与する。エラスチン線維は、コラーゲンネットワークを横行して、軟骨細胞が存在する小腔と称されるポケットを包囲する。これらのエラスチン線維を、軟骨スキャフォールドから除去することで、コラーゲンネットワークを横行する空の通路が残る。
in vitroでの軟骨試料の再細胞化に関する方法
[0060]軟骨スキャフォールドからのエラスチンの低減または完全な除去後に、小腔が開放し、エラスチン線維が、マトリックスを横行していたところに通路が生じ、細胞レムナントの除去を容易にする。上記エラスチンの低減または完全な除去はまた、軟骨スキャフォールドのグリコサミノグリカン(GAG)の低減をもたらし得る。軟骨細胞等の細胞の接着は、GAGによって防止され得ると報告されている(Baraら、2012.Connect Tissue Res 53:220〜8)ため、軟骨スキャフォールド中のGAGの低減は、スキャフォールドの再細胞化に有益であり得る。ここで、通路およびアクセス可能な小腔は、細胞がスキャフォールドに浸潤するのを可能にし、軟骨の再細胞化を可能にする。
a)静的播種;軟骨スキャフォールドは、培養ウェルの底部に配置されてもよく、続いて、培養ウェルに、細胞を含んだ増殖培地(通常、約1.000個の細胞/スキャフォールドmm3〜10.000個の細胞/mm3)を充填する。細胞は沈降し、軟骨スキャフォールドに付着する。
b)動的播種;軟骨スキャフォールドは、細胞を含んだ増殖培地(通常、約5.000個の細胞/スキャフォールドmm3〜約20.000個の細胞/mm3)を充填した閉じたチューブ中に配置されて、角度45°および90°で回転させながらインキュベートされ得る。
c)注入;約1.000個の細胞/スキャフォールドmm3〜約10.000個の細胞/mm3の細胞懸濁液は、針を用いて軟骨スキャフォールドへ注入され得る。
再細胞化された軟骨スキャフォールドの移植
[0067]再細胞化された軟骨スキャフォールドは、宿主への移植に使用され得る。
エラスチンが低減された軟骨スキャフォールドの移植
[0070]耳全体の再構築のためには、移植に先立つ再細胞化が好ましい場合があるが、無細胞アプローチは、関節軟骨欠損、骨軟骨欠損の処理に、または軟骨膜がまだ無傷である場合は、鼻もしくは耳介欠損に役立ち得る。このアプローチは、エラスチンが低減された、再細胞化されていない軟骨スキャフォールドの、宿主への移植を含む。再細胞化されていない軟骨スキャフォールドの移植手順は、再細胞化された軟骨スキャフォールドに関して、本明細書中で上述したような手順と同様である。
動的播種によるBMSCを用いた再細胞化
[0073]12週齢の仔ウシの外耳を水で洗浄して、軟骨のみが残るまで、軟骨膜、皮膚および筋肉を、メスを使用して除去した。続いて、直径6mmおよび高さ1mmのバイオプシーを、バイオプシーパンチを使用して、耳介軟骨から入手し、したがって、試料はそれぞれ、容量が約30mm3であった。
注入後の原位置での軟骨形成
[0078]軟骨の幾つかの領域は、遊走によって細胞が到達するのが困難であり、例えば、外耳の軟骨は、高密度な軟骨膜層で囲まれている。Utomoら、2015年によって示されるように、耳全体を、エラスターゼを使用して脱細胞化することができる。軟骨膜は、軟骨にしっかりと結合されており、軟骨構造に損傷を与えることなく、軟骨膜を除去することは、実現不可能である。
関節モデルにおけるin vivoでの軟骨形成
[0085]エラスターゼ処理した弾性軟骨が、軟骨欠損を修復するのに適しているかどうかを確定するために、エラスターゼ処理した弾性軟骨を、関節軟骨損傷のモデルにおける欠損を充填するのに使用した。まず、12週齢の仔ウシの外耳を水で洗浄して、軟骨のみが残るまで、軟骨膜、皮膚および筋肉を、メスを使用して除去した。続いて、直径6mmのバイオプシーを、バイオプシーパンチを使用して、耳介軟骨から入手し、およそ0.4mmまたは1.2mmのいずれかの高さに切り取った。
[0097]スキャフォールドの積み重ねを試験するために厚い軟骨を有する領域に焦点を当て、骨軟骨プラグを、上述したように調製した。より若い軟骨細胞(ヒトドナーからはほぼ入手不可能)の性能を試験するために、ウシ軟骨細胞を収集して、単独で、またはASC/TERT1と組み合わせて使用した。スキャフォールド1個当たり0.25×106個の細胞として、ウシ関節軟骨細胞を単独で、またはASC/TERT1との同時培養物を播種した、標準化した4mmのスキャフォールドを、欠損に充填した。プラグを、ヌードマウスに6週間、皮下移植して、上述したように組織学的に分析した。
Claims (18)
- 通路および/または小腔を含有する軟骨スキャフォールドを生成する方法であって、
弾性軟骨試料を提供するステップと、
前記軟骨試料を、1つまたは複数の酵素を含む溶液とともにインキュベートして、それにより、前記軟骨試料のエラスチン含有量を低減させて、軟骨スキャフォールドに通路および/または小腔を生成するステップと
を含む方法。 - エラスチン含有量が、約50%、好ましくは約25%、好ましくは約10%、好ましくは約1%に低減される、請求項1に記載の方法。
- 軟骨スキャフォールドが、1U/ml〜12U/ml、または2U/ml〜10U/ml、または3U/ml〜5U/mlの1つまたは複数の酵素を含む溶液とともにインキュベートされる、請求項1または2に記載の方法。
- 溶液が、エラスターゼ酵素、および任意選択で、1つまたは複数の他のタンパク質分解酵素を含む、請求項3に記載の方法。
- エラスターゼ酵素が、膵エラスターゼであり、さらなるタンパク質分解酵素が、ペプシンである、請求項3または4に記載の方法。
- 軟骨スキャフォールドが、3U/mlのエラスターゼを含む溶液とともにインキュベートされる、請求項3に記載の方法。
- 軟骨スキャフォールドが、脱細胞化ステップに付される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 軟骨スキャフォールドが、汚染除去ステップにさらに付される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- インキュベーションステップが、0.5時間〜80時間、または5時間〜78時間、または20時間〜50時間実施される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞を、エラスチンが低減された軟骨スキャフォールドに接着させることによって、前記スキャフォールドを再細胞化させるステップをさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 軟骨スキャフォールドが、軟骨スキャフォールドの通路および/または小腔への細胞の遊走によって再細胞化される、請求項10に記載の方法。
- 細胞が、軟骨スキャフォールド上へ、および/または軟骨スキャフォールドの通路および/または小腔へ細胞を注入することによって播種される、請求項11に記載の方法。
- 軟骨スキャフォールドの再細胞化に使用される細胞が、軟骨細胞、軟骨膜細胞、骨膜細胞、ならびに脂肪由来間質血管幹細胞、滑膜由来間葉系細胞および骨髄由来間質細胞等の幹細胞/前駆細胞等の軟骨形成能または骨形成能を有する細胞である、請求項10〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 軟骨スキャフォールドの再細胞化に使用される細胞が、前記軟骨スキャフォールドのレシピエントから得られる自己ヒト細胞である、請求項10〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 軟骨スキャフォールドの再細胞化に使用される細胞が、前記軟骨スキャフォールドのレシピエントではない個体から得られる同種ヒト細胞である、請求項10〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 通路および/または小腔を含むエラスチンが低減された軟骨スキャフォールド。
- 軟骨細胞、軟骨膜細胞、骨膜細胞、ならびに脂肪由来間質血管幹細胞、滑膜由来間葉系細胞および骨髄由来間質細胞等の幹細胞/前駆細胞からなる群から選択される細胞をさらに含む、請求項16に記載のエラスチンが低減された軟骨スキャフォールド。
- 関節、鼻、気道および耳軟骨等の軟骨の修復、骨軟骨欠損の修復および骨欠損の修復の方法における使用のための請求項16または17に記載の軟骨スキャフォールド。
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