CN108588004A - 诱导分化睾丸间质细胞的方法及其在性功能恢复中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导分化睾丸间质细胞的方法及其在性功能恢复中的应用，属于生物医药技术领域，利用充间质干细胞诱导分化睾丸间质细胞，并利用睾丸间质细胞与一定比例的其他成分组成性功能恢复药物，将该性功能恢复药物制成注射液，以注射的方式注射到病灶区域，通过睾丸间质细胞分泌睾酮素来恢复体内的睾酮水平，有效恢复男性性功能。总之，本发明安全有效，实用性强，高效的诱导分化出睾丸间质细胞，并且本发明药物可以有效地恢复男性性功能等优点。

Description

诱导分化睾丸间质细胞的方法及其在性功能恢复中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体是涉及一种诱导分化睾丸间质细胞的方法及其在性功能恢复中的应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞能够发育成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。间充质干细胞可以接受移植，而它们会成长为何种类型的细胞取决于其被注入的部位。例如，被注入心脏的间充质干细胞能够形成健康的新组织等。1976年，Freidenstein首次发现在骨髓里存在一群不纯一的细胞群体，这种细胞在体外培养时贴壁生长，形态和成纤维细胞相似，呈克隆性增殖，并提出“骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)的概念。后经过深入和广泛的研究，发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。人类对间充质干细胞的生物学特性、来源、诱导分化、前期临床应用等取得了长足的进展。例如，骨髓间充质干细胞通过诱导能产生具有合成性腺激素和肾上腺类型类固醇激素能力的细胞，但骨髓间充质干细胞体外增殖能力、多向分化能力以及细胞稳定性都会随着骨髓供体的年龄增长或疾病的影响逐渐不同程度的减弱甚至丧失；并且，骨髓间充质干细胞的分化效率较低，分泌的性腺激素量较低，需要寻找其他来源的干细胞和有效的诱导分化方法，可以更高效地将干细胞诱导分化为睾丸间质细胞。
随着人均寿命的延长，人口老龄化问题越来越严重，中老年男性雄激素部分缺乏症患者越来越多。目前临床上主要采用了外源性雄激素替代疗法，目的是维持血清中睾酮的生理浓度，以替代内源性睾酮的生理功能。然而长期服用雄激素副作用较大，其一，体内雄激素的靶细胞较多，长期服用外源雄激素治疗容易会有毒副作用的发生，尤其是前列腺；其二，不同个体间血清睾酮水平差异较大，病人需频繁抽血检查相关指标以调整用量；其三，睾酮替代治疗会破坏人体雄激素分泌晨高夜低的自然节律，还会抑制自身睾丸的雄激素分泌和生精功能。因此，现需要一种方法来优化诱导分化睾丸间质细胞和解决男性性功能恢复的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种诱导分化睾丸间质细胞的方法及其在性功能恢复中的应用，利用充间质干细胞诱导分化睾丸间质细胞，并采用睾丸间质细胞为主制备恢复男性性功能的药物，治疗效果良好。
本发明的技术方案是:一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，包括以下步骤:
(1)间充质干细胞的培养:将间充质干细胞单体按4-6×105/ml接种于干细胞培养液中，并置于38℃的培养箱内，以1℃/天的速度降至36℃，后一直恒温保持在36℃，之后每2-3天换液传代一次，收获4-6代间充质干细胞，然后用体积比为2:1.5的0.3％胶原酶和0.25％胰蛋白酶先后加入进行消化25-40min，再通过振荡器震荡10-12min，得到培养扩增的间充质干细胞；其中干细胞培养液为DMEM和F12按体积比1.5:1混合后并加入3％FBS作为基础培养液，还含有55ng/ml EGF、15ng/ml bFGF、3％非必需氨基酸、0.3mM GABA、1.5％复合维生素，余量为超纯水，所述FBS所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，避免有害成分过多影响细胞的扩增；所述EGF能够促进细胞的增殖分化；所述bFGF具有很强的促细胞分裂增殖活性，能促进细胞扩增；所述GABA能促进细胞生长。
(2)诱导分化睾丸间质细胞:将步骤(1)得到的间充质干细胞按照4-6×104/ml的细胞密度贴壁在二氧化钛纳米管容器上诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行培养，3-4天后半量换液，5-6天时终止诱导；其中诱导培养液为DMEM作为基础培养基，还含有8％FBS、80U/ml青霉素、60μg/ml青链霉素、35μg/ml微量元素化合物、25μg/ml谷氨酰胺、150uM二丁酰环磷腺苷、17μg/ml丙氨酰谷氨酰胺、15ng/ml EGF和4ng/ml LH，余量为超纯水；所述FBS所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，避免影响细胞的诱导分化；所述谷氨酰胺能促进细胞的诱导分化，且能刺激睾酮的分泌；所述二丁酰环磷腺苷对细胞渗透性较强，可以促进睾丸间质细胞的诱导分化；所述丙氨酰谷氨酰胺可以为诱导分化过程中提供额外的营养支持；所述EGF能够促进细胞的增殖分化；所述LH能够促进诱导分化的过程，且能刺激睾酮的分泌。
进一步地，所述复合维生素为维生素A、维生素B2、维生素C、维生素E、维生素H以质量比为1:1.5:0.8:2:1组成的，该复合维生素可以促进充间质干细胞的扩增。
进一步地，所述微量元素化合物为硫酸锌、氯化铁、氯化钾、碘酸钾以质量比为2:1.5:1:0.9组成的，该配比下的微量元素化合物能充分促进诱导分化睾丸间质细胞的过程。
进一步地，所述间充质干细胞的制备方法包括以下步骤:
(1)抽取用药患者脂肪组织15ml，利用清洗液冲洗后，将脂肪组织破碎至直径2-3mm的脂肪粒块，再利用清洗液清洗2-3次，进行组织破碎便于后续的消化处理更加充分地进行，进行多次清洗可以避免组织杂物对充间质干细胞的制备产生影响；
(2)在所述脂肪粒块中加入体积比3:2的0.25％胰蛋白酶与0.2％胶原酶的混合酶液，并不断以50-60rpm的速度进行搅拌，在恒温37℃下消化50-70min，在该配比下的胰蛋白酶和胶原酶并配合该范围区间的搅拌速度，可以使脂肪粒块消化处理更充分，为后续提取更高质量的间充质干细胞做好前提基础；
(3)消化处理后，再经过230目筛后利用离心机以800-1300rpm离心3-5min，吸出下层细胞液移至间充质干细胞培养液中培养后得到间充质干细胞，先过230筛过滤未消化完全的脂肪粒块后通过该范围区间的离心处理，可以得到更高质量的间充质干细胞；
(4)将制备的间充质干细胞冻存于-196℃的深低温中，以便后续使用。
更进一步地，所述步骤(3)中放置于间充质细胞培养液中培养，是指待组织块周围有梭型细胞爬出后，培养至80-90％细胞融合。
一种睾丸间质细胞在性功能恢复中的应用，其特征在于，将所述睾丸间质细胞制备成性功能恢复药物。
进一步地，所述性功能恢复药物按照重量百分比计包括:10-13％睾丸间质细胞、7-9％人血白蛋白原液、1.6-2.3％葡萄糖酸锌、2.1-3.6％类黄酮素、0.4-0.6％亭扎肝素钠、3-7％熟地黄浓缩液、4-5％维生素E、0.2-0.3％硫辛酸、3.7-5.8％LH、1.3-1.7％谷氨酰胺、0.3-0.7％乳化剂、1-2％稳定剂、0.6-0.7％pH调节剂，余量为生理盐水，所述人血白蛋白原液为睾丸间质细胞提供适宜的存活环境，并增强睾丸间质细胞的活性；所述葡萄糖酸锌可以补充男性所缺乏的锌元素；所述类黄酮素可起到抗炎抑菌的作用，且能够消除细胞产生的自由基；所述亭扎肝素钠可以防止药物注射时产生血肿硬结，具有抗凝血的作用；所述熟地黄浓缩液可以起到一定的辅助调理作用，达到益气补肾的作用；所述维生素E具有良好的抗氧化作用；所述硫辛酸能消除加速老化与致病的自由基，且能辅助配合维生素E起到抗氧化的作用；所述LH可以促进睾丸间质细胞分泌睾酮，进而增强男性性功能；所述谷氨酰胺可以刺激生长激素、睾酮等的分泌，进而增强男性性功能。
更进一步地，所述性功能恢复药物的制备方法包括以下步骤:
(1)将睾丸间质细胞用所述人血白蛋白原液进行稀释，在37℃恒温下，以100rpm的转速缓缓搅拌10-15min，得到稀释细胞溶液；
(2)将所述熟地黄浓缩液、葡萄糖酸锌、亭扎肝素钠依次用40％、30％、30％的所述生理盐水进行溶解，在通过超声波分散3-5min后，分别得到熟地黄溶液、葡萄糖酸锌溶液、亭扎肝素钠溶液，将所述三种溶液混合，加热至55℃搅拌3-5分钟，静置冷却至室温，形成混合溶液；
(3)将所述混合溶液与所述稀释细胞溶液进行混合，以150rpm的速度进行搅拌5-7min，得到混合细胞溶液，混合期间溶液温度恒温37℃；
(4)再将类黄酮素、维生素E、硫辛酸混合后加入所述混合细胞溶液中，在37℃恒温下通过超声波分散辅助混合，经过20-25min后，再加入LH和谷氨酰胺，以100rpm的速度进行搅拌2-3分钟，得到药物混合溶液；
(5)在所述药物混合溶液中加入乳化剂、稳定剂，以120rpm速度搅拌5-10min，期间通过加入所述pH调节剂至药物混合溶液pH＝7.1-7.3，即得到睾丸间质细胞制成性功能恢复药物的注射液。
本发明的有益效果是:本发明的干细胞培养液可以有效地促进充间质干细胞的扩增和培养，为后续诱导分化出高质量的睾丸间质细胞做前提基础；诱导培养液可以有效提高充间质干细胞诱导分化为睾丸间质细胞的质量，而且利用二氧化钛纳米管对细胞进行贴壁，提高了诱导分化的稳定性、质量等；本发明的间充质干细胞的制备方法相对于传统方法制备出的间充质干细胞更密集、质量更高，更易制备使用；本发明通过睾丸间质细胞与一定比例的其他成分组成性功能恢复药物，通过注射液的形式对患者进行治疗，促进产生睾酮实现恢复性功能，有效恢复男性患者的性功能，并具有一定的益气补肾功效，总之，本发明安全有效，实用性强，高效的诱导分化出睾丸间质细胞，并且本发明药物可以有效地恢复男性性功能。
具体实施方式
实施例1
一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，包括以下步骤:
(1)间充质干细胞的培养:将间充质干细胞单体按4×105/ml接种于干细胞培养液中，并置于38℃的培养箱内，以1℃/天的速度降至36℃，后一直恒温保持在36℃，之后每2天换液传代一次，收获4代间充质干细胞，然后用体积比为2:1.5的0.3％胶原酶和0.25％胰蛋白酶先后加入进行消化25min，再通过振荡器震荡10min，得到培养扩增的间充质干细胞；其中干细胞培养液为DMEM和F12按体积比1.5:1混合后并加入3％FBS作为基础培养液，还含有55ng/ml EGF、15ng/ml bFGF、3％非必需氨基酸、0.3mM GABA、1.5％复合维生素，余量为超纯水，FBS所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，避免有害成分过多影响细胞的扩增；EGF能够促进细胞的增殖分化；bFGF具有很强的促细胞分裂增殖活性，能促进细胞扩增；GABA能促进细胞生长。复合维生素为维生素A、维生素B2、维生素C、维生素E、维生素H以质量比为1:1.5:0.8:2:1组成的，该复合维生素可以促进充间质干细胞的扩增。
(2)诱导分化睾丸间质细胞:将步骤(1)得到的间充质干细胞按照4×104/ml的细胞密度贴壁在二氧化钛纳米管容器上诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行培养，3天后半量换液，5天时终止诱导；其中诱导培养液为DMEM作为基础培养基，还含有8％FBS、80U/ml青霉素、60μg/ml青链霉素、35μg/ml微量元素化合物、25μg/ml谷氨酰胺、150uM二丁酰环磷腺苷、17μg/ml丙氨酰谷氨酰胺、15ng/ml EGF和4ng/ml LH，余量为超纯水；FBS所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，避免影响细胞的诱导分化；谷氨酰胺能促进细胞的诱导分化，且能刺激睾酮的分泌；二丁酰环磷腺苷对细胞渗透性较强，可以促进睾丸间质细胞的诱导分化；丙氨酰谷氨酰胺可以为诱导分化过程中提供额外的营养支持；EGF能够促进细胞的增殖分化；LH能够促进诱导分化的过程，且能刺激睾酮的分泌。微量元素化合物为硫酸锌、氯化铁、氯化钾、碘酸钾以质量比为2:1.5:1:0.9组成的，该配比下的微量元素化合物能充分促进诱导分化睾丸间质细胞的过程。
间充质干细胞的制备方法包括以下步骤:
(1)抽取用药患者脂肪组织15ml，利用清洗液冲洗后，将脂肪组织破碎至直径2mm的脂肪粒块，再利用清洗液清洗2次，进行组织破碎便于后续的消化处理更加充分地进行，进行多次清洗可以避免组织杂物对充间质干细胞的制备产生影响；
(2)在脂肪粒块中加入体积比3:2的0.25％胰蛋白酶与0.2％胶原酶的混合酶液，并不断以50rpm的速度进行搅拌，在恒温37℃下消化50min，在该配比下的胰蛋白酶和胶原酶并配合该范围区间的搅拌速度，可以使脂肪粒块消化处理更充分，为后续提取更高质量的间充质干细胞做好前提基础；
(3)消化处理后，再经过230目筛后利用离心机以800rpm离心3min，吸出下层细胞液移至间充质干细胞培养液中培养，待组织块周围有梭型细胞爬出后，培养至80％细胞融合后得到间充质干细胞，先过230筛过滤未消化完全的脂肪粒块后通过该范围区间的离心处理，可以得到更高质量的间充质干细胞；
(4)将制备的间充质干细胞冻存于-196℃的深低温中，以便后续使用。
一种睾丸间质细胞在性功能恢复中的应用，其特征在于，将睾丸间质细胞制备成性功能恢复药物。性功能恢复药物按照重量百分比计包括:10％睾丸间质细胞、7％人血白蛋白原液、1.6％葡萄糖酸锌、2.1％类黄酮素、0.4％亭扎肝素钠、3％熟地黄浓缩液、4％维生素E、0.2％硫辛酸、3.7％LH、1.3％谷氨酰胺、0.3％乳化剂、1％稳定剂、0.6％pH调节剂，余量为生理盐水，人血白蛋白原液为睾丸间质细胞提供适宜的存活环境，并增强睾丸间质细胞的活性；葡萄糖酸锌可以补充男性所缺乏的锌元素；类黄酮素可起到抗炎抑菌的作用，且能够消除细胞产生的自由基；亭扎肝素钠可以防止药物注射时产生血肿硬结，具有抗凝血的作用；熟地黄浓缩液可以起到一定的辅助调理作用，达到益气补肾的作用；维生素E具有良好的抗氧化作用；硫辛酸能消除加速老化与致病的自由基，且能辅助配合维生素E起到抗氧化的作用；LH可以促进睾丸间质细胞分泌睾酮，进而增强男性性功能；谷氨酰胺可以刺激生长激素、睾酮等的分泌，进而增强男性性功能。
性功能恢复药物的制备方法包括以下步骤:
(1)将睾丸间质细胞用人血白蛋白原液进行稀释，在37℃恒温下，以100rpm的转速缓缓搅拌10min，得到稀释细胞溶液；
(2)将熟地黄浓缩液、葡萄糖酸锌、亭扎肝素钠依次用40％、30％、30％的生理盐水进行溶解，在通过超声波分散3-5min后，分别得到熟地黄溶液、葡萄糖酸锌溶液、亭扎肝素钠溶液，将三种溶液混合，加热至55℃搅拌3分钟，静置冷却至室温，形成混合溶液；
(3)将混合溶液与稀释细胞溶液进行混合，以150rpm的速度进行搅拌5min，得到混合细胞溶液，混合期间溶液温度恒温37℃；
(4)再将类黄酮素、维生素E、硫辛酸混合后加入混合细胞溶液中，在37℃恒温下通过超声波分散辅助混合，经过20min后，再加入LH和谷氨酰胺，以100rpm的速度进行搅拌2分钟，得到药物混合溶液；
(5)在药物混合溶液中加入乳化剂、稳定剂，以120rpm速度搅拌5min，期间通过加入pH调节剂至药物混合溶液pH＝7.1，即得到睾丸间质细胞制成性功能恢复药物的注射液。
实施例2
一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，包括以下步骤:
(1)间充质干细胞的培养:将间充质干细胞单体按5×105/ml接种于干细胞培养液中，并置于38℃的培养箱内，以1℃/天的速度降至36℃，后一直恒温保持在36℃，之后每3天换液传代一次，收获5代间充质干细胞，然后用体积比为2:1.5的0.3％胶原酶和0.25％胰蛋白酶先后加入进行消化32min，再通过振荡器震荡11min，得到培养扩增的间充质干细胞；其中干细胞培养液为DMEM和F12按体积比1.5:1混合后并加入3％FBS作为基础培养液，还含有55ng/ml EGF、15ng/ml bFGF、3％非必需氨基酸、0.3mM GABA、1.5％复合维生素，余量为超纯水，FBS所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，避免有害成分过多影响细胞的扩增；EGF能够促进细胞的增殖分化；bFGF具有很强的促细胞分裂增殖活性，能促进细胞扩增；GABA能促进细胞生长。复合维生素为维生素A、维生素B2、维生素C、维生素E、维生素H以质量比为1:1.5:0.8:2:1组成的，该复合维生素可以促进充间质干细胞的扩增。
(2)诱导分化睾丸间质细胞:将步骤(1)得到的间充质干细胞按照5×104/ml的细胞密度贴壁在二氧化钛纳米管容器上诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行培养，4天后半量换液，5天时终止诱导；其中诱导培养液为DMEM作为基础培养基，还含有8％FBS、80U/ml青霉素、60μg/ml青链霉素、35μg/ml微量元素化合物、25μg/ml谷氨酰胺、150uM二丁酰环磷腺苷、17μg/ml丙氨酰谷氨酰胺、15ng/ml EGF和4ng/ml LH，余量为超纯水；FBS所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，避免影响细胞的诱导分化；谷氨酰胺能促进细胞的诱导分化，且能刺激睾酮的分泌；二丁酰环磷腺苷对细胞渗透性较强，可以促进睾丸间质细胞的诱导分化；丙氨酰谷氨酰胺可以为诱导分化过程中提供额外的营养支持；EGF能够促进细胞的增殖分化；LH能够促进诱导分化的过程，且能刺激睾酮的分泌。微量元素化合物为硫酸锌、氯化铁、氯化钾、碘酸钾以质量比为2:1.5:1:0.9组成的，该配比下的微量元素化合物能充分促进诱导分化睾丸间质细胞的过程。
间充质干细胞的制备方法包括以下步骤:
(1)抽取用药患者脂肪组织15ml，利用清洗液冲洗后，将脂肪组织破碎至直径3mm的脂肪粒块，再利用清洗液清洗3次，进行组织破碎便于后续的消化处理更加充分地进行，进行多次清洗可以避免组织杂物对充间质干细胞的制备产生影响；
(2)在脂肪粒块中加入体积比3:2的0.25％胰蛋白酶与0.2％胶原酶的混合酶液，并不断以55rpm的速度进行搅拌，在恒温37℃下消化62min，在该配比下的胰蛋白酶和胶原酶并配合该范围区间的搅拌速度，可以使脂肪粒块消化处理更充分，为后续提取更高质量的间充质干细胞做好前提基础；
(3)消化处理后，再经过230目筛后利用离心机以1150rpm离心4min，吸出下层细胞液移至间充质干细胞培养液中培养，待组织块周围有梭型细胞爬出后，培养至90％细胞融合后得到间充质干细胞，先过230筛过滤未消化完全的脂肪粒块后通过该范围区间的离心处理，可以得到更高质量的间充质干细胞；
(4)将制备的间充质干细胞冻存于-196℃的深低温中，以便后续使用。
一种睾丸间质细胞在性功能恢复中的应用，其特征在于，将睾丸间质细胞制备成性功能恢复药物。性功能恢复药物按照重量百分比计包括:12％睾丸间质细胞、8％人血白蛋白原液、1.9％葡萄糖酸锌、3.1％类黄酮素、0.5％亭扎肝素钠、5％熟地黄浓缩液、5％维生素E、0.3％硫辛酸、5.1％LH、1.5％谷氨酰胺、0.6％乳化剂、1.5％稳定剂、0.7％pH调节剂，余量为生理盐水，人血白蛋白原液为睾丸间质细胞提供适宜的存活环境，并增强睾丸间质细胞的活性；葡萄糖酸锌可以补充男性所缺乏的锌元素；类黄酮素可起到抗炎抑菌的作用，且能够消除细胞产生的自由基；亭扎肝素钠可以防止药物注射时产生血肿硬结，具有抗凝血的作用；熟地黄浓缩液可以起到一定的辅助调理作用，达到益气补肾的作用；维生素E具有良好的抗氧化作用；硫辛酸能消除加速老化与致病的自由基，且能辅助配合维生素E起到抗氧化的作用；LH可以促进睾丸间质细胞分泌睾酮，进而增强男性性功能；谷氨酰胺可以刺激生长激素、睾酮等的分泌，进而增强男性性功能。
性功能恢复药物的制备方法包括以下步骤:
(1)将睾丸间质细胞用人血白蛋白原液进行稀释，在37℃恒温下，以100rpm的转速缓缓搅拌13min，得到稀释细胞溶液；
(2)将熟地黄浓缩液、葡萄糖酸锌、亭扎肝素钠依次用40％、30％、30％的生理盐水进行溶解，在通过超声波分散4min后，分别得到熟地黄溶液、葡萄糖酸锌溶液、亭扎肝素钠溶液，将三种溶液混合，加热至55℃搅拌4分钟，静置冷却至室温，形成混合溶液；
(3)将混合溶液与稀释细胞溶液进行混合，以150rpm的速度进行搅拌6min，得到混合细胞溶液，混合期间溶液温度恒温37℃；
(4)再将类黄酮素、维生素E、硫辛酸混合后加入混合细胞溶液中，在37℃恒温下通过超声波分散辅助混合，经过22min后，再加入LH和谷氨酰胺，以100rpm的速度进行搅拌3分钟，得到药物混合溶液；
(5)在药物混合溶液中加入乳化剂、稳定剂，以120rpm速度搅拌7min，期间通过加入pH调节剂至药物混合溶液pH＝7.2，即得到睾丸间质细胞制成性功能恢复药物的注射液。
实施例3
一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，包括以下步骤:
(1)间充质干细胞的培养:将间充质干细胞单体按6×105/ml接种于干细胞培养液中，并置于38℃的培养箱内，以1℃/天的速度降至36℃，后一直恒温保持在36℃，之后每3天换液传代一次，收获6代间充质干细胞，然后用体积比为2:1.5的0.3％胶原酶和0.25％胰蛋白酶先后加入进行消化40min，再通过振荡器震荡12min，得到培养扩增的间充质干细胞；其中干细胞培养液为DMEM和F12按体积比1.5:1混合后并加入3％FBS作为基础培养液，还含有55ng/ml EGF、15ng/ml bFGF、3％非必需氨基酸、0.3mM GABA、1.5％复合维生素，余量为超纯水，FBS所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，避免有害成分过多影响细胞的扩增；EGF能够促进细胞的增殖分化；bFGF具有很强的促细胞分裂增殖活性，能促进细胞扩增；GABA能促进细胞生长。复合维生素为维生素A、维生素B2、维生素C、维生素E、维生素H以质量比为1:1.5:0.8:2:1组成的，该复合维生素可以促进充间质干细胞的扩增。
(2)诱导分化睾丸间质细胞:将步骤(1)得到的间充质干细胞按照6×104/ml的细胞密度贴壁在二氧化钛纳米管容器上诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行培养，4天后半量换液，6天时终止诱导；其中诱导培养液为D MEM作为基础培养基，还含有8％FBS、80U/ml青霉素、60μg/ml青链霉素、35μg/ml微量元素化合物、25μg/ml谷氨酰胺、150uM二丁酰环磷腺苷、17μg/ml丙氨酰谷氨酰胺、15ng/ml EGF和4ng/ml LH，余量为超纯水；FBS所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，避免影响细胞的诱导分化；谷氨酰胺能促进细胞的诱导分化，且能刺激睾酮的分泌；二丁酰环磷腺苷对细胞渗透性较强，可以促进睾丸间质细胞的诱导分化；丙氨酰谷氨酰胺可以为诱导分化过程中提供额外的营养支持；EGF能够促进细胞的增殖分化；LH能够促进诱导分化的过程，且能刺激睾酮的分泌。微量元素化合物为硫酸锌、氯化铁、氯化钾、碘酸钾以质量比为2:1.5:1:0.9组成的，该配比下的微量元素化合物能充分促进诱导分化睾丸间质细胞的过程。
间充质干细胞的制备方法包括以下步骤:
(1)抽取用药患者脂肪组织15ml，利用清洗液冲洗后，将脂肪组织破碎至直径3mm的脂肪粒块，再利用清洗液清洗3次，进行组织破碎便于后续的消化处理更加充分地进行，进行多次清洗可以避免组织杂物对充间质干细胞的制备产生影响；
(2)在脂肪粒块中加入体积比3:2的0.25％胰蛋白酶与0.2％胶原酶的混合酶液，并不断以60rpm的速度进行搅拌，在恒温37℃下消化70min，在该配比下的胰蛋白酶和胶原酶并配合该范围区间的搅拌速度，可以使脂肪粒块消化处理更充分，为后续提取更高质量的间充质干细胞做好前提基础；
(3)消化处理后，再经过230目筛后利用离心机以1300rpm离心5min，吸出下层细胞液移至间充质干细胞培养液中培养，待组织块周围有梭型细胞爬出后，培养至85％细胞融合后得到间充质干细胞，先过230筛过滤未消化完全的脂肪粒块后通过该范围区间的离心处理，可以得到更高质量的间充质干细胞；
(4)将制备的间充质干细胞冻存于-196℃的深低温中，以便后续使用。
一种睾丸间质细胞在性功能恢复中的应用，其特征在于，将睾丸间质细胞制备成性功能恢复药物。性功能恢复药物按照重量百分比计包括:13％睾丸间质细胞、9％人血白蛋白原液、2.3％葡萄糖酸锌、3.6％类黄酮素、0.6％亭扎肝素钠、7％熟地黄浓缩液、5％维生素E、0.3％硫辛酸、5.8％LH、1.7％谷氨酰胺、0.7％乳化剂、2％稳定剂、0.7％pH调节剂，余量为生理盐水，人血白蛋白原液为睾丸间质细胞提供适宜的存活环境，并增强睾丸间质细胞的活性；葡萄糖酸锌可以补充男性所缺乏的锌元素；类黄酮素可起到抗炎抑菌的作用，且能够消除细胞产生的自由基；亭扎肝素钠可以防止药物注射时产生血肿硬结，具有抗凝血的作用；熟地黄浓缩液可以起到一定的辅助调理作用，达到益气补肾的作用；维生素E具有良好的抗氧化作用；硫辛酸能消除加速老化与致病的自由基，且能辅助配合维生素E起到抗氧化的作用；LH可以促进睾丸间质细胞分泌睾酮，进而增强男性性功能；谷氨酰胺可以刺激生长激素、睾酮等的分泌，进而增强男性性功能。
性功能恢复药物的制备方法包括以下步骤:
(1)将睾丸间质细胞用人血白蛋白原液进行稀释，在37℃恒温下，以100rpm的转速缓缓搅拌15min，得到稀释细胞溶液；
(2)将熟地黄浓缩液、葡萄糖酸锌、亭扎肝素钠依次用40％、30％、30％的生理盐水进行溶解，在通过超声波分散5min后，分别得到熟地黄溶液、葡萄糖酸锌溶液、亭扎肝素钠溶液，将三种溶液混合，加热至55℃搅拌5分钟，静置冷却至室温，形成混合溶液；
(3)将混合溶液与稀释细胞溶液进行混合，以150rpm的速度进行搅拌7min，得到混合细胞溶液，混合期间溶液温度恒温37℃；
(4)再将类黄酮素、维生素E、硫辛酸混合后加入混合细胞溶液中，在37℃恒温下通过超声波分散辅助混合，经过25min后，再加入LH和谷氨酰胺，以100rpm的速度进行搅拌3分钟，得到药物混合溶液；
(5)在药物混合溶液中加入乳化剂、稳定剂，以120rpm速度搅拌10min，期间通过加入pH调节剂至药物混合溶液pH＝7.3，即得到睾丸间质细胞制成性功能恢复药物的注射液。
本发明性功能恢复药物在男性性功能恢复中的实验数据
选取患有男性性功能问题的患者共计200人，按照随机方法分为对照组、实验组1、实验组2和实验组3，每组50例患者，年龄均在30-50岁之间，其中实验组1、实验组2、实验组3为使用本发明药物进行治疗，对照组采用常规治疗方法治疗，疗效对比如下表所示。
组别 人数/人 显效/人 有效/人 无效/人 总有效率/％
对照组 50 9 21 20 60
实验组1 50 12 26 12 76
实验组2 50 15 26 9 82
试验组3 50 14 25 11 78
从表中数据可以看出，本发明性功能恢复药物对于男性性功能恢复的治疗效果明显优于对照组。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)间充质干细胞的培养:将间充质干细胞单体按4-6×105/ml接种于干细胞培养液中，并置于38℃的培养箱内，以1℃/天的速度降至36℃，后一直恒温保持在36℃，之后每2-3天换液传代一次，收获4-6代间充质干细胞，然后用体积比为2:1.5的0.3％胶原酶和0.25％胰蛋白酶先后加入进行消化25-40min，再通过振荡器震荡10-12min，得到培养扩增的间充质干细胞；其中干细胞培养液为DMEM和F12按体积比1.5:1混合后并加入3％FBS作为基础培养液，还含有55ng/ml EGF、15ng/ml bFGF、3％非必需氨基酸、0.3mM GABA、1.5％复合维生素，余量为超纯水；
(2)诱导分化睾丸间质细胞:将步骤(1)得到的间充质干细胞按照4-6×104/ml的细胞密度贴壁在二氧化钛纳米管容器上诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行培养，3-4天后半量换液，5-6天时终止诱导；其中诱导培养液为DMEM作为基础培养基，还含有8％FBS、80U/ml青霉素、60μg/ml青链霉素、35μg/ml微量元素化合物、25μg/ml谷氨酰胺、150uM二丁酰环磷腺苷、17μg/ml丙氨酰谷氨酰胺、15ng/ml EGF和4ng/ml LH，余量为超纯水。
2.根据权利要求1所述的一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，其特征在于，所述复合维生素为维生素A、维生素B2、维生素C、维生素E、维生素H以质量比为1:1.5:0.8:2:1组成的。
3.根据权利要求1所述的一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，其特征在于，所述微量元素化合物为硫酸锌、氯化铁、氯化钾、碘酸钾以质量比为2:1.5:1:0.9组成的。
4.根据权利要求1所述的一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的制备方法中采用的酶液为体积比3:2的0.25％胰蛋白酶与0.2％胶原酶混合的混合酶液。
5.根据权利要求1所述的一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的制备方法包括以下步骤:
(1)抽取用药患者脂肪组织15ml，利用清洗液冲洗后，将脂肪组织破碎至直径2-3mm的脂肪粒块，再利用清洗液清洗2-3次；
(2)在所述脂肪粒块中加入体积比3:2的0.25％胰蛋白酶与0.2％胶原酶的混合酶液，并不断以50-60rpm的速度进行搅拌，在恒温37℃下消化50-70min；
(3)消化处理后，再经过230目筛后利用离心机以800-1300rpm离心3-5min，吸出下层细胞液移至间充质干细胞培养液中培养后得到间充质干细胞；
(4)将制备的间充质干细胞冻存于-196℃的深低温中，以便后续使用。
6.根据权利要求4所述的一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3)中放置于间充质细胞培养液中培养，是指待组织块周围有梭型细胞爬出后，培养至80-90％细胞融合。
7.一种睾丸间质细胞在性功能恢复中的应用，其特征在于，将所述睾丸间质细胞制备成性功能恢复药物。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述性功能恢复药物按照重量百分比计包括:10-13％睾丸间质细胞、7-9％人血白蛋白原液、1.6-2.3％葡萄糖酸锌、2.1-3.6％类黄酮素、0.4-0.6％亭扎肝素钠、3-7％熟地黄浓缩液、4-5％维生素E、0.2-0.3％硫辛酸、3.7-5.8％LH、1.3-1.7％谷氨酰胺、0.3-0.7％乳化剂、1-2％稳定剂、0.6-0.7％pH调节剂，余量为生理盐水。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述性功能恢复药物的制备方法包括以下步骤:
(1)将睾丸间质细胞用所述人血白蛋白原液进行稀释，在37℃恒温下，以100rpm的转速缓缓搅拌10-15min，得到稀释细胞溶液；
(2)将所述熟地黄浓缩液、葡萄糖酸锌、亭扎肝素钠依次用40％、30％、30％的所述生理盐水进行溶解，在通过超声波分散3-5min后，分别得到熟地黄溶液、葡萄糖酸锌溶液、亭扎肝素钠溶液，将所述三种溶液混合，加热至55℃搅拌3-5分钟，静置冷却至室温，形成混合溶液；
(3)将所述混合溶液与所述稀释细胞溶液进行混合，以150rpm的速度进行搅拌5-7min，得到混合细胞溶液，混合期间溶液温度恒温37℃；
(4)再将类黄酮素、维生素E、硫辛酸混合后加入所述混合细胞溶液中，在37℃恒温下通过超声波分散辅助混合，经过20-25min后，再加入LH和谷氨酰胺以100rpm的速度进行搅拌2-3分钟，得到药物混合溶液；
(5)在所述药物混合溶液中加入乳化剂、稳定剂，以120rpm速度搅拌5-10min，期间通过加入所述pH调节剂至药物混合溶液pH＝7.1-7.3，即得到睾丸间质细胞制成性功能恢复药物的注射液。
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