KR960016207B1

KR960016207B1 - 태반으로부터 수득한 주사용 연조직 증강 물질 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR960016207B1
Application number: KR1019880003722A
Authority: KR
Inventors: 랜달 헤렐 칼
Original assignee: 리서치 디벨노프맨트 파운데이션; 제임스 에프. 웨일러
Priority date: 1987-04-03
Filing date: 1988-04-02
Publication date: 1996-12-06
Also published as: ES2052709T5; IE880946L; NO176551C; NO881406L; JP2643976B2; EP0285370B1; PT87150B; ATE105481T1; AU1408588A; EP0285370A2; HK1006677A1; DE3889489T2; GB8708009D0; IL85923A; PT87150A; FI92906C; DK178988D0; DK178988A; EP0285370B2; NO881406D0

Abstract

내용없음

Description

태반으로부터 수득한 주사용 연조직 증강 물질 및 이의 제조방법

본 발명은 연조직 증강을 위한 주사용 물질에 대한 것이다.

연조직 증강을 위한 주사용 물질을 사용하고자 하는 생각은 피하용 주사바늘의 발명후에 곧 대두되었다. 연조직 결함의 교정을 위한 파라핀, 바셀린, 식물성유, 라놀린, 밀랍, 실리콘 및 보다 최근에는, 콜라겐을 포함하는 다양한 생성물을 체내에 주사해왔다.

파라핀은 1899년 Gersury에 의해 처음 사용되었으며, 그는 이를 어린이의 음낭에 주사하여 절제된 고환을 대체시키기 위해 사용했다.⁽¹⁾그는 후에 안면의 외형상 결함을 교정하기 위해 파라핀을 사용했다. 1900년에서 1914년간, 파라핀 주사의 내용이 대중화되었다.

1906년에 Heidingsfeld가 파라핀 종을 기술했다.⁽²⁾주사된 파라핀은 조직내에서 매우 넓게 확산된 소적(droplet)을 형성한다. 대식세포 및 거대세포에 의한 식작용이 일어나고, 이어서 유관 중격의 초자질 괴사, 섬유 아세포의 증식 및 이물 거대세포에 의해 표시된 유구 및 낭포를 포함하는 반흔 조직의 발생이 일어난다.

임상적으로, 부종 및 반흔 형성이 일어나고, 때때로 궤양화가 일어난다. 세계 제1차 대전 당시 미합중국에서는 주사용 파리핀의 사용이 중단되었지만, 극동지역에서는 1950년까지 계속해서 사용했다.

실리콘이 대규모로 사람에게 주사된 그 다음 물질이었다. Conway 및 Goulian은 1963년에 가슴 및 얼굴에 대한 실리콘 주사의 용도에 대해 보고했다.⁽³⁾일부의 사람들은 보다 나은 고정을 위해 첨가제를 섞은, 실리콘 유체인 Sakurai 제형물을 사용하고 있었다.⁽⁴⁾Dow Corning은 보다 정제된 "의학적 등급 360 액체 실리콘"을 개발했고, 이 생성물을 본래 주사하고자 했던 것은 아님에도 불구하고, 곧 인체주사용으로 전 세계에서 사용되었다.

이물 육아종을 포함한 주사된 실리콘의 합병증에 관한 첫번째 보고가 1964년에 있었다.⁽⁵⁾1965년에, Ben-Hur 및 Neuman은 실리콘 360을 랫트에 주사한 후 발생되는 종양형 발생물인 실리콘 종에 대해 기술했다.⁽⁶⁾

1965년에, 미합중국 식품 의약국(F.D.A.:Food and Drug Administration)은 주사용 실리콘의 임상적 용도를 "약제 용도"로 결정하였고, 7명의 연구원들은 실리콘 유체를 연조식 대체물로서 사용하도록 인가하였다. 주사용 실리콘(Dow Corning, MDX 4.4011)을 사용하여 임상적 실험을 검토한 후에, 이들은 실리콘 MDX 4.4011이 항생물질 및 코르티코스테로이드로 조절될 수 있는 발적 및 반상출혈을 일으키는 염증 반응을 일으킬 수 있다고 결론지었다. 부분적인 재흡수 및 이동이 일어날 수 있지만 소량의 반복된 주사로 피할 수 있다.^{(7),(8),(9),(10),(11),(12),(13)}MDX 4.4011 사용시에는 보고된 합병증이 거의 없음에도 불구하고, 공지되지 않은 등급의 순도를 갖는 액체 실리콘을 주사한 후의 많은 합병증에 대해 기술되고 잇다.⁽¹⁴⁾일부 사람들이 좋은 결과를 제공하며 합병증이 거의 없는 실리콘을 여전히 주사하고 있음에도 불구하고, 적합치 못하게 사용될 경우에도 그 물질의 예기치 못하는 특성은 그의 광범위한 사용을 아마도 방해할 것이다.

소의 콜라겐은 최근 연조직 증강을 위한 주사용 물질로서 폭넓게 사용되어 왔다.

콜라겐은 동물체의 주요한 세포외 구조 단백질이다. 최소한 포유동물의 콜라겐의 7가지 형태가 기술되었다. 그들의 공통적인 특성은 알파-쇄라 불리우는, 3개의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진, 3중-나선구조이다. 모든 쇄는 동일한 배위를 가지지만, 조성 및 이의 아미노산 서열에 있어서는 다르다. 이는 알파-쇄의 상이한 형태를 유도하지만, 이는 모두 아미노산 서열의 매 세번째 위치에 글리신을 포함한다. 이들은 나선형 구조를 이룬다. 유형 Ⅰ 콜라겐은 2개의 알파₁-쇄 및 1개의 알파₂-쇄로 이루어져 있고, 피부, 건 및 뼈의 주요한 세포외 물질이다. 임상가들이 "콜라겐"을 말할 경우에, 이는 대개 유형 Ⅰ을 의미하는 것이다. 유형 Ⅱ 콜라겐은 연골 및 초자 체액에서 발견된다. 유형 Ⅲ 콜라겐은 신속하게 성장하는 조직, 특히 유약하고 치유해야 할 피부에 존재한다. 콜라겐 유형 Ⅳ 및 Ⅴ는 상피의 기초막에서 발견된다.⁽¹⁴⁾

세포외 매트릭스내에서 발견되는 콜라겐 이외의 주요한 분자 종류는 비콜라겐성 구조 당단백질, 엘라스틴 및 프로테오글리칸을 포함한다. 구조 당단백질은 피브로넥틴 및 라미닌(laminin)으로 이루어져 있다. 피브로넥틴은 혈장 및 조직형태에서 발견되며, 세포의 매트릭스의 다른 성분과 상호 작용할 수 있다. 최근, Wartiovaara는 피로브넥틴의 다른 기능으로, 콜라겐 또는 피브린을 옵소닌화(opsonization)시켜, 이 메카니즘에 의해, 상기 기질들의 세포성 분해를 조절한다고 제안하였다.⁽¹⁶⁾라미닌은 모든 기초막에서 발견된다. 프로테오글리칸은 글리코아미노글리칸 측쇄에 연결된 단백질 코어에 의해 특징화된다.^{(15),(16),(17),(18)}

콜라겐을 생체물질로서 사용할 경우에, 보다 강력한 항원인 비콜라겐성 단백질을 제거하기 위해 가장 순수한 결정형태로 이를 사용하는 것이 중요하다. 염증 사이클이 자극을 받을 경우에, 염증세포, 주로 거대세포 및 더욱 적은 정도의 과립구를 침윤시킴으로써 콜라겐의 재흡수가 일어난다. 이들 세포는 콜라겐을 분해시키는 작용을 하는 콜라게나제를 함유한다.⁽¹⁹⁾Houch 및 Chang은 피부콜라겐 자체가 화학 주성이며 조직 콜라게나제를 사용하여 보다 작은 펩타이드 단편으로 분해시킴으로써 훨씬 더 활성적이 된다는 것을 입증하였다.⁽²⁰⁾화학 향성은 산, 알칼리 또는 다른 체내에서 나타내는 화학적 특성에 의해 세포가 친화[양성 화학주성]되거나 저항[음성 화학 주성]하게 되는 화학적 자극에 대한 살아있는 원형질의 친화성이다.

Postlethwaite 등은 콜라겐의 다양한 형태인, 콜라게나제 분해에 의해 형성된 작은 펩타이드 뿐만 아니라 이들의 알파-쇄가 모두 피부 섬유 아세포에 대해 화학 주성임을 제시하고 있다. 그들은 섬유 아세포의 조직 손상부위 또는 이론적으로 주사된 콜라겐 부위로의 화학 주성 이동이, 가용화된 콜라겐 또는 이의 분해 생성물로 조절할 수 있다고 결론지었다. 따라서, 콜라겐 이식으로 조직내의 휴지상태가 잔류하지 않지만 복잡한 종류의 문제들이 발생할 수 있다. 먼저, 염증 및 섬유 아세포가 콜라겐 이식에 침입할 수 있으며, 연속적으로 재흡수되는 반면에, 그의 분해 생성물의 화학 주성 특성으로 인해 염증 반응을 증진시킬 수 있다. 따라서, 콜라겐 대사의 영역은 콜라겐 및 연조직 주사용 물질을 위해 중요한 뿐만 아니라, 정상 및 비정상적인 상처의 치유[즉, 비대 반흔(scarring) 및 해족종] 모두에 중요하다.^{(19),(20),(21)}

최근 폭넓게 사용되는 주사용 콜라겐은 1981년 F.D.A.에 의한 장치(약제가 아님)로서 판매 순이익을 제공했다. Zyderm

콜라겐 이식물이란 명칭으로 판매되는 이 물질은 정제된 소의 콜라겐이다. 약 95%가 유형 Ⅰ 콜라겐으로 이루어져 있고, 나머지 5%는 유형 Ⅲ의 콜라겐이다. 콜라겐은 이의 항원성을 감소시키는 이의 말단 펩타이드 부분을 단백질 가수분해시킨다. 물질을 생리 식염수 완충액에 현탁시키고, 0.3% 리도카인을 가한 후, 작은 게이지(gauge)의 주사바늘을 통해 주사하려고 하는 주사기에 이 물질을 충전시킨다.

대부분의 성형술에 대한 가장 즉각적인 관심사는 주사후 소 콜라겐의 운명이다. 콜라겐 35mg/ml를 함유하는ZydermA I

은 조직 콜라게나제에 의해 신속히 분해되며 한달내에 재흡수된다. 콜라겐 65mg/ml를 함유하므로, 콜라겐의 농도가 거의 2배인 Zyderm Ⅱ

는 보다 오래 지속되지만 Zyderm Ⅰ

와 동일한 운명을 지닌다. 글루타르 알데하이드로 가교-결합된 콜라겐 35mg/ml를 함유하는 Zyplast

가 가장 최근에 도입되었다. Zyplast

는 또한 궁극적으로 시간이 경화함에 따라 분해된다. Kligman은 최근 사람의 등에 이식시킬 경우에 Zyderm

콜라겐 및 Zyplast

콜라겐의 생물학적 지방을 비교했다.⁽²²⁾그들은, Zyderm

콜라겐은 이식한지 한달내에 호스트 조직에 의해 분명히 재흡수되는 반면에, Zyplast

는 보다 지속적이라는 사실을 보고했다. 섬유 아세포는 Zyplast

콜라겐을 침윤하며 호스트 콜라겐을 축적한다. Burke 등은 Zyderm

콜라겐이 새로이 생성된 호스트 콜라겐에 의해 이식분해 및 대치되는 반응을 촉진시킨다고 보고했다.⁽²³⁾

Zyderm Ⅰ

콜라겐, Zyderm Ⅱ

콜라겐 및 Zyplast

콜라겐에 대한 추가적 일면은 각각에 있어서의 콜라겐의 %이다. Zyderm Ⅰ

콜라겐 및 Zyplast

콜라겐은 35mg/ml(3.5% 콜라겐)를 함유하는 반면에, Zyderm Ⅱ

는 65mg/ml(6.5% 콜라겐)를 함유한다.

이후부터는 소 콜라겐 이식물(BCI:bovine collagen implant)로서 언급될, Zyderm Ⅰ

콜라겐, Zyderm Ⅱ

콜라겐 또는 Zyplast

콜라겐을 수용한 환자중 적은 %가 면역성의 역반응을 나타냈다. 이들 이식물의 안전한 용도는 보고된 소 콜라겐의 낮은 면역성에 입각한다. 그러나, 자동 면역 질환의 병력을 가진 환자에게는 금기가 된다. BCI의 수용전에 피부시험이 요구된다. 피부시험을 한지 4주후 7회의 음성 피부시험을 나타내는 환자에게만 치료 주사를 할 수 있다. Collagen Corporation은 약 3%의 환자가 주사부위에 부종, 경화, 홍반, 소양종 또는 민감성을 특징으로 하는 양성 피부 시험반응을 나타낸다고 제시하고 있다. 해로운 일반화된 치료반응은 1 내지 5%를 차지한다. 그들은 담마진, 근통증, 관절통 및 유과민성 반응을 특징으로 한다.^(23),(24)해로운 BCI-치료반응을 하는 환자의 순환에 있어서 항-BCI 항체 발생율의 놀라운 증가는 역반응으로 고생하는 치료되지 않은 환자 또는 치료된 환자로부터 수거한 혈청 샘플과 비교시 주목된다. BCI는 약한 항원이지만 여전히 이종 단백질이다. 면역성은 적게 하지만 분자의 나선형 부분은 이의 항원 부위로 유지시키기 위해 말단 헵타이드를 절단하는 방법으로 처리한다.

세포-중재된 면역학적 메카니즘에 의해 인식되는 유력한 구조는 콜라겐 분자의 3중 나선체내에 존재하는 것으로 나타난다. 이들 항원 및 이들의 장기간의 효과에 대한 환자의 반복적인 노출에 주요한 관심이 있다.^{(24),(25),(26)}

간단하게 요약해보면, 지속성의 결여, 반복된 주사의 필요성 및 역반응에 대한 심각한 문제점을 포함하는 BCI의 단점으로 인해, 연조직 증강을 위해 보다 새로운 주사용 물질이 요구된다. 본 발명은 BCI 및 선행 기술의 다른 주사용 물질의 단점을 극복하는 연조직 증강을 위한 주사용 물질 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

상술한 선행 기술외에, 미합중국 특허 제4,361,552호에는, 이의 단백질이 가교-결합되도록, 글루타르 알데하이드 용액 또는 다른 고정액 또는 탄닌 용액과 같은 독성 화학물질에 의해 고정되거나 안정화되는 적합한 동물종(사람, 소, 돼지 등)으로부터 양막 드레싱하여 상처 또는 화상을 치료하는 방법에 대해 기술하고 있다. 수많은 미합중국 특허가 본 특허에 인용 및 기술되었다.

1983년 6월 22일에 공개된 영국 특허원 제8133375호에는 상처의 치료에 사용하기 위한 양막, 바람직하게는 사람의 양막을 배양한 배양 매질로부터 유도된 사실상 양막이 없는 제조방법에 대해 기술하고 있다.

본 발명은, 이종의 소 공급원과 관련되는 문제가 해결되며 지속성의 결핍 및 반복된 주사를 위한 필요성의 문제가 분해에 대해 덜 민감하고 출발물질을 저비용 및 비제한 양으로 이용할 수 있는 물질로 해결되는 주사용 연조직 물질에 관한 것이다.

주사용 연조직 증강 물질은 사람의 태반에서 얻은 것이고 불용성 양막, 가용성 양막, 가용성 융모막 및 이들의 조합물로 구성되어 있고 수술용 주사바늘에 통과시키기 위해 균질화되어 있다. 바람직하게는, 균질화된 물질은 불쾌감을 피하기 위해 30 게이지 수술용 주사바늘에 통과되어야 하고 경우에 따라 진통제가 첨가될 수 있다. 본 발명의 일면에는, 멸균 및 가교결합을 위해 약 0.25 내지 약 2.0M 래드(rad)의 바람직한 범위에서 최소 0.2M 래드로 물질에 조사한다. 최근 바람직한 주사용 연조직 증강 물질은 조사된 가용성 양막이다.

이러한 주사용 연조직 물질을 제조하는 본 발명의 방법은, 수술용 주사바늘, 바람직하게는 30 게이지 수술용 주사바늘에 통과시키기에 충분하고 불용성 양막, 가용성 양막, 가용성 융모막 및 이들의 조합물로 구성된, 사람의 태반에서 수득한 물질을 균질화하는 단계 및 콜라겐 물질을 바람직하게는 이들을 가교결합시키는 감마 조사에 의해 멸균시키는 단계를 포함한다. 이러한 물질을 멸균하기 위하여 최소 0.20M 래드가 필요하고 최근 바람직한 범위는 약 0.25 내지 2.0M 래드이다. 경우에 따라, 진통제를 균질화된 주사용 연조직 물질에 첨가할 수 있다.

연조직 외형 결함을 교정하는 본 발명의 방법은 본 발명의 주사용 연조직 물질을 환자에 주사하는 것이다. 유익하게는, 매우 소량이 존재하므로 연조직 물질 소량을 다회 주사하는 것이 바람직하다. 이것은 더 큰 호스트 이식 계면을 제공하며 이식의 중심이 호스트 조직의 영향에서 그리 떨어져 있지 않기 때문에 조직으로의 동화를 더 빠르게 한다.

따라서 본 발명의 목적은, 해로운 알레르기 반응이 제거되고 장기간 지속성이 있고 염증이 거의 없으며 30 게이지 주사바늘을 통해 주사할 수 있고 본 발명의 일면으로, 감마 조사를 사용하여 물질을 멸균하고 독성의 가교결합제를 사용하지 않고 콜라겐의 가교결합량을 증가시킨 멸균된 주사용 연조직 물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 불용성 양막, 가용성 양막, 가용성 융모막 및 이들의 조합물로 구성되어 있고 30게이지 주사바늘과 같은 수술용 주사바늘에 통과시키기에 충분하도록 균질화되며 본 발명의 일면으로, 정제되고 독성 화학물질을 사용하지 않고 감마 조사에 의해 가교결합된 사람의 태반에서 수득한 멸균된 주사용 연조직 물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 해로운 알레르기 반응이 제거되고 감마 조사를 사용하여 물질을 멸균하고 가교결합량을 증가시키며, 가교결합량이 다양함으로써 조직의 지속성을 조절할 수 있는 주사용 연조직 물질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 물질이 수술용 주사바늘, 바람직하게는 30 게이지 수술용 주사바늘에 통과시키기 위하여 사람의 태반에서 수득된, 불용성 양막, 가용성 양막, 가용성 융모막 또는 이의 조합물을 균질화시키고, 0.20M 래드 이상, 바람직하게는 0.25 내지 2.0M 래드의 범위에서 감마 조사하여 물질의 콜라겐 분자를 가교결합시킴으로써 상기 언급한 이점을 갖는 주사용 연조직 증강 물질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적으로는 사람의 태반에서 수득된, 불용성 양막, 가용성 양막, 가용성 융모막 또는 이의 조합물로 된 물질을 멸균하고 수술용 주사바늘, 바람직하게는 30 게이지 수술용 주사바늘에 의해 주사될 수 있는 정도로 균질화시키며, 본 발명의 일면에서는 물질을 감마 조사하여 멸균 및 가교결합된 콜라겐 분자를 갖게 하는 것을 포함하여, 이 물질을 사람에게 주사하여 연조직을 재형성시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이러한 주사용 물질을 소량으로 사람에게 주사하여 우수한 호스트 이식 계면을 제공하고 조직에 보다 빠르게 동화시키고 우수한 지속성을 갖게 되는, 연조직을 재형성시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 그외의 추가 목적, 특징 및 이점을 명세서 및 특허청구의 범위를 통해 나타낸다.

사람 태아의 막은 연조직을 재형성시키기 위해 사람에게 주사할 수 있는 연조직 증강 물질을 위한 출발물질로 선택되며 이것은 이종의 공급원, 즉 소에서 나타나는 알레르기 문제를 해결하고, 사람의 태반은 비교적 비제한 양으로 이용할 수 있고 콜라겐의 풍부한 공급원이며, 태반은 저비용으로 이용할 수 있고, 양막은 거의 90년전부터 다양한 의학적 및 수술용 응용물을 위한 의학적 용도로 오랜 역사를 가지고 있기 때문이다.

태아막은 하나 또는 수가지의 상이한 연조직 주사용 물질로 개발될 수 있는 복잡한 생화학적 구조물이다. 이것은 다양한 임상적 필요를 충족시키기 위해 변형될 수 있는 물리적 생물학적 특징을 가진다.

바람직한 사람의 태아막은 불용성 양막, 가용성 양막, 가용성 융모막 또는 이의 조합물이다. 이것들을 수술용 주사바늘에 통과시키기 위해 균질화시킨다. 25 게이지 수술용 주사바늘을 통해 연조직 증강 물질을 주입하는 것이 불쾌감을 피하기 위하여, 임상적인 목적에 만족되며, 바람직하게는 물질을 균질화시켜 30 게이지 수술용 주사바늘을 통해 주사할 수 있다.

본 발명의 한 양상에는, 주사용 물질을 글루타르 알데하이드와 같은 독성의 화학적 가교결합제를 사용하지 않고 감마 조사로 가교결합시킨다. 감마 조사는 이러한 물질을 멸균하기 위해 최소 20M 래드이어야 하고, 이는 AIDS를 포함하여 모든 세균, 곰팡이 및 바이러스가 0.20M 래드에서 사멸되기 때문이다. 바람직하게는 멸균 및 콜라겐 분자의 가교결합을 위해 0.25 내지 2.0M 래드로 물질에 조사한다.

경우에 따라 리도카인과 같은 진통제를 주사용 물질에 첨가할 수 있다.

연질의 주사용 물질을 제조하는데 있어서, 신선한 태반을 수집하고 양막을 손가락 분리와 같은 손으로 융모막으로부터 분리한다. 그 다음 양막 및 융모막에 남아 있는 혈액 덩어리 또는 찌꺼기를 씻어낸다. 단기간 저장을 위해서는, 양막 및 융모막을 항생 물질 용액, 예를 들어 공정이 끝날때까지 정상 염수 1ℓ중의 리노마이신 3gm/10ml, 암포테리신 B 50mg/10ml, 네노마이신 설페이트 0.5gm/10ml, 폴리믹신 B 설페이트 500,000unit/10ml의 용액에 넣어둔다.

콜라겐은 펩신으로 제한 단백질 분해시켜 추출한다. 간단히, 조직을 0.5M 아세트산에 균질화시키고 pH를 HCl로 2.5로 조절한 다음, 제제를 펩신(펩신 10mg/조직의 습윤중량 gm)으로 밤새 2회 분해시킨다. 중성염 용액 및 산성 용액로부터의 선택성 침전 조합방법은 콜라겐을 정제하는데 사용한다. 정제된 콜라겐은 15 내지 17℃에서 낮은 이온 강도의 인산나트륨 완충액(pH 7.2)에 대해 투석하여 재구성한다. 리도카인을 최종농도의 0.3%로 첨가한다. 모든 방법은, 다른 적합한 온도가 사용될 수 있지만 4 내지 8℃에서 수행한다.

불용성 양막의 가공

양막을 가공하는 바람직한 방법은 양막으로부터 항생 물질을 제거하고, 각 양막에 냉 증류수 5ml를 가한 다음, 양막을 폴리트론중에서 약 15분간 균질화시키는 것을 포함한다. 균질화시킨 양막을 4℃에서 15분 동안 8,000×g로 원심분리시키고 상등액을 제거한 후 침전물을 세척(아세톤으로 5회)하여 지질을 제거한다. 침전물을 계량하고, 양막 당 펩신(Sigma, 1:10,000, 돼지 위점막으로부터) 및 3.0M 아세트산을 가하고(매우 큰 양막의 경우 15ml 이상) 침전물을 폴리트론중에서 약 5분간 균질화시킨다.

혼합물을 4℃에서 18시간 동안 정치시키고, 4℃에서 1시간 동안 100,000×g로 원심분리한 다음, 상등액을 제거한 후 침전물을 계량하고, 펩신 및 균질화 단계를 반복한 다음 상등액을 제거한다.

가용성 양막의 가공

가용성 양막을 가공하는 가장 바람직한 방법은 양막으로부터 탈이온수로 항생 물질을 씻어내고, 각 양막에 냉 증류수 5ml를 가한 다음, 폴리트론중에서 약 15분간 균질화시킨 후, 4℃에서 15분 동안 8,000×g로 원심분리하는 것을 포함한다. 상등액을 버리고 침전물을 아세톤으로 3회 세척하여 지질을 제거한 다음 침전물을 계량한다.

침전물(1/100w/w)에 펩신(돼지의 위점막으로부터, Sigma, 1:10,000)을 가하고 양막 당 0.5M 아세트산 100ml를 가한 후(양막이 상당히 큰 경우 그 이상을 가한다), 폴리트론중에서 약 10분간 균질화시킨다. 펩신을 사용하여 4℃에서 18시간 동안 침전물로부터 콜라겐을 추출하고 4℃에서 1시간 동안 100,000×g로 원심분리한 후 침전물 및 상등액을 그대로 놔둔다. 상등액을 다시 계량하고, 펩신 및 아세트산 첨가 단계, 균질화 단계, 콜라겐의 펩신 추출 단계 및 원심분리 단계를 반복한다.

제1 및 제2추출물로부터의 상등액을 합하고 10M NaOH를 적가하여 pH를 7.0 내지 7.2로 조절한다. 혼합물을 4℃에서 2시간 정치시키고, 4℃에서 45분 동안 100,000×g로 원심분리한 다음 침전물을 제거한다. NaCl을 3.0M로 상등액에 가하고 4℃에서 2시간 정치시킨 다음 4℃에서 45분 동안 100,000×g로 원심분리하고 침전물을 계량한 후 0.3%로 리도카인을 가한다.

추가 정제와 함께 가용성 양막의 가공

가용성 양막 가공 및 추가 정제의 가장 바람직한 방법은 탈이온수로 양막으로부터 항생 물질을 씻어내고, 양막을 약 2cm×2cm로 절단한 다음 아세톤으로 간단히 세척한 후, 0.5M 아세트산(HCl로 pH 2.5로 조절)에 침액시키고, 약 15분 동안 폴리트론으로 균질화시킨 다음, 펩신(1:100펩신/조직 세트)(펩신 1mg/용액 1ml)을 가하고, 4℃에서 밤새 교반시킨 후, 상기 지시와 같이 원심분리시키고, 상등액을 보존하는 것을 포함한다. 상술한 것과 같이 펩신을 다시 가하고 4℃에서 밤새 교반시킨 후, 원심분리하고 원심분리 두 단계로부터의 상등액을 합한 다음, NaCl을 2M로 가하고 4℃에서 밤새 정치한 후 다시 원심분리하고, 상등액을 버린 다음 침전물을 보유한다.

침전물을 0.5M 아세트산에 용해시키고, 원심분리한 다음, 침전물을 제거하고, 상등액에 NaCl를 2M로 가한 다음, 4℃에서 밤새 정치한 후 다시 원심분리하여 상등액을 제거함으로써 정제시킨다. 수득한 침전물을 0.5M 아세트산에 용해시키고, 다시 원심분리하여 침전물을 제거한다. 상등액을 48시간 동안 투석 유체를 자주 교환시키면서 0.02M Na₂HPO₄에 대해 완전하게 투석하고, 원심분리한 다음, 상등액은 버리고, 침전물을 계량한 다음 고체 리도카인 HCl을 기계적으로 교반시키면서 0.30%로 가한다.

융모막의 가공

가용성 융모막을 가공하는 가장 바람직한 방법으로는, 탈이온수로 융모막에서 항생 물질을 씻어내고, 융모막을 약 2cm×2cm 단위로 절단한 다음 아세톤으로 간단히 세척한 후 HCl로 pH 2.5로 조절한 0.5M 아세트산에 침액시킨다. 조직을 약 15분 동안 폴리트론과 함께 균질화시켜 미립자로 만들고, 펩신을 가하여 상기 지시대로 원심분리한 다음 상등액을 보유한다. 펩신 및 원심분리 단계를 반복하고, 각 단계의 상등액을 합하여 NaCl을 2M로 가한 다음 4℃에서 밤새 정치시킨 후 다시 원심분리하고 상등액을 제거한다.

정제를 위하여, 침전물을 0.5M 아세트산에 용해시키고, 원심분리하여 침전물을 제거한다. 상등액에 NaCl을 2M로 가하고 4℃에서 밤새 정치한 후 다시 원심분리하고 상등액을 제거한다. 침전물을 0.5M 아세트산 용해시키고, 원심분리하여 0.02M Na₂HPO₄에 대해 48시간 동안 투석 유체를 자주 교환시켜주면서 완전하게 투석하고, 다시 원심분리하고, 상등액을 버리고 침전물을 계량한다. 고체 리도카인 HCl을 0.30%로 기계적으로 교반시키면서 침전물에 가한다.

가교결합 및 멸균

전 과정에서 생성된 침전물 각 15cc를 크림프 봉합물이 있는 20cc들이 혈청병에 넣고, 물질을 멸균하고 콜라겐을 가교결합시키는 이중 목적을 만족시키는 0.25M 래드, 0.5M 래드, 1.0M 래드 및 2.0M 래드를 조사받기 위하여 시간을 다양하게 하여 CE¹³⁷방사선 공급원에 장치한다.

[실시예 1]

콜라겐 추출물의 몇몇 그룹을 인산염 완충 염수에 재구성하고 유리관에 넣고 1000래드/분의 조사량으로 1779curie 세슘 감마선을 조사하다. 조사량은 0.25M 래드이다. 조사는 상온에서 실시한다.

[표 1]

시험된 그룹은 하기와 같다:

그룹

1. 0.25M 래드조사된 가용성 양막

2. 조사되지 않은 가용성 양막

3. 0.25M 래드 조사된 불용성 양막

4. 조사되지 않은 불용성 양막

5. 0.25M 래드 조사된 불용성 양막+가용성 양막(1:1)

6. 조사되지 않은 불용성 양막+가용성 양막(1:1)

7. 0.25M 래드 조사된 가용성 융모막

8. 조사되지 않은 가용성 융모막

9. 0.25M 래드 조사된 가용성 융모막+가용성 양막(1:1)

10. 조사되지 않은 가용성 융모막+가용성 양막(1:1)

각 그룹의 샘플을 호기성, 혐기성 및 균류 배양물에 제공한다. 모든 그룹은 조사 전 뿐만 아니라 후에도 성장하지 않는다.

체중이 200 내지 300g인 120마리의 어린 스프레규-돌리(Sprague-Dawley) 랫트를 주사용 동물로 사용한다. Zyderm Ⅱ

및 Zyplast

로 주사한 그룹을 포함하여 12개의 동물 그룹을 연구한다. 각 그룹은 10마리 랫트로 구성된다. 주사용 물질 0.2ml 등 아래의 피부근층의 3부분에 경피적으로 주사한다. 각 그룹에서 5마리 랫트로부터 샘플을 1개월 및 6개월 후 채취한다.

검체를 10% 완충 포르말린에 고정시킨 다음 파라핀에 봉매시킨다. 몇개의 절편을 만들어 헤마톡실린-에오신(H&E)으로 염색한다. 독립적을 스태프(staff) 병리학자를 통하여 결과를 비교한다.

계속해서 논의되어질 불용성 양막을 제외하고 모든 실험 그룹은 이식물의 조직적 평가에 의해 유사성 있게 나타난다. 특히, 염증 반응은 명백하지 않고 피낭(encapsulation)이 발생하지 않는다. 섬유 세포의 안쪽으로의 성장은 30일째에 나타나고 180일 경과후에는 구심적으로 더 진전된다. 신혈관 신생은 180일째에 다양한 크기로 나타난다. 섬유 세포의 안쪽으로의 성장 및 신혈관 신생의 정도는 180일 경과후 Zyderm Ⅱ

및 Zyplast

로 인해 발견된 것보다 더 크다.

불용성 양막 그룹은 또한 염증 또는 피낭은 나타내지 않으나, 뚜렷한 신혈관 신생 및 섬유 세포의 안쪽으로의 성장을 나타낸다. 30일 경과후에는 소량의 지방 세포의 존재가 추가로 관찰된다. 180일 경과후에는 이식물의 주변에 처음 나타난 지방 세포가 이식물 전체에 퍼진다. 이런 현상은 다른 사람에 의해 관찰되었다.^(27),(28)

정량 분석(지소하는 이식물의 정확한 크기 측정)은 수행하기 매우 힘들다. 따라서, 지속성의 예비 정성 연구가 수행된다. 간단하게, 6개월 후 살아있는 랫트중에 육안으로 볼 수 있는 이식물의 수를 센다. 표 2는 가용성 양막 그룹이 6개월 후 매우 양호한 지속성을 나타냄을 보여준다. 비조사된 가용성 양막은 6개월 후에 모든 이식물이 나타나고 조사된 가용성 양막은 11 내지 15개월 후에 나타난다. 불용성 그룹은 또한 조사된 그룹 및 비조사된 그룹에서 양호한 지속성을 보여준다. 물질의 조합물, 특히 가용성 융모막의 조합물을 갖는 그룹의 몇몇은 조사후 지속성이 감소된다.

[표 2]

주사 6개월 후 연조직 증강의 지속성 동물 실험 그룹 1 내지 10, Zyderm Ⅱ

및 Zyplast

참조:^*0.25M 래드 감마로 조사한 샘플

1 내지 6개월의 간격에서 다수의 조직적 연구는 섬유 세포의 안쪽으로의 성장 뿐만 아니라 염증을 수반하지 않고 신혈관 신생을 보여준다. 불용성 양막 이식물 속으로의 지방 세포의 혼입에 대한 관찰은 매우 흥미있는 일이지만 그것의 발생 이유는 설명할 수 없다. 지방의 기질 침투는 이미 다른 사람에게 관찰되었고 불명료한 특성의 이상 현상이다.^(27),(28)지방의 과량 축적은 특정한 조직 및 기관의 간질 조직내에서 발생한다. Robin 및 Angel은 간질중의 다중 잠재성 섬유 아세포는 지방으로 채워져 있고 효과면에서 "비만의" 지방 세포로 전환됨을 가상하여 설명하였다.⁽²⁹⁾지방에 의한 기질 침투는 비만 또는 실질 세포의 위축과 함께 일어나지만, 상관 관계는 불완전하다. 심장 및 췌장이 가장 자주 연루된다.

30일 경과후 소량의 지방 세포만이 존재하고 180일 경과후 그 수가 증가한다는 사실은 상기 기술한 것과 유사한 현상이 발생됨을 보여준다. 새로운 지방 세포 축적의 자극은 흥미로운 일이고 연조직 증강에 대한 새로운 가능성을 제공한다.

생화학적 분석은 주사용 사람 양막 및 융모막 콜라겐의 순도를 입증해준다. PAGE 전기 영동 및 아미노산 분석은 HAC가 전형적인 콜라겐 전기 영동 패턴을 갖고 유형 Ⅰ 및 Ⅲ 콜라겐의 혼합물의 아미노산 조성을 갖음을 보여준다.

세균성 콜라게나제 분해 결과는 주사용 사람 양막 및 융모막 콜라겐 속에 비콜라겐성 단백질이 존재하지 않음을 입증한다. 면역 블로팅 시험에 의해, 본 발명의 콜라겐 생성물중에 잔여의 피브로넥틴 및 라미닌을 감지하지 못한다. HAC의 고순도는 랫트 모델에 있어서 낮은 면역 반응에 기여한다.

유형 Ⅰ 콜라겐에 대한 유형 Ⅲ 콜라겐의 비율은 Zyderm

및 Zyplast

(5:95)에 있어서 보다 주사용 사람 양막 콜라겐(43:57)에 있어서 훨씬 더 크다. 유형 Ⅲ 콜라겐이 내부-쇄 디설페이트 결합을 가지고 있는 반면, 유형 Ⅰ 콜라겐은 가지고 있지 않으므로 후에 펩신 추출로 처리하고, 유형 Ⅲ 콜라겐은 주로 γ형으로 존재하는 반면, 유형 Ⅰ 콜라겐은 α,β 및 γ쇄의 혼합물형으로 존재한다. 양막 콜라겐에 있어서 가교-결합이 많을수록, 유형 Ⅲ 콜라겐의 지속성이 길어진다는 사실이 연조직 증강을 위해 가장 유효한 콜라겐을 고려해 볼때 중요한 요인으로서 나타난다는 것은 당연한 일이다.

세포 생물학 연구는 감마선이 조사된 사람 양막 콜라겐이 세포 성장 및 세포 운동에 있어서 세포 독성 효과를 갖지 않음을 나타낸다. 조사된 사람 양막 콜라겐 기질상에서 성장하는 세포는 정상적인 형태학적 외형 및 활성 위족을 갖는다. 세포수 및 [³H] 도입 실험에 있어서, 조사된 사람 양막 콜라겐 및 Vitrogen

, Zyderm

및 비조사된 사람 양막 콜라겐상에서 성장하는 세포 사이의 중대한 차이는 없음이 발견되었다.

순도 평가를 위한 다양한 주사용 사람 양막 콜라겐의 생화학적 특징, 및 콜라겐 유형의 비율은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), 밀도측정기, 콜라게나제 분해, 아미노산 분석(AAA), 면역 블로팅, 전자현미경(EM), 콜라게나제 감응 분석 및 하이드록시프롤린 분석을 포함한다. 이들은 모두 통상적인 것이므로 상세히 설명하지 않았고 이들의 다양한 방법도 필요하다고 생각하지 않았다.

최소 0.20M 래드에서 및 0.24 내지 2.0M 래드의 범위에서 감마선을 조사시키면 좋은 결과를 수득할 수 있다. 양막 및 융모막의 특정한 조합물이 좋은 결과를 수득하게 할 수 있다.

전술한 동물 연구는 사람으로의 주사용 물질의 주사를 위한 탁월한 모델이다.

따라서, 본 발명은 목적물을 수득하는데 적용시키기에 적합하고 상기 기술한 특징 및 이점뿐만 아니라 다른 고유 특성을 갖는다.

상기 기술한 실시예는 본 명세서의 목적을 위해 주어진 것이고, 첨부된 특허청구의 범위에 의해 정의된 것과 같은 본 발명의 범주내에서의 변화가 가능하다.

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Claims

사람의 태반으로부터 단백질 분해에 의해 추출된, 불용성 양막, 가용성 양막, 가용성 융모막 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 멸균되고, 수술용 주사바늘에 통과시키기 위하여 균질화시킨, 유형 Ⅰ 콜라겐에 대한 유형 Ⅲ 콜라겐의 비율이 43:57인 유형 Ⅰ 콜라겐과 유형 Ⅲ 콜라겐의 혼합물을 포함하는 주사용 연조직 증강 물질.
제1항에 있어서, 콜라겐은 30 게지이 수술용 주사바늘에 통과시키기 위하여 균질화시킨 주사용 연조직 증강 물질.
제1항에 있어서, 선택된 콜라겐이 가용성 양막인 주사용 연조직 증강 물질.
제1항에 있어서, 콜라겐이 감마 조사에 의해 가교결합된 주사용 연조직 증강 물질.
제1항에 있어서, 감마 조사가 최소 0.20M 래드인 방법.
제4항에 있어서, 감마 조사의 범위가 0.25 내지 2.0M 래드인 주사용 연조직 증강 물질.
제1항에 있어서, 진통제를 포함하는 주사용 연조직 증강 물질.
사람의 태반으로부터 단백질 분해에 의해 추출된, 불용성 양막, 가용성 양막, 가용성 융모막 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유형 Ⅰ 콜라겐에 대한 유형 Ⅲ 콜라겐의 비율이 43:57인 유형 Ⅰ 콜라겐과 유형 Ⅲ 콜라겐의 혼합물을 멸균시키는 단계 및 25게이지 이상의 수술용 주사바늘에 통과시키기에 충분하도록 물질을 균질화시키는 단계를 포함하여, 주사용 연조직 증강 물질을 제조하는 방법.
제8항에 있어서, 감마 조사에 의해 콜라겐 분자를 가교결합시키는 단계를 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 감마 조사가 최소 0.20M 래드인 방법.
제9항에 있어서, 감마 조사의 범위가 0.25 내지 2.0M 래드인 방법.
제8항에 있어서, 균질화시킨 콜라겐에 진통제를 첨가하는 단계를 포함하는 주사용 연조직 물질의 제조방법.
제1항에 있어서, 펩신으로 단백질 분해시킨 주사용 연조직 증강 물질.