NO176551B - Fremgangsmåte for fremstilling av et injiserbart mykvevaugmentasjonsmateriale - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av injiserbart mykvev-augmentasjonsmateriale.

Idéen med bruk av et injiserbart materiale for augroentasjon av mykt vev fremkom straks etter oppfinnelsen av den hypoder-miske nål. Forskjellige produkter har blitt injisert i det menneskelige legeme for korreksjon av defekter i mykt vev, inkludert paraffin, vaselin, vegetabilske oljer, lanolin, bi-voks, silikon, og mer nylig kollagen.

Paraffin ble først benyttet av Hersury i 1899^ som injiserte det i skrotum på en ung mann for å ertatte operativt fjernede testikler. Han benyttet senere paraffin for å korrigere konturdefekter i ansiktet. I løpet av perioden 1900-1914 ble bruken av paraffininjeksjoner popularisert.

Heidingsfeld beskrev i 1906<2> paraffinoma. Injisert paraffin danner mange sterkt spredte dråper i vevene. Fagocytose av makrofager og kjempeceller oppstår, fulgt av hyalin nekrose av fibrovskulære septa, proliferasjon av fibroblaster, og utvikling av arrvev inneholdende oljedråper og cyster poret med fremmede koppskjempeceller.

Klinisk oppsto ødemer og arrdannelse, noen ganger fulgt av ulcerasjon. Bruken av inji serbar paraffin opphørte i USA omkring første verdenskrig, men fortsatte å bli benyttet i det fjerne østen inntil 1950-årene.

Silikoner var det neste materialet som for injeksjon i mennesker i stor målestokk. Conway og Goulian ga rapporter om anvendelsen av silikoninjeksjoner i bryst og ansikt i 1963<3>. Noen mennesker benyttet "sukari"-materialet, et silikonfluid oppblandet med et additiv for bedre fiksering<4>. Dow Corning utviklet et mer renset "flytende silikon av medisinsk kvalitet 360" og, selv om dette produkt opprinnelig ikke var ment for injeksjon, ble det snart benyttet for injeksjoner i mennesker omking i verden.

De første rapporter på komplikasjoner av injisert silikon inkluert fremmedlegeme-granulomer fremkom i 1964^. I 1965 beskrev Ben-Hur og Neuman*5 siliconoma som var en tumor-lignende dannelse som utviklet seg etter injeksjonen av silikon 360 i rotter. ;I 1965 bestemte U.S. Food and Drug Administration (F.D.A.) at den kliniske bruk av injiserbar silikon var en "legemiddel-anvendelse" og bemyndiget syv etterforskere til å benytte silikonfluid som en mykveverstatning. Etter å ha studert deres kliniske erfaringer med injiserbar silikon - Dow Corning - MDX 4.4011, konkluderte de at silikonMDX 4.40011 kan fremkalle en inflammasjonsreaksjon som resulterer i rødhet og ekkymose som kan bekjempes med antibiotika og corticostereoider. Delvis resorpsjon og migrering kan oppstå, men kan unngås ved gjentatte injeksjoner var små meng-(jer7 ,8,9 ,10 ,11,12 ,13. selv om få komplikasjoner har blitt rapportert med MDX 4.4011, har mange komplikasjoner blitt beskrevet etter injeksjon av flytende silikon av en ukjent renhetsgrad<*4>. Selv om noen personer fremdeles injiserer silikon med gode resultater og få komplikasjoner, vil materialets uforsonlige natur, dersom det brukes på uriktig måte, sannsynligvis hindre dets utbredte bruk.

Bovin-kollagen har nylig vunnet utbredt anvendelse som et injiserbart materiale for forstørrelse av mykt vev.

Kollagen er det viktigste ekstracellulære struktuelle protein i det animalske legeme. Minst 7 typer av pattedyrkollagen har blitt beskrevet. Deres felles egenskaper er en tretrådet spiral bestående av tre polypeptidkjeder, kalt a-kjeder. Alle kjedene har den samme konfigurasjonen, men adskiller seg i sammensetningen og sekvensen av deres aminosyrer. Dette leder til forskjellige typer av a-kjeder, men alle har glycin i hver tredje stilling i aminosyresekvensen. Dette tillater forekomsten av spiralformen. Type I kollagen består av to a^-kjeder og en o^-kjede og er det viktigte ekstracellulære materialet i hud, sener og ben. Når klinikere taler om "kollagen", refereres det vanligvis til type I. Type II kollagen finnes i brusk og glasslegeme. Type III kollagen er til stede i hurtigvoksende vev, spesielt ung og helende hud. Kollagener typer IV og V finnes i epitelisk basalmembran<14>.

De største molekylære artene ved siden av kollagen som finnes i den ekstracellulære matrisen, innbefatter de ikke-kollagenholdige strukturelle glykoproteinen, elastin, og proteo-glukanene. De stukturelle glukoproteinene består av fibronektin og laminin. Fibronektin finnes både i plasma- og vevsformene og er i stand til å samvirke med andre komponen-ter i den ekstracellulære matrisen. Nylig foreslo Wartiovaara at en annen funksjon for fibronektin er å opsonisere kollagen eller fibrin, og ved denne mekanisme å regulere den cellulære spalting av disse substratene<15>. Laminin finnes i alle basalmembraner. Proteoglykaner er kjennetegnet ved en proteinkjerne bundet til glykoaminoglukansidekjeder<15><»>•17 »-18.

Ved bruk av kollagen som et biomateriale er det viktig å benytte det i sin reneste og krystallinske form for å elimi-nere de ikke-kollagenholdige proteinene som er langt mer virkningsfulle antigener. Når først den inflammatoriske cyklus er stimulert, oppstår resorpsjonen av kollagen ved infiltrering av inflammatoriske celler, hovdsakelig makrofager, og, i mindre grad, granulocytter. Disse cellene inneholder kollagenase som virke slik at en spalter kol-lagen<19>. Houch og Chand demonstrerte at hudkollagen var kjemotaktisk i seg selv og ble enda mer aktivt ved spalting med vevskollagenase i mindre peptidfragmenter<20>. Kjemi-tropisme er tiltrekningen av levende protoplasma til kjemiske stimuli hvorved cellene tiltrekkes (positiv hemotaksis) eller avstøtes (negativ kjemotaksis) av syrer, alkalier eller andre stoffer som viser kjemiske egenskaper. Postlethwaite et al<21> viste at forskjellige typer av kollagener, deres a-kjeder samt små peptider dannet ved kolla-genasespalting, alle var kjemotoksiske overfor dermalfibro-blaster. De konkluderte med at den kjemotaktiske migrering av fibroblaster inn i stedet for vevskade eller teoretisk injisert kollagen kan reguleres med det oppløseliggjorte kollagen eller dets spaltnings- eller nedbrytningsprodukter. Et kollagenimplantat ville således ikke forbli værende i vevet, men en kompleks serie av hendelser kan oppstå. For det første kunne kollagenimplantatet bli invadert av inflammatoriske celler og fibroblaster og, mens det ble kon-tinuerlig resorbert, kunne det fremme en inflammatorisk reaksjon av kjemotaktiske egenskaper til dets spaltnings-produkter. Området for kollagenmetabolisme er således ikke bare viktig for kollagen og andre injiserbare mykvevmateria-ler, men også for både normal og abnormal sårheling (dvs. hypertrofisk arrdannelse og keloider19»20»21.

Det injiserbare kollagen som nylig har fått utbredt anvendelse, ble gitt klarering for markedet som en anordning (ikke et legemiddel) av Food and Drug Aministration i 1981. Dette materialet som selges under betegnelsen Zyderm®-kollagenimplantat er et renset bovin-kollagen. Omkring 95$ består av type I kollagen, og de gjenværende 5$ av type III-kollagen. Kollagenet gjennomgår proteolytisk hydrolyse av dens telo-pepiddel til minsking av dens antigenisitet. Materialet suspenderes i fysiologisk saltoppløsningsbuffer og 0,356 lidokain tilsettes og materialet forpakkes i sprøyter som er klare for injeksjon gjennom tynne nåler.

Det som de fleste plastiske kirurger er mest opptatt av, er skjebnen til bovinkollagen etter injeksjon. Zyderm I® med 35 mg/ml kollagen blir hurtig nedbrutt av vevkollagenser og resorbert i løpet av måneder. Zydermll® med 65 mg/ml kollagen og således nesten to ganger konsentrasjonen av kollagen varer lenger, men følger den samme skjebne som Zyderm I®. Zyplast® ble ganske nylig introdusert og inneholder 35 mg/ml kollagen tverrbundet med glutaraldehyd. Zyplast® blir også til slutt nedbrutt over tid. Kligmann<22> sammenlignet nylig det biologiske fettet i Zyderm®-kollagen og Zyplast®-kollagen når det var implantert i ryggen på frivillige mennesker. De rapporterte at mens Zyderm®-kollagen tydeligvis ble resorbert av vertvevet i løpet av måneder fra implantering, var Zyplast® mer varig. Fibroblaster infiltrerte Zyplast®-kollagenet og avsatte vertkollagen. Burke et al<23> rapporterte at Zyderm®-kollagen stimulerer en respons som resulterer i implantatnedbrytning og erstatning med nyutviklet vertkollagen .

Et ytterligere område med forvirring angående Zyderm®-kollagen, Zyderm II®-kollagen og Zyplast®-kollagen er pro-sentandelen av kollagen i hver. Zyderm I®-kollagen og Zyplast®-kollagen har 35 mg/ml (3,5$ kollagen) mens Zyderm II® har 65 mg/ml (6,5$ kollagen).

En liten prosentandel av pasienter som mottar enten Zyderm I®-kollagen, Zyderm II®-kollagen eller Zyplast®-kollagen, idet følgende betegnet bovin-kollagenimplantater (BCI), har utviklet ugunstige reaksjoner av en immun natur. Den sikre bruk av disse implantater er basert på den rapporterte lave immunogenisitet til bovin-kollagenet. Det blir imidlertid kontraindikert i pasienter med en autoimmun sykdomhistorie. Hudtester er nødvendig før BCI-materialet mottas. Bare pasienter med negative hudtester etter 4 uker bør få behand-lingsinjeksjoner. Collagen Corporation angir at omkring 356 av pasientene har en positiv hudtestreaksjon kjennetegnet ved ødem, indurasjon, erytem, kløe eller ømhet ved in-jeksjonsstedet. Ugunstige generaliserte behandlingsreakjoner har blitt oppgitt fra mindre enn 156 til over 556. De er kjennetegnet ved urtikaria, myalgier, artralgier og en ana-fylaktoid reaksjon23»2<4>. En dramatisk økning i forekomsten av ånti-BCI-antistoffer i kretsløpet hos pasienter med ugunstige BCI-behandlingsreaksjoner har blitt notert sammenlignet med serumprøver fra ubehandlede individer eller behandlede pasienter med ugunstige reaksjoner. BCI er et svakt antigen, men er fremdeles et fremmede protein. Det har blitt behandlet på en slik måte at telopeptidene spaltes for å gjøre det mindre immunogent, men molekylets spiraldel bi-beholder sine antigeniske seter. De dominerende strukturer som gjenkjennes av den celleformidlede immunologiske meka-nismen, synes å befinne seg i det tredobbelte spirallegemet til kollagenmolekylene. Det har vært et hovedanliggende når det gjelder gjentatt eksponering av pasienter for disse anti-genene og deres langvarige effekter<24>»<25>»<2>^.

Som konklusjon, p.g.a. manglene ved BCI-materialet, inkludert mangelen på vedvarende virkning, behov for gjentatte injeksjoner og alvorlig bekymring for ugunstige reaksjoner, er nyere injiserbare materialer for augmentasjon av mykt vev nødvendig. Foreliggende oppfinnelse er rettet mot fremstilling av injiserbare materialer for augmentasjon av mykt vev som ikke oppviser manglene ved BCI-materialet og andre tidligere kjente injiserbare materialer.

I tillegg til den ovenfor omtalte tidligere teknikk beskriver US patent 4.361.552 en fremgangsmåte for behandling av et sår eller brannsår med en amnionforbinding fra en hvilken som helst egnet dyreart (menneske, kyr, griser, osv.) fiksert eller stabilisert med toksiske kjemiske midler, slik som glutaraldehydoppløsninger eller andre fikerings- eller garve-oppløsninger, slik at proteinene deri tverbindes. En rekke US patenter er angitt i ovennevnte US-patent.

GB patentsøknad 8.133.375, publisert 22. juni 1983, beskriver et vesentlig amnionfritt preparat for bruk ved behandling av sår, oppnådd fra et kulturmedium hvori amnion har blitt dyrket, idet amnionmaterialet fortrinnsvis er humanamnion.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et injiserbart mykvev-augmentasjonsmateriale, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved sterilisering av en blanding av type I- og type III-kollagen som er ekstrahert ved proteolytisk nedbrytning av uoppløselig amniom, oppløselig amniom og oppløselig korion fra human placenta og kombinasjoner derav, og homogenisering av materialet i tilstrekkelig grad til at det passerer gjennom i det minste en kirurgisk nål av en diameter på 0,556 mm (nr. 25 nål) og eventuelt tilsetning av et analgetikum til det homogeniserte materialet.

Det fremstilte injiserbare mykvevmaterialet oppviser ikke de problemer som er forbundet med xenogene bovinkilder, og problemet med mangel på vedvarende virkning, og behovet for gjentatt injeksjon har blitt taklet for å gjøre det mindre mottagelig for nedbrytning. Utgangsmaterialet som benyttes i foreliggende fremgangsmåte er tilgjengelig i ubegrensede mengder og til lav pris. Mykvevmaterialet gir ikke ugunstige eller skadelige allergiske reaksjoner, og har langvarig persistens og liten inflammasjon. Fordelaktig benyttes gamma-bestråling for både å sterilisere materialet og øke mengden av tverrbinding i kollagenet uten anvendelse av toksiske tverrbindingsmidler. Ved å variere mengden av tverrbinding kan vevpersistens reguleres.

Korreksjon av mykvev-konturdefekter utføres ved injisering av det injiserbare mykvevmaterialet fremstilt ifølge oppfinnelsen i en pasient. På fordelaktig måte er en rekke injeksjoner av små mengder av mykvevmaterialet mulig fordi selv små mengder vedvarer. Dette gir en større vert-implantat-grenseflate og tillater hurtigere assimilering i vevet fordi senteret for implantatet ikke er langt fra vertvevpåvirk-ninger.

Foretrukne utførelser av oppfinnelsen

Humah-føtalmembraner ble valgt som utgangsmateriale for det injiserbare materialet for forstørrelse av mykt vev hos mennesker for konturkorreksjon av mykt vev, fordi slikt membranmateriale eliminerer de allergiske problemene som forekommer med xenogene kilder, dvs. bovin. Human-placenta er tilgjengelig i relativt ubegrensede mengder og er en rik kilde for kollagen, placenta er tilgjengelig til lav pris, og amnion har hatt en lang historie når det gjelder medisinsk bruk fra nesten 90 år tilbake vedrørende en rekke forskjellige medisinske og kirurgiske anvendelser.

Føtalmembraner er komplekse biokjemiske strukturer som kan utvikles til ett eller flere forskjellige injiserbare myk-vevmateriale. Disse har fysikalske og biologiske egenskaper som kan modifiseres for å oppfylle forskjellige kliniske behov.

De foretrukne human-føtalmembranene er uoppløselig amnion, oppløselig amnion, oppløselig korion eller kombinasjoner derav. De homogeniseres for å passere gjennom en kirurgisk nål. Mens injeksjon av materialer som forstørrer mykt vev gjennom en nr. 25 kirurgisk nål er tilfedsstillende for kliniske formål, blir materialet for å unngå ubehag som nevnt fortrinnsvis homogenisert slik at det ved injeksjon passerer gjennom en nr. 30 kirurgisk nål.

Ifølge et foretrukket aspekt ved oppfinnelsen blir det injiserbare materialet tverrbundet ved gamma-bestråling uten bruk av kjemiske tverrbindingsmidler, slik som glutaraldehyd, som er toksisk. Gamma-bestrrålingen bør være et minimum på 20 M rad for å sterilisere materialet fordi alle bakterier, fungi og vira (inkludert AIDS), ødelegges ved 0,20 M rad. Materialet blir fortrinnsvis bestrålt med 0,25-2,0 M rad for å sterilisere og tverrbinde kollagenmolekylene.

Om ønsket, kan et smertestillende middel slik som lidokain tilsettes til det injiserbare materiale.

Ved fremstilling av det injiserbare mykvevmaterialet ble friske placentaer samlet og amion separert manuelt fra korion, slik som ved separering for hånd. Både amnion og korion ble deretter renset for eventuelle gjenværende blod-klumper eller brokker. For kortvarig lagring anbringes amnion og korion i en antibiotisk oppløsning, f.eks. linomycin 3g/10ml, amfotericin B 50 mg/10 ml, neomycinsulfat 0,5 g/10 ml, polymyksin B sulfat 500.000 enheter/10 ml i en 1 liter normal saltoppløsning inntil bearbeidelse.

Kollagen ble ekstrahert ved bruk av begrenset proteolytisk spaltning med pepsin. I korthet ble vev homogenisert i 0,5 M eddiksyre, pH-verdien ble justert til 2,5 med HC1 og prepara-tet ble spaltet to ganger med pepsin (10 mg pepsin/g våtvekt-vev) natten over. En kombinasjonsmetode for selektiv utfel-ling fra nøytralt saltoppløsningsmiddel og syreoppløsnings-roidler ble benyttet for å rense kollagenet. Renset kollagen ble rekonstituert ved dialyse mot natriumfosfatbuffer av lav ionestyrke (pH 7,2) ved 15-17°C. Lidokain ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,356. Alle metodene ble utført ved 4-8°C skjønt andre egnede teemperaturer kan benyttes.

Bearbeidelse av uoppløselig amnion

En foretrukket metode for bearbeidelse av amnionen omfatter dekantering av antibiotikumet fra amnionen, tilsetning av 5 1 kaldt destillert vann til hver amnion, og homogenisering av amnionen i ca. 15 min. i polytron. Den homogeniserte amnion sentrifugeres deretter ved 8000 x g i 15 min. ved 4°C, supernatanten kasseres, og bunnfallet vaskes for å fjerne lipider, slik som 5 ganger med aceton. Det utfelte materialet veies deretter, og pepsin (Sigma, 1:10.000, fra slimhinnen i svinemave) og 3,0 molar eddiksyre pr. amnion ble tilsatt, 15 ml eller mer dersom ekstra store amnioner foreligger, og det utfelte materialet ble homogenisert i ca. 5 min. i polytron.

Blandingen ble hensatt i 18 timer ved 4°C, sentrifugert ved 100.000 x g i 1 time ved 4°C, supernatanten ble kassert, det utfelte materialet ble veiet og deretter ble pepsin- og homogeniseringstrinnene gjentatt og supernatanten kassert.

Bearbeidelse av oppløselig amnion

En foretrukket metode for bearbeidelse av oppløselige amnioner omfatter skylling av antibiotika fra amnionene med deionisert vann, tilsetning av 5 ml kaldt destillert vann til hver amnion, homogenisering i ca. 15 min. i polytron og sentrifugering ved 8000 x g i 15 min ved 4°C. Supernatanten ble kassert, og lipider fjernet fra bunnfallet ved vasking med aceton 3 ganger, og bunnfallet ble veiet.

Pepsin (Sigma, 1:10.000, fra slimhinnen i svinemave) ble tilsatt til bunnfallet (1:1100 vekt/vekt) og 100 ml 0,5 molar eddiksyre pr. amnion ble tilsatt, mer dersom amnionene er ekstra store, og deretter homogenisert i ca. 10 min. i polytron. Pepsinet fikk ekstrahere kollagen fra bunnfallet i 18 timer ved 4°C og ble deretter sentrifugert ved 100.000 x g i 1 time ved 4°C idet både bunnfallet og supernatanten ble bibeholdt. Supernatanten ble igjen veiet, og trinnene med pepsin- og eddiksyretilsetning, homogenisering, pepsinekstraksjon av kollagen og sentrifugering ble deretter gjentatt .

Supernatantene fra første og andre ekstraksjon ble kombinert og 10 molar NaOH ble tilsatt dåpevis for å justere pH-verdien til fra 7,0 til 7,2. Blandingen ble hensatt i 2 timer ved 4°C, sentrifugert ved 100.000 x g i 45 min. ved 4°C, og bunnfallet ble kassert. NaCl til 3,0 molar ble tilsatt til supernatanten, og det hele hensatt i 2 timer ved 4°C, og deretter sentrifugert ved 100.000 x i 45 min. ved 4°C og bunnfallet ble veiet, og lidokain til 0,356 tilsatt.

Bearbeidelse av oppløselig amnion med ytterligere rensing

En foretrukket fremgangsmåte for bearbeidelse av oppløselig amnion og ytterligere rensing omfatter skylling av antibiotika fra amnionen med deionisert vann, oppdeling av amnionene til en størrelse på ca. 2 cm x 2 cm og kortvasking med aceton, gj ennombløting i 0,5 M eddiksyre (pH-verdien justert til 2,5 med HC1), homogenisering med polytron i ca. 50 min., tilsetning av pepsin (1:100pepsin/vev) (1 mg pepsin/ 1 ml oppløsning) og omrøring ved 4°C natten over, sentrifugering som angitt ovenfor, og ivaretagelse av supernatanten. Pepsin blir igjen tilsatt som angitt ovenfor og omrørt ved 4°C natten over, sentrifugert, og supernatanten fra begge sentrifugeringstrinnene kombineres, og NaCl tilsettes til 2 M og det hele hensettes natten over ved 4°C, hvoretter sentrifugering foretas, og supernatanten kasseres og bunnfallet bi-beholdes .

Bunnfallet renses ved oppløsning i 0,5 M eddiksyrre, deretter foretas sentrifugering idet bunnfallet kasseres, NaCl tilsettes til 2M til supernatanten, og det hele hensettes natten over ved 4°C, og sentrifugering foretas på nytt idet supernatanten kasseres. Det resulterende bunnfall oppløses i 0,5 M eddiksyre, sentrifugeres på nytt, og bunnfallet kasseres. Supernatanten dialyseres grundig mot 0,02 M NagHPC^ i 48 timer med hyppig utveksling av dialysevæske, sentrifugering foretas, supernatanten kasseres, bunnfallet veies og fast lidokain og EC1 tilsettes til 0,30$ under mekanisk om-røring.

Bearbeidelse av korion

I en foretrukken fremgangsmåte for bearbeidelse av oppløselig korion ble antibiotika skyllet bort fra korionen med deionisert vann, korionen ble oppdelt til en størrelse på ca. 2 cm x 2 cm enheter og vasket kort med aceton og deretter gjennom-bløtet i 0,5 M eddiksyre som var justert til pH 2,5 med HC1. Vevet ble deretter homogenisert med polytron til fine partik-ler i ca. 15 min., pepsin ble tilsatt og sentrifugering foretatt som angitt ovenfor idet supernatanten ble bibeholdt. Pepsin- og sentrifugeringstrinnene ble deretter gjentatt, supernatanten fra hvert av disse trinnene ble kombinert, og NaCl til 2 M ble tilsatt, og hensetning ble foretatt natten over ved 4°C hvoretter sentrifugering ble foretatt på nytt, og supernatanten kassert.

For rensing ble bunnfallet oppløst i 0,5 M eddiksyre, sentrifugering ble foretatt og bunnfallet kassert. NaCl til 2 M ble tilsatt til supernatanten, og det hele hensatt natten over ved 4°C, hvoretter sentrifugering ble foretatt på nytt, og supernatanten kassert. Bunnfallet ble oppløst i 0,5 M eddiksyre, sentrifugert, dialysert mot 0,02 M Na2HP04 i 48 timer med hyppig utveksling av dialysevæske, hvoretter sentrifugering på nytt ble foretatt, supernatanten kassert og bunnfallet veiet. Fast lidokain HC1 ble tilsatt til 0,30$ til bunnfallet under mekanisk omrøring.

Tverrbinding og sterilisering

15 ml av hvert av de i det ovenstående oppnådde bunnfall ble anbragt i 20 ml serumflasker med krympelukning og plassert i Ce<137> radioaktiv kilde i varierende tidsperioder for at de kan motta 0,25 M rad, 0,5 M rad, 1,0 M rad og 2,0 M rad, hvilket tjente det dobbelte formål med sterilisering av materialet og tverrbinding av kollagenet.

Eksempel 1

Flere grupper av kollagenekstrakter ble rekonstituert i fosfatbufret saltoppløsning og anbragt i glassrør og bestrålt med en kilde for 1979 curie cesium-gammastråler ved en dose på 1000 rad/min. Doseringen var 0,25 M rad. Bestrålingen ble utført ved romtempertur.

Prøver fra hver gruppe ble benyttet for aerobe, anaerobe og fungale kulturer. Ingen av gruppene viste vekst hverken før eller etter bestråling. 10 unge Spraque-Dawley rotter som veide mellom 200 og 300 g, ble benyttet for injeksjoner. 12 grupper av dyr ble studert, inkludert grupper injisert med Zyderm II® og Zyplast®. Det var 10 rotter i hver gruppe. 0,2 ml injiserbart materiale ble injisert perkutant i deres rygger under panniculus carnosus på tre separate steder. Prøver ble innhøstet fra 5 rotter i hver gruppe ved 1 måned og 6 måneder.

Prøvestykker ble fiksert i 1056 bufret formalin og senere inn-leiret i paraffin. Serieseksjoner ble preparert og farget med hematoksylin-eosin (H&E). Resultater ble sammenlignet ved bruk av en uavhengig patolog.

Den histologiske bédømmelse av implantater viste likheter i alle de eksperimentelle gruppene med unntagelse av den uopp-løselige amnion som vil bli omtalt senere. Spesielt kunne det ikke sees noen inflammatorisk reaksjon, og ingen innkapsling forekom. Fibrocytisk innvekst foreligger ved 30 dager og er mer fremskredet sentripetalt ved 80 dager. Neovaskularisering forekom i variabel grad ved 180 dager. Graden av både fibrocytisk innvekst og neovaskularisering var større enn det som ble funnet med Zyderm II® og Zyplast® ved 180 dager.

Gruppen med uoppløselig amnion viste heller ingen inflammasjon eller innkapsling, men markert neovaskularisering og fibrocytisk innvekst. En ytterligere observsjon var til-stedeværelsen av noen adipocytter ved 30 dager. Ved 180 dager hadde adipocyttene som først viste seg på implantatets periferi blitt spredt gjennom hele implantatet. Dette feno-menet har blitt observert av andre27»28.

En kvantitativ analyse (måling av eksakte dimensjoner av per-sisterende implantat) var vanskelig å utføre. Derfor ble det foretatt et preliminært kvalitativt studium av persistens. Således ble antallet av implantater som synlig var til stede i rottene som overlevde ved 6 måneder, opptelt. Tabell 2 viser at gruppen med oppløselig amnion viste meget god persistens ved 6 måneder. Den ikke-bestrålte oppløselig amnion hadde alle implantater til stede ved 6 måneder, og den bestrålte oppløselige amnion hadde 11 av 15. Den uoppløselige gruppen viste også god persistens i både den bestrålte og den ikke-bestrålte gruppen. Noen av gruppene som hadde kombinasjoner av materialer av spesielt oppløselig chorion, hadde mindre persistens etter bestråling.

Flere histologiske studier ved intervaller fra 1 til 6 måneder har vist fibrocytisk innvekst samt neovaskularisering uten inflammasjon. Observasjonen av adipocytt-inkorporering i de- uoppløselig amnion-implantatene er meget interessant, men man kan ikke forklare hvorfor den forekommer. Stromal infiltrasjon av fett har tidligere blitt observert av andre27»2<8>, og er et underlig fenomen av en uklar natur. Akkumulering av forøkede mengder av fett oppstår av og til i mellomvevet i spesielle vevstyper og organer. Robbins og Angel<29> gir en forklaring om at de multipotensielle fibro-blastene i mellomrommet antageligvis blir fylt med lipid, og faktisk omdannes til meget store fettceller. Stromal infiltrasjon av fett har tilbøyelighet til å være forbundet med sterk fedme eller med atrofi av parenchymale celler, men korrelasjoner er ufullstendige. Hjerte og bukspyttkjertelen er mest ofte involvert.

Det faktum at det bare var noen få adipocytter ved 30 dager og et forøket antall ved 180 dager ville synes å indikere at det oppsto et fenomen lik det som er beskrevet ovenfor. Stimuleringen av ny adipocyttavsetning gir en interessant og ny mulig vei til mykvevaugmentasjon.

Biokjemisk analyse har demonstrert renheten av det injiserbare, humane amnion- og korion-kollagen. PAGE-elektroforese og aminosyreanalyse har vist at HAC har et typisk kollagen-elektroforesemønster og en aminosyresammensetning for en blanding av type I og type III kollagen.

Resultatene fra bakteriell kollagenase-spalting viste at intet ikke-kollagen-protein eksisterte i injiserbart, humant amnion- og korion-kollagen. Ved undersøkelse ved immunoblotting ble det ikke detektert noe resterende fibronektin og laminin i kollagenproduktet ifølge oppfinnelsen. Det antas at den høye renheten til HAC bidro til den lave immunologiske respons i rottemodellen.

Mengdeforholdet for type III kollagen til type I kollagen er mye større i injiserbart humant amnion-kollagen (43:57) enn i Zyderm® og Zyplast® (5:95). Type III kollagen har inter-kjedé-disulfatbindinger, mens type I kollagen ikke har dette, slik at etter behandling ved pepsinekstraksjon eksisterer type I kollagen i form av en blanding av a-, p- og -y-kjeder, mens type III kollagen hovedsakelig forekommer i -y-formen. Det er postulert at jo større tverrbindingen er, desto lengre synes persistensen av type III kollagen i amnion-kollagen å være en viktig faktor når man betrakter det mest effektive kollagen for mykvevaugmentasjon.

Celle-biologistudier viste at gamma-bestrålt, humant amnion-kollagen ikke hadde noen cytotoksisk effekt på cellevekst og på celleadferd. Celler som vokser ved bestråling av humant amnion-kollagensubstrat, har et normalt morfologisk utseende og aktive pseudopodia. I foretatte forsøk med celleantall og [<3>H] ble det ikke funnet noen signifikante forskjeller blant cellene som vokste på bestrålt, humant amnion-kollagen og Vitrogen®, Zydderm® og ikke-bestrålt, humant amnion-kollagen.

Den biokjemiske karakterisering av forskjellige injiserbare human amnion-kollagener for renhetsbestemmelse, og forholdet for kollagentyper, innbefattet polyakrylamid-gelelektroforese (PAGE), densittometri, kollagenase-spalting, aminosyreanalyse (AAA), immunoblotting, elektronmikroskopi (EM), kollagenase-sensitivitetsanalyse, og hydroksyprolin-analyse. Ingen detaljert beskrivelse er gitt eller ansett for å være nøvendig av disse forskjellige metodene siden de alle er kon-vensjonelle .

Gode resultater kan oppnås med gamma-bestråling ved et minimum på 0,20 M rad og i området 0,25-2,0 M rad. En hvilken som helst kombinasjon av amnion og korion kan benyttes med gode resultater.

Det ovenfor omtalte dyrestudium er en utmerket modell for injeksjon av det injiserbare materialet i mennesker.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et injiserbart mykvev-augmentasjonsmateriale, karakterisert ved sterilisering av en blanding av type I- og type III-kollagen som er ekstrahert ved proteolytisk nedbrytning av uoppløselig amniom, oppløselig amniom og oppløselig korion fra human placenta og kombinasjoner derav, og homogenisering av materialet i tilstrekkelig grad til at det passerer gjennom i det minste en kirurgisk nål av en diameter på 0,556 mm (nr.

25 nål) og eventuelt tilsetning av et analgetikum til det homogeniserte materialet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at materialet homogeniseres i tilstrekkelig grad til at det passerer gjennom en kirurgisk nål av en diameter på 0,318 mm (nr. 30 nål).

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at kollagenmolekyler i materialet tverr-bindes ved gamma-bestråling.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at gamma-bestrål ingen er ved et minimum på 2,0 kJ/kg (0,20 M rad).

5 Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at gamma-bestrålingen er i området 2,5-20 kJ/kg (0,25-2,0 M rad).