CN115429937B

CN115429937B - 一种软组织填充修复材料及其制备方法

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Publication number: CN115429937B
Application number: CN202211388934.8A
Authority: CN
Inventors: 刘俊华; 修冰水; 徐绍梅; 王庚
Original assignee: Shengzhirunhe Beijing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shengzhirunhe Beijing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-11-08
Filing date: 2022-11-08
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2042-11-08
Also published as: CN115429937A

Abstract

一种软组织填充修复材料及其制备方法，该材料可诱导自身细胞外基质形成。该修复材料由网膜脱细胞基质凝胶与网膜脱细胞基质颗粒组成；该材料能够诱导自身细胞外基质的形成发挥组织填充修复作用。通过调节网膜脱细胞基质颗粒的添加量可精确控制软组织填充修复材料的体内降解时间。本发明操作工艺简单、实施条件温和、安全可控，制备的软组织填充修复材料用于可注射植入剂，在美容整形领域中具有广阔的应用前景。

Description

一种软组织填充修复材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术与医学美容领域，具体涉及一种软组织填充修复材料及其制备方法。

背景技术

随着生活水平的提高，人们越来越注重对于美的追求。注射美容术因为手术危险性低、并发症少，恢复时间短而备受推崇。注射美容术是将可注射材料直接注射于人体特定部位，使人体的容貌或体形有所改观，起到增进容貌美或同时改善功能的方法。注射美容材料多种多样，有神经肌肉毒素，既肉毒素；有软组织填充材料，如胶原蛋白、玻尿酸、自体细胞等；还有磷脂酰胆碱、生长激素、富血小板血浆等作用机制各异的材料。

其中，可注射的软组织填充剂因其简易性、成本相对低和最小的不适感，是一种理想的软组织填充材料。目前的软组织填充材料主要有生物性材料和人工合成材料。生物性可注射填充材料主要包括自体、同种异体及异种材料，如自体脂肪、动物源胶原蛋白、以及透明质酸钠凝胶等。上述生物性可注射填充材料均不可避免的面临持久性不佳与产生免疫反应等缺点。人工合成的可注射填充材料如聚甲基丙烯酸甲酯、聚己内酯PCL、生物塑化剂等具有较为长效的软组织填充效果，但也因其降解吸收缓慢，使其在注射后可见或可触及，易产生炎症反应，形成包膜、硬结，且注射失误时难以补救等问题。因此，亟需开发理想的可注射软组织充填材料，使其具备生物相容性好、无毒、无致癌性、无免疫原性、效果持久且效果完美无痕等特点。

近年来，器官与组织脱细胞策略的出现为医学美容领域开发具备上述特点的再生型组织填充材料提供了新的途径。脱细胞基质支架材料由于保留了细胞外基质的天然成分和三维结构，如I型胶原、III型胶原、IV型胶原以及纤连蛋白、粘连蛋白、糖氨聚糖（GAGs）等，有利于细胞粘附、增殖、分化及其他生物学功能的发挥；不仅如此，由于细胞外基质成分在不同物种间的相对保守性，脱细胞基质支架材料几乎没有或仅有很小的免疫排斥性，因此，脱细胞基质在组织修复与再生中具有其他生物材料无法比拟的优势。目前，研究人员人们通过脱细胞技术已经成功获得了各种不同组织与器官来源的脱细胞基质材料，如皮肤、心包、小肠粘膜、膀胱等。

大网膜是腹膜的一种，是存在于高等动物腹腔中的一层黏膜，是由结缔组织形成的膜状组织。大网膜是连接胃大弯至横结肠的腹膜。大网膜富有极强的弹性以及高度血管化的结构，这些优点使其在组织工程与再生医学领域中具有广泛的应用前景。然而，目前还未见利用网膜脱细胞基质凝胶联合网膜脱细胞基质颗粒制备可诱导自身细胞外基质形成的软组织填充修复材料的相关报道及产品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种软组织填充修复材料，该材料可诱导自身细胞外基质形成。该材料皮下注射后，能够提高胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质蛋白的表达，进而通过诱导自身细胞外基质的形成发挥组织填充修复作用；此外，通过调节网膜脱细胞基质颗粒的添加量可精确控制软组织填充修复材料的体内降解时间。

根据本发明的一个方面，提供一种软组织填充修复材料，该材料可诱导自身细胞外基质形成。所述材料由网膜脱细胞基质凝胶与网膜脱细胞基质颗粒混合制备而成。

其中，在一实施方案中，所述网膜脱细胞基质凝胶的含量为2.0-5.0mg/mL，和/或所述网膜脱细胞基质颗粒的含量小于5.0mg/mL。优选的，所述网膜脱细胞基质凝胶与网膜脱细胞基质颗粒的质量比为2:1-2:5。更优选的，所述网膜脱细胞基质颗粒的直径小于50μm。

根据本发明的另一方面，提供一种上述的软组织填充修复材料的制备方法，包括以下步骤：

（1）采用大网膜组织制备网膜脱细胞基质；

（2）采用所述网膜脱细胞基质制备网膜脱细胞基质凝胶；

（3）制备网膜脱细胞基质颗粒：将所述网膜脱细胞基质冻干后研磨成粉，筛网过滤收集网膜脱细胞基质颗粒；

（4）将所述网膜脱细胞基质凝胶与网膜脱细胞基质颗粒充分混合摇匀，获得软组织填充修复材料。

其中，在一实施方案中，所述步骤（2）为利用网膜脱细胞基质消化液消化网膜脱细胞基质，并通过孵育成胶得到网膜脱细胞基质凝胶。优选的，所述网膜脱细胞基质消化液为胃蛋白酶溶液。

在一实施方案中，所述步骤（3）中将网膜脱细胞基质进行冷冻干燥与超细粉碎，制备成直径小于50μm的微粒。

在一实施方案中，所述网膜脱细胞基质凝胶的含量为2.0-5.0mg/mL，和/或所述网膜脱细胞基质颗粒的含量小于5.0mg/mL。优选的，所述网膜脱细胞基质凝胶与网膜脱细胞基质颗粒的质量比为2:1-2:5。

在一实施方案中，所述的大网膜组织来源于哺乳动物。优选的，所述哺乳动物选自猪、牛或羊。

根据本发明的另一方面，提供所述软组织填充修复材料或采用上述方法获得的软组织填充修复材料的用途，其用于医学美容领域的软组织植入剂。优选的，所述植入剂为注射剂。

本发明的方法建立的软组织填充修复材料与现有可注射性填充材料相比，由于网膜脱细胞基质的组织特异性有助于其植入后提高自身胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质蛋白的表达，进而通过诱导自身细胞外基质的形成发挥组织填充修复作用；另一方面，通过调节网膜脱细胞基质颗粒的添加量可精确控制软组织填充修复材料的体内降解时间。本发明操作工艺简单、实施条件温和，制备的软组织填充修复材料用于可注射植入剂在美容整形领域中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1 软组织填充修复材料的大体观察。

图2 软组织填充修复材料提高皮下组织细胞外基质中胶原蛋白表达的RT-PCR检测。

图3 软组织填充修复材料提高皮下组织细胞外基质中弹性蛋白表达的RT-PCR检测。

图4 通过延长软组织填充修复材料的降解时间可延长皮下组织细胞外基质中胶原蛋白高表达的RT-PCR检测。

图5 通过延长软组织填充修复材料的降解时间可延长皮下组织细胞外基质中弹性蛋白高表达的RT-PCR检测。

具体实施方式

在本申请中，缩写词的含义如下：

SDS：十二烷基硫酸钠；

PBS：磷酸盐缓冲液；

DNA酶：脱氧核糖核酸酶；

min：分钟。

根据本发明的一个方面，提供了软组织填充修复材料的制备方法，其由网膜脱细胞基质凝胶与网膜脱细胞基质颗粒混合制备而成。其中，网膜脱细胞基质凝胶的含量为2.0-5.0mg/mL；网膜脱细胞基质颗粒的含量小于5.0mg/mL，网膜脱细胞基质颗粒的直径小于50μm。其中，网膜脱细胞基质凝胶与网膜脱细胞基质颗粒的质量比为2:1-2:5，2:2-2:5、2:3-2:5、2:4-2:5或2:5。

在某些实施方案中，网膜脱细胞基质的制备包括使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶的缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤。

在某些实施方案中，还包括脱脂处理的步骤。在示例性实施方案中，脱脂处理的步骤在脱细胞处理的步骤之前进行。在某些优选的实施方案中，该脱脂处理的步骤使用体积比为1:1:0.2-1的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液进行。在某些更优选的实施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的体积比为1:1:0.4-0.7。在最优选的实施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的体积比为1:1:0.5。

在某些实施方案中，脱细胞处理的步骤是分梯度进行的，所述梯度包括至少第一梯度和第二梯度。

在某些优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5-3.5%(w/v)，DNA酶的浓度为3500-4500U/L，pH为7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5-2.5%(w/v)，DNA酶的浓度为3600-4400U/L。在某些更优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.8-2.2%(w/v)，DNA酶的浓度为3800-4200U/L。在最优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为2.0%(w/v)，DNA酶的浓度为4000U/L。

在某些优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.6-1.5%(w/v)，DNA酶的浓度为2500-3500U/L，pH为7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.7-1.3%(w/v)，DNA酶的浓度为2600-3400U/L。在某些更优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.8-1.2%(w/v)，DNA酶的浓度为2800-3200U/L。在最优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.0%(w/v)，DNA酶的浓度为3000U/L。

在某些优选的实施方案中，所述梯度还包括第三梯度，其中在所述第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1-0.6%(w/v)，DNA酶的浓度为1500-2500U/L，pH为7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.2-0.6%(w/v)，DNA酶的浓度为1600-2400U/L。在某些更优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.4-0.6%(w/v)，DNA酶的浓度为1800-2200U/L。在最优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.5%(w/v)，DNA酶的浓度为2000U/L。

根据本发明的另一方面，提供了软组织填充修复材料的制备方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行：

（1）脱脂溶液的配制

将甲醇、氯仿与乙醚以体积比为1:1:0.2-1的比例混匀；

（2）脱细胞液的配制

1）脱细胞液I：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为1.5-3.5%(w/v)，DNA酶在磷酸盐缓冲液中的浓度为3500-4500U/L, pH为7.2-7.4，过滤除菌；

2）脱细胞液II：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.6-1.5%(w/v)，DNA酶在PBS中的浓度为2500-3500U/L, pH为7.2-7.4，过滤除菌；

3）脱细胞液III：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1-0.6%(w/v)，DNA酶在PBS中的浓度为1500-2500U/L, pH为7.2-7.4，过滤除菌；

（3）网膜脱细胞基质消化液的制备

将胃蛋白酶以1.0-2.0 mg/mL的比例溶于稀盐酸或醋酸等酸性溶液中，调解pH至2.0-3.0，获得网膜脱细胞基质消化液。

（4）大网膜脱细胞处理

1）取新鲜的大网膜组织，于磷酸盐缓冲液中清洗，将清洗后的组织震荡浸泡于所述脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18-30h，震荡频率为150-250r/min；

2）将去除脂肪的所述大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于所述脱细胞液I中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min；

3）将经脱细胞液I处理后的所述大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于脱细胞液II中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min；

4）将经脱细胞液II处理后的大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于所述脱细胞液III中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min；

5）PBS洗净，获得网膜脱细胞基质。

（5）网膜脱细胞基质凝胶的制备

将清洗并剪碎的网膜脱细胞基质加入到含有上述消化液的消化瓶中，每100毫升消化液加入10-20克网膜脱细胞基质，加盖后放在磁力搅拌器上进行搅动，转速为60-100rpm，于37℃，5% CO₂的孵箱中消化48-72小时（消化时间根据消化酶浓度不同适当调节），然后将pH调节到7.0终止消化。收集消化液，将网膜脱细胞基质浓度调整为2.0-5.0mg/mL，通过37℃孵育成胶得到网膜脱细胞基质凝胶。

（6）网膜脱细胞基质颗粒的制备

将网膜脱细胞基质进行冷冻干燥与超细粉碎，通过筛网过滤收集直径小于50μm的网膜脱细胞基质颗粒。

（7）软组织填充修复材料的制备

将上述网膜脱细胞基质凝胶与网膜脱细胞基质颗粒按不同比例混合均匀。

在某些实施方案中，新鲜的大网膜组织来源于猪、牛、羊等哺乳类动物。

在本发明中，大网膜组织是可商购的，可以购自例如屠宰场。

根据本发明的另一方面，提供了根据上述方法获得的软组织填充修复材料。

现将通过以下实施例对本发明做详细描述，然而以下实施例仅是作为例证，并不对本发明构成任何限制。

以下实施例中使用的大网膜脱细胞处理及其鉴定所需试剂的配制：

1) PBS：称取8g NaCl，0.2g KCl，3.491g Na₂HPO₄•12H₂O，0.2g KH₂PO₄，溶解于1L超纯水中，调节pH值为 7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。

2）脱脂溶液：将400mL甲醇、400mL氯仿与200mL乙醚混匀。

3）脱细胞液I：称取20g SDS溶解于PBS中，添加DNA酶并定容于1L，使DNA酶浓度达到4000U/L,调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。

4）脱细胞液II：称取10g SDS溶解于PBS中，添加DNA酶并定容于1L，使DNA酶浓度达到3000U/L,调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。

5）脱细胞液III：称取5g SDS溶解于PBS中，添加DNA酶并定容于1L，使DNA酶浓度达到2000U/L,调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。

6) 网膜脱细胞基质消化液：将胃蛋白酶0.1g溶解于100mL 醋酸溶液中，调节pH值为2.0，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。使用前现配制，用于网膜脱细胞基质的消化。

7) 消化瓶：200mL有盖柱形玻璃瓶，内置一个的磁力搅拌器用转子（直径×长：6×20mm）。

实施例1 小型猪来源大网膜的脱细胞处理

取新鲜的小型猪腹膜大网膜组织（购自屠宰场），于PBS中清洗3遍。将清洗后的组织震荡浸泡于2L脱脂溶液中处理24h，震荡频率为200r/min。随后，将去除脂肪的大网膜组织于PBS中清洗3遍，并震荡浸泡于1L脱细胞液I中处理8h，震荡频率为150r/min。随后，将经脱细胞液I处理后的大网膜组织于PBS中清洗3遍，并震荡浸泡于1L脱细胞液II中处理8h，震荡频率150r/min。随后，将经脱细胞液II处理后的大网膜组织于PBS中清洗3遍，并震荡浸泡于1L脱细胞液III中处理8h，震荡频率为150r/min。最后，将经脱细胞液III处理后的大网膜组织经PBS洗净，4℃保存。

实施例2 网膜脱细胞基质凝胶的制备

将清洗并剪碎的网膜脱细胞基质10g加入到含有上述消化液的消化瓶中，随后加入100毫升消化液，加盖后放在磁力搅拌器上以100rpm的转速进行搅动，磁力搅拌器和消化瓶一同置于37℃孵箱中，连续消化48小时，然后将pH调节到7.0终止消化反应。收集消化液，将网膜脱细胞基质浓度调整为2mg/mL。通过37℃孵育成胶得到网膜脱细胞基质凝胶。

实施例3 网膜脱细胞基质颗粒的制备

将清洗并剪碎的网膜脱细胞基质放入冷冻干燥机进行冻干处理，称取2.0g

冻干的网膜脱细胞基质进行粉碎研磨，筛网过滤收集直径50μm以下的网膜脱细胞基质颗粒，并辐照灭菌。其中，50μm以下直径范围内的颗粒有利于注射并且有利于颗粒在凝胶中稳定悬浮。

实施例4 软组织填充修复材料的制备

将2.0mg/mL的网膜脱细胞基质水凝胶与1-5.0mg/mL网膜脱细胞基质颗粒充分混合摇匀，分别获得不同型号的软组织填充修复材料（图1）。

实施例5 软组织填充修复材料动物皮下注射后自身细胞外基质形成的鉴定

实验动物（SD大鼠）用3％的戊巴比妥腹腔注射(40mg/kg)麻醉后，背部皮肤碘酒、乙醇消毒。实验组：用1mL注射器将软组织填充修复材料（2:1型）缓慢注射到大鼠背部皮下组织中，分两点注射，每个位点注射500μL，每只大鼠总计注射1.0mL。对照组：分别用1mL注射器将生理盐水、商品化的胶原材料、透明质酸钠凝胶、真皮脱细胞基质颗粒、小肠粘膜脱细胞基质颗粒等缓慢注射到大鼠背部皮下组织中，分两点注射，每个位点注射500μL，每只大鼠总计注射1.0mL。注射后4周取材，进行RNA提取、反转录cDNA后对实验组与对照组的胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质主要蛋白的基因表达水平进行RT-qPCR检测。结果显示，与其他几种植入材料相比，本发明制备的软组织填充修复材料皮下注射后能够显著提高机体自身胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质主要蛋白的基因表达水平，具有统计学差异（p<0.01, 图2，图3）。

实施例6 软组织填充修复材料动物皮下注射后的降解试验

实验动物（SD大鼠）用3％的戊巴比妥腹腔注射(40mg/kg)麻醉后，背部皮肤碘酒、乙醇消毒。用1mL注射器将不同型号的软组织填充修复材料缓慢注射到大鼠背部皮下组织中，分两点注射，每个位点注射500μL，每只大鼠总计注射1.0mL。注射后不同时间点取材，在无菌条件下取注射位点皮下组织及其周边组织，固定于4%多聚甲醛中。1周后，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片。然后二甲苯脱蜡至水，用Harris苏木素染色，0.5%盐酸乙醇分色，95%乙醇伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察观察注射部位植入剂的吸收降解情况。结果表明，随着网膜脱细胞基质颗粒含量的增加，软组织填充修复材料的降解时间延长，2:1型号降解时间为2个月，2:5型号降解时间为6个月（表1）。

表1软组织填充修复材料降解时间

型号	2:0型	2:1型	2:2型	2:3型	2:4型	2:5型
							成分	网膜凝胶2mg/mL	网膜凝胶2mg/mL+颗粒1mg/mL	网膜凝胶2mg/mL+颗粒2mg/mL	网膜凝胶2mg/mL+颗粒3mg/mL	网膜凝胶2mg/mL+颗粒4mg/mL	网膜凝胶2mg/mL+颗粒5mg/mL
降解率（1月）	100%	50%	40%	35%	20%	10%
							降解率（2月）	-	100%	75%	50%	30%	20%
降解率（3月）	-	-	95%	70%	60%	35%
							降解率（4月）	-	-	100%	90%	80%	50%
降解率（5月）	-	-	-	100	100%	75%
							降解率（6月）	-	-	-	-	-	100%

实施例7 软组织填充修复材料动物皮下注射后持续促进自身细胞外基质形成试验

实验动物（SD大鼠）用3％的戊巴比妥腹腔注射(40mg/kg)麻醉后，背部皮肤碘酒、乙醇消毒。用1mL注射器将不同型号的软组织填充修复材料缓慢注射到大鼠背部皮下组织中，分两点注射，每个位点注射500μL，每只大鼠总计注射1.0mL。在注射后只在第1个月和第6个月对各组动物随机分两批取材，进行RNA提取、反转录cDNA后各组的胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质主要蛋白的基因表达水平进行RT-qPCR检测。结果显示，本发明制备的软组织填充修复材料皮下注射后通过延长降解时间，能够延长机体自身胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质主要蛋白的基因表达时间，且表明在材料完全降解一定时间后，不再继续促进机体自身胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质主要蛋白的基因表达，安全可控。具有统计学差异（p<0.01, 图4，图5）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

1.一种软组织填充修复材料，其特征在于：所述材料由网膜脱细胞基质凝胶与网膜脱细胞基质颗粒混合制备而成；所述网膜脱细胞基质凝胶的含量为2.0-5.0mg/mL，和所述网膜脱细胞基质颗粒的含量小于5.0mg/mL；所述网膜脱细胞基质凝胶与网膜脱细胞基质颗粒的质量比为2:1-2:5，所述网膜脱细胞基质颗粒的直径小于50μm，其中所述软组织填充修复材料为医学美容领域的软组织植入剂，且所述软组织植入剂为注射剂。

2.一种权利要求1所述的软组织填充修复材料的制备方法，包括以下步骤：

（1）采用大网膜组织制备网膜脱细胞基质；

（2）采用所述网膜脱细胞基质制备网膜脱细胞基质凝胶；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）为采用网膜脱细胞基质消化液消化网膜脱细胞基质，并通过孵育成胶得到网膜脱细胞基质凝胶，所述网膜脱细胞基质消化液为胃蛋白酶溶液。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中将网膜脱细胞基质进行冷冻干燥与超细粉碎，制备成直径小于50μm的微粒。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的大网膜组织来源于哺乳动物。

6.一种如权利要求1中所述的软组织填充修复材料或权利要求2-5中任一项所述制备方法获得的软组织填充修复材料的用途，其特征在于，用于医学美容领域的软组织植入剂，其中所述软组织植入剂为注射剂。