CN114058570A - 一种用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基及其应用 - Google Patents

一种用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基及其应用，该培养基包含以下组分：基础培养基、10～50ng/mL转化生长因子β1、0.5～1mM丙酮酸钠、10～50μg/mL抗坏血酸、100～300nM地塞米松、10～50μg/mL脯氨酸、10～50mg/mL牛胰岛素‑转铁蛋白‑硒钠。本发明的提供的培养基能够促进诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化，采用该培养基诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化周期短，分化效率高。并且该培养基不含有血清，具有更加安全、高效、经济的优点。

Description

一种用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基及其应用
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种用于一种诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基及其应用。
背景技术
骨关节炎是骨科临床的常见疾病，可导致退行性病变、创伤等造成的关节软骨缺损，应用组织工程方法修复关节软骨缺损展示了令人鼓舞的前景。种子细胞是组织工程化软骨形成的首要条件。
牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是一种具有广阔的临床应用前景的再生医学和组织工程领域中的种子细胞，不仅具有同其他间充质干细胞一样的良好增殖分化能力和多向分化潜能，同时无胚胎干细胞的致瘤性。牙髓干细胞可以在体外诱导向软骨组织分化，它和骨髓间充质干细胞还具有相似的免疫表型，低免疫原性，异体使用不产生排斥反应。同时，DPSCs增殖能力和克隆能力强，来源丰富、取材过程避免了对人体的二次创伤和伦理法律问题，由于DPSCs所具有的这些优势，使其成为一种极具研究潜力的种子细胞。DPSCs被诱导成为软骨细胞(chondrocytes)后，软骨细胞外具有一层富含蛋白多糖(aggrecan)的基质，是软骨分化的标志物，可被阿尔新蓝染成蓝色或蓝绿色。常用的软骨细胞分化培养基添加了胎牛血清(Fetalbovine serum，FBS)，其被运用到细胞培养增值和诱导的各种实验中，是体外扩增间充质干细胞最有效的培养基。但是，由于胎牛血清成分复杂，使用含血清的培养基培养细胞存在潜在的细胞毒性作用、外源病毒和致病因子污染问题，使细胞培养的标准化和终产品纯化难度加大，异种血清的残留也易导致临床上的过敏反应。因此，需要研发一种无血清的诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化且诱导周期短分化效率高的培养基。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基及其应用。本发明的提供的培养基能够促进诱导牙髓干细胞分化成为软骨细胞，采用该培养基诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化周期短，分化效率高。并且该培养基不含有血清，具有更加安全、高效、经济的优点。
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基，包含以下组分：基础培养基、10～50ng/mL转化生长因子β1、0.5～1mM丙酮酸钠、10～50μg/mL抗坏血酸、100～300nM地塞米松、10～50μg/mL脯氨酸、10～50mg/mL牛胰岛素-转铁蛋白-硒钠。
在骨组织中，转化生长因子β1的异构体约占转化生长因子β的80％-90％，不同转化生长因子β基因中因其启动子的差异而表现出不同调节机制。骨微环境中潜在的转化生长因子β1激活对于调节控制骨再建过程有十分重要的作用。其对软骨代谢的作用主要是：诱导间充质细胞向软骨细胞分化，促进软骨特异性基质的合成，如增加成骨细胞I型胶原的合成，骨基质蛋白，骨粘连素，蛋白聚糖，纤维结合蛋白的产生，并保护软骨基质不被各种蛋白酶水解破坏，也可诱导滑膜中的间充质细胞持续迁入软骨缺损处。转化生长因子β1可产生抑制或刺激两种作用，对软骨细胞的增殖分化具有双向调节作用。
转化生长因子β1和β3属于转化生长因子β(TGF-β)的两种异构体，它们的分泌是由不同基因编码的，调节方式也不同，它们的生物功能是多效的，包括生长控制，细胞分化，胚胎形态学及免疫作用。转化生长因子β3作为较新被发现的亚型，其在软骨和纤维组织形成、组织创伤修复方面的研究比较成熟。
抗坏血酸对干细胞分化为软骨细胞有较大作用，主要是促进胶原合成时脯氨酸和赖氨酸的羟基化，同样促进非胶原基质蛋白的合成。
地塞米松能通过增强其受体与基因组靶序列的亲和性而调控分化细胞中的基因表达，促进干细胞向软骨细胞转化。
牛胰岛素-转铁蛋白-硒钠(ITS)中的胰岛素是一种刺激葡萄糖利用的蛋白激素，可以诱导胰岛素样生长因子受体的表达，现已经发现胰岛素样生长因子对软骨细胞的表型具有维持作用。因此胰岛素对软骨细胞的生长分化也具有调节作用。
本发明提供的培养基中含有基础培养基、转化生长因子β1、抗坏血酸、地塞米松、脯氨酸、牛胰岛素-转铁蛋白-硒钠，这几种组分之间能够产生协同作用，为干细胞创造了分化的适宜诱导环境。促进了牙髓干细胞蛋白多糖和I型胶原的合成，同时在增强了软骨缺损处的修复，使牙髓干细胞成功向软骨细胞分化，并且为细胞生长提供营养元素，进一步缩短了牙髓干细胞的诱导和生长周期。
优选地，上述基础培养基为高糖型DMEM培养基。
优选地，上述培养基还包括0.5～1.5vol％青霉素-链霉素。
用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基在诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的应用。
本发明还提供了一种诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的方法，具体包括以下步骤：
步骤一：配制诱导培养基：将10～50ng/mL转化生长因子、0.5～1mM丙酮酸钠、10～50μg/mL抗坏血酸、100～300nM地塞米松、10～50μg/mL氨基酸、10～50mg/mL牛胰岛素-转铁蛋白-硒钠和1％青霉素-链霉素vol％混合，配成诱导培养基；
步骤二：制备牙髓干细胞：取对数生长期DPSCs进行复苏培养，记录复苏细胞冻存管的相关信息，从-196℃液氮中取出冻存管，立即放入37℃恒温水浴锅内，不断来回摇晃，直至所有冰块消融。从水浴锅中取出冻存管，用75％的酒精喷洒冻存管表面，放入生物安全柜内充分擦拭；
步骤三：将上述牙髓干细胞加入上述诱导培养基中得细胞密度为(0.5～1.5)x106个/mL的细胞液，将上述细胞液接种培养，每0.5～1.5mL接种于4x15mL聚丙烯管，在300g下离心5～10分钟，半扭开每个管子的盖子，孵育3天；
步骤四：再在上述细胞液中加入0.5mL上述诱导培养基，继续孵育3天；
步骤五：每3天换液，于第15天时收集细胞，并保存。
优选地，在步骤二中，选择对数生长期的牙髓干细胞进行复苏培养以制备所述牙髓干细胞。
优选地，在步骤三中，定期换液为每3天换液一次。
优选地，在步骤三中，定期换液为半量换液。
优选地，上述孵育条件为37℃和5％CO2。
本发明提供的用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基不含血清，主要添加有利于诱导干细胞分化的以下几种成分：10～50ng/mL转化生长因子β、0.5～1mM丙酮酸钠、10～50μg/mL抗坏血酸、100～300nM地塞米松、10～50mg/mL牛胰岛素-转铁蛋白-硒钠、1％青霉素-链霉素vol％，并限定了各个成分的浓度，利用该培养基来诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化，使用各个成分在适宜的浓度下的组合作用对牙髓干细胞向软骨细胞分化起到明显的促进作用，提高了诱导分化的效率，缩短了诱导分化的周期。采用本发明提供的培养基培养牙髓干细胞，在诱导的第3天时牙髓干细胞形态从长梭形开始变化为三角形的状态，在第10天时，细胞呈现出更加明显的多边形状态，为软骨细胞的典型状态，在第15天时，软骨细胞的形态更加明显，从形态上已初步判断牙髓干细胞分化成为了软骨细胞。在诱导培养21天后产生了软骨细胞外的蛋白多糖特征标记物，阿尔新兰试剂盒染色显蓝色，说明牙髓干细胞成功分化为软骨细胞。
并且该培养基不含血清，具有更加安全、高效、经济的优点，首先避免了血清来源污染物对诱导牙髓干细胞分化造成的不利影响，使细胞的增殖分化过程更加安全可靠，其次通过在基础培养基中添加一定浓度的上述组分，培养基的各种成分可调可控，提高了细胞培养的效率，再者，省去了血清的加入，节约了培养基的成本耗费。
附图说明
图1为实施例1中的牙髓干细胞诱导培养21天后的阿尔新兰试剂盒染色图。
图2为实施例2中的牙髓干细胞诱导培养21天后的阿尔新兰试剂盒染色图。
图3为实施例3中的牙髓干细胞诱导培养21天后的阿尔新兰试剂盒染色图。
具体实施方式
实施例1
本实施例中所采用的用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基的具体成分组成如表1实施例1所示，其余含量为高糖型DMEM培养基。
1.牙髓干细胞的制备
取对数生长期DPSCs进行复苏培养，记录复苏细胞冻存管的相关信息，从-196℃液氮中取出冻存管，立即放入37℃恒温水浴锅内，不断来回摇晃，直至所有冰块消融。从水浴锅中取出冻存管，用75％的酒精喷洒冻存管表面，放入生物安全柜内充分擦拭。
2.利用本发明提供的用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基进行诱导分化培养，具体步骤如下：
步骤一：在室温(15-25℃)中将细胞转移至装有10mL本发明提供的培养基的15mL离心管，1000rpm离心5min，离心结束后去上清液，将每2x106个DPSCs重新悬浮分装在2mL的软骨分化培养基中，得到DPSCs细胞密度为2x106个/mL的细胞悬浮液。
步骤二：在4x15 mL聚丙烯管中各加入0.5mL的细胞悬浮液；盖紧，在300g下离心5～10分钟。
步骤三：非常轻轻地松开每个管子的盖子(同时仍然保持盖子的一半扭转)，并放置在架子上，在37℃和5％CO下孵育3天。
步骤四：每个管子加入0.5mL培养基，在37℃和5％CO下继续孵育3天。
步骤五：之后孵育15天，每3天在不扰动细胞团的情况下吸出0.5ml培养基，重新加入0.5mL，仍放置在架子上。每一次换液后，轻轻地弹每根管子，以确保球团不完全附着在管子上。
步骤六：收集细胞并固定。
实施例2～3和对比例1～2与实施例1的区别在于所采用的培养基的各个组分的含量不同，具体如表1所示，其余制备牙髓干细胞的步骤和诱导分化培养的步骤均与实施例1相同。
表1实施例1～3和对比例1培养基的成分
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
TGFβ1(ng/mL) 10 50 12 60
丙酮酸钠(mM) 0.5 1 0.6 1.5
抗坏血酸(μg/mL) 10 50 20 60
地塞米松(nM) 100 300 200 350
脯氨酸(μg/mL) 10 50 30 60
ITS(mg/mL) 10 50 30 60
青霉素-链霉素vol％ 1％ 1％ 1％ 1％
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于基础培养基中不含丙酮酸钠。其余制备牙髓干细胞的步骤和诱导分化培养的步骤均与实施例1相同。
对比例3
对比例3与实施例1的区别在于基础培养基中不含抗坏血酸。其余制备牙髓干细胞的步骤和诱导分化培养的步骤均与实施例1相同。
对比例4
对比例4与实施例1的区别在于基础培养基中不含地塞米松。其余制备牙髓干细胞的步骤和诱导分化培养的步骤均与实施例1相同。
对比例5
对比例5与实施例1的区别在于基础培养基中不含TGFβ1。其余制备牙髓干细胞的步骤和诱导分化培养的步骤均与实施例1相同。
对比例6
对比例6在基础培养基中添加的成分为：10％胎牛血清、10ng/mLTGFβ1、1％青霉素-链霉素vol％其余制备牙髓干细胞的步骤和诱导分化培养的步骤均与实施例1相同。
对比例7
对比例7与实施例1的区别在于将培养基中的TGFβ1替换为TGFβ3，其余制备牙髓干细胞的步骤和诱导分化培养的步骤均与实施例1相同。
对比例8
对比例8与实施例1的区别在于所采用的培养基为不添加任何组分的高糖型DMEM培养基，其余制备牙髓干细胞的步骤和诱导分化培养的步骤均与实施例1相同。
测试例1
取实施例1～3和对比例1～8诱导培养的3、5、10、15天后的牙髓干细胞，在显微镜下观察细胞的形态。
实施例1～3中的细胞在诱导第3天时细胞形态从长梭形开始变化为三角形的状态，在诱导第5天时，大部分细胞边缘模糊呈现出多边形的状态，在第10天时，细胞呈现出更加明显的多边形状态，呈“铺路石”状，为软骨细胞的典型状态，在第15天时，软骨细胞的形态更加明显，从形态上已初步判断牙髓干细胞分化成为了软骨细胞。对比例1～4和对比例5～7中的细胞分别于培养的第10天和第8天细胞才开始发生形态的改变，且培养至第15天时，没有明显分化软骨细胞的形态表现。对比例8中的细胞随着培养时间的增加，一直呈现出长梭形，表现出典型的成纤维状生长，并且慢慢地聚集成旋涡状，开始出现细胞老化及凋亡。
以上实验结果说明，本发明提供的培养基能够成功诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化，并且提高了分化的速度和效率。对比例1～6的实验结果说明当缺少本发明提供的培养基中的任何一种组分时，牙髓细胞的增殖分化速度大大减慢，在培养15天之久时仍未分化为软骨细胞。并且实施例7中当仅含有基础培养基时，细胞表现为仅缓慢增殖而不分化。
测试例2
取实施例1～3和对比例1～8诱导21天后的牙髓干细胞，用阿尔新兰染色，观察其分化为软骨细胞的情况。
将带有组织和石蜡切片的载玻片放入烘箱，65℃烤片7小时以上(可过夜烤片)。将烤好的片子趁热放入二甲苯中(此容器的二甲苯定义为二甲苯I)，浸泡10min。之后将此切片依次浸泡二甲苯II(10min)，二甲苯III(10min)，无水酒精I(5min)，无水酒精II(5min)，90％酒精(5min)，80％酒精(5min)，75％酒精(5min)。其中二甲苯环节为脱蜡，酒精环节为复水。将上一步浸泡完75％酒精的切片拿出后，用自来水冲洗1～3min(不要将组织对着水管冲洗，而是利用水接触片子后形成的水流将酒精洗掉)。之后泡入PBS/DPBS缓冲液中保湿等待染色。
吸弃DPBS，加入3mL固定液(Vivacell，MSC Chondro-Staining Kit试剂盒C37B00150；Fixation C37B10020)，轻轻晃动培养瓶，使底面浸润均匀。室温下静置30分钟。吸弃固定液；加入3mLWash I，润洗细胞，静置2-3分钟。吸弃Wash I(Vivacell，MSCChondro-Staining Kit试剂盒C37B00150；Wash IC37B20050)，加入3ml阿尔新兰染色液(Vivacell，MSC Chondro-Staining Kit试剂盒C37B00150；Staining C37B30020)，底面浸润均匀，室温避光染色过夜。吸弃染色液，加入3mLWash II，润洗细胞。吸弃Wash II，重复吸弃Wash II，再次漂洗细胞(如若上清依然很蓝，可延长漂洗时间或再漂洗一次。注意：不要把组织/细胞冲下来)。
吸弃Wash II(Vivacell，MSC Chondro-Staining Kit试剂盒C37B00150；Wash IIC37B40050)，加入1mL检测液(Vivacell，MSC Chondro-Staining Kit试剂盒C37B00150；Inspection C37B50010)，置于显微镜下观察并拍照。结果如图1～3所示。
从图1～3可知，使用本发明提供的用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基，实施例1～3中的牙髓干细胞在诱导培养21后，产生了软骨细胞外的蛋白多糖特征标记物，阿尔新兰试剂盒染色显蓝色，说明牙髓干细胞成功分化为软骨细胞。而对比例1～8的细胞液阿尔新兰试剂盒染色不显色。
以上实验结果说明，本发明提供的培养基的转化生长因子β1、丙酮酸钠、抗坏血酸、地塞米松、脯氨酸、牛胰岛素-转铁蛋白-硒钠之间具有协同作用，共同诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化。并且本发明提供的培养基能够为诱导牙髓干细胞分化提供诱导因子和产生生长促进作用，能够取代并且能够超过传统的胎牛血清的诱导分化作用。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基，其特征在于，包含以下组分：基础培养基、10～50ng/mL转化生长因子β1、0.5～1mM丙酮酸钠、10～50μg/mL抗坏血酸、100～300nM地塞米松、10～50μg/mL脯氨酸、10～50mg/mL牛胰岛素-转铁蛋白-硒钠。
2.如权利要求1所述的用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基，其特征在于，所述基础培养基为高糖型DMEM培养基。
3.如权利要求1所述的用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基，其特征在于，所述培养基还包括0.5～1.5vol％青霉素-链霉素。
4.如权利要求1～3任一项所述的用于诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的培养基在诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的应用。
5.一种诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：配制诱导培养基：将10～50ng/mL转化生长因子、0.5～1mM丙酮酸钠、10～50μg/mL抗坏血酸、100～300nM地塞米松、10～50μg/mL氨基酸、10～50mg/mL牛胰岛素-转铁蛋白-硒钠和1vol％青霉素-链霉素混合，配成所述诱导培养基；
步骤二：制备牙髓干细胞；
步骤三：将所述牙髓干细胞加入所述诱导培养基中得细胞密度为0.5～1.5x106个/mL的细胞液，将所述细胞液分成每0.5～1.5mL的接种体积接种，孵育3天；
步骤四：再在所述细胞液中加入与所述步骤三中所述接种体积相等的所述诱导培养基，继续孵育3天；
步骤五：定期换液，于第15天时收集细胞，并保存。
6.一种如权利要求5所述的诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于，在所述步骤二中，选择对数生长期的牙髓干细胞进行复苏培养以制备所述牙髓干细胞。
7.一种如权利要求5所述的诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于，在所述步骤五中，所述定期换液为每3天换液一次。
8.一种如权利要求7所述的诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述定期换液为半量换液。
9.一种如权利要求5所述的诱导牙髓干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于，所述孵育条件为37℃和5％CO2。
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