DE3889489T2

DE3889489T2 - Injizierbare Stoffe aus der Placenta für die Weichgewebevermehrung und ihr Verfahren zur Herstellung.

Info

Publication number: DE3889489T2
Application number: DE3889489T
Authority: DE
Inventors: Carl Randall Harrell
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Institut Clayton de la Recherche Genf/geneve Ch
Priority date: 1987-04-03
Filing date: 1988-03-29
Publication date: 1994-08-25
Anticipated expiration: 2008-03-30
Also published as: PT87150B; NO176551B; ZA882306B; KR960016207B1; DE3889489D1; JPH01256967A; KR880012234A; GB8708009D0; IE880946L; HK1006677A1; DK178988A; FI881518A; AU1408588A; DK173020B1; AU609108B2; ATE105481T1; PT87150A; ES2052709T5; IE64226B1; FI881518A0

Description

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liegt im Bereich der injizierbaren Stoffe für die Weichgewebeveimehiung.

Grundlage der Erfindung

Der Gedanke zur Verwendung eines injizierbaren Stoffes zur Weichgewebevermehrung entstand bald nach der Erfindung der Injektionsnadel. Verschiedene Stoffe wurden in den menschlichen Körper zur Behebung von Weichgewebestörungen injiziert, einschließlich Paraffin, Petrolatum, pflanzliche Öle, Lanolin, Bienenwachs, Silikon, und in letzter Zeit Kollagen.
Paraffin wurde zuerst von Gersury 1899¹ verwendet, der es in den Hodensack eines jungen Mannes injizierte, um abgetrennte Hoden zu ersetzen. Er verwendete später Paraffin, um Gesichtsformmängel zu beheben. Während der Zeit von 1900- 1914 wurde die Verwendung von Paraffin allgemein eingeführt.
1906² beschrieb Heidingsfeld den Paraffinkrebs. Das injizierte Paraffin erzeugt in den Geweben viele weit verstreute Tröpfchen. Es tritt die Phagozytose durch Freßzellen und Riesenzellen ein, gefolgt von Hyalinnekrose der fibrovaskulären Scheidewände, Wucherung von Fibroblasten und Entwicklung von Narbengewebe, das ölige Kügelchen und Zysten, abgegrenzt durch Fremdkörperriesenzellen, enthält.
Klinisch tritt Ödem- und Narbenbildung ein, manchmal gefolgt von Geschwürsbildung. Die Verwendung von injizierbarem Paraffin wurde in den Vereinigten Staaten etwa im ersten Weltkrieg eingestellt, aber im Fernen Osten wurde es bis in die 1950er Jahre weiter verwendet.
Silikone waren der nächste Stoff, der in Menschen in großem Maßstab injiziert wurde. Conway und Goulian berichteten 1963³ über die Verwendung von Silikoninjektionen in die Brust und das Gesicht. Einige Mediziner verwendeten die "Sakurai"-Formel, eine Silikonflüssigkeit, die zur besseren Fixierung mit einem Additiv versetzt wurde.&sup4; Dow Corning entwickelte ein stärker gereinigtes "medical grade 360 liquid silicone" und obwohl es ursprünglich nicht beabsichtigt war, dieses Produkt zum Injizieren zu verwenden, wurde es bald für Injektionen beim Menschen weltweit verwendet.
Die ersten Berichte über Komplikationen von injiziertem Silikon, einschließlich Fremdkörpergranulome, er schienen 1964&sup5;. 1965 beschrieben Ben-Hur und Neuman&sup6; das Silikonoma, das eine Tumor-ähnliche Bildung war, die sich nach der Injektion von "Silicone 360" in Ratten entwickelte.
1965 beschloß die U.S. Food and Drug Administration (F.D.A.), daß die klinische Verwendung von injizierbarem Silikon eine "rnedikamentöse Verwendung" war und ermächtigte sieben Forscher, flüssiges Silikon als Weichgewebeersatz anzuwenden. Nach der Überprüfung ihrer klinischen Erfahrungen mit injizierbarem Silikon-Dow Corning-MDX 4.4011 folgerten sie, daß Silikon MDX 4.4011 eine Entzündung hervorrufen kann, die eine Rötung und subkutane Blutung zur Folge hat, die mit Antibiotika und Corticosteroiden geheilt werden kann. Es kann eine partielle Resorption und Wanderung eintreten, die aber durch wiederholte Injektionen kleiner Mengen7,8,9,10,11,12,13 vermieden werden kann. Obwohl nur über wenige Komplikationen mit MDX 4.4011 berichtet wurde, wurde über viele Komplikationen nach der Injektion von flüssigem Silikon mit einem unbekannten Reinheitsgrad¹&sup4; berichtet. Obwohl wenige Mediziner noch Silikon mit guten Ergebnissen und wenigen Komplikationen injizieren, wird die Tatsache, daß man sich bei der Verwendung des Stoffes keinerlei Fehler erlauben darf, eine breite Verwendung wahrscheinlich verhindern.
Kürzlich erlangte Rinderkollagen eine breite Verwendung als injizierbarer Stoff zur Weichgewebevermehrung.
Kollagen ist das wichtigste extrazelluläre Strukturprotein des tierischen Körpers. Es wurden mindestens sieben Typen von Säugerkollagen beschrieben. Ihr allgemeines Merkmal ist eine dreisträngige Spirale, die aus 3 Polypeptidketten besteht, die Alphaketten genannt werden. Alle Ketten besitzen die gleiche Konfiguration, aber sie unterscheiden sich in der Zusammensetzung und der Sequenz ihrer Aminosäuren. Das führt zu verschiedenen Typen von Alphaketten, aber alle besitzen Glycin in jeder dritten Stellung der Aminosäuresequenz. Das erlaubt das Vorkommen der spiralförmigen Konformation. Der Kollagentyp I ist aus 2 Alpha&sub1;-Ketten und einer Alpha&sub2;-Kette zusammengesetzt und er ist der hauptsächliche extrazelluläre Stoff der Haut, der Sehne und des Knochens. Wenn die Kliniker von "Kollagen" sprechen, beziehen sie sich gewöhnlich auf Typ I. Der Kollagentyp II wird im Knorpel und der Glaskörperflüssigkeit gefunden. Der Kollagentyp III liegt in schnell wachsendem Gewebe vor, besonders in jungem Gewebe und in heilender Haut. Die Kollagentypen IV und V werden in der Epithelgrundmembran gefunden¹&sup4;.
Die hauptsächlichen Molekulararten neben Kollagen, die in der extrazellulären Matrix gefunden werden, schließen die nichtkollagenen strukturellen Glykoproteine, Elastin und die Proteoglykane ein. Die Strukturglykolproteine bestehen aus Fibronectin und Laminin. Fibronectin wird sowohl im Plasma als auch in Gewebearten gefunden und kann auf andere Bestandteile der extrazellulären Matrix einwirken. Kürzlich äußerte Wartiovaara die Meinung, daß eine andere Funktion von Fibronectin darin besteht, Kollagen oder Fibrin zu opsonisieren und durch diesen Mechanismus den zellulären Abbau dieser Substrate zu regeln¹&sup5;. Laminin wird in allen Grundmembranen gefunden. Proteoglykane sind durch einen Proteinkern gekennzeichnet, der an die Glykoaminoglykanseitenketten bindet15,16,17,18.
Wenn Kollagen als ein biologisches Material verwendet wird, ist es wichtig, es in seiner reinsten und kristallinen Form zu verwenden, um die nichtkollagenen Proteine, die weit stärkere Antigene sind, zu entfernen. Wenn einmal der Entzündungszyklus angeregt wird, tritt die Resorption von Kollagen durch das Eindringen von entzündlichen Zellen, hauptsächlich Makrophagen und, in geringerem Ausmaß, Granulocyten ein. Diese Zellen enthalten Kollagenase, die den Kollagenabbau bewirkt. Houch und chang wiesen nach, daß Hautkollagen selbst chemotaktisch war und durch Abbau mit Gewebekollagenase in kleinere Peptidstücke noch aktiver wurde. Chemotropismus ist die Anziehungskraft von lebendem Protoplasma auf chemische Anregungsmittel, wodurch die Zellen durch Säuren, Alkali oder andere Stoffe, die chemische Eigenschaften aufweisen, angezogen werden (positive Chemotaxis) oder abgestoßen werden (negative Chemotaxis). Postlethwaite et al²¹ zeigten, daß verschiedene Kollagentypen, ihre Alphaketten, als auch kleine Peptide, die durch Kollagenaseabbau erzeugt wurden, alle gegenüber dermalen Fibroblasten chemotaktisch waren. Sie folgerten, daß die chemotaktische Wanderung von Fibroblasten in verletztes Gewebe oder theoretisch injiziertes Kollagen, durch das solubilisierte Kollagen oder seine Abbauprodukte geregelt werden kann. Auf diese Weise würde ein Kollagenimplantat im Gewebe nicht ruhend bleiben, sondern es kann eine komplexe Reihe von Ereignissen eintreten. Zuerst könnte das implantierte Kollagen durch entzündliche Zellen und Fibroblasten befallen werden und könnte, während es kontinuierlich resorbiert wird, eine Entzündungsreaktion durch chemotaktische Eigenschaften ihrer Abbauprodukte fördern. Auf diese Weise ist der Umfang des Kollagenmetabolismus nicht nur für Kollagen und andere Stoffe zur Weichgewebevermehrung wichtig, sondern auch für die normale und abnorme Wundheilung (d.h. überentwickelte Narbenbildung und Keloide)19,20,21.
Das injizierbare Kollagen, das kürzlich breite Verwendung erlangte, erhielt von der Food and Drug Administration 1981 die Zulassung als ein Mittel für einen Kunstgriff (nicht als Medikament) . Dieser unter dem Namen Zyderm collagen Implant verkaufte Stoff ist ein gereinigtes Rinderkollagen. Etwa 95% besteht aus dem Kollagentyp I und die restlichen 5% aus dem Kollagentyp III. Das Kollagen erleidet eine proteolytische Hydrolyse des Telopeptidteils, wobei sich seine Antigenwirkung verringert. Der Stoff wird in eine physiologische Salzlösung suspendiert und 0,3% Lidocain wird zugegeben und der Stoff in Spritzen, fertig zur Injektion durch kleinkalibrige Nadeln, verpackt.
Die häufigste unmittelbare Sorge der meisten Chirurgen in der plastischen Chirurgie besteht in dem Weg des Rinderkollagens nach der Injektion. Zyderm I mit 35 mg/ml Kollagen wird durch Gewebekollagenasen schnell abgebaut und innerhalb von einigen Monaten resorbiert. Zyderm II mit 65 mg/ml Kollagen und deshalb fast der doppelten Konzentration von Kollagen, ist länger beständig, aber es schlägt den gleichen Weg ein wie Zyderm I . Zyplast wurde erst kürzlich eingeführt und enthält 35 mg/ml mit Glutaraldehyd vernetztes Kollagen. Zyplast wird schließlich auch nach einiger Zeit abgebaut. Kligman²² verglich kürzlich den biologischen Weg von Zyderm -Kollagen und Zyplast -Kollagen, als es in den Rücken von freiwilligen Versuchspersonen eingeimpft wurde. Sie berichteten, daß, obwohl Zyderm -Kollagen anscheinend durch Wirtsgewebe während der Monate der Implantation resorbiert wurde, Zyplast persistenter war. Fibroblasten drangen in das Zyplast -Kollagen ein und lagerten Wirtskollagen ab. Burke et al²³ berichteten, daß Zyderm -Kollagen eine Reaktion stimuliert, die in einem Abbau des Implantats und Ersatz durch neu erzeugtes Wirtskollagen resultiert.
Ein weiterer Bereich der Verwirrung über Zyderm I - Kollagen, Zyderm II -Kollagen und Zyplast -Kollagen besteht in dem Prozentgehalt von Kollagen in jedem Produkt. Zyderm - Kollagen und Zyplast -Kollagen enthält 35 mg/ml (3,5% Kollagen), während Zyderm II 65 mg/ml (6,5% Kollagen) enthält.
Ein geringer Prozentsatz von Patienten, die entweder Zyderm I -Kollagen, Zyderm II -Kollagen oder Zyplast -Kollagen, nachstehend als Rinderkollagenimplantate (BCI) bezeichnet, verabreicht erhalten haben, haben nachteilige Immunreaktionen entwickelt. Die sichere Verwendung dieser Implantate beruht auf der berichteten niedrigen Immunogenitätsreaktion des Rinderkollagens. Es ist jedoch bei Patienten mit einer Autoimmunkrankheitsvorgeschichte schädlich. Vor dem Empfangen des BCI sind Hauttests notwendig. Nur Patienten mit negativen Hauttests nach 4 Wochen sollten die Injektionsbehandlung erhalten. Die Collagen Corporation weist darauf hin, daß etwa 3% der Patienten eine positive Hauttestreaktion zeigen, die durch Ödeme, Verhärtung, Erytheme, Hautjucken oder Empfindlichkeit an der Injektionsstelle gekennzeichnet ist. Allgemein nachteilige Behandlungsreaktionen wurden bei weniger als 1% bis mehr als 5% der Patienten festgestellt. Sie sind durch Nesselsucht, Muskelschmerz, Gelenkschmerz und eine anaphylaxieähnliche Reaktion gekennzeichnet. Es wurde ein dramatischer Anstieg der Häufigkeit von anti-BCI-Antikörpern im Kreislauf der Patienten mit nachteiligen BCI -Behandlungsreaktionen beobachtet, verglichen mit Serumproben von unbehandelten Personen oder behandelten Patienten, die keine nachteiligen Reaktionen erleiden. BCI ist ein schwaches Antigen, aber es ist doch ein fremdes Protein. Es wurde so behandelt, daß die Telopeptide gespalten werden, um sie weniger immunisierend zu machen, aber der spiralförmige Teil des Moleküls behält seinen antigenen Sitz. Die bestimmenden Strukturen, die durch den zellvermittelnden immunologischen Mechanismus erkannt wurden, scheinen innerhalb des dreifachen 1 Spiralhauptteils der Kollagenmoleküls zu liegen. Es bestand eine größere Sorge über das wiederholte Aussetzen der Patienten gegenüber diesen Antigenen und ihre Langzeitwirkungen24,25,26.
Zusammengefaßt werden, wegen der Mängel des BCI, einschließlich des Mangels der Persistenz, der Notwendigkeit für wiederholte Injektionen und der ernsten Besorgnis über nachteilige Reaktionen, neuere injizierbare Stoffe zur Weichgewebevermehrung benötigt. Die vorliegende Erfindung ist auf injizierbare Stoffe zur Weichgewebevermehrung und Verfahren zu ihrer Herstellung gerichtet, die die Unzulänglichkeiten von BCI und anderer injizierbarer Stoffe des Standes der Technik überwinden.

Beschreibung des Standes der Technik

Zusätzlich zum vor stehend besprochenen Stand der Technik offenbart das U.S. Patent Nr. 4,361,552 ein Verfahren zur Behandlung einer Wunde oder Verbrennung mit einem Amnionverband von einem geeigneten Lebewesen (dem Menschen, Vieh, Schweinen, usw.), der fixiert oder durch toxische chemische Mittel, wie Glutaraldehydlösungen oder andere Fixieroder Tanninlösungen stabilisiert wird, so daß die Proteine vernetzt werden. Eine Anzahl von U.S. Patenten werden in diesem Patent zitiert und aufgeführt.
Die G.B.-Nr. 8133375, veröffentlicht am 22. Juni 1983, offenbart ein im wesentlichen amnionfreies Präparat zur Verwendung bei der Wundbehandlung, das aus einem Kulturmedium, in dem Amnion gezüchtet wurde, gewonnen wird, wobei das Amnion vorzugsweise menschliches Amnion ist.
Die DE-A-2405002 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von löslichem natürlichem Kollagen aus menschlichem Gewebe, besonders aus der Plazenta, das durch teilweises oder vollständiges Entfernen von nicht-spiralförmigen Peptiden modifiziert werden kann.
Das WO 84/00491 beschreibt Implantate gegen Falten, umfassend Kollagen, das aus tierischem Knorpel durch Mazeration, Spülen und Aufarbeiten erhalten wird, wobei ein injizierbarer Stoff hergestellt wird.
Die EP-A-0083868 beschreibt ein injizierbares Implantat zur Weichgewebevermehrung, das eine Dispersion von Teilchen von vernetztem Atelopeptidkollagen und wieder aufgebautem faserigen Atelopeptidkollagen in einem physiologischen wäßrigen Träger umfaßt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist auf einen injizierbaren Weichgewebestoff gerichtet, in dem die mit xenogenetischen Rinderstoffen verbundenen Probleme beseitigt wurden, und wobei sich dem Problem des Mangels an Persistenz und der Notwendigkeit zur wiederholten Injektion zugewendet wurde, wobei der Stoff weniger anfällig gegenüber einem Abbau gemacht wurde und für den der Ausgangsstoff in unbegrenzten Mengen und billig erhältlich ist.
Der injizierbare Stoff zur Weichgewebevermehrung umfaßt ein sterilisiertes Gemisch vom Kollagentyp I und -typ III, das durch proteolytischen Abbau von unlöslichem Amnion, löslichem Amnion, löslichem Chorion aus menschlicher Plazenta extrahiert wurde, und Kombinationen davon, das homogenisiert wird, um durch eine Operationsnadel hindurchzugehen. Der homogenisierte Stoff sollte vorzugsweise durch eine Operationsnadel mit 0,318 mm Durchmesser (30 Gauge) hindurchgehen, um Beschwerden zu vemeiden und, falls nötig, kann ein Analgetikum dazugegeben werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird der Stoff mit einem Minimum von 2,0 kJ/kg (0,2 MRad) zur Sterilisierung und zum Vernetzen, mit einem bevorzugten Bereich von 2,5 kJ/kg (0,25 MRad) bis 20 kJ/kg (2,0 MRad), bestrahlt. Der vorliegende bevorzugte injizierbare Stoff zur Weichgewebevermehrung ist bestrahltes lösliches Amnion.
Das Verfahren der Erfindung zur Herstellung eines solchen injizierbaren Weichgewebestoffes umfaßt das Sterilisieren eines Gemisches des Kollagentyps I und -typs III, das durch proteolytischen Abbau von unlöslichem Amnion, löslichem Amnion, löslichem Chorion aus menschlicher Plazenta extrahiert wurde, und Kombinationen davon, und ausreichende Homogenisierung des Stoffes, so daß er durch eine Operationsnadel, und vorzugsweise durch eine Operationsnadel mit einem Durchmesser von 0,318 mm (30 Gauge), hindurchgehen kann. Die Sterilisation wird vorzugsweise durch Gammabestrahlung durchgeführt, die die Kollagenmoleküle auch vernetzt. Um die Stoffe zu sterilisieren, ist ein Minimum von 2,0 kJ/kg (0,20 MRad) notwendig und der gegenwärtig bevorzugte Bereich liegt bei 2,5 kJ/kg bis 20 kJ/kg (0,25 MRad bis 2,0 MRad). Zu dem homogenisierten injizierbaren Weichgewebestoff kann, falls erwünscht, ein Analgetikum zugegeben werden.
Der Stoff der Erfindung kann zur Verbesserung von Weichgewebeprofilmängeln durch Injektion des injizierbaren Weichgewebestoffes der Erfindung in einen Patienten verwendet werden. Vorteilhafterweise sind eine Anzahl von Injektionen kleiner Mengen des Weichgewebestoffs möglich, da auch kleine Mengen eine anhaltende Wirkung haben. Das stellt eine größere Wirt-Implantat-Grenzfläche bereit und erlaubt eine schnellere Assimilierung in das Gewebe, da der Mittelpunkt des Implantats nicht weit von den Einflüssen des Wirtsgewebes liegt.
Es ist demgemäß eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen injizierbaren sterilisierten Weichgewebestoff bereitzustellen, in dem ungünstige allergische Reaktionen, ausgeschlossen werden, der eine langanhaltende Persistenz und geringe Entzündungsmöglichkeit besitzt, der durch eine Nadel mit einem Durchmesser von 0,318 mm (30 Gauge) injiziert werden kann, und in einer Ausführungsform der Erfindung wird Gammabestrahlung verwendet, um den Stoff sowohl zu sterilisieren, als auch den Umfang der Vernetzung des Kollagens, ohne die Verwendung von toxischen Vernetzungsmitteln, zu erhöhen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen injizierbaren sterilisierten Weichgewebestoff aus menschlicher Plazenta bereitzustellen, der aus einem sterilisierten Gemisch des Kollagentyps I und -typs III besteht, das durch proteolytischen Abbau von unlöslichem Amnion, löslichem Amnion, löslichem chorion extrahiert wurde und Kombinationen davon, das ausreichend homogenisiert wird, um durch eine Operationsnadel, z.B. eine Nadel mit 0,318 mm Durchmesser (30 Gauge), hindurchzugehen, und in einer Ausführungsform der Erfindung wird der Stoff gereinigt und durch Gammabestrahlung, ohne die Verwendung von toxischen Chemikalien, vernetzt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Einrichtung zur Herstellung eines injizierbaren Weichgewebestoffs, in dem ungünstige allergische Reaktionen ausgeschlossen sind, in dem Gammabestrahlung sowohl zur Sterilisierung des Stoffes als auch zur Erhöhung des Umfangs der Vernetzung verwendet wird, und in dem durch Veränderung des Umfangs des Vernetzens das Ausmaß der Gewebepersistenz geregelt werden kann.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines injizierbaren Stoffes zur Weichgewebevermehrung mit den vorstehend erwähnten Vor teilen durch Homogenisieren eines sterilisierten Gemisches vom Kollagentyp I und -typ III, das durch proteolytischen Abbau von unlöslichem Amnion, löslichem Amnion, löslichem Chorion oder Kombinationen davon, aus menschlicher Plazenta extrahiert wurde, so daß der Stoff durch eine Operationsnadel, vorzugsweise eine Operationsnadel mit einem Durchmesser von 0,318 mm (30 Gauge), hindurchgeht, und Vernetzen der Kollagenrnoleküle des Stoffes durch Garnrnabestrahlung von mindestens 2,0 kJ/kg (0,20 MRad) und, vorzugsweise, im Bereich von 2,5 kJ/kg bis 20 kJ/kg (0,25 MRad bis 2,0 MRad).
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Stoffe zur Verwendung bei der Wiederherstellung des Weichgewebeprofils durch Injektion in Menschen, aus einer menschlichen Plazenta bereitzustellen, die ein Gemisch des Kollagentyps I und -typs III umfassen, das durch proteolytischen Abbau von unlöslichem Amnion, löslichem Ainnion, löslichem chorion extrahiert wurde, oder Kombinationen davon, das sterilisiert und in dem Maße homogenisiert wird, daß es durch eine Operationsnadel, und vorzugsweise eine Operationsnadel mit einem Durchmesser von 0,318 mm (30 Gauge) hindurchgehen und injiziert werden kann und in einer Ausführungsform der Erfindung wird es sterilisiert und dessen Kollagenmoleküle sind durch Gammabestrahlung vernetzt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Stoffen zur Verwendung bei dem Verfahren zur Wiederherstellung des Weichgewebeprofils durch Injektion des injizierbaren Stoffes in kleinen Mengen in Menschen, wobei eine gute Wirt-Implantat-Grenzfläche bereitgestellt und eine schnellere Assimilation in das Gewebe erlaubt wird und die außerdem eine gute Persistenz besitzen.
Andere und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der Beschreibung und den Ansprüchen hervor.

Gegenwärtig bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung

Als Ausgangsstoff für den injizierbaren Stoff zur Weichgewebevermehrung bei Menschen zur Wiederherstellung des Weichgewebeprofils wurden menschliche Fetalmembranen ausgewählt, da sie Allergieprobleme, die mit xenogenetischen Quellen, d.h. aus Rindern, gefunden wurden, ausschalten; menschliche Plazenten sind in relativ unbegrenzten Mengen erhältlich und sind eine reiche Quelle für Kollagen, Plazenten sind billig erhältlich und Amnion hatte eine lange Vorgeschichte von medizinischen Verwendungen, die vor fast 90 Jahren mit einer breiten Vielfalt von medizinischen und chirurgischen Anwendungen begann.
Die Fetalmembranen sind komplexe biochemische Strukturen, die für einen oder verschiedene injizierbare Weichgewebestoffe nutzbar gemacht werden können. Sie besitzen physikalische und biologische Eigenschaften, die modifiziert werden können, wobei sie verschiedene klinische Bedürfnisse erfüllen.
Die bevorzugten menschlichen Fetalmembranen sind unlösliches Amnion, lösliches Amnion, lösliches chorion oder Kombinationen davon. Sie sind homogenisiert, wobei sie durch eine Operationsnadel hindurchgehen. Obwohl das Injizieren der Stoffe zur Weichgewebevermehrung durch eine Operationsnadel von 0,556 mm Durchmesser (25 Gauge) für klinische Zwecke ausreichend ist, wird der Stoff, um Beschwerden zu vemeiden, vorzugsweise homogenisiert, so daß er durch eine Operationsnadel mit einem Durchmesser von 0,318 mm (30 Gauge) hindurchgeht und injiziert werden kann.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird der injizierbare Stoff durch Gammabestrahlung, ohne die Verwendung von chemischen Vernetzungsmitteln, wie z.B. Glutaraldehyd, die toxisch sind, vernetzt. Die Gammabestrahlung sollte mit einem Minimum von 2,0 kJ/kg (0,20 MRad) erfolgen, wobei der Stoff sterilisiert wird, da alle Bakterien, Pilze und Viren, einschließlich AIDS, bei 2,0 kJ/kg (0,20 MRad) vernichtet werden. Der Stoff wird vorzugsweise von 2,5 bis 20 kJ/kg (0,25 bis 2,0 MRad) bestrahlt, wobei die Kollagenmoleküle sterilisiert und vernetzt werden.
Falls erwünscht, kann ein Analgetikum, wie Lidocain, zu dem injizierbaren Stoff zugegeben werden.
Zur Herstellung des weichen injizierbaren Stoffes wurden frische Plazenten gesammelt und das Amnion manuell, z.B. durch Fingertrennung, von dem chorion getrennt. Sowohl das Amnion als auch das Chorion werden dann von Blutklümpchen oder Gewebstrümmern gereinigt. Zur kurzzeitigen Lagerung werden das Amnion und das Chorion bis zur Verarbeitung in eine Antibiotikalösung, zum Beispiel Linomycin 3 g/la ml, Amphotericin B 50 mg/10 ml, Neomycinsulfat 0,5 g/10 ml, Polymyxin B-Sulfat 500000 Einheiten/10 ml in 1 Liter einer normalen salinischen Lösung gelegt.
Das Kollagen wurde unter Verwendung eines begrenzten proteolytischen Abbaus mit Pepsin extrahiert. Kurz gesagt wurde das Gewebe in 0,5 M Essigsäure homogenisiert, der pH- Wert wurde mit HCl auf 2,5 eingestellt und das Präparat wurde zweimal mit Pepsin (10 mg Pepsin/g feuchtes Gewebe) über Nacht digeriert. Zur Reinigung des Kollagens wurde ein kombiniertes Verfahren mit selektiver Fällung aus einer Neutralsalzlösung und sauren Lösungsmitteln verwendet. Das gereinigte Kollagen wurde durch Dialyse gegen einen Natriumphosphatpuffer mit geringer Ionenstärke (pH 7,2) bei 15-17ºC wiederhergestellt. Lidocain wurde auf eine Endkonzentration von 0,3% zugegeben. Alle Verfahrensschritte wurden bei 4-8ºC durchgeführt, obwohl andere geeignete Temperaturen verwendet werden können.

Verarbeitung des unlöslichen Amnions

Ein gegenwärtig bevorzugtes Verfahren zur Verarbeitung des Amnions umfaßt das Dekantieren des Antibiotikums von dem Amnion, Zugabe von 5 ml kaltem destillierten Wasser zu jedem Amnion und etwa 15 Minuten langes Homogenisieren des Amnions in einem Polytron-Homogenisierer. Das homogenisierte Amnion wird dann 15 Minuten bei 4ºC bei 8000 x g zentrifugiert, der Über stand verworfen und der Niederschlag wird gewaschen, z.B. 5 mal mit Aceton, wobei die Lipide entfernt werden. Der Niederschlag wird dann gewogen und Pepsin (Sigma, 1:10000 aus Schweinemagenschleimhaut) sowie 3,0 molare Essigsäure pro Amnion, 15 ml oder mehr für besonders große Amnionen, wurden zugegeben, und der Niederschlag wurde etwa 5 Minuten in einem Polytron-Homogenisierer homogenisiert.
Das Gemisch wurde 18 Stunden bei 4ºC stehen gelassen, 1 Stunde bei 4ºC bei 100000 x g zentrifugiert, der Über stand verworfen, der Niederschlag gewogen und dann das Pepsin gewogen und die Homogenisierungsschritte wurden wiederholt und der Über stand verworfen.

Verarbeitung des löslichen Amnions

Ein gegenwärtig bevorzugter Weg der Verarbeitung löslicher Amnionen umfaßt das Abspülen der Antibiotika von den Amnionen mit entionisiertem Wasser, Zugabe von 5 ml kaltem destillierten Wasser zu jedem Amnion, etwa 15 Minuten langes Homogenisieren in einem Polytron-Homogenisierer und 15 Minuten langes Zentrifugieren bei 4ºC bei 8000 x g. Der Überstand wird verworfen und die Lipide wurden aus dem Niederschlag, durch 3-maliges Waschen mit Aceton, entfernt und der Niederschlag wurde gewogen.
Zu dem Niederschlag wurde Pepsin (Sigma, 1:10000, aus Schweinemagenschleimhaut) (Gewichtsverhältnis 1:100) und 100 ml 0,5 molare Essigsäure pro Amnion, mehr wenn die Amnionen besonders groß waren, zugegeben, und dann wurde etwa 10 Minuten in einem Polytron-Homogenisierer homogenisiert. Das Kollagen aus dem Niederschlag wurde durch Pepsin 18 Stunden bei 4ºC extrahiert und dann wurde 1 Stunde bei 4ºC bei 100000 x g zentrifugiert, wobei der Niederschlag und der Überstand zurückbehalten wurden. Der Überstand wurde wieder gewogen und die Stufen der Pepsin- und der Essigsäurezugabe, des Homogenisierens, der Pepsinextraktion von Kollagen und des Zentrifugierens werden dann wiederholt.
Die Überstände der ersten und zweiten Extraktion werden zusammengefaßt und 10 molare NaOH wird tropfenweise zugegeben, wobei der pH-Wert auf 7,0 bis 7,2 eingestellt wird. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 4ºC stehen gelassen, 45 Minuten bei 4ºC bei 100000 x g zentrifugiert und der Niederschlag wird verworfen. Bis zu 3,0 molares Nacl wird zu dem Überstand zugegeben, 2 Stunden bei 4ºC stehen gelassen, 45 Minuten bei 4ºC bei 100000 x g zentrifugiert, dann wird der Niederschlag gewogen und Lidocain auf 0,3% zugegeben.

Verarbeitung von löslichem Amnion mit weiterer Reinigung

Ein gegenwärtig bevorzugtes Verfahren zur Verarbeitung von löslichem Annion und weiterer Reinigung umfaßt das Abspülen des Antibiotikums von dem Amnion mit entionisiertem Wasser, die Amnionen werden auf etwa 2 cm x 2 cm geschnitten und kurz mit Aceton gewaschen, mit 0,5 M Essigsäure (pH mit HCl auf 2,5 eingestellt) eingeweicht, etwa 15 Minuten in einem Polytron-Homogenisierer homogenisiert, dann wird Pepsin zugegeben (1:100 Pepsin/festes Gewebe) (1 mg Pepsin / 1 ml Lösung) und bei 4ºC über Nacht gerührt, wie vor stehend angegeben zentrifugiert, wobei der Überstand zurückbehalten wird. Es wurde wieder Pepsin, wie vorher angegeben, zugegeben und über Nacht bei 4ºC gerührt, Zentrifugiert und der Über stand der beiden Stufen des Zentrifugierens wurde zusammengefaßt und NaCl auf 2 M zugegeben und über Nacht bei 4ºC stehen gelassen, dann wieder zentrifugiert, der Über stand verworfen und der Niederschlag zurückbehalten.
Der Niederschlag wurde durch Auflösen in 0,5 M Essigsäure gereinigt, zentrifugiert, der Niederschlag verworfen, zu dem Überstand wurde Nacl auf 2 M zugegeben und der Überstand über Nacht bei 4ºC stehen gelassen, dann wieder zentrifugiert und der Überstand verworfen. Der erhaltene Niederschlag wurde in 0,5 M Essigsäure gelöst, es wurde wieder zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Der Über stand wurde 48 Stunden gründlich gegen 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4;, mit häufigem Austausch der Dialyseflüssigkeit, dialysiert, zentrifugiert, der Über stand verworfen, der Niederschlag gewogen und festes Lidocain HCl auf 0,30% unter mechanischem Rühren zugegeben.

Verarbeitung des Chorions

Nach einem gegenwärtig bevorzugten Verfahren der Verarbeitung des löslichen chorions wurden die Antibiotika von dem Chorion mit entionisiertem Wasser abgespült, das Chorion wurde auf etwa 2 cm x 2 cm-Einheiten geschnitten und kurz mit Aceton gewaschen und dann in 0,5 M Essigsäure, die mit HCl auf pH 2,5 eingestellt wurde, eingeweicht. Das Gewebe wurde dann in einem Polytron-Homogenisierer etwa 15 Minuten zu feinen Teilchen homogenisiert, Pepsin dazugegeben und, wie vorstehend angegeben, unter Zurückbehalten des Überstands zentrifugiert. Die Pepsin- und Zentrifugierstufen wurden dann wiederholt, der Über stand von jedem dieser Stufen wurde zusammengefaßt und NaCl auf 2 M zugegeben und über Nacht bei 4ºC stehen gelassen und danach wieder zentrifugiert und der Über stand verworfen.
Der Niederschlag wurde zur Reinigung in 0,5 M Essigsäure gelöst, zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Zu dem Überstand wurde Nacl auf 2 M zugegeben und über Nacht bei 4ºC stehen gelassen, dann wieder zentrifugiert und der Überstand verworfen. Der Niederschlag wurde in 0,5 M Essigsäure gelöst, zentrifugiert, 48 Stunden gründlich gegen 0,02 M Na&sub2;HPO&sub4;, mit häufigem Wechseln der Dialyseflüssigkeit, dialysiert, wieder zentrifugiert, der Überstand verworfen und der Niederschlag gewogen. Zu dem Niederschlag wurde unter mechanischem Rühren festes Lidocain HCl auf 0,30% zugegeben.

Vernetzen und Sterilisieren

15 ml von jedem der vorstehend erhaltenen Niederschläge wurden in 20 ml Serumflaschen mit Kräuselverschluß gebracht und für verschiedene Zeiträume in eine radioaktive Ce¹³&sup7;-0 Quelle gebracht, um 2,5 kJ/kg (0,25 MRad), 5,0 kJ/kg (0,5 MRad), 10 kJ/kg (1,0 MRad) und 20 kJ/kg (2,0 MRad) aufzunehmen, das dem doppelten Zweck, der Sterilisierung des Stoffes und der Vernetzung des Kollagens, diente.

Beispiel 1

Verschiedene Gruppen von Kollagenextrakten wurden in phosphatgepufferter Salzlösung wieder aufgebaut, in Glasröhren gebracht und mit einer 6,58 x 10¹³ s&supmin;¹ (1779 Curie) Cäsium-Gammastrahlenquelle mit einer Dosis von 0,167 J kg&supmin;¹ s&supmin;¹ (1000 Rad/Minute) bestrahlt. Die Dosis betrug 2,5 kJ/kg (0,25 MRad). Die Bestrahlung wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Tabelle 1 Es wurden die folgenden Gruppen untersucht: Gruppe 1. Lösliches Amnion mit 2,5 kJ/kg (0,25 MRad). 2. Lösliches Amnion ohne Bestrahlung. 3. Unlösliches Amnion mit 2,5 kJ/kg (0,25 MRad). 4. Unlösliches Arnnion ohne Bestrahlung. 5. Unlösliches Amnion + lösliches Amnion (1:1) mit 2,5 kJ/kg (0,25 MRad). 6. Unlösliches Amnion + lösliches Amnion (1:1) ohne Bestrahlung. 7. Lösliches Chorion mit 2,5 kJ/kg (0,25 MRad). 8. Lösliches chorion ohne Bestrahlung. 9. Lösliches Chorion + lösliches Amnion (1:1) mit 2,5 kJ/kg (0,25 MRad). 10. Lösliches Chorion + lösliches Amnion (1:1) ohne Bestrahlung.
Aus jeder Gruppe wurden Beispiele zur Prüfung auf aerobe-, anaerobe- und Pilzkulturen gegeben. Sämtliche Gruppen zeigten kein Wachstum, sowohl vor als auch nach der Bestrahlung.
120 junge Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 200-300 Gramm wurden für die Tierinjektionen verwendet. Zwölf Tiergruppen wurden untersucht, einschließlich Gruppen, die mit Zyderm II und Zyplast injiziert wurden. In jeder Gruppe befanden sich 10 Ratten. Es wurde 0,2 ml des injizierbaren Stoffs perkutan in ihre Rücken unter dem Panniculus carnosus in drei getrennte Stellen injiziert. Von 5 Ratten jeder Gruppe wurden Muster nach einem Monat und nach sechs Monaten genommen.
Die Muster wurden in 10%igem gepufferten Formalin fixiert und danach in Paraffin eingebettet. Es wurden Reihenschnitte hergestellt und mit Haematoxylin-Eosin (H&E) gefärbt. Die Ergebnisse wurden durch einen unabhängigen Pathologen aus der Reihe unserer Mitarbeiter verglichen.
Die histologische Auswertung der Implantate zeigte in allen untersuchten Gruppen Ähnlichkeiten, mit Ausnahme des unlöslichen Amnions, die später erörtert wird. Es war besonders keine Entzündungsreaktion feststellbar und es trat keine Einkapselung ein. Ein fibrozytärer Einwuchs liegt nach 30 Tagen vor und ist nach 180 Tagen stärker zentripetal fortgeschritten. Neue Gefäßbildung war in veränderlichem Ausmaß nach 180 Tagen vorhanden. Das Ausmaß sowohl des fibrozytären Einwuchses als auch der neuen Gefäßbildung war größer als das, das mit Zyderm II und Zyplast nach 180 Tagen festgestellt wurde.
Die Gruppe des unlöslichen Amnions zeigte auch keine Entzündung oder Einkapselung, aber eine ausgeprägte neue Gefäßbildung und ausgeprägten fibrozytären Einwuchs. Eine weitere Beobachtung war die Anwesenheit von wenigen Adipozyten nach 30 Tagen. Nach 180 Tagen waren die Adipozyten, die zuerst am Rand des Implantats auftraten über das Implantat verteilt. Diese Erscheinung wurde durch andere beobachtet 27,28.
Es war sehr schwierig eine quantitative Analyse (die Messung des genauen Umfangs des bestehenden Implantats) durchzuführen. Deshalb wurde eine vorläufige quantitative Untersuchung der Persistenz durchgeführt. Es wurde einfach die Anzahl der vorhandenen sichtbaren Implantate der nach 6 Monaten überlebenden Ratten gezählt. Tabelle 2 legt dar, daß die Gruppe des löslichen Amnions nach 6 Monaten eine sehr gute Persistenz zeigt. Das nicht bestrahlte lösliche Amnion besaß alle Implantate nach 6 Monaten und das bestrahlte lösliche Amnion besaß 11 von 15 Implantaten. Die unlösliche Gruppe zeigte auch eine gute Persistenz sowohl bei den bestrahlten als auch den nicht-bestrahlten Gruppen. Einige Gruppen mit Kombinationen von Stoffen, besonders lösliches Chorion, besaßen nach der Bestrahlung eine geringere Persistenz. Tabelle 2 Persistenz von Injektionen zur Weichgewebevermehrung nach 6 Monaten Tierversuchsgruppe 1-10, Zyderm II und Zyplast Gruppe Kollagenkonzentration Anzahl Ratten Überlebende/Injizierte vorhandene Injektionen nach 6 Monaten/Gesamtzahl Injizierte Zyderm II Zyplast Anmerkung: * Das Muster wurde mit 2,5 kJ/kg (0,25 MRad) Gammabestrahlung bestrahlt.
Zahlreiche histologische Untersuchungen in Zeitabständen von einem bis sechs Monaten zeigten sowohl fibrozytären Einwuchs als auch neue Gefäßbildung ohne Entzündung. Die Beobachtung der Adipozytaufnahme in die unlöslichen Amnionimplantate ist sehr interessant, aber wir können nicht erklären, warum sie auftritt. Das Eindringen von Fett in das Stroma wurde früher durch andere Autoren27,28 beobachtet und ist ein eigentümlicher Vorgang von unklarer Art. Die Ansammlung von erhöhten Fettmengen tritt gelegentlich innerhalb des dazwischenliegenden Gewebes von bestimmten Geweben und Organen ein. Robbins und Angel²&sup9; äußern eine Erklärung, wonach vermutlich die multipotentiellen Fibroblasten in dem Zwischenraum mit Lipid gefüllt und im wesentlichen zu "fettleibigen" Fettzellen umgewandelt werden. Das Eindringen von Fett in das Stroma neigt dazu mit Fettleibigkeit oder mit Atrophie von parenchymatösen Zellen verbunden zu sein, aber die Wechselbeziehungen sind unvollkommen. Das Herz und die Bauchspeicheldrüse sind am häufigsten betroffen.
Die Tatsache, daß nach 30 Tagen nur wenige Adipozyten vorhanden waren und nach 180 Tagen eine erhöhte Anzahl vorlag, scheint darauf hinzuweisen, daß ein Vorgang eintrat, der dem vorstehend beschriebenen ähnlich war. Die Stimulierung einer weiteren Adipozytablagerung bietet einen interessanten und neuen möglichen Weg zur Weichgewebevermehrung.
Die biochemische Analyse hat die Reinheit des injizierbaren menschlichen Amnion- und Chorionkollagens nachgewiesen. Die PAGE-Elektrophorese und die Amnionsäureanalyse haben gezeigt, daß HAC ein typisches Kollagenelektrophoresemuster und eine Aminosäurezusammensetzung eines Gemisches vom Kollagentyp I und -typ III besitzt.
Die Ergebnisse des bakteriellen Kollagenaseabbaus wiesen nach, daß im injizierbaren menschlichen Amnion- und Chorionkollagen kein Protein vorhanden war, daß nicht Kollagenprotein war. Durch Immuno-Blotting-Untersuchung wurde in dem Kollagenprodukt der vorliegenden Erfindung kein Fibronectinund Lamininrückstand nachgewiesen. Wir glauben, daß die hohe Reinheit des HAC zu der geringen immunologischen Reaktion in dem Rattenmodell beitrug.
Das Verhältnis des Kollagentyps III zu dem Kollagentyp I ist im injizierbaren menschlichen Amnionkollagen viel größer (43:57) als in Zyderm und Zyplast (5:95). Der Kollagentyp III besitzt Disulfatbindungen zwischen den Ketten, während der Kollagentyp I keine solche Bindungen besitzt, so daß nach der Behandlung durch Pepsinextraktion, der Kollagentyp I in Form eines Gemisches von α, β und γ-Ketten vorliegt, während der Kollagentyp III hauptsächlich in der γ- Form vorliegt. Es wird angenommen, daß je größer die Vernetzung ist, um so größer die Persistenz des Kollagentyps III im Amnionkollagen ist und das erscheint als ein wichtiger Faktor bei der Berücksichtigung des wirksamsten Kollagens zur Weichgewebevermehrung.
Untersuchungen der Zellbiologie wiesen nach, daß mit Gammastrahlen bestrahltes menschliches Amnionkollagen keine zellschädigende Wirkung auf das Zellwachstum und das Zellverhalten aufwies. Das Zellwachstum auf bestrahltem menschlichen Amnionkollagensubstrat besitzt ein normales morphologisches Aussehen und hat aktive Pseudopodien. In der Anzahl der Zellen und Versuchen mit inkorporiertem [³H] wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Zellwachstum auf bestrahltem menschlichen Amnionkollagen und Vitrogen , Zyderm und nicht-bestrahltem menschlichem Amnionkollagen gefunden.
Die biochemische Kennzeichnung der verschiedenen injizierbaren menschlichen Amnionkollagene für die Reinigungsbewertung und den Anteil von Kollagentypen, schloß die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE), die fotograpfische Dichtemessung, den Kollagenaseabbau, die Aminosäureanalyse (AAA), das Immuno-Blotting, die Elektronenmikroskopie (EM), die Kollagenaseempfindlichkeitsbestimmung und die Hydroxyprolinbestimmung ein. Es wird keine ins einzelne gehende Beschreibung der verschiedenen Verfahren gegeben oder als nötig empfunden, da das alles übliche Verfahren sind.
Man kann gute Ergebnisse mit Gammabestrahlung mit einem Minimum von 2,0 kJ/kg (0,20 MRad) und im Bereich von 2,5 kJ/kg (0,25 MRad) und 20 kJ/kg (2,0 MRad) erhalten. Es kann jede Kombination der Amnionen mit Chorion mit guten Ergebnissen angewendet werden.
Die vor stehende Tieruntersuchung ist ein ausgezeichnetes Modell für die Injektion des injizierbaren Stoffes in Menschen.
Die vorliegende Erfindung ist deshalb gut geeignet und zweckentsprechend angepaßt, die Aufgaben und Ziele zu erfüllen und besitzt die erwähnten Merkmale und Vorteile als auch andere hier zugehörende Merkmale und Vorteile.

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Claims

1. Injizierbarer Stoff zur Weichgewebevermehrung, umfassend ein sterilisiertes Gemisch von Kollagen Typ I und Typ III,das durch proteolytischen Abbau von unlöslichem Amnion, löslichem Amnion, löslichem chorion aus menschlicher Placenta extrahiert wird, und Kombinationen davon, homogenisiert, um durch eine Operationsnadel hindur chzugehen.

2. Injizierbarer Stoff zur Weichgewebevermehrung nach Anspruch 1, wobei der Stoff homogenisiert wird, um durch eine Operationsnadel mit einem Durchmesser von 0,318 mm (30 Gauge) hindurchzugehen.

3. Injizierbarer Stoff zur Weichgewebevermehrung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 wobei der ausgewählte Stoff lösliches Amnion ist.

4. Injizierbarer Stoff zur Weichgewebevermehrung nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei der Stoff durch Gammabestrahlung vernetzt ist.

5. Injizierbarer Stoff zur Weichgewebevermehrung nach Anspruch 4, wobei die Gammabestrahlung minimal 2,0 kJ/kg (0,2 MRad) beträgt.

6. Injizierbarer Stoff zur Weichgewebevermehrung nach Anspruch 4, wobei die Gammabestrahlung im Bereich von 2,5 kJ/kg bis 20 kJ/kg (0,25 MRad bis 2,0 MRad) liegt.

7. Injizierbarer Stoff zur Weichgewebevermehrung nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei der Stoff ein Analgetikum einschließt.

8. Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Stoffes zur Weichgewebevermehrung, umfassend das Sterilisieren eines Gemisches vom Kollagen Typ I und Typ III, das durch proteolytischen Abbau von unlöslichem Amnion, löslichem Amnion, und löslichem Chorion aus menschlicher Placenta extrahiert wird, und Kombinationen davon, und genügendes Homogenisieren des Stoffes, um durch eine Operationsnadel mit einem Durchmesser von mindestens 0,556 mm (25 Gauge) hindurchzugehen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Stoff ausreichend homogenisiert wird, um durch eine Operationsnadel mit einem Durchmesser von 0,318 mm (30 Gauge) hindurchzugehen.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, umfassend das Vernetzen von Kollagenmolekülen des Stoffes durch Gammabestrahlung.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Gammabestrahlung minimal 2,0 kJ/kg (0,20 MRad) beträgt.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Gammabestrahlung im Bereich von 2,5 kJ/kg bis 20 kJ/kg (a,25 MRad bis 2,0 MRad) liegt.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 12, wobei das Verfahren die Zugabe eines Analgetikums zu dem homogenisierten Stoff einschließt.