CN108795843B - 小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法 - Google Patents

小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，包括如下步骤：①获取人源可诱导多能性干细胞；②使用不含有碱性成纤维细胞生长因子的E7培养基对人源可诱导多能性干细胞进行预处理培养；③使用分化培养基并结合小分子诱导剂诱导人源可诱导多能性干细胞进行分化，小分子诱导剂包括有DHH激动剂SAG、22R‑OHC、氯化锂、人血小板衍生生长因子AA、成纤维生长因子2、胰岛素样生长因子1、雄激素、促黄体生成素、视黄醇和八溴环磷酸腺苷；④手工剔除克隆团样杂细胞；⑤剔除杂细胞后剩下的细胞用富集培养基继续培养，富集培养基定期更换，最终获得目标睾丸间质细胞。

Description

小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，尤其涉及一种由小分子诱导人源可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法。
背景技术
男性生殖健康离不开生殖系统的功能健全。目前，雄激素缺乏症的治疗方法仅停留在雄激素替代治疗。然而，长期的雄激素治疗会引起肝肾功能损伤、免疫力降低、水钠潴留等并发症，而且不受自身昼夜节律的调控。虽然睾丸间质细胞移植可以避免外源性雄激素替代治疗带来的某些并发症，但是睾丸间质细胞来源不足和异体移植可能导致宿主免疫排斥反应限制了睾丸间质细胞在临床上的应用。
目前，诱导全能干细胞或成体干细胞分化为睾丸间质细胞作为供体移植是国际上公认的解决上述问题的突破口。全能干细胞，如胚胎干细胞虽然是一种很好的种子细胞，它理论上能被诱导分化为各种类型的细胞，包括睾丸间质细胞。但是，在临床应用中，胚胎干细胞面临着由于涉及人体胚胎存在伦理学问题，同时也无法克服免疫排斥反应的问题。
可诱导多能性干细胞是一种类似于胚胎干细胞的多能性干细胞。可诱导多能性干细胞既具备了胚胎干细胞一样的多能性，同时它可以从任何一种来自患者自体细胞重编程获取，彻底规避了胚胎干细胞应用中所面临的免疫排斥和伦理学问题，具备了巨大的临床应用价值。
现有技术中，还未有出现通过小分子将此可诱导多能性干细胞诱导分化为睾丸间质细胞的方法。因此，本发明人对此提出了本申请的技术方案。
发明内容
本发明的目的是诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，尤其是一种由小分子作为诱导剂对可诱导多能性干细胞进行诱导，使之分化为睾丸间质细胞的方法。
所述可诱导多能干细胞是指人源可诱导多能性干细胞，具体方法包括如下步骤：
①获取人源可诱导多能性干细胞；
②使用不含有碱性成纤维细胞生长因子的E7培养基对人源可诱导多能性干细胞进行预处理培养；
③使用分化培养基培养并结合小分子诱导剂诱导人源可诱导多能性干细胞进行分化，小分子诱导剂包括有DHH激动剂SAG、22R-OHC、氯化锂、人血小板衍生生长因子AA、成纤维生长因子2、胰岛素样生长因子1、雄激素、促黄体生成素、视黄醇和八溴环磷酸腺苷
④手工剔除克隆团杂细胞；
⑤剔除所述杂细胞后剩下的细胞用富集培养基继续培养，所述富集培养基定期更换，最终获得目标睾丸间质细胞。
为进一步完善上述方案，本发明进一步设置为：步骤①中所述人源可诱导多能性干细胞由人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞经细胞培养获得，具体方法包括如下步骤：将人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞接种在质量体积比1%基质胶处理过（至少37℃孵育1小时以上）的6孔板上，并置于37℃二氧化碳培养箱内培养，每天全量更换新鲜的E8培养基，发现有分化的细胞及时挑走，每间隔6天传代一次，传代稀释比例为6:1，在每次传代后的第1天，培养基中需要添加10 μM Y-27632。
本发明进一步设置为：在获取所述人源可诱导多能性干细胞过程中，为减少对人源可诱导多能性干细胞的损伤，传代时使用质量体积比0.25%EDTA处理3-5分钟，当克隆团边缘部分开始卷起并快脱离培养皿底部时，用去离子的PBS洗1遍，然后用1 mL的 E8培养基轻轻吹打且吹打次数不超过10次，收集细胞接种到新的被质量体积比1%基质胶预处理过（至少37℃孵育1小时以上）的6孔板上继续培养。
本发明进一步设置为：定义步骤③中诱导开始时间为第0天，所述小分子诱导剂及其添加时间如下所示：①第0至7天，在分化培养基中加入0.2 μm DHH激动剂SAG、5 μM 22R-OHC和5 mM 氯化锂; ②第7至10天，在分化培养基中加入5 ng/mL人血小板衍生生长因子AA和5 ng/mL成纤维生长因子2；③第10至17天，在分化培养基中加入5 ng/mL人血小板衍生生长因子AA、5 nM胰岛素样生长因子1和10 μM雄激素；④第17至20天，在分化培养基中加入10ng/mL人血小板衍生生长因子AA和10 ng/mL成纤维生长因子2；⑤从第20至25天，在分化培养基中加入5 ng/mL 促黄体生成素, 0.5 mM视黄醇和1 mM八溴环磷酸腺苷。
本发明进一步设置为：步骤③中的分化培养基包括有DMEM/F12、体积百分比1%牛血清白蛋白、5 mM ITS和5 ng/mL促黄体生成素。
本发明进一步设置为：步骤⑤中所述的富集培养基包括有DMEM/HG、体积百分比5%胎牛血清、体积百分比2.5% HS, 1×丙酮酸钠、1×GlutaMAX和体积百分比1% P/S。
本发明进一步设置为：对富集培养基中所培养的目标睾丸间质细胞进行鉴定，鉴定的方法包括免疫荧光鉴定、逆转录PCR检测和蛋白印记检测。
本发明进一步设置为：步骤②中预培养时间为2天；步骤③中分化培养基每2天更换一次；步骤⑤中富集培养基每2天更换一次。
采用这样的方法以后，可以成功将人源可诱导多能性干细胞诱导分化为能分泌睾酮的睾丸间质细胞，从而为未来临床采用患者自体细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞分化的睾丸间质细胞，用以进行细胞移植治疗性功能低下等疾病提供细胞来源。
采用这样的方法以后，在细胞分化过程未引入外源基因，完全采用小分子诱导，提高了未来临床应用的安全性；小分子诱导过程灵活可控，避免了过度诱导，提高了诱导效率；诱导方法可操作性强，重复性好，可稳定诱导出大量能分泌睾酮的睾丸间质细胞，从而更适用于未来临床应用。
以下结合附图对本发明进行更进一步详细的说明。
附图说明
附图1为细胞分化的流程及其结果示意图，其中：图1A为诱导分化示意图，图1B为诱导分化第25天分化组和对照组细胞明场形态，图1C为放射免疫法测定在LH刺激3小时后iPSC（阴性对照），LC（阳性对照）和iPSC -LC（分化组）培养基上清中睾酮水平；
附图2为免疫荧光鉴定结果示意图，其中：免疫荧光检测iPSC（阴性对照）、LC（阳性对照）和iPSC-LC（实验组）标记蛋白CYP11A1、HSD3B1、HSD17B3、NANOG和OCT4蛋白表达；
附图3为逆转录PCR（RT-PCR）检测结果示意图，其中：图3A为100 bp DNA Marker，图3B为RT-PCR检测iPSC（阴性对照）、LC（阳性对照）和iPSC-LC（实验组）基因Lhcgr、Star、Scarb1、Sf-1、Cyp11a1、Hsd3b1、Hsd17b3、Nanog、Oct4、Sox2和Klf4表达；
附图4为蛋白印迹检测结果示意图，其中：蛋白印迹检测iPSC（阴性对照）、LC（阳性对照）和iPSC-LC（实验组）标记蛋白LHCGR, SCARB1、SF-1、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1、HSD17B3、NANOG、OCT4、SOX2和SSEA4蛋白表达。
具体实施方式
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
下面，通过示例性的实施方式对本发明具体描述。然而应当理解，在没有进一步叙述的情况下，一个实施方式中的方法和特征也可以有益地结合到其他实施方式中。
下文中，睾丸间质细胞简称为LC；胚胎干细胞简称为ESC；人源可诱导多能性干细胞简称为iPSC；由iPSC诱导分化形成的目标睾丸间质细胞简称为iPSC-LCs；碱性成纤维细胞生长因子简称为bFGF; Li是指氯化锂（lithium chloride）；人血小板衍生生长因子AA简称为PDGF-AA；成纤维生长因子2简称为FGF-2；胰岛素样生长因子1简称为IGF-1；雄激素简称为Androgen；促黄体生成素简称为LH；视黄醇（Retinoic acid）简称为RA；八溴环磷酸腺苷简称为8Br-cAMP；胎牛血清简称为FBS；Sodium pyruvate是指丙酮酸钠；SAG是指DHH的激动剂；BSA是指牛血清蛋白；ITS 包括有：insulin, transferrin和selenium，即胰岛素，转铁蛋白和硒；Matrigel是指基质胶; EDTA是乙二胺四乙酸的简称；gelatin是指明胶。
一种小分子诱导iPSC分化为LC的方法，其特征在于：所述可诱导多能干细胞是指人源可诱导多能性干细胞，具体方法包括如下步骤①获取所述人源可诱导多能性干细胞；②使用不含有碱性成纤维细胞生长因子的E7培养基对所述人源可诱导多能性干细胞进行预处理培养；③使用分化培养基培养并结合小分子诱导剂诱导所述人源可诱导多能性干细胞进行分化，所述小分子诱导剂包括有DHH激动剂、22R-OHC、氯化锂、人血小板衍生生长因子AA、成纤维生长因子2、胰岛素样生长因子1、雄激素、促黄体生成素、视黄醇和八溴环磷酸腺苷；④手工剔除克隆团样杂细胞；⑤剔除所述杂细胞后将剩下的细胞用富集培养基继续培养，所述富集培养基定期更换，最终获得目标iPSC-LCs。
优选的，步骤①中所述人源可诱导多能性干细胞由人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞经细胞培养获得，具体方法包括如下步骤：将人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞接种在质量体积比1%基质胶处理过（至少37℃孵育1小时以上）的6孔板上，并置于37℃二氧化碳培养箱内培养，每天全量更换新鲜的E8培养基，发现有分化的细胞及时挑走，每间隔6天传代一次，传代稀释比例为6:1，在每次传代后的第1天，培养基中需要添加10 μM Y-27632。
优选的，在获取所述人源可诱导多能性干细胞过程中，为减少对人源可诱导多能性干细胞的损伤，传代时使用质量体积比0.25%EDTA处理3-5分钟，当克隆团边缘部分开始卷起并快脱离培养皿底部时，用去离子的PBS洗1遍，然后用1 mL的 E8培养基轻轻吹打且吹打次数不超过10次，收集细胞接种到新的被质量体积比1%基质胶预处理过（至少37℃孵育1小时以上）的6孔板上继续培养。
步骤①中所述iPSC由人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞经细胞培养获得，具体获得方法如实施例1所示。
实施例1:人源可诱导多能性干细胞iPSC的培养方法
将克隆团样人源尿液细胞重编程来源的iPSC接种在质量体积比1% Matrigel孵育处理过（至少37℃孵育1小时以上）的6孔板上，37℃二氧化碳培养箱内培养，每天倒置显微镜观察生长状态，每天全量更换新鲜的E8培养基。一旦发现有分化的细胞及时挑走，每间隔6天传代一次，传代稀释比例为6:1。为减少对iPSC的损伤，传代时使用质量体积比0.25%EDTA处理3-5分钟，当克隆团边缘部分开始卷起并快脱离培养皿底部时，用去离子的PBS洗1遍，然后用1 mL的 E8培养基轻轻吹打（不能超过10次），收集细胞接种到新的被质量体积比1% Matrigel预处理过（至少37℃孵育1小时以上）的6孔板上继续培养。在每次传代后的第1天，培养基中需要添加10 μM Y-27632，最终获得目标iPSC。
优选的，步骤②在预培养时间为2天。
优选的，定义步骤③中诱导开始时间为第0天，所述小分子诱导剂及其添加时间如下所示：①第0至7天，在分化培养基中加入0.2 μm DHH激动剂SAG、5 μM 22R-OHC和5 mM 氯化锂; ②第7至10天，在分化培养基中加入5 ng/mL人血小板衍生生长因子AA和5 ng/mL成纤维生长因子-2；③第10至17天，在分化培养基中加入5 ng/mL人血小板衍生生长因子AA、5nM胰岛素样生长因子1和10 μM雄激素；④第17至20天，在分化培养基中加入10 ng/mL人血小板衍生生长因子AA 和10 ng/mL成纤维生长因子2；⑤从第20至25天，在分化培养基中加入5 ng/mL 促黄体生成素, 0.5 mM视黄醇和1 mM八溴环磷酸腺苷。
优选的，步骤③中的分化培养基包括有DMEM/F12, 体积百分比1%牛血清白蛋白、5mM ITS和5 ng/mL促黄体生成素。
优选的，步骤⑤中所述的富集培养基包括有DMEM/HG、体积百分比5% FBS、体积百分比2.5% HS、1×Sodium pyruvate、1×GlutaMAX和体积百分比1% P/S。
优选的，步骤③中的所述分化培养基每2天更换一次，步骤⑤中所述富集培养基每2天更换一次。
步骤②至⑤的具体实施方式如实施例2所示。
实施例2：诱导人源可诱导多能性干细胞iPSC分化为睾丸间质细胞iPSC-LCs的方法
实施过程：实施例1中所培养的的克隆团样iPSC达到70%融合时，定义此时间点为第-2天，此时细胞培养基换成不含bFGF的E7培养基进行培养，预处理2天，定义此时时间点为第0天。然后将培养基换成分化培养基iPSC-DIM：DMEM/F12、体积百分比1% 牛血清白蛋白BSA、5 mM ITS和5 ng/mL LH。从第0至7天，在分化培养基中加入0.2μM SAG、5μM 22R-OHC和5 mM Li进行早期分化诱导。从第7至10天，在分化培养基中加入5 ng/mL PDGF-AA和5 ng/mL FGF2进行早期促增殖诱导。从第10至17天，在分化培养基中加入5 ng/mL PDGF-AA、5 nMIGF-1和10 μM Androgen进行中期分化诱导。从第17至20天，在分化培养基中加入10 ng/mLPDGF-AA和10 ng/mL FGF2进行中期促增殖诱导。从第20至25天，在分化培养基中加入5 ng/mL LH、0.5 mM RA和1 mM 8Br-cAMP进行晚期成熟分化诱导。期间培养基每两天更换一次。然后通过手工富集的方式，剔除克隆团iPSC样的杂细胞。剩下的细胞用富集培养基继续培养5天，富集培养基主要含有：DMEM/HG、体积百分比5% FBS、体积百分比2.5% HS、1×Sodiumpyruvate、1×GlutaMAX和体积百分比1% P/S。期间培养基每两天更换一次。
为测定实施例2中分化形成的iPSC-LCs的活性，以下提供一个实施例3，采用放免法对上述血清睾酮进行测定。
实施例3：放免法测定血清睾酮含量的方法
所述样品是指实施例2中分化形成的细胞样品。
配制TBS-G溶液：1 g gelatin，4.4 g Trizma HCl，2.65 g Trizma Base，5.84 氯化钠 和1 g Na Azide 溶于1 L双蒸水。在不用活性炭吸附，测完整放射值的标记TC管中加500 μL TBS-G。在不加抗体，用于测量非特异性结合值的标记NBS管中加500 μL TBS-G。在标记样品管中加200 μL TBS-G和100 μL样品。在标记标准品管的管中加300 μL不同浓度的标准品：10-2000 pg/100 μL，8个浓度。除TC管和NBS管外，每管加200 μL睾酮抗体。每管加300 μL Tracer，即H-睾酮-TBS-G溶液，进行振荡，4℃过夜。除TC管外，每管加200 μL活性碳/葡萄聚糖并放置20分钟，再振荡，1800g离心力离心10 分钟。将上清小心加入到含有5 μL液闪瓶中，其过程中注意不让活性碳进入液闪瓶，然后上下颠倒混匀。液闪测量。检测的内部效应和外部效应差异为15%。
如图1所示，综合实施例2与实施例3，其实施结果如下：如图1A所示，当iPSC从E7培养基更换为分化培养基iPSC-DIM时定义为分化第0天，此时细胞呈致密克隆团样结构，生长状态良好；
如图1B所示，在诱导分化第25天，细胞形态呈梭形，椭圆形和圆形混合状态，细胞质中出现大量油滴状物质，克隆团样细胞逐渐萎缩凋亡。诱导分化后经过手工剔除克隆团样iPSC杂细胞，富集iPSC-LCs，在单独的DMEM/F12培养基中加入10 ng/ml LH刺激培养3小时，收集上清，测量培养基中睾酮含量。
如图1C所示， iPSC-LC在LH刺激下可以分泌睾酮，且高于阴性对照iPSC。
下面对以上方案进行进一步优化。
优选的，对富集培养基所培养的细胞进行鉴定，鉴定方法包括免疫荧光鉴定，逆转录PCR检测和蛋白印记检测。
以下提供采用免疫荧光鉴定法对目标细胞进行检测的方法，具体内容如实施例4所示。
实施例4：免疫荧光鉴定法检测目标细胞iPSC-LCs
实施过程：使用实施例2中分化形成的细胞样品。待细胞处理好后，吸弃上清，PBS洗1遍，分别加入体积百分比4%多聚甲醛室温下孵育15分钟，然后PBS洗3遍，每遍5分钟，再加入含有质量体积比0.1% Triton-X 100和质量体积比3% BSA的PBS室温进行膜通透化处理1小时。然后不洗涤直接加入一抗：兔多克隆CYP11A1抗体（体积比1:500），鼠单克隆HSD3B1抗体（体积比1:200），兔多克隆HSD17B3抗体（体积比1:500），兔多克隆NANOG抗体（体积比1:200），和兔单克隆OCT4抗体（体积比1:250）4℃孵育过夜。然后PBS洗3次，每次5分钟，接着加入二抗：Cy3标记羊抗兔IgG抗体（体积比1:500），FITC标记羊抗鼠IgG抗体（体积比1:500）和FITC标记羊抗兔 IgG抗体（体积比1:500）室温孵育2小时。之后PBS洗3次，每次5分钟，接着加入DAPI染色液室温避光孵育15分钟。最后PBS洗3次，每次5分钟，直接倒置荧光显微镜下观察拍照。
实施结果：当实施例2中的细胞分化30天后，对富集的靶细胞iPSC-LCs进行免疫荧光鉴定，检测睾丸间质细胞相关标志蛋白CYP11A1，HSD3B1，HSD17B3，以及iPSC细胞特异性标记蛋白NANOG和OCT4的表达情况。结果显示阴性对照组iPSC细胞可阳性表达NANOG和OCT4，但阴性表达CYP11A1，HSD3B1，HSD17B3。阳性对照组LC细胞可阳性表达CYP11A1，HSD3B1，HSD17B3，阴性表达NANOG和OCT4。实验组诱导分化靶细胞iPSC-LCs部分细胞能阳性表达睾丸间质细胞相关标记蛋白CYP11A1，HSD3B1，HSD17B3，阴性表达iPSC细胞特异性标记蛋白NANOG和OCT4
以下提供采用逆转录PCR（RT-PCR）检测法对目标细胞进行检测的方法，具体内容如实施例5所示。
实施例5：PCR（RT-PCR）检测法检测目标细胞iPSC-LCs
实施过程：使用实施例2中分化形成的细胞样品。提取各组细胞总的RNA，并测定OD，保证提取各组的RNA OD 260/OD280值在1.8和2.1之间，以保证其纯度。然后总RNA利用逆转录试剂盒进行反转录成cDNA。产物cDNA用来做RT-PCR，引物序列如下所示：
Lhcgr-F: CACATAACCACCATACCAGGAAA；
Lhcgr-R: AAGTCAGTGTCGTCCCATTGA；
Scarb1-F: GTCGCAGGCATTGGACAAAC；
Scarb1-R: CAGGACCTTGGCTCCGGATT；
Star-F: GGGAGTGGAACCCCAATGTC；
Star-R: CCAGCTCGTGAGTAATGAATGT；
Sf-1-F: GGAGGCTTGCGAAGGAGAAG；
Sf-1-R: AGCTTACCCAACGGCGTG；
Cyp11a1-F: GCAGTGTCTCGGGACTTCG；
Cyp11a1-R: GGCAAAGCGGAACAGGTCA；
Hsd3b1-F: CACATGGCCCGCTCCATAC；
Hsd3b1-R: GTGCCGCCGTTTTTCAGATTC；
Hsd17b3-F: GTCAACAATGTCGGAATGCTTC；
Hsd17b3-R: TGATGTTACAATGGATGAGGCTC；
Nanog-F: CAAGAACTCTCCAACATCCTGAA；
Nanog-R: CCTGCGTCACACCATTGCTATTC；
Oct4-F: GAAGGATGTGGTCCGAGTGT；
Oct4-R: GTGAAGTGAGGGCTCCCATA；
Sox2-F: CAGGAGTTGTCAAGGCAGAGA；
Sox2-R: CCGCCGCCGATGATTGTTA；
Klf4-F: GCCGCTCCATTACCAAGAG；
Klf4-R: GTGTGCCTTGAGATGGGAAC；
GADPH-F: ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG；
GADPH-R: GCCATCACGCCACAGTTTC；
瞬离后上机，94℃预变性2 分钟, 以94 ℃反应30秒，59℃至63℃反应30 秒，72℃反应30 秒为一个循环，共反应35个循环。反应产物吸取6 μL加上2 μL的6×LoadingBuffer混匀后进行质量体积比2%的琼脂糖凝胶电泳并拍照。
实施结果：逆转录PCR（RT-PCR）检测结果显示，诱导分化靶细胞iPSC-LCs能阳性表达睾丸间质细胞相关标记基因Lhcgr, Star, Scarb1, Sf-1, Cyp11a1, Hsd3b1,Hsd17b3，阴性表达iPSC细胞特异性标基因Nanog, Oct4, Sox2, Klf4。阴性对照组iPSC细胞不表达睾丸间质细胞相关标记基因Lhcgr, Star, Scarb1, Sf-1, Cyp11a1, Hsd3b1,Hsd17b3，但阳性表达Nanog, Oct4, Sox2, Klf4。阳性对照组LC细胞不表Nanog, Oct4,Sox2, Klf4，但阳性表达Lhcgr, Star, Scarb1, Sf-1, Cyp11a1, Hsd3b1, Hsd17b3。
以下提供采用蛋白印迹检测对目标细胞进行检测的方法，具体内容如实施例6所示。
实施例6：蛋白印迹检测法测定目标细胞iPSC-LCs
实施过程：使用实施例2中分化形成的细胞样品。待细胞培养达到融合后，吸掉上清，PBS洗1遍，放置冰上操作，加入细胞裂解液 (RIPA)裂解30分钟，收集裂解液4℃冷冻离心（16000 转/分钟, 15分钟）收集上清，BCA定量试剂盒测定蛋白浓度后，-20℃冰箱保存。跑胶前解冻后与溴酚兰（体积比4:1）混混合，加入β巯基乙醇后煮沸制样。各组分别用微量注射器取50 μg蛋白样进行12%十二烷基硫酸钠凝胶电泳，按“滤纸-PVDF膜-胶-滤纸”的顺序叠好，电流恒流180 mA，电压120 V，湿转 2.5小时，电泳后进行电转，再将蛋白样转移到PDVF膜上。然后用5%脱脂奶粉对PDVF膜进行4℃封闭处理1小时，接着加入一抗：兔多克隆NANOG抗体（体积比1:1000），兔单克隆OCT4抗体（体积比1:1000），兔单克隆SOX2抗体（体积比1:1000），鼠单克隆SSEA4抗体（体积比1:1000），鼠单克隆LHCGR抗体（体积比1:1000），兔单克隆SCARB1抗体（体积比1:1000），鼠单克隆SF-1抗体（1:200），兔多克隆CYP11A1抗体（体积比1:1000），鼠单克隆HSD3B1抗体（体积比1:1000），和兔单克隆CYP17A1抗体（体积比1:2000），兔多克隆HSD17B3抗体（体积比1:2000）和兔单克隆β-ACTIN抗体（体积比1:1000），4℃孵育过夜。然后TBST洗5遍，每次10分钟，接着加入二抗：HRP标记羊抗兔IgG抗体（体积比1:5000）和HRP标记羊抗鼠IgG抗体（1:5000）室温孵育2小时。之后TBST洗5遍，每次10分钟，加入ECL发光液后在蛋白荧光成像系统下曝光并拍照。
实施结果：诱导分化靶细胞iPSC-LCs能阳性表达睾丸间质细胞相关标记蛋白LHCGR, SCARB1, SF-1, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, HSD17B3，阴性表达iPSC细胞特异性标蛋白NANOG, OCT4, SOX2, SSEA4。阴性对照组iPSC细胞不表达睾丸间质细胞相关标记蛋白LHCGR, SCARB1, SF-1, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, HSD17B3，但阳性表达NANOG,OCT4, SOX2, SSEA4。阳性对照组LC细胞不表NANOG, OCT4, SOX2, SSEA4，但阳性表达LHCGR, SCARB1, SF-1, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, HSD17B3。
综合实施例3至6的结果可知，在分化培养基的基础上，外加SAG, 22OHC, Li,PDGF-AA, FGF2, IGF-1, Androgen, LH, RA和8Br-cAMP小分子能够成功诱导iPSC分化为LC，即能够通过小分子诱导剂将iPSC成功诱导分化为iPSC-LCs。

Claims (4)

1.一种小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述可诱导多能干细胞是指人源可诱导多能性干细胞，具体方法包括如下步骤：①获取所述人源可诱导多能性干细胞；②使用不含有碱性成纤维细胞生长因子的E7培养基对所述人源可诱导多能性干细胞进行预处理培养；③使用分化培养基并结合小分子诱导剂诱导所述人源可诱导多能性干细胞进行分化，所述小分子诱导剂包括有DHH激动剂、22R-OHC、氯化锂、人血小板衍生生长因子AA、成纤维生长因子2、胰岛素样生长因子1、雄激素、促黄体生成素、视黄醇和八溴环磷酸腺苷；④手工剔除克隆团样杂细胞；⑤剔除所述杂细胞后将剩下的细胞用富集培养基继续培养，所述富集培养基定期更换,最终获得目标睾丸间质细胞；
步骤②至⑤具体如下：
所述的克隆团样iPSC达到70%融合时，定义此时间点为第-2天，此时细胞培养基换成不含bFGF的E7培养基进行培养，预处理2天，定义此时时间点为第0天，然后将培养基换成分化培养基iPSC-DIM：DMEM/F12、体积百分比1% 牛血清白蛋白BSA、5 mM ITS和5 ng/mL LH，从第0至7天，在分化培养基中加入0.2μM SAG、5μM 22R-OHC和5 mM LiCl进行早期分化诱导，从第7至10天，在分化培养基中加入5 ng/mL PDGF-AA和5 ng/mL FGF2进行早期促增殖诱导；
从第10至17天，在分化培养基中加入5 ng/mL PDGF-AA、5 nM IGF-1和10 μM Androgen进行中期分化诱导，从第17至20天，在分化培养基中加入10 ng/mL PDGF-AA和10 ng/mLFGF2进行中期促增殖诱导，从第20至25天，在分化培养基中加入5 ng/mL LH、0.5 mM RA和1mM 8Br-cAMP进行晚期成熟分化诱导，期间培养基每两天更换一次，然后通过手工富集的方式，剔除克隆团iPSC样的杂细胞；
剩下的细胞用富集培养基继续培养5天，富集培养基主要含有：DMEM/HG、体积百分比5%FBS、体积百分比2.5% HS、1×Sodium pyruvate、1×GlutaMAX和体积百分比1% P/S，期间培养基每两天更换一次。
2.根据权利要求1所述的小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：步骤①中所述人源可诱导多能性干细胞由人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞经细胞培养获得，具体方法包括如下步骤：将人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞接种在质量体积比1%的基质胶处理过且至少37℃孵育1小时以上的6孔板上，并置于37℃二氧化碳培养箱内培养，每天全量更换新鲜的E8培养基，发现有分化的细胞及时挑走，每间隔6天传代一次，传代稀释比例为6:1，在每次传代后的第1天，培养基中需要添加10 μM Y-27632。
3.根据权利要求1或2所述的小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：在获取所述人源可诱导多能性干细胞过程中，为减少对人源可诱导多能性干细胞的损伤，传代时使用质量体积比0.25% EDTA处理3-5分钟，当克隆团边缘部分开始卷起并快脱离培养皿底部时，用不含Mg2+离子的PBS洗1遍，然后用1 mL的 E8培养基轻轻吹打且吹打次数不超过10次，收集细胞接种到新的被质量体积比1%基质胶预处理过且至少37℃孵育1小时以上的6孔板上继续培养。
4.根据权利要求1所述的小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：对富集培养基中所培养的目标睾丸间质细胞进行鉴定，鉴定的方法包括免疫荧光鉴定、逆转录PCR检测和蛋白印记检测。
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