CN112316121A - 胰高血糖素样肽-1在制备治疗男性性腺功能低下综合征药物中的应用 - Google Patents

胰高血糖素样肽-1在制备治疗男性性腺功能低下综合征药物中的应用 Download PDF

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CN112316121A CN202011328323.5A CN202011328323A CN112316121A CN 112316121 A CN112316121 A CN 112316121A CN 202011328323 A CN202011328323 A CN 202011328323A CN 112316121 A CN112316121 A CN 112316121A
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Abstract

本发明提供了GLP‑1在制备治疗男性性腺功能低下综合征药物中的应用，属于医药技术领域。本发明提供的GLP‑1在制备治疗男性性腺功能低下综合征的药物中的应用，GLP‑1制备的治疗男性性腺功能低下综合征的药物具有提高血清睾酮含量、诱导睾丸间质干细胞分化的作用，且用药安全，无明显毒副作用。

Description

胰高血糖素样肽-1在制备治疗男性性腺功能低下综合征药物 中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及胰高血糖素样肽-1在制备治疗男性性腺功能低下综合征药物中的应用。
背景技术
性腺功能低下综合征(hypogonadism)为男性多发的一种睾丸机能减退，其主要特征包括性欲和勃起质量减退、情绪改变伴有脑力和空间定向能力下降、肌力下降、体毛减少和皮肤改变、骨密度下降以及内脏脂肪增加等(中华男科学杂志[J]，2012，18(5)，475～477；中华男科学杂志[J]，2004，10(8)，563～566)。性腺功能低下综合征一般好发于45岁～55岁，也可以早至40岁或延迟到65岁，而发病原因与下丘脑-垂体-睾丸轴系的功能减退和睾丸间质细胞(Leydig cell，LCs) 衰退有关(J.Andrology，2009，32(1)，1～10；Endocrinology，2002， 143(5)，1637～1642)。
睾丸间质细胞是一种具有合成和分泌睾酮功能的细胞，是雄性体内雄激素的最主要来源。人体血清中的睾酮(Testosterone，T)是睾丸间质细胞受脑垂体分泌的促黄体生成激素(Luteinizing hormone， LH)刺激而产生的，并受一系列负反馈机制调节。临床研究表明，男性下丘脑-垂体轴功能随着年龄增长而逐渐下降，从而导致LH脉冲释放的幅度减弱，最终影响睾丸间质细胞合成和分泌雄性激素(Proc Natl Acad Sci U S A.2006Feb 21；103(8):2719-24；Proc Natl Acad Sci U S A.2016Mar 8；113(10):2666-71；EndocrRev.2020Feb 1；41(1): bnz013.)。
现时，临床上治疗性腺功能低下综合征主要通过睾酮补充疗法，然而，该疗法除了需要定期注射睾酮以外，还存在显著的安全性问题。首先，长期定量补充睾酮会使患者易生痤疮并患红细胞增多症；其次，容易造成血清睾酮浓度的大幅度波动，进而引起患者情绪和迟发性性腺功能低下综合征症状的明显起伏；再次，患者容易出现水、钠潴留及阴茎异常勃起、排尿困难等不良反应，甚至肝肾功能受损及引发前列腺癌等疾病(中国临床保健杂志[J]，2009，12(4)，386～388；中华男科学杂志[J]，2010，16(1)，68～71)。因此，急需一种治疗效果好、无明显毒副作用的治疗男性性腺功能低下综合征的药物。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备治疗男性性腺功能低下综合征药物中的应用。胰高血糖素样肽-1制备的治疗男性性腺功能低下综合征的药物具有提高血清和睾丸中睾酮含量、诱导睾丸间质干细胞分化的作用，且用药安全，无明显毒副作用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备治疗男性性腺功能低下综合征的药物中的应用。
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备诱导睾丸间质干细胞分化的药物中的应用。
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备提高血清中睾酮含量的药物中的应用。
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备提高睾丸中睾酮含量的药物中的应用。
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备上调睾丸间质细胞中雄激素合成途径中的关键基因Scarb1、Cyp11a1和Hsd11b1表达水平药物中的应用。
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备上调睾丸间质细胞中雄激素合成途径中的关键蛋白SCARB1、CYP11A1和HSD11B1表达水平药物中的应用。
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备上调睾丸间质细胞中关键蛋白EPAC1和pMEK1/2表达水平的药物中的应用。
有益效果：
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备治疗男性性腺功能低下综合征的药物中的应用。胰高血糖素样肽-1制备的治疗男性性腺功能低下综合征的药物具有提高血清睾酮含量、诱导睾丸间质干细胞分化的作用，且用药安全，无明显毒副作用。实施例的结果表明：胰高血糖素样肽-1可显著提高EDS模型大鼠血清中睾酮的含量，且连续给药14天，大鼠的体重及睾丸湿重无显著性变化，用药安全性能高；同时，胰高血糖素样肽-1还具有诱导睾丸间质干细胞的分化的作用，可以上调雄激素合成途径中的关键基因Scarb1、Cyp11a1和Hsd11b1 的表达水平，上调睾丸间质细胞中雄激素合成途径中的关键蛋白 SCARB1、CYP11A1和HSD11B1的表达水平，上调睾丸间质细胞中关键蛋白EPAC1和pMEK1/2的表达水平。
附图说明
图1为实施例1中GLP-1刺激睾丸间质干细胞的分化结果；其中，A为处理曲细精管的方案；B～D为HSD3B1对曲细精管表面睾丸间质干细胞的染色，B为BM处理组，C为DM处理组，D为DM+30 nM GLP-1处理组；E为实施例1中各处理对HSD3B1+细胞细胞数的影响；F为实施例1中各处理对睾酮含量的影响；
图2为实施例2中GLP-1对睾丸间质细胞中雄激素合成途径相关基因表达的影响；
图3为实施例2中GLP-1对睾丸间质细胞中雄激素合成途径相关蛋白表达的影响；
图4为实施例3中GLP-1对EDS模型大鼠血清中睾酮、LH和 FSH含量的影响；其中，A为EDS模型的操作方案，B为EDS模型大鼠给药后血清中睾酮的含量，C为EDS模型大鼠给药后血清中LH 的含量，D为EDS模型大鼠给药后血清中FSH的含量；
图5为实施例3中GLP-1对EDS模型大鼠给药后睾丸间质细胞 CYP11A1阳性细胞和HSD11B1阳性细胞的数量的影响；其中，A为对照组(0ng/睾丸GLP-1)细胞进行染色后细胞表达HSD11B1的状态，B为100ng/睾丸GLP-1组细胞进行染色后细胞表达HSD11B1 的状态，C为0ng/睾丸、10ng/睾丸和100ng/睾丸GLP-1组染色后表达HSD11B1的细胞数，D为对照组(0ng/睾丸GLP-1)细胞进行染色后细胞表达CYP11A1的状态，E为100ng/睾丸GLP-1组细胞进行染色后细胞表达CYP11A1的状态，F为0ng/睾丸、10ng/睾丸和100ng/睾丸GLP-1组染色后表达CYP11A1的细胞数；箭头表示表达HSD11B1的睾丸间质细胞，三角表示表达CYP11A1的睾丸间质细胞，比例尺＝50μm；
图6为实施例4中GLP-1对EDS模型大鼠给药后睾丸间质细胞中雄激素合成途径中相关基因表达水平的影响；
图7为实施例4中GLP-1对EDS模型大鼠睾丸间质细胞中雄激素合成途径中相关蛋白表达的影响；其中，A为凝胶条带；B为EDS 给药后给予不同浓度的GLP-1(0、10和100ng/睾丸)，WB检测大鼠睾丸间质细胞中SCARB1、CYP11A1、HSD3B1、HSD11B1表达水平的结果(ACTB为内参蛋白)；C为EDS给药后给予不同浓度的GLP-1(0、10和100ng/睾丸)，免疫组织化学半定量法检测睾丸中HSD11B1和CYP11A1蛋白表达水平的差异；箭头表示表达 HSD11B1蛋白的睾丸间质细胞，三角表示表达CYP11A1蛋白的睾丸间质细胞；
图8为实施例4中GLP-1对EDS模型大鼠给药后睾丸间质细胞中磷酸化蛋白及其总蛋白表达水平的影响；其中，A为凝胶条带；B 为EDS给药后给予不同浓度的GLP-1(0、10和100ng/睾丸)，WB 检测大鼠睾丸间质细胞中EPAC1表达水平的结果(ACTB为内参蛋白)；C为EDS给药后给予不同浓度的GLP-1(0、10和100ng/睾丸)，WB检测大鼠睾丸间质细胞中MEK1/2及其磷酸化蛋白表达水平的结果(ACTB为内参蛋白)；D为EDS给药后给予不同浓度的 GLP-1(0、10和100ng/睾丸)，WB检测大鼠睾丸间质细胞中ERK1/2 及其磷酸化蛋白表达水平的结果(ACTB为内参蛋白)。
具体实施方式
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备治疗男性性腺功能低下综合征的药物中的应用。本发明所述治疗男性性腺功能低下综合征的药物的有效成分为胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)。本发明GLP-1制备的治疗男性性腺功能低下综合征的药物具有提高血清睾酮含量、诱导睾丸间质干细胞分化的作用，从而到达缓解或治疗性腺功能综合征的目的，同时，GLP-1给药后无明显毒副作用，药品安全性能好。
在本发明中，所述GLP-1优选通过从自然界生物体中分离、多肽化学合成、原核微生物基因工程菌表达后纯化或由动物细胞等进行表达并纯化后获得。本发明实施例中的GLP-1为Peprotech公司的重组人GLP-1(产品编号：130-08)。
本发明所述的GLP-1还包括聚合体，即若干个GLP-1以自动的方式(如：物理吸附)聚集在一起，而形成的集合体，在此情况下，应理解为一种生物自发的自然现象，或者以基因工程方式形成若干个 GLP-1相连接的形式。
本发明提供的GLP-1还包括连接体，即采用生物的或化学的连接技术(BioConjugate Chemistry)以人为操作方式实现将GLP-1相互连接在一起，在此情况下，应理解为其有别于生物的自然现象，而是在人为干预的情况下实现。
本发明对所述药物的剂型没有特殊要求，采用本领域常规剂型即可，且不仅限于水溶液注射剂、粉针剂、丸剂、散剂、片剂、贴剂、栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂和控释剂等。
本发明对所述药物的辅料没有特殊要求，采用本领域常规辅料即可，且不仅限于等渗剂、缓冲液、矫味剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等；也可以是为了与所述物质相适应而选择使用的，如：乳化剂、增溶剂、抑菌剂、止痛剂和抗氧剂等，这类辅料能有效提高组合物所含化合物的稳定性和溶解性或改变化合物的释放速率和吸收速率等，从而改善各种化合物在生物体内的代谢，进而增强组合物的给药效果。此外，所述辅料还可以为实现特定的给药目的或方式，如：缓释给药、控释给药和脉冲给药等，而使用的辅料，如明胶、白蛋白、壳聚糖、聚醚和聚酯类高分子材料、聚乙二醇、聚氨酯、聚碳酸酯及其共聚物等。
当所述药物为水溶液注射剂时，所述辅料优选包括等渗剂、缓冲液以及必要的乳化剂、增溶剂和抑菌剂等。此外，还优选包括含有药学上可接受的其它药用辅料，如：抗氧剂、pH调节剂和止痛剂等。
当所述药物为口服液制剂时，所述辅料优选包括溶剂、矫味剂、抑菌剂、乳化剂和着色剂等。
当所述药物为片剂时，所述辅料优选为填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂等。
当所述药物为乳剂时，所述辅料优选为为水、油、乳化剂、必要的防腐剂和矫味剂等。
当所述药物为颗粒剂时，所述辅料的种类与片剂类似，但造粒过程不同。
当所述药物为胶囊剂时，所述辅料与颗粒剂类似，只需将制得的颗粒剂与助流剂混合后装入胶囊即得胶囊剂即可。
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备诱导睾丸间质干细胞分化的药物中的应用。本发明所述诱导睾丸间质干细胞分化的药物的有效成分为GLP-1，本发明对GLP-1的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明对所述诱导睾丸间质干细胞分化的药物的剂型没有特殊要求，采用本领域常规剂型即可。本发明对所述诱导睾丸间质干细胞分化的药物的辅料没有特殊要求，采用本领域常规辅料即可。本发明GLP-1制备的诱导睾丸间质干细胞分化的药物具有不改变HSD3B1阳性的睾丸间质细胞的数目的作用，但具有显著的促进睾丸间质干细胞分化的作用，进而促进睾酮的分泌，提高睾酮的水平。
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备提高血清中睾酮含量的药物中的应用。本发明所述提高血清中睾酮含量的药物的有效成分为 GLP-1，本发明对GLP-1的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明对所述提高血清中睾酮含量的药物的剂型没有特殊要求，采用本领域常规剂型即可。本发明对所述提高血清中睾酮含量的药物的辅料没有特殊要求，采用本领域常规辅料即可。本发明GLP-1制备的血清中睾酮含量的药物具有显著提高血清中睾酮水平的作用。
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备提高睾丸中睾酮含量的药物中的应用。本发明所述提高睾丸中睾酮含量的药物的有效成分为 GLP-1，本发明对GLP-1的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明对所述提高睾丸中睾酮含量的药物的剂型没有特殊要求，采用本领域常规剂型即可。本发明对所述提高睾丸中睾酮含量的药物的辅料没有特殊要求，采用本领域常规辅料即可。本发明GLP-1制备的提高睾丸睾酮含量的药物具有显著提高睾丸中睾酮水平的作用。
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备上调睾丸间质细胞睾酮合成途径中的关键基因Scarb1、Cyp11a1和Hsd11b1水平的药物中的应用。本发明所述上调睾丸间质细胞睾酮合成途径中的关键基因 Scarb1、Cyp11a1和Hsd11b1水平的药物的有效成分为GLP-1，本发明对GLP-1的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明对所述上调睾丸间质细胞睾酮合成途径中的关键基因Scarb1、 Cyp11a1和Hsd11b1水平的药物的剂型没有特殊要求，采用本领域常规剂型即可。本发明对所述上调睾丸间质细胞睾酮合成途径中的关键基因Scarb1、Cyp11a1和Hsd11b1水平的药物的辅料没有特殊要求，采用本领域常规辅料即可。本发明GLP-1制备上调睾丸间质细胞睾酮合成途径中的关键基因Scarb1、Cyp11a1和Hsd11b1水平的药物可通过睾丸间质细胞中EPAC1和pMEK1/2通路发挥作用，促进睾丸间质干细胞的分化。
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备上调睾丸间质细胞睾酮合成途径中的关键蛋白SCARB1、CYP11A1和HSD11B1含量的药物中的应用。本发明所述上调睾丸间质细胞睾酮合成途径中的关键蛋白 SCARB1、CYP11A1和HSD11B1含量的药物的有效成分为GLP-1，本发明对GLP-1的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明对所述上调睾丸间质细胞睾丸间质细胞睾酮合成途径中的关键蛋白SCARB1、CYP11A1和HSD11B1含量的药物的剂型没有特殊要求，采用本领域常规剂型即可。本发明对所述上调睾丸间质细胞睾丸间质细胞睾酮合成途径中的关键蛋白SCARB1、CYP11A1和 HSD11B1含量的药物的辅料没有特殊要求，采用本领域常规辅料即可。本发明GLP-1制备上调睾丸间质细胞睾丸间质细胞睾酮合成途径中的关键蛋白SCARB1、CYP11A1和HSD11B1含量的药物可通过睾丸间质细胞中EPAC1和pMEK1/2通路发挥作用，促进睾丸间质干细胞的分化。
本发明提供了胰高血糖素样肽-1在制备上调睾丸间质细胞关键蛋白EPAC1和pMEK1/2含量的药物中的应用。本发明所述上调睾丸间质细胞关键蛋白EPAC1和pMEK1/2含量的药物的有效成分为 GLP-1，本发明对GLP-1的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明对所述上调睾丸间质细胞关键蛋白EPAC1和pMEK1/2含量的药物的剂型没有特殊要求，采用本领域常规剂型即可。本发明对所述上调睾丸间质细胞关键蛋白EPAC1和pMEK1/2含量的药物的辅料没有特殊要求，采用本领域常规辅料即可。本发明GLP-1可以通过EPAC1和pMEK1/2蛋白通路，促进睾丸简直干细胞的分化，提高血清睾酮水平。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的胰高血糖素样肽-1在制备治疗男性性腺功能低下综合征的药物中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
GLP-1对大鼠睾丸间质干细胞的促分化作用
材料：Corning 12孔板(购自美国康宁公司，货号：3336)，睾酮放射性免疫检测试剂盒(购自浙江国药控股医疗供应链服务有限公司，货号：L2KTW6)，重组人GLP-1(购自Peprotech，产品编号： 130-08)，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂(ITS，购自sigma，货号：I1884)，促黄体生成激素(LH，购自sigma，货号：L9773)，乙烷二甲烷硫砜(EDS，由北京世康合成医药科技有限公司合成)， DMEM/F12(购自sigma，货号：D2906-10X1L)，Bio-Rad cDNA合成试剂盒和Bio-Rad SYBR荧光染料(购自Bio-Rad，货号：170-8890、 170-8880)。
雄性Sprague-Dawley大鼠(购自温州医科大学动物实验中心， 90日龄，250±20克/只)实验前7天腹腔注射EDS(75mg/kg)，二氧化碳处死后，将睾丸取出，置于4℃的磷酸盐缓冲液中，剪除被膜，将曲细精管分离成单根后，均分至12孔板中，共分成4组，具体分组如下：
BM组：将曲细精管在普通培养基(BM)培养3周，每3～4天更换一次培养基；
DM组：将曲细精管在普通培养基(BM)培养7d，每3～4天更换一次培养基；然后将曲细精管的培养基换成促分化培养基(DM)，每3～4天更换一次培养基其中，DM培养基中不加入GLP-1；
DM+3nM GLP-1组：将曲细精管在普通培养基(BM)培养7d，每3～4天更换一次培养基；然后将曲细精管的培养基换成促分化培养基(DM)，每3～4天更换一次培养基，其中，DM培养基中加入3nM 的GLP-1；
DM+30nM GLP-1组：将曲细精管在普通培养基(BM)培养7d，每3～4天更换一次培养基；然后将曲细精管的培养基换成促分化培养基(DM)，每3～4天更换一次培养基，其中，DM培养基中加入30 nM的GLP-1。
BM培养基的配制步骤为：
1)取1L烧杯2个(A、B两个)各加入500mL双蒸水；
2)两个烧杯均加入BSA 1.0g；
3)两个烧杯均加入NaHCO32.2 g；
4)两个烧杯均加入HEPES 4.2g；
5)A烧杯加入DMEM/F12(sigma，货号：D2906-10X1L)一瓶； B烧杯加入M199粉剂9.5g；
6)两个烧杯均加入双蒸水定容到990mL；
7)超声仪超声至所有成分直至完全溶解；
8)以M199：DMEM/F12体积比为1：1混合；
9)向混合液中加入双抗(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，充分混匀；
10)调pH至7.2，然后转至2个1L玻璃瓶中；
11)混匀后在无菌超净台内用负压吸引器通过无菌过滤器(0.2 μM)过滤至500mL的无菌瓶中，然后加入1g/L的ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)，混匀，用封口膜封闭后，保存于4℃冰箱中待用。
DM培养基的配制步骤为：
在BM中加入LH(5ng/ml)和LI(锂离子，5mmol/L)，混匀待用。
试验结束后，收集培养基待测睾酮水平；收集曲细精管进行 HSD3B1(abcam公司)染色处理(标记分化的睾丸间质细胞)：1) 将分离的曲细精管置于载玻片上，吹风机自然风吹干；2)吹干后迅速滴加适量的HSD3B1酶细胞化学染色液，并用免疫组化笔将染液圈起，避免流失；3)载玻片置于湿盒中，避光34℃染色，45min-120 min。染色液成分如下：A液：1mgNBT+0.6mg DHEA+0.6ml DMSO； B液：10mgβ-NAD++9.5ml D-PBS；4)染色前将A、B两液混合，摇匀，滴加于细胞涂片上；5)染色结束后以蒸馏水冲洗，入固定液 (10％Formalin inD-PBS with 5％Sucrose，PH 7.4)中固定10min， D-PBS洗去固定液，以50％甘油(Glycerol：PBS＝1：1，V/V)封片，镜下观察并拍照，记录曲细精管外周的蓝紫色细胞(分化细胞)的个数，以细胞数目/小管面积(cm2)的比值来计算睾丸间质干细胞分化百分率。检测结果见图1。
由图1的结果可知，在BM培养基培养3周后，没有HSD3B1 阳性的间质细胞(图1中的B)；在DM组(图1中的C)和DM+30 nM GLP-1(图1中的D)中，诱导分化产生了HSD3B1阳性的间质细胞。与DM(图1中的C)和BM(图1中的B)组相比，GLP-1 组(图1中的D)显著增加了HSD3B1阳性间质细胞数(图1E)。
在BM培养基培养曲细精管3周后，睾酮水平几乎为0(图1中的F)。然而，在DM中培养3周后，可产生睾酮；但与DM组相比， 3nM和30nM GLP-1进一步增加了睾酮的产生(图1中的F)。这表明GLP-1刺激睾丸间质干细胞分化进入睾丸间质细胞系，从而诱导产生睾酮。相同字母表示组间没有差异(p>0.05)，不同字母间表示有显著性差异(p<0.05)。
实施例2
GLP-1对睾酮合成通路上相关基因和蛋白表达的影响
雄性Sprague-Dawley大鼠(购自温州医科大学动物实验中心， 90日龄，250±20g/只)实验前7天腹腔注射EDS(75mg/kg)，二氧化碳处死后，将睾丸取出，置于4℃的磷酸缓冲液中，剪除被膜，将曲细精管分离成单根后，将曲细精管均分至12孔板中，加入BM 培养基。在37℃，5％二氧化碳的条件下培养3周。在第一周，不加入GLP-1，只用BM培养基进行培养；培养的第二周至第三周，更换为DM培养基，并在DM培养基中加入不同浓度的GLP-1(3nM和30nM)处理曲细精管，每3～4天更换一次培养基，收取曲细精管提取RNA，逆转录试剂盒(promega)反转录1μgRNA，42℃逆转录30min 后，85℃处理5min终止反应，40S核糖体蛋白S16基因(Rps16，其引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，Rps16作为内参；用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(QPCR)和蛋白质印迹 (Westernblot，WB)检测睾酮合成通路上相关基因和蛋白的表达情况。本试验检测睾酮合成通路相关基因为Lhcgr、Scarb1、Star、 Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Srd5a1和Hsd11b1；检测的相关蛋白为LHCGR、SCARB1、STAR、CYP11A1、HSD3B1、 CYP17A1、HSD17B3、SRD5A1和HSD11B1。检测结果见图2和图3。
由图2可知，GLP-1显著上调了基因Scarb1、Cyp11a1、Hsd3b1 和Hsd11b1的表达水平，而不影响其他雄激素合成相关基因Lhcgr、 Star、Cyp17a1、Hsd17b3和Srd5a1的表达水平。表明GLP-1选择性地上调睾丸间质细胞雄激素合成通路中的关键性基因的表达水平，促进睾丸间质干细胞的分化。
由图3可知，与对照组相比，GLP-1显著上调了SCARB1、 CYP11A1、HSD3B1和HSD11B1蛋白的表达量，这与它们相应的 mRNA水平变化一致。
实施例3
GLP-1对EDS处理的睾酮低下症的治疗作用
选取18只雄性Sprague-Dawley大鼠(90日龄，250±20克/只，购自温州医科大学实验动物中心)作为研究对象。腹腔注射75mg/kg 乙烷二甲烷硫砜(EDS，现配现用，溶解在DMSO：生理盐水＝1：3 溶液中)杀死睾丸间质细胞制造血清无睾酮模型，随机分成3组，每组6只。1)GLP-1-0ng/睾丸/天(0.9％生理盐水对照组)；2)GLP-1-10 ng/睾丸/天(GLP-1溶于0.9％的生理盐水)；3)GLP-1-100ng/睾丸/ 天(GLP-1溶于0.9％的生理盐水)；从EDS处理14天后(此时睾酮为零)，每只大鼠每天睾丸内注射给药，给药体积为50μL，EDS 处理后第14～28d期间，每日连续给药。实验结束后，收集血清和睾丸。血清用于检测睾酮、LH以及FSH的水平；一侧睾丸-80℃保存用于提取RNA进行实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(QPCR)和提取蛋白进行蛋白质印迹(WB)，用于检测雄激素合成途径上相关基因和蛋白的表达情况以及检测大鼠睾丸间质细胞磷酸化蛋白的表达情况；另一侧睾丸于Bouin’s液中固定用于石蜡切片进行免疫组织学检测，检测GLP-1对睾丸间质细胞数目的影响。检测结果如图 4～8。其中Bouin’s固定液配制步骤如下：准备2个清洁干燥的100 mL玻璃瓶；量取100mL双蒸水，加入1～2g苦味酸充分混匀后制成饱和苦味酸溶液；量取饱和苦味酸溶液75mL，甲醛25mL，冰醋酸5mL混合均匀，室温保存待用。
由图4的结果可知，GLP-1显著提高了EDS模型大鼠血清中睾酮的含量，对血清中的LH和FSH没有显著影响。表明GLP-1具有提高EDS模型大鼠血清中睾酮水平的作用，可以用于由睾丸引起的睾酮低征的治疗，且对垂体和下丘脑的功能不产生影响。
由图5的结果可知，GLP-1不会增多或减少CYP11A1阳性细胞和HSD11B1阳性细胞的细胞数量，从侧面说明GLP-1提高雄激素(睾酮)的水平，不是单纯的增加了细胞的数量，而是提高了细胞的功能。
由图6的结果可知，GLP-1显著上调了基因Scarb1、Cyp11a1、 Hsd3b1和Hsd11b1的表达水平，而不影响其他雄激素合成相关基因 Lhcgr、Star、Cyp17a1、Hsd17b3和Srd5a1的表达水平。表明GLP-1 选择性地上调睾丸间质细胞合成睾酮通路中的关键性基因的表达水平，促进睾丸间质干细胞的分化。与实施例2的体外试验的结果一致。
由图7的结果可知，通过WB和免疫组织化学半定量法检测结果发现，与对照组相比，GLP-1显著上调了SCARB1、CYP11A1、HSD3B1 和HSD11B1蛋白的表达量，这与它们相应的mRNA水平变化一致。
由图8的结果可知，GLP-1可以上调EPAC1蛋白的表达水平；同时，上调了MEK1/2磷酸化蛋白(pMEK1/2)的表达水平，从而上调了pMEK1/2/MEK1/2的比值；也上调了ERK1/2总蛋白的表达水平，表明GLP-1可以通过EPAC1、MEK1/2以及ERK1/2等发挥作用。
实施例4
安全性能考察
实验方案：
体内给药方案同实施例3。试验结束时，称量大鼠体重，解剖大鼠，取双侧睾丸、双侧附睾，称湿重并记录，检测结果见表1。
表1 GLP-1对大鼠体重、睾丸及附睾重量的影响
Figure BDA0002794961910000131
Mean±SEM，n＝6-12
由表1的结果可知：连续给药14天后，各组大鼠的体重及睾丸湿重比较，无统计学意义(P>0.05)，说明GLP-1不影响大鼠体重、睾丸及附睾的重量，GLP-1用药安全，对大鼠无不良影响。
由以上实施例的结果可知，GLP-1可显著提高EDS模型大鼠血清中睾酮的含量；同时，GLP-1还具有诱导睾丸间质干细胞的分化的作用，不增加HSD11B1和CYP11A1阳性细胞的数目，却可以上调雄激素合成通路上的关键基因Scarb1、Cyp11a1和Hsd11b1和关键蛋白SCARB1、CYP11A1和HSD11B1的表达水平，这一作用可以通过 EPAC1、MEK1/2以及ERK1/2途径发挥作用；另外，连续给药14d，大鼠的体重及睾丸湿重无显著性变化，用药安全性能高。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (7)

1.胰高血糖素样肽-1在制备治疗男性性腺功能低下综合征的药物中的应用。
2.胰高血糖素样肽-1在制备诱导睾丸间质干细胞分化的药物中的应用。
3.胰高血糖素样肽-1在制备提高血清中睾酮含量的药物中的应用。
4.胰高血糖素样肽-1在制备提高睾丸中睾酮含量的药物中的应用。
5.胰高血糖素样肽-1在制备上调睾丸间质细胞中雄激素合成途径中的关键基因Scarb1、Cyp11a1和Hsd11b1表达水平药物中的应用。
6.胰高血糖素样肽-1在制备上调睾丸间质细胞中雄激素合成途径中的关键蛋白SCARB1、CYP11A1和HSD11B1表达水平药物中的应用。
7.胰高血糖素样肽-1在制备上调睾丸间质细胞中关键蛋白EPAC1和pMEK1/2表达水平的药物中的应用。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103861087A (zh) * 2012-12-14 2014-06-18 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心 神经生长因子在制备用于治疗中老年男性性功能低下综合征的药物中的用途
US20170079970A1 (en) * 2014-03-21 2017-03-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Tetrahydroquinoline derivatives and their use as epac1 inhibitors for the treatment of myocardial infarction injury
CN106636210A (zh) * 2016-10-09 2017-05-10 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心 转录因子组合诱导成纤维细胞转分化为类睾丸间质细胞的方法
CN107375910A (zh) * 2017-07-12 2017-11-24 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 PTHrP在制备治疗男性性腺功能低下综合征中的应用
CN108588004A (zh) * 2018-04-09 2018-09-28 深圳市莱利赛生物科技有限公司 诱导分化睾丸间质细胞的方法及其在性功能恢复中的应用
CN108795843A (zh) * 2018-06-01 2018-11-13 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法
CN110433282A (zh) * 2018-05-04 2019-11-12 上海交通大学医学院附属瑞金医院 胰高血糖素样肽-1在制备治疗钙化性主动脉瓣疾病药物方面的应用
CN111514279A (zh) * 2020-06-16 2020-08-11 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 神经营养因子3在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用
CN111529691A (zh) * 2020-06-03 2020-08-14 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 甲状旁腺激素(1-34)在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103861087A (zh) * 2012-12-14 2014-06-18 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心 神经生长因子在制备用于治疗中老年男性性功能低下综合征的药物中的用途
US20170079970A1 (en) * 2014-03-21 2017-03-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Tetrahydroquinoline derivatives and their use as epac1 inhibitors for the treatment of myocardial infarction injury
CN106636210A (zh) * 2016-10-09 2017-05-10 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心 转录因子组合诱导成纤维细胞转分化为类睾丸间质细胞的方法
CN107375910A (zh) * 2017-07-12 2017-11-24 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 PTHrP在制备治疗男性性腺功能低下综合征中的应用
CN108588004A (zh) * 2018-04-09 2018-09-28 深圳市莱利赛生物科技有限公司 诱导分化睾丸间质细胞的方法及其在性功能恢复中的应用
CN110433282A (zh) * 2018-05-04 2019-11-12 上海交通大学医学院附属瑞金医院 胰高血糖素样肽-1在制备治疗钙化性主动脉瓣疾病药物方面的应用
CN108795843A (zh) * 2018-06-01 2018-11-13 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法
CN111529691A (zh) * 2020-06-03 2020-08-14 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 甲状旁腺激素(1-34)在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用
CN111514279A (zh) * 2020-06-16 2020-08-11 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 神经营养因子3在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALAN K. L. KAI等: "Exchange protein activated by cAMP1(Epac1)-deficient mice develop β-cell dysfunction and metabolic syndrome", 《THE FASEB JOURNAL》 *
MARCO G. ALVES等: "Male Fertility and Obesity: Are Ghrelin, Leptin and Glucagon-like Peptide-1 Pharmacologically Relevant?", 《CURRENT PHARMACEUTICAL DESIGN》 *
ROSARIO CALTABIANO等: "Glucagon-like peptide-1 receptor is expressed in human and rodent testis", 《ANDROLOGY》 *
SARAH A. BEAK等: "Glucagon-like Peptide-1 Stimulates Luteinizing Hormone–releasing Hormone Secretion in a Rodent Hypothalamic Neuronal Cell Line", 《J CLIN INVEST》 *
Z. ORFI等: "Novel members of quinoline compound family enhance insulin secretion in RIN-5AH beta cells and in rat pancreatic islet microtissue", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
吴斯文等: "小鼠体外诱导Leydig细胞培养模型的建立", 《中国药理学会第十届全国基础与临床生殖药理学术研讨会暨2017育英生殖药理论坛论文汇编》 *

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