CN102174468A - 诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用。本发明所述的方法包括如下步骤：采用携带小鼠类固醇生成因子-1基因的腺病毒感染人脐带间充质干细胞，在含有0.3-3ng/ml黄体生成素，200-800μM二丁酰环磷酸腺苷，5×10^-6-5×10^-4M全反式维甲酸，10mU/ml人绒毛膜促性腺激素和2.4uM促肾上腺皮质激素的DMEM-F12培养液内培养一周。经过本发明所述方法的诱导，人脐带间充质干细胞在体外可以分化为睾丸间质细胞，为采用细胞替代或者基因方法治疗睾酮缺乏症提供了重要的细胞来源。

Description

诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用

技术领域

本发明诱导干细胞分化的生物技术领域，特别涉及一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用。

背景技术

随着人均寿命的延长，人口老龄化问题越来越严重，中老年男性雄激素部分缺乏症(PADAM)患者越来越多。目前临床上主要采用了外源性雄激素替代疗法(ART)，目的是维持血清中睾酮的生理浓度，以替代内源性睾酮的生理功能。然而长期服用激素副作用较大，其一体内雄激素的靶细胞较多，长期服用外源雄激素治疗容易会有毒副作用的发生，尤其是前列腺；其二不同个体间血清睾酮水平差异较大，病人需频繁抽血检查相关指标以调整用量；其三睾酮替代治疗会破坏人体雄激素分泌晨高夜低的自然节律，还会抑制自身睾丸的激素分泌和生精功能。

近年来随着细胞移植疗法的发展，人们把目光转向了对睾丸间质细胞(Leydig cells)的移植。由于睾丸间质细胞分泌的睾酮约占血浆睾酮的95％，人们试图通过睾丸间质细胞的移植来治疗睾酮分泌不足的问题，睾丸间质细胞移植可以升高患者血清睾酮水平。采用将分离提纯的睾丸间质细胞微囊化的方法，既可以防止宿主对植入睾丸间质细胞的免疫排异反应，又保证微胶囊内睾丸间质细胞成活和睾酮分泌，微囊化后睾丸间质细胞能对人绒毛膜促性腺激素有良好的反应性，术后能在一定时间保持患者血清睾酮水平。以上研究说明睾丸间质细胞移植可能是一种有效的治疗男性雄激素部分缺乏症的方法，但目前尚无法解决移植细胞来源问题。

间充质干细胞具有多向分化能力，在一定的条件下，间充质干细胞能够被诱导分化为多种细胞，包括成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，神经细胞和肝细胞等。向骨髓间充质干细胞中转入类固醇生成因子-1(SF-1)基因，能产生具有合成性腺激素和肾上腺类型类固醇激素能力的细胞。但骨髓间充质干细胞体外增殖能力、多向分化能力以及细胞稳定性都会随着年龄增长或疾病的影响逐渐不同程度的削弱甚至丧失，这种方法分化效率较低，分泌的性腺激素量较低，需要寻找一种高效地将干细胞分化为睾丸间质细胞的方法。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种有效地诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法。

本发明的另一目的在于提供所述诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，包含以下步骤：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的SF-1基因插入腺病毒的穿梭质粒pAdtrack-CMV-EGFP的多克隆位点中，得到重组载体pAdtrack-CMV-SF-1；然后将重组载体pAdtrack-CMV-SF-1与腺病毒载体质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183细胞，得到携带SF-1基因的腺病毒质粒pAd-SF-1；将腺病毒质粒pAd-SF-1单酶切线性化，转染人胚肾细胞AD-293细胞，得到腺病毒；

(2)按MOI＝200的量将步骤(1)制备得到的腺病毒加入到诱导培养液中感染人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)，将人脐带间充质干细胞诱导分化，得到睾丸间质细胞；其中，诱导培养液的组成为：基础培养基为DMEM-F12，含有体积百分比10％的胎牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素、1ng/mlLH黄体生成素(LH)、500μM的二丁酰环磷酸腺苷(dbcAMP)、10^-5M的全反式维甲酸(ATRA)、10mU/ml的人绒毛膜促性腺激素(hCG)和2.4uM的促肾上腺皮质激素(ACTH)。

步骤(1)中所述的腺病毒质粒pAd-SF-1单酶切线性化优选通过Pac I酶切进行线性化；

步骤(1)中所述的转染优选通过磷酸钙共沉淀法进行；

步骤(2)中所述的人脐带间充质干细胞优选通过如下方法制备得到：首先从出生的正常足月新生儿的人脐带中分离得到沃顿胶组织(Wharton’s Jelly)，将沃顿胶组织剪碎，用培养液培养，待从组织块游离出来的细胞长至80～90％融合，用胰酶消化游离出来的细胞，进行细胞传代培养，得到人脐带间充质干细胞；其中培养液为含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)，5ng/ml bFGF，216μg/ml谷氨酸盐，2mg/ml NaHCO₃，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和1μg/ml两性霉素B的LG-DMEM培养液；

所述人脐带间充质干细胞的细胞表面抗原分子可用FACScan流式细胞仪检测，人脐带间充质干细胞不表达造血标志分子CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，而强表达间充质干细胞表面特异性抗原CD44、CD73、CD90和CD105；流式细胞的鉴定条件为：细胞的密度不低于10⁶/ml，采用mouse anti IgG1/R-PE，mouse anti IgG1/FITC作为同型对照；可用成脂、成骨分化鉴定干细胞的分化能力，成脂分化用油红染色鉴定，成骨分化用ALP染色及Von kossa染色鉴定；

步骤(2)中所述诱导分化的条件优选为用胰酶将人脐带间充质干细胞消化，离心收集，按5×10⁵个细胞/孔的密度接种到6孔板，培养箱培养过夜让细胞贴壁，接着更换诱导培养液，以MOI＝200的量将腺病毒加入到诱导培养液中，轻晃培养板，使病毒分布均匀，然后每两天更换新鲜诱导培养液；诱导分化的时间为7天。

上述的方法应用于诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞。

一种睾丸间质细胞，通过上述方法得到。

一种睾酮，通过上述睾丸间质细胞分泌得到。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)人脐带沃顿胶组织(Wharton’s Jelly)来源的间充质干细胞取自免疫系统尚未发育完善胎儿的脐带，具有增殖效率高，免疫原性低，在无免疫抑制的情况下也不会出现免疫排斥。而骨髓间充质干细胞体外增殖能力、多向分化能力以及细胞稳定性都会随着年衰或疾病的影响，逐渐不同程度的削弱甚至丧失。脐带来源间充质干细胞比骨髓来源间充质干细胞更容易获得，而且增殖能力更强，因此脐带间充质干细胞可以成为干细胞治疗中细胞移植的良好的细胞来源。

(2)本发明所述的方法利用携带SF-1基因的腺病毒感染人脐带间充质干细胞，并在DMEM-F12培养液中添加LH，dbcAMP，ATRA，hCG和ACTH，整个分化时间短，仅需一周即可获得睾丸间质细胞，具有更高的分化效率，能够获得更好睾酮分泌能力的睾丸间质细胞。本发明是一种高效地将干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，为治疗男性雄激素部分缺乏症提供了稳定的移植细胞的来源。

附图说明

图1是人脐带间质干细胞原代与培养5代图，其中：图(a)为原代细胞；图(b)为培养5代的细胞；观察倍数均为100×。

图2是人脐带间充质干细胞流式细胞术鉴定图。

图3是ALP染色鉴定人脐带间充质干细胞成骨分化能力图，其中：图(a)为人脐带间充质干细胞经过28天的成骨诱导分化后ALP染色图；图(b)为未分化的人脐带间充质干细胞，为阴性对照。

图4是Von Kossa染色鉴定人脐带间充质干细胞成骨分化能力，其中：图(a)为人脐带间充质干细胞经过28天成骨诱导分化后的Von kossa染色图；图(b)为未分化的人脐带间充质干细胞，为阴性对照。

图5是油红染色鉴定人脐带间充质干细胞成脂分化能力图，其中：图(a)为人脐带间充质干细胞经过21天成脂分化诱导后的油红染色图；图(b)为未分化的人脐带间充质干细胞，为阴性对照。

图6是亚甲基蓝染色鉴定人脐带间充质干细胞软骨分化能力图，其中：图(a)为人脐带间充质干细胞经过21天软骨分化诱导后的亚甲基蓝染色图；图(b)为未分化的人脐带间充质干细胞，为阴性对照。

图7携带SF-1基因的腺病毒的制备过程检测图，其中：

图(a)为从小鼠睾丸间质瘤细胞中拷贝SF-1基因，泳道1为回收的SF-1基因的PCR产物，泳道M为200bp DNAmarker分子量标准；

图(b)为将扩增得到的SF-1基因插入腺病毒的穿梭质粒pAdtrack-CMV-EGFP内，构建pAdtrack-CMV-SF-1质粒，连接产物转化大肠杆菌top10细菌，泳道1-8为挑取的8个单克隆中所提取的质粒，泳道M为1kb DNAmarker分子量标准；

图(c)为EcoR I酶切验证，泳道1～6分别代表从图7(b)中选取1、2、4、5、7、8号pAdtrack-CMV-SF-1质粒，采用EcoR I酶切后验证；泳道M为1kbDNA marker分子量标准；

图(d)为采用电穿孔法将pAdtrack-CMV-SF-1与pAdEasy-1共转染BJ5183，挑取4个单克隆，提取质粒进行电泳分析；泳道1～4为所提取质粒，泳道M为1kb DNA marker分子量标准。

图8为pAdTrack-CMV-EGFP质粒图。

图9为pAdTrack-CMV-SF-1质粒图。

图10为pAdEasy-1质粒图。

图11是人脐带间充质干细胞经诱导分化为睾丸间质细胞的基因表达图。

图12是人脐带间充质干细胞经诱导分化为睾丸间质细胞的睾酮分泌图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1人脐带间充质干细胞的分离与扩增

采用组织块贴壁分离法。无菌条件下取得脐带，体积百分比0.25％碘伏浸泡3min消毒，生理盐水冲洗，除去脐带表面及血管内血块，剪开脐带，用镊子撕下血管壁周围的沃顿胶组织(Wharton’s Jelly)，将其剪成1.5～2.5mm³大小的组织块，置于24孔板，加入800ml培养液(培养液成分为10％(v/v)胎牛血清(FBS)，5ng/ml bFGF，216μg/ml谷氨酸盐，2mg/ml NaHCO₃，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和1μg/ml两性霉素B的LG-DMEM培养液)，放于培养箱，37℃，5％CO₂条件下静置培养。12-15天后，镜检可看见从贴壁的组织块周围游离出的大量长梭形细胞，这时可用PBS溶液(1X，pH＝7.2)清洗去除组织块，质量体积比0.25％的胰蛋白酶溶液，200g离心收集细胞，进行传代培养。贴壁细胞长至90％融合后，去除培养液，PBS溶液(1X，pH＝7.2)清洗，质量体积比0.25％胰蛋白酶溶液消化，镜检等贴壁细胞收缩，胞间间隙变大时，加入含体积百分比10％FBS的LG-DMEM终止消化，轻轻吹打让细胞悬浮，200g离心收集细胞，血球计数板计数，调整细胞密度为1×10⁵个细胞/孔(6孔板)，37℃，5％CO₂培养箱培养，每两天更换培养液。

实施例2细胞形态学观察

将脐带华尔通胶质组织块接种至24孔板培养10天后，逐渐可见到少量细胞从组织块中游离出来，贴壁生长，并不断增殖(图1a)。在显微镜下观察，可见细胞形态呈现均一的长梭形，为典型的成纤维细胞的形态，成平行排列生长或漩涡状生长，随着集落生长的不断扩大而融合为单层贴壁细胞。常规传代培养，长满后可见细胞呈现漩涡状(图1b)。

实施例3流式细胞术鉴定细胞表面抗原

取正常培养的脐带间充质干细胞，流式细胞术检测细胞表面抗原的表达，包括CD105，CD73，CD90，CD45，CD34，CD14，CD19，HLA-DR。

(1)细胞长至80～90％融合后，质量体积比0.25％胰蛋白酶溶液消化，离心收集细胞，PBS溶液(1X，pH＝7.2)清洗2次，调整细胞悬液浓度到10⁶细胞/ml。

(2)加入2ml含体积百分比为2.5％FBS的PBS溶液(1X，pH＝7.2)，吸打混匀细胞，200g离心。

(3)所用抗体包括CD105，CD73，CD90，CD45，CD34，CD14，CD19和HLA-DR的抗体，非特异性背景以mouse anti IgG1/PE，mouse anti IgG1/FITC进行孵育作为对照均按1∶50比例，用PBS溶液(1X，pH＝7.2)稀释后，冰上避光孵育40min；。

(4)孵育完成后，离心去上清，PBS溶液(1X，pH＝7.2)重悬洗去抗体，重复1次。

(5)最后用500μl PBS溶液(1X，pH＝7.2)重悬细胞，流式细胞仪检测各组细胞荧光值。

利用流式细胞术分析脐带间充质干细胞的细胞表面抗原的表达，在分离获得的脐带间充质干细胞中，CD44、CD73、CD90、CD105的表达为阳性，阳性率分别为94.3％、95.5％、96.9％、98.1％，而CD14、CD19、CD34、CD45及HLA-DR的表达基本上为阴性，其阳性率仅分别为1.8％、2.5％、2.6％、1.2％和2.3％(图2)。这些表面抗原的表达与典型的间充质干细胞的表面抗原的表达是一致的。

实施例4人脐带间充质干细胞多向分化能力鉴定

取实施例1制备的传代培养的脐带间充质干细胞，按2×10⁴细胞/孔的密度接种到24孔板内，细胞长至60～70％融合后，去除原来培养液，PBS溶液(1X，pH＝7.2)清洗，加入成骨分化诱导培养液(LG-DMEM，10％FBS，0.216g/LNaHCO₃，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素，100mM地塞米松，10mMβ-甘油磷酸钠，0.2mM L-抗坏血酸盐)，以后每3天更换一次成骨分化诱导培养液。诱导28天后，进行von-Kossa染色和碱性磷酸酶染色(ALP staining)的成骨分化鉴定。

取实施例1制备的传代的人脐带间充质干细胞，按2×10⁴细胞/孔的密度接种到24孔板内，细胞长至60～70％融合后，去除原来培养液，PBS清洗，加入成脂分化诱导培养液(LG-DMEM，10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，60μM茚甲新，1μM地塞米松，0.5mM IBMX，5μg/ml胰岛素)，以后每3天更换培养液一次，诱导21天后，进行Oil Red O染色检测。

取实施例1制备的传代的人脐带间充质干细胞，经胰酶消化后，转移1ml细胞悬液于15ml塑料离心管中，500g离心15分钟，使其形成细胞微团结构，小心吸掉上层培养液，加入2ml软骨分化培养液(LG-DMEM，10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1％胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)，0.1μM地塞米松，50μg/mL 2-磷酸抗坏血酸，40μg/mL L-脯氨酸，100μg/mL丙酮酸钠，10ng/ml转化生长因子β1)，4天后首次换液，以后每隔2天换液，在21天后取出培养的细胞团块。行固定、包埋、切片。将切片进行亚甲基蓝染色，显微镜下观察并拍照。

间充质干细胞的一个重要的鉴定标准，就是间充质干细胞具有多向分化的能力。人脐带间充质干细胞在成骨分化诱导培养液中诱导28天以后，通过yon Kossa染色以及碱性磷酸酶(ALP)染色对分化后的细胞进行成骨分化鉴定。图3(a)中的棕红色显色区域显示ALP的染色结果。可见脐带间充质干细胞经成骨诱导分化后，胞质中呈现了碱性磷酸酶活性。图4(a)中的黑色颗粒状小结是矿质沉淀经Von Kossa染色的结果。而对照组则均呈现为阴性(图3(b)与图4(b))。

脐带间充质干细胞经成脂分化诱导培养液的诱导21天后，采用Oil Red O染色进行脂滴的检测。人脐带间充质干细胞经过成脂诱导后，分化的细胞中出现细小的脂滴，呈现明显的阳性(图5(a))，而在未分化的细胞内，染色未见脂滴的存在(图5(b))。

软骨细胞分化诱导培养液中培养的细胞团约2天时与管壁分离形成球形结构，并在培养过程中逐渐长大。培养21天后进行切片和亚甲基蓝染色观察，可见经诱导的人脐带间充质干细胞呈现均一异染，细胞外基质呈淡蓝色(图6(a))，提示经诱导后细胞分泌的基质中含有大量的酸性蛋白多糖，而对照组未着色(图6(b))。

实施例5携带SF-1基因腺病毒的制备

从小鼠睾丸间质瘤细胞(MLTC-1，中国科学院上海细胞所，上海，中国)中提取总mRNA，反转录得到cDNA，用PrimerSTAR高保真DNA聚合酶扩增SF-1基因(98℃10s，58℃20s，72℃1.5min，反应30个循环)，回收SF-1的PCR产物，并将其磷酸化。其中扩增SF-1基因的引物根据基因库号NM_139051的序列设计，如下：

正向PCR引物：5’-ATTCTCCTTCCGTTCAGCGGACG-3’；

反向PCR引物：5’-GGCTGATGGAGGAAGGAATGGT-3’。

将扩增得到的SF-1基因插入腺病毒的穿梭质粒pAdtrack-cmv-EGFP内(见图8，Stratagene公司，加利福尼亚州，美国)，具体步骤如下：首先用内切酶SalI消化pAdtrack-cmv-EGFP载体，然后将先线性化的载体末端补平并去磷酸化。将制备好的SF-1片段和pAdtrack-CMV-EGFP载体按照3∶1的比例进行连接构建pAdtrack-CMV-SF-1质粒(见图9)，连接产物转化大肠杆菌top10细菌(Tiangen公司，北京，中国)并挑取单克隆。由于SF-1片段和载体上各有一个EcoR I酶切位点。用EcoR I消化单克隆，正向连接的质粒将被切成2.8kb和8.0kb的DNA片段，反向连接的产物将被切成7.1kb和3.3kb的DNA片段，从而可以通过酶切筛选得到阳性克隆，再通过测序进行验证。

将构建好的携带SF-1基因的穿梭质粒pAdtrack-CMV-SF-1与腺病毒载体质粒pAdEasy-1(见图10，Stratagene公司，加利福尼亚州，美国)共转染大肠杆菌BJ5183(Genmed公司，上海，中国)，两质粒在BJ5183细胞内会发生重组，得到携带SF-1基因的腺病毒质粒pAd-sf-1。

将得到的携带SF-1基因的腺病毒质粒pAd-sf-1用Pac I酶切线性化后，磷酸钙共沉淀法转染人胚肾细胞(AD-293细胞，NIH，MD，美国)，以产生腺病毒。腺病毒的产生可根据EGFP的绿色荧光来确定。当表达绿色荧光的AD-293细胞越来越多，并出现细胞变圆，核变大，细胞脱板悬浮的情况下，吸打收集AD-293细胞，PBS溶液(1X，PH7.2)清洗，离心，只保留200μl PBS，-80℃和37℃反复冻融三次，使细胞破壁，释放腺病毒，10000g离心10分钟，上清液为含制备的第一代腺病毒。得到的腺病毒可直接用于感染AD-293细胞，进行再一轮的扩增，以提高腺病毒的滴度。

将AD-293细胞按2×10⁴细胞/孔的密度接种到24孔板内，待细胞长至50％融合后，更换新鲜高糖培养液(培养液成分为10％(v/v)胎牛血清(FBS)，216μg/ml谷氨酸盐，2mg/ml NaHCO₃，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的HG-DMEM培养液)，将需要测定滴度的腺病毒悬液从10^-1到10^-12，接10倍的梯度进行稀释，然后每个梯度取50μl加到培养液中进行感染，每个梯度设3个重复孔。24小时后荧光显微镜下检查绿色荧光的表达情况。如在10^-7梯度的孔中计数得到绿色细胞为50个，则病毒的滴度计为10¹⁰。

研究结果：从小鼠睾丸间质瘤细胞中提取总mRNA，反转录得到cDNA，PCR扩增SF-1基因，回收PCR产物(如图7(a)所示)，跑胶结果显示PCR产物符合目标基因大小。将制备好的SF-1片段和pAdtrack-CMV-EGFP载体按照一定的比例进行连接，将连接产物转化top10细菌，并挑取8个单克隆(如图7(b)所示)。用EcoR I酶切消化验证连接产物(如图7(c)所示)，正向连接的质粒将被切成2.8kb和8.0kb的DNA片段，反向连接的产物将被切成7.1kb和3.3kb的DNA片段。从酶切结果可以判断7号克隆为正向连接，将7号克隆测序后发现该克隆DNA序列正确。将得到的pAdtrack-CMV-SF-1与pAdEasy-1质粒采用电穿孔法共转染BJ5183，挑选重组质粒，重组质粒大小约为44Kb(如图7(d)所示)，挑选2号质粒进行酶切转化AD-293细胞，以产生携带SF-1基因的腺病毒。

实施例6采用携带SF-1基因的腺病毒感染人脐带间充质干细胞

采用常规培养的实施例1制备得到的人脐带间充质干细胞，酶消化，离心收集，按5×10⁵的密度接种到6孔板内，培养箱培养过夜让细胞贴壁。第二天早上，更换诱导培养液(DMEM-F12，10％FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1ng/ml LH，500μM dbcAMP，10^-5M ATRA，10mU/ml hCG，2.4uM ACTH)，以MOI＝200的量将腺病毒加入到培养液中，轻晃培养板，使病毒分布均匀。以后每两天更换新鲜诱导培养液，诱导分化7天。

实施例7鉴定诱导分化的细胞的基因表达

携带SF-1基因的腺病毒感染人脐带间充质干细胞后第7天，用Real-timeRT-PCR检测类固醇合成相关基因的表达，包括P450scc、17β-HSD、LHR和3β-HSD，引物及荧光探针如下：

P450SCC-F：5’-GCGGGCTCCGGAAATTACTC-3’

P450SCC-R：5’-CTGGTAGATGGCATCAATGAATCG-3’

P450SCC-P：5’-(FAM)AGTGATGACCTGTTCCGCTTTGCCT (Eclipse)-3’

17β-HSD-F：5’-TTAGTCAACAATGTCGGAATGCTTC-3’

17β-HSD-R：5’-ACTACGGAGGTGATGTTACAATGG-3’

17β-HSD-P：5’-(FAM)CCCAAGCCATTTCCTGAACGCACCG(Eclipse)-3’

LHR-F：5’-CAATGTGAAAGCACAGTAAGGAAAG-3’

LHR-R：5’-GGTGTCTTGGGTAAGCAGAAAC-3’

LHR-P：5’-(FAM)CCAGCCACTCAGTTCACTCTCAGCA (Eclipse)-3’

3β-HSD-F：5’-AAGCTAGTGTGCCAGTCTTCATC-3’

3β-HSD-R：5’-CGTTTTTCAGATTCCACCCGTTAG-3’

3β-HSD-P：5’-(FAM)CGCCAGTACAGCCTTCTCAGCAAGC(Eclipse)-3’

反应扩增条件为：

Real-time PT-PCR结果显示：将Ad-SF-1转染脐带间充质干细胞后，三个类固醇激素合成相关酶P450scc、3β-HSD、17β-HSD，LHR的mRNA表达水平大大提高。LHR的高表达能够使分化后的细胞接受外源LH的刺激，刺激细胞睾酮合成酶的表达，促进睾酮的分泌(图11)。

实施例8：化学发光法检测睾酮的分泌

携带SF-1基因的腺病毒感染人脐带间充质干细胞第7天后，去除诱导分化液，加入不含血清的培养液(DMEM-F12，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1ng/mlLH，500μM dbcAMP、10^-5M ATRA、10mU/ml hCG和2.4uM ACTH)，再继续培养4天，然后吸取培养液上清进行睾酮浓度的测定。

携带SF-1基因的腺病毒(MOI＝200)感染人脐带间充质干细胞7天后，更换新鲜的不含血清的培养液，以去除外源血清中含有少量睾酮的影响，继续培养4天，测定细胞合成和分泌睾酮的能力。从检测的结果看，表达SF-1基因的脐带间充质干细胞合成和分泌睾酮的能力得到了极大的提高，平均每1×10⁴细胞可分泌睾酮250ng，而从未感染的对照细胞中，未能检测到睾酮的分泌(图12)。

实施例9采用不同来源的脐带分离和诱导间充质干细胞

采用以实施例1中的不同脐带，采用实施例1的同样方法分离和培养人脐带间充质干细胞；采用实施例2中的同样方法，观察脐带间充质干细胞的的形态，结果与图1一致；采用实施例3的同样方法，通过FACS鉴定细胞表面抗原，结果与图2基本一致；采用实施例4的同样方法，鉴定脐带间充质干细胞的多向分化能力，结果与图3-6一致；采用实施例5的同样方法，制备携带SF-1基因腺病毒，结果与图7一致；采用实施例6的同样方法，用携带SF-1基因的腺病毒感染脐带间充质干细胞，但采用与实施例6中的不同诱导培养液，诱导培养液成分为DMEM-F12、10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.3ng/ml LH、200μMdbcAMP、10^-5M ATRA、10mU/ml hCG和2.4uM ACTH；采用实施例7的同样方法，采用real-time RT-PCR鉴定分化的睾丸间质细胞，结果与图11基本一致；采用实施例8的同样方法，采用化学发光法检测睾酮的分泌，结果如图12基本一致。

实施例10采用不同来源的脐带，分离和诱导间充质干细胞

采用与实施例1和9中的不同脐带，采用实施例9中的所有同样方法，但唯一不同的方法为实施例6的诱导培养液，诱导培养液为DMEM-F12、10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、3ng/ml LH、800μM dbcAMP、5×10^-6M ATRA、10mU/ml hCG和2.4uM ACTH。所得结果与实施例9基本一致。

实施例11采用不同来源的脐带，分离和诱导间充质干细胞

采用与实施例1，9和10中的不同脐带，采用实施例9中的所有方法，但唯一不同的方法为实施例6的诱导培养液，诱导培养液为DMEM-F12、10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1ng/ml LH、500μM dbcAMP、5×10^-4M ATRA、10mU/ml hCG和2.4uM ACTH。所得结果与实施例9基本一致。

实施例12采用不同来源的脐带，分离和诱导间充质干细胞

采用与实施例1，9，10和11中的不同脐带，采用实施例9中的所有方法，但唯一不同的方法为实施例6的诱导培养液，诱导培养液为DMEM-F12、10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、3ng/ml LH、200μM dbcAMP、5×10^-6M ATRA、10mU/ml hCG和2.4uM ACTH。所得结果与实施例9基本一致。

结论

(1)采用组织块贴壁培养方法，从脐带动脉血管周围的沃顿胶组织中分离得到干细胞，经过流式细胞术检测细胞表面抗原的表达，体外成骨分化和成脂肪分化潜力的评价，分离得到的干细胞纯度较高，增殖能力强，符合间充质干细胞所具有的典型特征。

(2)SF-1基因被认为在类固醇激素的合成上起着重要的调控作用，本次实验从小鼠睾丸间质瘤细胞中提取总mRNA，经反转录及PCR获得SF-1基因，并将其插入到腺病毒载体中，成功构建了携带了SF-1基因的腺病毒。脐带间充质干细胞在黄体生成素(LH)，二丁酰环磷酸腺苷(dbcAMP)，全反式维甲酸(ATRA)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)与促肾上腺皮质激素(ACTH)存在的情况下，经携带有外源SF-1基因的腺病毒的转染后，能向睾丸间质细胞方向分化，表达一系列类固醇激素合成所需要的酶及LH受体，并且具有了睾酮合成和分泌的能力。本实验结果说明，将携带SF-1基因的腺病毒感染人脐带间充质干细胞，并在细胞培养液中添加LH、dbcAMP、ACTH、hCG和ATRA，能够高效地将干细胞分化为睾丸间质细胞，产生大量的睾酮，可以为睾丸间质细胞移植提供稳定的细胞来源。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的小鼠类固醇生成因子-1基因插入腺病毒的穿梭质粒pAdtrack-CMV-EGFP的多克隆位点中，得到重组载体pAdtrack-CMV-SF-1；然后将重组载体pAdtrack-CMV-SF-1与腺病毒载体质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183细胞，得到携带SF-1基因的腺病毒质粒pAd-SF-1；将腺病毒质粒pAd-SF-1单酶切线性化，转染人胚肾细胞AD293，得到腺病毒；

(2)按MOI＝200的量将步骤(1)制备得到的腺病毒加入到诱导培养液中感染人脐带间充质干细胞，将人脐带间充质干细胞诱导分化，得到睾丸间质细胞；其中，诱导培养液的组成为：基础培养基为DMEM-F12，含有体积百分比10％的胎牛血清、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素、0.3-3ng/ml黄体生成素、200-800μM的二丁酰环磷酸腺苷、5×10^-6-5×10^-4M的全反式维甲酸、10mU/ml的人绒毛膜促性腺激素和2.4uM的促肾上腺皮质激素。

2.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的腺病毒质粒pAd-SF-1单酶切线性化为通过Pac I酶切进行线性化。

3.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的转染为通过磷酸钙共沉淀法进行。

4.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的人脐带间充质干细胞通过如下方法制备得到：首先从出生的正常足月新生儿的人脐带中分离得到沃顿胶组织，将沃顿胶组织剪碎，用培养液培养，待从组织块游离出来的细胞长至80～90％融合，用胰酶消化游离出来的细胞，进行细胞传代培养，得到人脐带间充质干细胞；其中培养液为含有体积百分比10％的胎牛血清，5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，216μg/ml谷氨酸盐，2mg/ml NaHCO₃，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和1μg/ml两性霉素B的LG-DMEM培养液。

5.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述的人脐带间充质干细胞的细胞表面抗原分子为通过FACScan流式细胞仪进行检测，人脐带间充质干细胞不表达造血标志分子CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，而强表达间充质干细胞表面特异性抗原CD44、CD73、CD90和CD105；流式细胞的鉴定条件为：细胞的密度不低于10⁶/ml，采用mouse anti IgG1/R-PE，mouse anti IgG1/FITC作为同型对照；

所述的人脐带间充质干细胞通过成脂、成骨分化鉴定干细胞的分化能力，成脂分化用油红染色鉴定，成骨分化用ALP染色及Von kossa染色鉴定。

6.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中所述诱导分化的条件为用胰酶将人脐带间充质干细胞消化，离心收集，按5×10⁵个细胞/孔的密度接种到6孔板，培养箱培养过夜让细胞贴壁，接着更换诱导培养液，以MOI＝200的量将腺病毒加入到诱导培养液中，轻晃培养板，使病毒分布均匀，然后每两天更换新鲜诱导培养液；诱导分化7天。

7.权利要求1～6任一项所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法的应用，其特征在于：所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法用于诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞。

8.一种睾丸间质细胞，通过权利要求1～6任一项所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法得到。

9.一种睾酮，通过权利要求8所述的睾丸间质细胞分泌得到。

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